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1 理學碩士學位請求論文 MALDI-TOF 질량분석기를이용한이황화결합확인 Identification of Disulfide Bonds by MALDI-TOF Mass Spectrometry 2004 年 2 月仁荷大學校大學院化學科 ( 化學專攻 ) 郭鎬錫

2 理學碩士學位請求論文 MALDI-TOF 질량분석기를이용한이황화결합확인 Identification of Disulfide Bonds by MALDI-TOF Mass Spectrometry 2004 年 2 月指道敎授崔英植 이論文을碩士學位論文으로堤出함 仁荷大學校大學院化學科 ( 化學專攻 ) 郭鎬錫

3 이論文을郭鎬錫의碩士學位論文으로認定함 2004 年 2 月主審副審委員

4 목 차 (Contents) 요약 (Abstract) 1 Ⅰ. 서론 (Introduction) 3 Ⅱ. 실험 (Experiment) 6 Ⅲ. 결과및토의(Results and Discussion) 9 [1] Performic acid 와과산화수소의산화반응 9 [2] Somatostatin 의산화반응과이황화결합확인 12 [3] Lysozyme 의산화반응과이황화결합확인 18 Ⅳ. 결론 (Conclusion) 23 Ⅴ. 참고문헌 (References) 24

5 요 약 질량분석기를사용하여단백질에이황화결합(disulfide bond) 의위치를확인하는방법을제시하였다. 변형되지않은단백질을효소(trypsin) 에의해서가수분해하면, 이황화결합을포함한펩티드가만들어진다. 50% acetonitrile 조건에서이황화결합을포함한용액에과산화수소 (H 2 O 2 ) 를첨가하면, 이황화결합은 cysteic acid(mso 3 H) 로산화된다. 산화반응이전에양이온과음이온의 MALDI 질량스펙트럼을얻는다. 그리고산화반응이후에도양이온과음이온의 MALDI 질량스펙트럼을얻는다. 이렇게얻어진 MALDI 질량스펙트럼들을비교하면, 양이온스펙트럼에서는이황화결합을포함한펩티드가산화반응이후에사라지고, 음이온스펙트럼에서는 cysteic acid를포함한산성의펩티드가나타나게된다. matrix에 ammonium sulfate 를첨가함으로써, 음이온질량스펙트럼에서는 cysteic acid를포함한펩티드의 signal 은증가되고, cysteic acid를포함하지않은펩티드의 signal 은감소하거나사라진다. 질량스펙트럼을통해서이황화결합으로연결된펩티드의정보를확인하고, 단백질의아미노산서열을이용해서이황화결합의위치를확인하였다. 1

6 Abstract Proposed an experimental protocol to confirm position of disulfide bonds in protein making use of mass spectrometry. After tryptic digestion of native protein, disulfide-containing peptides are made. If Add hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) to disulfide-containing peptides solution under 50% acetonitrile condition, disulfide bonds are oxidized to cysteic acid(mso 3 H). Get MALDI mass spectrum of positive and negative ion before oxidation reaction. And get MALDI mass spectrum of positive and negative ion after oxidation reaction. If compare MALDI mass spectrum, disulfide-containing peptides disappear after oxidation reaction in the positive mode spectrum, and cysteic acid-containing peptides appear in the negative mode spectrum. By adding ammonium sulfate to CHCA matrix, the signal intensities for cysteic acid-containing peptides are increased and the signal intensities for cysteic acid-noncontaining peptides are decreased or disappeared in the negative mode spectrum. Confirm peptide that is linked by disulfide bond through mass spectrum, and confirm position of disulfide bond by using amino acid sequence of protein. 2

