02 JNH 강명희(K16-41).fm

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1 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(5): 277 ~ pissn / eissn Research Article 한식식품군의 in vitro 총항산화능 (TDAC) 과 ex vivo DNA 손상보호효과와의관련성 * 이민영 한정화 강명희 한남대학교식품영양학과 Protective effect of Korean diet food groups on lymphocyte DNA damage and contribution of each food group to total dietary antioxidant capacity (TDAC)* Lee, Min Young Han, Jeong-Hwa Kang, Myung-Hee Dept. of Food & Nutrition, Daedeok Valley Campus, Hannam University, Daejeon 34054, Korea ABSTRACT Purpose: This study was performed to compare total phenolic contents, in vitro antioxidant capacity, and reduction effect of Korean food groups on ex vivo DNA damage in human cells and analyze correlations between each indicator. Methods: Vegetable foods in the Korean diet based the results of the KNHANES V-2 (2011) were classified into 10 food groups: cereals, fruits, vegetables, nuts, kimchi, seaweeds, potatoes, mushrooms, legumes, and oils. Eighty-four foods constituted more than 1% of the total intake in each food group and finally designated as vegetable foods in the Korean diet. Total phenolic content of each food group was measured. Further, in vitro antioxidant capacity was measured based on DPPH radical scavenging assay, TEAC assay, and ORAC ROO assay. Ex vivo DNA damage in human lymphocytes was assessed using comet assay. Results: Total phenolic contents of food groups of the Korean diet increased in the order of mushrooms, fruits, vegetables, seaweeds, and kimchi. Meanwhile, antioxidant rankings of food groups as mean values from the three in vitro test methods increased in the order of mushrooms, seaweeds, vegetables, kimchi, and fruits. Protection against ex vivo DNA damage in human lymphocytes was highest in mushrooms, followed by vegetables, fruits, seaweeds, and kimchi. The rankings of the food groups for total phenolic content, in vitro DAC, and ex vivo DNA protection activity were similar, and correlations between each indicator were significantly high. Conclusion: Mushrooms, fruits, vegetables, and seaweeds among the tested food groups in the Korean diet showed high total phenolic contents, in vitro antioxidant capacities, and protection against DNA damage. Correlations between each indicator in terms of total phenolic content, in vitro antioxidant capacity, and ex vivo DNA protection between each food group were found to be particularly high. KEY WORDS: total dietary antioxidant capacity, Korean diet, DPPH, total phenolics, DNA damage 서론 활성산소 (reactive oxygen species, ROS) 는체내의에너지생성과정중산소의대사과정에서발생하는물질이며, 체내 ROS가증가하면이는세포를공격하여세포파괴및자살을유도할뿐아니라 DNA의단일및이중가닥을손상시키거나염기를산화시키는여러유형의 DNA 손상을유도한다. 1 이렇게산화된 DNA는인체내많은항산화 방어기전에의해 DNA 손상이제한되거나광범위한범위에서 DNA 복구가이루어지기도한다. 그러나세포의손상을일으키는 ROS의생성이체내항산화방어메커니즘의능력을초과하게되면산화스트레스가발생하게되어체내의항산화상태를악화시키고노화, 암, 심혈관계질환등을발병시키는원인이된다. 2 식물성식품에는영양소외에 polyphenol, carotenoids, phytosterols 등비영양소활성성분들이풍부하게들어있 Received: September 1, 2016 / Revised: September 17, 2016 / Accepted: October 5, 2016 *This study was supported by grants from the Basic Science Research Program of the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education, Science and Technology, Republic of Korea (NRF-2013R1A1A ). To whom correspondence should be addressed. tel: , mhkang@hnu.kr 2016 The Korean Nutrition Society This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

