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1 KISEP 대한두경부종양학회지제 권제 호 6 방사선치료에내성이유도된두경부편평세포암에대한종양살상헤르페스바이러스의유전자치료효과 * = Abstract = 연세대학교의과대학이비인후과학교실 김세헌 최은창 이진석 천제영 변형권 송기재 김광문 Therapeutic Effect of Oncolytic Herpes Simplex Virus on Induced Radioresistant Head and Neck Squamous Cell Carcinoma* Se-Heon Kim, M.D., Eun Chang Choi, M.D., Jin Seok Lee, M.D., Je Young Chun, M.D., Hyung Kwon Byun, M.D., Ki Jae Song, M.D., Kwang-Moon Kim, M.D. Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Introduction:The sensitivity of tumor cells to radiotherapy is a critical determinant of local control and potential cure in advanced head and neck squamous cell carcinoma(hnscc). The emergence of radioresistant tumor cells is an obstacle to cancer therapy. Most radioresistant cells have a higher proportion of cells in the S- phase of the cell cycle and a lower apoptotic fraction than radiosensitive cells. HSV replication is increased in cells that have higher S-phase fractions. NV66 is an oncolytic herpes simplex virus type- mutant. We hypothesized that NV66 replication and cytotoxicity are increased in radioresistant cells. The purpose of this study is to evaluate the antitumor efficacy of NV66 to treat radioresistant HNSCC. Methods:Radioresistant cells were selected by treating five HNSCC cell lines with repeated conventional fractionated doses of radiation(gy/day), using a Cs-37 irradiator, up to a cumulative dose of 7Gy. Clonogenic cell survival and S-phase fractions were compared between radioresistant and parental radiosensitive cells. The two cell populations were then treated with NV66 to examine viral replication, by the viral plaque assay and viral cytotoxicity. Results:Fractionated irradiation resulted in the selection of radioresistant cells. Radioresistant cells had a higher S-phase fraction(4.9%) compared to parental cells(6.%). NV66 replication in radioresistant cells was 7.4 times higher than in parental cells(p<.). Treatment with NV66 resulted in increased cytotoxicity of 4.5% in radioresistant cells compared to parental cells(p<.5). Conclusion:NV66 showed increased viral replication and cytotoxicity in radioresistant HNSCC cell lines. These findings suggest a potential clinical application for this oncolytic viral therapy as treatment for radioresistant head and neck cancers. KEY WORDS:Gene therapy Herpes simplex virus Radiation Head and neck neoplasm. 