7 Ⅰ. 서론 (Introduction) 단백질의이황화결합은번역후변형 (post-translational modification) 의하나로단백질(protein) 의 3차원적구조를안정화시키는역할을한다. 1 그러므로이황화결합(disulfide bond) 의확인은단백질의구조와기능에대한중요한정보를제공해준다. 이황화이성화효소(disulfide isomerase) 로인해발생되는이황화결합재배열은단백질의구조에변화를일으킨다. 단백질의구조변화에따른단백질의기능변화는생체내에질병을유발하기도한다. 2 같은질량을가진단백질이라도구조에영향을주는이황화결합의위치를확인하는것은매우중요하다. 1985년에 Morris와 Pucci는 Fast Atom Bombardment(FAB) 질량분석기를이용해서이황화결합의위치를확인하는방법을처음으로제안하였다. 3 이들은단백질가수분해효소를사용하여이황화결합을포함한펩티드를만들고, Dithiothreitol(DTT) 로환원전과후의펩티드의질량을 FAB 질량분석기로확인한다. 환원전과후의스펙트럼을비교하면, 환원후에사라진펩티드의질량은환원후에생성된펩티드들의질량에합으로나타나거나, 환원에의한질량차이를나타낸다. 환원전과후의질량분석으로이황화결합의연결정보를확인하고, 아미노산서열정보를이용하면이황화결합의위치도확인하였다. 이후에이방법은질량분석기를이용하여이황화결합을확인하는데많이활용되었다. 하지만 Morris와 Pucci의방법은 2개이상의이황화결합을가진펩티드는이황화결합의연결된위치를확인할수없었다. 이러한문제점을해결하기위해서여러가지의효소들과화학적분해반응을조합하여다른위치의펩티드결합을분해하였다. 여러번의반응을거쳐서 1개의이황화결합이포함된펩티드들을얻은후 Morris와 Pucci의방법으로이황화결합의위치를확인하였다. 4-7 한번의가수분해반응보다는더 3

8 많은정보를얻을수있었지만, 여러차례반응에따른시료손실과 HPLC 분리과정이필요했으며, 환원된 cysteine이이황화결합으로재결합되어이황화결합이재배열되는문제점이있었다. 그리고단백질에따라서여러번의반응이후에도 2개의이황화결합을포함하는펩티드가생성되기때문에모든이황화결합의위치를찾을수없었다. MALDI-MS 8 와 ESI-MS 9 가개발된이후에질량분석기를사용하여여러가지의효소와화학적분해반응으로다른위치의펩티드결합을분해하는방법과 Morris와 Pucci 방법을이용해서단백질의이황화결합을확인하였다 하지만 2개의이황화결합을포함한펩티드의이황화결합의위치는확인되지않았다. 이러한문제점을 Tandem MS와 PSD(Post Source Decay) 의활용으로해결하려는방법이제시되었다 이방법은진공상태에서펩티드를인위적으로높은상태의분자로만든후에펩티드결합이분해되는분자이온들을분석하여아미노산서열확인하고, 이황화결합의위치를확인하는것이다. 하지만 2개의이황화결합으로이루어진펩티드의스펙트럼을얻으면, 몇개의아미노산서열의스펙트럼이겹쳐나타나고감도가좋지않아서해석에어려움을주었다. 이황화결합의재배열과가수분해된펩티드에 2개이상의이황화결합이형성되는문제들을해결하기위해서 Michigan State University의 Watson group에서는이황화결합을포함한단백질을 partial reduction 하여부분적으로환원된단백질을얻었다. 이때환원된 cysteine을 cyanylation 시킨후에 ph 9에서 cysteine의 N-terminal을분해하여 1 개의이황화결합을포함한펩티드를만드는방법을제시하였다 하지만 cyanylation이모든 cysteine 에반응이잘일어나지않았으며, 이황화결합의재배열과여러차례의반응을통한부반응에의해서나타나는스펙트럼의복잡성과낮은감도때문에시료를 HPLC를통해서한번더분리분석을해야하는문제점이있었다. 이황화결합의재배열을막을수있는효과적인방법은이황화결합을 직접변형시키는방법이다. 1988년에 Sun과 Smith는이황화결합을 4

9 cysteic acid 로변형시키는방법을제시하였다. 이들을강한산화제인 performic acid를이용하여이황화결합을 cysteic acid로산화시킨후 에 FAB 질량분석기를 이용하여 이황화결합을 확인하였다. 하지만 performic acid의강한산화력으로인한부반응과 cysteic acid로산화 된펩티드는강한산성을나타내므로, 양이온생성과정에서 MH + 이온 의생성이어려워서 FAB 질량스펙트럼에서낮은감도를나타내는문 제점이있었다. 이연구에서는 Sun과 Smith의방법에서이황화결합을직접산화시킬 때발생하는부반응을줄이고, MALDI 질량분석기를사용하여 MALDI 이온생성과정에서생성되는양이온과음이온을이용하여이황화결합의 위치를확인하는데유용한스펙트럼을얻고자시도하였다. 산화반응에 서나타나는부반응을줄이기위해 performic acid 보다약한산화제인 과산화수소 (H 2 O 2 ) 를사용하고, cysteic acid로산화된산성의펩티드는 - MSO 3 음이온으로검출하였다. 또한 ammonium sulfate를 CHCA matrix에첨가해 MSO - 3 음이온의감도를증가시키고이황화결합에무관한펩티드이온들의검출감도를줄여서질량스펙트럼을단순화시켰다. 양이온검출에서산화반응전과후의질량스펙트럼을비교하면, 이황화결합을포함한펩티드의질량은산화되어변형되거나쪼개져사라진다. 음이온스펙트럼에서는산화반응전과후의질량을비교하면, 산화된펩티드는산성을나타나게되고, 질량스펙트럼에서는새로운질량이나타나게된다. 산화반응에의한질량의변화를이용해서이황화결합으로연결된펩티드를확인하였다. 단백질의아미노산서열과가수분해효소에의해서분해된펩티드의질량그리고질량분석기를통해서얻은정보를이용하여이황화결합의위치를확인하였다. 5

