발간등록번호 NIER-SP OECD 화학물질평가를위한독성연구 2012 년 11 월

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1 발간등록번호 NIER-SP OECD 화학물질평가를위한독성연구 2012 년 11 월

2 연구용역사업보고서표지 발간등록번호 NIER-SP OECD 화학물질평가를위한독성연구사업 한국화학융합시험연구원 1) 홍정섭 1), 박명규 1), 서흥식 1), 박학수 1), 김강현 1), 성낙원 1), 김민석 1), 이진희 1), 조희금 1), 임정현 1), 오동민 1), 김선주 1), 신성섭 1), 김윤주 1), 정정욱 1), 이택진 1), 조기연 1), 김준호 1), 김건용 1), 백종기 1) Toxicity Study for Evaluation of OECD Chemical Hong Jeong-sup 1), Park Myeng-kyu 1), Seo Heung-sik 1), Park Hark-soo 1), Kim Kang-hyun 1), Seong Nak-won 1), Kim Min-seok 1), Lee Jin-hee 1), Cho Hui-gum 1), Lim Jeong-hyeon 1), Oh Dong-min 1), Kim Seon-ju 1), Shin Sung-sup 1), Kim Yoon-joo 1), Jung Jeong-uk 1), Lee Taek-jin 1), Jo Ki-yeon 1), Kim Jun-ho 1), Kim Geon-yong 1), Baek Jong-ki 1) Health Care Research Laboratory, KTR 1) 2012 국립환경과학원

3 목 차 Abstract Ⅰ. 세부시험국문요약문 1 1. Ammonium carbonate의 28일반복경구투여독성시험 (KG ) 1 2. L-Glutamic acid의 28일반복경구투여독성시험 (KG ) 3 3. Ammonium carbonate의생식 / 발생독성스크리닝시험 (KG ) 5 4. L-Glutamic acid의생식 / 발생독성스크리닝시험 (KG ) 6 Ⅱ. 서론 7 Ⅲ. 연구내용및방법 9 Ⅳ. 연구결과및고찰 일반독성시험 (28일반복투여독성평가연구 ) Ammonium carbonate의 7일반복경구투여용량결정시험 (TBH-786) Ammonium carbonate의 28일반복경구투여독성시험 (KG ) L-Glutamic acid의 7일반복경구투여용량결정시험 (TBH-787) L-Glutamic acid의 28일반복경구투여독성시험 (KG ) 특수독성시험 ( 생식발생독성시험 ) Ammonium carbonate의생식 / 발생독성스크리닝시험용량결정시험 (TBH-808) Ammonium carbonate의생식 / 발생독성스크리닝시험 (KG ) L-Glutamic acid의생식 / 발생독성스크리닝시험용량결정시험 (TBH-809) L-Glutamic acid의생식 / 발생독성스크리닝시험 (KG ) 192 Ⅴ. 결론 212 Ⅵ. 참고문헌 214

4 Abstract The Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) agreed with other member countries in 1990 to undertake an investigation of existing chemicals on the market without hazard information. As part of the investigation, Screening Information Data Sets (SIDS) programme was launched to complete SIDS reports on toxicity for High Production Volume (HPV) chemicals. They gave priority to HPV chemicals in collecting data for an initial assessment of hazard. The programme has been implemented cooperatively in the Republic of Korea, as well as in other countries. Ammonium carbonate and L-glutamic acid are produced at levels greater than 1,000 tonnes per year internationally. Ammonium carbonate is mainly used as a leavening agent in traditional recipes, the main component of smelling salts, emetic and an active ingredient intended to help relieve symptoms of bronchitis. L-glutamic acid is the most abundant excitatory neurotransmitter in the vertebrate nervous system and also serves as the precursor for synthesis of the inhibitory GABA in GABA-ergic neurons and used for a flavor enhancer, nutrient and plant growth. Although oral LD50 values of L-glutamic acid in rats have been reported as above 5,110 mg/kg bw/day (ECHA), their toxicological properties are little known. Oral toxicity of ammonium carbonate and L-glutamic acid in male and female Sprague-Dawley rats was profiled in 28-day repeated dose toxicity study and a screening test for reproduction/developmental toxicity study conducted under OECD test guidelines. Daily administration of ammonium carbonate did not show any adverse effect at 0, 31.25, 125 and 500 mg/kg bw/day in 28-day repeated dose toxicity study and 0, 250, 500 and 1,000 mg/kg bw/day in reproduction/developmental toxicity study. In addition, daily administration of L-glutamic acid was found to show no adverse effects at 0, 62.5, 250 and 1000 mg/kg bw/day in 28-day repeated dose toxicity study and 0, 250, 500 and 1,000 mg/kg bw/day in reproduction/developmental toxicity study. From these results, the No Observed Adverse Effect Level (NOAEL) for 28-day repeated dose toxicity study of ammonium carbonate was considered to be above 500 mg/kg bw/day in both sexes. In reproduction/developmental toxicity study, the NOAEL

5 was considered to be above 1000 mg/kg bw/day. The NOAEL for 28-day repeated dose toxicity study and reproduction/developmental toxicity study of L-glutamic acid was considered to be above 1000 mg/kg bw/day.

6 Ⅰ. 세부시험국문요약문 1. Ammonium carbonate 의 28 일반복경구투여독성시험 (KG ) Ammonium carbonate의 28일반복경구투여에의한전신독성영향과무영향관찰량을조사하기위하여 31.25, 125 및 500 mg/kg bw/day의투여용량을설정하여 SD 랫드 [ 군당 5마리, 회복군 ( 대조군및 500 mg/kg bw/day 투여군 ) 5마리 ] 에 28일간경구투여하였고, 14일간회복성을관찰한결과는다음과같다. - 시험기간동안암 수모든시험군에서시험물질투여와관련된사망동물은관찰되 지않았고, 일반증상관찰, 상세관찰, 체중변화, 감각반응평가및악력측정결과이상 소견은관찰되지않았다. - 운동량측정결과, 측정후 0 ~ 10 분간수컷 및 500 mg/kg bw/day 투여군에 서대조군에비해운동량이유의하게증가하였고, 측정후 40 ~ 50 분간 125 mg/kg bw/day 투여군에서대조군에비해유의하게감소하였다. - 사료섭취량측정결과, 투여 1주차에수컷 mg/kg bw/day 투여군에서대조군에비해사료섭취량이유의하게감소하였고, 암컷 및 125 mg/kg bw/day 투여군에서대조군에비해유의하게증가하였다. 투여 2주차에수컷 mg/kg bw/day 투여군에서대조군에비해유의하게감소하였고, 투여 3주차에는암컷시험물질투여군이대조군에비해유의하게증가하였다. 투여 4주차에암컷 및 500 mg/kg bw/day 투여군에서대조군에비해유의하게증가하였고, 회복 1주차에는수컷 500 mg/kg bw/day 투여군에서대조군에비해유의하게증가하였다. - 뇨및안과학적검사결과, 시험물질에의한독성학적인변화는관찰되지않았다. - 부검결과, 투여종료시수컷 mg/kg bw/day 투여군에서간우측외측엽및전엽의횡격막유착과우측외측엽의노란색색변화 1례가관찰되었다. 암컷에서는대조군의비장종대 1례, mg/kg bw/day 투여군에서간양측외엽의적색변화 1례와 125 mg/kg bw/day 투여군에서비장종대및어두운색변화 1례가관찰되었다. 또한회복기간종료시에는수컷대조군에서폐우측외측엽에짙은적색변화 1례가관찰되었다. - 장기중량측정결과, 절대장기중량에서회복기간종료시에암컷 500 mg/kg bw/day - 1 -

7 투여군에서난소와뇌하수체가대조군에비해유의하게증가하였다. 또한상대장기중 량에서회복기간종료시암컷 500 mg/kg bw/day 투여군에서뇌하수체는대조군에비 해유의하게증가하였고, 폐는유의하게감소하였다. - 혈액학적검사결과, 회복기간종료시에수컷 500 mg/kg bw/day 투여군에서산호성백혈구 (eosinophil) 와호중구 (neutrophil) 의백분율이대조군에비해유의하게증가하였고, 림프구 (lymphocyte) 의백분율은유의하게감소하였다. 또한암컷 500 mg/kg bw/day 투여군에서큰미염색성세포 (large unstained cell) 는대조군에비해유의하게증가하였다. - 혈액생화학적검사결과, 회복기간종료시에수컷 500 mg/kg bw/day 투여군에서칼 륨 (potassium) 이대조군에비해유의하게감소하였고, 암컷 500 mg/kg bw/day 투여군에 서염소 (chloride) 는대조군에비해유의하게증가하였다. - 주요장기에대한조직병리학적검사결과, 시험물질과관련된병변은관찰되지않았 다. 위의관찰된시험결과는시험물질에의한영향이아니며, 독성학적으로유의성이없었 다. 이상의결과로부터 Ammonium carbonate를 31.25, 125 및 500 mg/kg bw/day의용량으로 28일간반복경구투여하였을때 500 mg/kg bw/day의투여용량까지유의할만한독성학적인변화가관찰되지않았으므로, 무영향관찰량 (NOAEL) 은암 수모두 500 mg/kg bw/day 이상으로판단된다

