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윤혜 임
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1 2005 국립보건연구원보 제42권 질병관리본부 국립보건연구원

2 국립보건연구원보 제42권 2005 목 차 Ⅰ. 연구보고 <내부과제> 쯔쯔가무시증 다발생 지역에서의 기후 변화 잠재 영향 박재경, 박옥, 김미영, 김귀향, 김선미, 고정애, 신영학 1, 박만석 3 동성애자 대상 HIV/AIDS 혈청역학 및 성행태 감시체계 개발과 유행예측 모형 구축 고운영, 기미경 1, 박효숙 2, 정연화 3, 김성주, 황지영 3 5 전염병 신속대응을 위한 과학적인 역학조사 방법론 개발 허영주, 이동한, 강영아, 이상원, 이욱교 1, 최연화 2, 최빈아, 김성순, 이용제, 김진현 3 23 장출혈성대장균의 병인기작의 해명 연구 조성학, 김종철, 박미선, 이복권 47 보툴리눔 독소생물활성 분석 및 고감도 진단법 개발 연구 신나리, 윤소연, 신지훈, 이기은, 성원근 1, 김봉수, 오희복 49 병원성 가시아메바 superoxide dismutase의 분자생물학 및 면역학적 병원성 기전 연구 김정연, 조신형, 주정원, 전형일, 최택균, 오창미, 이영희, 김동수, 나병국 1 51 Moraxella catarrhalis의 분자 역학 및 UspA 단백의 병원성, 면역원성 특성 연구 이영희, 성화영, 최지혜, 김기상, 강연호, 유재연 53 Francisella tularensis 감염증 진단표준화 및 면역기전 연구 황규잠, 황성조, 심수경, 최영실, 박상희, 이병철, 박만석 1, 박미연 55 쯔쯔가무시증의 지역에 따른 분리균 특성에 관한 연구 심수경, 최은나, 한선웅, 황규잠, 최영실, 박상희, 이병철, 김연숙 1, 김효열 2, 위성헌 3, 김동민 4, 김신우 5, 박미연 57 Azole계 내성 Candida균의 내성기전 및 분자유전학적 특성 연구 유재일, 최치원, 이영선, 이경민, 김봉수 77 ii

허영주, 이동한, 강영아, 이상원, 이욱교 1, 최연화 2, 최빈아, 김성순, 이용제, 김진현 3 23 장출혈성대장균의 병인기작의 해명 연구 조성학, 김종철, 박미선, 이복권 47 보툴리눔 독소생물활성 분석 및 고감도 진단법 개발 연구 신나리, 윤소연, 신지훈, 이기은, 성원근 1, 김봉수, 오희복 49 병원성 가시아메바 superoxide

3 The Report of National Institute of Health, Vol.42, 2005 Ⅰ. Research works Contents <Intermural Research Project> Potential impacts of climate change on scrub typhus in high incidence area of Korea J.K. Park, O. Park, M.Y. Kim, K.H. Kim, S.M. Kim, J.A. Ko, Y.H. Shin 1 and M.S. Park 4 Development sero-behavioral surveillance system of HIV/AIDS for MSMs and construction of mathematical model U.Y. Go, M.K. Kee 1, H.S. Park 2, Y.H. Jung 3, S.J. Kim and J.Y. Hwang 3 21 The development of scientific epidemic investigation method for the rapid response to the communicable disease outbreak Y.J. Hur, D.H. Lee, Y.A. Kang, S.W. Lee, W.K. Lee 1, Y.H. Choi 2, B.A. Choi, S.S. Kim, Y.J. Lee and J.H. Kim 3 46 Research on pathologic mechanism of enterohemorrhagic E. coli S.H. Cho, J.C. Kim, M.S. Park and B.K. Lee 48 Bioactivity analysis of botulinum neurotoxin and development of high sensitive diagnostic method for botulism N.R. Shin, S.Y. Yoon, J.H. Shin, G.E. Rhie, W.K. Seong 1, B.S. Kim and H.B. Oh 50 Molecular characterization and pathogenic study of Acanthamoeba castellanii superoxide dismutase J.Y. Kim, S.H, Cho, J.W. Ju, H.I. Jun, T.K. Choi, C.M. Oh, Y.H. Lee, T.S. Kim and B.K. Na 1 52 Molecular epidemiological study and characterization of Pathogenic and immunogenetic characteristics of UspA gene on Moraxella catarrhalis isolated in Korea Y.H. Lee, H.Y. Sung, J.H. Choi, K.S. Kim, Y.H. Kang and J.Y. Yu 54 Standardization of the Laboratory diagnostic methods and Immunological mechanism of Francisella tularensis K.J. Hwang, S.J. Hwang, S.K. Shim, Y.S. Choi, S.H. Park, B.C. Lee, M.S. Park 1 and M.Y. Park 56 Characterization of Orientia tsutsugamushi isolated by regions in Korea S.K. Shim, E.N. Choi, S.W. Han, K.J. Hwang, Y.S. Choi, S.H. Park, B.C. Lee, Y.S. Kim 1, H.Y. Kim 2, S.H. Wi 3, D.M. Kim 4, S.W. Kim 5 and M.Y. Park 76 Antifungal resistant mechanism and moleculargenetic characterization of azole antifungal agent resistance Candida species J.I. Yoo, C.W. Choi, Y.S. Lee, K.M. Lee and B.S. Kim 93 iii

K. Kee 1, H.S. Park 2, Y.H. Jung 3, S.J. Kim and J.Y. Hwang 3 21 The development of scientific epidemic investigation method for the rapid response to the communicable disease outbreak Y.J. Hur, D.H. Lee, Y.

4 Ciprofloxacin 내성 Neisseria gonorrhoeae의 Non-target site 변이 내성기작 규명 유정식 2, 김보림 1, 김윤정, 유천권 1, 성원근 1, 김봉수 95 Orientia tsutsugamushi의 adhesion 관련 단백질의 발현 및 특성 연구 박상희, 김주심, 이지선, 이정현, 심수경, 최영실, 황규잠, 박미연 97 프로테옴 분석으로 확인된 폐렴구균의 GrpE 단백의 기능유전체학적 접근 배송미, 장미정, 강연호 99 콜레라 백신 후보 균주 개발 및 경구용 다가 백신 delivery system으로서의 이용에 관한 연구 정혜미, 정경태, 전정훈, 이복권 1, 유천권 2, 성원근 2, 김봉수, 이기은 101 sirna에 의한 RNA interference 기법을 이용한 아데노바이러스(Adv) 증식억제에 관한 연구 김민경, 정윤석, 강춘 103 한국인 HIV 감염자에서의 HIV dynamics와 면역반응 분석 김갑정, 이학성, 남정구, 기미경, 주재신, 서순덕, 김성순 105 국내 유행 HCV를 사용한 Replicon cell 제작 및 유전자 변이 분석 강수진, 김소연, 김선옥, 조영주, 조경아, 김대진 1, 김은주 2, 신해림 3, 지영미 107 국내 발생 바이러스성 식중독의 분자역학적 특성 분석 연구 김경창, 안정배, 이정수, 이회규, 정아용, 엄홍기, 천두성, 지영미 109 도심서식 질병매개모기(Diptera: Culicidae)에 대한 방제전략 수립 및 모기발생 network 구축 신이현, 이희일, 이욱교, 장규식, 김용기, 송봉구, 김태균, 홍한기, 이원자 111 사스(중증급성호흡기증후군) 재조합 단백질을 이용한 dual antigen/ antibody detection ELISA 진단체계 구축에 관한 연구 신구철, 정윤석, 김인수, 최장훈, 강춘 113 진드기매개뇌염바이러스 (Tick-Borne Encephalitis Virus)에 대한 실험실 진단 및 국가 감시체계 구축에 대한 연구 주영란, 김수연, 윤석민, 이인용 1, 유정희, 정영의, 이대연 115 HIV 전파양상에 따른 HIV 유행주의 변화 및 특성에 대한 분자역학적 연구 : 남성 동성 감염자 남정구, 김갑정, 신보경, 백진영, 기미경, 김성순 117 바이러스 감염진단을 위한 다목적 DNA chip개발 정윤석, 최우영, 김기순, 지영미, 신영학, 강춘, 김성순, 조해월, 이주실 119 JEV 국내분리주와 prototype주들에 대한 감염 세포에서의 유전자 발현과 면역학적 특성에 관한 비교분석 유정희, 김연희, 조정은, 이대연, 정영의, 주영란, 박근용, 신영학 130 iv

이용한 아데노바이러스(Adv) 증식억제에 관한 연구 김민경, 정윤석, 강춘 103 한국인 HIV 감염자에서의 HIV dynamics와 면역반응 분석 김갑정, 이학성, 남정구, 기미경, 주재신, 서순덕, 김성순 105 국내 유행 HCV를 사용한 Replicon cell 제작 및 유전자 변이 분석 강수진, 김소연, 김선옥, 조영주, 조경아, 김대진 1,

5 Evidence of Ciprofloxacin resistant mechanism associated with Non-target site in Neisseria gonorrhoeae J.S. Yoo 2, B.R. Kim 1, Y.J. Kim, C.K. Yoo 1, W.K. Seong 1 and B.S. Kim 96 Characteristics and expression of proteins related with the adhesion of Orientia tsutsugamshi S.H. Park, J.S. Kim, J.S. Lee, J.H. Lee, S.K. Shim, Y.S. Choi, K.J. Hwang and M.Y. Park 98 Functional genomic approach of Streptococcus pneumoniae GrpE identified by proteomic analysis S.M. Bae, M.J. Jang and Y.H. Kang 100 Construction of Vibrio Cholerae Vaccine Candidate Strains in Which Cholera Toxin B Subnit is Overexpressed H.M. Jung, K.T. Jung, J.H. Chun, B.K. Lee 1, C.K. Yoo 2, W.K. Seong 2, B.S. Kim and G.E. Rhie 102 Analysis of Inhibition mechanism for the Adenovirus(Adv) replication by RNA interference with sirna M.K. Kim, Y.S. Chung and C. Kang 104 Analysis of HIV Dynamics and Immune Responses of HIV-1 infected Koreans G.J. Kim, H.S. Lee, J.G. Nam, M.K. Kee, J.S.Chu, S.D. Suh and S.S. Kim 106 Genotyping and Development of Replicon system for Hepatitis C viruses S.J. Kang, S.Y. Kim, S.O. Kim, Y.J. Cho, K.A. Cho, D.J. Kim 1, E.J. Kim 2, H.R. Shin 3 and Y.M. Jee 108 Genetic Analysis of Epidemic Strains Causing Foodborne Viral Gastroenteritis K.C. Kim, J.B. Ahn, J.S. Lee, H.K. Lee, A.Y. Jeong, H.K. Um, D.S. Cheon and Y.M. Jee 110 Establishment on Control Strategy and Mosquito-net of Urban mosquitoes E.H. Shin, H.I. Lee, W.G. Lee, K.S. Chang, Y.K. Kim, B.G. Song, T.K. Kim, H.K. Hong and W.J. Lee 112 Development of dual antigen/antibody detection ELISA system with SARS-CoV recombinant protein G.C. Shin, Y.S. Chung, I.S. Kim, J.H. Choi and C. Kang 114 Construction of diagnostic methods and national surveillance for tick-borne encephalitis virus in Korea Y.R. Ju, S.Y. Kim, S.M. Yun, I.Y. Lee 1, C.H. Yu, Y.E. Jeong and D.Y. Lee 116 Molecular Epidemiological Investigation on the Trends and Characteristics of Prevalent HIV Strains by Transmission Mode : HIV-infected MSM J.G. Nam, G.J. Kim, B.K. Shin, J.Y. Baek, M.K. Kee and S.S. Kim 118 Development of oligonucleotide DNA chip for Rapid and multiple detection of viral pathogen Y.S. Chung, W.Y. Choi, K.S. Kim, Y.M. Jee, Y.H. Shin, C. Kang, S.S. Kim, H.W. Cho and J.S. Lee 128 Studies of the replication and immunological characterization in infected cells by JEV isolated in Koreas and JEV prototypes C.H. Yu, Y.H. Kim, J.E. Cho, D.Y. Lee, Y.E. Jeong, Y.R. Ju and Y.H. Shin 145 v

K. Shim, Y.S. Choi, K.J. Hwang and M.Y. Park 98 Functional genomic approach of Streptococcus pneumoniae GrpE identified by proteomic analysis S.M. Bae, M.J. Jang and Y.H. Kang 100 Construction of Vibrio Cholerae Vaccine Candidate Strains in Which Cholera Toxin B Subnit is Overexpressed H.

6 전염병 매개모기관리를 위한 방역용 살충제 감수성 조사 장규식, 박재선, 문승국, 이혜은, 신이현, 이희일, 이욱교, 박근용, 이원자 146 덱사메타손과 비타민 C를 방출하는 생분해성 고분자 지지체와 인간골수줄기세포를 이용한 생체 내 골형성 연구 김형범, 서활 1, 안상미, 김현우 1, 이정민, 김은혜, Yvonne Reinwald, 박상혁 3, 민병현 2, 조인호 172 한국인의 endothelial nitric oxide synthase내의 유전적 다형성인 -786TC과 심근경색에 대한 흡연과의 관계 연구 조인호 1, 문제성 1, 윤수인 1, 김흥태 1,2, 김은경 1, 박현영 1,3, 신철 4, 민지호 1, 진윤미 1, 차승헌 2, 안상미 배아줄기세포를 이용한 심장근육세포로의 분화기전 및 이를 이용한 심근재생에 관한 연구 박윤신, 강성기, 이수재 1, 김광표 1, 박상익 177 TGF-β에 의한 cardiac remodeling의 기전 연구를 통한 심부전 억제제 개발 임중연, 박성준, 황하영, 박은정, 남재환 1, 김준 2, 박상익 179 The role of ERK1/2 activation in the infection of HeLa cells with human coxsackievirus 정선구, 김주영, 황하영, 전은석 1, 임병관 1, 남재환 2, 박상익 181 Coxsackievirus and adenovirus receptor(car)와 coxsackievirus의 결합을 방해하는 DNA vaccine 개발 김주영, 전은석 1, 임병관 1, 김선미, 정선구, 김종묵 2, 박상익, 조인호, 남재환 알츠하이머 치매의 증상 심화에 따른 Rab6 발현의 증가 채산숙, 백태경 1, 안상미 185 베타 아밀로이드 펩타이드 (β-amyloid peptide)를 분해하는 Streptomyces sp. KK565 aminopeptidase (SKAP)의 작용기전 연구 유철배, 안경숙, 안상미 187 간질발작 후 MARCKS와 PKC의 세포유형별 발현양상 규명 김은해, 김화정, 강기석, 안상미, 은수용 209 세포간극 유전자 돌연변이에 의한 유전성 난청 유발 기전 연구 진현석, 엄상미, 박현영, 구수경 211 임신성 고혈압 발생에 있어서 leptin과 leptin receptor 유전자의 다형성 분석 이광수, 엄상미, 김영주 1, 류현미 2, 박현영 226 vi

이를 이용한 심근재생에 관한 연구 박윤신, 강성기, 이수재 1, 김광표 1, 박상익 177 TGF-β에 의한 cardiac remodeling의 기전 연구를 통한 심부전 억제제 개발 임중연, 박성준, 황하영, 박은정, 남재환 1, 김준 2, 박상익 179 The role of ERK1/2 activation in the infection of HeLa

7 Study on susceptibility of disease vector mosquito against insecticides used for public health K.S. Chang, J.S. Park, H.E. Lee, E.H. Shin, H.I. Lee, W.K. Lee, K.Y. Park and W.J. Lee 171 In vivo bone formation by human marrow stromal cells in biodegradable scaffolds that release dexamethasone and ascorbate-2-phosphate H.B. Kim, H. Suh 1, S.A. Jo, H.W. Kim 1, J.M. Lee, E.H. Kim, Y. Reinwald, S.H. Park 3, B.H. Min 2 and I.H. Jo 173 Interaction between-786tc polymorphism in the endothelial nitric oxide synthase gene and smoking for myocardial infarction in Korean population I.H. Jo 1, J.S. Moon 1, S.I. Yoon 1, H.T. Kim 1,2, E.K. Kim 1, H.Y. Park 1,3, C. Shin 4, J.H. Min 1, Y.M. Jin 1, S.H. Cha 2 and S.A. Jo Identification of a target protein β2-tubulin and specific tyrosine residues under nitration modification by NO produced during DMSO-induced cardiomyocyte differentiation in embryonic stem cell line P19CL6 Y.S. Park, S.K. Kang, S.J. Lee 1, K.P. Kim 1 and S.I. Park 178 TGF-β induces cardiac hypertrophic responses via PKC-dependent ATF2 activation J.Y. Lim, S.J. Park, H.Y. Hwang, E.J. Park, J.H. Nam 1, J. Kim 2 and S.I. Park 180 The role of ERK1/2 activation in the infection of HeLa cells with human coxsackievirus S.K. Chung, J.Y. Kim, H.Y. Hwang E.S. Jeon 1, B.K. Lim 1, J.H. Nam 2 and S.I. Park 182 Immunogenicity of a DNA vaccine for coxsackievirus B3 in mice: protective effects of capsid proteins against viral challenge J.Y. Kim, E.S. Jeon 1, B.K. Lim 1, S.M. Kim, S.K. Chung, J.M. Kim 2, S.I. Park, I.H. Jo and J.H. Nam The expression of Rab6 protein is increased in AD brain S.S. Chae, T.K. Baek 1 and S.A. Jo 186 An aminopeptidase from Strepomyces sp. KK565 (SKAP) inhibits β-amyloid peptide aggregation by cleaving Aβ N-terminal amino acids C.B. Yoo, K.S. Ahn and S.A. Jo 208 Cell Type-specific Upregulation of Myristoylated Alanine-rich C Kinase Substrate (MARCKS) and Protein Kinase C-alpha, -betaⅠ, -betaⅡ, and -delta in Microglia Following Kainic Acid-induced Seizures E.H. Kim, H.J. Kim, K.S. Kang, S.A. Jo and S.Y. Eun 210 Functional study of syndromic GJB2 mutant alleles detected in Korean deaf patients H.S. Jin, S.M. Eom, H.Y. Park and S.K. Koo 225 Association study of LEP and LEPR gene polymorphisms in patients with pre-eclampsia K.S. Lee, S.M. Eom, Y.J. Kim 1, H.M. Ryu 2 and H.Y. Park 227 vii

Lee 171 In vivo bone formation by human marrow stromal cells in biodegradable scaffolds that release dexamethasone and ascorbate-2-phosphate H.B. Kim, H. Suh 1, S.A. Jo, H.W. Kim 1, J.M. Lee, E.H. Kim, Y.

8 비만과 당뇨병 관련 유전자들의 기능 연구 서영호, 조명국, 정명호 228 KLF에 의한 hepatic gluconeogenesis 조절연구 서영호, 방정현, 문창숙, 정명호 230 난소절제 랫드에서 제니스테인과 콩단백질이 지질 대사에 미치는 영향 이영민 1,2, 정명호 1, 이연숙 2, 송지현 Pancreatic βcell에서 chronic high glucose가 유도하는 apoptosis가 당뇨병 발병에 미치는 영향과 그 관 련 기전에 관한 연구 김원호, 이준우, 송지현, 정명호 244 Mitochondria 이상이 Pancreatic β 세포의 기능에 미치는 영향 이준우, 김원호, 정명호, 임주현 246 당뇨병 병인기전 관여 유전자의 정량적 특성 분석 (quantitative trait analysis)을 통한 발현조절 전사조 절 네트워크 복합체 연구 김영열, 유길미, 김상배, 김영진, 김동준, 박성준, 박찬, 김규찬 260 인간게놈에서 리간드와 상호작용하는 단백질을 암호화하는 유전자 추출 및 분석 정종선, 박찬, 김규찬 262 핵내 전사체의 발현 및 alternative splicing 분석을 통한 세포내 대사 조절기작에 관한 연구 김영열, 김동준, 박성준, 오경수, 김규찬, 박찬 272 질병 및 질병유전자의 발현에 영향을 주는 요인 발굴 및 위험요인 평가도구 개발 김효미, 박선주, 박윤주, 민해숙, 곽혜경, 박용철, 김규호, 오경수, 안윤진, 김규찬, 박찬 274 지역사회 코호트 여성의 요골과 경골에서의 골다공증 유병률과 관련 요인 분석 - Quantitative Ultrasound 방법을 이용하여 - 박선주, 안윤진, 민해숙, 오경수, 박찬, 조남한 1, 김규찬 289 한국인 호발 만성질환의 병리생리학 모델연구를 위한 전사체와 단백체의 발현연구 기반구축 김연정, 최정원, 박성규, 황민영, 오범석 292 한국인에서 새로운 HLA-DOB-allele 발굴 구해옥, 이종극, 오범석 294 Transforming Growth Factor Beta-Induced 유전자의 다형성과 체질량지수와의 연관성 박경수, 신형두 1, 박병래 1, 정현섭 1, 조영민, 이홍규, 이종영 2, 이종극 2, 김흥태 2, 한복기 2, 김준우 2, 고인송 2, 김영진 2, 김규찬 2, 오범석 viii

analysis)을 통한 발현조절 전사조 절 네트워크 복합체 연구 김영열, 유길미, 김상배, 김영진, 김동준, 박성준, 박찬, 김규찬 260 인간게놈에서 리간드와 상호작용하는 단백질을 암호화하는 유전자 추출 및 분석 정종선, 박찬, 김규찬 262 핵내 전사체의 발현 및 alternative splicing 분석을 통한 세포내 대사 조절기작에 관한 연구

9 Functional study on the genes associated with obesity and type 2 diabetes Y.H. Suh, M.K. Jo and M.H. Jung 229 Regulation of hepatic gluconeogenesis by KLF Y.H. Suh, J.H. Bang, C.S. Moon and M.H. Jung 241 Effect of genistein and soy protein on lipids metabolism in ovariectomized rats Y.M. Lee 1,2, M.H. Jung 1, Y.S. Lee 2 and J.H. Song Exposures to Chronic High Glucose Induces β-cell Apoptosis Through Decreased Interaction of Glucokinase with Mitochondria Downregulation of Glucokinase in Pancreatic β-cells W.H. Kim, J.W. Lee, J.H. Song and M.H. Jung 245 Mitochondria Dysfunction Induces Pancreatic β-cell Apoptosis Through decreased Interaction of GCK with Mitochondria J.W. Lee, W.H. Kim, M.H. Jung and J.H. Lim 259 Gene expression and regulatory network analysis through quantitative trait analysis of diabetes associated genes Y.Y. Kim, G.M. Ryu, S.B. Kim, Y.J. Kim, D.J. Kim, S.J. Park, C. Park and K.C. Kimm 261 Genes for ligand-interacting proteins in Human genome J.S. Jung, C. Park and K.C. Kimm 271 The Association of TRAF-2 with the Short form of Cellular FLICE-like Inhibitory protein prevents TNFR1-mediated apoptosis Y.Y. Kim, D.J. Kim, S.J. Park, K.S. Oh, K.C. Kimm and C. Park 273 Methods for searching and evaluating risk factors to express genes related to diseases H.M. Kim, S.J. Park, Y.J. Park, H.S. Min, H.K. Kwak, Y.C. Park, K.H. Kim, K.S. Oh, Y.J. Ahn, K.C. Kimm and C. Park 288 Osteoporosis Prevalence of Radius and Tibia and Related Factors Using Multiple Bone Sites Quantitative Ultrasound Measurement of the Korean Health and Genome Study Cohort Women S.J. Park, Y.J. Ahn, H.S. Min, K.S. Oh, C. Park, N.H. Cho 1 and K.C. Kimm 291 Functional studies for identifying genetic risk factors associated with complex trait diseases Y.J. Kim, J.W. Choi, S.K. Park, M.Y. Hwang and B.S. Oh 293 Identification of a novel HLA-DOB-allele, DOB*010103, by sequence-based typing in the Korean polulation H.O. Gu, J.K. Lee and B.S. Oh 295 Genetic Polymorphisms in the Transforming Growth Factor Beta-Induced Gene Associated With BMI K.S. Park, H.D. Shin 1, B.L. Park 1, H.S. Cheong 1, Y.M. Cho, H.K. Lee, J.Y. Lee 2, J.K. Lee 2, H.T. Kim 2, B.G. Han 2, J.W. Kim 2, I.S. Koh 2, Y.J. Kim 2, K.C. Kimm 2 and B.S. Oh ix

10 천식 후보 유전자에서 유전 변이의 발굴 및 특성 규명 김재정, 김현희, 박주현, 유하정, 김주영, 문송민, 구해옥, 김흥태, 이종영, 한복기, 박찬, 김규찬, 박춘식 1, 이종극, 오범석 298 한국인 집단에서 제 이형 당뇨에 대한 연관 분석 박미현, 김광중, 김경선, 이혜자, 오범석, 김규찬, 조영민, 이홍규, 박경수, 이종영 300 DNA 형광염색법을 이용한 mycoplasma 검출 염색기법에 관한 연구(바이오자원은행의 효율적 관리 및 활 용에 관한 연구) 남혜영, 심성미, 전재필, 김준우, 한복기 302 EBV에 의해 변형된 림포블라스토이드 세포주의 어레이 CGH 프로파일의 특징 남혜영, 심성미, 전재필, 김준우, 한복기 304 외부과제 국내 유행 A군 로타바이러스의 병원성인자 분석 천두성, 김경창, 안정배, 이강범, 지영미 313 탄저독소(LF) 중화 단일클론항체의 탄저균 방어 효능 평가 연구 유천권, 전정훈, 이시정, 문정선, 이기은, 성원근 315 유전자변형생물체 국가안전관리체계 구축을 위한 인체위해성 심사 평가기술 연구 손태종, 유천권, 성원근 317 항생제내성 FoodNet 구축사업 조성학, 신현호, 박미선, 이복권 319 지역사회 내 항생제 내성 감시사업 정영희, 이영선, 김광욱, 안주선, 이경민, 유재일, 김봉수 321 열대열말라리아 LSA-3의 조기 진단 항원으로서의 유용성 이형우, 문승욱, 류혜선, 이영희, 조신형, 주정원, 전형일, 김정연, 김동수 325 위생동물의 층간 차음 system 에 대한 위생동물의 서식환경 평가 장규식, 박재선, 이혜은, 문승국, 신이현, 박근용, 이원자 327 전염병관리사업 평가 및 기술지원 박기동, 이덕형, 인혜경, 최준길 330 x

안정배, 이강범, 지영미 313 탄저독소(LF) 중화 단일클론항체의 탄저균 방어 효능 평가 연구 유천권, 전정훈, 이시정, 문정선, 이기은, 성원근 315 유전자변형생물체 국가안전관리체계 구축을 위한 인체위해성 심사 평가기술 연구 손태종, 유천권, 성원근 317 항생제내성 FoodNet 구축사업 조성학, 신현호, 박미선, 이복권 319 지역사회 내 항생제

11 Large-scale identification and characterization of genetic variants in asthma candidate genes J.J. Kim, H.H. Kim, J.H. Park, H.J. Ryu, J.Y. Kim, S.M. Moon, H.O. Gu, H.T. Kim, J.Y. Lee, B.G. Han, C.Park, K.C. Kimm, C.S. Park 1, J.K. Lee and B.S. Oh 299 Genome-Wide Linkage Analyses of Type 2 Diabetes in Korean population M.H. Park, K.J. Kim, K.S. Kim, H.J. Lee, B.S. Oh, K.C. Kimm, Y.M. Cho, H.K. Lee, K.S. Park and J.Y. Lee 301 The studies of mycoplasm detection method by DNA fluorescent staining : Studies on the efficient management and application of bio-resource bank H.Y. Nam, S.M. Shim, J.P. Jeon, J.W. Kim and B.G. Han 303 An array CGH profile characteristic of EBV-transformed lymphoblastoid cell lines H.Y. Nam, S.M. Shim, J.P. Jeon J.W. Kim and B.G. Han 312 Extramural Research Project Genetic analysis of the NSP4 gene of group A rotavirus strains in Korea D.S. Cheon, K.C. Kim, J.B. Ahn, K.B. Lee and Y.M. Jee 314 Assessment of protection efficacy of anti-lf antibody against anthrax C.K. Yoo, J.H. Chun, S.J. Lee, J.S. Moon, G.E. Rhie and W.K. Sung 316 Study on Human Health Risk Assessment of Living Modified Organism for National Bio-Safety Framework T.J. Son, C.K. Yoo, and W.K. Seong 318 Establishment of National FoodNet for Antimicrobial Resistance S.H. Cho, H.H. Shin, M.S. Park and B.K. Lee 320 The surveillance of antimicrobial resistant pathogens in community Y.H. Jung, Y.S. Lee, K.W. Kim, J.S. Ahn, K.M. Lee, J.I. Yoo and B.S. Kim 323 Usefulness of the recombinant liver stage antigen-3 for an early serodiagnosis of Plasmodium falciparum infection H.W. Lee, S.W. Moon, H.S. Ryu, Y.H. Lee, S.H, Cho, J.W. Ju, H.I. Jun, J.Y. Kim and T.S. Kim 326 The evaluation on the possibility of habitation of medical insect and mouse in intercepting-sound system between floors K.S. Chang, J.S. Park, H.E. Lee, S.K. Moon, E.H. Shin, K.Y. Park and W.J. Lee 328 Evaluation and Technical Assistance of Communicable Disease Control Program K.D. Park, D.H. Lee, H.K. In and J.K. Choi 331 xi

S. Park and J.Y. Lee 301 The studies of mycoplasm detection method by DNA fluorescent staining : Studies on the efficient management and application of bio-resource bank H.Y. Nam, S.M. Shim, J.P. Jeon, J.

12 Berberine의 항동맥경화효과 및 그 기전에 대한 연구 이세형, 임현정 1, 이귀숙 1, 박진희 1, 장양수, 박현영 국내 분리 탄저균주의 Amplified fragment length polymorphism analysis와 Multi-locus variablenumber tandem repeat analysis에 의한 유전적 다양성 분석 류춘선, 이경희, 황한준 1, 유천권, 성원근, 오희복 336 Vibrio vulnificus 의 PFGE 표준화와 분자역학적 특성연구 김석호, 정혜숙, 김준영, 이복권 340 알츠하이머 치매관련 Beta secretase 유전자의 polymorphism과 발병 시기의 연관성 분석 김화수, 안경숙, 김은경, 조인호, 김도관 1, 안상미 342 Berberine의 항동맥경화효과 및 그 기전에 대한 연구 이세형, 임현정 1, 이귀숙 1, 박진희 1, 장양수, 박현영 Ⅱ. 현황 및 연구과제 347 xii

336 Vibrio vulnificus 의 PFGE 표준화와 분자역학적 특성연구 김석호, 정혜숙, 김준영, 이복권 340 알츠하이머 치매관련 Beta secretase 유전자의 polymorphism과 발병 시기의

13 Berberine inhibits rat vascular smooth muscle cell proliferation and migration in vitro and improves neointima formation after balloon injury in vivo: Berberine improves neointima formation in a rat model S.H. Lee, H.J. Lim 1, K.S. Lee 1, J.H. Park 1, Y.S. Jang and H.Y. Park Molecular characterization of Korean Bacillus anthracis isolates by using amplified fragment length polymorphism analysis and multi-locus variable-number tandem repeat analysis C.S. Ryu, K.H. Lee, H.J. Hawng 1, C.K. Yoo, W.K. Seong and H.B. Oh 338 PFGE Standardization and molecular epidemiological study of Vibrio vulnificus S.H. Kim, H.S. Jeong, J.Y. Kim and B.K. Lee 341 BACE1 polymorphism C786G is associated with early onset Alzheimer s disease H.S. Kim, K.S. Ahn, E.K. Kim, I.H. Jo, D.K. Kim 1 and S.A. Jo 343 Berberine inhibits rat vascular smooth muscle cell proliferation and migration in vitro and improves neointima formation after balloon injury in vivo: Berberine improves neointima formation in a rat model S.H. Lee, H.J. Lim 1, K.S. Lee 1, J.H. Park 1, Y.S. Jang and H.Y. Park Ⅱ. Present status and Activities 347 xiii

14 Ⅰ. 연구보고 3 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 3-4, 2005 쯔쯔가무시증 다발생 지역에서의 기후 변화 잠재 영향 질병관리본부 전염병대응센터 전염병감시팀, 국립보건연구원 연구지원팀 1 박재경, 박옥, 김미영, 김귀향, 김선미, 고정애, 신영학 1, 박만석 목 적:최근의 우리나라 쯔쯔가무시증 발생은 지속적인 감소추세에 있음에도 불구하고 2004년에 전년 대비 3배 정도의 급격한 증가추세를 보였다. 이것은 매우 특징적인 현상으로, 실재 질병 매개체 와 관련된 기후 변화가 발생 증가에 영향을 미쳤는지를 조사하여 그 원인을 규명함으로서 환자 감소 와 확산에 대한 대비책을 제시할 수 있다. 방 법:2001년 이후 법정전염병 감시체계를 통해 신고된 쯔쯔가무시증 다발생 6개 시 도를 대상으 로 발생율과 기후변화와의 상관성을 분석하였다. 해당 기간의 기후는 기상청 자료를 이용하였으며, Elisabet, Susan 등이 사용했던 기상요인과 질병발생간의 상관관계를 회구분석 등 통계적 방법으로 직접 분석하는 방식을 적용하였다. 결 과:최저기온관련 변수 중에는 당해년도 여름최저기온, 전년도 가을 최저기 온, 2년 전 겨울최 저기온의 관련성이 높게 나타났으며 상대습도 관련 변수 중에는 전년도 겨울, 여름, 가을의 상대습도 가 쯔쯔가무시증의 발생과 같은 변화 양상을 나타내었다. 최소한의 습도가 유지되는 상태에서 해당 년도 여름의 기온이 높아지면 진드기 부화(hatching) 및 life-cycle 과정이 빨라짐에 의해 전염가능 매개체(진드기 유충; unfed larvae)의 수가 증가하여 쯔쯔가무시증 발생이 많아지는 것으로 추론된 다. 따라서 매년 진드기유충지수(chigger-index)를 측정하여 비교해보면 이에 대한 확인이 가능할 것 으로 고찰되었다. 결 론:쯔쯔가무시증 발생율 변화는 다른 진드기 매개 질병(e.g. Tick-borne encephalitis, Lyme disease)과 같이 기후 조건에 영향을 받는 것으로 확인되었으며, 보다 높은 기온 상태가 산란생존율 과 털진드기 개체 발생에 호조건임이 확인되었다. 중심단어 : 쯔쯔가무시증, 기후변화, 회귀분석, 털진드기 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

방 법:2001년 이후 법정전염병 감시체계를 통해 신고된 쯔쯔가무시증 다발생 6개 시 도를 대상으 로 발생율과 기후변화와의 상관성을 분석하였다. 해당 기간의 기후는 기상청 자료를 이용하였으며, Elisabet, Susan 등이 사용했던 기상요인과 질병발생간의 상관관계를 회구분석 등 통계적 방법으로 직접 분석하는 방식을 적용하였다.