10 Ⅱ. 실험 (Experiment) [1] 질량분석기 Linear and reflectron MALDI 질량스펙트럼은 Applied Biosystems (Framingham, MA, USA) Voyager-DE STR time-of-flight mass spectrometer (nitrogen laser : 337 nm, 3 ns, pulse width, 3 Hz repetition rate) 를사용하였다. 모든스펙트럼은 linear mode에서 accelerating voltage: V, grid voltage: 95%, 100shot average 로설정해얻었으며, 검출기의감도를좋게하기위해서 이하의질량은 LMS(Low-Mass Gate) 를이용하여제거하였다. laser intensity는 까지사용하였으며, negative mode에서는 positive mode보다 laser intensity를 더올려사용하였다. 각각의스펙트럼은아래와같은조건에서얻어졌다. - 산화된 somatostatin의스펙트럼 extraction delay time: 150 ns, guide wire: 0.01% - 가수분해된 somatostatin의스펙트럼 extraction delay time: 60 ns, guide wire: 0.01% - 가수분해된 lysozyme의스펙트럼 extraction delay time: 120 ns, guide wire: % [2] Trypsin 가수분해반응 - Somatostatin의 trypsin 가수분해반응 가수분해반응은 100 mm ammonium bicarbonate(sigma, A-6141) 10 μl, M somatostatin (Sigma, S-9129) 10 μl, 0.01μg/ μ L TPCK treatment Trypsin (Sigma, T-1426) 3μL을순서대로혼합한 6

11 후 37 에서 4 시간동안반응시킨다. 기질(substrate) : 효소(enzyme) 비율은 67:1 (w: w) 로반응시킨다. -Lysozyme의 trypsin 가수분해반응 가수분해반응은 100 mm ammonium bicarbonate 20μL, M lysozyme(usb, 18645) 20 μl, acetonitrile 5 μl, 0.4 μg/ μl TPCK treatment Trypsin (Promega, Madison, WI) 1 μl을순서대로혼합한후 37 에서 12 시간동안반응시킨다. 기질 : 효소비율은 250:1 (w: w) 로반응시킨다. [3] 산화반응 - Performic acid 산화 Performic acid의제조는 88% formic acid(sigma, ) 900 μl 에 30% 과산화수소(Sigma, ) 100 μl를혼합한다음상온에서 1시간동안방치하면 performic acid 가생성된다. 생성된 performic acid 는얼음속에서냉각시킨후에사용한다. performic acid의생성량 22,23 은대략 μg/ml(about 7 mm) 이생성된다. 시료 /H 2 O 용액 10 μl와 performic acid 용액 1 μl를혼합한후상온에서 10 분동안반응시킨다. - 과산화수소산화 시료/50%acetonitrile 용액 10 μl에 3% 과산화수소 (1.04 mm) 1 μl 를혼합한후상온에서 10 분동안반응시킨다. [4] MALDI 시료의제조 이실험에서는 CHCA( α-cyano-4-hydroxycinnamic acid; Aldrich, 7

12 ) matrix 를사용하였다. CHCA는 EtOH에서한번의재결정을한후에사용하였다. 모든 solvent는 HPLC grade 순도를사용하였다. - Dried droplet method Matrix solution은 50% acetonitrile 1 ml에 CHCA 10 mg를녹인후 TFA(Trifluoroacetic Acid) 1 μl를넣어 vortex mixer를사용하여혼합 한후사용하였다. matrix solution 10 μl에시료 solution 1 μl를혼합 한 후 ammonium form bead를 전체부피의 절반정도의 양을 넣고 vortex mixer를사용하여혼합한후 1 μl를 stainless plate에떨어뜨린 후상온에서건조시킨다. -Thinlayermethod Matrix solution은 100 μl(chca 10 mg/dmf 1 ml) 에 0.1 M ammonium sulfate(aldrich, ) 1 μl를섞고원심분리한뒤에 μl를 stainless plate에떨어뜨린후따뜻한공기를흘려주면서건조시켰다. 시료 solution 10μl에 ammonium form bead를전체부피의절반정도의양을넣고 vortex mixer를사용하여혼합한뒤에 1 μl를건조된 matrix 위에떨어뜨리고상온에서건조시킨다. - Ziptip Cleaning μ-c 18 Ziptip 을다음과같은순서대로 (100% acetonitrile 50% acetonitrile : 0.1% TFA 0.1% TFA) 10 μl씩 2-3회 pipetting 후용액은버리고시료 solution에서 2-3회 pipetting을한뒤에 0.1% TFA solution에서 10 μl씩 2-3회 pipetting 한다음시료의손실을적게하기위해서 CHCA matrix solution (50% acetonitrile: 0.1% TFA) 10 μl 에바로용출시킨다. 시료가용출된 matrix solution을 stainless plate에 1 μl 를떨어뜨리고건조시킨다. 8