8 2. L-Glutamic acid 의 28 일반복경구투여독성시험 (KG ) 시험물질인 L-Glutamic acid의 28일반복경구투여에의한전신독성영향과무영향관찰량을조사하기위하여 62.5, 250 및 1000 mg/kg bw/day의투여용량을설정하여 SD 랫드 [ 군당 5마리, 회복군 ( 대조군및 1000 mg/kg bw/day 투여군 ) 5마리 ] 에 28일간경구투여하였고, 14일간회복성을관찰한결과는다음과같다. - 시험기간동안암 수모든시험군에서시험물질과관련된사망동물은관찰되지않 았으며, 일반증상관찰, 상세관찰, 감각반응평가, 악력측정및운동량측정, 체중변화 관찰결과이상소견은관찰되지않았다. - 사료섭취량측정결과, 투여 1주차에암컷 250 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게증가하였고, 투여 2주차및 3주차에서수컷 250 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게증가하였다. 또한회복기간 1주차에암컷 1000 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게감소하였고, 회복기간 2주차에는수컷 1000 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게증가한반면, 암컷 1000 mg/kg bw/day 투여군은유의하게감소하였다. - 뇨및안과학적검사결과, 시험물질에의한독성학적인변화는관찰되지않았다. - 부검소견결과, 투여종료시암컷 62.5 mg/kg bw/day 투여군에서폐좌측엽의광범위한짙은적색변화와우측엽의짙은적색변화 1례암컷 1000 mg/kg bw/day 투여군에서악하림프절의종대 1례가관찰되었다. 또한회복기간종료시에수컷대조군에서기관내거품성물질과부풀려진폐 1례, 암컷대조군에서간우측엽가장자리의짙은적색변화 1례와암컷 1000 mg/kg bw/day 투여군에서기관내거품성물질과부풀려진폐, 간우측엽의짙은적색변화 1례가관찰되었다. - 장기중량측정결과, 상대장기중량에서투여종료시수컷 250 mg/kg bw/day 투여군의전립선과정낭중량의합이대조군에비해유의하게감소하였다. 또한회복기간종료시에수컷 1000 mg/kg bw/day 투여군의폐중량이대조군에비해유의하게감소하였다. - 혈액학적검사결과, 투여종료시에수컷 250 mg/kg bw/day 투여군의혈색소량 (Hb) 과암컷 62.5 mg/kg bw/day 투여군및 250 mg/kg bw/day 투여군의총적혈구수 (RBC) 가대조군에비해유의하게증가하였다. 또한회복기간종료시암컷 1000 mg/kg bw/day 투여군의평균적혈구용적 (MCV), 평균적혈구헤모글로빈량 (MCH), 망상적혈구의수와비 - 3 -

9 율 (Reticulocyte) 및부분활성트롬보플라스틴시간 (APTT) 이대조군에비해유의하게감소 하였다. - 혈액생화학적검사결과, 투여종료시암컷 250 mg/kg bw/day 투여군의총빌리루빈 (total bilirubin) 이대조군에비해유의하게증가하였다. 또한회복기간종료시수컷 1000 mg/kg bw/day 투여군의총빌리루빈 (total bilirubin), 아스파테이트아미노기전이효소 (AST), 칼슘 (calcium) 및크레아틴키나아제 (creatine kinase) 가대조군에비해유의하게증가하였다. 암컷 1000 mg/kg bw/day 투여군의경우혈액요소질소 (blood urea nitrogen) 는대조군에비해유의하게증가하였고, 트리글리세라이드 (triglycerides), 혈당 (glucose), 칼슘 (calcium) 및총담즙산 (Total bile acid) 은대조군에비해유의하게감소하였다. - 주요장기에대한조직병리학적검사결과, 시험물질과관련된병변은관찰되지않았 다. 위의관찰된시험결과는시험물질에의한영향이아니며, 독성학적으로유의성이없었 다. 이상의결과로부터 L-Glutamic acid를 62.5, 250 및 1000 mg/kg bw/day의용량으로 28일간반복경구투여하였을때 1000 mg/kg bw/day의투여용량까지유의할만한독성학적인변화가관찰되지않았으므로, 무영향관찰량 (NOAEL) 은암 수모두 1000 mg/kg bw/day 이상으로판단된다

10 3. Ammonium carbonate 의생식 / 발생독성스크리닝시험 (KG ) Ammonium carbonate를임신전, 후및포육기간중랫드에노출시켰을때생식선기능 (gonadal function), 교미행동 (mating behavior), 수태 (conception), 태자의발생및분만과같은생식능을평가하기위하여실시하였으며, 각군당임신이확인된 10마리이상의랫드를사용하였다. Ammonium carbonate를이용한용량결정시험결과 1000 mg/kg bw/day에서유의한독성학적영향이발현되지않았으므로본시험에서는 1000 mg/kg bw/day 투여군을고용량으로설정하고, 공비 2로대조군을제외한 3개의시험물질투여군 (G2 ~ ) 을각각설정하였다. 시험수행중획득한기초자료를분석한결과는아래와같다. - 일반증상평가 친세대 (P) 에대한일반증상, 체중, 사료섭취량, 부검소견및조직병리학적소견을분 석한결과, 시험물질에기인한소견은관찰되지않았다. - 생식능력평가 친세대 (P) 에대한성주기변화, 교미율, 수태율및임신율을분석한결과, 시험물질에 기인한소견은관찰되지않았다. - F1 차세대에대한평가친세대 (P) 임신모동물의임신기간, 황체수, 착상수, 착상전배자사망률, 착상후배자사망률, 산자수, 성비, 생후 4일째생존율, 생후 0일과 4일째생존동물의체중및육안소견을분석한결과, 시험물질에기인한소견은관찰되지않았다. 이상의결과를종합해볼때, Ammonium carbonate를임신전, 후및포육기간 (4일) 중랫드에경구반복투여하였을때친세대 (P) 와차세대 (F1) 에미치는영향은없는것으로판단된다. 이에본시험조건하에서 Ammonium carbonate의무영향관찰량 (NOAEL) 은친세대 (P) 와차세대 (F1) 에있어 1000 mg/kg bw/day 이상으로사료된다

11 4. L-Glutamic acid 의생식 / 발생독성스크리닝시험 (KG ) L-Glutamic acid를임신전, 후및포육기간중랫드에노출시켰을때생식선기능 (gonadal function), 교미행동 (mating behavior), 수태 (conception), 태자의발생및분만과같은생식능을평가하기위하여실시하였으며, 각군당임신이확인된 10마리이상의랫드를사용하였다. L-Glutamic acid를이용한용량결정시험결과 1000 mg/kg bw/day에서유의할만한수준의독성학적영향이발현되지않았으므로본시험에서는 1000 mg/kg bw/day 투여군을고용량으로설정하고, 공비 2로대조군을제외한 3개의시험물질투여군 (G2 ~ ) 을각각설정하였다. 시험수행중획득한기초자료를분석한결과는아래와같다. - 일반증상평가 친세대 (P) 에대한일반증상, 체중, 사료섭취량, 부검소견및조직병리학적소견을분 석한결과, 시험물질에기인한소견은관찰되지않았다. - 생식능력평가 친세대 (P) 에대한성주기변화, 교미율, 수태율및임신율을분석한결과, 시험물질에 기인한소견은관찰되지않았다. - F1 차세대에대한평가친세대 (P) 임신모동물의임신기간, 황체수, 착상수, 착상전배자사망률, 착상후배자사망률, 산자수, 성비, 생후 4일째생존율, 생후 0일과 4일째생존동물의체중및육안소견을분석한결과, 시험물질에기인한소견은관찰되지않았다. 이상의결과를종합해볼때, L-Glutamic acid를임신전, 후및포육기간 (4일) 중랫드에경구반복투여하였을때친세대 (P) 와차세대 (F1) 에미치는영향은없는것으로판단된다. 이에본시험조건에의한 L-Glutamic acid의무영향관찰량 (NOAEL) 은친세대 (P) 와차세대 (F1) 에있어 1000 mg/kg bw/day 이상으로사료된다

12 Ⅱ. 서론 1. 연구목적 화학물질은우리의생활필수품뿐만아니라반도체, 전기전자, 자동차및항공우주산업을비롯하여최근에는각종첨단산업에서도반드시필요한원료또는기초소재로사용되고있다. 그러나화학물질이과학기술의눈부신발달과더불어인류사회에획기적인편의를제공하는반면에그유해성으로인하여인체건강과환경을해치는주원인으로지목되고있다. 이와같이화학물질의위해성에대한관심이증대되면서, 화학물질로부터의인체노출사고가사회적으로주요이슈가되고있다. 또한화학물질유통량은 2010 년 백만톤으로 2002 년도 백만톤대비 48.1% 증 가하였으며, 석유계화학물질이전체유통량의 48.8% 를차지하였다 (2010 년환경부, 화 학물질유통량조사최종보고서 ). 이와같이국내화학산업의영역이더욱커지고화학물질배출량과유통량이지속적으로증가함에따라환경사고의발생과유해화학물질에대한노출위험성이더욱높아지고있다. 국제적으로 UN은지속가능한화학물질관리를달성하기위해 국제적화학물질관리에대한전략적접근 (SAICM) 을채택하여유해물질의대체물질개발, 특정유해물질의사용제한ㆍ금지등을개별국가가이행하도록하고있다. EU의경우신화학물질관리제도 (REACH) 를도입하여신규물질은물론이고기존화학물질과완제품 (Article) 에대해서도제조ㆍ수입자가위해성을평가하여등록하도록의무화하는등화학물질관리에관한국제적규제가강화되고있는추세이다. 이에우리나라도화학물질의위해성으로부터국민건강과생태계보호를정책목표로삼고수용체중심의화 - 7 -

13 학물질관리, 위해성 (Risk) 에근거한화학물질전생애 (Life-cycle) 통합관리를위해다양한정책을추진해나가고있으며, 또한 OECD 회원국으로서의역할을수행하고있다. OECD는 1987년부터연간 1,000톤이상생산 수입 사용하는대량생산화학물질을대상으로노출, 거동, 생태독성및인체독성을평가해왔으며, 1,482종에대한평가를완료하여 OECD website 등을통해전세계에공유하고있다. 우리나라는 99년부터참여하여그간벤조일퍼록사이드등 36종의분담물질중 25종에대한평가를완료하였다. OECD/SIDS 물질선정기준에따라 OECD Test Guideline에의한독성시험을실시하고자한다

14 Ⅲ. 연구내용및방법 1. 과업내용 - OECD TG 407, 421( 반복투여독성, 생식발생독성 ) 에근거하여독성평가를수행하고 OECD CoCAM(Cooperative Chemical Assessment Meeting, 협력적화학물질평가회의 ) 보고서작성을위한기초자료생산 2. 연구방법 - 한국화학융합시험연구원에서실시하는각 GLP시험항목의연구진행과정은다음과같음 1.1. GLP 준수 - 화학물질유해성시험연구기관지정등에관한규정 ( 국립환경과학원고시제 호, ) 및 OECD GLP (Principles of Good Laboratory and Compliance Monitoring) 규정을준수하며, 본계획서에명시된사항중상기기준에규정되지않은경우는한국화학융합시험연구원헬스케어연구소표준작업수순서 - 9 -