15 4 국립보건연구원보 Potential impacts of climate change on scrub typhus in high incidence area of Korea J.K Park, O. Park, M.Y. Kim, K.H. Kim, S.M. Kim, J.A. Ko, Y.H. Shin 1 and M.S. Park Infectious Disease Surveillance Division, KCDC, Division of Planning and Research, NIH 1, Seoul Korea Purpose:The incidence of tsutsugamushi disease in 2004 was unpredictably increased than ever. This study was conducted to find the causes of tsutsugamushi disease variation among weather variables to establish the effective prevention and control strategy. Methods:Since year 2001, all cases of tsutsugamushi disease have been reported to Korea Center for Disease Control and Prevention by reporting system of statutory notifiable diseases. For southern six provinces where tsutsugamushi incidence is high, we assessed the linkages between tsutsugamushi disease incidence and weather variables obtained from Korea Meteorological Administration. The multiple regressions and Spearman correlation test were used as assessing tool for this study. Results:Variability in annual disease incidence was significantly(p<0.01) related to all season relative humidity(1 year previously) and the average daily minimum temperature of summer. Multiple regression model using these two variables could explain about 70 percent of the observed variability as adjusted R-square(p<0.0001). Though not statistically significant, the average daily minimum temperature of winter(1 year previously) had positive correlation with disease incidence. Conclusions:Our results provide evidence that tsutsugamushi disease incidence variation is affected by the climate condition like other tick-borne disease(e.g. Tick-borne encephalitis, Lyme disease). Wetter condition(1 year previously) and the higher temperature may have provided favorable condition for oviposition, survival and development of mites. Key words:tsutsugamushi disease, multiple regressions, variability, mites This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea. The Report of National Institute of Health 42, 3-4, 2005

16 Ⅰ. 연구보고 5 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 5-22, 2005 동성애자 대상 HIV/AIDS 혈청역학 및 성행태 감시체계 개발과 유행예측 모형 구축 질병관리본부 질병예방센터 예방접종관리팀, 국립보건연구원 면역병리센터 에이즈 종양바이러스팀 1, 질병관리본부 총무혁신팀 2, 질병관리본부 질병예방센터 에이즈 결핵관리팀 3 고운영, 기미경 1, 박효숙 2, 정연화 3, 김성주, 황지영 3 목 적:우리나라의 에이즈는 현재 빠른 증가를 보이기 시작하는 초기단계에 있으며, 일반 인구집단 에 광범위하게 퍼지기 전인 일부 동성애자 등의 고위험집단에 집중되어 있는 유행을 보이고 있는 것으 로 추정된다. 이에 본 연구에서는 우리나라 실정에 맞고 국제적 지표 산출이 가능한 동성애자 대상 혈청역학적 및 행태학적 모니터링체계를 개발하고 시범사업을 통하여 보완함으로서 모니터링체계를 구축하고자 하였다. 개발된 모니터링체계는 민간단체가 운영하는 동성애자 전용 에이즈 상담소 체계로써 익명성 을 보장할 수 있도록 익명검사 방법을 도입하였고, 소요시간 및 재방문의 단점을 극복하기 위해 신속 검사를 수행할 수 있는 진단키트를 사용함으로써 감시체계의 주요한 지표가 산출됨을 증명하였다. 방 법:2005년 9월 중순부터 14주간 총 303명을 대상으로 혈청역학적 지표를 산출한 결과 신속검 사 스크리닝 양성률은 월별로 3~5%로 나타났으며, 검사의 양성예측도는 100%로 나타났다. 행태학적 지표 중 하나인 성적 파트너 특성은 비지속적인 동성파트너 60%, 지속적인 동성파트너 24.6%로 나 타났으며, 마지막 성관계 시 콘돔사용 여부는 사용한 경우 51.6%, 사용안함 30.9%, 사용실패 1.7%, 불필요 11.7%, 기억이 안남 4.1%였다. 최근 3개월간의 콘돔사용 현황은 항상 사용 38.2%, 자주 사용 10.8%, 가끔 사용 22.6%, 전혀 사용안함 14.2%, 불필요 14.2%였으며, 콘돔 사용을 꺼리는 이유는 상 대방의 거부와 콘돔 없음이 전체의 50%가 넘는 이유로 분석되었다. 결 과:혈청역학적 지표와 행태학적 지표를 기반으로 에이즈 예방사업의 효과를 분석하기 위해 구 분구획미분방정식 모형을 사용하였다. 모형 구축 후 국내 적용 결과 HIV 전파에는 콘돔 사용에 의해 감염확률을 낮추게 되면 감염기간이 크게 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 성 파트너 수와 파트너와의 평균 접촉횟수가 고정 되더라도 같은 결과를 보였으며, 인구 10%가 감염되는 기간은 현 재 콘돔 사용률인 30%에서 60%로 증가하는 경우 감염기간이 약 2배 늘어나는 것으로 분석되었다. 결 론:본 연구에서 개발된 모니터링체계는 동성애자 대상 에이즈 예방사업을 기획하고 그 효과 평 가의 기본 자료로 활용될 수 있을 것이며, 국제적 지표 산출이 가능할 것으로 기대된다. 또한 제시된 모델링 기법을 이용하여 모니터링체계의 효율성과 타당성을 평가할 수 있을 것이다. 중심단어:HIV/AIDS, 혈청역학, 행태학, 모니터링 체계 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

이에 본 연구에서는 우리나라 실정에 맞고 국제적 지표 산출이 가능한 동성애자 대상 혈청역학적 및 행태학적 모니터링체계를 개발하고 시범사업을 통하여 보완함으로서 모니터링체계를 구축하고자 하였다.

17 6 국립보건연구원보 서 론 2005년 말 현재 세계보건기구(World Health Organization, WHO)와 UNAIDS(Joint United Nations Programme on HIV/AIDS, UNAIDS) 보 고에 따르면, 전 세계적으로 AIDS(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)로 인식된 환 자가 1981년에 처음 발생한 이후 2,500만 명 이 상이 사망하였고, 310만 명이 생존해 있으며 그 중 57만 명 이상이 어린이로 보고되고 있다. HIV(Human Immunodeficiency virus, HIV)의 경 우 2005년 현재 4,030만 명이 HIV에 감염된 것 으로 추정되었고, 2005년에만 500만 명 가까운 감염자가 발생한 것으로 나타났다(UNAIDS report, 2005). HIV 및 AIDS가 유행하기 시작한 1980년대 초부터 여러 나라와 국제기구에서는 HIV/AIDS에 관한 연구와 예방활동을 하였으나, 2001년 유엔이 특별총회를 개최하여 AIDS가 전 세계가 함께 해결해야 할 현안으로 재확인할 만큼 AIDS는 심각한 문제로 남아 있다. 세계적인 동향을 살펴보면 사하라 사막 이남 지역이 최대 유행지역으로 HIV에 감염된 환자 가 2,580만 명이며 2003년에 비해 약 100만 명 이상이 증가하였고, 그 중 77%가 여성이며 2005년 HIV에 관련한 질병으로 사망한 환자가 240만 명으로 추정되었다. 또한 급속하게 유행 이 퍼지고 있는 지역으로는 동유럽, 중앙아시아 및 동아시아가 있는데, 우리나라가 속해 있는 동아시아의 경우 2005년 현재 2003년과 비교하 여 87만 명이 증가한 것으로 나타났다. 유행지 역에서 2005년 새롭게 나타난 현상은 여성 환 자의 증가로 2003년에 비해 100만 명 이상인 1,750만 명으로 집계 되었고, 특히 사하라 사막 이남 지역, 남동 아시아, 동유럽 그리고 중앙아 시아에서 집중적으로 나타나고 있다(UNAIDS report, 2005). 우리나라의 AIDS 감염률은 2001년 말을 기준 으로 성인 인구 1만 명 당 2.03명으로 일본, 필 리핀 지역과 함께 HIV 감염률이 매우 낮은 단 계 로 분류되고 있다(WHO, 2004). 그러나 우리 나라는 1985년에 첫 HIV 감염자가 보고된 이후 1999년까지는 완만하게 증가되어 1999년 누적 감염자수는 1,000여명 수준이었으나, 2000년 이 후 신규감염자 증가율이 35%로서 최근에 급속 히 증가하는 경향을 보이고 있으며, 2004년 한 해 동안 614명의 감염자가 새로이 보고되었다. 이는 하루 평균 1.7명꼴로 꾸준히 발생하고 있 는 것으로서 2003년 대비 15% 증가했다. 우리나라의 에이즈는 현재 급격한 증가를 보이기 시작하는 초기단계에 있으며 일반 인구 집단에 광범위하게 퍼지기(generalized epidemic) 전인 일부 고위험집단에 집중되어 있는 유행 (concentrated epidemic)을 보이고 있는 것으로 추정된다. 감염경로에 대한 역학자료는 보건소 담당자가 신규 감염인을 면담 조사하여 파악하 고 있는데, 감염경로가 확인된 감염인들 중 동 성간 성접촉에 의하여 감염된 것으로 보고된 비율은 약 30% 정도이다. 또한 최근 UNAIDS/WHO에서 제시한 방법을 이용하여 우리나라의 2002년 HIV/AIDS 감염 자를 추정한 연구에 의하면 2002년 우리나라 성인 HIV/AIDS 감염자는 6,052명으로 추정되 었고, 고위험집단 중 남성 동성애군이 추정 감 염자가 4,133명(68,3%)으로 가장 많은 부분을 차지하였다(WHO, 2005). 동성애자들에 대한 조사결과 30%가 에이즈 검사를 목적으로 헌혈한 적이 있으며, 50%가 최근 3년 이내에 에이즈 검사를 한 적이 없다 고 밝혔다. 동성애자 전용 에이즈 검진소가 생 긴다면 이용하겠다는 의사를 밝힌 경우가 87% 에 이르는 등 에이즈 검진에 대한 수요가 높은 것을 알 수 있다(한국에이즈퇴치연맹, 2003). 본 연구는 우리나라에서 활용 가능한 동성애 자 대상 모니터링체계를 개발하고 시범실시와 평가를 통하여 모니터링체계를 구축하고자 하 며, 예방효과평가 모형을 구축하여 향후 동성애 자 대상 에이즈 예방사업 전력수립 및 평가에 필요한 기반을 마련하고자 한다.

HIV(Human Immunodeficiency virus, HIV)의 경 우 2005년 현재 4,030만 명이 HIV에 감염된 것 으로 추정되었고, 2005년에만 500만 명 가까운 감염자가 발생한 것으로 나타났다(UNAIDS report, 2005).

18 Ⅰ. 연구보고 7 재료 및 방법 1) 국내 남성 동성애자 감시체계 분석 외국의 남성 동성애자 대상 모니터링체계는 행태모니터링을 위한 설문조사 실시여부 및 HIV 혈청검사 실시여부에 따라 혈청역학적 및 행태학적 모니터링체계를 동시에 운영하는 것 과 개별적으로 실시하는 것으로 구분된다 (Nardone A et al, 1999, Suligoi B et al, 1999, Dukers NH et al, 2002, Nardone A et al, 1997, Dodds JP et al, 2000, Amirkhanian YA et al, 2001, Chen SY et al, 2003, del Romero J et al, 2001). 행태 및 혈청역학적 모니터링체계에 사 용되는 국제적 지표는 다음과 같으며, 이를 국 내에 적용하여 평가하였다. 1 행동지표 -전체 성파트너를 가진 동성애자중 지난 6 개월에 항문성관계를 한 동성애자의 비율 -지난 6개월 동안 항문성관계를 가진 사람 들 중 마지막 사람과 관계 시 콘돔을 사 용한 사람의 비율 2 검사 지표 - 동성애자로 정체성을 안 후 자발적 에이 즈 검사를 받았던 사람의 비율 -지난 12개월 사이 자발적 에이즈 검사를 받았던 사람의 비율 3 지식 지표 - 에이즈 예방법으로 항문 성관계를 하지 않 거나 항문 성관계 시 콘돔을 사용하는 것을 정확하면서 바로 알고 있는 사람의 비율 국외의 경우와는 달리 국내에서는 감염률을 파악할 수 있는 모니터링체계가 마련되어 있지 않기 때문에 2005년 국민건강증진기금에 의해 지원된 동성애자 에이즈 검사 및 상담소 구축 사업과 연계하였고, 혈청역학적 및 행태학적 모 니터링체계 운영결과는 동성애자 상담소 결과 를 활용하였다. 또한 수행된 연구결과를 토대로 국내에 적합한 동성애자 모니터링체계 방안을 제시하였다. 2) 연구대상 본 연구에서의 HIV/AIDS 유병률과 동성애자 분포 및 특성을 위한 분석은 질병관리본부, 한 국에이즈 퇴치연맹과 한국남성동성애자 인권운 동 단체에서 수행한 연구(한국에이즈 퇴치연맹 2002, 2003, 한국남성동성애자 인권운동 단체, 2001)와 2005년 국민건강증진기금에 의해 지원 된 동성애자 에이즈 검사 및 상담소 구축사업 자료를 활용하였다. 3) HIV/AIDS 확진 방법 우리나라에서는 보건소나 병원(1차 검사기관, 검사방법: EIA법, PA법)에서 HIV 항체검사결과 양성이 나오더라도 모두 HIV 감염인을 의미하 는 것은 아니다. 위양성의 경우가 발생할 수 있 기 때문에 HIV 양성자 확진은 질병관리본부 국 립보건연구원 면역결핍연구실에서 실행한 웨스 턴블롯 검사에서 양성일 경우에만 최종 HIV 확 진으로 본다. 본 연구에서 제시된 확진 사례도 위와 같은 방법을 사용하였다. 4) 감시체계 자료를 이용한 감염예측모형 구축 HIV 감염에 관한 기본적인 모형은 SI : Susceptible(감수성기) Infectious(전염기) 모형 을 따른다. 모든 사람은 태어나면 HIV에 감염 되지 않았으나 감염될 수 있는 감수성기에 있 으며, 감염이 되면 평생 감염력이 있는 전염기 로 이행된다. 전염기에서 AIDS로 이행된 후 사 망에 이르게 되며, AIDS 단계에서도 여전히 전 염력은 유지된다. HIV 전파에 관한 실제적인 모형은 보다 복잡 한 모형이 된다. 고위험군과 일반인구가 각각의 구획으로 나뉘며, 각 집단별로 감수성기와 전염 기로 구분되게 된다. 감염취약계층은 남성 동성 애자 및 양성애자, 마약사용자, 성매매여성이 될 수 있다.

행태 및 혈청역학적 모니터링체계에 사 용되는 국제적 지표는 다음과 같으며, 이를 국 내에 적용하여 평가하였다.

19 8 국립보건연구원보 Sexual Debut Force of Infection Progression S I AIDS Death Death Death 그림 1. HIV 전파 단순모형 그 외 성적으로 활발한 여성 및 남성으로부 터 단일배우자 여성 및 남성, 산모를 통한 태아 등 일반인으로 전파되는 과정은 매우 복잡하며, 집단 간 접촉행태에 따라 전파속도가 결정된다. 각각의 집단들은 감염에 감수성인 기간(S)과 감염된 기간(I)으로 나눌 수 있다. 전체적으로 감수성자가 감염이 되는 속도는 각 집단별 접촉의 빈도 및 형태, 각 행태별 바 이러스의 전파력, 각 집단별 감염률 등 복잡한 요소에 의해 결정된다. 그러므로 계량적 모형의 경우 특정 변수의 조정에 매우 민감하게 반응 하는 단점이 있으며, 이러한 이유로 이 모형은 실제 감염수준을 반영하는데 사용되기 보다는 각 사업의 효과를 평가하는데 오히려 활용가치 가 있다고 한다(Herbert W.H, 1992). 즉, 이 전 파 모형에서는 몇 가지 질적인 측면에 대한 정 보를 얻을 수 있다. ⑴ 감염 곡선, g(t) 의 가능한 패턴에 대한 정보 ⑵ 어떠한 상황에서 유행이 증가하는가에 대한 정보 ⑶ 집단의 이질성 및 동일 집단 간 접촉 행태의 감염 곡선에 미치는 영향 ⑷ 특정 예방정책의 효과평가 ⑸ 감염의 위험요인에 대한 이해 HIV 감염유행에 대한 구분구획미분방정식 모 형은 유행에 미치는 주요 지표에 대한 이해를 도울 수 있다. 본 연구에서는 HIV 감염유행 모 형 중 단순 TWO-COMPARTMENTAL MODEL 을 이용하였다. 단순 TWO-COMPARTMENTAL MODEL은 인 구집단 N0 를 가정할 때, β: 감염된 파트너와 접촉하여 전염될 확률 (chance of transmission per infected partner contacted) μ: 단위 시간당 파트너를 만나는 속도 y(t) 를 시간 t에서 감염된 분율이라고 한다면 시간간격 (t,t+dt) 사이에 감수성 있는 개인이 감염인과 파트너쉽을 맺게 되는 속도는 μ y(t)dt 이다. 이에 따른 감염확률은 βμy(t)dt 이다. 따라서 감염인이 사망하는 율을 α 라고 하는 경우 사망률은 α y(t)n(t) 가 된다. 감염율의 변화속도는 다음과 같다. dn(t)y(t) dt =βμy(t)n(t)1-y(t)-αn(t)y(t) 그 인구집단의 사망이 HIV 감염에 의한 사망 뿐이라면, dn(t) dt =-αn(t)y(t) 이다. 왼쪽의 공식은 다음과 같이 되므로, N(t) dy dt +y(t) 2 -αn(t) 이를 재배열하고 N(t)로 나누면, dy dt =( βμ-α)y(1-y) 이를 y(t) 에 대해서 정리하면, y(t)=y 0 e k *t 1+y 0 (e k *t -1) -1 [모형 1] 이를 통하여 단위 시간당 새로이 감염되는 사람에 대한 감염곡선은 g( t) =μβy(t)n( t)1-y(t) 이 된다. 사망률 공식을 대입하면, N(t)=N 0 y 0 (e k *t -1)+1 -α/k * 위의 공식들을 풀면 감염곡선은 다음과 같다.

전체적으로 감수성자가 감염이 되는 속도는 각 집단별 접촉의 빈도 및 형태, 각 행태별 바 이러스의 전파력, 각 집단별 감염률 등 복잡한 요소에 의해 결정된다.

20 Ⅰ. 연구보고 9 g(t)= N 0y 0 (1-y 0 )μβe k 1+y 0 (e k *t -1) α/k * +2 감염초기에는 y(t) y 0 e k * t, N(t) N 0 e -αy 0t N 0, * t Number of cases Newly found HIV/AIDS cases Cummulative HIV/AIDS cases g(t) N 0 μβy 0 e k * t, 이 된다. 그러므로 감염초기에는 지수적으로 증가한다. 두배가 되는 doubling time은 Year 그림 2. 연도별 신고된 HIV/AIDS 감염현황(1985~2004) 0 t d =loge(2)/k * 기초감염재생산비, Basic reproductive ratio, R0 R 0 =μβd 이다. 본 연구에서는 단순 TWO-COMPARTMENTAL MODEL을 이용하여 국내 자료로 산출된 혈청역 학적 및 행태학적 자료에 기반한 예방사업의 효과측정을 위한 모형을 구축하였고, 이를 통하 여 예방사업 중 하나인 콘돔사용율의 변화에 따라 인구 10%, 20%와 50%가 감염되는데 걸리 는 소요기간을 산출하여 예방사업 전략수립의 근거를 제시하였으며 모형을 이용한 시뮬레이 션은 R(version 2.2.0)을 사용하였다. 결 과 1) 국내 동성애자 유병률 및 특성 1985년 첫 감염이 발생한 후 2004년까지 새 롭게 감염되는 감염인은 지수적으로 증가하고 있다(그림 2). 2004년 12월말 현재 내국인 누적 감염인수는 3,153명이며, 이중 631명이 사망하 여 2,522명이 생존해 있으며, 성별로는 남성이 2,835명(89.9%), 여성이 318명(10.1%)으로 남성 이 여성보다 9배 높게 보고되었다(표 1). 표 1. 내국인 HIV/AIDS 연도별 보고현황 ( 월말) (단위:명) 구분 계 계 3, 남자 2, 여자 보고년도 기준임 2004년 내국인 감염인 자료에서 연령의 분포 를 살펴보면 30~39세가 204명(33.2%)로 가장 높았다(표 2), 또한 감염경로가 밝혀진 2,675명 중 성접촉에 의한 감염이 2,624명(98.1%)로 보 고되었고, 성접촉에 의한 감염 중 이성간 성접 촉이 1,646명(61.5%)이며 동성간 성접촉이 978 명으로 나타났다(표 3). 2004년 감염경로별 분 포에서는 동성간 성접촉이 245명(47.6%)이었다 (표 4).

연도별 신고된 HIV/AIDS 감염현황(1985~2004) 0 t d =loge(2)/k * 기초감염재생산비, Basic reproductive ratio, R0 R 0 =μβd 이다.

21 10 국립보건연구원보 표 년 내국인 신규 HIV/AIDS 감염인 성별 연령별 분포 연령 계 남자 여자 감염인수(명) 백분율(%) 감염인수(명) 백분율(%) 감염인수(명) 백분율(%) 계 발견당시 연령임 표 3. 에이즈 감염자(HIV/AIDS) 감염경로별 분포(1985~2004) 계 남자 여자 감염인수(명) 백분율(%) 감염인수(명) 백분율(%) 감염인수(명) 백분율(%) 계 2, , 이성간 성접촉 1, , 동성간 성접촉 수혈/혈액제제 혈액제제 국내수혈 국외수혈 수직감염 마약사용자 감염경로가 밝혀진 2,675명에 대한 통계임 국내수혈 : 헌혈액 모두 HIV스크리닝 검사에서 음성으로 나온 경우임 표 년 내국인 신규 HIV/AIDS 감염인 감염경로별 분포 연령 감염인수 (명) 계 남자 여자 백분율 (%) 감염인수 (명) 백분율 (%) 감염인수 (명) 백분율 (%) 계 이성간성접촉 동성간성접촉 국내에는 동성애자를 대상으로 감염률을 파 악할 수 있는 모니터링체계가 없어 국내 HIV 감염수준을 추계하는데 커다란 제약이 되고 있 다. 남성 동성애자의 감염률에 관한 체계적인 연구는 없으나, 국립보건원에서 수행한 1985 년~1992년 동성애자 검사결과에 의하면 617

22 Ⅰ. 연구보고 11 명의 검사자 중 34명의 양성자가 발견되어 5.5%의 양성률을 보였다. 한편 한국에이즈 퇴 치연맹이 1995년에 동성애자 287명을 대상으 로 한 설문조사에 의하면 66.9%가 에이즈 검 사경험이 있었으며, 에이즈 검사를 받았다고 응 답한 187명 중 6명이 에이즈 양성이라고 응답 하여 3.2%의 양성률을 보였다. 무응답률은 2.6%였다. 양성인 경우 음성으로 응답하거나 무응답의 가능성이 있어 실제 양성률은 더 높 을 것으로 추정되어, 국립보건원의 자료에 근거 한 5.5%의 양성률이 지나치게 과대추정한 값 은 아니라고 판단된다(한국에이즈 퇴치연맹, 2003). 1995년도에 한국에이즈 퇴치연맹은 전국 58 개 게이바를 대상으로 동성애자들의 성행태에 관하여 조사하였다. 287명의 응답자 중 동성애 자는 69.7%이고 양성애자는 28.9%이었다. 동성 애자의 경우 최근 1년 동안 성관계자수는 1~5 명이 54.7%, 6명~20명은 17.7%, 21~50명은 5.6%, 50명 이상은 1.7%이었다. 지난 1년간 79.8%가 동성과의 성관계가 있었으며, 25.8%가 이성과 성관계가 있었다. 지난 6개월 동안의 동 성애 파트너에 대한 설문결과 응답자의 63.1% 가 고정된 파트너가 있었으며, 이중 65.7%가 1 명의 고정된 파트너가 있었다. 성행태에 대한 조사결과 항문 성교율은 65.5%였으며 이중 수 동적 역할은 7.7%, 능동적 역할은 23.3%, 둘다 인 경우는 32.8%였다. 항문 성교 시 콘돔을 항 상 사용하는 사람은 13.7%이며, 항상 사용하지 는 않는 경우 41.2%, 전혀 사용하지 않는 사람 이 45.1%로서 콘돔 사용률이 낮았다(한국에이 즈 퇴치연맹, 2003). 남성동성애자 단체에서 수행한 2001년도 한 국동성애자들의 의식구조 및 에이즈에 관한 인 식도 조사결과 응답자 338명 중 남성동성애자 는 83.7%, 양성애자는 11.0%이었다. 최근 1년 동안 성관계자수는 약 1~5명 70%, 6명 이상은 23.3%이었다. 7.8%는 지난 1년간 성관계를 하지 않았다. 선호하는 성 형태는 애무 35.6%, 구강 성교 32.2%, 항문성교 19.5%, 자위행위 4.6%였 다. 파트너를 만나는 장소와 방법은 인터넷의 채팅이나 메일을 통해서 만나는 경우가 29.4%, 특정지역의 업소에서 만나는 경우가 28.4%이었 다. 사우나나 찜질방에서 만나는 경우는 6.1%이 며 공원이나 터미널에서 만나는 경우는 0.3%이 었다. 여성과의 성경험은 55.3%가 있었다. 항문 성교 시 콘돔을 항상 사용하는 경우는 26.4%이 며, 항상 사용하지는 않는 경우 56.0%, 전혀 사 용하지 않는 경우는 17.6%이었다. 콘돔을 사용 하지 않는 이유는 귀찮아서가 18.0%, 성감이 떨 어져서가 32.3%, 필요성을 못 느껴서가 27.3%이 었다. HIV 검사 여부는 정기적으로 검사하는 경우는 10.2%, 가끔 검사하는 경우 33.7%, 검사 를 전혀 하지 않은 경우는 52.1%이었다. 에이즈 에 대한 정보는 응답자의 52.2%가 방송 등 대 중 매체를 통해서 얻으며, 인터넷을 통하여 18.9%가 정보를 얻고 있었다. 그리고 에이즈 예 방교육 참여의사는 50.2%가 있다고 응답하였다 (한국남성동성애자 인권운동 단체, 2001). 최근 2002년에 한국 남성 1,613명을 설문 조 사한 한국남성의 성의식 조사 결과 에 따르 면 자신을 양성애자(0.3%) 또는 동성애자(0.2%) 로 밝힌 비율이 0.5%였고, 같은 남성과의 성행 위를 해본 적이 있는 비율이 1.1%인 것으로 조 사된 바 있다(이윤수, 2003). 또한 2003년 1,955 명의 설문조사 결과에서는 지난 5년간 동성애 경험이 있느냐는 질문에 1.0%가 있다고 대답하 였고, 에이즈 검사를 받아보신 적이 있습니 까? 라는 질문에 받은 적이 있다고 응답한 경 우가 11.5%였다(한국에이즈퇴치연맹, 2003). 그리고 2003년 설문 조사에서는 항문성교 경험이 있다고 응답한 경우가 66.1%, 항문성교 않음으로 답한 경우가 33.9%였으며, 최근 3년간 에이즈검사 경험이 한번도 없는 경우가 51.4% 로 나타났다. 두 연구결과는 남성동성애자의 성 선호도가 다양하며, HIV 검사율이 저조하다는 것을 보여주고 있다(한국에이즈퇴치연맹, 2003).