2 278 / 한식의항산화활성 으며인체건강을유지하는데중요한역할을담당하고있다 3. 과일과채소와같은식물성식품의섭취가심혈관계질환 4,5 과암 6,7 을포함한다양한퇴행성질환의발생을낮춰준다는것은널리알려져있다. Serafini 등 8 은지속적으로과일 / 채소와같은식물성식품을섭취할경우, 혈장에서비효소적항산화활성 (non-enzymatic antioxidant capacity) 수준이증가한다고밝혔다. 여러연구에서는식물성식품속에들어있는 phenolic acid, flavonoids와같은폴리페놀화합물의중요성과항산화활성에대해보고되었다. 9,10 구조적으로다양한 phytochemical은유사하거나중복된작용을하거나혹은반대로상반되는작용을할수있다 11. 그러므로우리가섭취하는식물성식품의건강상의이익을판단하기위해서는식품속단일항산화물질이아닌혼합된식품의항산화활성을평가하는것이필요하다. 12 총식사항산화능 (total dietary antioxidant capacity, TDAC) 이란매일의식사에서섭취하는모든식물성식품및음료의항산화활성의합을말하며, 식품으로부터섭취하는항산화활성의누적효과를평가하는도구로서사용된다. 13 개별식품또는식품속특정물질의항산화활성은식사로부터섭취하는총항산화능을나타내어주지못하므로단일식품의항산화활성을측정하는것보다총식사항산화능인 TDAC를측정하는것이중요하다. 14 Hermsdorff 등 15 의연구에따르면식사총항산화능 (total antioxidant capacity) 이복부비만과포도당, 지질바이오마커들 (total cholesterol, HDL-C ratio, triglyceride, oxidized-ldl concentrations) 과역의상관관계가있음을발견하였다. Wang 등 16 은건강한 18~25세의젊은성인을대상으로 dietary total antioxidant capacity (DTAC) 와 plasma antioxidant status의관련성을관찰한결과 DTAC 가혈장의항산화상태를예측하기에좋은도구라고보고하였다. 식품의항산화활성을측정하는방법에는 in vitro 화학적측정법들외에생체세포를이용하는생물학적측정법이있으며최근화학적측정결과보다는생물학적측정결과가실제생체내에서의항산화활성을더잘나타내준다는의견이설득력을얻고있다. 17 생체내깨진 DNA 단편을염색한후에전기영동에의해이동된 DNA의길이를측정하여 DNA의손상정도를평가하는단세포전기영동법 (the single cell gel electrophoresis, comet assay) 은 DNA 단일또는이중가닥의손상을세포수준에서평가할수있으므로생체내에서의항산화활성을반영할수있다. 18 식물성식품의건강상의이익을설명하기위한여러선 행연구에서는개별식품단위의 in vitro 항산화활성 19 또는 ex vivo 항산화활성에대한연구 20 가각각보고되었을뿐섭취량을고려한식품그룹단위의연구는매우제한되어있다. 또한최근저자들의실험실에서 in vitro 방식으로식품군별 (KNHANES V-1) 총식사항산화능 (TDAC) 을연구하고총페놀함량과 in vitro 실헙법들간의상관성을보고하였으나, 21 아직까지우리나라식품군의항산화활성을세포 DNA 손상회복능을관찰하는 ex vivo 방식으로평가한후, 지표들을비교하여그상관성을본연구는시도되지않고있다. 따라서본연구에서는제5기 2차년도국민건강영양조사결과를활용하여한식식품군의총페놀함량, in vitro 항산화활성, 그리고인체세포를이용한 ex vivo DNA 손상감소효과를비교하여각실험법들간의상관성을분석하고, 각한식식품군의 TDAC에대한기여도를알아보기위해수행되었다. 연구방법 시료의구입및전처리연구에서는한식에서섭취하는식물성식품을선정하기위해제 5기 2차년도국민건강영양조사 ( 국건영 ) 결과를활용하였다 (Table 1). 식물성식품을 10가지식품군 ( 곡류, 과일류, 채소류, 견과류, 김치류, 해조류, 감자류, 버섯류, 오일류, 두류 ) 으로분류한후, 각식품군별섭취량의 1% 이상을섭취한식품 84종을한식의식물성식품으로최종선정하였다. 선정된식물성식품은대전지역시중에서신선한상태로구입하였고, 식물성식품과기름은각각별도의과정을거쳐전처리하였다. 식물성식품의섭취방법은식품마다다양하므로각식품마다일반적으로섭취할수있는상태의가공과정을사용하여처리하였다. 가열조리된상태로섭취하는식품은삶기, 데치기등의방법을이용하여처리하였으며, 조리가필요하지않은식품은세척하거나구입시식품상태그대로사용하였다. 전처리된한식의식물성식품은각식품마다국건영결과에따라 1인 1 일섭취량비율로혼합하여 10가지식품군샘플을만들었으며, 이 10가지식품군을섭취량비율대로모두혼합하여만든식품군인총한식혼합군 (total군 ) 을포함하여 11가지실험용시료를준비하였다. 준비된샘플은동결건조하여분석시까지 -20 o C 냉동고에저장하였다. 식품군시료의추출한식의 10가지식품군과식품군전체혼합샘플 (total) 의추출물시료를제조하기위해각샘플이들어있는시험관

3 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(5): 277 ~ 287 / 279 Table 1. Intake of plant foods and oils in the Korean diet (KNHANES V-2, 2011) Food group Intake 2) (plant foods and oils) 1) (g/day) Creals Food group (plant foods and oils) Intake (g/day) Vegetables Rice Onions Rice cake Red peppers Glutinous rice Tomatoes Noodles 9.58 Cucumbers Barley 6.80 Green onions Brown rice 6.60 Chinese cabbage Corn 5.53 Squash 9.78 Flour 5.02 Radish leaves 9.14 Buckwheat noddles 3.73 Soybean sprouts 8.83 Noodle soup 3.41 Radishes 7.06 Total Spinach 6.64 Potatoes Lettuce 6.57 Potato Carrots 5.43 Sweet potato Sesame leaf 4.70 Chinese noodle 1.21 Garlic 4.06 Starch 0.71 Cabbage 3.45 Arrow roots 0.58 Leeks 2.67 Total Eggplants 2.45 Fruits Bracken 2.44 Citrus fruits Chwinamuls 2.18 