15 (SOPs) 에따른다 신뢰성보증 - 한국화학융합시험연구원신뢰성보증부서 (Quality Assurance Unit) 는시험계획서의점검및시험중정기적으로시험의기록과검체의보관에관한점검을수행하며, 기초자료를토대로보고서에대한점검을수행 동물윤리 - 한국화학융합시험연구원의실험동물의사용과관리에관한규정 ( 동 물윤리위원회개정고시 ) 을준수하여실시. 3. 연구내용 년도 OECD 화학물질평가를위한독성연구대상물질 (2 종 ) 에대한독성시험 ( 반복투여독성, 생식발생독성 ) 1.1. Ammonium carbonate(cas No : ) 에대한반복투여독성및생식발 생독성시험 : OECD T07 및 OECD T21 에따라수행 1.2. L-Glutamic acid(cas No : ) 에대한반복투여독성및생식발생독성 시험 : OECD T07 및 OECD T21 에따라수행

16 Ⅳ. 연구결과및고찰 1. 일반독성시험 (28 일반복투여독성평가연구 ) 1.1. Ammonium carbonate 의 7 일반복경구투여용량결정시험 (TBH-786) (1) 시험방법 1) 군구성시험의뢰자가제공한독성자료를참고하여 500 mg/kg bw/day을고용량으로하고, 250 mg/kg bw/day을중용량, 125 mg/kg bw/day을저용량으로설정하여예비시험을실시하였다. 용량결정시험에서는예비시험의결과와 OECD Test guideline 상의한계투여용량을참고하여 1000 mg/kg bw/day을고용량으로하고, 500 mg/kg bw/day을중용량, 250 mg/kg bw/day을저용량으로설정하였다. 대조군으로는멸균증류수를투여하는부형제대조군을설정하였다. ( 예비시험 ) 시험군시험물질성동물수동물번호 1 군 () ( 대조군 ) 2 군 (G2) ( 저용량군 ) 3 군 (G3) ( 중용량군 ) 4 군 () ( 고용량군 ) 투여량 (mg/kg) 투여액량 (ml/kg) 멸균증류수수컷 ~ 암컷 ~ 2102 Ammonium carbonate 수컷 ~ 1202 암컷 ~ 2202 수컷 ~ 1302 암컷 ~ 2302 수컷 ~ 1402 암컷 ~

17 ( 용량결정시험 ) 시험군시험물질성동물수동물번호 1 군 () ( 대조군 ) 2 군 (G2) ( 저용량군 ) 3 군 (G3) ( 중용량군 ) 4 군 () ( 고용량군 ) 투여량 (mg/kg) 투여액량 (ml/kg) 멸균증류수수컷 ~ 암컷 ~ 2105 Ammonium carbonate 수컷 ~ 1205 암컷 ~ 2205 수컷 ~ 1305 암컷 ~ 2305 수컷 ~ 1405 암컷 ~ ) 관찰항목 1 일반증상관찰전동물에대하여시험기간동안당일투여후매일 1회이상씩일반증상의변화, 독성증상및사망의유무를관찰하였다. ( 예비시험은일반증상관찰만실시하였다.) 2 체중측정 체중은입수시, 군분리시를포함하여투여 4 일차및투여종료일에측정하였다. 3 부검실험종료시생존동물은 isoflurane을이용하여심마취시켜채혈및안락사시킨다음체표및모든체공 (external surface & all orifices), 두개강 (cranial cavity), 흉강및복강의모든장기 (thoracic and abdominal & their contents) 에대하여육안적검사를실시하였다. 4 장기중량측정모든동물에대해부검시육안적검사를실시한후에간 (liver), 신장 (kidney), 비장 (spleen), 부신 (adrenal gland), 고환 (testis), 난소 (ovary), 뇌 (brain), 뇌하수체 (pituitary gland), 폐 (lung), 심장 (heart), 흉선 (thymus), 자궁 (uterus), 전립선 (prostate), 부고환 (epididymis) 및악하선 (submaxillary gland) 에대한습중량을측정하였고, 절식체중에대한상대장기중량비를측정하였다. 좌우가있는장기는무게를측정한후합하였다. 5 혈액학적검사

18 채혈전 18시간이상절식시킨동물을 isoflurane으로마취한다음복대동맥으로부터채혈한혈액중약 3 ml을 EDTA가함유된 CBC bottle(edta 2K, BD vacutainer) 에취하여자동혈구측정기 (ADVIA 120E, Seimens, U.S.A.) 로다음의항목들을측정하였다. 혈액응고시간의측정은채혈후 vacutainer(9ncsodium citrate 3.2%, BD vacutainer) 에취하여원심분리 (3000 rpm, 10분 ) 를통해얻은혈장을자동응고시간측정기 (ACL 7000, Instrumentation Laboratory, U.S.A.) 를이용하여측정하였다. 6 혈액생화학적검사채혈한혈액중혈액학적검사와혈액응고검사에사용된혈액을제외한나머지의혈액을실온에서응고시킨다음원심분리 (3000 rpm, 10분 ) 하여혈청을취한후자동혈청분석기 (HITACHI 7060, HITACHI, Japan) 와전해질분석기 (EasyLyte PLUS Na/K/Cl Analyzer, MEDICA, U.S.A.) 를이용하여다음과같이측정하였다. 7 조직병리학적검사모든동물에대해서간 (liver), 비장 (spleen), 신장 (kidney), 심장 (heart), 폐 (lung) 및위 (stomach) 를적출하여 10% 중성완충포르말린용액 (neutral buffer formalin) 에고정한후, 대조군과 1000 mg/kg bw/day 투여군에서조직병리학적검사를실시하였다. 부검시이상소견이관찰된 500 mg/kg bw/day 투여군의장기에대해서도조직병리학적검사를실시하였다

19 (2) 시험결과 1) 예비시험의일반증상관찰결과, 암 수시험군에서시험물질과관련된사망과이상증상은관찰되지않았다. 용량결정시험기간동안, 수컷 1000 mg/kg bw/day 투여군의 2 례 (20%, 동물번호 :1401, 1402) 에서시험물질투여 1일차에적색유루 ( 경도 ), 혈뇨 ( 많음 ), 혈변및복와위등의증상이관찰되었고, 1례 (10%, 동물번호 :1401) 는투여 30분이내에사망하였으며, 나머지 1례 ( 동물번호 :1402) 는투여 2일차부터정상으로회복하였다. 그외시험기간동안암 수모든시험군에서시험물질투여와관련된사망과이상증상을보인동물은관찰되지않았다. (Table 1) 2) 체중변화관찰결과, 암 수시험물질투여군에서대조군과비교하여유의성있는 변화는관찰되지않았다. (Table 2) 3) 사망동물 ( 동물번호 :1401) 의부검결과, 대장및소장의부종성, 암적색변화 (edamatous and dark red color change in large and small intestine), 대장의충혈 (hyperemia in large intestine), 정낭및전립선왜소 (reduced seminal vesicle and prostate) 등이관찰되었다. 생존동물의부검결과, 수컷대조군의 1례 ( 동물번호 :1101) 에서우측신장의낭포 (cyst in right kidney) 가관찰되었고, 암컷 250 mg/kg bw/day 투여군의 2례 ( 동물번호 :2201, 2205) 에서좌측신장의낭포 (cyst in left kidney), 1례 ( 동물번호 :2202) 에서우측신장의주변조직과유착 (adhesion to surrounding tissue of right kidney) 이관찰되었다. 그외암 수모든시험군에서특이한이상소견은관찰되지않았다. (Table 3) 4) 장기중량측정결과, 암 수시험물질투여군에서대조군과비교하여유의성있는 변화는관찰되지않았다. (Table 4 ~ 5) 5) 혈액학적검사결과, 수컷 1000 mg/kg bw/day 투여군에서망상적혈구 (reticulocyte) 수및비율이대조군과비교하여유의하게증가 ( 망상적혈구수 25.6%, 비율 29.5%, P<0.05) 하였다. (Table 6) 6) 혈액생화학적검사결과, 암 수시험물질투여군에서대조군과비교하여유의성있 는변화는관찰되지않았다. (Table 7) 7) 조직병리학적검사결과, 대조군과 1000 mg/kg bw/day 투여군의간장, 비장, 신장, 심장, 폐장및위장을관찰한결과, 시험물질투여와관련된병변은관찰되지않았다. (Table 8)

20 1 특이적소견암 수모두간 (liver) 에서미약한골수외조혈 (EMH) 이관찰되었다. 수컷에서는대조군과 1000 mg/kg bw/day 투여군모두 4례이상에서관찰되었고, 암컷에서는대조군의 3 례, 1000 mg/kg bw/day 투여군의 1례에서미약하게관찰되었다. 또한대조군과 1000 mg/kg bw/day 투여군수컷전개체의비장 (spleen) 에서중등도로 (moderate) 골수외조혈 (EMH) 이관찰되었다. 암컷 250 mg/kg bw/day 투여군 3례 ( 동물번호 :2201, 2202, 2205) 에서각각부검시육안소견이관찰되어슬라이드를제작하여검경한결과, 1례 ( 동물번호 :2201) 에서는신장수질부의낭포 (medullary cyst) 가관찰되었고, 다른 1례 ( 동물번호 :2205) 에서는신장수질부의낭포 2개 (medullary cysts) 가관찰되었으며, 나머지 1례 ( 동물번호 :2202) 에서는이상병변이관찰되지않았다. 2 배경병변암 수모두에서간의미약한염증세포침윤 (inflammatory cell foci), 간세포의공포화 (hepatocyte vacuolation), 미약한골수외조혈 (EMH), 신장피질세뇨관의변성및재생 (cortical tubular basophilia), 신장간질의염증세포침윤 (renal interstitial inflammatory cells infiltration), 신장수질부의낭포 (medullary cyst), 신장수질부세뇨관의원주 (medullary tubular cast), 신장간질의미약한염증세포침윤 (interstitial inflammatory cell infiltration in kidney) 및비장의골수외조혈 (EMH) 등이관찰되었다. 3 사망동물병변간에서미약한골수외조혈 (EMH), 신장에서피질세뇨관의변성및재생, 간질의미약한염증세포침윤 (Cortical tubular basophilia/interstitial inflammatory cells), 폐의혈관주위염증세포침윤 (perivascular inflammatory cells), 기도말단부에희미한호산성 (eosinophilic) 의 material 존재, 비장의골수외조혈 (EMH), 위에서의자가융해 (autolysis) 및전장기에서울혈 (congestion) 소견이관찰되었다