13 Ⅲ. 결과및토의 (Results and Discussion) [1]. Performic acid와과산화수소의산화반응 Performic acid는일반적으로아미노산정량분석 24 과이황화결합의직접산화를통해서이황화결합의개수를알아내는데많이사용되었다. 25 하지만강산산화제이기때문에 cysteine, methionine, tryptophan, serine, threonine, tyrosine와같은 residue에서도산화반응이나타난 다. 26 Performic acid 에의한펩티드의산화반응은이황화결합(disulfide bond), methionine, tryptophan 의잔기(residue) 들이비교적수용액에서쉽게산화되며, 산화된펩티드를 FAB 질량분석기를통해서확인하였다. 22 하지만 performic acid는강한산화제이면서쉽게증발하는성질이있어상업적으로판매되지않으며인체에강한독성을지니고있다. 반면에과산화수소는강한산화제이면서비교적안정적이고상업적으로시판되어지고있으며, performic acid 보다다루기가더쉽다. 1개의이황화결합을가지고있는 somatostatin의과산화수소산화반응조건은 performic acid와는달리 50% acetonitrile의수용액상에서반응이잘일어난다. 100% acetonitrile과 H 2 O에서는전혀반응이일어나지않았다. MALDI 시료조제조건인산성(pH 1-2) 에서는산화반응이일어나지않았고, 중성상태(pH 7-8) 에서만산화반응을보였다. performic acid와다른산화조건을보이는이유는과산화수소가 performic acid 보다는약한산화제이기때문이다. acetonitrile과같은유기용매는친수성과소수성을모두지니고있어서물과잘섞일수있으며, 동시에물과잘섞이지않는화합물도용해도를증가시킬수있을것이다. 그림 1은수용액에 acetonitrile 비율증가에따라서산화반 응의반응성이증가해 cysteic acid로산화된 peak(m/z ) 의상 9

14 대적크기가증가하는것을보여주고있다. 이것은수용액에 acetonitrile이증가하면서이황화결합의용해도가증가되어이황화결합과과산화수소의반응성이증가한것으로추측된다. 그림 1. MALDI-TOF mass spectra of somatostatin (m/z ) after oxidation with H 2 O 2 in (A) H 2 O; (B) 20% acetonitrile, m/z ; and (C) 40% acetonitrile. 그림 2와같이 performic acid에비해과산화수소는약한산화제이기때문에같은시간동안산화가되더라도(10 분) 이황화결합은쉽게산화되어 cysteic acid 로변하고, tryptophan은느리게산화되어산화된 tryptophan의 signal 은약하게나타난다. 음이온검출에서 tryptophan이 과산화수소로산화되어나타나는형태는 Trp+Oxygen 형태와 10

15 Trp+2Oxygen 형태가약하게나타난다. 하지만강한산화제인 performic acid의경우산화반응이더진행되어 Trp+Oxygen 형태가크게나타나는것을볼수있다. 그리고양이온검출에서 performic acid는이황화결합이 cysteic acid로불완전산화에의해서나타나는 signal과산화된 tryptophan의 signal 이나타난다. 그림 2. MALDI-TOF mass spectra of somatostatin (A,D) before oxidation, m/z ; (B,E) after oxidation with H 2 O 2 ; and (C,F) after oxidation with performic acid. 10분동안의산화반응에서 performic acid 와과산화수소/50% acetonitrile 는이황화결합을 cysteic acid로산화시켰다. performic acid 산화반응에서 는 tryptophan의산화된 signal 이크게나타났다. 반면에과산화수소/50% acetonitrile의산화반응은 tryptophan의산화된 signal 이약하게나타나고, cysteic acid로산화된펩티드의 signal 은크게나타났다. 양이온검출에서 perfomic acid 산화반응에의해서생성된 signal 은보이지만, 과산화수소 산화반응에의해서생성된 signal 은보이지않았다. performic acid에비해 11

