대한진단검사의학회지 : 제 25 권제 6 호 2005 Korean J Lab Med 2005; 25: 수혈의학 제대혈유래 CD34 양성세포로부터적혈구분화유도와 Microarray를이용한유전자프로파일분석 김창기 이지혁 1, 박광일 김현숙 유철주 2 라선영 3

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소연 당
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1 대한진단검사의학회지 : 제 25 권제 6 호 2005 Korean J Lab Med 2005; 25: 수혈의학 제대혈유래 CD34 양성세포로부터적혈구분화유도와 Microarray를이용한유전자프로파일분석 김창기 이지혁 1, 박광일 김현숙 유철주 2 라선영 3 김현옥 연세대학교의과대학진단검사의학과, 내과 1 소아과 2, 암전이연구센터 3 Ex Vivo Generation of RBCs from CD34+ Cells in Human Umbilical Cord Blood and Expression Profile Analysis Using Microarray Chang Ki Kim, M.D., Jihyuk Rhee, M.D. 1, Kwang-il Park, M.D., Hyon Suk Kim, M.D., Chuhl Joo Lyu, M.D. 2, Sun Young Rha, M.D. 3, and Hyun Ok Kim, M.D., Departments of Laboratory Medicine, Internal Medicine 1, Pediatrics 2 and Cancer Metastasis Research Center 3, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Background : In this study, we attempted to generate RBCs from CD34+ cells in cord blood using a 3-step culture protocol and also evaluated a change in immunophenotypic characteristics and expression profile according to erythropoietin (EPO) concentrations and culture duration. Methods : Using mini-macs columns, CD34+ cells were isolated from cord blood. The culture procedure comprised three steps. For each step, cells were cultured sequentially for 7 days in a serum free liquid medium with a specific combination of growth factors for 21 days. [1st step: Flt3-ligand (Flt3-L), thrombopoietin and stem cell factor (SCF); 2nd step: IGF-1, SCF and EPO; and 3rd step: IGF-1 and EPO] To evaluate the effect of EPO on proliferation and differentiation, cells were cultured with different EPO concentrations (0, 3, 10 & 20 U/mL). Cell count and morphology were monitored during the culture. For phenotyping, antibodies to CD34, CD38, CD45 and glycophorin A (GPA) were used. The expression profile of cultured cells was analyzed by 17,000-gene microarray analysis. Results : As EPO concentration increased, cell expansion was also increased, showing a maximum expansion at 20 U/mL. The cell population showed a gradual decrease in expression of CD34 and CD45, whereas the expression of GPA was not prominent in any conditions. However, we observed increased expression in some genes associated with erythropoiesis (e.g. glycophorin A, rhesus blood group CcEe antigens). Conclusions : This study shows that erythropoietin enhances the proliferation of hematopoietic progenitor cells. Our culture system did not achieve pure production of RBCs, but induced expression changes that indicated erythroid differentiation. (Korean J Lab Med 2005; 25: ) Key Words : Cord blood, CD34+ cells, Erythropoietin, RBCs 접수 : 2005년 7월 18일접수번호 : KJLM1869 수정본접수 : 2005년 11월 7일교신저자 : 김현옥우 서울시서대문구신촌동 134 연세대학교의과대학진단검사의학교실전화 : , Fax: hyunok1019@yumc.yonsei.ac.kr * 본연구는과학기술부 21 세기프론티어연구개발사업단인세포응용연구사업단의연구비지원 ( 과제관리번호 SC13051) 에의해수행되었음. 서론의료기술의발달로장기이식술의보편화, 노령화인구증가, 교통사고증가등혈액에대한수요가급격히증가하고있다 [1]. 그러나안전한혈액을공급하려는노력에도불구하고수혈을통한 B형간염, C형간염, HIV 감염사례가사회적으로큰파장을준바있다 [2-4]. 또한 West Nile virus, variant Creutzfeldt- 457

