대한정형외과학회지 : 제 39 권제 4 호 2004 J. of Korean Orthop. Assoc. 2004; 39: Beta-Ig H3 을이용한사람골수중배엽줄기세포의연골분화유도 이태규ㆍ권굉우ㆍ감상경 * ㆍ김인산 ㆍ조명래ㆍ조대원 대구가톨릭대학교의과대학정형외

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승호 호
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1 대한정형외과학회지 : 제 39 권제 4 호 2004 J. of Korean Orthop. Assoc. 2004; 39: Beta-Ig H3 을이용한사람골수중배엽줄기세포의연골분화유도 이태규ㆍ권굉우ㆍ감상경 * ㆍ김인산 ㆍ조명래ㆍ조대원 대구가톨릭대학교의과대학정형외과학교실, 진단검사의학교실 *, 경북대학교의과대학생화학교실 목적 : 사람골수중배엽줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSC) 의연골분화유도에서 TGF-beta 를대체할수있는물질로서 Beta-Ig H3 (BigH3) 의가능성을알아보고자하였다. 대상및방법 : 20 명의건강한골수공여자의골수흡인액에서 density gradient Ficoll-hypaque 분리방법으로얻은 MSC 를알긴산을지지체로 28 일간삼차원배양하였다. 성장인자로 0.5 혹은 10 ng/ml 의 transforming growth factor (TGF)-beta 1, TGF-beta 1+TGF-beta 3, BigH3 을첨가한군에서농도별, 시기별세포생존력, 총콜라겐함량, Glycosaminoglycan (GAG) 함량을측정하여통계학적으로비교하였다. 결과 :TGF-beta 3 은배양 21 일까지유의하게세포생존력을강화하였다 (p=0.029). 10 ng/ml 농도일때 TGF-beta 1+TGFbeta 3 첨가군과 BigH3 첨가군간에는세포생존력 (p=0.197), 총 GAG 함량 (p=0.253) 에서유의한차이가없었다. 총콜라겐함량은 10 ng/ml 농도의경우배양 21 일까지 BigH3 첨가군이 TGF-beta 1+TGF-beta 3 첨가군보다높았다 (p=0.041). 결론 : 사람골수의 MSC 를연골모세포로성공적으로분화유도하였으며, 이때의배지에첨가하는성장인자로 TGF-beta 대신국내에서생산되는 BigH3 을대체하여배양하여도세포의생존력과단백당함량등연골분화유도의외적표지에차이가없음을확인하였다. 색인단어 : Beta-Ig H3, 연골분화, 중배엽줄기세포, 사람골수 Effect of beta-ig H3 on Chondrogenesis by Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Tae Kyu Lee, M.D., Koing Woo Kwun, M.D., Sang Gyung Kim, M.D.*, In San Kim, M.D., Myung Rae Cho, M.D., and Dae Won Cho, M.D. Department of Orthopedic Surgery, Department of Laboratory Medicine*, School of Medicine, Catholic University of Daegu, Daegu; Department of Biochemistry, School of Medicine, Kyungbook National University, Daegu, Korea Purpose: This study was undertaken to compare the activity of beta-ig H3 (BigH3) and transforming growth factor (TGF)-beta on chondrogenesis by mesenchymal stem cells (MSCs). Materials and Methods: MSCs in human bone marrow aspirated from 20 healthy donors were isolated by density gradient Ficoll-hypaque separation and expanded in culture. MSC-alginate beads were prepared and incubated for 28 s in the presence of 0.5 or 10 ng/ml of TGF-beta 1, TGF-beta 1+TGF-beta 3 or BigH3. Cellular viability, total collagen and glycosaminoglycan (GAG) contents were measured and compared. SPSS version 9.0 was used for the statistical analysis. Results: TGF-beta 3 significantly enhanced cell viability in beads by 21 (p=0.029). No significant differences were found in terms of cell viability (p=0.197) or in total GAG content (p=0.253) between 10 ng/ml of TGF-beta 1+3 and 10 ng/ml of BigH3. Total collagen content was higher in the BigH3 added on 21 (p=0.041). Conclusion: The replacement of BigH3 instead of TGF-beta produced appropriate external signals indicating the chondrogenic differentiation of human bone marrow MSCs. Key Words: Beta-Ig H3, Chondrogenesis, Mesenchymal stem cells, Human bone marrow 통신저자 : 권굉우대구광역시남구대명동 대구가톨릭대학병원정형외과학교실 TEL: FAX: kwkwun@cu.ac.kr Address reprint requests to Koing Woo Kwun, M.D. Department of Orthopaedic Surgery, Daegu Catholic University Hospital, Daemyung-dong, Nam-gu, Daegu , Korea Tel: , Fax: kwkwun@cu.ac.kr 373