서 진행된두경부종양의주된치료방법은수술과방사선치 론 료이나, 지난 3년간수술및방사선치료법의발달에도불구하고환자의생존률은의미있는증가를보이지못했다. 치료실패의가장큰원인은암의국소재발인데, 이를좌우하는가장중요한요인은종양세포의방사선치료에대한민 * 본연구는 5 학년도연세대학교의과대학교수연구비로이루어졌음. 교신저자 : 김세헌, -75 서울서대문구신촌동 34 연세대학교의과대학이비인후과학교실전화 :() 8-36 전송 :() shkimmd@yumc.yonsei.ac.kr - 3 -

2 감도이다 ). 특히방사선치료도중종양세포군에서출현하는방사선치료에내성 (radioresistant) 이있는종양세포의존재유무가중요한데, 이러한종양세포는전이를잘일으킬뿐만아니라추가적인방사선치료나항암치료에잘반응하지않으므로, 두경부종양의궁극적치료율을떨어뜨리는중요한원인이된다 )3). 현재까지이러한상황에대한뚜렷한치료방법은없으며, 기존의치료법과는다른새로운치료방법의개발이시급한실정이다. 최근두경부종양영역에서유전적으로변형된종양살상헤르페스바이러스를이용한유전자치료에대한연구가희망적인실험결과를보여주고있다 4-8). 이는종양살상능력이있으며또한종양에특이성이있는바이러스를유전공학적으로생성하여암치료에도입하려는시도이다. 이상적인바이러스모델은다양한암종에작용하며, 복제가가능하고, 독성이적고, 항바이러스치료를받기쉬워야한다 9). 종양살상헤르페스바이러스는다음과같은여러장점을가지고있다. 첫째, 열에민감하여발열시바이러스복제가억제되고, 둘째, acyclovir, gancyclovir 와같은항바이러스제재에감수성이높으므로치료시야기될수있는바이러스의과도증식에의한부작용을치료하기용이하다. 셋째, 바이러스내의다수의유전자대변이로인하여 HSV 로의자연적인전환은거의되지않으며, 넷째, 감염의지표로 lacz 유전자또는 green fluorescent protein(gfp) 유전자등을발현하도록조작되어있어바이러스의증식을간접적으로확인할수있다는장점이있다 9). 이중대표적인예가 NV66 바이러스이다. NV66 바이러스는헤르페스바이러스의일종으로유전자 ICP 와 ICP4 및 γ34.5 loci 유전자부분이소실되고, 대신표식유전자인 CMV-EGFP 삽입된다변이바이러스이다. NV66는한쪽부분의 γ34.5 loci 유전자소실로인하여바이러스의신경독성을없앴으나, 바이러스의증식능력에는큰변화가없다 9). 두경부편평세포암에서종양살상헤르페스바이러스의종양세포살상능력은바이러스와종양세포의비율이 : 일때즉 Multiplicity Of Infection(MOI) 에서 9 이상의종양살상능력이있는것으로보고되고있으며, 바이러스증식에가장중요한요소중의하나는종양세포의세포주기중 S-phase 부분으로 S-phase 부분이높은세포주일수록바이러스의증식이활성화된다 ). 방사선치료에민감한세포주기는 G/M phase 이며, G/S phase 는방사선치료에가장저항성이있는데, NV66 바이러스는 S-phase 주기의세포에서증식이왕성하게일어나므로두치료는서로상호보완적관계를가지며, 연구자등은방사선치료와종양살상바이러스의병합치료가서로상승작용을나타낸다는것을보고한바있다 5). 본연구의목적은두경부편평세포암종세포주들을이용하여, 임상적조건과유사한방사선치료 (/day, Total dose of 7,) 후생존하는세포들을선택하여, 두경부편평세포암종치료의난제인방사선치료에내성이있는세포에서의 NV66 종양살상바이러스의치료효과를알아보고자한다. 연구방법. 세포주 (Cell Lines) 선택및처치본연구에서는 5가지의두경부편평세포암종세포주들이사용되었다. 4가지세포는인간두경부편평상피세포암종세포주로, 가지는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA;SCC 5, SCC 5) 에서구입하으며, 가지세포주 (MSKQLL, MSKQLL) 는 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center 에서, 분리하여특성화한것이다. SCC Ⅶ 세포주는미국 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center 로부터기증받은것으로 C3H/HeJ 쥐에서자연적으로발생한편평세포암종세포주이다. 