Apples Total Persimmons Kimchi Pears Chinese cabbage kimchi Water melons Cubed radish kimchi 8.54 Grapes Young leafy radish kimchi 5.98 Oranges 8.20 Dong chi mi 5.42 Musk melons 8.13 Small radish kimchi 6.02 Banana 6.14 Na bak kimchi 5.70 Strawberries 5.21 Watery young leafy radish kimchi 2.95 Peaches 4.87 Cucumber kimchi 1.64 Japanese apricots 4.61 Beak kimchi 1.24 Kiwies 2.16 Green onions kimchi 1.10 Total Total Mushrooms Nuts Oyster mushrooms 1.33 Chestnuts 0.80 Pine mushrooms 1.36 Sesame 0.65 Oak mushrooms 1.25 Peanuts 0.92 Winter mushrooms 0.52 Perilla seeds 0.36 White mushrooms 0.49 Walnuts 0.24 Phellinus linteus 0.23 Ginko nuts 0.08 Total 5.18 Pine nuts 0.06 Legumes Total 3.11 Tofu Seaweeds Soybean milk Sea mustard 7.06 Soybean 3.80 Sea tangle 1.91 Kidney beans 0.66 Laver 1.38 Red beans 0.60 Green laver 0.34 Total Total Oils Soybean oil 3.49 Sesame seed oil 1.47 Wild sesame seed oil 0.21 Rape seed oil 0.27 Total ) Individual items that comprised more than 1% of the total dietary intake by the group selected in this study are representative of the plant foods commonly consumed in the Korean diet. 2) g of edible portion / day / person 에 50% 메탄올 (methanol : D.W = 50 : 50) 을넣고실온에서 1시간동안 shaking 하였다. 그다음시험관을 3,000 rpm에서 30분동안원심분리한후상등액을회수하였다. 같은시험관에다시 70% 아세톤을넣고실온에서 1시간동안 shaking 한후에원심분리하여상등액을회수하였다. 회수된메탄올과아세톤추출물을섞어서추출물시료를완성하였다. 오일류의경우 99.9% 메탄올 2 ml와오일류 2 g을섞은후 30분동안아주강하게저어섞은다음 3,000 rpm, 20 o C에서 15분동안원심분리하였다. 그다음메탄올층을따라낸다음다시메탄올 2 ml를섞어원심분리하여다시추출하였다. 두번의메탄올추출물을합하여시료를완성하였다. 각각의메탄올-아세톤추출물, 오일류의메탄올추출물을 in vitro 총페놀함량과항산화활성, DNA 손상정도를측정하는시료로사용하였다. 총페놀함량측정 Folin-Ciocalteu Phenol법 22 에따라시험관에시료희석액 1 ml, 95% ethanol 1 ml, 증류수 5 ml을가한후 50% Folin-Ciocalteu Phenol reagent 0.5 ml를넣고혼합하여상온에서 5분간반응시킨다음 Na 2 CO 3 1 ml을넣고암실에서 1시간동안반응시켰다. 이혼합용액은 spectrophotometer (Shimadzu Inc., Kyoto, Japan) 를사용하여 725 nm 에서흡광도를측정하였으며, gallic acid를표준물질로하여표준곡선을작성한후총페놀화합물을정량하였다. 항산화활성측정 DPPH radical scavenging capacity 96-well micro-plate (white) 에 120 µm DPPH/ethanol solution (99.9%) 190 μl와농도별로희석한시료 10 μl를넣고 37 o C에서 30분동안항온유지한후 517 nm에서 ELISA reader (Tecan Austria, Salzburg, Austria) 를사용하여흡광도를측정하였다. 23 식품군시료의항산화활성은각농도별산화억제값 (inhibition %) 을 slope 방정식을통해계산하여 radical을 50% 저해하는농도인 IC 50 (the half maximal inhibitory concentration) 으로나타내었으며, 이값이작을수록항산화활성이높은것으로해석하였다. TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity) assay 7 mm ABTS와 2.45 mm K 2 S 2 O 8 을 D.W. 5 ml에녹인후호일에씌워상온에서 12~16시간방치하여 ABTS radical 을생성시킨후 D.W. 로희석하여 734 nm 에서흡광도값 0.70 (± 0.02) 인 ABTS 희석용액을만들었다. ABTS 희석용액 990 μl에식품군추출물시료 10 μl를첨가하여 6분간방치후 spectrophotometer (Shimadzu Inc., Kyoto, Japan)

4 280 / 한식의항산화활성 를사용하여 734 nm에서흡광도를측정하였다. 항산화활성은 trolox standard curve를이용하여산출하였으며, 모든결과는 trolox equivalents (TE, μm) 으로환산하여나타내었다. ORAC ROO (oxygen radical absorbance capacity) assay 형광표준용액 80 nm fluorescein solution 100 μl, 식품군추출물시료 50 μl, peroxyl 라디칼생성을위한 80 mm AAPH (2,2'-azobis(2-amidino-propane) dihydrochloride) 50 μl를잘혼합한후 GENios fluorescence plate reader (TECAN Trading AG, Switzerland) 를이용하여 37 o C에서 2분간격으로형광값을측정하였다 (excitation wavelength 485 nm, emission wavelength 535 nm). 시료의결과값은각시료의형광이감소하는곡선아래부분의총면적 (net area under the curve) 을산출하여 trolox에의해보호된 curve area와비교하여 trolox equivalents (TE) 로나타내었다. 