23 12 국립보건연구원보 2) 국내 동성애자 대상 감시체계 방안 개발 최근 에이즈 상담 및 익명검사(voluntary counseling and testing, VCT) 는 에이즈 관리 사업의 핵심 영역으로 부각되고 있다. 2003년 미국 질병통제 센타(CDC)는 자발적인 HIV 검사 확대 를 새로 운 전략으로 제시하였다. 이는 일반인의 감염 예방 역량을 증진하고 감염인에게는 긍정적인 삶을 위한 지지 제공, 치료 기회 제공을 통하여 감염확산을 억제하고자 함이다(그림 3). 앞에서 기술한 바와 같이 혈청역학적 및 행 태학적 지표를 산출하여서, 동성애자의 예방역 량을 강화할 수 있는 형태는 민간단체가 운영 하는 동성애 전용 검사 및 상담소를 구축하는 것이다. 국민건강증진기금 지원 하에 민간단체 를 통하여 상담소를 구축하게 되었으며, 이를 통하여 혈청역학적 및 성행태 지표산출의 체계 를 마련하였다. 질병관리본부에서는 동성애자 상담소 운영 및 지표산출 체계의 원칙을 개발 하였다(질병관리본부, 에이즈 상담소 운영가이 드라인, 2005). 동성애자 자발적 장애요인인 스크리닝 검사 의 소요기간이 길고 재방문 해야 하는 단점을 극복하기 위하여 신속검사를 도입하였는데, 신 속 HIV 검사법(Rapid HIV Testing)은 소량의 혈 액(finger stick)으로도 가능하고, 실험실이 아닌 곳에서도 시행 가능하며, 고도로 훈련된 전문 인력이 아니라도 가능하며, 30분 이내에 시행 가능하고 검사 당일 결과를 받을 수 있다는 것 이 장점이다. 이는 내담자의 참여율을 증가시킬 수 있다(US VCT centers, 1999~2000). 본 사업에 서는 후천성면역결핍증 대책위원회 산하 에이즈 진단 및 정도관리 분과위원회 자문을 통하여 2002년 말 FDA의 승인을 얻은 OraQuick HIV 진단키트(Orasure tech, USA)를 사용하여 수행하 였고, VCT에서의 검사 및 프로토콜에 대해서는 그림 4에 제시하였다. 그림 3. 에이즈 상담 및 익명검사(VCT)의 역할과 의미적 위치

24 Ⅰ. 연구보고 13 pre-test counseling 고객의 검사 동의 고객이 HIV 검사 거부 검사 담당자에게 의뢰 스크리닝 검사 수행 결과 : 양성반응 결과 : 음성반응 검사자가 결과 기록= 음성(N) post-test counseling post-test counseling 검사자 의뢰 : 채혈 확진 검사 의뢰, 고객 기록 체크 그림 4. VCT에서의 상담 및 검사 프로토콜 3) 혈청역학 및 행태학적 모니터링 결과 2005년 9월 중순부터 14주간에 걸쳐 총 303 명을 검사하였다. 검사자의 약 70%가 검사를 처음 받은 것으로 밝혀져 익명검사 서비스 제 공으로 에이즈 검사율 제고 라는 상담소 설치 목적을 충분히 달성하였다고 판단된다. 이는 동 성애자 관련업소 집중지역에 위치함에 따른 지 리적 접근 제고, 익명검사 보장, 예약에 의한 검사, 신속한 검사 결과 확인, 동성애 단체들에 대한 사전 홍보 등에 기인한다(이훈재, 2006). 성별분포는 남성 299명, 여성 1명, 트렌스젠 더 1명이었다. 연령분포는 20대가 46.3%로 가장 많은 분포를 차지하였으며, 30대(37%), 20세 미 만(9%), 40세 이상(7.7%) 순이었다. 상담소 방 문 이유는 파트너의 감염사실을 알게 되었기 때문에가 31.9%로 가장 많았으며, 감염이 의심 되는 행위를 해서 24.2%, 주변에서 검사를 권유 해서 18.1%, 검사결과 재확인 등 순이었다. 기존에 HIV 검사경험이 있는 경우는 59.4%였 으며, 최종 검사 후 경과기간은 6~12개월이 27.1%로 가장 많았으며 12~23개월이 22.4%였다. 검사받은 기관은 보건소 53.8%, 병의원 31.9%였 다. 보건소와 병의원의 검사가 망설여지는 요인 은 검사결과 확인까지 장기 소요가 61.1%, 절차 가 복잡하다는 응답이 45.6%, 비밀이 보장되지 않아서 17.5%, 불친절 16.8%였다. 혈청역학적 지표로 사용된 신속검사 스크리 닝 양성률은 월별로 3~5%의 양성률을 보였으 며, 스크리닝 검사의 양성예측도는 100%였다. 그러나 본 연구가 사업초기단계이기 때문에 감 염 위험이 높은 군을 집중적으로 검사했을 가 능성이 높으므로, 이를 대표성 있는 값으로 추 정하기는 어렵다고 판단된다. 향후 상담소가 지 속적으로 운영되면 보다 대표성 있는 값이 산 출될 것으로 기대된다. 그리고 행태학적 지표로 성적 파트너 특성은 비지속적인 동성파트너 60%, 지속적인 동성파 트너 24.6%였다. 최근 3개월간의 콘돔사용 현황 은 항상 사용 38.2%, 자주 사용 10.8%, 가끔 사 용 22.6%, 전혀 사용안함 14.2%, 불필요 14.2% 였다. 마지막 성관계 시 콘돔사용 여부는 사용 한 경우 51.6%, 사용안함 30.9%, 사용실패 1.7%, 불필요 11.7%, 기억이 안남 4.1%였다. 콘돔을 사용하지 않는 경우가 있는 사람들이 콘돔 사용을 꺼리는 이유는 상대방이 거부해서

25 14 국립보건연구원보 37.9%, 콘돔이 없어서 21.2%, 성감이 감소 19.2%, 술취한 상태여서 12.1%, 상대방에 대한 믿음 10.6%, 신뢰관계가 깨질까봐 9.9%, 통증 때문 4.5% 순이었다. 4) 단순 TWO-COMPARTMENTAL MODEL의 국내 적용 연구방법에 제시된 단순 TWO-COMPARTMENTAL MODEL은 일년에 만나는 평균 파트너 수, 감염 된 성파트너와 접촉 시 감염확률, 사망률과 초 기 감염률을 이용한 수학적 모형으로 각각의 모수가 모형에 미치는 영향을 쉽게 살펴볼 수 있는 장점이 있다. 한 예로, 일년에 평균 15명 의 파트너를 만나고( μ ), 감염된 성파트너와 접 촉 시 감염확률( β )은 0.1이며, 사망률( α )은 1 년에 0.1이라고 가정하고 초기의 감염률( y0 )을 1%라고 할 때, 인구의 50%가 감염되는 데 소 요되는 기간은 약 3년이다. 이때 콘돔 등의 사 용으로 감염확률( β )이 0.05로 감소하게 되면, 인구의 50% 감염되는데 약 7년이 소요된다. 일년에 평균 파트너 수가 15명에서 3명으로 감 소하게 되면, 감염증가 곡선은 급격히 저하되게 된다. 성행태 지표의 변화에 따른 감염수준 곡 선의 변화는 큰 반면 초기 감염률이 3%인 경 우 인구의 50%가 감염되는데 걸리는 기간은 약 2.5년이 소요된다. 이는 HIV의 전파에는 성 파트너 수, 콘돔 사용 등에 따른 1회당 감염확 률이 초기 감염률에 비해 영향을 더 크게 미치 는 것을 알 수 있다(그림 5). 그림 5를 통하여 알 수 있듯이 seroprevalence curve는 감염된 파트너와 1회 접촉하여 전염될 확률( β )과 년 성파트너 수(μ)에 민감하기 때 문에 두 모수에 따라 어떻게 변화하는지 살펴 보았다. 이 때 사망률( α )과 초기 감염율( y0 )은 각각 1%와 3%로 고정하였다. 단순 TWO-COMPARTMENTAL MODEL을 국내에 적용하기 위해서는 감염된 파트너와 1 회 접촉하여 전염될 확률( β )의 추정이 필수적 이다. 감염확률( β )의 추정을 위해 동성애자가 1회당 HIV에 감염될 확률이 보통 1~5%로 알 려져 있기 때문에 본 연구에서는 중간값인 3% 를 이용하였고, 년 파트너당 접촉횟수를 4회와 10회로 가정하였다. 이때 접촉횟수에 따른 감 염확률은 이항분포(binomial distribution)를 이 용하여 계산하였고, 예방 효과를 분석하기 위해 예방의 방법 중 하나인 콘돔 사용률을 고려하 여 감염확률을 산출하였다(표 5). 1 y 0 = 0.03 Standard line 3 2 β = 0.05 µ = 3 * Standard line: α=0.1, β=0.1, μ=15, y 0 =0.01 * No. 1 line: α=0.1, β=0.1, μ=15, y 0 =0.03 * No. 2 line: α=0.1, β=0.05, μ=15, y 0 =0.01 * No. 3 line: α=0.1, β=0.1, μ=3, y 0 =0.01 그림 5. 4개의 epidemic models에 대한 seroprevalence curve([모형 1]에 의해 산출) 표 5. 년 파트너당 접촉 평균횟수와 콘돔 사용률에 따른 감염확률( β) 콘돔 사용률 0% 30% 60% 80% 년 파트너당 접촉 평균횟수 4회 년 파트너당 접촉 평균횟수 10회 년 파트너당 접촉 평균횟수가 4회일 때 콘돔 사용률을 고려하여 산출된 감염확률( β )을 바탕 으로 인구 50%가 감염되는데 걸리는 기간을 추 정한 결과는 표 6과 그림 6에 제시되어 있다.

26 Ⅰ. 연구보고 15 그림 6을 살펴보면 성파트너 수가 10명인 경우 감염율이 낮아짐에 따라 인구 50%가 HIV에 감 염되는 기간의 증가폭이 커짐을 알 수 있다. 특 히 콘돔 사용률이 30%(감염율 0.08)에서 60% (감염율 0.04)로 증가하는 경우와 80%(감염율 0.02)로증가하는 경우 감염기간의 폭이 급격하 게 증가함을 알 수 있다. 이러한 결과는 성파트 * No. 1 line: β=0.11 (콘돔 사용률: 0%), No. 2 line: No. 3 line: β=0.04 (콘돔 사용률: 60%), No. 4 line: 그림 6. 성파트너 수와 감염확률(평균 접촉횟수 4회)에 seroprevalence curve 15명일 때에도 유사하였는데, 콘돔 사용률이 30%일 때 감염기간이 3.16년인데 비해 사용률 표 6. 성파트너 수와 감염확률에 의해 인구 50%가 감염되는데 걸리는 기간(년) 콘돔 사용률에 따른 감염확률( β) 년 파트너당 접촉 평균횟수 4회 0% 30% 60% 80% 년 성파트너 수( μ) 10명 년 성파트너 수( μ) 15명 감염률은 표 5 참조 너 수가 이 60%와 80%로 증가하는 경우 각각 6.95년, 17.38년으로 인구 50%가 감염되는 기간이 늘어 (a) 성파트너 수 10명 (b) 성파트너 수 15명 남을 알 수 있다.

27 16 국립보건연구원보 년 파트너당 접촉 평균횟수가 10회인 경우 평 균횟수가 4회인 경우에 비해 콘돔 사용률에 따른 인구 50%가 감염되는 기간의 증가폭은 크지 않 지만, 콘돔 사용률이 증가할수록 감염기간이 보다 늘어나는 경향을 나타내고 있다(표 7, 그림 7). 따라서 성파트너 수와 감염률에 의해 산출되 는 인구 50% 감염기간에서 콘돔 사용률은 HIV 감염기간을 연장할 수 있는 효과적이면서 중요 한 예방 요인임을 위의 모형을 통해 알 수 있다. 표 7. 성파트너 수와 감염확률에 의해 인구 50%가 감염되는데 걸리는 기간(년) 년 파트너당 접촉 평균횟수 10회 콘돔 사용률에 따른 감염확률( β) 0% 30% 60% 80% 년 성파트너 수( μ) 10명 년 성파트너 수( μ) 15명 감염률은 표 5 참조 (a) 성파트너 수 10명 (b) 성파트너 수 15명 * No. 1 line: β=0.23 (콘돔 사용률: 0%), No. 2 line: β=0.16 (콘돔 사용률: 30%), No. 3 line: β=0.09 (콘돔 사용률: 60%), No. 4 line: β=0.05 (콘돔 사용률: 80%) 그림 7. 성파트너 수와 감염확률(평균 접촉횟수 10회)에 따른 epidemic models에 대한 seroprevalence curve

28 Ⅰ. 연구보고 17 인구 50%가 HIV에 감염되는 상황은 비현실 적이기 때문에 인구 20%, 10%가 감염되는 기간 을 표 8과 9에 제시하였다. 인구 20%가 감염되 는데 걸리는 기간이 5년 이상인 경우는 년 파 트너당 접촉 평균횟수가 4회일 때 성파트너 수 가 10명이며 감염확률이 0.04인 경우이고, 성파 트너 수가 15명이며 감염확률이 0.02인 경우이 다. 평균 접촉횟수가 10회인 경우에는 년 성파 트너 수가 10명이며 감염확률이 0.05일 때이고, 년 성파트너 수가 15명일 때는 감염확률이 0.09 이하일 때 감염기간의 증가폭이 커짐을 알 수 있다. 인구 10%가 HIV에 감염되는데 걸리는 기 간 또한 20%가 감염되는데 걸리는 기간과 패턴 이 유사하게 나타났으며, 이는 성파트너 수와 파 트너당 접촉 평균횟수가 고정이 되더라도 콘돔 사용률을 증가시킴으로써 감염율을 낮추는 방법 이 HIV 예방 정책으로 효과적임을 의미한다. 현재 동성애자의 콘돔 사용률은 감시체계에 의해 평가된 행태학적 지표에 따르면 약 30%로 추정할 수 있다. 그리고 전체 인구의 5%를 감 염 인구로 가정하였을 때 현재의 doubling time 인 인구 10%가 감염되는 기간에 대해 콘돔 사 용률 30%를 기준으로 비교한 결과는 표 10에 제시되어 있다. 파트너 당 접촉 평균횟수 4회이 며 년 성파트너 수가 10명일 때 콘돔 사용률이 30%인 경우를 1이라고 가정하면, 콘돔 사용률 이 60%로 증가할 때 기간은 2.33배 증가하며 80%로 증가할 때 약 7배 증가됨을 알 수 있다. 접촉 평균횟수 10회이며 년 성파트너 수가 10 명일 때 역시 콘돔 사용률 30%를 기준으로 60%와 80%가 될 때 각각 1.9배, 3.8배 감염기간 이 증가되는 것으로 나타났다. 따라서 국내 연 구 조사를 기반으로 현재의 콘돔 사용률을 기준 으로 현 감염 인구의 doubling time을 비교 분석한 표 8. 성파트너 수와 감염률에 의해 인구 20%가 감염되는데 걸리는 기간(년) 콘돔 사용률에 따른 감염확률( β) 0% 30% 60% 80% 년 파트너당 접촉 평균횟수 4회 년 성파트너 수( μ) 10명 년 성파트너 수( μ) 15명 년 파트너당 접촉 평균횟수 10회 년 성파트너 수( μ) 10명 년 성파트너 수( μ) 15명 감염률은 표 5 참조 표 9. 성파트너 수와 감염률에 의해 인구 10%가 감염되는데 걸리는 기간(년) 콘돔 사용률에 따른 감염확률( β) 0% 30% 60% 80% 년 파트너당 접촉 평균횟수 4회 년 성파트너 수( μ) 10명 년 성파트너 수( μ) 15명 년 파트너당 접촉 평균횟수 10회 년 성파트너 수( μ) 10명 년 성파트너 수( μ) 15명 감염률은 표 5 참조

29 18 국립보건연구원보 결과 콘돔 사용률이 60%에 도달하는 경우 HIV에 감염되는 기간이 약 2배 증가되는 것으 로 분석되었다. 표 10. 접촉 평균횟수, 성파트너 수와 콘돔 사용률에 의해 현재 seroprevalence doubling time(인구 10%)이 감염되는 기간 비교 콘돔 사용률에 따른 감염확률( β) 30% 1) 60% 2) 80% 3) 년 파트너당 접촉 평균횟수 4회 년 성파트너 수( μ) 10명 년 성파트너 수( μ) 15명 년 파트너당 접촉 평균횟수 10회 년 성파트너 수( μ) 10명 년 성파트너 수( μ) 15명 ) 현재 동성애자의 콘돔 사용률 2) 콘돔 사용률 30%를 기준으로 하였을 때 소요기간 비교 3) 콘돔 사용률 30%를 기준으로 하였을 때 소요기간 비교 감염률은 표 5 참조 고 찰 연구에서는 외국의 동성애자 대상 혈청역학 및 행태학적 모니터체계 자료를 검토하여 국내 동성애자 특성에 맞는 감시체계를 제안하였다. 동성애자들의 HIV 검사 장애요인으로는 익명성 유지가 어렵다는 점이며 검사 소요시간이 길고 재방문해야 한다는 점이다(이훈재, 2006). 이를 극복하고자 민간단체가 운영하는 동성애자 전 용 에이즈 상담소 체계를 개발하여 익명성을 보장할 수 있도록 익명검사 방법을 도입하였다. 소요시간 및 재방문의 단점을 극복하기 위해 신속검사를 수행할 수 있는 진단키트를 사용함 으로써 모니터체계의 주요한 지표가 산출됨을 증명하였다. 체계적인 운영을 위해 익명검사, 상담 및 시 스템 내용을 위주로 사업수행 과정을 작성하였 고, 훈련체계과 자문위원회에 대한 사업수행 전 략 지침을 작성하였다. 그리고 검사 전후의 상 담 방법 뿐 아니라 사용되는 서식을 작성하여 업무의 효율성 및 정확성을 기대할 수 있도록 하였다. 개발된 모니터체계를 이용하여 2005년 9월 중순부터 14주간 총 303명을 대상으로 혈청역 학적 지표를 산출한 결과 신속검사 스크리닝 양성률은 월별로 3~5%로 나타났으며, 검사의 양성예측도는 100%로 나타났다. 행태학적 지표에서 나타난 성적 파트너 특성 은 비지속적인 동성파트너 60%, 지속적인 동성 파트너 24.6%였다. 마지막 성관계 시 콘돔사용 여부는 사용한 경우 51.6%, 사용안함 30.9%, 사 용실패 1.7%, 불필요 11.7%, 기억이 안남 4.1% 였다. 콘돔 사용을 꺼리는 이유는 상대방의 거 부와 콘돔 없음이 전체의 50%가 넘는 이유로 분석되었다. 혈청역학 및 행태학적 모니터체계 결과를 이 용하여 전염병 예측 모형 중 하나인 구분구획 미분방정식 모형을 구축하여 국내에 적용하였 다(Herbert W.H, 1992). 사용된 모형은 단순 TWO-COMPARTMENTAL MODEL로써 평균 파트너 수와 콘돔 사용에 의한 감염확률이 감 염기간에 미치는 영향을 분석하여 예방효과를 평가할 수 있었다. HIV 전파에는 콘돔 사용에 의해 감염확률을 낮추게 되면 감염기간이 급격 하게 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는

30 Ⅰ. 연구보고 19 성 파트너 수와 파트너와의 평균접촉횟수가 고 정이 되더라도 같은 결과를 보였다. 특히 전체 인구의 5%를 감염 인구로 가정하고 현재의 doubling time인 인구 10%가 감염되는 기간을 분석한 결과, 행태학적 지표에서 조사된 현재 콘돔 사용률인 30%에서 60%로 증가하는 경우 감염기간은 약 2배 늘어나는 것으로 모형을 통 해 알 수 있었다. 이것은 콘돔 사용률을 높임으 로써 감염확률을 낮추는 것이 효과적인 HIV 예 방 정책임을 시사한다. 결 론 본 연구는 2005년 국민건강증진기금으로 수 행된 동성애자 검사 및 상담소 사업과 상담소 평가결과를 활용하여 작성되었다. 모니터링체계 에서의 신속검사 양성률과 양성예측도는 사업 초기단계에서 수행되었기 때문에 감염 위험이 높은 군을 대상으로 검사했을 가능성이 높음으 로 평가 결과가 과대 추정되었을 수 있지만, 국 내 최초로 체계적인 감시체계를 개발한 것에 큰 의미가 있다고 할 수 있다. 개발된 감시체계 를 이용하여 동성애자 대상 에이즈 예방사업을 기획하고, 그 효과 평가의 기본 자료로 활용될 수 있을 것이며 국제적 지표 산출이 가능할 것 으로 기대된다. 본 연구에서는 모니터링체계 결과를 이용하 여 예방효과를 측정할 수 있는 수학적 모형을 제시하였다. 모형에서 사용되는 모수는 HIV 전 파에 미치는 요인을 모두 포함하고 있지 못하 며 기간의 산출이 정확하지 않다는 제한점이 있지만, 예방효과를 측정할 수 있는 근거를 제 공하기 때문에 향후 예방사업의 중요한 평가도 구로써 사용될 수 있을 것으로 사료된다. 동성애자 대상으로 개발된 감시체계를 적용 한 상담소가 장기적으로 운영된다면 동성애자 를 대표할 수 있는 자료 산출이 가능할 것이며, 이러한 결과를 토대로 HIV 전파 및 예방사업 평가를 위한 보다 체계적인 수학적 모델링 기 법을 도입한 연구가 필요할 것이다. 참고문헌 1.이윤수, 한국남성의 성의식 조사, 한국성과 학연구소, 이훈재, 동성애자 에이즈 상담검진소 성과평 가, 이훈재 등, HIV 감염인/AIDS 환자들의 인권 실태조사, 국가인권위원회, 질병관리본부, 에이즈 상담소 운영가이드라 인, 질병관리본부, 2005 HIV/AIDS 통계자료, 한국남성동성애자 인권운동 단체, 한국에이즈퇴치연맹, 동성애 대상 동료교육 프로그램 및 동성애 성행태연구조사, 한국에이즈퇴치연맹, 고위험군 성행태 및 에 이즈 의식조사, 한국에이즈퇴치연맹, 2003년 전국민 성행태 및 에이즈 의식연구, Amirkhanian YA, Kelly JA, Kukharsky AA, Borodkina OI, Granskaya JV, Dyatlov RV, McAuliffe TL, Kozlov AP., Predictors of HIV risk behavior among Russian men who have sex with men: an emerging epidemic. AIDS. 15(3):407-12, Chen SY, Gibson S, Weide D, McFarland W., Unprotected anal intercourse between potentially HIV-serodiscordant men who have sex with men, San Francisco. J Acquir Immune Defic Syndr. 33(2):166-70, del Romero J, Castilla J, Garcia S, Clavo P, Ballesteros J, Rodriguez C., Time trend in incidence of HIV seroconversion among homosexual men repeatedly tested in Madrid, AIDS. 15(10): , Dodds JP, Nardone A, Mercey DE, Johnson AM., Increase in high risk sexual behaviour

31 20 국립보건연구원보 among homosexual men, London : cross sectional, questionnaire study. BMJ. 320(7248):1510-1, Dukers NH, Spaargaren J, Geskus RB, Beijnen J, Coutinho RA, Fennema HS., HIV incidence on the increase among homosexual men attending an Amsterdam sexually transmitted disease clinic: using a novel approach for detecting recent infections. AIDS. 16(10):F19-24, Herbert W.H, James W.V, Modeling HIV Transmission and AIDS in the United States, Springer-Verlag, Nardone A, Mercey DE, Johnson AM., Surveillance of sexual behaviour among homosexual men in a central London health authority. Genitourin Med 73: , Nardone A, Mercey D, Johnson AM, McCarthy M., Developing surveillance for HIV transmission and risk behaviours among high-risk groups in a central London health district. J Public Health Med. 21(2): , Suligoi B, Giuliani M, Galai N, Balducci M., HIV incidence among repeat HIV testers with sexually transmitted diseases in Italy. STD Surveillance Working Group. AIDS. 13(7):845-50, UNAIDS/WHO. AIDS epidemic update, U.S Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. CDC/GAP/VCT TEAM. Program Tools for Implementing Voluntary HIV Counseling and Testing (VCT) 21. U.S Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Quality Assurance Guidelines for Testing Using the OraQuick Rapid HIV-1 Antibody Test 22. WHO. Using the Workbook Method to Make HIV/AIDS Estimates in Countries with Low-Level or Concentrated Epidemics, 2005

32 Ⅰ. 연구보고 21 Development sero-behavioral surveillance system of HIV/AIDS for MSMs and construction of mathematical model U.Y. Go, M.K. Kee 1, H.S. Park 2, Y.H. Jung 3, S.J. Kim and J.Y. Hwang 3 Division of VPD control and NIP, Center for Disease Prevention, Division of AIDS, Center for Immunology and Pathology 1, Office of General Affairs and Innovation 2, Division of HIV and TB control, Center for Disease Prevention 3, KCDC, Seoul Korea Purpose:Nowadays, AIDS in Korea is in the early-stage that is showing concentrated epidemic of high risk group that are defined as MSM(men who have sex with men). But constructing surveillance was too difficult to detect MSMs due to the specific character of AIDS and homosexuality. In this study, we tried to construct the AIDS surveillance by developing serosurveillance and behavioral surveillance, and complementing the preliminary project, which is suited for our country and is can be figured out international index. Proposed surveillance used voluntary counseling and testing, VCT run by a private organization, so we can guarantee the anonymity. And to minimize the waste of the time, the diagnosis kit is used to conduct rapid HIV testing and this proved the production of the important index of surveillance. Methods:Three hundred and three MSMs undergoing HIV/AIDS test for serosurveillance and behavioral surveillance index from the middle of September of 2005 for 14 weeks were included in this study. The results of serosurveillance index, the screening positive rate was 3~5% for month by month and prediction of positive rate was 100%. In the analyses of the sex partners' behavioral characteristics, the two types were male to male regularly sexual contact(24.6%) and irregularly sexual contact(60%). And the experiences on whether or not MSMs to use condom during the last sexual contact were used(51.6%), not used(30.9%), failed(1.7%) and unnecessary(4.1%), respectively. Results:Based on serosurveillance index and behavioral index for HIV, to analysis the effect of the prevention of AIDS using a mathematical model. After model fitting, the result on spread of HIV was turned out that infected period has been delayed related to the use of the condom to lower chance of transmission. This result matched with fixed number of sex partner and sex. The 10% of population s infected period delayed by twice when using of the condom s rate is raised

33 22 국립보건연구원보 from 30% to 60%. Conclusions:Proposed surveillance of HIV/AIDS can be utilized as a base data to plan AIDS prevention project and evaluate the result of it. Also it is expected to produce international index for HIV/AIDS. And by using suggested modeling technique, we can evaluate the efficacy and validity of surveillance. Keywords: HIV/AIDS, MSM, serosurveillance, behavioral surveillance, mathematical model This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, 5-22, 2005

34 Ⅰ. 연구보고 23 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 23-46, 2005 전염병 신속대응을 위한 과학적인 역학조사 방법론 개발 질병관리본부 전염병대응센터 역학조사팀, 면역병리센터 질병매개곤충팀 1, 감염병센터 장내세균팀 2,질병예방센터 만성병조사팀 3. 허영주, 이동한, 강영아, 이상원, 이욱교 1, 최연화 2, 최빈아, 김성순, 이용제, 김진현 3 목 적:최근 전염병 발생현황과 최신의 역학조사 기술 등을 반영한 체계적인 전염병역학조사지침을 개발한다. 기존 역학조사서를 개정하고, 역학조사에 필요한 도구를 개발한다. 방 법:국내 및 외국의 전염병 역학조사 사례와 기존의 전염병 관리 지침을 검토하였다. 이에 근거 하여 역학조사 지침을 개발하고, 역학조사서를 개정하며 역학조사 관련 도구를 개발하였다. 또한 전 염병예방법 등 관련법령을 검토하였다. 결 과:전염병 발생 인지부터 보고서 작성까지 순차적인 역학조사 방법을 개발하고, 역학조사반 각 팀별 수행업무를 정의하였으며, 역학조사 자료 수집 및 분석 방법을 제시하였다. 수두 역학조사서를 개발하고, 3종의 역학조사서를 개정하였으며 외국어 수인성 식품매개질환 역학조사서를 개발하였다. 또한 수인성 식품매개감염병 역학조사 핸드북 을 제작하고, 식품매개 병원체의 원인식품과 병원체 특성 을 정리하였다. 결 론:시 도 및 시 군 구 역학조사 능력 향상을 기대할 수 있다. 또한 역학조사 자료수집 방법 향상으로 수집된 자료의 질적 향상을 도모할 수 있을 것이다. 중심단어:역학조사, 현장역학, 역학조사서, 역학조사지침 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

35 24 국립보건연구원보 서 론 경제 및 생활수준 향상으로 기존에 사라졌다 고 생각되었던 수인성/식품매개 전염병 등이 꾸 준히 발생하고 있다(장티푸스 2000년 234명 (이하 발생 수), 2004년 174명, 세균성이질 2000년 2,462명, 2004년 487명, 장출혈성대장 균감염증 2000년 1명, 2004년 118명, 2004년 전염병통계연보). 또한 기존에 드물게 발생하였 던 A형간염, 노로바이러스 등의 유행이 나타나 고 있다(2004년 감염병 역학조사보고서). 이는 학교급식이 확대되고 외식중심의 문화, 즉석 식 품의 대량생산 체계로 변화함에 따라 발생하는 현상으로 생각된다. 그리고 대표적 해외유입전 염병인 뎅기열(dengue fever)의 경우 2000년 0명, 2001년 6명, 2004년 16명(2004년 전염 병통계연보)에서 보듯 최근 국제적인 교류가 빈번해짐에 따라 해외유입전염병도 점차 늘어 나고 있다. 이러한 전염병 유행 발생에 따라서 중앙역학 조사반 또는 시 도 역학조사반, 시 군 구 보건소 의 역학조사 방역팀이 구성되고 역학조사지침을 활용하여 역학조사를 실시하고 원인을 규명하 여 방역 대책을 수립하고 있다. 변화하는 전염 병 발생 추세에 맞추어 전염병예방법이 수차례 개정되었으나, 기존의 전염병 역학조사지침은 2000년 전염병 역학조사지침과 2001년 식품매 개질환 역학조사지침이 가장 최근의 것으로, 주 로 이질, 장티푸스, 콜레라 등의 수인성/식품매 개질환과 홍역, 유행성이하선염, 디프테리아, 백일해 등의 호흡기질환만 다루고 있고 근래의 변화를 반영한 적절한 지침이 없는 경우가 많 다. 역학조사서도 기존의 것을 활용하여 임시로 상황에 따라 맞는 역학조사서를 작성하여 사용 하고 있는 실정이다. 기존 역학조사지침(2000년 전염병역학조사지 침, 2001년 식품매개역학조사지침)은 발간 후 시간의 경과로 최근의 전염병 발생경향과 신종 전염병 등을 반영하고 있지 못하다. 따라서 새 로운 전염병 발생시 각 질환별로 관련된 외국 문헌을 고찰하거나 지침을 개발해야 하며, 특히 유행발생 초기에 원인미상인 질환의 역학조사 시 수인성/식품매개질환 외에 호흡기 질환, 신 경계 질환, 간염, 발진열 등의 질환에는 적절한 지침이 없다. 또한 2005년 전염병관리사업지 침, 2005년 전염병관리 및 보고지침은 질환을 전염병예방법상의 1, 2, 3, 4군 및 지정전염병을 시 도 사례조사와 시 군 구 보건소사례조사 대상으로 나누어 구성되어 있으나 기존 역학조 사지침은 이러한 체계가 없어 유기적인 연계성 이 부족하여 업무의 효율성이 떨어질 수 있다. 최근 전염병관리자 실무과정(Field Epidemiology Training Program, FMTP)을 통하여 각 지역 보건 소에 전염병 전문가가 육성됨에 따라 시도 및 보 건소 단위에서 역학조사가 이루어지고 있어, 이 에 맞는 발전된 지침이 요구된다. 또한, 일부 부서에서 개발한 질병별 역학조사지침을 일원 화하고, 전염병관리사업지침과 전염병보고 및 정보관리지침과 유기적인 연계를 구축함으로서 업무의 혼선을 방지하여 전염병 발생시 즉각적 이고 효율적인 역학조사를 할 수 있을 것으로 기대된다. 이에 따라 이 연구에서는 신속대응을 위한 체계적인 전염병역학조사지침 개발을 위해 수 행하였다. 새 지침에는 최근의 전염병 발생현황 을 반영하고, 전염병관리사업지침, 전염병보고 및 정보관리지침과의 유기적 연계하도록 하였 으며, 전염병관리자들의 능력 개발 및 활용을 도모하도록 하였다.

36 Ⅰ. 연구보고 25 재료 및 방법 결 과 국내 자료를 검토하여 국내 실정에 맞는 지 침 개발을 위한 국내 전염병 발생현황을 파악 하였으며, 년 감염병 역학조사 사례 집을 심층 분석하였고, 감염병에 대한 최근의 검체 채취, 실험실 검사방법 검토하였다. 또한 기존 지침 및 관련 자료를 검토하고, 각 질환별 역학조사지침 및 역학조사서의 분석하였으며, 2005년 전염병관리사업지침과 2005년 전염병 보고 및 정보관리지침 등 전염병 관리와 관련 된 지침을 검토하였다. 동시에 전염병 예방법 등 전염병 관련법령을 검토하였다. 급성호흡기증후군과 조류인플루엔자 등의 국 외 역학조사사례 및 지침을 검토하고, 국외 전 염병 발생현황을 파악하여 국내 유입가능성 파 악하였다. 동시에 국외 전염병 역학조사지침 및 역학조사서를 검토하였다. 질병발생 인지에서 최종보고서 작성까지 각 과정에서 수행해야 할 업무를 정의하고, 역학조 사반 내 각 팀의 업무를 정의하고, 역학조사 자 료 수집 및 분석방법을 제시하였다. 또한 수두 역학조사서를 개발하고 3종을 개정하였다. 동시 에 현지역학조사에 필요한 자료를 개발하였다. 각 질환별 역학조사지침, 역학조사서를 분석 하였다. 또한 전염병관리사업지침, 전염병보고 및 정보관리지침, 관련법안과 전염병 역학조사 사례를 분석하였다. 해외의 역학조사 지침 등 자료를 수집하고 전염병에 대한 최신 학술연구 문헌수집, 검토하였으며, 국외 전염병(급성호흡 기증후군, 조류인플루엔자 등) 발생현황 자료수 집하고 급성호흡기증후군, 조류인플루엔자 등 지침, 역학조사서 등을 수집하였다. 역학조사관, 역학조사 실무자 및 전문가를 대상으로 기존 역학조사지침과 역학조사서의 문제점에 대한 의견을 수집하였다. 제1장 현장역학조사 방법론 현지역학조사 라는 것은 다음과 같은 특수한 상황 하에서 역학적 원리를 활용한 현지조사를 수행하는 것이라고 정의할 수 있다. 예기치 않은 질병의 발생 즉각적인 조치가 필요 문제의 해결을 위하여 보건요원들의 현지 조사가 요망 추가적 질병발생을 차단하기 위해 조사의 신속성이 요망 제1절 현지역학조사 전 준비사항 1. 기초정보 수집 효율적인 역학조사의 수행을 위하여 다음의 기초정보를 미리 준비하여 활용토록 한다. 유행 지역의 역학조사는 1 유행 발생 및 유행규모 파악, 2 유행자료의 수집 및 분석, 3 유행원 인규명 및 방역활동의 순서로 진행되는 것이 일반적이다. 그러나 역학조사의 준비단계에서는 아직 명확한 정보들이 수집되기 이전이며, 새로 운 유행의 시작만이 겨우 알려져 있을 뿐이므 로 역학조사의 방향에 대한 가정을 상정(Image training)하고 이를 검토하며, 최선을 다하여 기 초정보를 입수할 수 있는 방법을 생각해야 한 다. 기초정보란 본격적인 역학조사 이전 역학조 사계획 수립을 위한 질병발생과 관련된 기본적 정보를 뜻한다. 그러나 기초정보는 전체 역학조 사의 방향을 변화시킬 수 있을 만큼 중요한 정 보이며, 짧은 기간 내 역학조사에 투입되는 물 량 및 인력지원 판단의 근거가 되므로 가능한 다양한 정보를 가능한 정확하게 입수하여야 한 다. 일선 보건요원(보건소 직원)들이 수행하는 현지역학조사는 이미 유행의 원인 병원체가 알 려진 이후의 사례에 대한 것이 대부분인데, 이 러한 경우라면 기초정보에 포함될 수 있는 내 용은 다음과 같은 것이 추천된다.