세포주들은 37, 5% CO 의환경에서 fetal calf serum(fcs) 이들어있는 minimal essential media(mem) 배지에서배양되었으며, 세포주에따라일주일에한번내지두번계대배양하였다.. 방사선치료에대한내성을유도한두경부편평세포암세포주들의생성방사선치료에내성이있는세포를만드는방법은임상적치료환경과최대한유사한방법으로한번에 G씩조사한후살아남은세포를계대배양하여세포주에따라 일에서 4일후 T-75 플라스크에서세포의밀도가 5 정도되는증식기에다시 G의방사선조사를계속하는방법으로 5개세포주에서모두총 35회에걸쳐전부 7, 를조사하였으며, 살아남은세포를실험에이용하였다. 이렇게하여얻어진세포주들은모세포와구분하기위하여각각 RR-SCC5, RR- SCC5, RR-MSKQLL, RR-MSKQLL, RR-SCCVⅡ 로표기하고자한다. 3. NV66 바이러스의제조 NV66 바이러스는헤르페스바이러스의일종으로유전자 ICP와 ICP4 및 γ34.5 loci 유전자부분이소실되고, 대신표식유전자인 CMV-EGFP 삽입된다변이바이러스이다. 바이러스의증식이활발히일어나는아프리카 green monkey 의신장세포 (Vero cell;atcc) 에서 DMEM(Dulbecco s modified Eagle s medium) 배지를이용하여바이러스를배양한다. 바이러스의정량화는 Vero 세포주에서의플라크형성단위 (plaque forming unit, pfu) 에근거하여시행하였으며, 사용할때까지 -8 에보관한다. G7 바이러스는 Memo

3 rial Sloan-Ketterin Cancer Center 의 Surgical Oncology Laboratory 에서기증받았다. 3. MTT 세포독성연구 (Cytotoxicity Assay) 종양세포의살상능력을분석하는데있어단순히혈구측정기를이용하여 Trypan blue 염색을하여생존해있는세포를계수할수있으나이것은주관적이며, 아치사의손상을입은세포의상태를정확히대변할수없으므로본실험에서는 MTT(3-(4,5-Dimethyl thiazole--yl)-,5-diphenyl tetrazolium Bromide, SIGMA #8) cytotoxicity assay 를시행하였다. 편평한 96-well 용기 (Falcon Plastics, 375) 에 μl의부피로 5 3 개의종양세포를각실험군에따라이식하며, 약 ~8 시간배양후세포가안전하게세포배양용기에착상된것을확인하였다. 필요한실험별로세포를처치후의도된시간에상층액을제거하고인산완충용액을이용하여세척후, MTT(5μg MTT/μl) 가섞인배양액을넣고 4~6 시간배양하였다. 이때실험군을 5개의두경부편평세포암종세포주별로 가지로나누어각각에대한 NV66바이러스의종양살상효과를측정하였다. 각군의구성은대조군, 즉아무런처치를하지않은두경부편평세포암종세포주에서 NV66 바이러스를처치한군과실험군인방사선치료에내성이유발된두경부편평세포암세 포주에서 NV66 바이러스를처치한군으로나누어지며, 각그룹에있어서생존세포의비율을 Day 4에 MOI(multiplicity of infection) of.5,.,.5,, 에서각각측정하여비교하였다. MTT 는살아있는세포에서 Mitochonrial dehydrogenase 에의하여보라색의결정체를형성하므로, 상층액제거후, 결정을 DMSO로용해시켜그농도를 Spectrophotometry 를이용하여 5nm 파장에서분석하였으며, 각실험은 4회반복실시하였다. 4. in vitro 바이러스배양연구 (Viral Proliferation Assay) 대조군인방사선을조사하지않은 5개의두경부편평세포암종세포주 (SCC5, SCC5, MSKQLL, MSKQLL, SCCⅦ) 군과 7, 실험군인방사선을조사한후생존한방사선치료에내성이유도된 5개의두경부편평세포암종세포주군 (RR-SCC5, RR-SCC5, RR-MSKQLL, RR-MSKQ- LL, RR-SCCⅦ) 에서 G7 바이러스의증식정도의차이를알아보기위하여, NV66 바이러스처치 4일후 (Day 4) 세포와배양액을수집하였다. 