24 식사항산화능 (DAC) 산출및총식사항산화능 (TDAC) 에대한기여도평가식품군의식사항산화능 (dietary antioxidant capacity, DAC) 은각식품군의일정단위당항산화능에그식품의섭취량을고려하여구할수있다. 21 본연구에서항산화활성에측정에사용된모든시료는동결건조된시료로진행하였으나식품섭취량을고려한 DAC를산출하기위해서는동결건조전신선한식품의항산화활성이필요하다. 따라서신선한식품의항산화활성은식품의동결건조전 (fresh) 과동결건조후 (dry) 의무게로부터구한계수동결건조계수 (freeze-drying factor) 를사용하여환산하였다. In vitro 실험법 (DPPH, TEAC, ORAC ROO ) 을이용하여측정한항산화활성과각식품군의일일일인평균섭취량을고려하여 DAC를계산한후총식사항산화능 (total dietary antioxidant capacity, TDAC) 에대한각식품군의기여도를평가하였다. 계산식은다음과같다. Dietary antioxidant capacity (DAC) = mean of antioxidant capacity (DPPH, ORAC ROO, TEAC (TE, μm) per capita daily intake / freeze drying food (g) fresh food (g) Freeze drying factor = freezdry food (g) Alkaline comet assay 를이용한 DNA damage 측정본연구는건강한성인을대상으로채혈하여한식식품 군의 DNA 손상감소효과여부를알아보는인체대상연구이므로수행에앞서한남대학교인체연구심의위원회 (IRB) 의승인을받았다 ( k). 건강한 20대성인여성 5명의자발적인동의를받아채혈을진행하였으며, 채혈된신선한전혈은 3시간이내에임파구를분리하였다. 분리된임파구에식품군 10종 ( 버섯류, 채소류, 과일류, 해조류, 김치류, 견과류, 두류, 감자류, 곡류, 오일류 ) 및총한식혼합군 (total군) 1종을포함한 11종의식품군시료를최대손상감소효과가나타난 50 μg/ml 농도로처리하여 DNA 손상감소효과를 comet assay로알아보았다. Comet assay는 Singh 등 25 의방법에따라진행하였다. 추출물시료를 4 o C에서 30분동안임파구세포에반응시키고 PBS로세척한다음산화스트레스에의한 DNA 손상을유발시키기위해, 전처리한임파구세포에 100 µm의 H 2 O 2 를가하여 4 o C에서 5분동안반응시킨다음 PBS로세척하였다. 일련의과정을마친임파구를채취하여 75 μl의 0.85% low melting agarose gel (LMA) 와섞은후 0.75% 의 normal melting agarose (NMA) 가 precoating 된 fully frosted slide 위에분산시켜 cover glass로덮어준후 4 o C 냉장고에서겔을굳혀주었다. Cell lysis를위해차가운 alkali lysis buffer (2.5 M NaCl, 100 mm Na 2 EDTA, 10 mm Tris) 에 1% 의 triton X-100와 10% dimethyl sulfoxide 를섞은후 slide를담가암실에서 1시간동안저온에서침지시켜 DNA double strand를풀어주었다. Lysis가끝난슬라이드에 4 o C에서냉장보관하였던 electrophoresis buffer (300 mm NaOH, 10 mm Na 2 EDTA, ph > 13) 를채워 40분동안 unwinding시켜 DNA의알칼리에취약한부위가드러나게한후 25 V, 300 ± 3 ma의전압을걸어 20분동안전기영동하였다. 전기영동이끝난후 Tris 완충용액 (ph 7.4) 에 5분씩총 3번의세척을반복한후슬라이드를건조시켰다. Comet image 분석을위해 20 μl/ml 농도의 ethidium bromide로핵을염색하여형광현미경 (Leica, Germany) 상에서관찰하고, CCD camera (Nikon, Japan) 를통해보내진각각의세포 image는 comet image analyzing system (Kinetic image 4.0, UK) 이설치된컴퓨터상에서분석하였다. 26 결과값은핵으로부터끌려나온꼬리의길이 (tail length, TL), 꼬리부분에포함된 DNA % (% DNA in tail, TD), TL과 TD를곱한값 (tail moment, TM) 의세가지지표로나타냈으며, 이지표값은작을수록 DNA 손상이적은것을의미한다. 통계처리모든통계분석은 statistical package for social science (SPSS-PC+, version 22) 를이용하였으며, 각식품군으로부

5 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(5): 277 ~ 287 / 281 터얻은결과값은평균 ± 표준편차또는표준오차 (mean ± SD or SE) 로나타내었다. 식품그룹간비교를위해 oneway ANOVA 를시행하여 F값을구하고 Duncan s multiple range test를이용하여그룹간유의적차이를검증하였다 (p < 0.05). 결 국건영 1인 1일섭취량비율대로혼합된 11가지식품군의총페놀함량과항산화활성을비교한결과 Fig. 1과같다. 11가지식물성식품군중버섯류가가장높은페놀함량을나타내었으며, 그다음이과일류와채소류였고, 그다음으로해조류, 김치류, 견과류, 한식혼합, 감자류, 두류의순이었으며, 곡류와오일류의페놀함량은상대적으로낮게나타났다 (Fig. 1(a)). IC 50 으로본식품군의 DPPH radical 소거활성을보면앞의총페놀함량과비슷한경향을보여버섯류, 채소류, 과일류, 해조류, 한식혼합, 견과류및김치류에서높았고, 그다음이두류와감자류였으며, 곡류와오일류의항산화활성은매우낮았다 (Fig. 1(b)). 이와같은경향은 TEAC assay에서도마찬가지로나타나버섯류의항산화활성이유의적으로가장높았고, 그다음이해조류, 과일류, 채소류, 견과류및한식혼합이었으며, 그다음으로두류, 김치류및감자류였고, 곡류및오일류의항산화활성이가장낮게나타났다 (Fig. 1(c)). ORAC R00 assay를이용하여항산화활성비교해본결과에서는해조류가가장높은항산화활성을보였으며, 그다음으로버섯류, 채소류, 김치류, 과일류, 감자류, 두류, 한식혼합및견과류의순을보였으며, 역시곡류와오일류의항산화활성이매우낮게나타났다 (Fig. 1(d)). 3가지 in vitro 실험법 (DPPH, TEAC, ORAC ROO ) 을모두포함한식품군의항산화활성을비교하기위해세가지실험법의단위를 trolox equivalent (TE) 으로전환한후, 각항산화활성을평균내어산출해본식품군의항산화활성은 Fig. 2와같다. 역시버섯류, 해조류및채소류의항산화활성이가장높았으며그다음이김치류, 과일류, 한식혼합, 감자류, 두류, 견과류의순이었으며, 곡류와유지류의항산화활성이가장낮게나타났다. 