37 26 국립보건연구원보 가. 질병발생의 개략적 상황 급성전염병의 유행과 관련된 현재의 상황을 정리한다. 보통 보건소에서 지역사회 유행발생 을 파악하는 방법은, 의료기관을 통한 신고, 주 민들의 신고, 보건소의 감시사업을 통해서이며, 이러한 경우 본격적인 조사이전에 보건소의 방 역담당 직원이 여러 경로로 질병발생의 대략 적 상황을 파악하게 된다. 기초자료의 수집에 특별한 방법이 요구되는 것은 아니나 활용가치 가 큰 기초자료원으로 활용되려면 대략적인 시 간적, 공간적, 인적 특성이 포함되어야 한다. (1) 시간적 특성 시간적 특성은 질병발생에 대하여 일별, 또는 일정한 기간별로 빈도분포를 조사한 것이다. 아 직 본격적인 조사가 이루어지기 이전이며, 환자 의 숫자도 명확히 밝혀지지는 않은 단계이지만, 상식적인 범위 (예를 들어 학급에서 유행발생 이 있는 경우 선생님을 통하여 정보를 얻는다 던가, 지역사회의 경우 마을 이장 등을 통하여 질병발생의 개요를 간단히 물을 수 있다)에서 정보를 얻을 수 있다. 기초자료이므로 명확한 유행발생곡선(Epidemic curve) 등의 역학적 특 성을 알 수는 없지만, 대략적인 유행의 양상 (공동감염원에 의한 동시폭로인가, 산발적으로 확산되는 것인가, 2차감염의 징후는 있는가 등)은 파악될 수 있다. (2) 공간적 특성 질병발생을 지역별로 빈도분포를 표시한 것 이다. 지역별 환자의 분포는 감염원 혹은 위험 요인에 대한 단서를 제공하며, 특정한 지역의 집적성은 환경적 요인이 개입되어있을 가능성 도 시사한다. 역시 기초자료의 수집단계이므로 시간적 자료와 마찬가지로 환례의 숫자조차 명 확하지 않은 단계이지만, 알려진 범위 내에서 행정지도위에 환자의 주소에 따라 표식을 해두 는 간단한 지점도(spot map)를 작성하는 것으 로도 유행발생을 이해하는데 큰 도움이 된다. 조금 더 여유가 있다면 지점도 위에 질병발생 시간을 함께 기술하면 더욱 좋다. (3) 인적특성 질병발생과 관련되어 있는 사람들에 대한 분 포를 정리하는 것이다. 가령 어떤 질환의 이환 자들이 특정한 직업이나 종교, 또는 행태와 관 련되어 집중되어 있다면, 이러한 특성들이 질병 발생과 관련되어 있을 가능성이 높으므로 이에 대한 빈도분포 기술은 중요한 단서가 된다. 그러나 한편으로 역학조사의 계획수립을 위 한 기초정보로서 시간적, 공간적, 인적특성을 파악하는 것이 어려울 경우도 있을 수 있는데, 이러한 경우에는 6하원칙(누가, 언제, 어디서, 무엇을, 왜, 어떻게 하였나)을 응용하여 작성하 는 것도 나름대로 도움이 된다. 나. 문헌고찰 역학조사의 설계, 필요한 방역계획의 수립 등 을 위하여, 해당질병의 역학적 특성 및 관리 가 이드가 수록된 문헌을 준비한다. 보건복지부 질 병관리본부에서 발간되는 지침서, 국내에서 발 간되는 역학관련 교과서, 세계보건기구의 질병 관리 지침 (인터넷을 통하여 쉽게 얻을 수 있 다), 미국 CDC의 질병관리 가이드(Control of Communicable Diseases Manual)등이 비교적 널리 활용되는 편이다. 다. 조사 대상지역 자료 수집 대상지역의 인구자료, 최근동향, 지역 상세지 도 등을 준비한다. 이러한 자료는 역학조사 방 법뿐 아니라, 지역사회에 투입할 인적, 물적 자 원의 양을 결정할 때도 도움이 된다. 대부분의 경우는 동사무소, 구청 등에서 얻을 수 있다. 라. 가용 인적자원 및 가용물량 지피지기( 知彼知己 )면 백전백승이라는 말이 있는 것처럼, 역학조사 대상에 대한 파악만으로 는 효율적인 역학조사를 수행 할 수 없으며 역 학조사의 수행주체에 대한 평가도 이루어져야 한다. 하루 이틀 만에 역학조사는 완료되기 어

38 Ⅰ. 연구보고 27 려우며 경우에 따라 많은 인적, 물적 자원을 동 원해야 하므로 가능한 장기적인 관점에서 가용 자원을 파악한다. (1) 인적자원 궁극적으로 역학조사를 수행하는 것은 사람 이며, 특히 보건소 요원이 수행주체가 된다. 보 건소 요원의 경우 평상시 수행하는 업무가 지 정되어 있으므로 본래의 업무를 저해하지 않는 범위에서 역학조사를 위한 인력선발을 수행하 여야 하나, 적극적인 방역 및 역학조사가 필요 한 긴급한 경우라면 본 업무에 어느 정도 영향 을 미치더라도 방역활동에 우선순위를 두고 비 상 업무를 새롭게 지정하여 역학조사를 수행하 여야만 한다. 또한 효율성의 극대화를 위해 평 상시 수행하던 업무특성에 따라 수행업무를 지 정하는 것이 바람직하다. 역학조사팀은 역학조 사 설계에 따라 얼마든지 바뀔 수 있으나 일반 적으로 역학조사를 지휘하는 조사본부 요원, 자 료수집 요원(설문조사 및 방문 가검물채취 요 원), 검사실요원, 자료관리요원, 행정보조요원, 방역 홍보요원으로 나누어 파악하면 큰 무리는 없다고 본다. (2) 물적 자원 대규모 유행의 경우 검사를 위한 배지, 진단 키트부터 인쇄용지까지 많은 물적 자원을 소모 하게 된다. 특히 진단을 위한 배지는 필요에 따 라 그때그때 만들어 사용하는 것이어서 쉽게 구입할 수 있는 것도 아니므로, 현실적으로 동 원 가능한 자원을 파악하는 것은 중요한 일이 다. 기본적인 물적 자원의 경우 검사실에서 사 용하는 진단용품, 보건소에 내원하는 환자치료 를 위한 치료약품, 자료입력 및 관리를 위한 컴 퓨터, 복사기, 전화기, 팩스, 사무용 소모품, 차 량 등 다양하며, 목록을 만들어 점검하면서 사 용 가능한 자원을 파악하면 준비과정에서 발생 하는 실수를 줄일 수 있다. 본격적인 역학조사 계획이 작성되면 추가적으로 필요한 물품을 목 록에 넣어 이를 점검토록 한다. 2. 역학조사를 위한 협조체계 구성 역학조사를 수행하다보면 필연적으로 많은 행정기관의 협조를 필요로 하며, 경우에 따라 중앙기관의 전문가, 학계 전문가의 도움을 받아 야 하는 경우도 있다. 그러므로 역학조사 수행 이전 관련된 기관 (시 도청 보건위생과, 보건환 경연구원 등)에 사전 연락을 취하여 역학조사 의 수행이전단계에서부터 이들을 기관의 참여 와 협조를 구하는 것이 바람직하다. 특히 시 도 보건위생과에서는 보건소에서 할 수 없는 행정 지원을, 그리고 보건환경연구원에서는 검사실 지원을 기대할 수 있으므로 이들의 참여는 필 수적이다. 역학조사의 설계 및 자료분석 그리고 추진과정에서 역학조사에 있어 풍부한 경험을 가지고 있는 중앙기관의 역학조사 전문가 또는 학계 전문가의 조언을 받는 것도 시행착오를 줄이는 방법이 된다. 3. 중앙역학조사반 자문회의 개최 중앙역학조사반 출동 전 자문회의를 개최하 는 것이 좋다. 시간 및 공간적 제한이 있다면 전화회의를 소집할 수도 있다. 회의는 질병관리 본부 관계자, 관계전문가 및 유행 발생지역 보 건소 및 시 도 관계자가 참가해야 한다. 자문회 의를 통해 환자발생현황, 현지주민동향, 언론동 향 등 현지 상황을 정확히 파악해야 한다. 중앙 역학조사반 파견여부와 인력 구성을 정해야 한 다. 또한 주요 조사내용과 방역조치 방향을 결 정해야 한다. 제2절 현지역학조사의 수행 역학조사 수행이전에 마련된 기초 자료를 토 대로 구체적인 역학조사의 설계를 진행 할 수 있는데, 역학조사의 설계는 유행의 특성에 따라 역학조사의 대상과 방법이 달라질 수 있다는 점을 염두에 두어야 한다.

39 28 국립보건연구원보 1. 역학조사팀 조직 역학조사계획이 수립되면 우선적으로 역학조 사에 투입될 필요한 인력을 선발하여 팀을 조 직하고 업무에 따른 훈련을 하여야 한다. 앞서 언급했던 것처럼 역학조사팀은 역학조사 설계 에 따라 얼마든지 바뀔 수 있으므로 지나친 일 반화는 곤란하다. 그러나 보건소에서 활동하는 요원이 주축이 되며, 장관 감염병에 대한 역학 조사를 수행하게 되는 경우 역학조사를 지휘하 는 조사본부 팀, 자료수집 팀(설문조사 및 방문 가검물채취 요원), 검사실팀, 자료관리팀, 행정 보조팀, 방역 홍보팀으로 나누어 구성하면 큰 무리는 없다고 본다. 가. 역학조사본부 (1) 수행업무 조사본부는 역학조사과정에서 의사결정을 담 당하며, 역학조사의 방향을 이끄는 두뇌 역할을 하게 된다. 보건소장, 보건소 방역담당 간부, 시 도청의 방역담당관, 보건환경연구원 관계자, 중앙기관 학계의 전문가등이 주축이 될 수 있 다. 조사본부요원들은 날마다 수집되고 분석된 자료를 바탕으로 현재의 상황을 판단하고, 추가 적으로 필요한 역학조사 계획 및 방역조치를 결정하여야 하는데 순간적인 판단착오로 인하 여 조사업무의 효율성을 크게 저하시킬 수도 있으므로 상황판단에 주의를 기울여야 한다. 특 히 다른 팀의 요원들이 가져오는 사소한 정보 도 중요한 단서가 될 수 있으므로 이를 주의 깊게 경청하는 자세가 필요하다. 또한 조사본부 에서는 다른 팀에서 일어나는 불편함, 갈등 등 을 적극적으로 해결해 주어야 하며, 언론의 인 터뷰 요청에도 응하여야 하므로 이를 원만히 처리할 수 있는 마음의 여유가 필요하다. (2) 업무 수행 시 유의점 역학조사에 필요한 역학조사서의 제작, 팀의 인력구성 결정, 각 팀의 훈련, 각종 지침의 하 달, 보고양식의 제작, 각 기관과의 협조 등 업 무전반에 걸친 내용을 수행하여야 하므로 숙달 되지 않은 요원들은 이에 대한 구체적인 업무 추진 훈련이 필요하다. (가) 역학조사서 제작 역학조사서는 역학조사 시 획득되는 정보의 대부분을 결정한다. 따라서 이를 제작함에 신중 함을 기하는 것은 당연하며 꼭 필요한 정보가 누락되는 경우 설문조사를 다시 해야 할 정도 로 그 문제는 심각하다. 지역사회에서 장관전염병이 발생하게 되면, 보건소에서 제작하는 역학조사서중 우선적으로 인용되는 것은 수인성/식품매개질환역학조사서 이다. 보건복지부에서는 이러한 역학조사서를, 콜레라 등 설사질환에 대한 하나의 조사양식 견본으로 제작하여 배포한 것이며, 전염병이 발 생하는 사례는 매우 다양하기에 이를 응용하여 현지 실정에 알맞은 역학조사표를 제작해야 한 다는 취지에서 만들어진 것이다. 질병자료의 종 합화, 체계화를 위하여 역학조사서는 가능한 규 격화 되어 있는 것이 좋다. 그러나 역학조사서 의 내용 중 변치 않는 것은 성명, 연령, 주소, 주민등록번호, 전화번호 등의 기본적인 사항에 국한된 것일 뿐, 전체 내용의 획일화는 있을 수 없으며 현지의 필요에 따라, 그리고 역학조사를 통하여 달성하고자하는 목적에 따라 적절히 응 용되고 개선되어야 한다. 또한 역학조사서 제작에 있어 역학조사서를 작성하는 대상자가 보건요원인지, 또는 자기기 입식 설문이지도 중요한 요인이다. 피치 못하게 대규모의 주민을 대상으로 자기 기입식 설문을 하려고 하는 경우에는, 전문교육을 받은 보건요 원이 설문하여 작성하는 역학조사서와 같은 내 용의 것을 사용하기는 어렵다. 대상자의 학력, 보건학적 상식, 참여욕구 등을 고려하여 적절히 어투 및 내용을 변형 하여야 하며, 특히 자기기 입식 설문의 경우 너무 욕심을 부려 과도하게 많은 설문을 하거나 난해한 내용이 삽입되지 않도록 한다. 또한 애매모호한 질문이나 중복질 문 역시 금물이다. 역학조사표는 가능한 글자를

40 Ⅰ. 연구보고 29 크게 하고 종이의 여백도 넉넉히 하는 것이 좋 으며, 지나친 욕심으로 너무 많은 설문이 되지 않도록 한다. 역학조사 과정에서 가히 정보의 홍수라 불릴 만큼 많은 자료들이 입수되게 되는데, 힘들게 입수한 자료들이 제 가치를 발휘하기 위해서는 제작단계에서부터 분석을 염두에 두는 것이 좋 다. 예를 들어 어떤 환자의 증상을 설문할 경 우, 환자가 호소하는 증상을 있는 그대로 설문 지에 적는 것보다, 가능한 증상을 일정하게 나 열한 후 예/아니오로 답하게 한 후 설문조사서 에 없는 증상내용만 따로 기입하게 하는 것이 자료의 활용을 위하여 효율적이다. (나) 팀의 인력구성 및 업무 결정 수립된 역학조사계획에 따라, 각 팀의 인력구 성을 결정할 뿐 아니라, 업무까지 명확히 결정 되어야 한다. 팀을 구성한 이후 각 팀의 요원들 이, 정작 자신의 업무를 정확히 파악하지 못하 면 역학조사 진행에 있어 많은 지장을 초래하 기도 한다. 또한 역학조사 계획이 보건소의 인 력동원 범위를 넘는 경우, 상급보건기관(시 도 청 보건과)과의 협조를 통하여 인근지역 보건 소의 인력을 지원 받는 것도 고려해 볼만하다. 나. 자료수집팀 (1) 수행업무 자료수집팀은 설문면접조사, 방문 가검물 채 취, 병의원 학교 모니터 및 가검물 회수, 현장조 사 등 실질적으로 역학조사 시 수행되는 조사 내용을 추진하는 역할을 담당한다. 가장 많은 인력이 필요한 팀이면서, 직접 발로 뛰면서, 사 람을 만나고, 자료를 수집하는 업무를 가지므로 이에 의한 스트레스도 크다. 특히 전염병이 발 생한 지역에서는 주민들이 의도적으로 자료수 집요원의 방문을 기피하는 일이 많으며, 심지어 조사를 거부하는 사례도 가끔 있는데, 어려움에 좌절하지 않고 친절하게 주민을 면접하면서 역 학조사를 수행하는 적극적인 자세가 필요하다. 자료수집팀에는 지역사회 실정을 잘 알고 있으 면서 지리에도 밝은 요원들이 투입되면 효율적 인데, 보건소의 방문간호사업요원, 통합간호 사 업요원들이 업무수행에 도움이 된다. 한 가지 주의할 점은 역학조사요원들의 성비( 性比 )이다. 장관감염증의 경우, 설문조사와 더불어 직장채 변 등의 가검물 채취를 동시에 수행하게 되는 사례가 대부분인데, 여자요원들의 경우 남자성 인의 직장채변은 용이한 일이 아니며, 조사대상 자가 이를 거부하는 일도 드물지 않다. 따라서 자료수집팀에 훈련된 남자요원들을 적절히 함 께 투입하여 같은 팀으로 움직이게 하는 것이 좋다. 또한 성인들은 대부분 낮 시간에는 직장 에 출근하고 밤에 가정으로 돌아오게 되므로 역학조사를 피치 못하게 밤늦은 시간에 수행하 는 경우가 많은데, 이러한 경우 남자직원이 함 께 동행하는 것이 도움이 된다. (2) 업무수행 시 유의점 자료수집팀 요원이 처음 역학조사에 투입되 기 이전 역학조사서의 기입 내용을 숙지하는 것은 매우 중요한 일이다. 역학조사서에서 설문 하는 내용을 명확히 파악하여야 할 뿐 아니라, 기입방법에 대해서도 충분히 알아 두어야 자료 의 수집과정에서 일어나는 편견(bias)이나 오류 를 줄일 수 있다. 역학조사에 임하기 전 피조사 자의 입장에서 역학조사서를 작성하는 훈련, 말 을 건네어 답변을 이끌어내는 훈련하는 것이 좋다. 자료수집팀의 요원은 최선을 다하여 조사 에 임하여야 하는데, 특히 역학조사서에 나와 있지 않은 항목이라도 중요한 단서가 될만한 내용이 있으면 이를 기록하여 조사본부에 통보 하는 적극성을 가져야 한다. (가) 역학조사서 작성 원칙을 반드시 지켜라. 어떤 가구에 급성 전염병의 발생이 신고 되 거나 예측되는 경우 보건소의 조사요원이 방문 하여 역학조사를 실시하게 되는데, 1회의 방문 으로 가구원(폭로원) 전원을 조사할 수 있는 경우는 거의 없다(가구원들의 귀가시간이 서로 다름). 따라서 집에 남아 있는 주부를 대상으로

41 30 국립보건연구원보 가구원 전체에 대한 설문을 하게 되는 경우가 많은데, 원칙적으로 의사소통이 불가능한 유아 등을 제외하고는 추천되지 않는 방법이다. 최선 의 방법은, 조사대상 가구원들에게 아직 역학조 사가 완료되지 않았음을 알리고 정중하게 재차 방문을 통보하여 직접적인 면접조사를 완수하 는 것이다. (미리 방문할 시간 등을 약속하면 일정관리에 도움이 된다) 부득이 가구원에 대 한 조사가 불가능한 경우에는 주부 등 면접이 가능한 사람을 통하여 가구원 전체에 대한 역 학조사서를 작성하여야 하는데, 이때 중요한 것 은, 절대로 한 장의 역학조사서에 가족 전체의 사항을 기록하여서는 안 된다는 것이다. 역학조 사서는 1장의 조사대상자를 기입할 수 있도록 설계되어 있기 때문에, 접촉자등 가족관계를 묻 는 설문조사 항목이 역학조사서에 있다하여도 이것이 가족전체에 대한 조사를 갈음하는 것은 아니다. 1장의 역학조사서는 어떠한 경우에도 자료처리과정에서 1명에 대한 기록으로만 간주 된다. 그러므로 대리조사를 통한 역학조사의 경 우에도 1인 1장 역학조사서 작성의 원칙을 반 드시 지켜서 기록 하여야 하며, 역학조사서에 대리조사가 이루어 졌음을 나타내는 내용을 기 입 하여야 한다. 만일 이러한 원칙이 지켜지지 않는다면 가구원에 대한 조사를 완료 하였음에 도 불구하고 가구원 중 1명에 대한 기록만이 남게 되므로 같은 오류에 의하여 재차, 삼차방 문을 하게 되므로(중복조사) 이를 각별히 주의 하여야 한다. 역학조사서에 나타는 피조사자의 신원이 불 명확한 경우처럼 난감한 경우도 별로 없다. 모 든 조사내용이 중요하겠지만 특히 성명, 주소, 주민등록번호(연령, 성별), 전화번호, 직업 등 인적사항이 구체적으로 기입되어 있지 않으면, 재조사가 불가피하다. 주민등록번호, 전화번호 등은 동명이인의 구별, 가족관계의 파악 및 가 구내 집적성 계산 등에 유용히 활용되며, 직업 은 식당종사자등 전파의 우려가 큰 사람에 대 한 방역조치를 위하여 반드시 필요하므로 역학 조사서에 성명만 간략히 기입하는 일은 삼가 하여야 한다. (나) 가검물 채취 원칙을 반드시 지켜라. 검사실 진단은 확진자를 구별하며 지역사회 의 유병현황을 파악하는데 결정적 역할을 하지 만 일반적으로 가검물 채취는 설문조사보다 협 조가 어려운 편이다, 특히 직장채변 가검물의 경우 채취방법이 피조사자에게 모멸감을 줄 수 있으므로 충분히 검사내용을 설명하고 가검물 채취에 임하는 것이 바람직하다. 그런데 어떤 경우에는 그 곤란함으로 말미암아 보건요원이 직접가검물을 채취하는 것이 아니라 채취장비 를 피조사자에게 건네어 주고 이를 수거하는 사례가 있다. 그러나 이는 매우 잘못된 행위이 다. 첫째, 피조사자가 직접 채취하는 것은 채취 체위 상 정확한 방법으로 하기 어렵고, 둘째, 피조사자가 수치심으로 아무런 조작도 하지 않 은 검사기구를 그대로 보건요원에게 넘기는 일 이 흔하기 때문이다. 급성 전염병의 발생에 따라 현장에 투입된 보건요원들이 가검물 채취에 중심을 두고 역학 조사서를 작성하지 않는 경우가 가끔 있는데, 이는 아주 금기 시 해야 될 사향이다. 이런 잘 못이 빈발하는 이유는 과거에 가검물 채취 건 수로 방역실적을 평가하던 잘못된 관행과, 전염 병보건관리에 대한 이해부족에 따른 것이며 역 학조사서(설문조사)작성과 가검물 채취는 함께 이루어져야만 한다. (다) 적극적 모니터 활동을 수행하라 자료수집팀의 주요한 업무 중 하나는 병의원 학교의 환자모니터링이며 일부 자료수집팀 요 원들은 병의원 학교의 모니터링을 담당하게 된 다. 병의원은 약국을 제외하고 현성증상이 있는 환자들을 가장 빨리 만나게 되는 장소이므로 이를 효율적으로 활용한다면, 환자발생의 추이 를 감시할 수 있으며, 의사의 협조를 얻어 현장 에서 역학조사 및 가검물 채취를 수행할 수 있 어 일석이조의 효과를 거둘 수 있다. 학교는 질 병발생에 있어 증폭원(amplifier)으로 작용할

42 Ⅰ. 연구보고 31 수 있으므로 이에 대한 항상적 감시가 필요하 다. 병의원 및 학교 모니터링 방법은 조사본부 의 지도에 따른다. 특히 주의할 점은 이들 모니 터 활동을 적극적으로 수행 하라는 것이다. 현 재 보건소에는 설사질환 감시망이 있지만 그 효율성은 낮은 편이므로 의사 학교의 적극적 협 조가 이루어지도록 효율성 제고를 위한 노력이 필요하다. 다음은 한 도시에서 수행된 설사환자 모니터 요원의 업무분장이다. 다. 검사실팀 (1) 수행업무 검사실팀은 역학조사기간 동안 의뢰되는 각 종 가검물에 대한 미생물학적 시험을 담당한다. 그러나 검사실 업무는 검사실에 근무하는 요원 만이 담당할 수 있으며, 고도의 전문성을 필요 로 하므로 다른 업무를 담당하는 사람을 지원 하여 업무를 돕게 하는 것도 불가능하다. 때문 에 역학조사 전 기간 동안 과중한 업무에 시달 리게 되며 검사를 위한 감별배지, 수송배지, 진 단키트 등 많은 물량을 준비하여야 하는 어려 움도 따른다. (2) 업무수행 시 유의점 검사실팀은 진단을 위한 정도관리에 관심을 가져야 한다. 익숙지 않은 시험인 경우에 임으 로 시험하지 말고 관할 보건환경연구원의 전문 가에게 자문을 구하도록 한다. 가능하면 표준균 주를 구하여 수회 동정시험을 함으로서 검사능 력을 기르는 것이 좋다. 검사실팀은 다음과 같 은 사항을 주의 하여야 한다. (가) 가검물에 대한 표식(Label) 및 기록을 철 저히 한다. 밀려드는 가검물을 급히 처리하다보면 가검 물에 대한 표식을 제대로 하지 못하는 경우가 있으며, 이에 따른 혼란을 겪는 경우가 있다. 경우에 따라 반복검사를 수행하거나, 특히 법정 전염병의 경우처럼 입 퇴원 관리를 위하여 3회 이상 검사하게 되는 경우에는 자료가 뒤섞여 어려움을 겪는 사례도 있으므로 주의하여야 한 다. 바람직한 것은 가검물과 역학조사서를 함께 접수한 후 별도의 가검물 처리 노트를 만들어 노트에 검사일자 및 신원을 알아보는 사항(이 름, 주민등록번호, 검사집단명)을 모두 기록하 고, 고유번호를 부여하여 배양배지 등 가검물에 표식하는 것이다. (나) 물량확보에 주의하라 현장에서 역학조사의 수행은 격동적으로 이루 어진다. 역학조사 초기에 계획을 수립하지만 역 학조사 과정중 돌발적으로 발생하는 변수는 예 측하기 어렵고, 특히 갑자기 집중적인 조사를 수행할 경우 확보된 검사용품은 쉽게 바닥을 드 러낸다. 따라서 검사실 담당자는 매일 조사본부 와 연락을 취하여 이후의 역학조사 계획을 입수 하고, 이에 필요한 물품을 확보하여야 한다. (다) 검사실 감염에 주의하라. 검사실은 원인 병원체를 직접 다루는 곳이다. 따라서 어느 조사요원보다 감염의 우려가 크므 로 특히 위생관리에 주의를 기울여야 한다. 라. 자료관리팀 (1) 수행업무 자료관리팀은 역학조사기간 동안 입수되는 각종 정보를 컴퓨터에 입력하고, 자료를 분석하 여 조사본부에 보고 함으로서, 현재의 질병발생 상황을 파악하고 향후 조사방향을 이끌어 내는 데 필요한 기초자료를 생산한다. 다른 역학조사 와는 달리 급성 장관 전염병의 경우, 전염병의 확산방지를 위하여 역학조사와 동시에 방역관 리를 수행해야 하는 어려움이 있으므로, 매일 입수되는 정보는 바로 당일에 입력하여 즉시 분석되는 기민함이 필요하다. 자료관리팀의 요 원은 특별한 제한은 없으나, 컴퓨터 작업에 익 숙한 사람이 가장 적당하다. (2) 업무수행 시 유의점 조사본부로부터 입력지침을 받아, 역학조사서 등 매일 같이 입수되는 정보를 컴퓨터에 입력한

43 32 국립보건연구원보 다. 대부분의 자료는 문자자료(text)로 처리되 는 것이 아니라, 코딩을 통한 부호로 입력되므 로, 반드시 입력지침을 숙지하고 있어야 한다. 입력하는 과정 중에서 입력이 곤란한 내용이 발 생하게 되면 임의로 입력하지 말고 조사본부로 연락하여 이에 대한 대응방침을 전달 받아야 하 며, 본격적인 자료입력 이전에, 조사본부요원의 지도로 몇 개의 자료를 시험 삼아 입력하는 훈 련을 함으로서 오류를 줄일 수 있다. 자료관리 팀은 다음의 사항을 주의하여야 한다. (가) 입력지침을 준수하라 만약 입력하는 내용이 입력자에 따라 모두 다르다면 어떻게 될까? 예를 들어 역학조사서 에 수록된 남자와 여자를 입력하는 것에 대하 여, 갑은 1과 2로, 을은 1과 0으로, 병은 남자 여자로, 정은 남 여로 구별한다면 무척 혼란스 러울 것이다. 입력은 하나의 규약이다. 모든 자 료들은 일관된 방침을 가지고 입력이 되어야하 므로 이를 주의 하여야 한다. (나) 자료정리를 염두에 두라 아무리 주의를 기울여도 역학조사과정에서 흔히 발생하는 문제 중 하나가 중복자에 대한 처리이다. 만약 동일인에 대하여 중복된 역학조 사 자료가 있으면, 이를 찾아내어 하나의 자료 (레코드)로 만들어야 한다. 여러자료가 있으면 가장 신뢰성이 있는 자료를 택하여 입력하고 나머지 자료 중 특이 부분이 있으면 이를 보충 하는 방법을 쓰면 무난하다. 물론 1개의 자료 를 제외한 나머지 자료는 삭제한다. 중복자를 가려내는 방법은 다양한데, 가장 좋은 것은 주 민등록번호를 구별인자로 삼아 동일인을 가려 내는 방법이다. 하루 입력을 마치면 자료를 검 수하여, 입력과정에서 발생한 오류가 있었는지 를 검토하는 것이 좋다. (다) 분석자료를 부단히 갱신하라 자료를 분석하고 정리하는 것은 일선 보건소 요원에게는 다소 벅찬 일이 될 것이다. 그러나 현재 어느 집단에서 환자가 발생되고 있으며, 일자별 환자 발생의 양상이 어떠한가, 어떤 요 인에 의하여 발생된다고 의심되는가 등 기초 자료를 분석하는 것은 원인규명 및 방역활동 수행이 반드시 필요한 자료가 된다. 그러므로 기회가 있는 대로 자료를 분석하여 조사본부의 판단을 돕도록 하여야 한다. 자료의 분석은 조 사본부 요원의 지도를 받아 수행한다. 마. 행정보조팀 (1) 수행업무 행정보조팀은 역학조사과정에서 연관을 가지 게 되는 각 기관에 대한 협조업무(협조공문 발 송, 일정관리 등)를 담당하며, 자료취합 및 전 달역할, 법정전염병 확진자 관리, 격리자의 입 퇴원 관리, 효율적 역학조사 수행을 위한 각 팀 간의 의사전달 창구 역할 등을 담당한다. 보건 소의 방역담당(예방의약계, 방역계등) 직원이 적당하다. (2) 업무수행 시 유의점 행정보조팀은 가장 복잡한 업무를 가지는 팀 이다. 공문발송에서, 입 퇴원까지의 모든 크고 작은 행정처리들이 행정보조팀을 통하여 이루 어지므로, 자신의 업무를 명확히 파악하여야 하 며 적절한 시기에 능동적으로 이룰 수행하여야 한다. 행정보조팀은 역학조사서 및 여러 보고양 식의 흐름을 관리하여야 하므로 이를 숙지한다. 행정보조팀에서는 하루 중 일어나는 업무 및 자료흐름에 대하여 작업 흐름도를 만들어 활용 하면 매우 효율적이다. 행정보조팀은 다음과 같 은 사항에 주의한다. (가) 업무의 흐름을 효율적으로 정리하라 행정보조팀은 각 팀에서 입수되는 자료를 취 합하여 다음 과정으로 넘기는 정리 역할을 담 당하게 되므로, 하루 중 접수되는 자료량에 대 하여 알고 있어야 하며, 언제 어느 시기에 자료 가 처리되는 지를 파악하여야 한다. 특히 현장 에서 돌아온 자료수집팀이 자료를 전달할 대상 을 찾지 못하거나, 자료취합을 게을리 하여, 자

44 Ⅰ. 연구보고 33 료입력요원에게 넘기는 시간이 늦어지는 것은 금물이다. (나) 확진자, 입 퇴원자 관리를 철저히 하라 1종 법정전염병 환자는 격리를 원칙으로 하 기에 환자들은 어느 정도의 신체적 불편함을 감수 하여야 한다. 그러나 격리에 대한 일반적 정서는 좋지 못하며, 국가에서도 재원기간동안 치료비를 부담하게 되므로, 환자가 완전히 세균 학적으로 음전되었고(3회 반복검사), 더 이상 치료의 필요성이 없다면 격리를 해제 하여야 한다. 그런데 여러 업무 때문에 격리의 해제를 위한 세균학적 시험 시기를 잊어버리게 되면, 재원기간은 그에 비례하여 늘어나기 때문에 환 자들의 불편이 가중되고, 불필요한 국고의 손실 도 뒤따른다. 그러므로 확진환자들이 어느 시기 에 검사를 받아야 하는지를 파악하여 격리병원 에 통보 하여야 한다. 확진자 관리를 위해서는 확진자 관리대장 을 만들어 사용하면 이와 같 은 실수를 피할 수 있다. 바. 방역 홍보팀 방역 홍보팀은 역학조사 기간동안 필요한 방 역조치 및 홍보활동을 담당한다. 특히 세균성 이질과 같이 위생관리가 중요한 질환은 적극적 인 위생관리 홍보가 필수적이며 유인물, 유선방 송, 현수막 등이 활용될 수 있다. 홍보요원에 대한 특별한 기준이나 자격요건은 없다. 약간의 훈련으로 누구나 요원이 될 수 있으며, 보건소 요원 이외에 동, 면사무소의 직원이 되어도 무 방하다. 적극적인 홍보를 위하여 마을 부녀회, 청년회 등의 조직과 접촉하는 것도 방법이 된 다. 구충 관리가 필요한 경우는 기존에 운영하 던 방역 소독 관리체계를 준용한다. 방역홍보팀은 일반주민 또는 홍보대상에게 명확히 홍보내용을 전달하는 훈련이 필요하다. 홍보요원은 주민들에게 과장되거나 불필요한 공포심을 주어서는 안 되며, 개인 위생관리를 위하여 필요한 사항을 정확히 전달하여야 한다. 2. 현지 역학조사 수행 방법 가. 유행의 발생과 크기에 대한 인식 현지 역학조사에 있어 질병발생의 상황을 명 확히 파악하는 것은 중요하다.역학조사는 환자 발생이 유행적 경향을 가지고 있는지, 그렇지 않은지의 구별부터 시작된다. 그러나 어떤 지역 사회에서의 질병발생 수준에 대하여 유행여부 를 판단하는 것은 쉬운 일이 아니다. 왜냐하면 첫째, 현재의 질병발생의 측정에 많은 노력이 소요되며, 둘째 현재의 질병발생을 비교할 과거 의 자료가 체계적으로 정리되어 있어야 하기 때문이며, 셋째 유행 또는 집단 발생은 토착성 발생 수준 이상의 환자 발생을 의미하는데 유 행판정에 대한 경계구분이 어렵기 때문이다. 그 렇지만 현재의 유행수준을 가늠할 수 있어야 지역사회기 처한 현실을 올바르게 인식할 수 있으며, 투입이 필요한 방역사업의 내용을 결정 할 수 있기에 보건소 요원들은 최선을 다하여 현재의 상황을 판단해야 한다. 지역 보건 공무원들은 평소 예상되는 것보다 더 많은 질병이 발생하고 있다는 사실을 감으 로 알게 된다. 검사실 확진이 없어도 지역의 의 사가 보고하는 환례가 증가하면 조사할 충분한 증거가 된다. 인위적인 요소로 인해 질병 보고건수의 증감 이 있을 수 있음을 알고 있어야 하는 데, 지역의 보고 체계의 변화, 지역 또는 전국적인 의식의 변화 때문에 특정 질환에 대한 관심의 증가, 지 역에 새로 온 의사 또는 새로 생긴 크리닉, 또는 진단 방법의 변화 등이 요소가 될 수 있다. 때로는 유행의 존재를 신속하게 증명할 수 없는 경우가 있다. 이럴 경우 신속한 평가를 위 해 학교나 공장의 결석 또는 결근 기록, 병원 외래 방문 및 입원 기록, 검사실 기록, 사망 신 고서 등을 참고할 수 있다. 개업 의사들에게 간 단히 전화로 실태조사를 실시하면 유행의 존재 를 시사하는 증거를 얻을 수 있다. 이 경우 특 정한 진단명을 물어서는 안 되고 증상과 징후 를 물어 보아야 한다.