16 약한산화제를사용해서산화된펩티드가검출한계까지생성하지않는것으로보일수도있지만, 음이온검출에서산화되어나타난 signal은거의같은감도를나타낸다. 용액에 acetonitrile의포함으로부반응이다르게나타나는것으로보일수도있지만, performic acid의산화반응은 50% acetonitrile 에서도부반응을나타냈다. 50% acetonitrile 용액에서과산화수소를이용한산화반응은부반응을최소한줄이면서이황화결합을 cysteic acid 로산화시키는데적합하다. [2]. Somatostatin의산화반응과이황화결합확인 Somatostatin을 trypsin 가수분해를하면 1개의이황화결합을가진펩티드 (m/z ) 와다른 1 개의펩티드 (m/z ) 가생성된다. trypsin 가수 분해의조건은 50 mm NH 4 HCO 3 (ph 7-8) 에서반응이일어나므로, trypsin 가수분해후가수분해된용액을 50% acetonitrile조건에서바로과산화수 소를첨가하면바로산화반응이일어난다. ph 7-8에서는과산화수소산화 반응이잘일어나는조건이므로 ph 변화과정과 cleaning 과정을없이도 산화반응이일어난다. 0.1mM H 2 O 2 50% ACN 10 min Mass : Mass : Mass : Mass : 그림 3. Oxidation of tryptic digestion of somatostatin 그림 3과같이 somatostatin은 trypsin 가수분해반응에의해서 2개의펩티드로분해된다. 이중에서 1개의이황화결합을포함한펩티드는산화반 12

17 응이후에 cysteic acid를포함한 2 개의펩티드를생성한다. cysteic acid(mso 3 H) 를포함한펩티드는술폰산 (-SO 3 H) 기에의해서강한산성을지니므로 H + 가떨어지고 MSO - 3 형태가기체상에서안정하게존재할수있을것이다. MALDI 이온생성과정에서 cysteic acid를포함한펩티드는다른어떤작용기들보다강한산성이므로쉽게 H + 를내주게되고 MSO - 3 형태가기체상에서안정하게존재할것이다. cysteic acid를포함한펩티드는음이온으로검출될것이다. 그림 4. MALDI-TOF mass spectra by dried droplet method of somatostatin (A) before oxidation and after oxidation with H 2 O 2 (B) in negative mode; and (C) in positive mode. 13

18 하지만일반적인 dried droplet 방법을사용하면그림 4와같이양이온은 잘검출되는반면에산화반응이후에음이온은검출되지않았다. 일반적으 로 MALDI 시료의제조방법에서는산성용액인 matrix 용액에시료용액을 첨가한후섞어서사용하는데, 이때카르복시기를가지는 matrix가펩티드 에비해 배정도가더존재하며더강한산성의조건을만들기 위해서 matrix 용액에 TFA가 0.1% 포함되기때문에강한산성인펩티드라 도이온생성과정에서음이온형태가안정하게존재하기가어렵다. 그리 고가수분해되지않은 somatostatin은 2개의 cysteic acid를가지는반면 에가수분해가된 somatostatin 중에 1개의이황화결합을포함한펩티드는 산화반응후에 1개의 cysteic acid 를포함한다. cysteic acid의개수가감소 하면서 cysteic acid가 2개있을때보다는약산성을나타내므로음이온의 signal 은잘나타나지않았다. 인산(Phospholic acid) 기를포함한 oligonucleotide와 phosphopeptide는 MALDI 질량분석기를사용해서분석할경우에일반적으로음이온을검출한 다. 이때 ammonium salt를첨가하면 signal을증가시킬수있다고알려져 있다 하지만시료와 matrix 그리고 ammonium salt 종류에따라서 signal 의증가하는경향은다르게나타났었다. MALDI 이온생성과정중에 plume이되는과정은 matrix와시료가섞인고체가기화되는과정이다. 짧은시간동안 matrix와시료가 proton transfer 과정을거쳐이온화되고, MH + 이온이주로생성된다. 이온화효율이좋은 CHCA matrix와산성의펩티드그리고 plume 과정에서안정한 ammonium salt 의음이온이펩티드보다과량존재한다면, ammonium salt 음이온이 plume 과정에서 matrix에서제공되는상당히많은 proton을산성의펩티드대신에받아줄수있으며, 산성의펩티드에 proton을제거할수도있을것이다. plume 과정에서 ammonium salt의음이온은음이온형태를나타내므로 proton 을다시제공해야한다. 이때충돌의확률이높은 matrix와 proton transfer가쉬운염기성의펩티드에 proton을제공할확률이높을것이다. UV laser pulse 직후에 peak의분해능을증가시키기위해서강한 14