21 (3) 고찰및결론 Ammonium carbonate의 28일반복투여독성시험의투여용량을설정하기위하여 125, 250 및 500 mg/kg bw/day의투여용량을설정하여 4일간경구투여한예비시험의결과를바탕으로 250, 500 및 1000 mg/kg bw/day의투여용량을설정하여 SD 랫드에 7 일간매일반복경구투여한결과는아래와같다. 예비시험의일반증상관찰결과, 암 수시험물질투여군에서시험물질투여와관련된사망과이상증상을보인동물은관찰되지않았다. 용량결정시험의일반증상관찰결과, 수컷 1000 mg/kg bw/day 투여군의 2례에서시험물질투여 1일차에적색유루 ( 경도 ), 혈뇨 ( 많음 ), 혈변, 복와위등의증상이관찰되었고, 1례는투여 30분이내에사망하였으며, 나머지 1례는투여 2일차부터정상으로회복하였다. 그외, 시험기간동안암 수모든시험군에서시험물질투여와관련된사망또는이상증상을보인동물은관찰되지않았다. 체중변화, 장기중량및혈액생화학적검사결과, 암 수시험물질투여군에서대조군과비교하여유의성있는변화는관찰되지않았다. 사망동물의부검결과, 대장과소장의부종성, 암적색변화 (edematous and dark red color change in large and small intestine), 대장의충혈 (hyperemia in large intestine) 및정낭과전립선왜소 (reduced seminal vesicle and prostate) 등이관찰되었다. 생존동물의부검결과, 수컷대조군의 1례에서우측신장의낭포 (cyst in right kidney) 가관찰되었고, 암컷 250 mg/kg bw/day 투여군의 2례에서좌측신장의낭포 (cyst in left kidney), 1례에서우측신장의주변조직과유착 (adhesion to surrounding tissue of right kidney) 이관찰되었다. 그외암 수모든시험군에서특이한이상소견은관찰되지않았다. 혈액학적검사결과, 수컷 1000 mg/kg bw/day 투여군에서망상적혈구 (reticulocyte) 수및비율이대조군과비교하여유의하게증가하였다. 혈액학적검사결과에서의변화는용량및암 수상관성이결여된변화로시험물질에의한독성학적인변화로판단되지않았다. 조직병리학적검사결과, 시험물질투여와관련된병변은관찰되지않았다. 조직병리학적결과의특이적소견으로암 수모두간 (liver) 에서미약한골수외조혈 (EMH) 이관찰되었다. 수컷에서는대조군과 1000 mg/kg bw/day 투여군모두 4례이상에서관찰되었고, 암컷에서는대조군의 3례, 1000 mg/kg bw/day 투여군의 1례에서미약하게관찰되었다. 또한대조군과 1000 mg/kg bw/day 투여군수컷전개체의비장 (spleen) 에서중등도로 (moderate) 골수외조혈 (EMH) 이관찰되었다. 이는어린개체 ( 부검시 7주령 ) 에서조

22 혈작용이활발하게일어나기때문으로, 생리적인 (physiological) 현상으로판단되었다. 암컷 250 mg/kg bw/day 투여군 3례 ( 동물번호 :2201, 2202, 2205) 에서각각부검시육안소견이관찰되어슬라이드를제작하여검경한결과, 1례 ( 동물번호 :2201) 에서는신장수질부의낭포 (medullary cyst) 가관찰되었고, 다른 1례 ( 동물번호 :2205) 에서는신장수질부의낭포 2개 (medullary cysts) 가관찰되었으며, 나머지 1례 ( 동물번호 :2202) 에서는이상병변이관찰되지않았다. 이들모두반복시험시발견가능한배경변화의하나로판단되어시험물질에의한병변은아니라고판단하였다. 또한배경병변으로암 수모두에서간의미약한염증세포침윤 (inflammatory cell foci), 간세포의공포화 (hepatocyte vacuolation), 미약한골수외조혈 (EMH), 신장피질세뇨관의변성및재생 (cortical tubular basophilia), 신장간질의염증세포침윤 (renal interstitial inflammatory cells infiltration), 신장수질부의낭포 (medullary cyst), 신장수질부세뇨관의원주 (medullary tubular cast), 신장간질의미약한염증세포침윤 (interstitial inflammatory cell infiltration in kidney) 그리고비장의골수외조혈 (EMH) 등이관찰되었다. 이들병변은본시험시설의조건에서실험된품종, 성및연령등이일치하는동물에서관찰가능한배경변화 (background findings) 의범주를벗어나지않는변화로판단하였다. 사망동물의조직병리학적검사결과, 간에서미약한골수외조혈 (EMH), 신장에서피질세뇨관의변성및재생, 간질의미약한염증세포침윤 (Cortical tubular basophilia/interstitial inflammatory cells), 폐의혈관주위염증세포침윤 (perivascular inflammatory cells), 기도말단부에희미한호산성 (eosinophilic) 의 material 존재, 비장의골수외조혈 (EMH), 위에서의자가융해 (autolysis) 및전장기에서울혈 (congestion) 소견이관찰되었다. 사망동물에서시험물질투여와관련된명백한조직학적증거 (histological evidence) 는관찰되지않았지만투여후짧은시간내 ( 약 30분이내 ) 에사망하였고수컷 1000 mg/kg bw/day 투여군의다른개체도투여후독성학적이상증상을보였다가회복된것을미루어보아, 사망동물은 histological evidence를남기지않고시험물질에의해사망하였을가능성을배제하기어렵다고판단하였다. 이상의결과로부터 Ammonium carbonate를 250, 500 및 1000 mg/kg bw/day의용량으로 7일간반복경구투여하였을때혈액학적검사에서유의성이관찰되었지만, 이러한변화는일부에서일반적인생리학적범위내의변화였고용량및암 수상관성이결여된변화로판단되었다. 하지만 1000 mg/kg bw/day 투여군에서시험물질투여와관련된일반증상들과사망동물등을고려한다면본시험의최고용량은 1000 mg/kg bw/day 아래로설정해야할것으로판단되었다. 따라서 28일반복경구투여독성시험은투여기간을고려하여고용량을 500 mg/kg bw/day으로설정하고, 공비를 4로하여중용량과저용량을각각 125 및 mg/kg bw/day로설정하고자한다

23 Table 1. Clinical signs Dose (mg/kg) Sex No. of animal Mortality (dead / total) Clinical signs Days PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE Male 5 Female 5 0% (0 / 5)a 0% (0 / 5) NAD NAD G2 (250) Male 5 Female 5 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) NAD NAD G3 (500) Male 5 Female 5 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) NAD NAD NAD Red tear(slight) (1000) Male 5 20% (1 / 5) Hematurai (large amount) Bloody stool Prone position Death Female 5 0% (0 / 5) NAD a : No. of dead animals/no. of tested animals, PRE : Before dosing, AFT : After dosing, NAD : No abnormalities detected

24 Table 2. Body weights Sex Dose (mg/kg) G2 (250) Male G3 (500) (1000) G2 (250) Female G3 (500) (1000) Not significantly different from control Days (g) Mean S.D. ±18.0 ±20.0 ±22.4 N Mean S.D. ±22.5 ±22.2 ±26.3 N Mean S.D. ±23.6 ±26.4 ±28.4 N Mean S.D. ±28.6 ±99.8 ±31.1 N Mean S.D. ±4.0 ±6.8 ±6.2 N Mean S.D. ±4.3 ±7.4 ±5.6 N Mean S.D. ±4.8 ±7.8 ±8.5 N Mean S.D. ±7.1 ±8.0 ±10.5 N

25 Table 3. Necropsy findings Group Dose (mg/kg) 0 G2 250 G Sex No. of animal examined Male 5 Female 5 Male 5 Female 5 Male 5 Female 5 Male 5 Female 5 Removal reason Submitted External 5 NAD (5) Necropsy findings Internal NAD (4) Cyst (diameter approximately 1 mm) in right kidney (1) 5 NAD (5) NAD (5) 5 NAD (5) NAD (5) 5 NAD (5) NAD (2) Cyst (diameter approximately 1 mm) in left kidney (2) Adhesion to surrounding tissue of right kidney (1) 5 NAD (5) NAD (5) 5 NAD (5) NAD (5) 5 NAD (4) Soiled perineal region (1) Lacrimation (1) NAD (4) Edamatous and dark red color change in large and small intestine (1) Hyperemia in large intestine (1) Reduced seminal vesicle and prostate (1) 5 NAD (5) NAD (5) (number) : incidence, NAD : No abnormalities detected

26 Table 4. Absolute organ weights Sex Dose (mg/kg) No. of animal Liver (g) Kidneys (g) Spleen (g) Adrenal glands (g) Testis (g)/ Ovaries (g) Brain (g) Pituitary gland(g) Lung (g) Heart (g) Thymus (g) Pros./ Uterus Submaxillar (g) y gland (g) Epididymis (g) 5 Mean SD ±0.55 ±0.13 ±0.08 ±0.009 ±0.23 ±0.05 ±0.002 ±0.06 ±0.05 ±0.10 ±0.05 ±0.07 ±0.02 Male G2 (250) G3 (500) 5 5 Mean SD ±0.92 ±0.34 ±0.13 ±0.010 ±0.30 ±0.07 ±0.002 ±0.09 ±0.12 ±0.04 ±0.06 ±0.04 ±0.06 Mean SD ±0.94 ±0.37 ±0.11 ±0.006 ±0.42 ±0.06 ±0.001 ±0.08 ±0.07 ±0.07 ±0.02 ±0.07 ±0.06 (1000) 5 Mean SD ±0.72 ±0.22 ±0.10 ±0.004 ±0.24 ±0.09 ±0.003 ±0.15 ±0.13 ±0.07 ±0.05 ±0.07 ± Mean SD ±0.09 ±0.09 ±0.10 ±0.006 ±0.006 ±0.05 ±0.003 ±0.06 ±0.04 ±0.04 ±0.13 ±0.02 Female G2 (250) G3 (500) 5 5 Mean SD ±0.31 ±0.12 ±0.07 ±0.007 ±0.010 ±0.03 ±0.002 ±0.10 ±0.05 ±0.12 ±0.18 ±0.05 Mean SD ±0.49 ±0.11 ±0.08 ±0.006 ±0.011 ±0.10 ±0.003 ±0.07 ±0.04 ±0.07 ±0.16 ±0.05 (1000) 5 Mean SD ±0.54 ±0.08 ±0.06 ±0.009 ±0.013 ±0.37 ±0.003 ±0.08 ±0.10 ±0.03 ±0.06 ±0.03 Not significantly different from control