2 458 김창기 이지혁 박광일외 4 인 Jakob disease 등의새로운병원체로인한수혈전파성감염이보고되고있다 [5, 6]. 따라서감염의위험이없으며안정적으로혈액을공급하기위한노력이모색되어왔으며, 그중하나로조혈모세포를배양하여새로운혈액의공급원으로이용하려는연구가시도되었다 [7-12]. 조혈모세포에대한개념이부족하였던과거에는성인의골수나말초혈액에서분리한단핵구를바로배양에이용하였다 [13-15]. 그러나조혈모세포의표지인자인 CD34 단클론성항체를이용하여순수한조혈모세포분리가가능하게되면서 CD34 양성세포를분리하여조혈모세포분화연구에많이사용하게되었다 [16-18]. 조혈모세포원으로가장많이쓰이는것은골수이지만최근제대혈의이용이늘고있다 [19]. 골수에비해서제대혈은비교적구하기쉽고조혈모세포의농도가높으며 [20, 21], 조혈모세포가보다더미성숙하고증식능력이우수하여배양시간이짧은장점이있어이를이용한세포배양이활발히진행되고있다 [20, 22, 23]. 조혈모세포로부터적혈구분화는초기 CD34 양성세포의증폭배양과정과 erythropoietin (EPO) 에의한적혈구분화를유도하는두단계로나누어진다. 이는초기배양에필요한성장인자와적혈구분화를유도하는성장인자가다르기때문이다 [24], 초기배양에첨가되는 Flt3-ligand (Flt3-L), stem cell factor (SCF) 그리고 thrombopoietin (TPO) 등의성장인자는다양한분화능력을가진혈액줄기세포의성장과증식을촉진하는것으로알려져있다 [7]. 이들중 SCF는조혈모세포의초기성장뿐아니라특정세포의분화와성숙을유지하는데도움을준다 [9]. 반면 EPO 는적혈구모세포에대해서 mitogen의역할과성장인자로서작용하여적혈구모세포의증식과적혈구로의분화를촉진한다 [7]. 특히적혈구계열이아닌다른혈구들의분화를억제하기위해서는 EPO의자극이가장중요한것으로알려져있다 [7, 23]. 기존의적혈구분화유도연구에서는배양방법을 EPO에독립적인초기와 EPO를통해최종적혈구분화를유도하는후기의두단계로구분하는유사점이있다. 그러나적혈구분화를위한적정 EPO 농도와배양초기에 EPO가미치는영향에대한보고는많지않다. 따라서본연구에서는제대혈로부터 CD34 양성세포를분리하여세분화된배양조건에서적혈구분화를유도하였고배양초기부터다양한농도의 EPO를첨가하는실험을병행하여적혈구분화과정에미치는 EPO의효과를규명하고자하였다. 또한적혈구분화과정중유전자발현을 high-density microarray 방법을이용하여측정함으로써적혈구분화유도에따른유전자발현양상의변화를알아보고자하였다. 한후제대혈을채집하였다. 분만후제대를이중으로결찰하고소독한후제대를절단하였으며, 태반이만출되기전제대정맥에서 25 ml의항응고제 CPDA-1이포함된채혈백 ( 녹십자, 서울, 한국 ) 을사용하여제대혈을채취하였다. 2. 조혈모세포분리제대혈을 Ficoll-Hypaque ( 비중 1.077, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 를이용하여단핵구층을분리하였다. CD34 양성세포는분리된단핵구로부터 high-grade magnetic field와 mini-macs column (Miltenyi Biotech, Auburn, CA, USA) 을이용한 superparamagnetic microbead 방법으로분리하였다. 3. 배양기본배지는 X-Vivo 10 (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA) 에 50 g/ml iron-saturated human transferrin, 90 g/ ml ferric nitrate, 100 g/ml insulin, 30 g/ml soybean lecithin, 7.5 g/ml cholesterol 그리고 10-6 M hydrocortisone을첨가하여제조하였다. 배양은 3주 (21일 ) 동안진행하였다. 첫 1주는조혈모세포의증식을유도하기위해 CD34 양성세포를 10 4 /ml 농도로기본배지에부유시키고, 50 ng/ml Flt3-L (PeptroTech Inc., Rocky Hill, NJ, USA), 100 ng/ml TPO (PeptroTech Inc.) 그리고 100 ng/ml SCF (Endogen, Woburn, MA, USA) 의농도로배지에첨가하였다. 2주째에는적혈구모세포의증식을위해 50 ng/ ml SCF, 3 U/mL EPO 그리고 50 ng/ml Insulin like growth factor-1 (IGF-1, PeptroTech Inc.) 이첨가된배지에서세포를배양하였다. 마지막 3주에는적혈구모세포의최종분화를유도하기위해 3 U/mL EPO와 50 ng/ml IGF-1이첨가된배지에서배양을시행하였다. 조건별로 3개씩총 12개의배양을시행하였다. 37 의온도와 5% 의 CO2 대기조건에서배양을시행하였으며, 배지는 3-4일마다교체하였다. 배양세포의증식정도는 hemocytometer를이용하여측정하였으며, 새로분주하는세포수를 /ml로조정하였다. 또한세포의형태변화를분석하기위하여슬라이드도말표본을만들어 Wright-Giemsa 염색후현미경으로관찰하였다. 4. 유세포분석 1. 제대혈의채집 재료및방법 세브란스병원분만실에서정상분만한산모로부터동의를구 면역표현형분석을위하여 CD45, CD34, CD38, GPA (Immunotech, Marseille, France) 에대한단클론성항체를사용하였다. Mini-MACS column을통해분리된세포는배양직전에 CD45 와 CD34의표현을측정하여순수도를구하였고, 배양 7일, 14일, 21일째배양세포에대해 CD45, CD34, CD38, GPA의표현을측정하였다. 유세포분석은 EPICS XL (Beckman-Coulter Inc.,