2 374 이태규ㆍ권굉우ㆍ감상경외 3 인 최근관절연골손상의치유현상을세포단위에서이해하고여기서얻어진지식을토대로치유를촉진하려는시도를하고있다. 골수에존재하는중배엽줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSC) 는뼈, 연골, 건, 근육, 인대, 지방조직등각종중배엽조직으로분화할수있는데 1,3,8,13,18), 연골조직으로분화유도시에는 MSC 가단층배양시다른계열의세포들로분화해버리는것을막기위하여삼차원배양을하여야하며, 첨가해야하는필수적인성장인자로, transforming growth factor (TGF) 가계중 TGF-beta 1과 TGF-beta 3이있다. 이외에도연골기질물질로콜라겐을첨가하여배양한경우연골모세포로의분화에더욱유리하였다는보고등이있다 1,8,18). Beta-Ig H3 (BigH3) 은 TGF-beta 유도유전자로 1992년처음분리되어상처의치유, 조직의발생, 재생에깊이연관되는것으로알려지고있으며, 콜라겐연관단백으로연골에서분리되고, integrin 1 1을통하여연골세포가콜라겐에부착되게하는세포부착분자로도알려져있다 6,12,15). 또한 BigH3은사지연골의성장판과대부분의연골발생에서특이적으로표현된다고알려져있으나 6,12), 이에관한많은연구에도불구하고아직 Big H3의생물학적역할에대해서는명확히밝혀져있지않으며더구나연골분화시에이의작용에관해서도알려져있지않다. 이에본연구에서는 BigH3이 MSC로부터연골분화유도에어떤작용을할것으로가정하여, 골수 MSC 를이용한연골분화유도에서가능한많은수의연골모세포를확보하기위한방법으로 TGF-beta를대체할수있는물질로의가능성을알아보고자하였다. 연구재료및방법 1. 재료본연구에사용된실험재료는동의를얻은 20명의건강한사람골수로부터 MSC 를분리하여사용하였다. 배지로는 Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM, DMEM/F-12) 에 ITS 2+ (Sigma Chemical Co. USA), dexamethasone (Gibco, USA), Heparin, TGF-beta 1, TGF-beta 3 (R&D, Peprotech, MN, USA) 혹은 BigH3을첨가하여사용하였다. 알긴산 (Sigma Chemical Co. USA) 과단클론항체들로 anti-cd34, anti- CD45 (Imunotech, Marcelli, France), anti-cd29, anti-cd105 (Serotec, Oxford, UK) 단클론항체를사용하였다. Sircol soluble collagen assay kit (biocolor, Northern Ireland) 을구입하여사용하였고, Big H3 단백은경북의대생화학교실이제공하였다. 2. 방법 1) 사람골수흡인액에서단핵세포의분리골수흡인액 10 ml씩을 heparin이첨가된시험관에무균의조작으로모아 density gradient centrifugation 방법으로골수의단핵세포를분리하였다. Ficoll-hypaque (pharmacia, USA) 2 ml을 15 ml 원심관에담고 DMEM 으로 2배희석한골수흡인액을이시험관위에조심스럽게중첩하여 1,550 rpm에서 15분간원심분리하여파스퇴르파이펫을이용해서단핵세포층만을모았다. 다른시험관에서세포를모아 DMEM 으로 2회세척하여 10% Fetal bovine serum (FBS)(Gibco, USA) 이포함된 DMEM (Gibco, USA) 배지에넣은뒤 trypan blue (Gibco, USA) 로염색하여, hemocytometer 로계수하였다 세포를플라스크에배지와함께넣은후37 배양기 (95% air, 5% CO 2 ) 에서배양했다. 이때 2-3 일에한번씩새로운배지를갈아주고약 4-5 일에계대배양하였다 18) (Fig. 1). 2) 단핵세포가 MSC 임을확인하기위한유세포분석유세포분석기를이용하여세포표지자분석을시행하였다. 즉, 단클론항체 anti-cd34, anti-cd45 (imunotech, france) 를이용하여조혈모세포가아님을확인하고, human integrin beta 1 subunit 에대한단클론항체인 anti-cd29와, endoglin에대한단클론항체로 stromal cell 에표현되는 type III TGF-beta 수용체인 anti-cd105 (serotec, USA) 를이용하여면역형광염색후유세포분석기로분석하였다 7,14). 3) 삼차원배양을위한알긴산 -MSC bead 제조및배양방법은단층배양된골수단핵세포를 0.05% trypsin (Sigma, USA) 을사용하여수획하고, 알긴산 1.2% 용액에혼합하였다. 이때세포수는 cells/ml로하였다. MSC 와알긴산용액을잘혼합한후멸균된주사기 (22G) 를이용해 102 mm CaCl 2 (Sigma, USA) 용액

Beta-Ig H3 을이용한사람골수중배엽줄기세포의연골분화유도 375 에한방울씩떨어뜨리면 bead 가형성되었다. 이 bead 를 3회세척하고 10% FBS가포함된 DMEM/F-12 배지로 37 incubator (95% air, 5% CO 2) 에서 4주간배양하였다. 이때배지의조건으로는저농도 (0.