45 34 국립보건연구원보 만일 매년 병의원 자료의 수집을 통하여 질 병발생 상태를 감시 할 수 있다면, 무엇보다 좋 은 자료로 활용될 수 있다. 누적된 자료가 없는 상태라면, 전년도의 자료, 혹은 수개월 전의 자 료와 비교하여 유행판단의 여부 및 크기를 가 늠할 수 있지만, 장기간의 추이관측은 되지 못 함을 유념하여야 한다. 다음 그림은 1998년 군에서 수행한 세균 성 이질역학조사의 설사환자 발생곡선이다. 이 그래프는 1997년과 1998년의 병원환자 진료기 록부를 통하여 수집된 자료를 바탕으로 한 것 인데 1998년 6월 이후 1997년의 경우보다 설 사환자 진료빈도가 높다. (명) /1 5/8 97년 98년 5/15 5/22 5/29 6/5 유행발생 및 크기에 대한 평가를 수행할 때의 주의(검토)사항 6/12 - 환례의 정의는 마련되어 있는가? - 환례의 정의 가 모든 환자들에게 동일하게 적용 되었는가? - 일상적 발생수준을 넘는가? 넘는다면 어느 정도 의 크기인가? - 유행의 범위는 어떠한가?(발생지역, 범위 등) 나. 환례의 정의 및 환례 색출 질병에 따른 검사결과를 임상진단과 비교하 여 환례를 정의하고 각 환례가 동일 질환인지 를 확인한다. 환례는 가장 단순하면서도 객관적 으로 정의되어야 한다(즉 발열, 폐렴의 방사선 적인 증거, 척수액의 백혈구, 일일 배변 수, 대 변의 혈액, 피부 발진 등). 환례 정의 시 아래 사항이 고려되어야 한다. - 질병특유의 또는 강한 질병의 임상적 징후 6/19 6/26 7/3 7/10 7/17 7/24 7/31 나 증상은 무엇인가? - 어떤 검사법이 쉽고 실용적이며 믿을 만한가? - 환자들과 위험군에는 얼마나 접근성이 있는가? - 긴 추적조사를 요구하는 경우에는 환례정의 가 쉽게 적용가능하고 현재 연구팀의 구성 원이 아니 다른 사람들에게서도 일관성 있 게 적용이 될 수 있는 정의는 무엇인가? 환례는 임상적 진단 기준에 따라 정해야 하고, 이때 시간적 특성(time), 공간적 특성(place), 인 적 특성(person)에 대한 제한이 필요하다. 검사 실 검사에서 원인 병원체가 동정된 사람을 환 자 로 하고, 검사실 검사가 진행 중이거나 검 사결과 원인 병원체는 동정되지 않았으나 임상 양상이 환례 정의에 부합되고, 역학적(시간적, 공간적, 인적) 특성이 확진자와 연관성이 있는 사람을 의사환자 로 한다. 환례 색출의 방법은 문제의 질병과 지역사회 환경에 따라 상당히 달라질 수 있다. 대부분의 폭발적인 발생은 명백하게 색출 가능한 위험에 처한 그룹을 대상으로 하기 때문에 환례 색출 이 비교적 자명하고 쉬울 것이다. 일부 의사, 병원, 검사실, 학교 또는 사업장과 적극적이고 직접적으로 접촉하거나 또는 대중을 상대로 공 지함으로써 대부분의 남아있는 보고되지 않은 환례를 색출할 수 있을 것이다. 때로 의사, 전 화, 가정 방문, 또는 배양이나 혈청학 조사와 같은 좀더 철저한 노력이 필요할 수도 있다. 단순히 환례 수를 안다고 해서 적절한 정보 를 제공해 주지는 않는다. 환자의 특성뿐만 아 니라 감염원과 전파방법에 따라 통제와 예방 조치가 달라진다. 그러므로 환례 색출 시 유행 의 자연사에 대한 증거 또는 단서를 제공할 가 능성이 높은 관련특성에 대한 자료를 얻어야 한다. 먼저 환자의 연령, 성별, 거주지, 직업, 발열일 등에 대한 자료를 수집하여 유행의 기 본적인 측면을 정리한다. 다음으로 관련 징후, 증상, 검사실 자료를 모은다. 만약에 조사 중인 질병이 수인성 또는 식품 매개 질환이면 여러 가지 물과 식품 감염원에 노출된 경험을 묻는

46 Ⅰ. 연구보고 35 다. 만약 대인 전파가 의심되면 개인적인 접촉 의 빈도, 기간, 성질에 대해 질문한다. 만약 질 병의 성질을 모르거나 또는 추정할 수 없을 경 우, 질병 전파와 위험에 대한 다양한 질문을 던 질 필요가 있을 것이다. 만약에 처음 자료 분석 이 도움이 되지 않을 경우 다시 면접 조사를 해야 할 가능성이 있다는 것을 항상 염두에 두 고 마음의 준비를 해 두어야 한다. 다. 역학조사와 표본추출 방법 일반적인 보건소의 역학조사에서는 좀처럼 사용되지 않는 경우이지만, 지역사회의 보건현 황 또는 유병현황을 적극적으로 파악할 목적으 로 수행하는 경우 표본 추출을 통한 연구가 활 용될 수 있으므로 역학조사 수행 시 사용되는 원칙을 간략히 언급하고자 한다. (1) 표본 수의 결정 역학조사 수행에 있어 표본수의 결정은 대상 집단의 유병률 또는 검사결과의 양성률(예 : 혈 청검사시 항체양성률) 등을 고려하여야 한다. 왜냐하면 극히 유병률이 낮은 질환에 대하여 지나치게 적은 수의 표본검사를 수행할 경우, 유병상황을 아예 측정조차 할 수 없을 수도 있 으며 지나치게 많은 표본을 사용할 경우 비용 편익적이지 못하기 때문이다. 일반적으로 표본 수의 결정에는 다음의 사항이 고려된다. (가) 허용 표본오차(Sampling variability) 표본의 수가 커질수록 표준오차는 작아지므 로 표본의 수가 커지면 커질수록 좋으나 경비 의 문제, 조사의 한계 등으로 인하여 표본의 수 를 무한히 늘릴 수는 없기에 적절한 허용 표본 오차의 결정이 필요하다. 실제 역학조사 집단 전체에 대한 유병상황, 병원체 검사의 정확도 등이 거의 존재하지 않으므로 pilot study 를 통하여 대략적인 상황을 파악함이 바람직하다. 추정된 표본오차, 표본비율의 변동 등과 여건 상 현실적으로 접근 가능한지의 여부를 파악하 여 적정한 수준에서 표본의 수를 결정한다. 즉 이렇게 계산되는 목적이 표준오차를 감소시키 기 위하여 최소한 필요한 표본의 수의 의미로 파악하여 한다는 것이며 검정하고자 하는 가설 의 여건이 모두 다르고, 경비의 문제, 실험의 한계 등에 의하여 표본수를 제한하여야 할 경 우는 이를 따로 고려해야 한다. (나) 요구하는 신빙성의 정도 어떤 확률수준에서의 신빙도를 정할 것인가 를 (확률수준 0.05, 0.01 등) 결정 (2) 표본의 대표성 획득을 위한 표본추출법 및 전략 표본의 추출방법에는 여러 가지가 있으나 표 본추출의 원칙은 대상 집단을 대표할 수 있는 표본이 되어야 한다는 것이다. 그러므로 대상 집단을 대표할 수 있는 표본 집단은 확률표본 추출법, 즉 대상 집단을 구성하고 있는 개개 구 성원이 표본으로 뽑힐 확률이 똑같다는 것이 전제가 되어야 한다 확률표본추출에는 다음과 같은 방법이 있다. (가) 단순무작위 추출(simple random sampling) (나) 계통추출(systematic sampling) - 처음숫자를 무작위추출방법으로 결정 하고, 이 숫자로부터 계통적으로 표본 단위를 뽑는 방법 (다) 층화무작위추출(Stratified random sampling) - 연구내용에 가장 영향을 크게 미친다 고 예상되는 변수를 선정하여 이들을 층화시켜 각 층별로 무작위추출하는 방법 (라) 집락표본추출(Cluster random sampling) -표본단위가 큰 덩어리로 되어 있을 때 이 들 집락을 추출단위로 무작위 표본추출 (마) 다단표본추출 (Multi-stage sampling) - 무작위추출방법을 큰 단위에서 작은위 로 내려가는 여러 단계에서 이용 전염병 역학조사의 경우, 일반적인 조사와는

47 36 국립보건연구원보 달리 우리나라 사람의 전염병에 대한 기피현상 에 비추어 볼 때 누구나 쉽게 조사에 응하는 것은 아니다. 따라서 표본추출 방법에 관계없이 항상 조사 미참가자의 특성에 의한 표본의 비 대표성이 존재하지 않는지 확인하여야 한다. 이를 위하여 Pilot study를 수행하여 미참가 집 단의 특성을 파악하고 이를 추출단계에서 응용 함이 바람직하다. 라. 역학조사서(설문조사표) 제작시 유의사항 역학조사서(설문조사표)는 역학조사 시 획득 되는 정보의 대부분을 결정하므로 신중히 제작 해야 한다. 꼭 필요한 정보가 누락되는 경우 설 문조사를 다시 수행하여야 한다. 1 역학조사서는 형식이 고정되어 있는 것이 아니므로 상황에 맞는 역학조사서를 작성 해야 한다. 2 꼭 포함되어야할 기본적인 자료(인구학적 변수)가 들어가 있어야 한다. - 시간, 장소, 사람에 대한 기본정보 - 성명, 연령, 주소, 주민등록번호, 전화번호, 학교집단발생의 경우 학년, 반, 번호 3 보건요원이 면접설문할 것인지 응답자가 직 접 작성할 것인지에 따라 다르게 작성해야 한다. 4 자기 기입식 설문 제작 시 대상자의 학력, 보건학적 상식, 참여욕구 등을 고려하여 질 문의 난이도 수준 및 어투를 결정해야 한 다. 애매모호한 질문이나 중복질문 피하며, 가능한 글자를 크게 하고 종이의 여백도 넉넉히 하는 것이 좋으며, 지나친 욕심으로 너무 많은 설문이 되지 않도록 유의해야 한다. 5 되도록 객관식으로 작성해야 한다. 환자의 증상을 설문할 경우, 환자가 호소하는 증상 을 있는 그대로 설문지에 적는 것보다, 가 능한 증상을 일정하게 나열한 후 예/아니오 로 답하게 한 후 설문조사서에 없는 증상 내용만 따로 기입하게 하는 것이 자료의 활용을 위하여 효율적이다. 마. 유행자료의 수집 및 분석 유행자료의 수집 및 분석은 역학조사의 준비 단계에서도 수행되었던 기초조사를 심화하는 것이라 할 수 있다. 역학조사서, 병의원 진료기 록, 병리검사서, 학교의 출결상황, 보건소 모니 터링 자료, 환경가검물 분석자료 등 입수 가능 한 자료원을 종합하여 시간적, 공간적, 인적 특 성을 분석한다. 시간적 자료를 통하여 환자발생 의 빈도를 일별 또는 기간별로 정리한 유행발 생곡선 (Epidemic curve)를 구함으로서 유행의 양상과 2차,3차 전파의 전파양상, 폭로시기, 잠복기, 추정감염모형 등을 도출할 수 있으며, 공간적(지역적)자료, 인적자료 등을 통하여 감 염원 및 위험요인, 집적성 등을 알 수 있다. 유 행자료를 총체적으로 수집하여 분석함으로서 감염원에 대한 추적을 수행하고, 효율적인 방역 관리 대책을 수립할 수 있다. (1) 시간 y축에 환례 수, x축에 적절한 시간 간격으로 질병의 발병시간을 나타내는 유행 곡선을 그려 서 환례의 특징을 살펴본다. 이러한 유행곡선은 유행의 크기, 가능한 전파양식, 유행의 기간 등 에 대한 귀중한 정보를 제공한다. 환례를 단순 하게 나열하는 것보다 훨씬 더 많은 것을 알려 준다. 질병의 발병 시기를 간단한 그림으로 표 현하면 많은 정보를 추론할 수 있다. 질병의 잠 복기가 알려져 있다면 단일감염원 노출, 대인 전파 또는 이들 둘의 혼합형의 가능성에 대해 비교적 확실한 추론을 내릴 수 있다. 그리고 반 대의 경우 노출이 일어난 시점을 알게 되면 잠 복기를 알 수 있다. 이것은 특히 어떤 질병이 유행인지 모를 경우 중요한 정보이다. 또한 유 행이 진행 중일 때는 앞으로 있을 환자 발생 수를 예측할 수 있다. 마지막으로 유행곡선은 유행의 성질과 규모를 이해할 필요가 있는 전 문가가 아닌 사람들과 의사소통을 하는데 아주 좋은 소품이 될 수 있다.

48 Ⅰ. 연구보고 37 (2) 장소 때때로 질병은 독특한 장소에서 발생하거나 질병을 얻을 수 있는 데, 이 경우 시각화하면 인자의 원천과 노출의 성격에 대한 중요한 증 거를 얻을 수 있다. 물 공급, 우유 배달 경로, 하수 처리 유출, 일반적인 풍향, 빌딩 내의 공 기 유통 양상, 병원 매개 곤충의 생태적 서식지 등은 미생물 또는 환경적인 병원체 전파에 중 요한 역할을 하고 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상자를 알아내는 데 중요한 역할을 한다. 환 례를 지리적으로 그리면 분포 양상을 보고 노 출의 감염원과 경로를 추정할 수 있어 매개체 또는 전파 양식을 찾는 데 도움이 된다. (3) 사람 마지막으로 연령, 성별, 인종, 직업 등 환자의 특성을 조사해야 한다. 만약에 어떤 특성이 드러 나면 위험에 처한 그룹에 대한 단서를 제공해 줄 수 있으며, 특정한 노출에 대해서도 감을 잡을 수 있는 경우가 있다. 사람의 특성에 대한 조사 는 거의 끝이 없으나, 문제의 질병에 대해서 더 많이 알수록 좀 더 특이하고 연관된 정보를 더 많이 찾을 수 있으므로, 이들 위험 또는 노출이 질병과 관련성을 가지는지를 알 수 있다. 바. 지역학조사 자료의 기술 (1) 유행곡선의 작성 적당한 시간 간격(x축)을 사용하여 병의 발 병일자별 환자수(y축)를 그래프로 그림 유행곡선 은 유행규모, 전파경로, 유행지속 기간을 알 수 있게 해줌 질병의 잠복기가 알려진 경우 감염원에 노 출된 시간을 측정할 수 있음 유행이 진행 중이라면 얼마나 더 많은 환 자가 발생할지를 예측할 수 있고 유행곡선 은 비역학자, 행정관, 유행의 자연사와 규 모의 이해가 필요한 사람들과의 대화준비 에 훌륭한 지침이 됨. (가) 단일 감염원에 의한 발생 환자수 발생일 <일별 환자발생수 분포 - 단일봉 곡선> 위 그림의 경우 최초 환자는 12일에 발생하 였으며, 16일에 가장 높은 발생을 나타내었다. 발생은 24일까지 계속하여 약 열흘에 걸쳐 일 어났다. 이러한 유행은 단일봉 형태로 동시에 하나의 감염원에 의해 감염된 경우에 해당된다. 12일 발생한 환자의 경우는 잠복기가 가장 짧은 경우이며, 24일 발생한 환자는 가장 긴 경 우에 해당된다. 예상 가능한 감염원을 알 수 있 다면 질병의 잠복기간을 통하여 어떤 질병인지 를 추측할 수 있을 것이다.

49 38 국립보건연구원보 (나) 연속적인 감염원에 의한 발생 환자수 발생일 <일별 환자수의 분포- 지속적인 감염원에 의한 전파> 위 그림은 지속적으로 오염된 식수나 오염된 식료품을 취식하는 경우처럼 연속적인 오염(감 염)원에 의해 발생하는 경우에 해당된다. 지역사회에서 오염된 지하수를 마을 주민이 공동으로 섭취하는 경우 이와 같은 유행양상을 나타낸다. (다) 사람-사람으로 전파되는 유행발생 환자수 발생일 <일별 환자수의 분포 - 사람-사람 전파> 위 그림은 10일에 발생한 환자에 의해 15-17일 사이에 발생한 환자는 감염되었을 것 이며, 그리고, 21-25일 사이에 새로이 발생한 환자들은 15-17일 사이에 발생한 환자들에 의 해 감염되었을 것이다. 질병이 약 7일 전후 간격으로 파생되었으나, 한 군이 끝나면 다음 군으로 전염되는 유행양상을 보인다. 호흡기 전 염병의 경우 위와 같은 유행양상을 보인다. (2) 발병률의 계산 발병률은 감염원에 폭로된 사람 중 감염된 사람의 %이다. 분자는 기간 내에 발생한 환자 수이고 분모는 특정기간동안 감염원에 폭로된 사람이다. 새로 발병한 환자수 = % 감염원에 폭로된 사람 500명의 초등학교에서 유행성이하선염 유행 이 발생하여 50명의 유행성이하선염 환자 발생 시 발병률은 환자수 50 = = 10.0%이다. 학생수 500 성별, 연령별, 성 및 연령별, 장소별, 음식섭 취군과 비섭취군의 발병율을 구할 수 있다. (3) 교차비와 상대위험비 계산 교차비와 상대위험비는 특정 감염원에 폭로 되지 않은 군에 비하여 특정 감염원에 폭로된

50 Ⅰ. 연구보고 39 군의 질병발생 위험이 몇 배 증가하였나를 의 미를 가진다. 상대위험비는 감염원에 폭로된 군 의 발병율을 비폭로군의 발병률로 나눈 것으로 1보다 크면 감염원에의 폭로가 위험을 증가됨 을 의미하고, 1이면 감염원에의 폭로가 위험을 증가시키지 않음을, 1보다 작으면 감염원에 폭 로된 군보다 비폭로된 군이 더 위험이 큼을 의 미한다. 감염유무 감염원 환자(감염) 비환자(비감염) 계 폭로 a b a+b 비폭로 c d c+d 계 a+c b+d a+b+c+d 상대위험비= a/(a+b) c/(c+d) =폭로군의 발병률/ 비폭로군의 발병률 어느 환갑 잔치에서 음식을 먹은 손님들에게 서 식중독이 발생하였다. 이에 역학조사반이 회 갑연에 참석한 주민들을 대상으로 조사를 벌인 결과 잔치 음식을 먹은 사람들에 대한 다음과 같은 결과를 얻었다고 가정하면, 특정 음식을 먹은 사람 수 특정 음식을 안 먹은 사람 수 환자 정상 합계 % 환자 정상 합계 % 쌀밥 피조개 삶은 문어 쌀밥의 상대위험비는 0.67( 62/(62+31) )이 2/(2+0) 고, 피조개는 5.01( 63/(63+25) ), 삶은문어는 1/(1+6) 0.89( 50/(50+26) )이다. 피조개를 섭취한 군에 14/(14+5) 서 섭취하지 않은 군에 비하여 식중독 발생 위 험비 5배였다. 그러므로 피조개를 위험인자로 해석할 수 있다. 사. 가설 설정 및 검정 유행 역학조사에 있어서는 가설의 설정이 무 엇보다도 필요하다. 설정된 가설은 가설이 적용 될 인간집단의 특성, 검증하고자 하는 원인의 특성, 원인이 작용하여 발생하리라 기대되는 질 병의 특성, 원인 작용으로부터 질병 발생까지의 추정시간, 양-반응관계 등이 명시되어야 한다. (1) 가설 유도요령 가설의 유도요령은 크게 공통성 법칙, 차이성 법칙, 동시변화성 법칙, 동류성 법칙에 의거한다. (가) 공통성 법칙(method of agreement) 조사하는 현상의 2개 혹은 그 이상의 예에서 어떤 단일 상황이 공통적으로 존재할 때 이 상 황이 원인일 수 있는 가능성이 있다는 논법이다. (나) 차이성 법칙(method of difference) 연구대상 사건이 발생한 집단과 발생하지 않 은 집단을 비교할 때 모든 상황은 공통적으로 존재하고 한가지 상황만 다를 때 이 한 가지 다른 상황을 그 사건 발생의 원인이라고 추정 하는 방법이다. (다) 동시 변화성 법칙 (method of concomitant variation) 어떤 사상( 事象 )이 다른 사상의 변동에 따라 변화할 때 이들은 서로 인과관계를 가지고 있 을 가능성이 있다는 가정이다. 이것은 어떤 사 상의 양이 증가할 때 다른 사상의 양도 증가 또는 감소하는 현상, 즉 양-반응관계(doseresponse relationship)를 의미한다. 이는 통계 적 연관성일 수도 있고, 더 나아가서는 어떤 사 상의 질과 양을 변화시켰을 때 다른 사상의 질 과 양도 따라서 변동하는 역학적 의미에서 인 과관계인 원인적 연관성일 수도 있다. 따라서 원인에 관한 가설설정에서 이런 관계는 가장 강력한 원인인자가 된다. (라) 동류성 법칙(method of analogy) 원인이 알려지지 않은 어떤 질병의 자연사와 병리학적 소견 그리고 역학적 특성이, 이미 원 인이 알려진 질병과 비슷할 때는 이 질병의 원 인도 잘 알려진 질병의 원인과 비슷할 것이라

51 40 국립보건연구원보 는 논법이다. (2) 가설 설정 역학적 특성을 기술하기 위한 과정에서 얻은 정보를 토대로 가장 가능성이 높은 병원체, 병 원소, 전파양식 등에 대한 가설을 세운다. 가능 성이 높은 가설이란 대부분의 환례 발생이 설 명되어야 한다는 전제를 의미한다. 때로는 가설 로 설명이 불가능한 예외적인 환례가 있을 수 있는데 이때는 원래 있어 왔던 토착성 환례, 진 단이 잘못되었을 경우, 가설로 설정한 감염원 이외의 또 다른 감염원이나 전파양식 등의 세 가지 가능성을 고려하여야 한다. (가) 병원체 병원체는 검사실 소견에 의하여 정확한 진단 을 내릴 수 있다. 그러나 진단을 모른다면 진료 한 의사와 상담, 환례의 증상 및 징후를 통하여 잠정적인 진단을 정하고 역학조사를 진행하여 야 한다. (나) 병원소 병원소는 대개 현증 감염자, 불현성 감염자, 만성 보균자이며, 인수공통전염병인 경우는 동 물병원소이다. 역학조사에서 병원소를 찾아낸다 는 것은 매우 힘들다. 이들 병원소인 현증 감염 자나 불현성 감염자는 역학조사를 실시할 때는 이미 완치되거나 조사대상에 포함되지 않는 경 우가 많다. (다) 감염경로 전파양식은 직접전파와 간접전파로 구분할 수 있다. 직접전파는 사람간 접촉에 의한 전파 를 의미하며 간접전파는 매개물에 의한 것이다. 공동매개체에 의한 경우는 역학조사를 통하여 파악할 수 있는데 대개의 공동매개체는 음용수 또는 식품이 해당된다. 음용수에 의한 경우는 직접 마시는 것 뿐만 아니라 음식조리에 사용 되거나, 식기를 오염시켜서도 질병을 유행시킬 수 있다. 환자의 일별 분포로 그려낸 유행곡선으로부 터 감염원의 특성, 즉 단일폭로 혹은 연속폭로 에 의한 것인지, 아니면 사람과 사람의 접촉에 의한 전파인지 매개곤충에 의한 전파인지 대개 는 짐작이 가능하다. 랩토스피라증과 같이 특 수한 환경에 노출되었을 때만 감염되고 -사람 전파가 없는 경우나 곤충 매개인 경우는 산발 적인 발생양상을 보인다. 음용수 또는 식품에 의한 전파일 경우는 섭취군과 비섭취군에서 발 병률을 비교하여 판단할 수 있다. 그러나 교차 오염이 있었을 경우는 특별한 음식물이 드러나 지 않을 수 있으며, 설문조사의 한계, 발병에 개인차가 있다는 사실을 알아야 한다. 음식이 남아 있을 때는 이를 시료로 원인균 분리를 시 도한다. 때로는 의심되는 음식을 먹은 군과 먹 지 않은 군을 구분해서 각 군에서의 발병률을 검증하는 코호트 조사방법을 활용하기도 한다. 이때 유의할 것은 음식물이 서로 섞이거나 기 억이 정확하지 않을 경우도 있고, 또는 숙주의 특성 등으로 그 음식을 먹었는데도 발병을 안 하거나, 안 먹었는데도 발병하는 사람이 있을 수 있다는 사실을 이해해야 한다. (3) 가설 검정 질병의 임상적, 실험실적, 역학적인 특성을 면밀히 관찰하고, 질병을 유발시킬 수 있다고 추정되는 원인에 환자군과 대조군이 노출된 빈 도의 차이를 비교해야 한다. 만약에 환자군과 대조군 사이에 노출력이 유의하게 다르지 않다 면 새로운 가설을 설정하여야 한다. (4) 가설을 밝혀진 기존의 사실과 비교 검정된 가설이 임상적, 실험실적, 그리고 다 른 역학적인 사실과 일치하는지를 비교해 보아 야 한다. 즉 제안된 노출, 전파 양상, 대상자가 원인 질병의 일반적인 상황과 잘 일치하는가에 대한 검정이 필요하다. 예를 들어 위장관염 유 행에서 분석 결과 포도알균의 성장과 장독소의 생산을 지지해 주는 고단백 저산의 음식(예 버 섯)을 오염원으로 찾아냈다면, 이는 일반적인 포도알균 식품중독과 잘 일치한다. 그러나 분석

52 Ⅰ. 연구보고 41 결과 커피나 물이 원인으로 나타난다면, 포도알 균 장독소가 감염원으로써 가능성이 거의 없어 진다. 이 경우 결과를 재평가하고 좀 더 많은 정보를 수집하고 임상적인 진단을 재고려하고 새로운 가설을 설정하고 검정해야 할 것이다. 아. 현지 역학조사 시 반드시 해야 할 일들 매일 정해진 시간에 보건소장 이하 전 직 원이 참석하여 우선순위에 따라 조사를 진행하고 그 진척도를 확인한다. 타 기관과 협조가 필요한 경우 시 군 구청장 또는 부시 군 구청장, 경찰서장, 학교장, 원장(유치원, 학원 등), 의사회장, 약사회장, 요식업 협회장 등을 포함하여 회의를 개최하여 공식적인 협조를 구한다. 가검물은 반드시 직원이 직접 검사하도록 한다. 환자 스스로 검체를 채취할 경우 실 제 환자이지만 음성으로 판정되어 추가 환자 발생을 야기할 수 있다. 보존식, 음용수 등 환경가검물에서 원인균 을 검출하지 않으면 인과관계를 역학적으 로 추정할 수밖에 없으므로 인지 즉시 가 능한 환경가검물을 빠짐없이 수거하여야 하고, 음용수가 의심이 될 때는 2~3차례 추가검사를 시행한다. 조사결과에 따른 이해관계가 있을 경우 의도적인 비협조가 있을 수 있으므로 원 인과 관련될 것으로 추정되는 사람의 진 술은 현장에서 일대일 면접을 통하여 듣 고 3자에게 확인하는 것이 필요한 경우가 있다. 가설이 맞다면 모든 조사 결과를 논리적 으로 설명할 수 있다. 역학조사는 개인이 할 수 있는 것이 아니 라 여러 팀이 각자 역할을 충실히 하였을 때만 가능하다. 각자의 업무만을 고집하기 보다는 역학조사반의 반원으로서 상호간 에 돕는다면 더욱 빠른 시간 내에 종결할 수 있다. 자. 방역활동 역학조사의 목적은 전염병의 만연을 방지함 으로써 피해를 최소화하는 것이므로 신속성이 요구 된다. 그러나 현실에 있어서 이 원칙은 들 어맞지 않는 경우가 대부분인데, 그것은 질병 발생 감시체계 수립으로 유행의 기미가 보일 때 역학조사를 해야 그 발생을 최소화할 수 있 음에도 불구하고, 이미 유행이 극성기를 지나 수그러지기 시작할 때쯤에야 여론에 밀려 역학 조사가 겨우 이루어지기 때문이다. 어떤 상황에서든 방역은 당시의 가장 앞선 지식에 근거를 두고 가장 효율적인 방법을 선 택해서 계속 새로운 지식이나 사실이 얻어지는 대로 여기에 상응되는 방역활동이 신속히 수행 되어야 한다. 차. 문서 보고 다음과 같은 이유로 가능한 빨리 조사내용을 기록해야 한다. 먼저 보고서는 전염병 관리를 위한 자료를 제공해 줄 수 있다. 수행한 조사 횟수 및 사용 된 시간과 자원은 보건 문제의 크기, 질병 추세 의 변화, 통제 및 예방을 위한 노력의 결과를 기록일 수 있다. 의학적 법적 행위과 관련된 기 록은 소비자, 의사, 또는 지역과 주의 보건과 공무원들에게 절대적으로 값어치 있는 것으로 판명될 수 있다. 글로 기술하고 자료를 서술적으로 기술하는 과정에서 새로운 사고 과정을 낳게 되고 연관 성을 더 잘 알아차리게 된다. 실시한 내용과 얻 은 결과를 기록하는 과정을 통해 조사 기간 중 어느 정도 고려는 하였으나 특별히 추구하지 못한 사실과 사건을 발견하기도 한다. 제2장 역학조사서 개정 말라리아, 성홍열 및 브루셀라 역학조사서를 개정하고, 2군전염병에 추가된 수두 역학조사 서를 개발하였다. 외국인을 위하여 외국어로 수 인성 식품매개질환 역학조사서를 만들었다.