27 Table 5. Relative (% of body weight) organ weights Sex Dose (mg/kg) No. of animal 5 Body weight (g) Liver (%) Kidneys (%) Spleen (%) Adrenal glands (%) Testis (%)/ Ovaries (%) Brain (%) Pituitary gland(%) Lung (%) Heart (%) Thymus (%) Prostate (%)/ Uterus (%) Submaxillar y gland (%) Epididymi s (%) Mean SD ±19.9 ±0.09 ±0.11 ±0.02 ± ±0.08 ±0.09 ± ±0.05 ±0.04 ±0.04 ±0.02 ±0.02 ±0.02 Male G2 (250) G3 (500) 5 5 Mean SD ±24.4 ±0.14 ±0.06 ±0.03 ± ±0.08 ±0.08 ± ±0.03 ±0.03 ±0.04 ±0.01 ±0.01 ±0.02 Mean SD ±25.0 ±0.10 ±0.06 ±0.03 ± ±0.09 ±0.09 ± ±0.04 ±0.04 ±0.05 ±0.02 ±0.02 ±0.04 (1000) 5 Mean SD ±25.2 ±0.38 ±0.04 ±0.03 ± ±0.07 ±0.13 ± ±0.05 ±0.05 ±0.04 ±0.01 ±0.01 ± Mean SD ±6.0 ±0.08 ±0.10 ±0.06 ± ± ±0.05 ± ±0.05 ±0.04 ±0.037 ±0.09 ±0.02 Female G2 (250) G3 (500) 5 5 Mean SD ±4.7 ±0.14 ±0.05 ±0.05 ± ± ±0.04 ± ±0.05 ±0.02 ±0.068 ±0.12 ±0.03 Mean SD ±7.3 ±0.22 ±0.07 ±0.05 ± ± ±0.01 ± ±0.03 ±0.02 ±0.034 ±0.11 ±0.04 (1000) 5 Mean SD ±9.5 ±0.34 ±0.08 ±0.04 ± ± ±0.25 ± ±0.03 ±0.06 ±0.035 ±0.04 ±0.02 Not significantly different from control

28 Table 6. Hematological values Sex Dose (mg/kg) No. of animal 5 WBC RBC Hb HCT MCV MCH MCHC RETI RETI PLT PT APTT (10 3 /ul) (10 6 / μl ) (g/dl) (%) (fl) (pg) (g/dl) (10 9 /ul) (%) (10 3 / μl ) (sec) (sec) Mean SD ±1.34 ±0.36 ±0.6 ±1.9 ±1.3 ±0.6 ±0.2 ±41.2 ±0.53 ±122 ±0.7 ±1.2 Male G2 (250) G3 (500) 5 5 Mean SD ±2.86 ±0.18 ±0.2 ±0.6 ±1.3 ±0.4 ±0.2 ±33.8 ±0.54 ±61 ±1.1 ±1.8 Mean SD ±1.09 ±0.31 ±0.6 ±2.0 ±1.1 ±0.5 ±0.4 ±11.5 ±0.46 ±143 ±1.3 ±2.1 (1000) 4 Mean * 7.19* SD ±1.86 ±0.31 ±0.4 ±1.5 ±2.5 ±0.9 ±0.5 ±43.0 ±1.06 ±155 ±0.5 ±1.7 5 Mean SD ±0.73 ±0.34 ±0.7 ±1.7 ±2.7 ±0.3 ±1.1 ±85.9 ±1.16 ±133 ±0.5 ±2.8 Female G2 (250) G3 (500) 5 5 Mean SD ±2.64 ±0.29 ±0.3 ±0.8 ±2.5 ±0.5 ±1.2 ±85.7 ±1.13 ±151 ±0.3 ±2.1 Mean SD ±2.51 ±0.29 ±0.5 ±1.3 ±1.0 ±0.4 ±0.5 ±71.7 ±0.93 ±136 ±1.0 ±1.9 (1000) 5 Mean SD ±1.47 ±0.22 ±0.7 ±2.8 ±3.3 ±0.7 ±0.8 ±125.1 ±1.79 ±101 ±0.9 ±1.4 Significant differences as compared with control : *P<

29 Table 6. (Continued) Hematological values Sex Dose (mg/kg) No. of animal 5 Differential leukocyte count Differential leukocyte count NE LY MO EO BA LUC NE LY MO EO BA LUC (10 3 /ul) (10 3 /ul) (10 3 /ul) (10 3 /ul) (10 3 /ul) (10 3 /ul) (%) (%) (%) (%) (%) (%) Mean SD ±0.18 ±1.39 ±0.05 ±0.01 ±0.01 ±0.03 ±5.6 ±6.2 ±0.9 ±0.2 ±0.1 ±0.5 Male G2 (250) G3 (500) 5 5 Mean SD ±1.03 ±1.82 ±0.07 ±0.02 ±0.01 ±0.11 ±7.0 ±7.5 ±0.4 ±0.2 ±0.1 ±0.6 Mean SD ±0.24 ±1.03 ±0.04 ±0.01 ±0.01 ±0.05 ±4.5 ±4.4 ±0.5 ±0.2 ±0.0 ±0.5 (1000) 4 Mean SD ±0.45 ±1.52 ±0.07 ±0.03 ±0.01 ±0.06 ±4.4 ±5.7 ±0.8 ±0.2 ±0.1 ±0.6 5 Mean SD ±0.27 ±0.54 ±0.04 ±0.02 ±0.00 ±0.03 ±3.3 ±3.4 ±0.5 ±0.4 ±0.0 ±0.3 Female G2 (250) G3 (500) 5 5 Mean SD ±0.69 ±2.10 ±0.06 ±0.03 ±0.01 ±0.05 ±5.1 ±5.1 ±0.5 ±0.2 ±0.0 ±0.6 Mean SD ±0.32 ±2.23 ±0.05 ±0.02 ±0.01 ±0.04 ±4.4 ±4.9 ±0.7 ±0.2 ±0.1 ±0.4 (1000) Not significantly different from control 5 Mean SD ±0.37 ±1.15 ±0.03 ±0.02 ±0.01 ±0.03 ±4.1 ±4.2 ±0.3 ±0.2 ±0.1 ±

30 Table 7. Blood chemical values Sex Male Female Dose (mg/kg) G2 (250) G3 (500) (1000) G2 (250) G3 (500) (1000) TP ALB A/G T-BIL ALP AST ALT CREA BUN CHOL TG GLU CA IP GGT CK Na K Cl (g/dl) (g/dl) - (mg/dl) (U/L) (U/L) (U/L) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (mg/dl) (IU/L) (IU/L) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) Mean S.D. ±0.1 ±0.1 ±0.0 ±0.01 ±114 ±26 ±3 ±0.0 ±2.4 ±15 ±12 ±9 ±0.2 ±0.9 ±0.3 ±298 ±0.9 ±0.27 ±0.9 N Mean S.D. ±0.1 ±0.1 ±0.1 ±0.01 ±85 ±34 ±2 ±0.0 ±1.7 ±8 ±4 ±30 ±0.2 ±0.9 ±1.2 ±519 ±0.9 ±0.25 ±1.6 N Mean S.D. ±0.2 ±0.1 ±0.0 ±0.00 ±172 ±21 ±5 ±0.1 ±1.2 ±12 ±11 ±17 ±0.2 ±1.1 ±0.4 ±269 ±0.8 ±0.20 ±1.3 N Mean S.D. ±0.2 ±0.1 ±0.1 ±0.01 ±231 ±23 ±2 ±0.0 ±0.7 ±6 ±21 ±15 ±0.1 ±0.6 ±0.0 ±246 ±0.9 ±0.13 ±1.7 N Mean S.D. ±0.3 ±0.2 ±0.1 ±0.07 ±92 ±12 ±4 ±0.1 ±2.0 ±13 ±17 ±7 ±0.4 ±0.8 ±0.6 ±126 ±1.7 ±0.27 ±1.3 N Mean S.D. ±0.2 ±0.1 ±0.1 ±0.06 ±64 ±14 ±4 ±0.1 ±1.5 ±17 ±9 ±14 ±0.2 ±0.6 ±0.8 ±232 ±0.8 ±0.41 ±0.9 N Mean S.D. ±0.2 ±0.1 ±0.1 ±0.01 ±57 ±6 ±2 ±0.1 ±2.3 ±22 ±12 ±9 ±0.2 ±0.7 ±0.4 ±103 ±1.1 ±0.09 ±1.8 N Mean S.D. ±0.1 ±0.1 ±0.0 ±0.07 ±137 ±16 ±4 ±0.0 ±1.3 ±15 ±11 ±10 ±0.2 ±0.6 ±0.5 ±198 ±0.6 ±0.37 ±1.1 N Not significantly different from control

31 Table 8. Histopathological findings Removal reason Organs No. of animal examined Histopathological findings (0 mg/kg) Male (1000 mg/kg) (0 mg/kg) Female G2 (250 mg/kg) (1000 mg/kg) NAD Inflammatory cell foci minimal/focal minimal/multifocal Liver 5 Extra Medullary Hematopoiesis minimal/focal minimal/multifocal Inflammatory cell infiltration minimal/focal minimal/multifocal Congestion present NAD : No abnormalities detected

32 Table 8. (Continued) Histopathological findings Removal reason Organs Kidney No. of animal examined 5 (3 in female G2) NAD : No abnormalities detected Male Female Histopathological findings (0 mg/kg) (1000 mg/kg) (0 mg/kg) G2 (250 mg/kg) (1000 mg/kg) NAD Cortical tubular basophilia minimal/focal slight/focal Tubular cast minimal/focal Medullary mineralization minimal/multifocal Cortical cyst present Interstitial inflammatory cells minimal/focal minimal/multifocal Medullary cyst present Tubular dilation slight/focal Cortical cyst present Pelvic dilation(unilateral) minimal Congestion, present