3 Beta-Ig H3 을이용한사람골수중배엽줄기세포의연골분화유도 375 에한방울씩떨어뜨리면 bead 가형성되었다. 이 bead 를 3회세척하고 10% FBS가포함된 DMEM/F-12 배지로 37 incubator (95% air, 5% CO 2) 에서 4주간배양하였다. 이때배지의조건으로는저농도 (0.5 ng/ml) 의 TGF-beta 1만첨가하거나, 저농도의 TGF-beta 1 과 TGF-beta 3을첨가한조건그리고고농도 (10 ng/ ml) 의 TGF-beta 1과 TGF-beta 3을첨가한조건으로하였다. 그리고 TGF-beta 대신에 BigH3을 TGFbeta 와같은농도의저농도와고농도로첨가하여배양하면서일주일간격으로생존력, glycosaminoglycan (GAG) 함량, 콜라겐함량등을조사하였다 5,9). 4) 알긴산 -MSC bead의조직학적관찰삼차원배양의인공조직이연골조직인가를확인하기위하여 bead를 7일, 14일, 21일, 28일에각각 4% 포르말린으로고정한후 paraffin embedding하여 hematoxylin-eosin 염색하여관찰하였다. 5) 알긴산 -MSC bead의삼차원배양에서세포의생존력측정 (Methylthiazol tetrazolium, MTT assay) 성장인자들이 MSC 의생존력에미치는영향을보기위해삼차원배양하던 bead 에직접 MTT dye 를처리하였다. Bead에 MTT dye 를 10% 농도로첨가하고 37 incubator (95% air, 5% CO 2 ) 에4시간배양후용해완충액을이용하여 bead 를녹여 540 nm 파장에서흡광도를측정하였다 4). Bone marrow aspirates 6) 알긴산-연골세포 bead내총콜라겐함량측정 Sircoll reagent 를사용하여각 bead 의콜라겐함량을정량하였다. Bead는 Proteinase K (0.5 mg/ml) (Roche, Indianapolis, IN, USA) 를이용하여녹인후 sircoll reagent 를첨가하고 540 nm의파장에서흡광도를측정하였다 2). 삼차원배양된알긴산 bead 를인공연골조직으로간주하여이 bead 의수분을포함한무게 (wet weight, gwwt) 당측정되는콜라겐양 ( g/gwwt) 으로표현하였다. 7) 알긴산-연골세포 bead 내총단백당함량측정 (Glycosaminoglycan, GAG) DMMB (1,9-Dimethlymethylene blue chloride, Polysciences, USA) 시약을이용하여각 bead 의 GAG 함량을정량하였다. Bead는 Proteinase K (0.5 mg/ ml) (Roche, Indianapolis, IN, USA) 를이용하여녹인후 DMB solution 을첨가하고 540 nm의파장에서흡광도를측정하였으며 16) 총콜라겐함량측정에서와같이삼차원배양된알긴산 bead 를인공연골조직으로간주하여이 bead의수분을포함한무게 (wet weight, gwwt) 당측정되는단백당양 ( g/gwwt) 으로표현하였다. 8) 통계적분석모든결과는평균 ±SE 으로표시하였으며통계적분석은 SPSS version 9.0 (Chicago, IL, USA) 을이용하여배양시간과, TGF-beta family 를첨가한군과, Big H3 첨가군에대한반복측정 2요인분석을하였다. 통계학적유의수준은 p 값을 0.05 이하로하였다. Mononuclear cells, Density gradient centrifugation CD34, CD45, CD29, CD105 folw cytometry Mesenchymal stem cells Monolayer culture ±TGF beta 1, TGF beta 3 Alginate bead culture Pellet culture MTT assay Total Collagen and GAG assay Fig. 1. Overview of the experiments. Fig. 2. MSC-alginate bead, incubated for 14 s in the presence of 10 ng/ml of TGF-beta 1 and TGF-beta 3, shows chondroprogenitor cells in the lacuna (Hematoxylin-eosin staining 200).