53 42 국립보건연구원보 1. 말라리아 역학조사서 말라리아 역학조사서 말라리아 역학조사서에는 말라리아 진료 사 유에 증상(오심 구토, 전신쇠약감)을 추가하고, 말라리아 과거력 항목에 진단명(삼일열, 열대 열, 사일열, 난형열)을 추가하였으며, 말라리아 예방약 복용 여부에 예방약 종류(클로로킨, 프 리마킨, 독시사이클린, 메플로킨, 말라론, 기타) 를 추가하였다. 또한 헌혈 수혈 란에 장기이식 항목과 이유를 추가하였다. 역학조사결과를 바 탕으로 역학조사원이 의심되는 감염 경로를 추 정하게 하였다. 또한 말라리아 합병증 여부 및 치료약제 등도 조사하게 하였다. 2. 성홍열 역학조사서 성홍열 및 성홍열 유사증 역학조사서 에서는 가족관계와 발병여부에 대한 조사를 추가하였 다. 조사 대상 동반 증상(가래, 구토, 설사, 결 막충혈, 피부낙설, 림프절비대, 편도비대, 편 도 인후삼출, 오한, 기침, 두통, 복통, 피로감, 가려움증, 인후출혈)을 추가하였으며, 환자 접 촉력, 입원력(입원병원 및 입원기간), 치료약제 및 용량, 합병증(중이염, 편도주위 농양, 폐렴, 패혈증, 골수염, 류마티스열, 급성사구체신염) 및 격리현황 등에 대한 내용을 추가하였다. 3. 브루셀라증 역학조사서 최근 브루셀라증 인체감염 사례가 증가하면 서 이에 대한 조사 필요성이 증가하였다. 이에 브루셀라증 역학조사서를 과거력, 임상증상, 직 업력, 환축노출력 등의 질문을 자세하게 바꾸는 방향으로 개정하였다. 직업력에 대한 질문에서 종사기간, 축종 등을 추가하였고, 과거 질병력에 대한 질문에서는 발 현기간, 의료기관 외래방문여부, 의료기관 입원 여부, 입원의료기관명 등을 조사하게 하였다. 또한 최근 2개월 내 발현한 증상에 대한 질문 에서는 증상발현시기, 의료기관 방문여부, 의료 기관 방문시기, 의료기관명에 대해 조사하게 하 였다. 목축과정에서 착유, 분만개조, 살처분 참여 등 환축과 접촉할 수 있는 작업에 참여하였는 지 조사하고, 작업 시 보호구(고무장갑, 면장갑, 고글 등) 착용 여부를 조사하도록 하였다. 유 산 불임인 소와 접촉여부를 조사하고, 접촉 시 보호구 착용 여부를 조사하였다. 분만 및 인공 수정 참여 시 개인 보호구를 착용했는지와 소 질에 손을 넣었는지를 질문하도록 하였다. 또한 피부에 상처가 있는 상태로 환축과 접촉했는지 조사하면서 접촉부위, 접촉일자 등을 조사할 수 있도록 하였다. 인근 농장에서 환축 발생여부를 조사하고, 인 근 농장에서 농기계나 농기구를 빌려준 적이 있는지도 조사하도록 하였다. 생유, 육회, 소태 반 등의 섭취시기, 섭취부위 등을 조사하게 하 였고, 유 사산된 송아지의 처리에 대해서도 질 문하도록 하였다. 그리고 외국 여행에 대한 질 문에서는 여행 시기, 국가, 가축접촉여부 등을 조사하도록 하였다. 축주에게는 별도로 환축발 생, 유산 불임인 소의 발생 등에 대하여 조사하 도록 하였다. 4. 외국어 수인성 식품매개질환 역학조사서 개발 최근 국내거주 외국인이 증가하면서 외국인 에 대한 설문조사의 필요성이 증가하였다. 이에 외국인을 위하여 영어, 불어, 서반어, 일본어, 중국어로 수인성 식품매개질환 역학조사서를 만들었다. 환자의 인적사항과, 임상증상, 식이 섭취 등을 외국어로 바꾸었다. 한국어와 외국 어로 된 설문지를 동시에 제작하여 역학조사 요원들이 외국어 설문지에 기입된 사항을 한국 어 설문지를 이용하여 쉽게 해석할 수 있도록 하였다. 제3장 현지역학조사 도구 개발 역학조사 과정에서 필요한 정보를 쉽게 획득 할 수 있도록 핸드북을 개발하고, 병원체 특성

54 Ⅰ. 연구보고 43 등을 별도로 정리하였다. 1. 수인성 식품매개감염병 역학조사 핸드북 개발 현장조사자가 현장에서 필요한 정보를 수록 한 수인성 식품매개감염병 역학조사 핸드북 을 제작하였다. 역학조사반의 임무와 출동시기, 출동 시 필요한 준비물 등을 명기하였다. 역학 조사 내용과 방역대책반의 구성과 역할 등에 대한 사항도 정리하였다. 한편 주요 세균성 및 바이러스성 장관질환의 임상적 특성을 표로 만 들고, 세균성이질, 장티푸스, 콜레라 등의 특성 은 별도로 정리하였다. 검체채취 시 유의사항도 정리하여 일반적 원칙, 검체의 보존 및 수송 방 법에 대한 정보도 수록하였다. 2. 식품매개 병원체의 원인식품과 병원체 특성 식품매개 병원체의 특성을 정리하여 현장역 학조사 시 활용할 수 있도록 하였다. 17종의 병원체에 대하여 후유증, 원인식품, 병원성, 치 사율 등을 정리하였다. 3. 통계처리용 전산프로그램 개발 현지 역학조사에서 Chi-제곱값, 교차비, 상대 위험비 등을 쉽게 구할 수 있도록 엑셀을 이용 한 전산프로그램을 만들었다. 아래 그림에서 2 2 표나 2 3표의 연두색 부분에 빈도를 입 력하면 자동으로 Chi-제곱값, 교차비, 상대위 험비 등이 계산되고 p-값과 95% 신뢰구간도 계산될 수 있도록 만들어 현장 역학조사에서 쉽게 활용할 수 있게 하였다. 제4장 전염병 관련 법령 검토 전염병예방법 제7조의4에 역학조사에 대한 규 정이 있다. 이 조항 및 전염병 관련 법령 조항 을 검토한 결과 다음과 같은 의견을 제시한다. 1. 현 전염병 예방법 검토 의견 환자나 접촉자 등이 역학조사에 반드시 응해 야 한다는 규정과 이를 위반할 경우 처벌 규정 이 없다. 따라서 환자나 접촉자가 역학조사 거 부 시 역학조사를 강제할 수 없다. 동법 제7조의4제3항에 행정기관, 관련 기관 시설 단체의 장이 역학조사에 협조해야 한다고 규정되어 있으나, 관련기관, 시설, 단체의 범위, 협조내용 및 협조거부 시 처벌규정 등에 대한 규정이 없어 민간기관이 협조를 거부할 경우 강제할 수 없다. 또한 역학조사반의 권한에 대한 규정이 있어 야 한다. 역학조사반원의 의무기록 열람 및 복 사 권한을 명시해야 한다. 의료법 제20조제1항 에는 의료법이나 다른 법령에서 규정된 경우를 제외하고는 환자의 의무기록의 내용 확인을 금 하고 있고, 동 법 67조에 위반 시 3년 이하의 징역 또는 1천만원 이하의 벌금에 처하도록 규 정되어 있다. 따라서 역학조사 시 의무기록을 확보하는 데 의료기관 등과 마찰의 소지가 있 을 뿐 아니라 의무기록 확보 자체가 위법의 소 지도 있다. 또한 역학조사 시 식품검체, 환경검 체, 종사자 검체 등 검체 수거 권한을 명시해야 한다. 현재 검체 수거의 법적 근거가 미약하여 역학조사 시 식품접객업소 등에서 검체수거를 거부할 경우 강제로 검체를 수거할 수 있는 법 적 권한이 없다. 2. 개선 의견 먼저 환자 및 접촉자가 역학조사에 반드시 응해야 한다는 의무규정과 불응 시 처벌 규정 이 있어야 한다. 둘째 관련기관 등의 협조범위 및 내용등이 명시되어야 한다. 셋째, 역학조사 반원이 의무기록을 열람복사하고, 검체를 수거 할 수 있는 법적 근거가 명시되어야 한다. 고 찰 기존의 역학조사방법을 검토하고 이를 토대 로 역학조사방법론을 개발하였다. 전염병 발생 을 인지하고 현장에 출동 전까지 기초정보수집

55 44 국립보건연구원보 과 자문회의를 통한 역학조사 전략수립은 성공 적인 역학조사를 위해 매우 중요하므로, 역학조 사반 출동 전에 충분한 정보수집 및 전략수립 이 필요하다. 이 연구에서 제시한 역학조사팀 조직안을 바 탕으로 전염병발생현황과 지역 보건소 역량에 맞는 역학조사팀을 구성하여야 한다. 역학조사 팀 구성 시 보건소 방역팀 뿐 아니라, 필요 시 보건소 전체 인력이 역학조사와 전염병 관리에 투입될 수 있어야 하고, 이를 위해 각 보건소에 서는 사전에 인력배치 계획을 수립하여야 한다. 유행을 인지할 경우 유행여부 판단이 제일 먼저 이루어져야 한다. 검사방법의 개발, 보고 체계의 변화 등 인위적인 원인에 의한 전염병 발생 보고의 증가 가능성을 배제하여야 한다. 유행자료의 수집과 분석 시 역학조사팀의 역 량을 고려해서 대상자를 선정하여 수집된 자료 의 질적 수준을 향상시켜야 한다. 대상자 수가 많더라도 결측치가 많거나 부적절한 대답이 많 은 조사결과는 활용할 수 없다. 역학조사서는 조사대상자의 수준에 맞아야 하고, 자기기입식 설문조사는 가능한 피해야 한다. 불가피하게 자 기기입식 설문조사를 시행할 경우 역학조사서 수거 전 조사요원이 기입내용을 다시 확인하여 결측치나 부적절한 대답을 최대한 줄여야 한다. 가설을 설정하고 검정하는 과정에서 통계적 방법을 사용하는 데 이때 통계값에만 의존해서 는 안 된다. 분석통계 이전에 기술통계를 통해 수집된 자료의 특성을 충분히 검토하고 가설을 설정해야 한다. 특히 표본수가 적을 경우 통계 적 검정력을 고려하지 않고, 귀무가설을 기각할 수 없다는(p>0.05) 이유로 두 집단이 동일하 다고 해석하지 않도록 주의해야 한다. 역학조사서 검토를 통해 3종의 전염병에 대 한 역학조사서를 개정하였다. 역학조사 과정에 서 문제가 발견될 때마다 지속적인 역학조사서 의 개정이 필요하다. 동시에 전염병예방법 등 관련법령의 개정이 필요하다. 참고문헌 1. American Public Health Association. Control of Communicable Disease Manual. 18th ed Bryan FL. Procedures to Investigate Foodborne Illness. 5th ed. International Association for Food Protection Juranek D. Procedures to Investigate Waterborne Illness. 2nd ed. International Association for Food Protection Michael BG. Field Epidemiology. 2nd ed. Oxford University Press Michael BG. Field Epidemiology. 2nd ed. Oxford University Press Thomas JC, Weber DJ. Epidemiologic Methods for the Study of Infectious Disease. Oxford University Press 국립보건원. 사스관리지침 국립보건원. 수인성/식품매개전염병 식중독 역학조사지침 국립보건원. 전염병 역학조사지침 김정순. 역학원론. 신광출판사 김정순. 한국인의 건강과 질병양상. I. 한국 인의 건강수준 및 질병양상의 개관 II. 감염 병(역학과 관리). 신광출판사 예방의학편찬위원회. 예방의학. 계축문화사 질병관리본부. 2001년 감염병 역학조사 보 고서 질병관리본부. 2002년 감염병 역학조사 보 고서 질병관리본부. 2003년 감염병 역학조사 보 고서 질병관리본부. 2004년 감염병 역학조사 보 고서 질병관리본부 2004 전염병 통계연보, 질병관리본부. 2005~2006 인플루엔자 관 리지침

56 Ⅰ. 연구보고 질병관리본부. 2005년 전염병 보고 및 정보 관리지침 질병관리본부. 2005년 전염병관리사업지침 질병관리본부. 가을철발열성질환 관리지침 질병관리본부. 말라리아 관리지침 질병관리본부. 생물테러 대비 및 대응지침 질병관리본부. 조류인플루엔자 인체감염 및 관리지침 질병관리본부 법정전염병 진단 신고 기준

57 46 국립보건연구원보 The development of scientific epidemic investigation method for the rapid response to the communicable disease outbreak Y.J. Hur, D.H. Lee, Y.A. Kang, S.W. Lee, W.K. Lee 1, Y.H. Choi 2, B.A. Choi, S.S. Kim, Y.J. Lee and J.H. Kim 3 Division of Epidemic Intelligence Service, Center for Communicable Disease Surveillance and Response, Division of Medical Entomology, Center for Immunology and Pathology 1, Division of Enteric Bacterial Infections, Center for Infectious Disease 2, Division of Chronic Disease Surveillance, Center for Disease Prevention 3, KCDC, Seoul Korea Purpose:To develop a communicable disease investigation guideline that reflects the recent communicable disease trends and up-to-date investigation technology. And to revise the existing surveillance worksheet and develop the tools for epidemic investigation. Methods:We have reviewed the epidemic investigation cases in Korea as well as in other countries, and we have also reviewed the existing guideline for communicable disease control. Based on these reviews, we developed the communicable disease investigation guideline. We also revised the surveillance worksheet and developed the tools for epidemic investigation. And we reviewed the law for the communicable disease prevention. Results:We developed a successive method for epidemic investigation starting outbreak detection to the reporting of the result. We defined the role of each part in the investigation team, and showed how to collect and analyse the data. We also developed the varicella surveillance worksheet and revised the surveillance worksheet for 3 kinds of communicable diseases. We developed surveillance worksheet for the waterborne disease in foreign languages. Also we developed a handbook for the investigation of food and waterborne disease and a table for the characteristics of the foodborne disease. Conclusions:It is expected that the investigation capacities of province and public health centers will increase. We also expect the increase in the quality of data by improving the data collection methods. Key Word:Epidemic investigation, Field Epidemiology, Questionnaire, Guideline This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, 23-46, 2005

58 Ⅰ. 연구보고 47 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 47-48, 2005 장출혈성대장균의 병인기작의 해명 연구 국립보건연구원 감염병센터 장내세균팀 조성학, 김종철, 박미선, 이복권 목 적:본 연구는 quorum sensing이라는 조절기구를 통하여 EHEC의 병인기작을 밝히는 것이 최 종목표인데 2차년도인 당해연도의 연구목표는 첫째로 quorum sensing에 의하여 조절되는 병원성인 자들에 대한 연구를 하고 둘째는 무증상균의 병인기작을 밝히는 데 접근하고자 하는 것이었다. 방 법:luxS 유전자의 손실을 유도함으로써 신호전달물질의 합성을 불활성화시키고, 이 신호전달물 질로 인한 정족수인지 시스템의 기능 및 장출혈성 대장균의 특성 변화에 대한 분석을 이차원 전기영 동법 (2D gel electrophoresis)에 의한 단백질 분리와 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight)에 의한 단백질 동정법을 이용하여 발현 단백질체의 분석과 임상분리균주(wild-type strain)와 LuxS 유전자 돌연변이주의 표현형을 비교하였다. 더 나아가 증상 균주와 무증상균주의 세포생물학적인 분석을 하였다. 결 과:본 연구에 사용한 균주는 장출혈성 대장균 O157 임상분리 균주로써 동일 균주를 통해 돌연 변이주로의 제작을 하였다. 총 49종의 당을 대상으로 하여 두 균주의 당 발효 양상을 비교해 본 결 과, sorbose에서 임상분리균주는 발효양상을 나타낸 반면 luxs 유전자 돌연변이 주에서는 sorbose를 발효하지 못하는 것으로 나타났으며, sorbose를 제외한 나머지 48종의 당에 대해서는 두 균주 모두 같은 양상을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한 아미노산 분해능과, 균주의 편모형성에 영향을 끼치지 않는 것으로 확인되었다. verotoxin의 세포독성 시험에서는 임상분리균주에서보다 돌연변이균주에서 약 2.5배 정도로 verotoxin의 세포독성이 강하게 나타남을 확인할 수 있었다. 단백질 발현 양상 비 교실험에서는 대장균의 hemolysina와 efa1 유전자가 생성하는 것으로 알려져 있는 단백질이 임상분 리균주에서만 발현되는 것을 볼 수 있었다. 둘째로, 장출혈성 대장균 O157균주와 무증상 O91균주를 대상으로 하여 세포독성 실험을 실시해 본 결과, O157균주와 O91균주 모두에서 세포독성이 강하게 나타나는 것으로 확인되었다. 결과를 종합해 볼 때, 전자에서 언급했듯이 세포독성도에서 차이를 나타내지 않은 무증상 O91 균주의 경우 shiga-like toxin을 제외한 또 다른 병인요소가 증상과 무증상의 지표로 작용할 수 있다는 가능성을 배제할 수 없을 것으로 사료된다. 결 론:EHEC에서의 quorum sensing과 그 밖의 병원성 인자에 관련된 연구를 2차년도의 결과를 바탕으로 하여 더욱 집중적으로 하게 될 것이고 나아가서 병인기전을 세포 수준에서 관찰하고자 한다 중심단어:장출혈성대장균, 베로톡신, 숙주세포, 병인기작. 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

59 48 국립보건연구원보 Research on pathologic mechanism of enterohemorrhagic E. coli S.H. Cho, J.C. Kim, M.S. Park, and B.K. Lee Division of Enteric Bacteria infections, Center for Infectious diseases, NIH, Seoul Korea Purpose:This study expands the knowledge on quorum sensing regulation in the focus of pathogenic mechanism in enterohaemorrhagic E. coli (EHEC). In the second year studies, we have two purposes. The first purpose is characterization of global regulatory system that controls the virulence genes with associated quorum sensing on chromosomal DNA of EHEC bacteria. The other purpose is demonstration of pathogenic mechanism in asymptomatic EHEC strain. Methods:We constructed an isogenic luxs mutation in EHEC strain which is blocked the signal molecules. And we have approached to wild type strain compared to in the luxs mutant by proteomics analysis(two-dimensional electrophoresis, Maldi-ToF analysis) and phenotypic characterization of each strain. Moreover, we tried to cytological analysis in symptomatic and asymptomatic EHEC strains. Results:We first chose the 49 carbohydrates shown to be regulated through luxs in carbohydrates fermentation and examed. Of the 49 carbohydrates, we have not found different patterns, exclude sorbose. Both strains were nondiscriminated results in decarboxylase tests and flagellar formation. In cytotoxicity appearance, isogenic luxs mutant strain has shown increased verotoxin cytotoxicity(2.5 fold) in luxs mutant strain compared to in wild-type strain. Total protein prepared from wild-type strain and luxs mutant strain were examined by proteomics analysis indicating positively regulated Hemolysin A and Efa1(EHEC adherence factor 1) proteins, respectively, in wild-type strain compared to in the luxs mutant strain. Seconds, we also demonstrated cell cytotoxicity levels in symptomatic EHEC O157 srain and asymptomatic EHEC O91 strain. Both symptomatic and asymptomatic strains showed high cell cytotoxicity. One possible explanation about this result is that other virulence factors out of shigatoxin are required for pathogenesis in host cell. Conclusions:Future studies will seek to identify additional virulence genes that are regulated by luxs-dependent pathway. Moreover, we will perform the research on pathogenic mechanism in cellular level. key word:enterohemorrhagic E. coli, verotoxins, host cell, pathogenic mechanism This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, 47-48, 2005

60 Ⅰ. 연구보고 49 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 49-50, 2005 보툴리눔 독소생물활성 분석 및 고감도 진단법 개발 연구 국립보건연구원 감염병센터 병원체방어연구팀, 생물안전평가팀 1 신나리, 윤소연, 신지훈, 이기은, 성원근 1, 김봉수, 오희복 목 적:보툴리눔 독소는 Clostridium botulinum에 의해 생산되는 신경독소로 보툴리즘의 원인이 되며, 사람에서는 A-G의 7가지 독소형 중 A, B, E, F의 4가지 독소형이 보툴리즘을 유발한다. 국내 의 경우 2003년 A형 보툴리즘이 최초발생한 이래 꾸준히 환자발생이 보고되고 있으나, 진단표준품 부족으로 신속한 진단이 어려운 실정이다. 따라서 본 연구에서는 보툴리눔 독소형에 대한 기초연구를 수행하고, 표준 항독소 확보 및 새로운 고감도 진단법을 개발하고자 한다. 방 법:보툴리눔 균주를 수집하여 생리 생화학적, 유전자 및 단백질 수준에서의 분석을 통하여 균동 정을 실시하였으며, A, B, E, F 독소형에 대한 multiplex PCR법을 확립하였다. 또한 독소발현 확인 을 위한 realtime PCR 및 ELISA법을 개발하여 동정된 균주에 적용하였다. 항독소 생산용 항원 확보 를 위한 최적의 정제법 확립을 위하여 다양한 방법의 독소정제 프로토콜을 이용하여 A, B, E형 독소 정제를 시도하였다. 결 과:균주분석을 통하여 A-F의 6가지 독소형에 대한 균주를 동정 확보하였다. 균동정법으로는 16s rrna sequencing, multiplex PCR, 마우스 독성검사가 유용하였으며, 특히 multiplx PCR은 A, B, E, F 독소형에 대하여 각각 서로 다른 크기의 유전자를 증폭함(672, 457, 266 및 543 bp)으로써 독소형 확인도 가능하였다. Realtime PCR과 ELISA를 이용하여 mrna 및 단백질 수준에서의 독소발 현을 확인한 결과 late exponential phase에서 보툴리눔 독소발현이 최대값을 나타내었다. 독소정제 를 실시한 결과 발효조 배양, 황산 및 ammonium sulfate 침전을 혼합한 정제법이 효과적이었다. 결 론:본 연구는 보툴리눔 동정법 확립을 통한 균주확보, 독소발현량 측정법 개발 및 독소정제법 확립을 통하여 보툴리눔 진단을 위한 항독소 생산 및 새로운 고감도 진단법을 개발하기 위한 기초를 마련하였다는 데 의의가 있다. 중심단어:보툴리눔 독소, Clostridium botulinum, multiplex PCR, 독소정제 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

61 50 국립보건연구원보 Bioactivity analysis of botulinum neurotoxin and development of high sensitive diagnostic method for botulism N.R. Shin, S.Y. Yoon, J.H. Shin, G.E. Rhie, W.K. Seong 1, B.S. Kim and H.B. Oh Division of Biodefense Research, Center for Infectious Diseases, Division of Biosafety Evaluation and Control 1, NIH, Seoul Korea Purpose : Botulinum neurotoxins (BoNTs) produced by Clostridium botulinum are divided into seven antigenically distinct proteins designated A through G. In human, types A, B, E and F cause botulism. Although botulism outbreaks in Korea have been continuously reported since 2003, insufficiency of a standard material place a rapid diagnosis for botulism under restriction. In this study, we conducted a basic research for BoNTs according to serotypes, production of a standard antitoxin, and development of a high sensitive diagnostic method. Methods : C. botulinum was identified from collected strains by analysis of biochemical and genetic characteristics. For bacterial identification, multiplex PCR was developed for type A, B, E, and F. To quantify expression level of BoNT, realtime PCR and ELISA were developed and applied to identified strains. Purification of BoNT/A, /B, and /E was conducted with various protocols to determine most suitable purification method. Results : C. botulinum types A to F were efficiently identified by 16s rrna sequencing, multiplex PCR, and mouse toxicity test. Especially, multiplex PCR make possible serological classification of BoNT by amplification with differential sizes (672, 457, 266, and 543 bp) according to toxin types A, B, E, and F. Expression analysis of BoNT by using realtime PCR and ELISA showed that the expression was maximized in the late exponential phase. Most suitable method for toxin purification was a protocol to carry out in order bacterial culture in fermenter, toxin precipitation from supernatant by 3N H 2SO 4 and ammonium sulfate, and toxin purification using FPLC. Conclusions : We formed the foundation for antitoxin production and new diagnostic method through preparation of C. botulinum strains by constructing botulinum identification method, development of a quantitative method for toxin expression, and establishment of a toxin purification method. Key words : botulinum neurotoxin, Clostridium botulinum, multiplex PCR, toxin purification This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, 49-50, 2005

62 Ⅰ. 연구보고 51 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 51-52, 2005 병원성 가시아메바 superoxide dismutase의 분자생물학 및 면역학적 병원성 기전 연구 국립보건연구원 면역병리센터 말라리아 기생충팀, 경상대학교 의과대학 1 김정연, 조신형, 주정원, 전형일, 최택균, 오창미, 이영희, 김동수, 나병국 1 목 적:가시아메바 Fe-SOD의 분자생물학적 및 면역학적 병원성 기작 연구를 통해 가시아메바 감 염시 나타나는 숙주-병원체 상호작용을 규명하고자, 병원성 가시아메바 Fe-SOD 유전자의 클로닝 및 발현, 생화학적 특성을 분석하였다. 방 법:배양한 병원성 가시아메바 Acanthamoeba castellanii로부터 mrna를 분리하여 RT-PCR을 수행, cdna를 합성 후, degenerate PCR 과 RACE를 실시하여 전체 유전자 서열 확보, 유전자서열 의 비교 및 genome DNA를 이용한 southern blot 등을 통하여 DNA 구조를 분석하였다. AcFe-SOD 유전자를 pqe-30 발현벡터에 클로닝한 후, E. coli를 이용하여 발현시켰다. Ni-NTA affinity column 을 이용하여 재조합단백을 정제한 후, 효소활성도 및 생화학적 특성 (ph, 온도 안 정성)을 분석하였다. 결 과:Denature PCR 및 5 3 RACE 를 통하여 총 791 bp로 이루어진 full-gene sequence가 얻어졌다. 가시아메바 Fe-SOD 유전자는 5개의 exon과 4개의 intron으로 구성되어있었으며, Southern blot의 결과, single copy임이 확인되었다. SDS-PAGE의 결과로 발현 단백질이 약 25 kda임이 관찰 되었고, SOD 특이염색을 실시하여, Fe-SOD 재조합 단백질이 SOD 활성을 나타냄이 입증되었다. 정 제한 자연 단백과, 재조합 단백의 생화학적 특성을 비교한 결과, 모두 넓은 범위의 ph에서 강한 활 성을 보였고, 열안정성에 있어서도 37도 에서는 모두 안정했으나, 70도에서는 모두 상대적으로 불안 함을 보여, 재조합 단백질과 native 단백질의 성상이 매우 유사함이 확인되었다. 결 론:가시아메바의 Fe-SOD 유전자를 클로닝 하여, E. coli를 이용하여 발현시켰으며, 이 재조합 Fe-SOD 단백질은 가시아메바 native 단백질과 생물, 생화학적 성상이 유사하여 기능 분석에 유용하 게 이용될 것으로 기대되었다. 중심단어:가시아메바, superoxide dismutase, 병원성 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

63 52 국립보건연구원보 Molecular characterization and pathogenic study of Acanthamoeba castellanii superoxide dismutase J.Y. Kim, S.H, Cho, J.W. Ju, H.I. Jun, T.K. Choi, C.M. Oh, Y.H. Lee, T.S. Kim and B.K. Na 1 Division of Malaria and parasitic diseases, NIH, Seoul Korea, College of Medicine, Kyeongsang National University, Jinju Korea 1 Purpose:In order to examine the host-pathogen interaction in Acanthamoeba castellanii infection, molecular, biochemical and immunological characterization of A. castellanii Fe-SOD (AcFe-SOD) was invested. Methods:The mrna and genomic DNA were extracted from the culture of A. castellani. Then cdna was synthesized by RT-PCR and a degerate PCR and 3'-5' RACE PCR were followed. Southern blot was done to analysis the DNA structure of AcFe-SOD gene. The ORF portion of AcFe-SOD was cloned, expressed in E. coli and purified by using Ni-NTA affinity column. The enzyme activity of the purified AcFe-SOD and the biochemical features (ph and temperature stability) were examined. Results:A 791 bp- full length AcFe-SOD gene was obtained by a denature PCR and 5'-3' RACE. Fe-SOD gene was composed with 5 exons and 4 introns. Sourthern blot analysis revealed that AcFe-SOD was a single copy gene. By SDS-PAGE, a clear 25 kda product was observed. The activity of SOD was demonstrated by SOD specific dye. Both the purified recombinant protein and the nature Fe-SOD protein were stabilized in wide rages of ph, and showed a similar feature of temperature stability. Conclusions:A Fe-SOD of A. castellanii was cloned and expressed. The characterization of racfe-sod revealed that the similarity between recombinant and nature Fe-SOD protein of A. castellanii. Key words : Acanthamoeba castellanii, Superoxide dismutase, Pathogenicity This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, 51-52, 2005

64 Ⅰ. 연구보고 53 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 53-54, 2005 Moraxella catarrhalis의 분자 역학 및 UspA 단백의 병원성, 면역원성 특성 연구 국립보건연구원 감염병센터 호흡기세균팀 이영희, 성화영, 최지혜, 김기상, 강연호, 유재연 목 적:M. catarrhalis균을 임상가검물로부터 분리하여 국내에서의 감염양상을 파악하고 분리된 병 원체의 항생제 감수성 등 표현형적인 특성을 파악하는 한편 유전형별 분석 기법을 적용하여 분자유전 학적인 특성을 밝히고자 하였다. 방 법:병의원으로부터 가검물을 확보하여 표준화된 진단법으로 균을 분리하고 확인 동정 시험을 수행하였다. 분리된 M. catarrhalis균에 대하여 NCCLS의 지침에 따라 미량 액체 희석법으로 MIC 값을 측정하였고 nitrocefin 디스크법으로 β-lactamase를 검출하였다. 분리된 균종에 대하여 PFGE 패턴을 분석하고 M46-region에 대하여 PCR-RFLP를 수행하여 밴드 패턴을 분석하였다. UspA gene ORF의 유전적 변이는 uspa1과 uspa2 유전자를 PCR로 증폭하고 HaeIII 제한효소로 절단하여 RFLP 패턴을 분석하였다. 결 과:총 4,589건의 검체에서 140주의 M. catarrhalis 균이 분리되었다. 분리 균주중 페니실린에 대한 감수성은 4.3%를 보였으며, Ampiclin에 대한 감수성율은 52.1% 이고 시험한 여타의 항생제에 대하여는 97,9%에서 100%의 감수성율을 보였다. PFGE 양상으로 19종의 패턴으로 구분되었고 5개 균주는 고유한 PFGE 패턴을 보였다. M46 region에 대한 PCR-RFLP 시험결과 7개의 그룹으로 구분 되었으며 각균주는 2주 (1.4%)에서 64주 (45.7%)를 포함하였다. uspa1과 uspa2 유전자의 ORF 증폭 결과 140균주중 33%는 uspa1과 uspa2를 동시에 보유하였으며 19%는 uspa1만, 25%는 uspa2만을 보유하였고 23%는 uspa 유전자를 가지고 있지 않았다. uspa 유전자에 대한 PCR-RFLP 결과는 uspa1은 38개, uspa2는 20개의 형으로 구분되어 상당한 유전적 변이를 나타내었다. 결 론:국내에서 분리된 M. catarrhalis 균주는 외국의 경우에서와 같이 페니실린에 대하여 고도의 내성율을 나타내었고 uspa 유전자에 대하여 다양한 유전적 변이를 보였다. 분석 결과를 토대로 M. catarrhali 균의 유전적 변이에 대한 연구가 심도있게 수행되어야 할것으로 사료되었다. 중심단어 : Moraxella catarrhalis, PFGE, PCR-RFLP, UspA 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