3 제대혈 CD34+ 세포의적혈구분화유도와 Microarray 분석 459 Miami, FL, USA) 을사용하였다. 5. 배양세포의유전자 microarray 분석 1) RNA 추출및증폭세포를 정도취하여 TRIzol LS Reagent (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) 와 RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) 을이용하여 total RNA를분리, 정제하였다. 4 g의총 RNA를 template로하여 oligo-dt24/t7 primer와 SuperScript II RT (Invitrogen Corp.) 를이용하여 42 에서 1시간동안반응시켜 cdna를합성하였다. 첫번째반응이끝난혼합물에 dntp mix와 DNA ligase, DNA polymerase I, RNase H 2U를가하고 16 에서 2시간동안반응시켰다. 이후 T4 DNA polymerase를가하고 16 에서 5분간반응시킨후 double stranded cdna를추출하였고, T7 MEGAscript kit (Ambion, Austin, TX, USA) 을사용하여 double stranded cdna로부터 mrna 를전사했다. 2) RNA labeling과교잡반응증폭된 mrna 4 g의역전사반응에 Cyanine 3-dUTP (NEN Co., Boston, MA, USA) 혹은 Cyanine 5-dUTP (NEN) 를가하여표지하였다. 대조군인 CD34 양성세포 RNA 는 Cyanine 3로배양세포의 RNA는 Cyanine 5로표지하여표식자를만들었다. 표식자는 QIAquick PCR Purification kit (Qiagen) 를사용하여정제하였다. 최종적으로표식자는 Microcon YM-30 column (Millipore, Bedford, MA, USA) 로적당한용적을맞추었으며, 100 에서 2분간 denaturation시켰다. Microarray는 17,000개의인간유전자를포함한 cdna chip (GenomicTree Co., Daejon, Korea) 를사용하였다. 교잡반응을시행하기전에 3.5X SSC, 0.1% SDS, 10 mg/ml bovine serum albumin을가하여 42 에서 1시간동안 prehybridization을시켰 다. 배양세포및제대혈조혈모세포의증폭된 RNA로부터만들어진표식자 4 g을 25% formaldehyde, 5X SSC, 0.1% SDS와함께 62 에서습도를유지하면서하룻밤동안반응시켰다. 교잡반응이끝난다음 array는 2X SSC와 0.1% SDS, 1X SSC와 0.1 % SDS, 0.2X SSC 및 0.05X SSC로순서대로각 2분간세척하였고, 500 g에서원심분리하였다. 3) 이미지스캔및자료분석 Array는 GenePix 4000B (Axon Instruments, Union City, CA, USA) 로스캔하였으며, GenePix Pro 4.0 (Axon Instruments) 으로 background signal을제거한후형광신호를계산하였다. 배양하지않은 CD34 양성세포를대조군으로하여배양 7일과 14일세포의유전자발현의상대적인증가혹은감소를측정하였다. 배양세포의결과분석은 within-print tip Lowess function을이용하여 normalization을시행한후계층군집분석을하였고, SAM (Significant Analysis of Microarray) 를이용하여배양 7일에비해배양 14일에발현이변화한유전자를찾았다. 또한적혈구생성과관련이있는유전자에대해서는개별적으로검증하였다. 결과 1. 제대혈에서의 CD34 양성세포수와회수율산모로부터채집한제대혈은평균 50±22 ml이었다. 제대로부터얻은단핵구수는 2.4± 이었다. MACS 분리후얻은 CD34 양성세포는평균 1.2± 로회수율은총유핵세포의 0.5±0.4% 이었다. 유세포분석결과제대혈에서분리된 CD34 양성세포의순수도는 90% 이상이었다 (Fig. 1). 0 SS 128 A CD , % B 3 4 CD , B 96.6% FS 0.1 1,000 CD ,000 CD34 Fig. 1. Phenotypic characteristics of isolated hematopoietic progenitor cells from cord blood using Mini-MACS. Isolated cells were showing homogenous population with low side scatter and forward scatter. These cells were also expressing high CD34, CD45 and CD38. (CD34+/ CD45+: 99.1%, CD34+/CD38+: 96.6%).