수집된배양액및세포를동결및해동작업을 3~4 회실시하여세포막을붕괴시켜세포내헤르페스바이러스를유리시킨다음배양액을 -8 에보관하였다. NV66 바이러스에민감한 Vero 세포를 6개의용기 (6 well plate, Costar) 에한용기당 6 개의세포밀 cells of SCC5 cell line at day 4 cells of SCC5 cell line at day 4 cells of MSKQLL cell line at day 4 A cg B C cells of MSKQLL cell line at day 4 cells of SCCVII cell line at day 4 D E Fig.. Clonogenic cell survival between parent and radio-resistant cell lines after radiation Tx. A:SCC5 vs RR-SCC5, B:SCC5 vs RR-SCC5, C:MSK QLL vs RR-MSKQLL, D:MSK QLL vs RR-MSK QLL, E:SCCVII vs RR-SCCVII. Radioresistant cells were selected by treating five HNSCC cell lines with repeated conventional fractionated doses of radiation(gy/day), using a Cs-37 irradiator, up to a cumulative dose of 7Gy. Fractionated irradiation resulted in the selection of radioresistant cells. RR-SCC5: Radio-Resistant SCC5, RR-SCC5:Radio-Resistant SCC5, RR-MSKQLL:Radio-Resistant MSKQLL, RR-MSKQLL:Radio-Resistant MSKQLL, RR-SCCVII:Radio-Resistant SCCVII

4 도로이식하고 4시간배양하였고, 인산완충용액으로세척후, 실험전얼음속에서서서히녹인배양액샘플을일정비율의농도로희석후 Vero 세포에감염시켰다. 시간배양후 ml 의 DME agarous 혼합배지를첨가하고, 일간배양하였다. ml의 Neutral red solution(sigma N889) 을첨가후빛을차단한상태에서 일간배양하고, 각세포주별로바이러스의플라크 (plaque) 숫자를세는방법을이용하였다. 결. 방사선치료에내성이유발된두경부편평세포암세포주와원 (naive) 모세포 (parent cell) 간방사선치료에대한민감도비교임상적치료환경과최대한유사한방법으로 G/day 씩조사하여살아남은세포를선택하는방법으로 35회에걸쳐전부 7,를조사한후살아남은세포를선택하였다. 이와같은방법으로얻어진세포주를가지고,, 3, 4, 5의방사선을각각조사한뒤방 A 과 SK666 FL-A G= CV G=6.6 6 %G=5.4 5 G=9. 4 CV G=7. %G=6.3 3 %S= Chi Sq.= SCC5 사선에대한민감도를측정하였다. 5 방사선조사 4 일후 SCC5 의 66% 만이생존하였으나, RR-SCC5 은 96% 가생존하였다. 나머지 4세포주에서도비슷한결과를보였는데같은조건에서 SCC5 는 8%, MSKQLL 은 68%, MSK- QLL는 74%, SCCⅦ은 68% 가생존한반면, RR-SCC5 는 95%, RR-MSKQLL은 95%, RR-MSKQLL는 98%, RR-SCCⅦ 은 95% 가생존하여모세포보다월등하게방사선치료에대한내성을보였다 (Fig. ).. 방사선치료에내성이유발된두경부편평세포암세포주와원 (naive) 모세포 (parent cell) 간방사선조사후세포고사의정도비교및세포주기 (cell cycle) 비교증식기의모세포의경우세포주기중 S-phase를차지하는세포의비중이 SCC5 에서는 33% 였으나, 증식기의 RR- SCC5 의경우는 S-phase 를차지하는세포의비중이 48% 로증가되어있었다. 나머지 4세포주에서도비슷한결과를보였는데같은조건에서 SCC5 는 3%, MSKQLL 은 3, MSKQLL 는 3 의 S-phase 를보인반면, RR-SCC5 는 4%, RR-MSKQLL은, RR-MSKQLL는 37% SK66 FL-A 6 8 %S= Chi Sq.= RTx-Resist SCC5 G=54.7 CV G=7.6 %G=46.6 G=.3 CV G=5.3 %G=4.9 8 SK667 FL-A 7 48 SK66 FL-A G=47.3 CV G=.6 %G=45.8 G=95.4 CV G=8.6 %G=3. %S= G=56.4 CV G=9. %G=33.7 G=.3 CV G=5.9 %G=4.3 %S= Chi Sq.=.7 B SCC5 Chi Sq.= RTx-Resist SCC5 Fig.. Compare the cell cycle between parent and radio-resistant cell lines by flow cytometry. A:SCC5 vs RR-SCC5, B:SCC5 vs RR-SCC5. Radioresistant cells had a higher S-phase fraction(average:4.9%) compared to parental cells(average:6.%)