한국인이하루동안섭취한식사로부터얻을수있는모든식물성식품의총항산화활성 (total dietary antioxidant capacity, TDAC) 을추정하기위해세가지실험법의평균값으로부터얻은항산화활성 (dietary antioxidant capacity, DAC) 과그식품군의일일평균섭취량 (per capita daily intake in the Korean diet) 을곱하였으며그결과는 Table 2 와같다. 또한이렇게계산한하루한국인식사의 TDAC 로 과 부터각식품군의기여도를알아본결과는 Fig. 3과같다. 섭취량으로볼때곡류의섭취가가장많으므로한국인의식사에대한 TDAC의기여도도곡류가 33.4% 로가장높았으며, 그다음이과일류 (23.9%) 였으며, 이어서채소류 (12.7%), 김치류 (11.2%), 감자류 (7.3%), 두류 (4.6%), 해조류 (3.3%) 의순서를보였고, 견과류 (1.7%), 버섯류 (1.1%) 및오일류 (0.7%) 의기여도가가장낮았다 (Fig. 3). 건강한성인여성 5명을대상으로채혈한후임파구분리하여여기에식품군 10종 ( 버섯류, 채소류, 과일류, 해조류, 김치류, 견과류, 두류, 감자류, 곡류, 오일류 ) 및총한식혼합군 (total) 1종을포함한 11종의식품군을처리하여 DNA 손상감소효과를 COMET assay로알아본결과는 Table 3 및 Fig. 4와같다. Tail moment 지표로본 DNA 손상은식품추출물을처리하진않은 positive control (H 2 O 2 ) 에비해버섯류, 채소류및과일류에서가장낮아 DNA 손상의회복효과가가장높음을보였고, 그다음은해조류, 김치류, 견과류, total, 두류, 감자류, 곡류및오일류의순이었다 (Fig. 4). 이와같은결과는 % DNA in tail 지표및 Tail length 지표에서도비슷하게나타나버섯류의 DNA 손상보호효과가가장뛰어났으며, 그다음이채소류, 과일류, 해조류등의순서인것으로나타났다 (Table 3). 본연구에서사용한한식식품군을대상으로총페놀함량, 3가지 in vitro 항산화활성측정법, 그리고 ex vivo 세포임파구 DNA 손상회복능력을측정하는 comet assay 등각측정법간의상관관계를본결과는 Table 4와같다. 먼저총페놀함량과다른실험법간의상관관계를보면 in vitro 에서는 DPPH 소거능실험법 (r = 0.881) 과 TEAC assay (r = 0.874) 가가장높았고, 그다음이 ex vivo comet assay (r = 0.863) 였다. Ex vivo comet assay와가장상관관계가깊은실험법은 in vitro DPPH 소거능실험법 (r = 0.961) 이었으며, 세가지 in vitro 실험법을평균한값 (r = 0.895) 과도상관관계가높았다. 고찰 본연구에서한식식물성식품군의페놀함량과 in vitro 항산화활성은버섯류에서가장많이나타났고, 과일류, 채소류, 해조류, 견과류, 김치류등의순이었다. 또 ex vivo 방법으로수행한인체임파구 DNA 손상회복효과는버섯류, 채소류, 과일류및해조류의순서로나타났다. 아직까지국내외적으로섭취량을고려한버섯류추출물과채소류추출물의항산화활성을비교한연구는보고된바없다. Saura-Calixto 등은과일, 채소, 전곡등식물성식품들로구성된지중해식식단의식품군별총페놀함량과항산화

6 Fig. 1. Total phenolic content and antioxidant capacity of plant foods based on the dry mater of the edible part in the Korean diet. Different letters are significantly different among groups by Duncan s multiple range test. Total: mixture of 10 Korean plant food groups 282 / 한식의항산화활성

7 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(5): 277 ~ 287 / 283 Table 2. Total dietary antioxidant capacity (TDAC) of food based on per capita daily intake in the Korean diet Food group Mean DAC 1) (TE, µm) Daily Intake (g of edible portion/ person) Freezedrying factor 2) TDAC Cereals Fruits Vegetables Kimchi Potatoes Legumes Seaweeds Nuts Mushrooms Oils Total dietary antioxidant capacity (TDAC) 11,815 1) Dietary antioxidant capacity (DAC) = mean of antioxidant capacity (DPPH, ORAC ROO, TEAC (TE, µm) per capita daily intake/freeze-drying factor 2) Freeze-drying factor: Fresh weight of food (g)/dry weight of food after freeze-drying (g) Fig. 3. Contribution of total antioxidant capacities (mean of DPPH, ORAC and TEAC) from all plant foods as a percentage of total dietary antioxidant capacities (TDAC) from per capita daily intake in the Korean diet (KNHANES V-2, 2011). The TDAC values were obtained by multiplying the total antioxidant capacity of each food group and the intake of each food. Fig. 2. Comparison of in vitro antioxidant activity of plant foods in Korean diet. Total: mixture of 10 Korean plant food groups 활성을분석한연구에서견과류, 과일류, 채소류가높은페놀함량과항산화활성을보였다고보고하였다. 27 또한본실험실에서수행된선행연구에서제5기 1차년도결과를바탕으로 81종의우리나라식물성식품을 11가지식품군으로나누어항산화활성 (DPPH, TEAC, ORAC ROO ) 을측정한결과총페놀함량과항산화활성이채소류에서가장높았으며, 과일류, 과일주스, 견과류, 버섯류등의순으로나타났다. 