460 김창기 이지혁 박광일외 4 인 2. 적혈구분화유도배양에있어서의 EPO 의효과 4.

또한첨가한 EPO의농도가높아질수록세포증식이증가되는양상을보였으며, EPO를 20 U/mL 농도로배양시작부터첨가한경우에서가장높은세포증식 (n=3, 14일, 평균 233배 ) 을관찰할수있었다.

배양이진행되면서호산구성과립이관찰되었고세포의모양이불규칙해지며세포질내에공포 (vacuole) 와과립이많은백혈구계열의세포가많이관찰되었다 (Fig. 3). 배양조건에따른차이는없었다.

20 U/mL 10 U/mL 3 U/mL 3 steps 0 0 5 10 15 20 25 Day of culture Fig. 2. The mean cell expansion according to culture days and conditions.

4 460 김창기 이지혁 박광일외 4 인 2. 적혈구분화유도배양에있어서의 EPO 의효과 4. 면역표현형의변화 EPO를배양처음부터첨가한군과배양 1주일부터첨가한군에서모두 2주까지세포수가증가하다가그이후감소하는양상이관찰되었다 (Fig. 2). 또한첨가한 EPO의농도가높아질수록세포증식이증가되는양상을보였으며, EPO를 20 U/mL 농도로배양시작부터첨가한경우에서가장높은세포증식 (n=3, 14일, 평균 233배 ) 을관찰할수있었다. 대조군으로 EPO를첨가하지않고배양한경우에는모두증식을유지할수없어실험을중단하였다. 3. 배양세포의형태분석제대혈에서바로분리한 CD34 양성세포는무과립의크기가큰단핵구였다. 배양이진행되면서호산구성과립이관찰되었고세포의모양이불규칙해지며세포질내에공포 (vacuole) 와과립이많은백혈구계열의세포가많이관찰되었다 (Fig. 3). 배양조건에따른차이는없었다. Cell dxpansion 배양이진행되면서 CD34 의표현은배양 7 일에모든조건에서 EPO conc. 20 U/mL 10 U/mL 3 U/mL 3 steps Day of culture Fig. 2. The mean cell expansion according to culture days and conditions. All cells were showing maximum cell expansion at Day 14. As EPO concentration increased, cell expansion also increased. 3 Step cultures resulted in lowest cell expansion. A B C D Fig. 3. Photographs of the cells on day 0 (A), day 7 (B), day 14 (C) and day 21 (D). (Wright-Giemsa stain, 1,000).

제대혈 CD34+ 세포의적혈구분화유도와 Microarray 분석 461 15% 를넘지않을정도로급속하게감소하였고, CD45 항원은그에비해비교적높게표현되는양상이었지만배양 21일에는 20.2-33.9% 정도로뚜렷하게감소하였다.