19 전기장이생기기전에 ns delayed time 이주어진다. delayed time 은분자들의충돌횟수증가시켜주며, 이로인해서 ammonium salt의음이 온에의해서발생되는 proton 의재분배효과는증가될것이다. 이렇게 ammonium salt의음이온은 는기체상에서음이온으로존재하게되며, 을것이다. proton의재분배과정을통해서산성의펩티드 음이온으로쉽게검출할수있 그림 5. After add 1 M ammonium salt 1 μl to 1 μm bradykinin 2-9 solution 10 μl, MALDI-TOF low-mass spectra by thin layer method in negative mode. 그림 B-1901) 10 5는 1 M ammonium sulfate 1 μl와 1 μl를혼합한용액의 1 μl를 μm CHCA matrix spot bradykinin 2-9 (Sigma, 위에떨어뜨리 고, 건조시킨후에음이온스펙트럼을얻은것이다. [CHCA-H] - 이온이크 15

20 - 게나타나며 sulfate(so 4 ) 음이온에 H + - 가붙은 HSO 4 (m/z 97.52) 이온의 signal 이크게나타난다. 그리고 citrate 의 [citrate-h] - (m/z ) 음이온 도나타났다. 하지만 matrix signal 과상대적크기를비교해본다면, 음이온 의안정도는 HSO 4 - 음이온이더안정할것이다. 그림 6. After add 1 M (NH 4 ) 2 SO 4 1 μl to tryptic digest of somatostatin solution 10 μl, MALDI-TOF mass spectra by dried droplet method (A) before oxidation in positive mode and after oxidation with H 2 O 2 (B) in positive mode; and (C) in negative mode. Dried droplet 방법으로 TFA가첨가되지않은 CHCA matrix 용액과시료를 혼합한용액 10 μl에음이온이가장안정했던 1 M ammonium sulfate 1 μ 16

21 L를혼합한다. 혼합된용액의 1 μl를 stainless plate에떨어뜨려건조시킨 후에그림 6 과같은스펙트럼을얻었다. 하지만산화반응에의해생성된 cysteic acid를포함한펩티드는 1 개나타났다. matrix 용액과시료가혼합 된상태그리고 matrix와시료의혼합된결정상태에의해서 matrix가펩티 드에주는 proton transfer 영향이크기때문에 sulfate 음이온의역할을방 해할수있다. 그림 7. After add 1 M (NH 4 ) 2 SO 4 1 μl to CHCA matrix solution 10 μ L, MALDI-TOF mass spectra of tryptic digest of somatostatin by thin layer method (A) before oxidation in positive mode and after oxidation with H 2 O 2 (B) in positive mode; and (C) in negative mode. 17

22 시료와 matrix가혼합되는과정이없는 thin layer 방법을사용하면서 matrix 용액에 ammonium sulfate를첨가해그림 7과같은깨끗한스펙트럼 을얻었다. matrix와시료를혼합하는과정이없으므로 matrix의직접적인 영향을제거했으며, 시료에 ammonium sulfate을첨가하지않고 matrix에 ammonium sulfate 를첨가해시료에오염을적게했다. cysteic acid를포 한산성의펩티드는음이온스펙트럼에서 2 개모두얻었다. thin layer 방법 을사용하여 sulfate 음이온의효과를증가시켰으며, 좋은감도의스펙트럼 을얻을수있다. [3]. Lysozyme 의산화반응과이황화결합확인 Lysozyme은 3차원적구조를형성하고있기때문에 trypsin 가수분해가쉽 게진행되지않는다. trypsin 가수분해반응을통해서이황화결합을포함한 펩티드를얻기위해서는 trypsin의양을 lysozyme 보다적은양을사용하면 서긴시간동안반응시켰다. 가수분해반응시간을증가시키면, 이황화결합 을포함한펩티드의양을검출한계이상생성시킬수있다. A. CELAAAMK GCR B. GYSLGNWVCAAK CK C. WWCNDGR NLCNIPCSALLSSDITASVNCAK 그림 8. Sequence of disulfide bond containing fragment peptide lysozyme. 18