4 376 이태규ㆍ권굉우ㆍ감상경외 3 인 TGFbeta1 TGFbeta TGFbeta1+3h 1.00 mtt 0.50 mtt A B Fig. 3. Viability of cells. (A) The addition of TGF-beta 3 to medium significantly enhanced cell viability in beads by 21 (p=0.029). (B) Addition of 10 ng/ml of BigH3 instead of 10 ng/ml of TGF-beta 1 and TGF-beta 3 to medium showed no significant difference in the viability of the cells in alginate beads (p=0.197) collagen ( g/gwwt) TGFbeta1+3 collagen ( g/gwwt) TGFbeta A B Fig. 4. Collagen content of MSC-alginate beads. (A) The total collagen content was higher in BigH3 during the early incubation period (by 21 p=0.041) than in the 10 ng/ml TGF- beta 1+TGF-beta 3. The total collagen content then increased in TGFbeta 1+3. (B) In medium containing 0.5 ng/ml of TGF-beta 1+TGF-beta 3 or BigH3, no significant difference was observed between the two s (p=0.292). 결과분리되는단핵세포수는골수 1 ml당평균 ( 범위 ; ) 이었다. 이를배양접시에접종하여 7-10일간배양후접시에부착하여자라는세포를 MSC 로간주하였을때골수 1 ml당분리되는 MSC 는평균 이었다. 분리후 100 mm 배양접시에서배양하면서 7일째와 21일째바닥에붙어자라는세포를모아단클론항체를이용한면역형광염색후유세포분석기로확인한결과배양 7일째, 조혈모세포의표지자인 CD34와 CD45 양성세포가각각 3.3%, 1.0% 이었다. 또한골수 MSC의표지자로알려진 CD29와 CD105에대해서는양성세포가각각 52%, 59% 이었으며, 배양 21일째는 CD34와 CD45는모두 0.3% 이었고, CD29, 97% CD 105, 98.3% 이었다. 이와같은결과로배양접시에부착하여자라는세포들은 MSC 임을알수있었다. 알긴산이형성하는 bead 내에서연골모세포가 lacuna 를형성하고자라고있는형태를각배양기간별로 hematoxylineosin 염색후광학현미경으로확인하였다 (Fig. 2). 세포의생존력검사결과는성장인자로써 TGF-beta 1 (0.5 ng/ml) 만첨가하여삼차원배양한경우와 TGF-

5 Beta-Ig H3 을이용한사람골수중배엽줄기세포의연골분화유도 Table 1. Summary of results Study items Results gag 150 No of isolated MSC Viability of cells Total GAG contents Total collagen contents average /1 ml of BM aspirate 10 >5 ng/ml (TGF-beta and BigH3) TGF-beta BigH3 TGF-beta BigH3 TGF-beta<BigH TGFbeta1+3h Fig. 5. GAG content of MSC-alginate beads incubated in the presence of a high concentration (10 ng/ml) of TGF-beta 1+TGFbeta 3 or BigH3, showed no significant difference between the two (p=0.253). beta 3 (0.5 ng/ml) 를첨가하였을경우통계적으로의미있게차이났다 (p=0.029). 즉, TGF-beta 3을첨가하였을때가 MTT assay 결과배양 7일에 94% 의생존력을유지하는데비하여 TGF-beta 1만첨가하였을때는 61% 의생존력을보여알긴산 bead 내에서세포의생존력은 TGF-beta 3을첨가하는것이연골모세포로분화유도시유리하게작용함을보여주었다 (Fig. 3A). 첨가해주는성장인자들의농도에따른차이조사에서는 TGF-beta 1과 TGF-beta 3, 그리고 BigH3 모두 10 ng/ml로첨가해주었을때가 0.5 ng/ml에비하여통계적으로의미있게생존력에유리하였다 (p=0.001, p=0.000). 즉, TGF-beta 10 ng/ml 일때는생존력이배양 21일째까지 58% 를유지하였으며, 배양 28일에도 53% 를유지하였으나 TGF-beta 0.5 ng/ml 일때는배양 28일에 40% 의생존력을나타내었다. 