5 제대혈 CD34+ 세포의적혈구분화유도와 Microarray 분석 % 를넘지않을정도로급속하게감소하였고, CD45 항원은그에비해비교적높게표현되는양상이었지만배양 21일에는 % 정도로뚜렷하게감소하였다. 기본배양조건인세단계배양에서만배양 7일에 CD34의표현이 EPO를처음부터넣어준군보다높게표현되어 EPO를배양초기에첨가할경우조혈모세포가더빨리 CD34의표현이감소하는것을알수있었다. 그러나모든조건에서시간이경과함에따라적혈구의표지자인 GPA 의표현은 3% 이하였고, 배양기간동안발현의변화를보이지않았다 (Table 1). 5. 배양세포의유전자프로파일의분석 17,000개의유전자를 normalization한후 10,986개의유전자가남았고, 이중에서배양 7일에비해배양 14일에서유의한유전자발현의차이를보이는유전자를 Significant Analysis of Microarray (SAM) 을이용하여검색하였다. 그결과 False discovery Table 1. Immunophenotype analyses of cultured CD34+ cord blood cells Culture condition Culture day CD34 Expression (%) CD38 CD45 GPA 3 steps* day (n=3) day NT 0.5 day U/mL day (n=3) day day EPO conc. 10 U/mL day (n=3) day day U/mL day (n=3) day day *EPO 를배양 2 단계에서첨가한기본적인배양조건임. Abbreviations: NT, not tested; GPA, glycophorin A. Day 7 (n=3) Day 14 (n=4) rate (FDR) 가 0.74% 로유의한유전자를 125개선정하였고, 선정된유전자군을이용한 hierarchical clustering에서배양 7일과 14 일군이구분됨을확인하였다 (Fig. 4). 125개유전자중에서 17개의유전자가 7일배양세포에비해 14일배양세포에서 3배이상발현이증가하였으나, 기능적으로적혈구분화와관련성은높지않았다 (Table 2). SAM 분석에서는유의한변화를보이지않았으나형광신호의평균을비교하였을경우적혈구생성과관련이있는 glycophorin A, Rhesus blood group, CcEe antigens, ery- Table 2. Among 125 genes differently expressed based on culture duration, 17 up-regulated genes (more than 3-fold) Annotation Fold difference Solute carrier family 21 (organic anion transporter), member Small inducible cytokine A4 (homologous to mouse Mip-1b) 5.4 Isocitrate dehydrogenase 2 (NADP+), mitochondrial 4.8 EST 4.8 Dual specificity phosphatase Cyclin I 3.7 ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative 3.6 helix-loop-helix protein H2A histone family, member L 3.6 B-cell translocation gene 1, anti-proliferative 3.6 Related RAS viral (r-ras) oncogene homolog 3.4 Fatty-acid-Coenzyme A ligase, long-chain Human mrna for SB classii histocompatibility antigen 3.2 alpha-chain Brain-specific angiogenesis inhibitor Ceroid-lipofuscinosis, neuronal 2, late infantile 3.1 (Jansky-Bielschowsky disease) Putative translation initiation factor 3.1 HSPC022 protein 3.1 Fold difference glycophorin A Rhesus blood erythrocyte erythropoietin group, CcEe membrane receptor antigens protein band 4.2 Fig. 4. Hierarchical clustering with selected 125 genes using twoclass SAM (FDR 0.74%). Fig. 5. The change of mean expression in genes related to erythropoiesis. Expression of glycophorin A, rhesus blood group, CcEe antigens, erythrocyte membrane protein band 4.2, erythropoietin receptor genes increased 10, 8.3, 3.0 & 1.5 fold approximately.