23 Ammonium sulfate가첨가된 CHCA matrix를이용한 thin layer 방법으로 trypsin 가수분해된 lysozyme 의산화반응전과후의스펙트럼을비교했다. 음이온스펙트럼에서는 cysteic acid 를포함한펩티드의질량을얻었지만, 양이온스펙트럼에서는 3000 이상의질량이관찰되지않았다. 그리고이황 화결합을포함한펩티드들의 signal 크기가작거나거의나타나지않았다. 그림 8을보면 trypsin 가수분해에의해서생성된펩티드들은 C-terminal 에 Arg 또는 Lys 가존재하게된다. 이때 C-terminal에 Lys를가지는펩티 드들은 Arg 에비해상대적으로감도가적다고알려져있다. 30 lysozyme의 아미노산서열과이황화결합의연결위치를 Swiss-Prot/EMBL-Prot databases 에서확인했다. 31 GPMAW program (lighthouse data, Denmark) 을 사용하여 trypsin 가수분해반응에서생성된펩티드의질량을확인했다. 그 림 8 에서이황화결합을포함한펩티드의아미노산서열을확인해보면, 1개 의 C-terminal을제외한나머지는 Lys 로되어있다. MH + 이온의감도를증 가시키기위해서 dried droplet 방법을사용하였고, 스펙트럼을얻은결과 다른 signal 보다상대적크기는작지만, 이황화결합을포함한펩티드들이 검출된다. 산화반응이전의스펙트럼은 dried droplet 방법을이용해서얻었으며, 산 화반응이후의스펙트럼은 ammonium sulfate를첨가한 CHAC matrix를이 용한 thin layer 방법으로얻은것이그림 9 와같다. 양이온스펙트럼에서는 화살표로표시한부분이이황화결합을포함한펩티드이며, 음이온스펙트 럼에서는화살표로표시한부분이이황화결합이 cysteic acid로산화된펩 티드들이다. * 모양으로표시한 signal의펩티드는 Trp을포함하고있어서 산화반응에 의해서 변형되어 사라진 것으로 추측된다. 그리고 3개의 cysteic acid 를포함한펩티드 (m/z ) 는오히려 1개의 cysteic acid 를포한한펩티드보다 signal 이작게나타났다. μ-c 18 Ziptip (millipore, USA) 을 사용해 cleaning 후에 3개의 cysteic acid를 포함한 펩티드의 signal 세기는증가했다. 질량이큰펩티드의 signal은 buffer와 salt의영향 으로 signal 이감소한것이다. Ziptip cleaning은 TFA를포함한산성용액에 19

24 서 cleaning 과정을거치기때문에 1개의 cysteic acid를포함한산성의펩 티드는나타나지않았다. 펩티드들은산화반응이후에 음이온스펙트럼에서산화반응이전에보이는 ammonium sulfate의첨가로스펙트럼에서사 라지거나 signal 이감소되어나타났다. 이렇게산화반응전과후의스펙트 럼그리고양이온과음이온의스펙트럼을비교해보면, 이황화결합과관련 된질량들을쉽고빠르게관찰할수있다. * 그림 9. MALDI mass spectra of tryptic digests of lysozyme (A,C) before oxidation (dried droplet method); and (B,D) after oxidation with H 2 O 2 (thin layer method). 표 1 을보면이론값의질량과실험값의질량을정리해놓았다. buffer와 salt 그리고 matrix의강한 signal 때문에 400이하의질량을가지는펩티드 20

25 들은확인하지못하였다. 1개의이황화결합을가지고있을때질량차이는 96 이된다. 6-13의잔기들중에서 methionine 이포함되어있으며, 산화반 응에의해서 methionine은 sulfone(-ch 2 SO 2 CH 3 ) 으로변하고질량변화는 32 가더증가했다 의잔기들중에서 3개의 cysteine은 1개의내부 이황화결합(intra-disulfide bond) 과 1 개의외부이황화결합(inter-disulfide bond) 이존재하기때문에 3개의 cysteic acid 가생성된다. -1가형태의음 이온이검출되기때문에 1개의 cysteic acid 는음이온(MSO - 3 ) 으로존재하지 만나머지 cysteic acid 는중성상태(MSO 3 H) 로존재하게된다. 질량변화는 194(96+98) 가된다. 양이온검출에서의질량값은계산값과실험값의오차 범위가 % 에불과하지만음이온검출에서계산값과실험값의 오차범위는 % 의큰값을나타냈다. 질량이증가할수록질량의 계산값과실험값의차는증가했다. 음이온스펙트럼에서는안정하고감도 가좋은 calibration 물질을찾지못했다. calibration을하지않은상태에서 스펙트럼을얻었기때문에계산값과오차가많이생겼다. 음이온검출에서 안정하고감도가좋은 인할수있을것이다. calibration 물질을사용한다면더정확한질량을확 표 1. Mass of molecular ions in the MALDI mass spectrum of peptides found in the tryptic digest of lysozyme a before and after oxidation with hydrogen peroxide Residues 6-13 / / / Mass of Non-oxidized MH + Calculated Observed mass mass Mass of Oxidized [M -H] - Calculated Observed mass mass Mass Shift (M' 1 +M' 2 -M) Calculated Observed mass mass