5 의 S-phase 을보여방사선치료에내성이있는세포주에서. 모세포보다월등하게 S-phase 의부분이증가되어있는것을관찰할수있었다 (Fig. ). 3. 방사선치료에내성이유발된두경부편평세포암세포주와원 (naive) 모세포 (parent cell) 간 NV66 종양살상바이러스를이용한유전자치료효과 5개의세포주를대상으로아무런처치를하지않은모세포와방사선치료에내성을유도한세포주들에대한 NV66 의치료효과를비교하였다. MOI 를.5,.,.5,, 로달리하여바이러스를감염시켰으며, 4일후각각의세포주에서세포의생존률을비교하였다.. 로바이러스를감염시킨 4일후 SCC5 의 9% 가생존하였으나, RR-SCC5 은 45% 만이생존하였다. 나머지 4세포주에서도비슷한결과를보였는데같은조건에서 SCC5는 36%, MSKQLL은 95%, MSKQLL는 3%, SCCⅦ은 99% 가생존한반면, RR-SCC5는 7%, RR- MSKQLL은 68%, RR-MSKQLL는 %, RR-SCCⅦ은 8% 만이생존하여모세포보다월등하게 NV66의치료에대한민감도가증가하였다. 이와같은현상은좀더높은 MOI 인 에서도비슷한결과를보였는데, 로바이러 스를감염시킨 4일후 SCC5 의 5 가생존하였으나, RR- SCC5 은 % 만이생존하였다. 나머지 4세포주에서도비슷한결과를보였는데같은조건에서 SCC5 는 6%, MSKQLL 은 5%, MSKQLL는 %, SCCⅦ 은 7 가생존한반면, RR-SCC5는 %, RR-MSKQLL은 5%, RR-MSK- QLL 는 6%, RR-SCCⅦ 은 45% 만이생존하여, 여러비율의 MOI 에서모두 NV66 의치료에대한민감도가증가함을확인할수있었다 (Fig. 3). 4. 방사선치료에내성이유발된두경부편평세포암세포주와원 (naive) 모세포 (parent cell) 간 NV66 종양살상바이러스의증식능력비교 (direct viral tittering) 연구자등은방사선치료에내성이유발된두경부편평세포암세포주에서 NV66 바이러스의종양살상능력이의미있게증가함을관찰할수있었다. 이와같은실험결과를토대로과연바이러스의증식이얼마만큼증가되었는지를각각의세포주들을. 로감염시키고 48시간후 viral tittering 방법으로바이러스의수를정량적으로분석하여비교하여보았다. RR-SCC5 는모세포인 SCC5 에비해바이러스의수가 8. 배증가되어있었다. RR-SCC5 는모세포인 SCC5 에 NV66 effect on naive and cells of SCC5 cell line at day 4 NV66 effect on naive and cells of SCC5 cell line at day 4 NV66 effect on naive and cells of MSKQLL cell line at day A B C NV66 effect on naive and cells of MSKQLL cell line at day 4 NV66 effect on naive and cells of SCCVII cell line at day D E Fig. 3. Compare the sensitivity to the oncolytic virus between parent and radio-resistant cell lines by in vitro cytotoxicity assay. A: SCC5 vs RR-SCC5, B:SCC5 vs RR-SCC5, C:MSK QLL vs RR-MSKQLL, D:MSK QLL vs RR-MSK QLL, E:SCCVII vs RR- SCCVII. Treatment with NV66 resulted in increased cytotoxicity of 4.5% in radioresistant cells compared to parental cells (p<.5)