6 462 김창기 이지혁 박광일외 4 인 throcyte membrane protein band 4.2 그리고 erythropoietin receptor 유전자발현정도가 7일세포에비해 14일세포에서증가해있어적혈구항원의발현은초기에일어나고있음을알수있었다 (Fig. 5). 고찰적혈구생성은매우복잡한과정이며다양한성장인자와사이토카인, 조혈모세포그리고골수미세환경의상호작용에의해서조절된다 [21]. EPO는적혈구모세포에표현된 EPO receptor (EPOR) 에작용하여적혈구로의분화와증식을촉진하는역할을하는적혈구생성의핵심성장인자이다 [10, 12-16, 18, 22-25]. Wu 등 [26] 은 EPO와 EPOR이 knockout된쥐들에심한빈혈이발생되어결국사망에이르는것을관찰하여적혈구생성에 EPO 와 EPOR의상호작용이적혈구생성에필수적임을증명하였다. SCF는처음에는분화되지않은혈구모세포의증식을촉진하는것으로알려졌지만이미계열이정해진혈구세포의성장을돕는기능이있는것으로밝혀졌다 [10]. 적혈구생성에있어서 EPO와 SCF의상승작용이여러연구에서증명되었고, 대부분의적혈구생성실험에서이두성장인자를사용하였다 [8, 10, 16, 22, 25, 27, 28]. 골수의조혈모세포에서성숙한적혈구로분화하는과정은여러단계로구성되며, 크게 EPO가필요없는초기단계와 EPO 의존적인후기단계로구분된다. 즉 EPO의자극이필요없는단계에서는 SCF나 TPO 같은성장인자를첨가하여조혈모세포를증식시키고그뒤에적혈구로의최종분화를유도하기위하여 EPO를첨가하였다. Neildez-Nguyen 등 [7] 은배양조건을조혈모세포가증식하는단계, 적혈구모세포의증식과분화를촉진하는단계그리고적혈구의최종분화를유도하는단계로기존연구에비해배양조건을더욱세분하여높은순수도의적혈구계열세포를생성하였음을보고하였다. 본연구에서는모든배양조건에서 14일까지급속하게세포가증식하였으나배양 3단계에서는세포수가약간감소하는양상을보였다. 이는기존연구와유사한결과였으며 [7], 3단계배양에는조혈모세포의증식을촉진하는 SCF 등의성장인자가첨가되지않았기때문으로생각된다. 여러연구에서체외적혈구생성에있어서 EPO의중요성에대해강조하였으나실험마다 EPO 농도에차이가있었다. 정상인의혈중 EPO 농도는 50 mu/ml 정도이지만 [15], 기존연구에서사용한 EPO의농도는 1 U/mL에서 4 U/mL로다양하였다. 또한적혈구생성에있어서적정한 EPO 농도와 EPO 농도증가와첨가시기에따른변화에대해서는알려진내용이적은데, 본연구에서는 EPO 농도가증가하면서세포증식이증가하였고가장높은농도인 20 U/mL에서다른조건에비해월등한세포증식을관찰할수있었다. 따라서 EPO의농도와세포증식간에는양의상관관계가있음을알수있었다. 반면대조군으로 EPO를첨가하지않은경우배양 14일까지세포형태는유지하였지만세포수 가증식하지못하고결국사멸하였다. EPO를 1주배양후첨가한세단계배양의경우 EPO 를처음부터첨가한배양보다세포가더적게증식하였는데이는 EPO를배양초기부터첨가하여좋은배양성적을얻었다는 Giarratana 등 [9] 의보고와일치하는소견이었다. 또한 Sui 등은 EPO가조혈모세포의 apoptosis를억제하는기전을규명하였다 [28]. 따라서 EPO의첨가유무로배양과정을구분하는것은적혈구생성에큰의미가없을것으로판단된다. 그러나 EPO의자극으로세포의증식이증가되는반면대부분의배양세포의형태는적혈구계열의세포와는차이가있었다. 대부분의배양세포에서세포질내과립과공포를흔히관찰할수있었고배양이진행되면서그양이증가하였다. 배양세포의면역표현형분석결과배양이진행되면서 CD34와 CD45의표현이감소하였다. CD34 의경우모든배양에서배양 7일에 15% 이하로급속히감소하였고, EPO를처음부터첨가하지않은경우가첨가한배양에비해더높은 CD34 표현을보였다. 따라서 EPO를배양초기에첨가할경우조혈모세포의분화를촉진하는것으로생각되었다. 그러나 CD45와 CD34가감소하는데비하여모든배양조건에서 GPA의표현은매우낮았다. Liquid culture를통한적혈구생성의경우배양세포가여러계열의세포로분화되어낮은순수도를보이는것이문제점으로지적된바있었고 [7], 본실험에서도배양세포의형태와표현형결과를통해조혈모세포로부터증식된세포가적혈구계열로의분화가충분하게진행되지못한것으로해석하였다. 배양세포의유전자발현단계에서의변화를알기위해 microarray를시행하였다. 125개유전자가배양에따라통계적으로의미있는발현변화를보였고 3배이상의발현증가를보인유전자는 17 개였다. 지금까지밝혀진이들유전자의기능은적혈구분화와연관성이분명하지않으나 SAM을이용하여통계적차이를보인유전자이므로적혈구분화에서의역할이규명되야할것으로생각된다. SAM을이용하지않고적혈구생성과관련성이높은유전자들을개별적으로분석하였을경우 glycophorin A, Rhesus blood group, CcEe antigens, erythrocyte membrane protein band 4.2 그리고 erythropoietin receptor 유전자의발현이증가해있었다. 따라서본실험의배양조건을통해배양세포의형태나표현형은뚜렷한변화를보이지않았으나관련유전자의발현이증가했음을알수있었다. 본연구에서적혈구분화에있어서 EPO의농도와첨가시기의영향을분석하였다. EPO 농도가증가하면서세포의증식이촉진되는것을확인하였으나유전자단계의변화가표현형의변화로연결되지못하였다. 본연구에서사용한배양조건이적혈구분화를위한최적조건이아닌것으로생각되며 EPO 첨가외에다른첨가물의농도변화를통해해결할수있을것이다. 지금까지조혈모세포로부터혈구세포를얻으려는많은노력이있어왔다. 그러나적혈구의경우대부분의연구에서충분한수의성숙한세포를얻는데실패하였다. 또한지금까지의연구성과에도불구하고체외에서호산성적혈모구로부터핵을유출시켜성숙한적혈구를얻는과정은분화에있어서가장큰걸림돌로판단되