26 MALDI 질량분석기를통해서 cysteine의개수와이황화결합의위치를부분 적으로확인할수있었다. 400이하의질량을갖는산화된펩티드의생성과 펩티드에 2 개의이황화결합이있어서, 이황화결합의정확한위치를찾기 위한질량을모두얻지는못했다. 22

27 Ⅳ. 결론 (Conclusion) 이연구에서는이황화결합을과산화수소를사용해서단한번의산화반응으로 cysteic acid 로변형시킬수있는방법을제시하였다. 그리고음이온스펙트럼에서는 ammonium sulfate를사용으로산화된펩티드의검출감도를증가시켰고, 이황화결합과관련이없는 signal을감소시키거나사라지게했다. 이런방법을이용하여이황화결합의위치를쉽고빠르게확인하는방법을제시하였다. 이연구에서사용된방법은이전의방법들에비해서변형시키고자하는반응조건의변화가적고, 하나의 tube안에서가수분해반응과산화반응을처리하기때문에시료의손실이적으며, 단순화되어진스펙트럼으로쉽게이황화결합의정보를얻을수있다. 하지만 trypsin 가수분해반응에서생성된펩티드중에이황화결합을 2개이상포함하면정확한이황화결합의위치를확인할수없었고, 400이하의질량을갖는산화된펩티드도 matrix의강한 signal 때문에검출할수없었다. MALDI 질량분석기의질량검출한계와 1개의이황화결합을포함한펩티드를생성할수없는문제점때문에이황화결합에대한모든정보를얻을수없었다. 하지만한번의산화과정을통해서부반응과시료의손실없이이황화결합을재결합하지않도록변형시킬수있었으며, 단순화되어진스펙트럼을통해서쉽게이황화결합을확인할수있는방법을제시하였다. 23

28 Ⅴ. 참고문헌 (References) 1. Wedemeyer, W. J.; Welker, E.; Narayan, M.; Scheraga, H. A. Biochemistry 2000, 39, Kim, H. T.; Russell, R. L.; Raina, A. K.; Harris, P. L.; Siedlak S. L.; Zhu, X.; Petersen, R. B.; Shimohama, S.; Smith M. A.; Perry, G. Antioxid Redox Signal. 2000, 2, Morris, H. R.; Pucci, P. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1985, 126, Yazdanparast, R.; Andrews, P. C.; Smith, D. L.; Dixon, J. E. J. Biol. Chem. 1987, 262, Smith, D. L.; Zhou, Z. Methods Enzymol. 1990, 193, Zhou, Z.; Smith, D. L. Biomed. Environ. Mass Spectrom. 1990, 19, Poerio, E.; Caporale, C.; Carrano, L.; Pucci, P.; Buonocore, V. Eur. J. Biochem. 1991, 199, Karas, M.; Hillenkamp, F. Anal. Chem. 1988, 60, Fenn, J. B.; Mann, M.; Meng, C. K.; Wong, S. F.; Whitehouse, C. M. Science 1989, 246, Robertson, J. G.; Adams, G. W.; Medzihradszky, K. F.; Burlingame, A. L.; Villafranca, J. J. Biochem. 1994, 33, Sparrow, L. G.; McKern, N. M.; Gormann J. J.; Strike, P. M.; Robinson, C. P.; Bentley, J. D.; Ward, C. W. J. Biol. Chem. 1997, 272, Haniu, M.; Arakawa, T.; Bures, E. J.; Young, Y.; Hui, J. O.; Rohde M. F.; Welcher, A. A.; Horan, T. J. Biol. Chem. 1998, 273, 24

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(Microsoft PowerPoint - src.ppt [\300\320\261\342 \300\374\277\353] [\310\243\310\257 \270\360\265\345])

$(Microsoft PowerPoint - src.ppt [\300\320\261\342 \300\374\277\353] [\310\243\310\257 \270\360\265\345])$ LC/MS, LC/MS/MS 기초개론 LC LC/MS(Liquid Chromatography/Mass Spectrometry) 액상의분석물질을기화및이온화하여고진공관에서원하는질량 (m/z) 이나질량범위만검출하여정량 정성분석하는시스템 High vacuum PC/Software Ion source Mass Analyzer Detector ESI APCI APPI