또한 Big H3도역시 10 ng/ml에서는배양 28일에 56% 의생존력을유지하였으나, 0.5 ng/ml에서는 38% 의생존력을유지하였다. TGF-beta 1과 TGF-beta 3을첨가한군과, BigH3 을첨가한군간의세포생존력에미치는영향비교에서는통계학적으로의미있는차이가없었다 (p=0.197)(fig. 3B). 즉, MSC 에서연골모세포로분화유도에있어서첨 가하는성장인자로 TGF-beta 대신연골의기질물질인콜라겐의부착단백질로알려진 BigH3 을첨가하여도세포의생존력유지에는차이가없었다. BM, bone marrow. 총콜라겐함량은배양시간에따라증가하여알긴산 bead 내의 MSC 가콜라겐을합성하여기질물질로축적하는성질을가진연골모세포로분화유도된것으로생각할수있었다. TGF-beta를 10 ng/ml로첨가한경우콜라겐함량은 262 g±15에서배양 28일에 g±24.17로배양기간이지날수록증가하였다. 반면 BigH3을 10 ng/ml로첨가한경우에는배양 14일째가 g±56.30으로최대였고배양 28 일에는 363 g ±26.39로오히려감소하였으나, 총배양기간동안의효과에서는 BigH3을첨가하였을때가 TGF-beta를첨가한것보다총콜라겐함량이높게나타났다 (p=0.041) (Fig. 4A). 저농도 (0.5 ng/ml) 일때는두군간에유의한차이가없었다 (p=0.292)(fig. 4B). 총단백당함량도배양시간에따라증가하였다. TGFbeta를 10 ng/ml로첨가하였을경우총단백당함량은 87 g/gwwt±2.4 에서배양기간에따라증가하여 28일째에 g/gwwt±1.44로최대였고, BigH3 을 10 ng/ml로첨가한경우는콜라겐함량과같이배양 14일에 g/gwwt±9.8 로최대이다가감소하였다. 하지만총단백당함량에서는 TGF-beta family와 BigH3을첨가한군에서의미있는차이는없었다 (p= 0.253)(Fig. 5)(Table 1). 고찰근골격계의발생과정에서골형성과정과, 골의재형성과정, 그리고골절된골의치유단계에서일어나는세포, 분자수준의일련의상황은거의동일한데 3,18), 연골의형성도마찬가지로미분화한 MSC 로부터각단계의세포들에서여러가지생리활성물질들의상호작용으로형성되는미세환경이결국은연골로의분화를결정할것이다. 연골분화유도에서가장중심적인역할을하는것으로알려진것이바로 TGF-beta인데 TGF-beta의각 isoform 들은다양한세포에서서로다른효과가있다고

6 378 이태규ㆍ권굉우ㆍ감상경외 3 인 알려져있다. MSC는이들 TGF-beta isoform들과반응하여다양한반응을나타낸다 10,11). 또한 GAG 와콜라겐함량에있어서도 TGF-beta 2나 TGF-beta 3은 GAG 함량을 TGF-beta 1보다 2배나더많이축적하며, 시기적으로도제2형콜라겐의경우훨씬배양조기에더많은양을축적시킨다고보고하였다 1). MSC 를원하는조직으로분화유도하기위해서는여러가지조건들이있는데그중특수한배양법이한가지중요한요소가된다. 연골세포는단층배양시섬유아세포등으로분화해버리므로이를방지하기위한삼차원배양에서 mannuronic acid 와 glucuronic acid 가연결된다당류인알긴산이연골세포의표현형유지에아주효과적이라고보고되어있다 5,9). 이때사용되는지지체로는알긴산이외에도키토산, poylactic acid 와 poyglycoic acid 의혼합체, 콜라겐겔등이있다. 또한최근에는 pellet 로배양하는방법도소개되고있다. 본연구에서는비교적구하기쉽고다루기쉬운알긴산을이용하였다. 본연구에서골수흡인액 1 ml 당 의단핵세포를확보할수있었으며이들로부터분리되는 MSC 는약 개이었다. 이러한결과는앞으로자가연골이식술등에서필요한세포수에대해준비해야하는골수흡인액의양을미리예측할수있게해줄것이다. 미분화된 MSC 는다양한세포부착분자들과성장인자들에대한수용체의표현으로특징지워지는데, 본연구에서는 CD29와 CD105를이용하였다. 본연구에서배양시간이지날수록 CD29양성세포수가늘어나는것으로보아이들이 BigH3 단백질의수용체로작용한것으로생각할수있다. 즉, 연골내골형성과정에서 integrin beta 1과의상호작용에의한신호전달로 FAK 의 tyrosine phosphorylation 과 paxillin의작용으로전연골의 condensation 을촉진한다는보고 17) 로보아본연구에서배지에첨가한 BigH3 단백은 MSC 표면의 integrin beta 1을통하여이들세포가이웃세포혹은기질에부착하는데도움을주며, 이로인한세포간의신호전달은 MSC 에서연골로분화를자극할수있었을것으로생각한다. 