33 Table 8. (Continued) Histopathological findings Removal reason Organs No. of animal examined Histopathological findings (0 mg/kg) Male (1000 mg/kg) (0 mg/kg) Female (1000 mg/kg) Heart 5 NAD NAD Perivascular inflammatory cells minimal/focal minimal/multifocal Lung 5 Subpleural inflammatory cells minimal/focal Congestion present Preteinous material in airway present NAD Spleen 5 Extra medullary hematopoiesis minimal slight moderate Congestion present Stomach 5 NAD Autolysis NAD : No abnormalities detected

34 1.2. Ammonium carbonate 의 28 일반복경구투여독성시험 (KG ) (1) 시험방법 1) 군구성본시험물질을이용한 7일반복경구투여용량결정시험 (TBH-0786) 의결과를바탕으로고용량을 500 mg/kg bw/day으로설정하였고, 공비 4를적용하여 125 mg/kg bw/day과 mg/kg bw/day의용량을중용량과저용량으로각각설정하였다. 대조군으로는멸균증류수를투여하는부형제대조군을설정하였다. 또한본시험에서는독성반응의지속성과가역성을평가하기위하여부형제대조군과 500 mg/kg bw/day 투여군에는회복군을두었으며, 회복기간은투여종료후 14일간이며일반증상을관찰한후부검을수행하였다. 시험군시험물질성 1 군 () ( 대조군 ) 2 군 (G2) ( 저용량군 ) 3 군 (G3) ( 중용량군 ) 4 군 () ( 고용량군 ) 멸균증류수 Ammonium carbonate 동물수 시험군회복군 동물번호 수컷 ~ a ~ 1110 a 암컷 ~ a ~ 2110 a 수컷 ~ 1205 암컷 ~ 2205 수컷 ~ 1305 암컷 ~ 2305 수컷 5 5 암컷 ~ a ~ 1410 a 2401 ~ a ~ 2410 a 투여량 (mg/kg) 투여액량 (ml/kg) a : 회복군 2) 관찰항목 1 일반증상관찰시험기간중모든동물에대하여매일 1회이상일반증상의변화, 독성증상및사망유무의관찰을실시하였다. 2 상세관찰 - 핸들링시의관찰

35 모든동물에대하여케이지로부터꺼내어시험자의처치시반응, 외상, 피부색, 피모 의오염, 안구돌출, 안검하수, 결막의색조, 눈혹은코의분비물, 유루, 유연, 입모및 동공크기등의변화를 1 주일에 1 회씩아래항목별로관찰하였다. Handling reactivity Wound Skin color Soiled fur Exophthalmos Ptosis Conjunctiva color Discharge Lacrimation Salivation Piloerection Pupil size - 오픈필드에서의관찰 모든동물에대하여오픈필드의중앙에동물을두고각성상태, 뇨, 배변, 자세, 호흡, 보행, 진전, 경련및상동행동또는이상행동등에대해 1 주일에 1 회씩아래항목별 로관찰하였다. Arousal Urination Defecation Posture Respiration Gait Tremor Convulsion Stereotypies and/or bizarre behaviors 3 감각반응평가및악력측정 모든동물에대하여시험물질투여종료시점에감각반응평가를아래항목별로측정 하였고, 랫드용악력측정장치 (Grip strength, 1027 CSX, Columbus Instrument, U.S.A.) 를이용하여앞다리와뒷다리에대해 3 회씩측정하여각각평균을채용하였 다. Visual Auditory Touch response Pain response Righting reflex 4 운동량측정모든시험군에대하여시험물질투여종료시점에운동량평가 (Motor activity) 를실시하였다. - 자발운동량측정 [Activity Monitor, Columbus Instrument, U.S.A. (Opto-varimex-4 AutoTrack System 4.90)] 자발운동량관찰시스템을이용하여자발운동량을측정하였다. 5 체중측정 체중은입수시, 군분리시를포함하여투여개시후매주 1 회측정하였다. 6 사료섭취량측정

36 모든동물에대하여사료섭취량은투여개시후매주 1 회측정하였다. 7 뇨검사모든시험군에대하여투여최종주에뇨시험지 (Multistix 10SG, SEIMENS, U.S.A.) 와뇨측정기 (Clinitek 500, U.S.A.) 를이용하여 specific gravity, ph, leukocyte, nitrite, protein, glucose, ketone, urobilinogen, bilirubin 및 blood 등의뇨검사를실시하였다. 대조군과 500 mg/kg bw/day 투여군은대사케이지를이용하여 3시간동안채뇨한신선뇨에대해서뇨침사검사를실시하였고, 뇨량은 24시간동안채뇨한축뇨를이용하여측정하였다. 8 안검사모든동물에대하여군분리전및투여최종주에동물눈의외관을시진 ( 눈으로관찰 ) 하였다. 대조군과 500 mg/kg bw/day 투여군의실험동물에대해서는투여최종주에산동제 (Ocutropine, Samil pharm CO., LTD, Korea) 를이용하여동공을확장시킨후안저카메라 (Genesis, Kowa, Japan) 를이용하여안저를관찰하였다. 9 부검시험종료시생존동물은 isoflurane을이용하여심마취시켜채혈및안락사시킨다음체표및모든체공 (external surface & all orifices), 두개강 (cranial cavity), 흉강및복강의모든장기 (thoracic and abdominal & their contents) 에대하여육안적검사를실시하였다. 10 장기중량측정모든동물에대하여부검시육안적검사를실시한후에간 (liver), 신장 (kidney), 비장 (spleen), 부신 (adrenal gland), 고환 (testis), 난소 (ovary), 뇌 (brain), 뇌하수체 (pituitary gland), 폐 (lung), 심장 (heart), 흉선 (thymus), 자궁 (uterus), 전립선과정낭 (prostate and seminal vesicle), 부고환 (epididymis) 및악하선 (submaxillary gland) 에대한습중량을측정하였고, 절식체중에대한상대장기중량비를측정하였다. 좌우가있는장기는무게를측정한후합하였다. 11 혈액학적검사채혈전하룻밤절식시킨동물을 isoflurane으로마취한다음복대동맥으로부터채혈한혈액중약 3 ml을 EDTA가함유된 CBC bottle(edta 2K, BD vacutainer) 에취하여자동혈구측정기 (ADVIA 120E, Seimens, U.S.A.) 로다음의항목들을측정하였다

37 혈액응고시간의측정은채혈후 vacutainer(9ncsodium citrate 3.2%, BD vacutainer) 에취하여원심분리 (3000 rpm, 10 분 ) 를통해얻은혈장을자동응고시간측정기 (ACL 7000, Instrumentation Laboratory, U.S.A.) 를이용하여측정하였다. 항목측정장비및측정법단위 다음의항목은자동혈액분석기 (ADVIA 120E, SEIMENS, U.S.A) 로측정하였다. Total leucocyte count (WBC) 레이져광학법 10 3 /ul Differential leucocyte count Neutrophils Lymphocytes Monocytes Eosinophils Basophils Large unstained cells 레이져광학법 % Total erythrocyte count (RBC) 레이져광학법 10 6 /ul Hemoglobin concentration (Hb) cyanmethaemoglobin 을측정 g/dl Hematocrit (Hct) RBC MCV/10 % Mean cell volume (MCV) 레이져광학법 fl Mean cell hemoglobin (MCH) Hb/RBC 10 pg Mean cell hemoglobin Concentration (MCHC) Hb/(RBC MCV) cells/l Reticulocyte (RETIC) 레이져광학법 % Platelet (PLT) 레이져광학법 10 3 /ul 다음의항목은원심분리 (3000 rpm, 10 분 ) 하여얻은혈장을자동응고시간 측정기 (ACL 7000, Instrumentation Laboratory, U.S.A.) 를이용하여측정하였다 Prothrombin time (PT) 광산란검출방식 secs Activated partial thrombo- plastin time (APTT) 광산란검출방식 % secs 12 혈액생화학적검사채혈한혈액중혈액검사와혈액응고검사에사용된혈액을제외한나머지의혈액을실온에서응고시킨다음원심분리 (3000 rpm, 10분 ) 하여혈청을취한후자동혈청분석기 (HITACHI 7060, HITACHI, Japan) 와전해질분석기 (EasyLyte PLUS Na/K/Cl

38 Analyzer, MEDICA, U.S.A.) 를이용하여다음과같이측정하였다. 항목 측정장비및측정법 단위 다음의항목은 HITACHI 7060 Automatic analyzer로분석하였다. Total protein (TP) Biuret법 g/dl Albumin (ALB) BCG법 g/dl A/G ratio (A/G) Albumin/Globulin 산출하여측정 Total bilirubin (T-BIL) Azobilirubin법 mg/dl Alkaline phosphatase(alp) p-nitrophemyl phosphate법 U/L Alanine aminotransferase (ALT) UV-rate법 U/L Aspartate aminotransferase (AST) UV-rate법 U/L Gamma glutamyl transferase (GGT) γ-glutamyl CNA 기질법 IU/L Creatinine (CREA) Jaffe법 mg/dl Blood urea nitrogen(bun) Urease GLDH법 mg/dl Total cholesterol (T-CHO) COD-HDAOS법 mg/dl Triglycerides (TG) GPO-HDAOS 법, Glycerol blanking 법 mg/dl Glucose (GLU) Hexokinase-G-6-PDH법 mg/dl Calcium (CA) OCPC법 mg/dl Inorganic phosphorus(ip) Fiske Subbarow법 mg/dl Creatine kinase (CK) JSCC법 IU/L Total bile acid (TBA) Enzymatic colorimetric µmol/l 다음의항목은 EasyLyte PLUS Na/K/Cl Analyzer로분석하였다. Sodium (Na+) 이온전극선택법 mmol/l Potassium (K+) 이온전극선택법 mmol/l Chloride (Cl-) 이온전극선택법 mmol/l 13 조직병리학적검사모든동물에대해서개체별로간 (liver), 신장 (kidney), 부신 (adrenal gland), 심장 (heart), 폐 (lung), 뇌 (brain), 뇌하수체 (pituitary gland), 척수 (spinal cord), 비장 (spleen), 정낭 (seminal vesicle), 응고선 (coagulatory gland), 고환 (testis), 부고환