65 54 국립보건연구원보 Molecular epidemiological study and characterization of Pathogenic and immunogenetic characteristics of UspA gene on Moraxella catarrhalis isolated in Korea Y.H. Lee, H.Y. Sung, J.H. Choi, K.S. Kim, Y.H. Kang and J.Y. Yu Division of Bacterial Respiratory Infections, Center for Infections Diseases, NIH, Seoul Korea Purpose:We are intended to elucidate infectional aspect by isolating M. catarrhalis from clinical specimens,. and also tried to understand molecular chracterstics of M. catarrhalis by applying molecular analytical tools. Methods:M. catarrhalis strains were isolated from clinical specimens and identified by standardized methods. Isolates were screened for antibiotic MICs by NCCLS method. β-lactamase screened by nitrocefin disk. PFGE was performed by specified method and PCR-RFLP pattern was analyzed on M46 region. Genetic variation on uspa was performed by PCR-RFLP by using restriction endonuclease HaeIII. Results:One hundred and forty M. catarrhalis were isolated from 4,589 specimens. 4.3% of isolates were identified to penicillin susceptible. Susceptable rate aganist ampicilin was 52.1%. Susceptable rate against another used antibiotics were ranged from 97.9% to 100%. PFGE patterns were grouped to 19 types. Five strains showed unique PFGE pattern. PCR-RFLP against M46 region were patterned to 7 groups. Each group include 1.4% to 45.7% isolates. PCR amplification showed 33 % of isolates possesing usaa1 and uspa2 together. Nineteen percent of isolates possessed uspa1 and 25% of isolates possessed uspa2 only and 23% of isolates did not possess uspa genes. PCR-RFLP pattern showed 38 type and 20 type on uspa1 and uspa2 respectively. Conclusions:M. catarrhalis isolated in domestic field showed high penicillin resistance rate as the case reported abroad. And clinical isolates showed genetic variations on uspa gene. It was suggested to study in depth and diverse on genetic variation upon M. catarrhalis isolated in Korea. Key words:moraxella catarrhalis., PFGE, PCR-RFLP, uspa This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, 53-54, 2005

66 Ⅰ. 연구보고 55 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 55-56, 2005 Francisella tularensis 감염증 진단표준화 및 면역기전 연구 국립보건연구원 면역병리센터 인수공통감염팀, 질병예방센터 혈액안전감시팀 1 황규잠, 황성조, 심수경, 최영실, 박상희, 이병철, 박만석 1, 박미연 목 적:F. tularensis 감염 시 숙주세포 방어기전 연구를 위해 참조균주(LVS)와 국내 분리주 (Pohang)를 murine marophage cell line J774A.1 세포주에 감염시켜 두 균주간의 균 탐식능을 알 아보고자 하였으며, 감염세포에서의 cytokine, NO 생성 및 변화량 측정으로 F. tularensis의 세포성 면역관련 자료를 확보하고자 하였다. 방 법:병원성 측정, 탐식능 등을 알아보기 위하여, 20 MOI(multiplicity of infection)의 LVS주와 Pohang주는 2x10 6 의 세포주에 감염 후 3시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간에 따른 탐식능을 비 교하였으며, 초기면역에 관여하는 cytokine(tnf-α, INF-γ, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) 및 No의 분비량을 ELISA법으로 측정하여 비교분석하였다. 결 과:J774A.1의 1x10 6 세포에 LVS주 및 Pohang주를 20 MOI로 감염시킨 후, 시간에 따른 감염양 상은 3시간부터 세포벽을 통해 세포질에 균주가 관찰되었으며 24시간에서는 많은 균수가 세포질에서 관찰되었으며, 성장능은 두 균주가 비슷하였다. LVS 및 Pohang주로 3시간 동안 감염시킨 세포주에 서 회수된 균수는 각각 1x10 6 CFU이었으며, 72시간 배양 시 감염세포주에서 회수된 균수는 1x10 10 CFU로 증가된 탐식능을 나타내었다. 감염세포에서의 IFN-γ의 생성량은 두 균주 모두 지속적으로 증가하여 72시간에는 LVS가 2 μg/ml, Pohang 주가 2.8 μg/ml으로 측정되어 Th1 세포의 활성을 확 인하였다. IL-12의 생성량은 72시간에 LVS주의 약 80 μg/ml 보다 Pohang주가 150 μg/ml로 2배 높 게 나타났다. IL-12가 감염 초기 IFN-γ 생성량에 주요하게 작용하는 것을 두 균주간의 IL-12 생성 량에 따라 비례적으로 IFN-γ가 생성됨을 확인할 수 있었다. Th2 세포의 활성과 관련된 TNF-α, IL-2, L-10, IL-4 는 시간에 관계없이 모두 200 ng/ml이하로 대조군과 차이를 나타나지 않았다. NO 2- 생성은 두 균주가 유사한 량 4μg/ml(24시간), 6 μg/ml(72시간)으로 측정되었다. 이는 IFN-γ 로 활성화된 감염세포주가 항-LVS 및 항-분리주 활성과 연관될 것으로 사료된다. 결 론:F. tularensis LVS 및 Pohang분리주의 J774A.1 세포성 초기 면역기전에서 IL-12, IFNγ, NO이 중요한 기능을 할 것으로 사료된다. 중심단어:F. tularensis, LVS주, Pohang주, J774A.1, cytokine, NO 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

67 56 국립보건연구원보 Standardization of the Laboratory diagnostic methods and Immunological mechanism of Francisella tularensis K.J. Hwang, S.J. Hwang, S.K. Shim, Y.S. Choi, S.H. Park, B.C. Lee, M.S. Park 1 and M.Y. Park Division of Zoonoses, Center for Immunology & Pathology, NIH, Division of Human Blood Safety surveilance, Center for disease Prevension 1, KCDC, Seoul Korea Purpose:We investigated the immunological mechanism by which cytokines and NO induce murine marophage cell line J774A.1-mediated immunity responses in F. tularensis LVS- and Pohang-strains. Methods:To check of infectivity and growth, 20 MOI of LVS and Pohang strains were infected to the 2x10 6 of J774A.1. According to 3, 6, 24, 48, and 72h, the infectivity and growth pattern of infected-j774a.1 were determined and analyzed. To comparative study of cytokine (TNF-α, INF-γ, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) and NO in early infection, ELISA analysis was carried out. Results:Infected LVS- and Pohang-cells were appeared into cytoplasm at 3h (1x10 6 CFU) and increased 4-log CFU from the macrophages over 72 hours incubation period. Growth of LVS-J774A.1 was similar to Pohang-J774A.1. The activity of IFN-γ was continuously increased to 72h (LVS 2 μg/ml, Pohang 2.8 μg/ml). The difference of IL-12 production showed between LVS(80 μg/ml) with Pohang(150 μg/ml) at 72h, it means that Pohang strains may be higher cell-mediated immunity. But the production of cytokines including TNF-α, IL-2, IL-4, IL-10 was not different from control. The production of NO 2- was detected at 24h (4 μg/ml), and 72h (6 μg/ ml) in both strains, and also correlated with anti-lvs and anti-pohang activity in macrophages activated with IFN-γ. Conclusions:The findings suggest that IL-12, IFN-γ, NO production might be important to J774A.1 macrophage mediated early immunological mechanism, in the F. tularensis. Key words:f. tularensis, LVS, Pohang, cell line J774A.1, cytokine, NO This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, 55-56, 2005

68 Ⅰ. 연구보고 57 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 57-76, 2005 쯔쯔가무시증의 지역에 따른 분리균 특성에 관한 연구 국립보건연구원 면역병리센터 인수공통감염팀, 충남대학교병원 1, 원주의과대학기독병원 2, 수원성빈센트병원 3, 조선대학교병원 4, 경북대학교병원 5 심수경, 최은나, 한선웅, 황규잠, 최영실, 박상희, 이병철, 김연숙 1, 김효열 2, 위성헌 3, 김동민 4, 김신우 5, 박미연 목 적:최근 우리나라에서 쯔쯔가무시증 발생이 증가함에 따라 국내 지역별 환자와 매개체로부터 쯔쯔가무시균을 분리하여 혈청형, 유전자형, 균체 지방산 조성 및 항생제 감수성 등 특성을 분석하여 지역적 분포를 파악하고, 새로운 변이주의 존재 여부를 확인하여 실험실 진단 및 백신 후보주로 활용 하고자 하였다. 방 법:환자로부터 56주, 들쥐로부터 2주의 균을 분리하여 56 kda 염기서열 분석과 형특이 단클론 항체를 이용 분리균 특성을 분석하였다. Nested PCR을 이용하여 환자, 들쥐 및 매개체로부터 쯔쯔가 무시 특이 유전자를 검출하였고, PCR 산물을 제한효소 DdeI로 처리하여 PCR-RFLP 양상을 분석하 였다. 또한 gas chromatography를 이용하여 O. tsutsugamushi 6주에 대한 균체 지방산을 분석하였 으며, 보령주와 3개 분리주를 대상으로 tetracycline, rifampicin, erythromycine, chloramphenicol, doxycycline, 및 azithromycin 대하여 in vitro로 항생제 감수성 시험을 하였다. 결 과:환자 및 들쥐로부터 분리된 58주는 Boryong (43 주), Gunpo (8 주), Pajoo (6 주), Karp (1 주)형 이었다. 쯔쯔가무시 특이 유전자가 검출된 524 건에는 Boryong 360건 (68.7%), Karp와 Kawasaki가 각각 53건 (10.1%), Gunpo 14건 (2.7%), Pajoo 17건 (3.2%), Kato형이 5건 (1.0%)이 었다. 지방산 분석 결과 검사된 6주 모두에서 주요 지방산은 C18:1ω9C (57.3±3.5%). C18:0 (15.3±1.5%), C16:0 (12.7±1.7%)이었으며, 3-hydoxy 지방산은 존재하지 않았다. 조사된 국내 분리 균주는 rifampicin, azithromycine, doxycycline, tetracycline, erythromycine chloroamphenicol 의 항생제에 모두 감수성으로 나타났다. 결 론:본 연구를 통하여 국내에 다양한 형의 쯔쯔가무시가 존재함을 알 수 있었고, Boryong형이 국내에서 가장 많이 존재하였으며, 특히 충남, 경상, 전라 지역에서 주종을 이루었다. Pajoo형, Gunpo형, Karp형은 주로 강원, 충북, 경기도에서 존재하였고, Kato형과 Kawasaki형이 여러 지역에 서 검출되어 지역별 형별 분포의 차이를 나타내었다. O. tsutsugamushi에 대한 균체 지방산 분석 결과는 이들 균의 동정에 기초 자료로 활용될 수 있으며, 국내 분리주에서 항생제 저항성은 확인되지 않았다. 중심단어:쯔쯔가무시, 혈청형, 유전자형, 분리주, 균체 지방산, 항생제 감수성 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

69 58 국립보건연구원보 서 론 쯔쯔가무시증의 원인 병원체인 Orientia tsutsugamushi 는 LPS와 peptidoglycan이 없는 것이 특징이며, 1995년 Rickettsia 속에서 Orientia 속으 로 구분되었다. Orientia 속에는 O. tsutsugamushi 가 유일한 종이며 다양한 혈청형이 보고되고 있 다. 1950년경에 보고된 Gilliam, Karp, Kato를 비롯하여 태국에서 분리된 TA763, TA716, TA686, TA678, TH1817 혈청형과 일본의 Kuroki, Kawasaki, Shimokoshi 혈청형, 우리나 라의 Boryong과 Yoncheon 혈청형을 들 수 있 다. 분리 균주의 동정에 단클론 항체에 의한 혈 청형, 형-특이 유전자형, 균체 지방산(Cellular fatty acid) 분석 등이 분류 지표로 이용되고 있 다. Rickettsiae에 대한 균체 지방산 분석은 1981년 Tzianabos에 의하여 보고되었고 1987 년 Amano에 의하여 O. tsutsugamushi에 대한 지방산 분석이 보고되었으나 축적된 자료의 정 보를 포함하여 새로운 분석이 요구된다. 한편, Barker는 항생제에 대한 감수성은 균 주에 따라 차이가 있다고 보고한 바 있으며, 태 국에서는 chloramphenicol과 doxcycline에 저항성 이 있는 균주가 보고되었으나, 우리나라에서는 항생제 감수성 균의 존재 여부에 대한 조사가 되어 있지 않다. Chang 등은 우리나라에서 1994년 이전의 환 자 분리주에 대하여 단클론 항체를 이용하여 혈청형을 분석한 결과 137주 중 111주가 Boryong형으로 10주는 Gilliam형, 13주는 Karp 형으로 보고하였다. 지역별 분포는 Boryong형 이 충청남도, 전라도, 경상도에 Gilliam과 Karp 형은 충청북도, 경기도에 주로 분포한다고 보고 하였다. 일본의 경우 카나가와 및 미아자키현의 경우 Kawasaki와 Kuroki형이 70% 정도 분포하 며 시마네현의 Karp형과 Gilliam형이 주로 분 포하는 것으로 알려졌다. 이처럼 각 지역에서 유행하는 O. tsutsugamushi 의 혈청형 분포, 항원의 다양성으로 지역 특성에 맞는 실험실 진단이 요구된다. 또한 각 혈청형은 병원성과 많은 연관이 있는 것으로 확인되어 혈 청형의 분포는 지역특성에 따른 쯔쯔가무시증의 임상상에 차이를 나타낼 수 있다. 또한 생태학적, 역학적 연구는 쯔쯔가무시증의 효율적인 예방 관 리에 중요한 자료로 제시할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 국내 각 지역에서 발 생한 급성발열성 환자와 O. tsutsugamushi의 보유동물인 야생 설치류 및 매개체인 털진드기 로 부터 균을 분리하여 표준균주 및 분리균주 의 특이 단클론 항체에 의한 동정, 16S rrna, 56 kda, 22 kda, 110 kda 염기서열 상동성을 분석하여 국내 분리 O. tsutsugamushi의 지역 별 분포를 파악하였다. Nested-PCR을 이용하 여 환자, 숙주동물, 매개체 검체로부터 O. tsutsugamushi 특이 유전자를 검출하여 지역별 로 존재하는 균주의 형별 분포의 특성을 파악 하였다. 또한 O. tsutsugamushi에 속하는 표준균주를 포함한 6개 균주에 대하여 균체 지방산 조성 에 대한 특성과 국내 분리균주에 대해 현재 치 료에 사용되는 항균제에 대하여 감수성 시험을 실시하여 보고하고자 한다. 재료 및 방법 1. 사용 균주 및 세포주 본 연구에 사용된 O. tsutsugamushi의 각 혈 청형의 표준균주 Gilliam (ATCC VR 312), Karp (ATCC VR 150), Kato (ATCC VR 609)는 ATCC로부터 구입하였으며, Kuroki와 Kawasaki는 일본 NIID로부터, 국내 균주인 Boryong주는 서울대학교 의과대학으로부터 각 각 분양 받았으며, 1998년부터 2003년까지 쯔 쯔가무시증 환자 혈액으로부터 분리한 65균주 와 2003년에 들쥐 혈액으로부터 분리한 2주는 본 연구에서 분리하여 사용하였다. 균 배양에 마우스 섬유아 세포주인 L929 세

70 Ⅰ. 연구보고 59 포를 이용하였으며, 단클론항체 제조에는 종양 세포주인 SP2/0 Ag 14 (ATCC, USA)를 이용 하였다. 2. 검체 및 임상자료 수집 쯔쯔가무시 의심 환자의 혈액, 혈청, 피부 병 변 조직 등의 임상검체와 자료는 경기, 강원, 충청, 전라, 경상도 각 지역의 거점병원을 통해 제공 받았다. 들쥐는 환자 다발지역에서 sherman trap을 이용 채집하였고, 털진드기는 채집된 들 쥐의 사체를 증류수가 담긴 비이커 위에 거꾸 로 매달아 떨어진 진드기를 채집하여 사용하 였다. 3. 균 분리 항응고제(heparin) 처리된 환자 및 들쥐 혈액 0.4 ml을 cyclophosphamide (Sigma, Missouri, USA) 0.25 mg/g wt를 피하 주사한 6-8주령 ICR 마우스의 복강에 접종하였다. 털이 거칠어 지거나 복수가 차는 증상을 나타내는 (10-14일 후) 마우스를 해부하여 무균적으로 혈액, 비장, 복수, 간장을 채취하고, 복막을 웰 슬라이드에 도말하여 Giemsa 염색이나 형광 항체법을 이용 하여 O. tsutsugamushi의 존재를 확인하였다. 균 이 검출되면 복수나 혈액 1 ml를 2% 우태아 혈 청이 들어 있는 DMEM 배지 1 ml에 혼합하여 단층 배양된 마우스 섬유아세포인 L929 세포에 감염시켜 상기의 균 배양방법에 따라 배양하였 다. 증상이 나타나지 않은 경우 마우스 혈액을 새로운 마우스에 접종하는 blind passage를 2-3 회 실시하였다. 분리균을 다시 마우스에 감염 시 켜 병증을 일으킴을 확인하였다. 4. O. tsutsugamushi 배양 지름 100 mm 세포배양 용기에 L929 세포를 5% 우태아 혈청이 포함된 세포 증식 DMEM을 사용하여 5% CO 2, 37 조건에서 배양하였다. 세포가 배양 용기 단면의 80%까지 증식하였을 때 세포 증식 배지를 버리고 PBS로 세척하고 균을 접종 시킨 후 5% CO 2, 37 조건에서 2 시간 동안 세포에 O. tsutsugamushi를 흡착시 키고 새 배지로 갈아 배양하였다. 5. O. tsutsugamushi 정제 수확된 O. tsutsugamushi로 감염된 세포를 4 에서 2,600 g로 20분간 원심 침전하여 TS완충액 (0.033M Tris-hydrochrolide, ph7.4, 2.5M sucrose)으 로 부유하여 Tamura의 방법에 따라 정제하였다. 6. 단클론 항체 제조 정제된 쯔쯔가무시 균체 항원의 단백질 농도 를 100 μg/ml로 맞추어 Ed Harlow 등의 방법에 따라 면역하여 서혜임파절에서 분리한 임파세 포와 골수종 세포 (SP2/0 Ag14)와 혼합하여 polyethylene glycol 1500 (PEG, Missouri, Sigma) 을 첨가하여 세포융합을 실시하였다. 해당 분리 주에 특이 양성반응이 관찰되는 클론을 선별하 여 단일세포주로 클로닝을 실시하였다. 배양된 융합 세포를 PBS로 세척하여 BALB/c 마우스 복강에 0.2ml(10 7 cell) 접종하였다. 접종 후 10일이 경과하여 복수액이 생성되면 채취하 여 원심하여 상층액을 분리하였다. 7. DNA 정제 균체 DNA는 정제용 키트 (Qiagen, Hilden, Germany)의 사용설명서에 따라 추출하였으며, 환자 검체 (항응고제 처리된 혈액, 가피), 들쥐 혈액, 털진드기 마쇄 검체에서의 DNA 정제도 같은 방법을 이용하였다. 8. Nested PCR 검체로부터 정제된 DNA를 주형으로 Furuya등 (1993)이 제시한 공통 primer 55와 34 (Table 1) 을 1차 PCR에 이용하였고, 이들 1차 증폭산물 을 주형으로 primer 10과 11 (Table 1)을 2차 PCR에 이용하였다.

71 60 국립보건연구원보 Table 1. Primers used in this study. gene Primer Sequence Reference 16S rrna fd1 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG Weisburg, 1991 rd1 AAGGAGGTGATCCAGCC 56-kDa55 AGGGATCCCTGCTGCTGTGCTTGCTGCG Furuya, TCAAGCTTATTGCTAGTGCAATGTCTGCA Furuya, GATCAAGCTCCTCAGCCTACTATAATGCC Furuya, CATGGGATCCCGACAGATGCACTATTAGGC Furuya, K-F2 TAGTGTGGCATTATAATTAGTTTAGAA 56K-R2 TTTAAAGAAAAAGTAGAAGTTATAGCG 22-kDa22K-F AAGGCGACATACTATATCATCTACAC Kelly, K-R AAGGATCCAAGGCATATGTATTATTCTA Kelly, kDa110K-F CCAGGTGGACAGATGTCTGA Kelly, K-R TGCCAACAGAATTAGCCTGA Kelly, PCR-RFLP Nested-PCR 산물을 제한 효소인 DdeI (NEB, USA)으로 37 에서 2시간 동안 반응시켜 2.5% agarose gel에서 전기영동한 후 ethidium bromide 로 염색하여 화상 분석 시스템 (Alpha Innotech, Fluor Chem 8800, USA)을 이용하여 band 양상 을 표준균주와 비교하여 분석하였다. 10. 염기서열 분석 및 계통분석 가. 유전자 PCR 증폭 및 정제 16S rrna 유전자증폭은 Weisburg 등(1991) 이 제시한 fd1과 rd1 primer, 56 kda 유전자 증폭은 Furuya 등(1993)이 제시한 primer, 22 kda 및 110 kda 유전자증폭은 Kelly 등 (1994)이 제시한 22K-F와 22K-R primer 및 110K-F와 110K-R primer를 각각 이용하여 (Table 1) PCR을 실시하였다. PCR 증폭 산물 은 QIAgen PCR product purification kit를 이 용하여 정제 하였다. 나. 염기 서열 분석 각각의 유전자에 대한 PCR 증폭과 정제된 산 물을 이용하며, 염기서열은 ABI BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied biosystem, USA)와 ABI Prism 3100 (Applied biosystem, USA)을 이 용 96 20초 반응시킨 후 96 10초, 50 5초, 60 4분으로 25회 반응시켜 분석 하였다. 다. 계통 분석 LaserGene 프로그램 (DNASTAR, Winconsin, USA)을 이용하여 각각의 유전자에 대한 염기서열 및 아미노산 서열을 분석하였다. 계통분석은 ClustalX 소프 트웨어 프로그램(Thompson 등, 1997)을 이용하여 정렬 하고 unrooted neighbour-joining tree는 TreeExplorer (Tamura; metro-u.ac.jp/te/te_man.html)를 이용하여 작 성하였다. Bootstrap 수치는1,000회 resampling을 실시하여 70% 이상인 것만 나타냈다. 11. 지방산 분석 시료 준비는 Miler의 방법에 따랐으며 gas chromatography (Hewlett-Packard model HP5890A, USA)를 이용한 FAMEs 분석 조건은 carrier gas, hydrogen column head pressure, 10 psi split ratio, 100:1 split vent, 50 ml/min septum purge, 5 ml/min FID hydrogen, 30 ml/min FID nitrogen, 30 ml/min FID air, 400 ml/min initial temperature, 170 ; programmed rate, 5 C/min final temperature, 270 ; FID temperature, 300 ; injection port, 250 C; injection volume, 2 μl로 실시하였다. 분획 컬럼은 25 m 0.2 mm

72 Ⅰ. 연구보고 61 methyl phenyl silicone fused silica capillary column (HP 19091B-102)을 사용하였다. FAMEs profile은 Microbial Identification System (MIDI: Microbial ID, Inc., Delaware, USA)을 이용하였으 며, 표준 보정 용액 (Microbial ID, Inc. Delaware, USA)과 비교하여 peak를 동정하였고, retention time과 peak의 면적비율을 구하였다. 12. 항균제 감수성 시험 가. 감염 세포주, 균주 및 항균제 준비 L929 세포에 O. tsutsugamushi를 배양하여 세 포수( /ml)와 세포 당 균 감염률(40±5균/ ml)을 확인하고, 정상 L929 세포를 배양하여 세 포수( /ml)를 계산하여 감염세포와 정상세 포의 비를 1:2로 혼합한 후, 6 well plate의 각 well 당 혼합된 세포 를 넣고, 항균제 tetracycline, rifampicin, erythromycine, chloramphenicol, doxycycline과 azithromycin를 각 DMEM 배지로 각각 농도 16, 4, 1, 0.25, , , μg/ml가 되도록 희석한 배지를 넣어 5% CO 2, 34 에서 3일 동안 배양한 후 세 포 당 균수를 계산하였다. 나. 세포 당 균 감염률 계산 감염된 L929 세포를 PBS (0.1 % trypsin, 0.1 % EDTA 포함)로 처리하여 떼어 낸 후 well 슬라이드에 도포하여 공기 건조 시킨 후 아세톤으로 15분 동안 고정하였다. 균 감염률 은 100개 세포에서 감염된 균수를 간접형광항 체법으로 세어 다음과 같이 계산하였다. 세포 당 균 감염률=[(a/100) b]+[(c/100) 51] a : <51의 균으로 감염된 세포의 % b : <51의 균으로 감염된 세포 당 균의 평균 c : > 50의 균으로 감염된 세포의 % 결 과 1. O. tsutsugamushi 균 분리 및 유전자 검출 가. 2003년에 경기, 강원, 충청, 전라, 경상도 지역에서 발생한 급성 발열성환자의 혈액 검체 수집하여 56 균주를 분리하였고, 순창과 철원 에서 채집된 등들쥐(Apodemus agrarius)로부 터 2균주를 분리하였다 (Table 2). Table 2. Isolates of O. tsutsugamushi in this study. Source Location Strains Source Location 03-S01 Human Geumsan 03-S30 Human Daejeon 03-S02 Human Muju 03-S31 Human Nonsan 03-S03 Human Daejeon 03-S32 Human Yangpyeong 03-S04 Human Daejeon 03-S33 Human Buyeo 03-S05 Human Daejeon 03-S34 Human Yeongwol 03-S06 Human Inje 03-S35 Human Daejeon 03-S07 Human Daejeon 03-S36 Human Danyang 03-S08 Human Daejeon 03-S37 Human Chilgok 03-S09 Human Cheongyang 03-S38 Human Daejeon 03-S10 Human Cheongyang 03-S39 Human Daejeon 03-S11 Human Iksan 03-S40 Human Daejeon 03-S12 Human Hoengseong 03-S41 Human Daejeon 03-S13 Human Daejeon 03-S42 Human Daejeon 03-S14 Human Wonju 03-S43 Human Geumsan 03-S15 Human Daejeon 03-S44 Human Yeongi 03-S16 Human Daejeon 03-S45 Human Daejeon 03-S17 Human Wonju 03-S46 Human Unknown 03-S18 Human Yeongwol 03-S47 Human Muju 03-S19 Human Haman 03-S48 Human Muju 03-S20 Human Hwaseong 03-S49 Human Haman 03-S21 Human Suwon 03-S50 Human Nonsan 03-S22 Human Hwaseong 03-S51 Human Muju 03-S23 Human Daejeon 03-S52 Human Yeongi 03-S24 Human Wonju 03-S53 Human Hoengseong 03-S25 Human Daejeon 03-S54 Human Daejeon 03-S26 Human Daejeon 03-S55 Human Hongcheon 03-S27 Human Suwon 03-S56 Human Wonju 03-S28 Human Daejeon 03-S57 Rodent Sunchang 03-S29 Human Daejeon 03-S58 Rodent Cheolwon 나. 2003년부터 2005년 까지 수집된 급성 발 열성환자 혈액 검체로 부터 nested PCR에 의하 여 468건, 들쥐 혈액에서 33건, 털진드기 검체

73 62 국립보건연구원보 로부터 23건의 O. tsutsugamushi의 특이 56 kda 유전자를 검출하였다. 2. O. tsutsugamushi 분리주의 유전자형 특성 가. 염기서열 분석에 의한 유전자형 분석 (1) 16S rrna 유전자 염기서열 분석 분리균주에 대하여 Weisburg 등(1991)이 제시 한 fd1과 rd1 primer (Table 1)로 PCR을 실시 하여 1459 bp 길이의 염기서열을 분석한 결과 표준균주와 비교하여 모두 99.2% 이상의 상동 성을 나타내어 분리균주 모두가 O. tsutsugamushi 에 속하는 것으로 확인되었다 (Table 3). (2) 56 kda 유전자 염기서열 분석 국내 58개 분리주에 대하여 56 kda 유전자 염 기에 대한 상동성을 표준 균주 및 기존의 균주 들과 비교한 결과 43개 균주는 Boryong주 및 Kuroki주와 염기서열에서 99.2% 이상 상동성을 나타내었으며, 9개 균주 03-S12, 14, 17, 32, 34, 36, 53, 55, 56주는 Gunpo주와 100% 상동성을 나타내었다. Gunpo주는 Gilliam주와 상동성이 가 장 높았고 (88.3%), 4개 균주 03- S18, 24, 57, 58주는 Pajoo주와 99%이상의 염기서열 상동성 을 나타내었으며, Pajoo주는 Karp 주와 염기서 열 상동성이 가장 높았다(86.3%). 03-S06주와 Yongworl주는 상호 99% 이상의 염기서열 상동 성을 가졌으며, 표준균주 중 Karp주 및 Boryong 주와 각각 86.5%, 86.2%의 상동성을 나타내었 고, Pajoo 주와 95 %의 상동성을 나타내어 Pajoo형으로 분류되었다. 03-S11주는 Karp주와 염기서열 상동성이 93.3%를 나타내어 Karp형으 로 분류되었다. 국내 분리 58주는 Fig. 1에서와 같이 Boryong, Karp, Pajoo, Gunpo의 4군의 cluster 로 구분되었으며, 이와 같이 56 kda 염기서열 상 동성을 중심으로 Pajoo와 Gunpo는 새로운 유전 자형 (genotype)으로 구분되었다. Table 3. Nucleotide sequence similarity of the 16S rrna gene among the O. tsutsugamushi strains. Gilliam Karp Kato BoryongKuroki KawasakiShimokoshiYongworl Pajoo Gunpo03-S0203-S12 03-S14 03-S24 03-S32 03-S36 03-S5303-S55 Gilliam *** Karp 0.3 *** Kato *** Boryong *** Kuroki *** Kawasaki *** shimokoshi *** Yongworl *** Pajoo *** Gunpo *** S *** S *** S *** S *** S *** S *** S *** S *** 1) Similarities were determined using the Clustal program with weighted residue weight M37 (Windows 32, MegAlign 5.06; DNASTAR). 2) Percent similarity in upper triangle. 3) Percent divergence in lower triangle.