21 본연구에서도채소류, 과일류, 견과류등에서항산화활성이높았던것은선행연구들과비슷하였으나, 특히버섯류에서총페놀함량과항산화활성, 그리고 ex vivo 임파구 DNA 손상회복효과까지모두가장높게나타난것은선행연구들과는차이를보인다. 특히제5기국건영 1차년도조사결과를사용하여본연구실에서수행한선행연구 21 에서버섯류보다채소류에서항산화활성이가장높게나온것과는차이를보였는데, 이는아마도선행 Fig. 4. Relative score of lymphocyte DNA damage by Comet assay expressed as tail moment (TM) of different food groups in Korean diet. Different letters are significantly different among groups by Duncan s multiple range test (p < 0.05). P: positive control (H 2 O 2 ) Total: mixture of 10 Korean plant food groups 연구에서사용한버섯류의버섯종류와본연구에서사용한버섯류의버섯종류가달랐던것과관련이있을것으로생각된다. 즉제5기국건영 1차년도조사결과를사용한선행연구에서는버섯류섭취량중우리나라국민이 1% 이상섭취한버섯종류가느타리버섯, 송이버섯, 표고버섯과팽이버섯이었는데비해, 제5기국건영 2차년도조사결과를사용한본연구에서버섯류섭취량중우리나라국민이 1% 이상섭취한버섯종류가기존의버섯외에양송이버섯과상황버섯이추가되었다. 버섯류의항산화활성을비

8 284 / 한식의항산화활성 Table 3. Protective effect on lymphocyte DNA damage by Comet assay expressed as TM, TL, TD of food groups in whole blood Food groups Tail moment Tail length % DNA in tail Mushrooms 89.6 ± 0.6 1)a2) 84.5 ± 1.5 a 74.4 ± 2.9 a Vegetables 86.6 ± 1.0 ab 79.5 ± 1.0 b 71.5 ± 2.5 ab Fruits 86.3 ± 0.9 ab 80.1 ± 2.2 b 70.5 ± 3.4 ab Seaweeds 84.2 ± 1.2 ab 77.3 ± 0.6 bc 67.4 ± 3.2 abc Kimchi 82.3 ± 1.9 bc 76.5 ± 0.5 bc 62.1 ± 3.7 abc Nuts 82.0 ± 1.7 bc 77.9 ± 0.8 bc 62.7 ± 4.5 abc Total 81.0 ± 1.7 bc 74.4 ± 1.2 cd 63.5 ± 3.0 abc Legumes 78.2 ± 1.7 c 71.8 ± 2.0 de 56.4 ± 3.5 cd Potatoes 77.1 ± 2.4 cd 71.5 ± 1.7 de 57.6 ± 5.4 bcd Cereals 72.5 ± 2.1 de 67.7 ± 1.6 ef 46.0 ± 5.1 d Oils 71.3 ± 2.7 e 63.8 ± 1.1 f 47.7 ± 7.3 d 1) Mean ± SE; All values are relative score (%) for the positive control (H 2 O 2 ), the maximum amount of DNA damage. 2) Means with different superscripts in the same column are significantly different by the least significant difference test. Table 4. Correlation between DNA damage protective effect and antioxidant capacities (total phenolic contents, DPPH, ORAC ROO, and TEAC) Total phenolic contents COMET (ex vivo) Total phenolic contents *** DPPH ***2) *** ORAC ROO ** ** TEAC *** ** COMET (ex vivo) ** - Mean DAC 1) (TE, µm) ** *** 1) Dietary antioxidant capacity (DAC) = mean of antioxidant capacity (DPPH, ORAC ROO, TEAC (TE, µm) per capita daily intake / freeze-drying factor 2) ** p < 0.01, *** p < 교해볼때, 상황버섯과양송이버섯의항산화활성이다른버섯보다높다는연구 28 를비롯하여식용버섯인느타리버섯, 송이버섯, 표고버섯, 팽이버섯등에비해상황버섯이나차가버섯등약용버섯의경우 DPPH 라디칼소거능으로본항산화활성이 5배이상높다는연구, 29 그리고상황버섯의총폴리페놀과플라보노이드함량이다른버섯류에비해가장높았으며, 비타민 C 보다도항산화활성이높았다는연구 30 등으로볼때본연구에서상황버섯과양송이버섯이버섯류에추가된것이버섯류의항산화활성을높이는데부분적으로기여할수있을것으로여겨진다. 또선행연구 21 에서는버섯의구입시기가겨울이었던것에비해본연구에서는여름이어서아마도동일한버섯류라고해도재배조건, 수확시기, 품종등에따라항산화활성이다르게나타날수도있을것이다. 31,32 본연구에서사용한버섯류중가장섭취량이많았던것이느타리버섯이었고, 그다음이송이버섯, 표고버섯, 팽이버섯, 양송이버섯및상황 버섯이었는데, 특히우리나라사람들이주로섭취하는버섯종류에서식품군중가장높은항산화활성이나왔다는이와같은결과는한식의항산화우수성을연구할때매우소중한기초자료가되리라고본다. 물론현재우리나라식사에서버섯류의섭취량이다른식품군에비해많지않아서한식의총항산화능에서차지하는기여도는 1.1% 밖에되지않으나 (Fig. 3) 앞으로버섯류를이용한많은조리법과다양한레시피를개발하여한국인의항산화활성을높일수있는구제척인방법에대한정책적인고려가필요할것이다. 나아가앞으로버섯류에서항산화활성을보이는유효기능성분을찾아내고이를중심으로건강기능식품을개발하는일도광범위하게시도되어야할것이다. 식물의 2차대사산물의주요물질인페놀화합물은페놀기 (-OH) 를가지고있기때문에단백질및거대물질들과쉽게결합하여항산화효과, 항균효과등생리활성기능을가진다. 33 본연구에서도식물성식품의총페놀함량과 in vitro 항산화활성의상관관계를관찰한결과각각 DPPH method (r = 0.881), TEAC method (r = 0.874), ORAC method (r = 0.753) 의순서로상관관계가높은사실을확인하였다. 이와같은결과는본연구실에서의선행연구 21 결과와도일치하는결과이며, 페놀함량과항산화활성사이의높은상관관계가있다고보고한 Saura-Calixto와 Goni 27 의연구와도같은경향을보였다 (r = , FRAP method/ r = , ABTS method). 