6 Viral titer after D4 (initial titer=e4) Comparisons of viral titer between naive and RTx-resist(RTr) cells.5e+6.e+6.5e+6.e+6 5.E+5.E+ Repair, Repopulation과 Recruitment 현상을유발한다는점에서임상적환경과유사하며, 방사선치료에내성이있는세포를선택적으로취하는데유용한방법이다 )). 이렇게하여방사선치료에내성을유도한세포주들을만들어실질적으로방사선치료에내성이생긴것인지를검증한결과 5 조사 4일후 95~98% 의생존율을보였으며이는같은조건에서 68~8% 의생존율을보인모세포보다의미있게방사선치료에대해저항성이생겼음을확인할수있었다. 문헌보고에의하면방사선치료에잘반응하지않는종양세포는방사선조사후세포고사가잘일어나지않으며, 세포주기중 S-phase 의부분이많다고한다 3) NV66의증식이세포고사가잘일어나지않으며세포주기중 S-phase 의부분이많은세포에서잘일어난다는사실은이미밝혀져있다 )4). 이는앞서언급한바와같이종양살상헤르페스바이러스인 NV66의증식에매우유리한조건이다. 연구자등은방사선치료에내성을유도한두경부편평세포암종세포주와그것의원모세포와간의세포주기를비교하였으며, 증식기의모세포의경우세포주기중 S-phase 를차지하는세포의비중이 SCC5 에서는 33% 였으나, 증식기의 RR-SCC5 의경우는 S-phase 를차지하는세포의비중이 48% 로증가되어있었다. 나머지 4세포주에서도비슷한결과를보였는데같은조건에서방사선치료에내성이있는세포주에서. 모세포보다월등하게 S-phase 의부분이증가되어있는것을관찰할수있었다. 이는방사선치료에내성을유도한세포주들에서 S-phase 가증가함으로서종양살상헤르페스바이러스증식에필요한조건을제공하여 NV66 의종양세포살상능력을증가시킬수있다고생각할수있다. 5개의세포주를대상으로모세포와방사선치료에내성을유도한세포주들에대한 NV66 의치료효과를비교하기위하여, 각각의세포주에서세포의생존률을비교하였다.. 로바이러스를감염시킨 4일후 SCC5 의 9% 가생존하였으나, RR-SCC5 은 45% 만이생존하였다. 나머지 4세포주에서도비슷한결과를보였는데같은조건에서 SCC5 는 36%, MSKQLL은 95%, MSKQLL 는 3%, SCCVII 은 99% 가생존한반면, RR-SCC5는 7%, RR-MSKQ- LL은 68%, RR-MSKQLL 는 %, RR-SCCⅦ은 8% 만이생존하여모세포보다월등하게 NV66의치료에대한민감도가증가하였다. 이와같은연구결과는다음과같이해석할수있다. 방사선치료는주로세포고사의유발이주된세포사의기전이나 NV66 바이러스는세포고사의기전과는상관없이감염된세포를살상시키며오히려세포고사가일어나지않는세포에서더증식이왕성하게일어난다 4). 또한방사선치료에민감한세포주기는 G/M phase 이며, G/S phase 는방사선치료에가장저항성이있는데, NV66 바이러스는 S-phase 주기의세포에서증식이왕성하게일어 SCC- RTr 5N SCC- RTr 5N 비해바이러스의수가.배 RR-MSKQLL 은모세포인 MSKQLL 에비해바이러스의수가 9.7 배, RR-MSKQLL 는모세포인 MSKQLL 에비해바이러스의수가 4. 배, RR- SCCⅦ 은모세포인 SCCⅦ 에비해바이러스의수가.9 배증가되어있음을관찰할수있었다 (Fig. 4). 고 QLL- RTr N 두경부편평세포암치료의주된실패원인은방사선치료에저항이있거나내성이유발된세포의존재이다. 이들은치료후미세잔존암으로남아있다원발병소의재발및국소전이를유발하고환자의생존율에결정적역할을한다. 특히방사선치료도중종양세포군에서출현하는방사선치료에내성 (radioresistant) 이있는종양세포의존재유무가중요한데, 이러한종양세포는전이를잘일으킬뿐만아니라추가적인방사선치료나항암치료에잘반응하지않으므로, 두경부종양의궁극적치료율을떨어뜨리는중요한원인이된다 )3). 아직까지이러한상황에대한뚜렷한치료방법이없는상태로, 연구자등은유전자조작에의해만들어진종양살상헤르페스바이러스인 NV66 를가지고인위적으로방사선치료에내성을유도한두경부편평세포암종세포주들에대한치료효과를관찰하였다. 방사선치료에내성이있는세포를만드는방법은임상적치료환경과최대한유사한방법으로한번에 G씩조사한후살아남은세포를계대배양하여세포주에따라 일에서 4일후 T-75 플라스크에서세포의밀도가 5 정도되는증식기에다시 G의방사선조사를계속하는방법으로 5개세포주에서모두총 35회에걸쳐전부 7, 를조사하였으며, 살아남은세포를실험에이용하였다. 이러한방법은종양세포의방사선에대한민감도를측정하는데유효하며, 일시에 7,를조사하는방법보다종양세포의 Reassortment, 찰 QLL- N RTr SCC- RTr VIIN Fig. 4. Compare the viral proliferation between parent and radioresistant cell lines by viral titering assay. NV66 replication in radioresistant cells was average 7.4 times higher than in parental cells(p<.)