39 (epididymis), 전립선 (prostate gland), 난소 (ovary), 자궁 (uterus), 질 (vagina), 기관 (trachea), 식도 (esophagus), 흉선 (thymus), 혀 (tongue), 갑상선 / 부갑상선 (thyroid/parathyroid gland), 위 (stomach), 십이지장 (duodenum), 방광 (urinary bladder), 소장 / 대장 (small/large intestine), 안구 / 하더리안선 (eye/harderian gland), 피부 (skin), 유선 (mammary gland), 악하선 (submandibular gland), 골격근 (skeletal muscle), 좌골신경 (sciatic nerve), 췌장 (pancreas), 장림프절 (intestinal lymphnode), 대퇴골 (femur) 및흉골 (sternum) 의장기를적출하여 10% 중성완충포르말린용액 (neutral buffer formalin) 에고정하였으며, 안구는 Davidson 액, 고환및부고환은 Bouin 액에고정하였다. 병리조직학적검사는대조군과 500 mg/kg bw/day 투여군및육안소견이관찰된 mg/kg bw/day 투여군에대해서실시하였다

40 (2) 시험결과 1) 시험기간동안암 수모든시험군에서시험물질투여와관련된사망동물은관찰되 지않았고, 일반증상관찰결과암 수모든시험군에서특이할만한이상소견은관찰되 지않았다. (Table 1) 2) 상세관찰, 감각반응평가및악력측정결과, 암 수모든시험군에서시험물질영향 에의한변화는관찰되지않았다. (Table 2 ~ 3) 3) 운동량측정결과, 측정후 0 ~ 10 분간에수컷 mg/kg bw/day 투여군과 500 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게증가하였고 (31.25 mg/kg bw/day 투여군 42.4%, 500 mg/kg bw/day 투여군 27.3%, p<0.05 or p<0.01), 측정후 40 ~ 50 분간에 125 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게감소하였다 (580%, p<0.05). (Table 4) 4) 체중변화관찰결과, 암 수의시험물질투여군에서대조군과비교하여유의성있는 변화는관찰되지않았다. (Table 5) 5) 사료섭취량측정결과, 투여 1 주차에수컷 mg/kg bw/day 투여군은대조군에비해유의하게감소하였고 (12.2%, p<0.01), 암컷 mg/kg bw/day 투여군과 125 mg/kg bw/day 투여군은대조군에비해유의하게증가하였다 (31.25 mg/kg bw/day 투여군 13.6%, 125 mg/kg bw/day 투여군 12.5%, p<0.01). 투여 2 주차에수컷 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게감소하였고 (11.3%, p<0.01), 투여 3 주차에암컷시험물질투여군이대조군에비해유의하게증가하였다 (31.25 mg/kg bw/day 투여군 12.0%, 125 mg/kg bw/day 투여군 13.7%, 500 mg/kg bw/day 투여군 12.0%, p<0.05 or p<0.01). 투여 4 주차에암컷 mg/kg bw/day 투여군과 500 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게증가하였고 (31.25 mg/kg bw/day 투여군 10.6%, 500 mg/kg bw/day 투여군 11.5%, p<0.05 or p<0.01), 회복 1 주차에수컷 500 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게증가하였다 (19.1%, p<0.01). (Table 6) 6) 뇨검사결과, 시험물질에의한독성학적인변화는관찰되지않았다. (data not shown) 7) 안과학적검사결과, 시험물질에의한독성학적인변화는관찰되지않았다. (data not shown)

41 8) 부검소견결과, 투여종료시수컷에서는 mg/kg bw/day 투여군의간우측외측엽및전엽의횡격막유착과우측외측엽의노란색색변화 (right lateral and front lobe of liver adhesion to diaphragm and yellowish color change in right lateral lobe of liver) 1례 ( 동물번호 :1202) 가관찰되었다. 암컷에서는대조군의비장종대 (enlarged spleen) 1례 ( 동물번호 :2104), mg/kg bw/day 투여군의간양측외엽의적색변화 (red color change in both lateral lobe of liver) 1례 ( 동물번호 :2202) 와 125 mg/kg bw/day 투여군의비장종대및어두운색변화 (dark color changed and enlarged spleen) 1례 ( 동물번호 :2303) 가관찰되었다. 또한회복기간종료시수컷대조군에서폐우측외측엽의짙은적색변화 (dark red color change in right lateral lobe of lung) 1례 ( 동물번호 :1108) 가관찰되었다. (Table 7) 9) 장기중량측정결과, 절대장기중량에서회복기간종료시암컷 500 mg/kg bw/day 투여군의난소와뇌하수체가대조군에비해유의하게증가하였다 ( 난소 22.6%, 뇌하수체 28.6%, p<0.05 or p<0.01). 또한상대장기중량에서회복기간종료시암컷 500 mg/kg bw/day 투여군의뇌하수체는대조군에비해유의하게증가하였고 (27.3%, p<0.05), 폐는유의하게감소하였다 (8.7%, p<0.01). (Table 8 ~ 9) 10) 혈액학적검사결과, 회복기간종료시수컷 500 mg/kg bw/day 투여군의산호성백혈구 (eosinophil) 및호중구 (neutrophil) 의백분율이대조군에비해유의하게증가하였고 (eosinophil 44.4%, neutrophil 37.3%, p<0.05 or p<0.01), 림프구 (lymphocyte) 의백분율은유의하게감소하였다 (8.8%, p<0.05). 또한암컷 500 mg/kg bw/day 투여군의큰미염색성세포 (large unstained cell) 는대조군에비해유의하게증가하였다 (100%, p<0.05). (Table 10) 11) 혈액생화학적검사결과, 회복기간종료시수컷 500 mg/kg bw/day 투여군의칼륨 (potassium) 이대조군에비해유의하게감소하였고 (3.2%, p<0.05), 암컷 500 mg/kg bw/day 투여군의염소 (chloride) 가대조군에비해유의하게증가하였다 (1.9%, p<0.05). (Table 11) 12) 주요장기에대한조직병리학적검사결과, 대조군과 500 mg/kg bw/day 투여군의 주요장기에서시험물질과관련된병변은관찰되지않았다. (Table 12) 우발병변 (incidental findings) 으로주시험 (main study) 500 mg/kg bw/day 투여군의수컷 에서는간의미약한염증세포침윤 (inflammatory cell foci in liver), 신장피질세뇨관의

42 변성및재생 (cortical tubular basophilia in kidney), 신장수질의낭포형성 (medullary cyst in kidney), 심근의염증세포침윤 (myocardial inflammatory cells), 폐의혈관주위염증세포침윤 (perivascular inflammatory cells in lung), 전립선간질의염증세포침윤 (prostatic interstitial inflammatory cells), 흉선피질부의세포자멸사 (cortical apoptosis in thymus), 갑상선의아가미끝소체형성 (ultimobranchial cyst in thyroid) 및췌장샘포의자멸사 (acinar cell apoptosis in pancreas) 등이관찰되었다. 또한주시험 (main study) 500 mg/kg bw/day 투여군의암컷에서는간문맥주변의공포화 (periportal vacuolation in liver), 신장피질세뇨관의변성및재생 (cortical tubular basophilia in kidney), 신장간질의염증세포침윤 (renal interstitial inflammatory cell infiltration), 심근의염증세포침윤 (myocardial inflammatory cells), 폐의혈관주위염증세포침윤 (perivascular inflammatory cells in lung) 및흉선피질부의미약한세포자멸사 (cortical apoptosis in thymus) 등이관찰되었다. 우발병변중특이적인병변으로부검시수컷 mg/kg bw/day 투여군 1례 ( 동물번호 :1202) 의간우측전엽이횡격막과유착된육안소견이관찰되었고, 조직학적으로관찰한결과다핵거대세포가침윤된기질화된이영양성석회화구역 (An area of organized dystrophic mineralization with multinucleated cells) 으로관찰되었다. 또한동일개체에서부검시간에서색깔변화소견이관찰되었는데이를조직학적으로관찰한결과, 미세한공포화가있는간세포구역 (An area of fine vacuolated hepatocyte) 으로관찰되었다. 암컷 mg/kg bw/day 투여군 1례 ( 동물번호 :2202) 의간에서부검시육안소견이관찰되어조직학적으로관찰한결과, 문맥주변의공포화소견 (periportal vacuolation) 이미약하게관찰되었다. 또한암컷 125 mg/kg bw/day 투여군 1례 ( 동물번호 :2303) 의비장에서부검시비장종대 (splenomegaly) 소견이관찰되어조직학적으로관찰한결과, 골수외조혈 (EMH) 소견이중등도로관찰되었고비장전반적으로울혈 (congestion) 소견이관찰되었다. 회복군 (recovery group) 500 mg/kg bw/day 투여군의수컷과암컷에서도주시험 500 mg/kg bw/day 투여군의수컷과암컷에서관찰된병변의빈도및강도수준에서관찰 되었다

43 (3) 고찰및결론 시험물질인 Ammonium carbonate의 28일반복경구투여에의한전신독성영향과무영향관찰량을조사하기위하여 31.25, 125 및 500 mg/kg bw/day의투여용량을설정하여 SD 랫드에 28일간경구투여하였고, 14일간회복성을관찰한결과는다음과같다. 시험기간동안암 수모든시험군에서시험물질투여와관련된사망동물과특이할만한일반증상은관찰되지않았다. 상세관찰, 감각반응평가및악력을측정한결과, 암 수모든시험군에서시험물질영향에의한변화는관찰되지않았다. 체중변화관찰결과, 암 수의시험물질투여군에서대조군과비교하여유의성있는변화는관찰되지않았고, 뇨검사와안검사결과에서도시험물질에의한독성학적인변화는관찰되지않았다. 운동량측정결과, 측정후 0 ~ 10 분간수컷 mg/kg bw/day 투여군과 500 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게증가하였고, 측정후 40 ~ 50 분간 125 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게감소하였다. 이는용량과암 수상관성이결여된변화이며, 상세관찰과감각반응평가결과와상관성이없는일시적인변화로사료되어시험물질에의한영향으로판단하지않았다. 사료섭취량측정결과, 투여 1주차에수컷 mg/kg bw/day 투여군은대조군에비해유의하게감소하였고, 암컷 mg/kg bw/day 투여군과 125 mg/kg bw/day 투여군은대조군에비해유의하게증가하였다. 투여 2주차에수컷 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게감소하였고, 투여 3주차에암컷시험물질투여군이대조군에비해유의하게증가하였다. 투여 4주차에암컷 mg/kg bw/day 투여군과 500 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게증가하였고, 회복 1주차에수컷 500 mg/kg bw/day 투여군이대조군에비해유의하게증가하였다. 사료섭취량의유의한감소와증가는체중, 용량및암 수상관성이결여된일시적인변화로사료되어시험물질에의한영향으로판단하지않았다. 부검소견결과, 투여종료시수컷에서는 mg/kg bw/day 투여군의간우측외측엽및전엽의횡격막유착과우측외측엽의노란색색변화 1례가관찰되었으며, 조직병리학적검사결과다핵거대세포가침윤된기질화된이영양성석회화구역 (An area of organized dystrophic mineralization with multinucleated cells) 으로관찰되었다. 이는어떠한원인에의해간엽이횡격막과유착되어순환이되지않아괴사되는현상이일