개별식품인산수유를분석한결과, 총페놀함량이높을수록 DPPH 라디칼소거능, superoxide dismutase 활성, ORAC assay에의한항산화활성이높아양의상관관계를보임도보고되었다. 34 이와같이많은선행연구들에서식물의총페놀함량과 in vitro 항산화활성분석법간의양의상관관계가있음을보고하고있으나최근 in vitro 항산화활성분석법보다더의미있는결과를도출하는생체세포를이용한 ex vivo 실험법을사용하여식품의항산화활성분석방법들간의상관성을본연구들은많지않다. 본연구에서는 in vitro 항산화활성외에 ex vivo 방법으로인체임파구 DNA 손상정도를측정한결과, 11가지식품군중가장많은페놀화합물을가지고있었던버섯류의 ex vivo DNA 손상보호효과가가장높았으며, 다른식품군역시페놀함량및 in vitro 항산화활성이높을수록 ex vivo DNA 손상보호효과가높음을보여 DNA 손상보호효과와총페놀함량 (r = 0.853) 및 in vitro 항산화활성 (DPPH, r = 0.961; ORAC, r = 0.850; TEAC, r = 0.843) 과의상관성이매우높게나타났다. Jayakumar와 Kanthimathi 35 는여러가지향신료에서페놀함량이높을수록 DNA 손상보호효과가높았으며, 암세포증식억제효과도높아진다고보고하여본연구결과

9 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(5): 277 ~ 287 / 285 를뒷받침해주었다. 35 그러나이와는달리식물의페놀함량과 DNA 손상보호효과사이에상관관계가나타나지않았다는보고도있는데, 35 이는페놀성분이외다른유효성분들이 DNA 손상회복에더크게기여하기때문인것으로사료된다. 현재까지총페놀함량과 ex vivo DNA 손상보호효과의상관관계에대한연구는개별식품단위로진행되어졌으며, 개별식품속성분에따라유전독성을나타내기도한다. 36 따라서본연구에서보인한식식품군의총페놀함량및 in vitro 항산화활성과 ex vivo DNA 손상보호효과사이의높은상관관계는항산화활성이높은식물성식품의섭취와질병과의역의상관관계를연구한여러선행연구 4-7 의결과를뒷받침하는기초자료로사용될수있을것이며, 나아가한식의건강상의이로움을증명할수있는도구가될수있을것이다. 매일의식사 (Korean diet) 에서식물성식품으로부터섭취할수있는모든항산화활성을나타내는총항산화능 (TDAC) 에대한각식품군의기여도를평가한결과곡류가 33.4% 로가장높은기여도를보였으며, 과일류 (23.9%), 채소류 (12.7%), 김치류 (11.2%), 감자류 (7.3%) 등의순으로나타났다. 이와같은결과는국건영 1차년도자료를사용하여한식식품군의총항산화능에대한기여도를평가한선행연구 21 에서곡류가 39.7% 로가장높은기여도를보였으며, 과일류 (27.8%), 채소류 (13.9%), 김치류 (4.5%), 감자류 (4.4%) 등의순으로나타난것과같은경향이다. 한식은밥, 국, 채소를이용한다양한반찬으로구성되어있으며, 김치는매식사때마다제공된다. 37 밥을주식으로하는우리나라의식사패턴으로인해 1인 1일곡류의섭취는 g으로전체식품섭취량의 31.1% 를차지하며, 버섯류와해조류는각각 0.6%, 1.3% 를차지한다. 따라서 in vitro 실험법 (DPPH, TEAC, ORAC ROO ) 으로본곡류의항산화활성이매우낮았음에도불구하고총항산화능 (TDAC) 기여도가가장높게나타났으며, 반대로항산화활성이높았던버섯류와해조류는총항산화능 (TDAC) 기여도가낮음을보였다. 이는총항산화능이각식품의항산화활성과그식품의섭취량으로부터계산되기때문이다. 즉곡류의경우는섭취량이매우높고, 버섯류와해조류는항산화활성은높으나실제섭취량이낮기때문에총항산화능이낮게나타난다. 만약식품섭취량에대한고려없이각식품별혹은각식품군별항산화활성만측정한다면개별식품이식사안에서차지하는항산화활성에대해과평가될위험이있다. 따라서식품또는 whole diet의건강상의이익을설명하기위해서는개별적인식품의항산화활성뿐만아니라식품섭취량의개념을결합하여총항산화능으로써항산화활성을평가하는일이중요할것이다. 본연 구결과총항산화능 (TDAC) 에대해가장높은기여도를보인곡류가한식의건강상의이익에주된역할을하고있음을다시한번확인할수있었다. 본연구에서샘플로사용된곡류군은쌀 (rice) 이 73.3% 로가장많이섭취되고있으며, 떡 (rice cake) 6.1%, 찹쌀 (glutinous rice) 4.1%, 라면 (noodles) 3.9%, 보리 (barley) 2.8%, 현미 (brown rice) 2.7% 의순으로전곡이아닌도정된쌀을주로섭취하고있다. 일반적으로도정된곡류 (refined rice) 보다는전곡 (whole grain) 을섭취하는것이질병의위험을낮춘다고알려져있다. 여러 cohort 선행연구에서전곡 (whole grain) 섭취와심혈관계질환, 뇌졸중, 관상동맥심장질환의상관관계를연구한결과, 전곡의섭취가많을수록심혈관계질환등여러질병의발생과역의상관관계가있다고보고하였다. 38 또한전곡의섭취가많을수록 BMI가낮고, 고혈압또는고콜레스테롤을유병률이적었으며, 2형당뇨에대한상대적위험도가낮았다는보고도있다. 39 그러나 Enright L과 Slavin J 40 의연구에서전곡과도정된곡류의섭취후혈장항산화활성을비교하기위해 14일동안무작위- 교차식이중재연구를실시한결과전곡과도정된곡류를섭취한두그룹사이의혈장항산화활성에유의적차이를보이지않았다. 또한 6주간무작위-교차식이중재연구를통해전곡과도정된곡류의섭취후에인슐린민감성과지질과산화, 염증반응 marker 의차이를측정한결과전곡섭취가공복시혈당에영향을미치지않았으며, 지질과산화와염증반응마커에서도도정된곡류를섭취했을때와차이를보이지않았다. 41 이러한결과는본연구에서사용된곡류가전곡이아닌도정된곡류로구성되어있음에도불구하고섭취량이많음으로인해서한식전체의항산화활성에상당부분기여한다는사실을증명한다. 그러므로식사패턴과질병의상관관계연구에있어개별식품이나식품군의항산화능뿐만아니라그식품 ( 군 ) 의섭취량을고려해야하는총항산화능 (TDAC) 의개념은식사의올바른항산화활성을평가하는기준이될수있으며, 나아가질병예방을위해한식을활용한정책개발의기초자료로사용될수있을것이다. 결론적으로, 본연구에서한식식품군의총페놀함량, in vitro 항산화활성, 그리고인체세포를이용한 ex vivo DNA 손상보호효과를측정하여이측정법들간의상관성을비교한결과, 한식식품군의총페놀함량, in vitro 항산화활성및세포수준에서평가한 ex vivo DNA 손상보호효과의순위가비슷한경향을보였으며각실험법들간의상관성도매우높게나타났다. 본연구에서사용한 11가지한식식품군중에서버섯류의 in vitro 항산화활성과 ex vivo DNA 손상보호효과가가장높게나타났으며, 채소류와과