7 나므로두치료는서로상호보완적관계를가지며, 이러한이론적근거로연구자등은방사선치료와종양살상바이러스의병합치료가서로상승작용을나타낸다는것을보고한바있다 5). 결론 이상의결과를종합하여보면방사선치료에내성을유도한두경부편평세포암종세포주들은임상적으로쓰이는방사선용량의치료에의미있게증가된내성을보였으며, 세포주기중 s-phase 의부분이상승되어있었다. 이는 NV66 바이러스의증식에좋은환경을제공해주는것이며, 실험결과모세포보다방사선치료에내성을유도한두경부편평세포암종세포주들이 NV66 바이러스치료에의미있게민감한반응을보였다. 연구자등은기존의연구결과를근거로방사선치료에내성이있는두경부편평세포암종세포주에서종양살상 NV66 바이러스의유전자치료가효과적이라는가설을검증하였고, 이는기존치료방법의주된실패원인을해결하는새로운치료법으로자리매김할수있으리라기대하며, 궁국적으로두경부편평세포암종환자의생존율을높이는새로운치료법으로서의가능성을보여주었다고생각한다. 중심단어 : 두경부종양 유전자치료 종양살상헤르페스바이러스 방사선치료. References ) Brizel DM, Albers ME, Fisher SR, Scher RL, Richtsmeier JW, Hars Vl: Hyperfractionated irradiation with or without concurrent chemotherapy for locally advanced head and neck cancer N. Engl J Med. 998;338: ) Girinsky T, Lubin R, Pignon JP, Chavaudra N, Gazeau J, Dubray B: Predictive value of in vitro radiosensitivity parameters in head and neck cancers and cervical carcinomas: preliminary correlations with local control and overall survival. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 993;5: ) West CM, Davidson SE, Roberts SA, Hunter RD: Intrinsic radiosensitivity and prediction of patient response to radiotherapy for carcinoma of the cervix. Br J Cancer. 993;68: ) Kim SH, Carew JF, Kooby DA, et al: Combination gene therapy using multiple immunomodulatory genes transferred by a defective infectious single-cycle herpes virus in squamous cell cancer. Cancer Gene Ther. ;7: ) Kim SH, Wong RJ, Kooby DA, et al: Combination of mutated herpes simplex virus type (G7 virus) with radiation for the treatment of squamous cell carcinoma of the head and neck. Eur J Cancer. 5;4():33-3 6) Carew JF, Kooby DA, Halterman MW, Federoff HJ, Fong Y: Selective infection and cytolysis of human head and neck squamous cell carcinoma with sparing of normal mucosa by a cytotoxic herpes simplex virus type (G7). Hum Gene Ther. 999;: ) Wong RJ, Kim SH, Joe JK, Shah JP, Johnson PA, Fong Y: Effective treatment of head and neck squamous cell carcinoma by an oncolytic herpes simplex virus. J Am Coll Surg. ;93:- 8) Wong RJ, Joe JK, Kim SH, Shah JP, Horsburgh B, Fong Y: Oncolytic herpesvirus effectively treats murine squamous cell carcinoma and spreads by natural lymphatics to treat sites of lymphatic metastases. Hum Gene Ther. ;3:3-3 9) Mineta T, Rabkin SD, Yazaki T, Hunter WD, Martuza RL: Attenuated multi-mutated herpes simplex virus- for the treatment of malignant gliomas. Nature Med. 995;: ) Kooby DA, Carew JF, Halterman MW, et al: Oncolytic viral therapy for human colorectal cancer and liver metastases using a multi-mutated herped simplex virus type-(g7). FASEB. 999; 3: ) Pearce AG, Segura TM, Rintala AC, Rintala-Maki ND, Lee H: The generation and characterization of a radiation-resistant model system to study radioresistance in human breast cancer cells. Radiate Res. ;56(6): ) Lambin P, Malaise EP, Joiner MC: Might intrinsic radioresistance of human tumour cells be induced by radiation? Int J Radiat Biol. 996;69(3):79-9 3) Falck J, Petrini JH, Williams BR, Lukas J, Bartek J: The DNA damage-dependent intra-s phase checkpoint is regulated by parallel pathways. Nature Gen. ;3:9-94 4) Schang LM, Philips J, Schaffer PA: Requirement for cellular cyclin-dependent kinases in herpes simplex virus replication and transcription. J Virol. 998;7(7):

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