44 정시간지속되면서이영양성석회화 (dystrophic mineralization) 소견이관찰된것으로추정된다 mg/kg bw/day 투여군수컷 1례에서만국소적병변으로관찰되었고, 이는시험물질에의한독성학적변화로볼수있는소견은아니므로우발적병변 (incidental finding) 으로판단하였다. 노란색색변화소견의조직병리학적검사결과는미세한공포화가있는간세포구역 (An area of fine vacuolated hepatocyte) 으로관찰되었다. 이역시시험물질에의한독성학적변화가아닌독성시험에서배경병변의수준으로관찰가능한우발적병변 (incidental finding) 으로판단하였다. 또한암컷에서는 125 mg/kg bw/day 투여군의비장종대및어두운색변화소견이 1례관찰되었으며, 조직병리학적검사결과골수외조혈 (EMH) 소견이중등도로관찰되었고, 비장전반적으로울혈 (congestion) 소견이관찰되었다. 암컷 125 mg/kg bw/day 투여군의 1개체에서만관찰되었고, 비장에서의골수외조혈소견은독성시험에서관찰가능한병변중의하나이므로시험물질에의한독성학적변화가아닌우발적병변 (incidental finding) 으로판단하였다. 그외에암컷대조군의비장종대 1례, mg/kg bw/day 투여군의간양측외엽의적색변화 1례가관찰되었다. 또한회복기간종료시수컷대조군에서폐우측외측엽의짙은적색변화 1례가관찰되었다. 부검소견이관찰된장기들의조직병리학적검사결과, 일반적인반복시험에서관찰가능한배경병변수준의병변이었으므로시험물질에의한독성학적변화는없는것으로판단되었다. 장기중량측정결과, 절대장기중량에서회복기간종료시암컷 500 mg/kg bw/day 투여군의난소와뇌하수체가대조군에비해유의하게증가하였다. 또한상대장기중량에서회복기간종료시암컷 500 mg/kg bw/day 투여군의뇌하수체는대조군에비해유의하게증가하였고폐는유의하게감소하였다. 난소, 뇌하수체및폐에서관찰된유의한증가또는감소는투여종료시가아닌회복기간종료시관찰되었으며, 육안소견과조직병리학적결과와의상관성이없는일시적인변화로사료되어시험물질에의한영향으로판단되지않았다. 혈액학적검사결과, 회복기간종료시수컷 500 mg/kg bw/day 투여군의산호성백혈구 (eosinophil) 와호중구 (neutrophil) 의백분율이대조군에비해유의하게증가하였고, 림프구 (lymphocyte) 의백분율은유의하게감소하였다. 또한암컷 500 mg/kg bw/day 투여군의큰미염색성세포 (large unstained cell) 는대조군에비해유의하게증가하였다. 이결과는암 수상관성및투여와상관성이결여된변화였으며, 일반생리학적범위내에서의변화였으므로시험물질에의한영향으로판단하지않았다. 혈액생화학적검사결과, 회복기간종료시수컷 500 mg/kg bw/day 투여군의칼륨 (potassium) 이대조군에비해유의하게감소하였고, 암컷 500 mg/kg bw/day 투여군의

45 염소 (chloride) 가대조군에비해유의하게증가하였다. 이결과는암 수상관성및투 여와상관성이결여된변화였으며, 일반생리학적범위내에서의변화였으므로시험물질 에의한영향으로판단하지않았다. 주요장기에대한주시험및회복군의대조군과 500 mg/kg bw/day 투여군의조직병리학적검사결과, 시험물질과관련된병변은관찰되지않았다. 우발병변 (incidental findings) 으로주시험 (main study) 500 mg/kg bw/day 투여군의수컷에서는간의미약한염증세포침윤 (inflammatory cell foci in liver), 신장피질세뇨관의변성및재생 (cortical tubular basophilia in kidney), 신장수질의낭포형성 (medullary cyst in kidney), 심근의염증세포침윤 (myocardial inflammatory cells), 폐의혈관주위염증세포침윤 (perivascular inflammatory cells in lung), 전립선간질의염증세포침윤 (prostatic interstitial inflammatory cells), 흉선피질부의세포자멸사 (cortical apoptosis in thymus), 갑상선의아가미끝소체형성 (ultimobranchial cyst in thyroid) 및췌장샘포의자멸사 (acinar cell apoptosis in pancreas) 등이관찰되었다. 또한주시험 (main study) 500 mg/kg bw/day 투여군의암컷에서는간문맥주변의공포화 (periportal vacuolation in liver), 신장피질세뇨관의변성및재생 (cortical tubular basophilia in kidney), 신장간질의염증세포침윤 (renal interstitial inflammatory cell infiltration), 심근의염증세포침윤 (myocardial inflammatory cells), 폐의혈관주위염증세포침윤 (perivascular inflammatory cells in lung) 및흉선피질부의미약한세포자멸사 (cortical apoptosis in thymus) 등이관찰되었다. 회복군 (recovery group) 500 mg/kg bw/day 투여군의수컷과암컷에서도주시험 500 mg/kg bw/day 투여군의수컷과암컷에서관찰된병변의빈도및강도수준에서관찰되었다. 위에서관찰된모든병변들은본시험시설의조건에서시험된동물과품종, 성, 연령등이일치하는동물에서흔히발견가능한배경변화 (background findings) 의범주를벗어나지않는변화로판단하였다. 이상의결과로부터 Ammonium carbonate를 31.25, 125 및 500 mg/kg bw/day의용량으로 28 일간반복경구투여하였을때 500 mg/kg bw/day의투여용량까지유의할만한독성학적인변화가관찰되지않았으므로, 무영향관찰량 (NOAEL) 은암 수모두 500 mg/kg bw/day 이상으로판단된다

46 Table 1. Clinical signs Dose (mg/kg) Sex No. of animal Mortality (dead / total) Clinical signs Days PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT Male 10 Female 10 0% (0 / 10) a,b NAD % (0 / 10) b NAD G2 (31.25) Male 5 Female 5 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) NAD NAD G3 (125) Male 5 Female 5 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) NAD NAD (500) Male 10 Female 10 0% (0 / 10) b NAD % (0 / 10) b NAD a : No. of dead animals/no. of tested animals, PRE : Before dosing, AFT : After dosing, NAD : No abnormalities detected b : Main study(5 animals) + recovery group(5 animals)

47 Table 1. (Continued) Clinical signs Dose (mg/kg) Sex No. of animal Mortality (dead / total) Clinical signs Days PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT Male 10 Female 10 0% (0 / 10) a,b NAD % (0 / 10) b NAD G2 (31.25) Male 5 Female 5 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) NAD NAD G3 (125) Male 5 Female 5 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) NAD NAD (500) Male 10 Female 10 0% (0 / 10) b NAD % (0 / 10) b NAD a : No. of dead animals/no. of tested animals, PRE : Before dosing, AFT : After dosing, NAD : No abnormalities detected b : Main study(5 animals) + recovery group(5 animals)

48 Table 1. (Continued) Clinical signs Dose (mg/kg) Sex No. of animal Mortality (dead / total) Clinical signs Days PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT Male 10 Female 10 0% (0 / 10) a,b NAD % (0 / 10) b NAD G2 (31.25) Male 5 Female 5 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) NAD NAD G3 (125) Male 5 Female 5 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) NAD NAD (500) Male 10 Female 10 0% (0 / 10) b NAD % (0 / 10) b NAD a : No. of dead animals/no. of tested animals, PRE : Before dosing, AFT : After dosing, NAD : No abnormalities detected b : Main study(5 animals) + recovery group(5 animals)

49 Table 1. (Continued) Clinical signs Dose (mg/kg) Sex No. of animal Mortality (dead / total) Clinical signs Days PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE AFT PRE Male 10 Female 10 0% (0 / 10) a,b NAD % (0 / 10) b NAD G2 (31.25) Male 5 Female 5 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) NAD NAD G3 (125) Male 5 Female 5 0% (0 / 5) 0% (0 / 5) NAD NAD (500) Male 10 Female 10 0% (0 / 10) b NAD % (0 / 10) b NAD a : No. of dead animals/no. of tested animals, PRE : Before dosing, AFT : After dosing, NAD : No abnormalities detected b : Main study(5 animals) + recovery group(5 animals)

50 Table 1. (Continued) Clinical signs Dose (mg/kg) Sex No. of animal Mortality (dead / total) Clinical signs Days (500) Male 5 Female 5 Male 5 Female 5 0% (0 / 5) a,b NAD % (0 / 5) b NAD % (0 / 5) b NAD % (0 / 5) b NAD a : No. of dead animals/no. of tested animals, NAD : No abnormalities detected b : Recovery group

51 Table 2. Detailed clinical observations Hand held observations Sex Dose (mg/kg) Number of animals Handling reactivity Wound Skin color Soiled fur Exophthalmos Time in weeks Time in weeks Time in weeks Time in weeks Time in weeks Bef Bef Bef Bef Bef Score Male Female G2 (31.25) G3 (125) (500) G2 (31.25) G3 (125) (500) 10 a a a a See annex for details of score, Bef : Before the start of administration a : Main study(5 animals) + recovery group(5 animals)