10 286 / 한식의항산화활성 일류, 그리고해조류가그다음의순이었다. 이로써한식식품군, 특히버섯류가우수한항산화활성을갖고있으며, 생체내에서산화스트레스로부터세포를보호할수도있음을보여준다. 한식의총항산화능 (TDAC) 은식품군의섭취량을고려하여계산되므로, 항산화활성이가장낮았던곡류가한식의총항산화능에가장큰기여를하고있다는사실을다시한번확인하였으며, 식사의올바른항산화활성평가를위해서는섭취량을고려한총항산화능의개념으로접근할필요성을보여준다. 본연구에서는식사의항산화활성평가도구로서 TDAC의유용성을밝히고, 한식식품군의 in vitro 항산화활성과 ex vivo DNA 손상보호효과의높은상관관계를증명하였다. 이러한결과는식물성식품이풍부한한식식사패턴을유지하는것이인체내에서산화스트레스로인한손상을보호하여질병을예방할수있을가능성이있음을증명한다. 요약 본연구는제5기 2차년도국민건강영양조사결과를활용하여한식식품군의총페놀함량, in vitro 항산화활성및인체세포를이용한 ex vivo DNA 손상감소효과를비교하고, 각지표간의상관성을분석하며, 한식의총식사항산화능에대한각식품군의기여도를알아보기위해수행되었다. 제5기 2차년도국민건강영양조사결과를바탕으로한식의식물성식품을 10가지식품군 ( 곡류, 과일류, 채소류, 견과류, 김치류, 해조류, 감자류, 버섯류, 두류, 오일류 ) 으로분류한후각식품군별로총섭취량의 1% 이상섭취한식품 84종을한식의식물성식품으로최종선정하였다. 각식품군의총페놀함량을측정하였고, DPPH radical scavenging assay, TEAC assay, ORAC ROO assay를사용하여 in vitro 항산화능을측정하였다. 한식의식품군별항산화능 (dietary antioxidant capacity, DAC) 은 in vitro 항산화활성평균값과각식품군의 1일섭취량을고려하여계산하였고한식 TDAC는각식품군의 DAC로의합으로구하였으며, TDAC에대한각식품군항산화능의기여도를평가하였다. 인체임파구에서의 ex vivo DNA 손상정도는 comet assay를사용하여평가하였다. 한식식품군의총페놀함량은버섯류, 과일류, 채소류, 해조류, 김치류등의순으로높았으며, 3가지 in vitro 실험법을평균한식품군의항산화활성순위는버섯류, 해조류, 채소류, 김치류, 과일류등의순이었다. 각식품군의항산화활성에식품섭취량을고려하여계산한한식의 TDAC에대한식품군의항산화능기여도는곡류가 33.4% 로가장높았으며, 과일류 (23.9%), 채소류 (12.7%), 김치류 (11.2%) 등의순으로나 타났다. 인체임파구에서 ex vivo DNA 손상보호효과는버섯류에서가장높았으며, 그다음채소류, 과일류, 해조류, 김치류의순으로나타났다. 각식품군의페놀함량과 in vitro 항산화활성, 그리고 ex vivo DNA 보호효과의순위가비슷하게나타났으며각지표간의상관성은매우높았다. 한식식품군중버섯류, 과일류, 채소류, 해조류에서총페놀함량과항산화활성, DNA 손상보호효과가높게나타났다. 각식품군의총페놀함량과 in vitro 항산화활성, ex vivo DNA 보호효과지표간의상관성은매우높았다. 한식의 TDAC에대한식품군별항산화능기여도는곡류가가장높았고, 그다음이과일류, 채소류, 김치류의순이었다. 이러한결과는앞으로한식의우수성을항산화측면에서밝히는데매우중요한기초자료로활용될수있을것이다. References 1. De Bont R, van Larebeke N. Endogenous DNA damage in humans: a review of quantitative data. Mutagenesis 2004; 19(3): Benzie IF. Evolution of antioxidant defence mechanisms. Eur J Nutr 2000; 39(2): Saura-Calixto F, Goñi I. Definition of the Mediterranean diet based on bioactive compounds. Crit Rev Food Sci Nutr 2009; 49(2): Hertog MG, Feskens EJ, Hollman PC, Katan MB, Kromhout D. Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: the Zutphen elderly study. Lancet 1993; 342(8878): Hertog MG, Kromhout D, Aravanis C, Blackburn H, Buzina R, Fidanza F, Giampaoli S, Jansen A, Menotti A, Nedeljkovic S, Pekkarinen M, Simic BS, Toshima H, Feskens EJ, Hollman PC, Katan MB. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med 1995; 155(4): Doll R. An overview of the epidemiological evidence linking diet and cancer. Proc Nutr Soc 1990; 49(2): Hertog MG, van Poppel G, Verhoeven D. Potentially anticarcinogenic secondary metabolites from fruit and vegetables. In: Tomás- Barberán FA, Robins RJ, editors. Phytochemistry of Fruit and Vegetable. Oxford: Clarendon Press; p Serafini M, Del Rio D, Crozier A, Benzie IF. Effect of changes in fruit and vegetable intake on plasma antioxidant defenses in humans. Am J Clin Nutr 2005; 81(2): Mullen W, Marks SC, Crozier A. Evaluation of phenolic compounds in commercial fruit juices and fruit drinks. J Agric Food Chem 2007; 55(8): Luthria DL, Pastor-Corrales MA. Phenolic acids content of fifteen dry edible bean (Phaseolus vulgaris L.) varieties. J Food Compost Anal 2006; 19(2-3): Wang S, Meckling KA, Marcone MF, Kakuda Y, Tsao R. Synergistic, additive, and antagonistic effects of food mixtures on total antioxidant capacities. J Agric Food Chem 2011; 59(3):

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