연골모세포의생존력관찰에서본연구에서는이들알긴산 bead를녹여서세포를분리후 MTT assay 하였을때의세포수의손실등을고려하여 bead 를녹이지않고, 직접알긴산 bead에 MTT assay 했다는점이독창적이 며, 알긴산 bead에직접 MTT dye 를처리하여 bead 내에서살아있는즉, 미토콘드리아의활성도가있는세포수를직접확인하는방법으로선행연구들에서사용한방법인 DNA 양을측정하여세포수를추정하는것보다는세포의생존력을정확히반영한다고볼수있다 1,4,8,18). BigH3의대조군을결정하기위해배지에첨가해주는 TGF-beta 성장인자들의효과를비교조사하였으며그결과 TGF-beta 가계중 beta 3이연골분화유도에서가장효과적이라는선행연구의결과 1) 와일치하였기에 TGF-beta 3이포함된군과비교연구하였다. 본연구에서알아보고자하였던 BigH3 10 ng/ml를배지에첨가하였을때와 TGF-beta 1 10 ng/ml+tgfbeta 3 10 ng/ml를첨가하였을때연골모세포의생존력은배양 28일까지통계학적으로차이가없었다 (Fig. 3B). 이결과로연골의기질물질인콜라겐과관련이깊은단백질로알려져온 BigH3을 TGF-beta 대신첨가하여도알긴산을이용한 MSC 에서연골모세포로분화유도에있어서세포의생존력유지에는차이가없음을확인하였다. 이는이제까지알려지지않은결과로본연구의결과는앞으로이와같은연구를수행하는데있어서수입품인 TGF-beta를첨가하지않고도수행할수있다는점에서그의의가크다하겠다. 알긴산 bead 의총콜라겐양과단백당함량에서 TGFbeta 를첨가한경우는배양기간이지속됨에따라꾸준히증가하는것은 TGF-beta가지속적으로콜라겐과단백당합성에중요한정보를제공하는것을암시하며, Big H3을첨가한경우조기에증가하고점차감소하는것은 BigH3 이콜라겐부착단백질이며, 조기에 MSC 에작용하고어느정도연골모세포로분화하면더이상이들세포에작용하지않는 BigH3 단백의특이한성질로해석된다. 그러므로향후연골모세포로분화유도되는세포에나타나는 BigH3의수용체에대한연구도흥미로운과제가될것이다. 또한본연구에서는총콜라겐함량과단백당의함량을측정하여 MSC 가연골조직으로분화되는것으로보았지만관절연골의탄성을담당하는초자연골의대표적인기질물질은제2형콜라겐이므로이를정량하는것이관절연골을형성하는연골모세포로의분화를좀더반영할수있을것이다. 나아가서는이와같은연구에서는연골모세포로분화유도시여러가지기질단백의유전자발현등을시간에따라정량하는연구등이

7 Beta-Ig H3 을이용한사람골수중배엽줄기세포의연골분화유도 379 필요할것으로생각한다. 결론사람골수의단핵세포중중배엽줄기세포로부터알긴산을지지체로한삼차원배양법으로이들중배엽세포들을연골모세포로성공적으로분화유도하였다. 28일간배양하는동안 MSC 는알긴산 bead 내에서훌륭한생존력을보여주었으며, 연골모세포로의분화를확인하기위해시행한총콜라겐함량과단백당함량측정에서배양 14일이후부터연골기질물질이증가함을확인하였다. 이때의배지에첨가하는중요한성장인자인 TGF-beta 3 대신국내에서생산되는 BigH3을대치하여배양하여도세포의생존력과단백당함량에는차이가없음을확인하였다. 줄기세포의이용에대한연구가활발한이시점에서이와같은성장인자대체물질을찾았다는데본연구의의의가있다하겠으며앞으로이에관한더많은연구가필요할것으로생각한다. 참고문헌 1. Barry F, Boyton RE, Liu B and Murphy M: Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differemtiation-dependent gene expression of matrix components. Exp Cell Res, 268: , Brown AN, Kim BS, Alsberg E and Mooney DJ: Combining chondrocytes and smooth muscle cells to engineer hybrid soft tissue constructs. Tissue Eng, 6: , Bruder SP, Fink DJ and Caplan AI: Mesenchymal stem cells in bone development, bone repair, and skeletal regeneration therapy. J Cell Biochem, 56: , Denizot F and Lang R: Rapid colorimetric assay for cell growth and survival modification to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Method, 89: , D Souza AL, Masuda K, Otten LM, Nishida Y, Knudson W and Thornar E: Differential effects of interleukin-1 on hyaluonan and proteoglycan metabolism in two compartments of the matrix formed by articular chondrocytes maintained in alginate. Arch Biochem Biophysics, 374: 59-65, Hashimoto K, Noshiro M, Ohno