7 제대혈 CD34+ 세포의적혈구분화유도와 Microarray 분석 463 고있다. 그원인은골수의미세환경과다른세포와의상호작용을체외배양에서구현할수없기때문으로알려져있다 [9, 23]. 배양세포를쥐에투여하거나배양중에 DMSO를첨가하여핵의유출을유도하는방법이소개되었으나 [7, 23], 임상적으로이용되기에는어려운모델이다. 그러나최근골수의기질세포와조혈모세포의동시배양을통하여대규모의적혈구생성에성공한연구보고가있어 [9] 희귀혈액형의적혈구생산과혈색소병증치료등의임상적활용이가능할것으로생각된다. 앞으로체외에서생성된적혈구를환자치료에사용하기위해서는대량배양법이도입되어야하며, 적혈구분화의최적조건을찾는연구가더진행되어야할것이다. 요약배경 : 본연구에서는제대혈의 CD34 양성세포를분리하여 erythropoietin (EPO) 등의자극을통하여적혈구로분화를시도하였다. 또한 EPO 농도와첨가시기가배양에미치는영향을규명하기위하여유세포검사를통해면역표현형을, microarray를이용하여유전자발현의변화를알아보고자하였다. 방법 : 제대혈의 CD34 양성세포를다양한성장인자를첨가한배지에서 3주간배양하였고, EPO의농도와첨가시기를달리하여배양하였다. 배양에따른세포의형태와면역표현형그리고유전자발현의변화를분석하였다. 결과 : 배양세포는모든조건에서 14일에가장높은증식을보였으며 EPO의농도가높을수록처음부터첨가할수록좋은증식을보였다. CD34와 CD45는초기에 90% 이상높게표현하였고배양이진행되면서그표현이감소하였다. 그러나적혈구에특이적인항원인 glycophorin A (GPA) 의표현이두드러지지않았다. Microarray 분석결과배양이진행되면서적혈구생성과관련이깊은유전자들의발현이증가하였다. 결론 : 배양이진행되면서적혈구생성과관련된여러유전자의발현증가를관찰할수있었으나, 이런변화가배양세포의형태와면역표현형의변화로이어지지는못하였다. 따라서생체내의조건과좀더유사한배양조건을규명하는연구가필요할것으로생각된다. 참고문헌 1. Sullivan MT and Wallace EL. Blood collection and transfusion in the United States in Transfusion 2005; 45: Lefrere JJ, Girot R, Lefrere F, Guillaume N, Lerable J, Le Marrec N, et al. Complete or partial seroreversion in immunocompetent individuals after self-limited HCV infection: consequences for transfusion. Transfusion 2004; 44: Delwart EL, Kalmin ND, Jones TS, Ladd DJ, Foley B, Tobler LH, et al. First report of human immunodeficiency virus transmission via an RNA-screened blood donation. Vox Sang 2004; 86: Ling AE, Robbins KE, Brown TM, Dunmire V, Thoe SY, Wong SY, et al. Failure of routine HIV-1 tests in a case involving transmission with preseroconversion blood components during the infectious window period. JAMA 2000; 284: Pincock S. Government confirms second case of vcjd transmitted by blood transfusion. BMJ 2004; 329: Macedo de Oliveira A, Beecham BD, Montgomery SP, Lanciotti RS, Linnen JM, Giachetti C, et al. West Nile virus blood transfusion-related infection despite nucleic acid testing. Transfusion 2004; 44: Neildez-Nguyen TM, Wajcman H, Marden MC, Bensidhoum M, Moncollin V, Giarratana MC, et al. Human erythroid cells produced ex vivo at large scale differentiate into red blood cells in vivo. Nat Biotechnol 2002; 20: Sui X, Tsuji K, Tajima S, Tanaka R, Muraoka K, Ebihara Y, et al. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med 1996; 183: Giarratana MC, Kobari L, Lapillonne H, Chalmers D, Kiger L, Cynober T, et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol 2005; 23: Panzenbock B, Bartunek P, Mapara MY, Zenke M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood 1998; 92: Malik P, Fisher TC, Barsky LL, Zeng L, Izadi P, Hiti AL, et al. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood 1998; 91: Fibach E, Manor D, Oppenheim A, Rachmilewitz EA. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood 1989; 73: Eliason JF, Testa NG, Dexter TM. Erythropoietin-stimulated erythropoiesis in long-term bone marrow culture. Nature 1979; 281: Dexter TM, Testa NG, Allen TD, Rutherford T, Scolnick E. Molecular and cell biologic aspects of erythropoiesis in long-term bone marrow cultures. Blood 1981; 58: Fibach E, Rachmilewitz EA. Stimulation of erythroid progenitors by high concentrations of erythropoietin results in normoblasts arrested in G2 phase of the cell cycle. Exp Hematol 1993; 21: Sato T, Maekawa T, Watanabe S, Tsuji K, Nakahata T. Erythroid progenitors differentiate and mature in response to endogenous erythropoietin. J Clin Invest 2000; 106: Wojda U, Noel P, Miller JL. Fetal and adult hemoglobin production during adult erythropoiesis: coordinate expression correlates with cell proliferation. Blood 2002; 99:

8 464 김창기 이지혁 박광일외 4 인 18. Miller JL, Njoroge JM, Gubin AN, Rodgers GP. Prospective identification of erythroid elements in cultured peripheral blood. Exp Hematol 1999; 27: Broxmeyer HE, Gluckman E, Auerbach A, Douglas GW, Friedman H, Cooper S, et al. Human umbilical cord blood: a clinically useful source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells. Int J Cell Cloning 1990; 8 (Suppl 1): 76-89; discussion Kogler G, Sensken S, Airey JA, Trapp T, Muschen M, Feldhahn N, et al. A new human somatic stem cell from placental cord blood with intrinsic pluripotent differentiation potential. J Exp Med 2004; 200: Southcott MJ, Tanner MJ, Anstee DJ. The expression of human blood group antigens during erythropoiesis in a cell culture system. Blood 1999; 93: Freyssinier JM, Lecoq-Lafon C, Amsellem S, Picard F, Ducrocq R, Mayeux P, et al. Purification, amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol 1999; 106: Maggakis-Kelemen C, Bork M, Kayser P, Biselli M, Artmann GM. Biological and mechanical quality of red blood cells cultured from human umbilical cord blood stem cells. Med Biol Eng Comput 2003; 41: Lee R, Kertesz N, Joseph SB, Jegalian A, Wu H. Erythropoietin (Epo) and EpoR expression and 2 waves of erythropoiesis. Blood 2001; 98: Fibach E, Manor D, Treves A, Rachmilewitz EA. Growth of human normal erythroid progenitors in liquid culture: a comparison with colony growth in semisolid culture. Int J Cell Cloning 1991; 9: Wu H, Liu X, Jaenisch R, Lodish HF. Generation of committed erythroid BFU-E and CFU-E progenitors does not require erythropoietin or the erythropoietin receptor. Cell 1995; 83: Sui X, Krantz SB, You M, Zhao Z. Synergistic activation of MAP kinase (ERK1/2) by erythropoietin and stem cell factor is essential for expanded erythropoiesis. Blood 1998; 92: Sui X, Krantz SB, Zhao ZJ. Stem cell factor and erythropoietin inhibit apoptosis of human erythroid progenitor cells through different signalling pathways. Br J Haematol 2000; 110:

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Microsoft Word doc 제대혈유래 CD34 양성세포로부터적혈구분화유도와 microarray 를이용한유전자발현변화분석 연세대학교대학원 의학과 김창기 제대혈유래 CD34 양성세포로부터적혈구분화유도와 microarray 를이용한유전자발현변화분석 지도교수김현옥 이논문을석사학위논문으로제출함 2005 년 6 월일 연세대학교대학원의학과김창기 김창기의석사학위논문을인준함 심사위원김현옥인 심사위원김현숙인