S, et al: Characterization of a cartilage-derived 66-kDa protein (RGD-CAP/beta ig-h3) that binds to collagen. Biochim Biophys Acta, 1355: , Haynesworth SE, Baber MA and Caplan AI: Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies. Bone, 13: 69-80, Ma HL, Hung SC, Lin SY, Chen YL and Lo WH: Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginated beads. J Biomed Mat Res, 64: , Masuda K, Sah RL, Hejna MJ and Thonar EJ: A novel two-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by mature bovine chondrocytes: the alginate-recovered-chondrocyte (ARC) method. J Orthop Res, 21: , Merwin JR, Newman W, Beall LD, Tucker A and Madri J: Vascular cells respond differentially to transforming growth factors beta 1 and beta 2 in vitro. Am J Pathol, 138: 37-51, Merwin JR, Roberts A, Kondaiah P, Tucker A and Madri J: Vascular cell responses to TGF-beta 3 mimic those of TGF-beta 1 in vitro. Growth Factors, 5: , Ohno S, Noshiro M, Makihira S, et al: RGD-CAP (beta ig-h3) enhances the spreading of chondrocytes and fibroblasts via integrin alpha(1)beta(1). Biochim Biophys Acta, 1451: , Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 284: , Robledo MM, Hidalgo A, Lastres P, et al: Characterization of TGF-beta 1-binding proteins in human bone marrow stromal cells. Br J Haematol, 93: , Skonier J, Neubauer M, Madisen L, Bennett K, Plowman GD and Purchio AF: cdna cloning and sequence analysis of beta ig-h3, a novel gene induced in a human adenocarcinoma cell line after treatment with transforming growth factor-beta. DNA Cell Biol, 11: , Templetone DM: The basis and applicability of the dimethylmethylene blue binding assay for sulfated glycasaminoglycans. Connective Tissue Research, 17: 23-32, Vortkamp A, Lee K, Lanske B, Segre GV, Kronenberg HM and Tabin CJ: Regulation of rate of cartilage differentiation by Indian hedgehog and PTH-related protein. Science, 273: , Yoo JU, Barthtel TS, Nishimura K, et al: The chondrogenic potential of human bone-marrow-derived mesenchymal progenitor cells. J Bone Joint Surg, 80-A: , 1998.

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( )Kjhps043.hwp Difference of Fistula Maturation Degree and Physical Property by the Types of Tube Material: An Experimental Study Sang Koo Kang, M.D. 1, Hee Chul Yu, M.D. 1,4, Woo Sung Moon, M.D. 2,4, Ju Hyoung Lee,