74 Ⅰ. 연구보고 Boryong S02 Kuroki 05,07,08,09,10,13,15,16,19,20,2 03-S04 1,22,23,25,26,27,28,29,30,31,33, S03 35,37,38,39,40,41,42,43,44,45,4 6,47,48,49,50,51,52,54 03-S01 Karp Boryong type S S Yongworl Pajoo S S24 Pajoo type S18 03-S58 Gilliam Kawasaki 03-S55 03-S56 03-S36 03-S53 03-S32 Gunpo type S34 03-S17 03-S14 03-S12 Gunpo Kato Shimokoshi Fig. 1. Genetic diversity of O. tsutsugamushi strains based on the 56 kda gene sequence homology. The numbers at nodes indicate bootstrap values. Bar shows genetic distance of Gene Bank accession numbers: Gilliam (M33267), Karp (M33004), Kato (M63382), Boryong (L04956), Kuroki (M63380), Kawasaki (M63383), Yongworl (AF430141), Pajoo (AF430142). (3) 22 kda 유전자 염기서열 분석 각 혈청형의 표준균주에 대하여 22 kda 유전 자 염기서열에 대한 상동성을 비교한 결과 Gilliam주와 Karp주는 91%였으며, Gilliam과 Kato, Karp와 Kato는 각각 89.7%와 83.3%였으며 Boryong과 Karp는 97%로 56 kda 염기서열 보다 상동성이 높아 분류학적으로 의의가 적었다. (4) 110 kda 유전자 염기서열 분석 110 kda는 O. tsutsugamushi의 주요 항원 단백 중의 하나로 균주별 특이 항원 결정기를 가질 것이라는 보고 (Oaks 등, 1989)가 있으 며, 변이가 많은 유전자로 알려졌다 (Kelly 등, 1994). 따라서 균주별 110 kda 유전자의 염기 서열의 변이 부분을 확인하기 위하여 1,157 bp 의 염기서열을 비교하였다. 표준균주에 대하여 110 kda 유전자 염기서열 에 대한 상동성을 비교한 결과 Gilliam주와 Karp주는 염기서열과 상동성이 94.1%였으며, Gilliam과 Kato, Karp와 Kato는 각각 93.8%와 92.3%였으며 Boryong주와 Kato주는 95.6%였고 Boryong, Kuroki, Kawasaki주는 상호간의 상동 성이 %로 상동성이 높아 분류적으로 의의가 크지 않았다. 나. 형-특이 PCR에 의한 유전자형 특성 각 혈청형별 표준균주 Gilliam, Karp, Kato주 와 우리나라 분리주 Boryong주, 일본 분리주 Kuroki주, Kawasaki주에 대한 56 kda 염기서 열 중 각 균주별로 특이성을 나타내는 primer

75 64 국립보건연구원보 를 제작하였으며 이를 이용하여 PCR을 시행하 여 유전자형을 동정한 결과 Fig. 4와 같다. Lane 1-9는 분리균주로, lane 1은 Yongworl주이고, lane 4는 Pajoo주로, lane 9는 Gunpo 주로 앞서 56 kda 유전자 염기서열에서 새로운 형으로 구 분하였던 균주였으나, 형-특이 primer를 이용한 PCR결과에 따르면 lane 1, 2, 4, 6, 7에 해당하 는 균주는 Karp형으로 lane 3, 5, 8에 해당하는 균주는 Boryong, Kuroki형으로 동정되었다. 그 러나 lane 9에 해당하는 균주에 대해서는 동정 되지 않았다. Gilliam Karp Kato Boryong Kuroki Kawasaki Fig. 4. Pattern of type specific PCR amplified bands of DNAs of 15 strains with Gilliam type-specific primer pair of 10 and G, Karp type-specific primer pair of 10 and Kp, Kato type-specific primer pair of Kt-F and Kt-R, Boryeong type-specific primer pair of Bo-F and Bo-R, Kuroki type-specific primer pair of 10 and Ku, and Kawasaki type-specific primer pair of 11 and Kw. M, DNA marker (promega, 100 bp ladder); N, nagative control; G, Gilliam: Kp, Karp; Kt, Kato; B, Boryeong; KU, Kuroki; KW, Kawasaki; from 1 to 9, isolates in our lab.

76 Ⅰ. 연구보고 O. tsutsugamushi 분리주의 혈청형 분석 가. 단클론 항체 제작 및 특성 Gilliam, Karp, Kato, Boryeong, Pajoo, Yongworl, Gunpo주에 대한 단클론 항체를 제조하였고 Table 7에서 보이는 바와 같이 각 항원과 반응 성으로 조사하여 자체 항원에 만 반응하는 것을 확인하였고 IgG 아형을 분류하였다. 2002년 이 전에 본 실험실에서 분리된 균주와 반응성을 조 사하여 제조된 단클론항체가 분리균주의 혈청 형 동정에 유용하게 이용될 수 있음을 확인 하 였다 (Table 4). 나. 분리주의 혈청형 분석 제작된 단클론 항체를 이용하여 간접형광항 체법으로 58분리주에 대한 혈청형 분석 결과 Table 5에서와 같이 Boryong형 43주, Gunpo형 8주, Pajoo형 5주, Karp형과 Yongworl형이 각 각 1주 순으로 분포하였으며 Gilliam형과 Kato 형은 확인되지 않았다. Table 4. Reactivity of strain-specific monoclonal antibodies against prototype strains and new domestic strains of O. tsutsugamushi. M onoclonal antibodies IFA titer against : Immunogloblin Gilliam Karp Kato Boryong Yongw orl Pajoo Gunpo Class Subclass G 2E , ,600 IgG G2b G 2E , ,200 IgG G2b KP 6C -36-1, IgG G2b KT 12A , IgG G1 Bo A7A , IgG G2b Y W 4D IgG G1 Y W 12H-4 1,600-1,600 1, ,400 3,200 - IgG G1 PJ ,800 - IgG G2b PJ ,800 - IgG G2b GP 10B ,400 IgG G2b GP 10B ,400 IgG G2b GP 2B ,8 0IgG G2a The titer is expressed as the reciprocal of the dilution. -, negative or less than 1:100 Table 5. Reaction pattern of O. tsutsugamushi isolates with strain-specific monoclonal antibodies by IFA. MoAbs Strains IFA titer against : G2E-6 G2E-10 KP6C-36 KT12A-8 BoA7A-8 YW4D-7 YW2H-4 PJ22-9 PJ52-32 GP10B-25 GP10B-38 GP2B-10 Serotypes by IFA 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S ,000 10, YW 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , KP 03-S12 1,000 1, ,000 10, GP 03-S , Bo

77 66 국립보건연구원보 03-S14 1,000 1, ,000 10, GP 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S17 1,000 1, ,000 10, GP 03-S ,000 1, PJ 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S ,000 1, PJ 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S32 1,000 1, ,000 1,000 10,000 10,000 - GP 03-S , Bo 03-S34 1,000 1, ,000 1, GP 03-S , Bo 03-S36 1,000 10, ,000 1, , , GP 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S , Bo 03-S ,000 1, PJ 03-S , Bo 03-S , ,000 1, GP 03-S ,000 1, GP 03-S ,000 1, PJ 03-S ,000 1, PJ 다. 분리균주의 지역별 혈청형 분포 분리균주 58주에 대한 지역별 분포와 형별 분포를 확인한 결과 Table 6과 같다. 충남 이 남 지역에서는 주로 Boryong주가 분리되었고 경기, 강원, 충북지역의 분리주는 Boryong주 이 외의 Karp, Yongworl, Pajoo, Gunpo형의 균주가 분포하였다. Table 6. Regional distribution of O. tsutsugamushi serotype with MAb by IFA Province Total Serotype Gilliam Karp Kato Boryong Yongworl Pajoo Gunpo Gyeonggi Gangwon Chungbuk 1 1 Chungnam Gyeongbuk 1 1 Gyeongnam 2 2 Jeonbuk unknown 1 1 Total

78 Ⅰ. 연구보고 검체로부터 검출된 쯔쯔가무시 특이 유전 자에 의한 유전자형 분석 가. PCR-RFLP에 의한 유전자형 분석 수집된 환자나 들쥐 및 매개체인 털진드기 검체로부터 추출된 DNA를 이용 56 kda 유전 자에 대한 nested PCR을 실시하여 그 산물을 유전자형에 따라 밴드의 패턴이 구별되게 절단 하여 동정이 가능하도록 작용하는 제한 효소로 DdeI을 선정하였다. 검출된 PCR 산물에 DdeI 을 처리하여 전기영동한 밴드 패턴은 Fig. 6에 서 보여주는 바와 같이 lane 2는 Gilliam주이 고, lane 3은 Karp주, lane 4는 Kato주, lane 5 는 Boryong주로 각각 밴드 패턴에 차이를 나타 내었으며 367건을 분석하여 Boryong형이 68.1%, Karp형이 10.6%, Gilliam형이 3.5%, Kato형이 1.4%이었다. Fig. 6. PCR-RFLP electrophoretic patterns of DNA from O. tsutsugamushi isolates. PCR products were obtained with primer set 10/11 at Table and analyzed on 3% agarose gel after digestion with DdeI. Lane 1, 1kb ladder; lane 2, Gilliam; lane 3, Karp; lane4, Kato; lane 5, Boryong lane 6~19, isolates from patient [Karp type: 6, 9,and 14; Boryong type: 10, 11, 12, 15, and 17; GI(Gilliam related) type: 7, 8, and 16; GII(Gilliam related) type: 19; KpI(Karp related) type: 13; BoI(Boryong related) type: 18] 중 Boryong형이 329건 (70.1%)으로 국내에 가장 많이 분포하였으며, Kawasaki형이 53건 (11.3%), Karp형이 33건 (7.1%), Gilliam형이 20건 (4.3%) 순으로 분포 하였다. 중부 이남 지역에는 Boryong형이 주로 분포하였고 강원지 역에는 Karp형과 Gunpo, Boryong, Pajoo, Yongworl형의 순으로 분포하는 특징을 보였다. 특히 현재까지 국내에서 존재하지 않는 것으로 알려진 Kato형의 유전자가 전남지역 환자로부 터 5건이 국내 최초로 검출되었으며, Kawasaki 형에 대한 국내보고가 없었으나 본 결과에서 경기 32건을 비롯하여 충남 (4건), 경북 (13 건), 전남 (3건), 경남 (1건) 지역에서 총 53건 이 최초로 발견되어 한국에도 Kato형과 Kawasaki 형의 O. tsutsugamushi가 존재할 가능성을 확인 하였다. 각 지역으로부터 채집된 들쥐 혈액으로부터 nested PCR에 의하여 검출된 56 kda 유전자 33건에 대한 형 동정은 Table 9와 같다. 철원 의 17건 검체 중 Karp형 14건, Boryong형 2건 으로 1건을 제외한 모든 검체에서 병원체의 유 전자가 검출되었다. 들쥐 검체의 경우 환자 검 체와는 달리 Karp형의 분포가 57.6%로 가장 많았으며, Boryong형은 33.3%이었고, 옥천에 서 Gilliam형이 발견되었다. 채집된 들쥐 81마 리 중 33마리 (40.7%)에서 O. tsutsugamushi 특이 유전자가 검출되어 국내 쯔쯔가무시증 환 자가 다발하는 요인을 추정 할 수 있었다. 들쥐로부터 채집된 털진드기 검체에서 같은 방법으로 염기서열을 분석한 결과 Table 10과 같이 총 23건 중 20건 (83.3%)이 Boryong 형으 로 분석되었으며 Gilliam, Karp, Gunpo형이 각 각 1건씩 검출되었다. 나. Nested PCR 산물의 염기서열 분석에 의 한 유전자형 분석 Nested PCR로 환자로부터 검출된 56 kda 유전자 단편에 대하여 염기서열을 분석하여 계 통 분석한 결과는 Table 8과 같다. 전체 468건

79 68 국립보건연구원보 Table 7. Regional distribution of O. tsutsugamushi genotype by phylogenetic analysis based on nucleotide sequence homology of 56 kda type-specific genes from patients in Province Total Genotype Gilliam Karp Kato Boryong Pajoo Gunpo Kawasaki Gyeonggi Gangwon Chungbuk Chungnam Gyeongbuk Gyeongnam Jeonbuk Jeonnam Total (%) (4.3) 33 (7.1) 5 (1.1) 329 (70.1) 15 (3.2) 13 (2.8) 53 (11.3) Table 8. Regional distribution of O. tsutsugamushi genotype by phylogenetic analysis based on nucleotide sequence homology of 56 kda type-specific genes from wild rodents. Location No. of wild rodent Genotype Gilliam Karp Kato Boryong Pajoo Gunpo Yeoju 3 1 Icheon 3 1 Cheolwon Hwacheon Hongcheon Okcheon Goryong 2 1 Sunchang Total Table 9. Regional distribution of O. tsutsugamushi genotype by phylogenetic analysis based on nucleotide sequence homology of 56 kda type-specific genes from mites. Location Genotype Gilliam Karp Kato Boryong Pajoo Gunpo Cheolwon 8 Hongcheon Okcheon 1 3 Goryong 2 1 Sunchang 5 Total

80 Ⅰ. 연구보고 O. tsutsugamushi의 균체 지방산 패턴 표준균주인 Gilliam, Karp, Kato와 국내 분 리주 Boryong, Pajoo, Yongworl주에 대하여 gas chromatography를 이용하여 균체 지방산 을 분석한 결과 (Fig. 15), 6균주 모두에서 균 체 지방산 조성이 비슷하였으며, 그 조성은 C14:0 (0.9±0.2%), C16:0 (12.7±1.7%), C18:0 (15.3± 1.5%), C16:1ω7c (5.2±1.1%), C18:1ω 9c(57.3±3.5%) (평균농도±SD)로 분석되었다. Amano 등 (1987)의 보고에서와 같이 3-hydroxy fatty acid는 존재하지 않는 것으로 나타났다 (Table 16). 이는 O. tsutsugamushi에 LPS가 존재 하지 않음을 나타낸다. 특이한 점은 eicosenoic acid C20:1ω9c는 Yongworl주를 제외한 모든 균 주에서 발견된 반면, C17:0CYCLO (0.32%)는 Karp주에서만 발견되었다. 검출된 3종류의 주요 지방산 C18:1ω9c, C18:0, C16:0 농도에 대한 통 계 분석에서 표준편차는 각각 ±3.5%, ±1.5%, ±1.7%였으며 변이계수는 6.1%, 9.8%, 13.4%로 조사된 6개 균주에서 매우 유사한 농도를 나타 내어 같은 종내 균주 간에 유의한 차이는 찾아 볼 수 없었다 (Table 11). 특이한 점은 다른 세균에서는 발견되지 않는 C20:1ω9c, C20:4ω6,9,12,15c, C20:1ω7c와 같은 긴 사슬의 지방산이 %로 적은 비율이지만 Yongworl주를 제외한 5균주 모두에서 발견되었다. Table 10. Cellular fatty acid profiles of O. tsutsugamushi strains. Fatty acid % Total fatty acids Gilliam Karp Kato Boryong Pajoo Yongworl Saturated fatty acid : C14: C15: C16: C17: C18: Unsaturated fatty acid : C16:1 ω9c C17:1 ω8c C18:1 ω9c C18:1 ω7c C18:1 ω5c C20:4 ω6,9,12,15c C20:1 ω9c C20:1 ω7c Branched fatty acid : C19:1 iso Cyclopropane : C17:0 CYCLO 0.32 Summed feature Summed feature Summed feature Unknown

81 70 국립보건연구원보 6. 항균제 감수성 검사 Boryong주에 대한 항균제 감수성 시험결과 Fig.7과 같다. Rifampicin과 azithromycine의 경우 4-16μg/ml 농도를 처리한 결과와 비교하여 μg/ml 농도에서도 감염된 세포당 균수에 서 유사한 결과를 나타내어 MIC가 μg/ml 농도 이하로 감수성을 나타내었다. doxycycline과 tetracycline의 경우는 0.25와 μg/ml 농도 범 위에서 MIC를 나타내어 Miyamura 등에 의하여 보고된 결과인 μg/ml와 유사하게 나타 나 감수성임을 확인하였다. Erythromycine도 MIC가 0.25μg/ml 농도 이하 였으나, chloroamphenicol은 0.25μg/ml 농도에서 도 저항성을 나타내었으나 본 실험에서 그 이하 의 농도에 대한 시험을 실시하지 않아 MIC가 Caculated tsutsugamushi/ce 확인되지 않았다. 분리균주 중 03-S17(Gunpo형), 03-S32 (Gunpo형), 03-S53(Pajoo형)주에 대하여 균주별 azithromycine 에 대한 감수성 시험 결과를 Boryong주에 대한 결과와 비교하였다(Fig. 8). 03-S32주를 제외한 2 주는 Boryong주와 유사하게 μg/ml 농도에 서 세포 당 균수가 현저하게 적어진데 반하여 03-S32주는 μg/ml 농도에서 MIC 를 나타내었다. Doxycycline에 대해서는 Fig. 9와 같이 03-S53 주의 MIC가 μg/ml 농도 이하로 가장 감수성이 높게 나타났으며 나머지 2주는 MIC가 μg/ml로 Boryong주와 유사하게 나타났다. Az ithromycin Doxycycline Chloramphenicol Tetracycline Rifampicin Erythrymycin Concentration of Antibiotics (μg/ml) Fig. 7. Growth of O. tsutsugamushi Boryong strain after 72 hr incubation in L929 cells in the presence of various antibiotics Caculated tsutsugamushi/cell Boryong 03-S53 03-S32 03-S Concentration of Antibiotics (μg/ml) Fig. 8. In vitro activities of azithromycine against four O. tsutsugamushi strains

82 Ⅰ. 연구보고 71 Caculated tsutsugamushi/ Cell Boryong 03-S53 03-S32 03-S Concentration of Antibiotics (μg/ml) Fig. 9. In vitro activities of doxycycline against four O. tsutsugamushi strains 고 찰 쯔쯔가무시증 환자 발생이 최근 수년 동안 급격하게 증가하고 있다. 따라서 본 연구에서는 국내 발병 환자, 자연계 숙주동물 및 매개체가 보유하고 있는 O. tsutsugamushi에 대하여 혈 청형 및 유전자형의 분포 특성 및 다양성 등을 분석하여, 지역별 형별 분포를 파악하고, 새로 운 형의 균주 존재 여부를 확인하여 진단이나 백신개발에 활용 가능한 정보를 얻고자 하였다. 또한 국내 분리균주를 확보하여 병원체에 대한 병원성, 면역 반응 등 관련 연구에 이용할 수 있는 기반을 마련하고자 하였다. Enatsu 등 (1999)은 분리균주에 대한 유전자 형 동정에 Gilliam 주와 88% 상동성을 보이는 JG형, Karp주와 % 상동성을 나타낸 JP-1와 JP-2아형, Kawasaki, Kuroki형으로 구분 하였다. 다른 균주들과 가장 낮은 상동성 (63-69%)을 보인 Shimokoshi 형 그리고 태국에 서 분리된 TA686, 678, 716, 763은 다른 균주들 과 85%보다 낮은 상동성을 나타내어 모두 독 립된 형으로 구분되었으며, 타이에서 털진드기 로 부터 분리된 LF-1과 LA-1주도 계통수에서 다른 균주와 구분되었다. 그리고 LX-1은 다른 균주들과 80% 보다 낮은 상동성을 나타내어 새로운 형으로 동정하었다. Tamura 등 (2001)도 일본의 Saitama 현에서 설치류로 부터 분리된 15균주를 같은 방법으로 동정하였으며 Karp 형 으로 알려진 Karp, JP-1, JP-2와 90% 이하의 상동성을 나타내어 Saitama type 이라는 새로운 형으로 명명하였다. 본 연구에서는 2003년에 경기, 강원, 충청, 전 라, 경상도 지역에서 발생한 급성 발열성환자의 혈액 검체를 수집하여 56 균주를 분리하였다. 이들 유전자형을 분석한 결과 Boryong형 43주, Gunpo형 8주, Pajoo형 6주, Karp형 1주 순으 로 분포하였으며 Gilliam형과 Kato형은 확인되 지 않았다. 지역별 분포는 충남 이남에서는 주 로 Boryong형이 분포하였고, 경기, 강원, 충북 에서는 Boryong형 이외의 Karp, Pajoo, Gunpo형 의 균주가 분포하였다. 순창과 철원에서 채집된 등들쥐 (Apodemus agrarius)에서 분리된 2균주 는 모두 Pajoo형으로 동정되었다. 또한 분리균의 혈청형을 확인하기 위하여 표준균주인 Gilliam, Karp, Kato주와 국내 분리 주로 1990년 Chang 등에 의하여 보고된 Boryong주, 그리고 본 연구의 결과인 Yongworl 주, Pajoo주, Gunpo주의 단클론항체에 의한 혈 청형 동정 결과는 유전자형 분석 결과와 동일 하였다. 균이 분리된 동일한 검체로부터 O. tsutsugamushi의 주요 표면 항원 단백인 56 kda 유전자에 대한 Nested-PCR 산물의 염기

83 72 국립보건연구원보 서열 분석 결과가 분리균주의 혈청형과 일치하 여 본 연구에서 확립된 방법으로 분리주 및 임 상 검체의 유전자형을 동정할 수 있는 의의가 크며, 향후 국내에서의 지역별 O. tsutsugamushi 의 분자 역학적 연구에 기반 자료로 활용할 수 있다. 한편 2003년부터 2005년 까지 수집된 급성 발열성환자 혈액 검체로부터 nested PCR에 의 하여 유전자가 검출된 468건 중 Boryong형이 329 (70.1%)건으로 국내에 가장 많이 분포하 여 분리주의 77%와 유사한 양상을 보여주었다. 그러나 분리주에서는 없었던 Kawasaki형이 53(11.3%)건, Gilliam형이 20(4.3%)건 Kato형 (1.1%) 순으로 차이가 있었다. 이는 자료 축적 이 이루어지면 지역별 유형이 뚜렷해질 것으로 사료된다. 한편 강원지역에는 Karp형과 Gunpo, Boryong, Pajoo형의 순으로 분포하였고, Boryong 형은 중부 이남 지역에 주로 분포하였다. 특히 현재까지 우리나라에서 존재하지 않는 것으로 알려진 Kato형의 유전자가 전남지역의 검체에 서 검출되었으며, Kawasaki형도 경기 32건을 비 롯하여 충남 (4건), 경북 (13건), 전남 (3건), 경 남(1건) 지역에서 총 53건이 검출되어 국내에도 Kato형과 Kawasaki형의 O. tsutsugamushi가 존재 할 가능성을 확인하였다. 또한 들쥐 혈액에서 특이 56 kda 유전자 검 출은 Karp형의 분포가 57.6%로 가장 많았으며, Boryong형은 33.3%로 환자 검체에서와 다른 양 상을 보였다. 그러나 털진드기 검체에서 총 23 건 중 20건 (83.3%)이 Boryong형으로 분석되어 적은 수이지만 향후 국내의 환자 분리주와 매 개체와의 쯔쯔가무시 형과 지역별 상관 관계를 밝힐 수 있는 다각적 연구가 필요한 것으로 사 료된다. 본 연구에서 O. tsutsugamushi의 지방산 조성의 분석 결과 주요 지방산은 C18:1ω9c( %), C18:0(15.3=1.5%), C16:0( %)으로 전형적 인 그람 음성균의 특성을 나타냈다. 1987년 Amano 등에 의하여 보고된 4개의 지방산인 C18:0 (27%), C16:0(25%), C18:1(44%), C18:2(44%)로 분석된 결과와 차이를 나타내었으며, 이는 본 연 구에서는 MIDI 시스템을 이용하여 분석하여 좀 더 상세하고 분명하게 확인되었기 때문이라 사 료된다(17). 또한 C18:0ω9c가 57.3%로 매우 높 은 비율을 차지하는 것은 O. tsutsugamushi의 분 류상 중요한 지표로 볼 수 있다. 한편 국내 분리주에 대한 doxycycline을 위시 한 항균제 감수성 시험은 1996년 태국의 균주 에서 doxycycline 대한 저항성 균주의 보고와는 달리 조사된 국내 분리주는 모두 감수성임을 확인하였으며, 향후 분리주의 지속적인 항균제 감시가 요구된다. 결 론 년 급성 발열성환자의 혈액 검체 수집 하여 56 균주를 분리하여 유전자형을 분석 한 결과 Boryong형 43주, Gunpo형 8주, Pajoo형 5주, Karp형과 Yongworl형이 각각 1 주 순으로 분포하였으며 Gilliam형과 Kato형 은 확인되지 않았다. 2. 지역별 분포는 충남 이 남에서는 주로 Boryong 주가 분리되었고 경기, 강원, 충북에서는 Boryong주 이외의 Karp, Yongworl, Pajoo, Gunpo형의 균주가 분포하였다. 3. 순창과 철원에서 채집된 등들쥐 (Apodemus agrarius)로부터 2균주를 분리하였으며 모 두 Pajoo형으로 동정되었다. 4. 환자 혈액 검체에서 nested PCR에 의하여 검출된 유전자 468건 중 Boryong형이 329 (70.1%)건으로 국내 가장 많이 분포하였으 며, Kawasaki형이 53(11.3%)건, Karp형이 33(7.1%)건, Gilliam형이 20(4.3%)건 순으로 분포 하였으며, 강원지역에는 Karp형과 Gunpo, Boryong, Pajoo, Yongworl형의 순으 로 분포하였고, Boryong형은 중부 이남 지

84 Ⅰ. 연구보고 73 역에 주로 분포함을 알 수 있었다. 5. 채집된 들쥐 81마리 중 33마리(40.7%)에서 O. tsutsugamushi 특이 유전자가 검출되었고 환자 검체와는 달리 Karp형의 분포가 57.6% 로 가장 많았으며, Boryong형은 33.3%이었다. 6. 털진드기 검체에서는 총 23건 중 20건 (83.3%)이 Boryong형으로 분석되었으며 Gilliam, Karp, Gunpo형이 각각 1건씩 검출 되었다. 7. O. tsutsugamushi 표준균주인 Gilliam, Karp, Kato와 국내 분리주 Boryong, Pajoo, Yongworl 주에 대하여 gas chromatography를 이용하여 균체 지방산을 분석한 결과 균주 모두에서 균 체 지방산 조성이 비슷하였으며, 그 조성은 C14:0(0.9±0.2%), C16:0(12.7±1.7%), C18:0 (15.3±1.5%), C16:1ω7c(5.2±1.1%), C18:1ω 9c(57.3±3.5%) (평균농도±SD)로 분석되었으 며, C18:0ω9c가 57.3%로 매우 높은 비율을 차지하는 것은 O. tsutsugamushi의 분류상 중 요한 marker로 볼 수 있다. 8. 조사된 국내 분리 균주는 rifampicin, azithromycine, doxycycline, tetracycline, erythromycine chloroamphenicol 등의 항균제(MIC μg/ml)에 감수성이었다. 9. 국내 O. tsutsugamushi 분리주에 Boryong형 이외에 Gunpo형 및 Pajoo형을 추가하여 진 단을 확대할 예정이며, 향후 분리주의 병원 성, 면역원성, 분자역학적 연구 등은 국가의 기반연구에 유용한 자료로 제공될 수 있다. 참고문헌 1. Amano, K., Tamura, A., Ohashi, N., Urakami, H., Kaya, S., and Fukushi, K Deficiency of peptidoglycan and lipopolysaccharide components in Rickettsia tsutsugamushi. Infect. Immun. 55: CDC and NIH Biosafety in microbiological and biomedical laboaltories. U.S. Government Printing Office, Washington, DC. 3. Chang, W.H., Kang, J.S., Lee, W.K., Choi, M.S., and Lee, J.H Serological classification by monoclonal antibodies of Rickettsia tsutsugamushi isolated in Korea. J. Clin. Microbiol. 28: Eisemann, C.S., and Osterman, J.V Identification of strain-specific and groupreactive antigenic determinants on the Karp, Gilliam and Kato strains of Rickettsia tsutsugamushi. Am. J. Trop. Med. Hyg. 34: Enatsu, T., Urakami, H., and Tamura, A Phylogenetic analysis of Orientia tsutsugamushi strains based on the sequence homologies of 56-kDa type-specific antigen genes. FEMS. Microbiol. Lett. 180: Furuya, Y., Yoshida, Y., Katayama, T., Yamamoto, S., and Kawamura, A. Jr Serotype-specific amplification of Rickettsia tsutsugamushi DNA by nested polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 31: Hickman, C.J., Stover C.K., Joseph S.W., and Oaks E.V., Nucleotide, Protein Molecular cloning and sequence analysis of a Rickettsia tsutsugamushi 22 kda antigen containing B- and T-cell epitopes. Microb. Pathog. 11: Hisato, H,. Koichi, M,. Akihiki, O,. Yasuhiro, Nobuyoshi, T., and Hirohito, T. Genotypic identification of Rickettsia tsutsugamushi by restrction fragment length polymorphism analysis of DNA amplified by the polymerase chain reaction. Am. J. Trop. Med. Hyg., 54: Kang, J.S., and CHang, W.H Antigenic

85 74 국립보건연구원보 Relationship among the Eight Prototype and New Serotype Strains of Orientia tsutsugamushi Revealed by Monoclonal Antibodies. Microbiol. Immunol. 43: Kawamori, F., Akiyama, M., Sugieda, M., Kanda, T., Akahane, S., Uchikawa, K., Yamada, Y., Kumada, N., Furuya, and Y., Yoshida, Y., et al Epidemiology of Tsutsugamushi disease in relation to the serotypes of Rickettsia tsutsugamushi isolated from patients, field mice, and unfed chiggers on the eastern slope of Mount Fuji, Shizuoka Prefecture, Japan. J. Clin. Microbiol. 30: Kawamori, F., Akiyama, M., Sugieda, M., Kanda, T., Akahane, S., Yamamoto, S., Ohashi, N., and Tamura, A Two-step polymerase chain reaction for diagnosis of scrub typhus and identification of antigenic variants of Rickettsia tsutsugamushi. J. Vet. Med. Sci. 55: Miyamura, S., Ohta, T., and Tamura, A Comparison of in vitro susceptibilities of Rickettsia prowazekii, R. rickettsii, R. sibirica and R. tsutsugamushi to antimicrobial agents. Nippon Saikingaku Zasshi. 44: Murata, M., Yoshida, Y., Osono, M., Ohashi, N., Oyanagi, M., Urakami, H., Tamura, A., Nogami, S., Tanaka, H., and Kawamura, A. Jr Production and characterization of monoclonal strain-specific antibodies against prototype strains of Rickettsia tsutsugamushi. Microbiol. Immunol. 30: Ohashi, N., Fukuhara, M., Shimada, M., and Tamura, A Nucleotide Phylogenetic position of Rickettsia tsutsugamushi and the relationship among its antigenic variants by analyses of 16S rrna gene sequences. FEMS. Microbiol. Lett.125: Ohashi, N., Koyama, Y., Urakami, H., Fukuhara, M., Tamura, A., Kawamori, F., Yamamoto, S., Kasuya, S., and Yoshimura, K Demonstration of antigenic and genotypic variation in Orientia tsutsugamushi which were isolated in Japan, and their classification into type and subtype. Microbiol. Immunol. 40: Ohashi, N., Nashimoto, H., Ikeda, H., and Tamura, A Nucleotide, Protein Diversity of immunodominant 56-kDa type-specific antigen (TSA) of Rickettsia tsutsugamushi. Sequence and comparative analyses of the genes encoding TSA homologues from four antigenic variants. J. Biol. Chem. 267: Qiang, Y., Tamura, A., Urakami, H., Makisaka, Y., Koyama, S., Fukuhara, M., and Kadosaka, T Phylogenetic characterization of Orientia tsutsugamushi isolated in Taiwan according to the sequence homologies of 56-kDa type- specific antigen genes. Microbiol. Immunol. 47: Seong, S.Y., Park, S.G., Kim, H.R., Han, T.H., Kang, J.S., Choi, M.S., Kim, I.S., and Chang, W.H Isolation of a new Orientia tsutsugamushi serotype. Microbiol. Immunol. 41: Shim, S.K., Shin, Y.K., Choi, E.N., Han, B.G., Lee, H.K., Choi, Y.S., Lee, B.C., Yoon, K.S., and Park, M.Y Analysis of Cellular Fatty Acids in Orientia tsutsugamushi as Taxonomic Markers. Microbiol. Immunol. 49: Silverman, D.J., and Wisseman, C.L. Jr Comparative ultrastructural study on the cell envelopes of Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, and Rickettsia tsutsugamushi. Infect. Immun. 21: Tamura, A., Makisaka, Y., Kadosaka, T., Enatsu, T., Okubo, K., Koyama, S., Yu, Q.,

86 Ⅰ. 연구보고 75 and Urakami, H Nucleotide, Protein Isolation of Orientia tsutsugamushi from Leptotrombidium fuji and its characterization. Microbiol. Immunol. 44: Tamura, A., Ohashi, N., Koyama, Y., Fukuhara, M., Kawamori, F., Otsuru, M., Wu, P.F., and Lin, S.Y Characterization of Orientia tsutsugamushi isolated in Taiwan by immunofluorescence and restriction fragment length polymorphism analyses. FEMS. Microbiol. Lett. 150: Tamura, A., Ohashi, N., Urakami, H., and Miyamura, S Classification of Rickettsia tsutsugamushi in a new genus, Orientia gen. nov. as Orientia tsutsugamushi comb. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 45: Tamura, A., Urakami, H., and Ohashi, N A comparative view of Rickettsia tsutsugamushi and the other groups of rickettsiae. Eur. J. Epidemiol. 7: Tamura, A., Urakami, H., and Takahashi, T Purification of Rickettsia tsutsugamushi by percoll density gradient centrifugation. Microbiol. Immunol. 26: Tange, Y., Kanemitsu, N., and Kobayashi, Y Analysis of immunological characteristics of newly isolated strains of Rickettsia tsutsugamushi using monoclonal antibodies. Am. J. Trop. Med. Hyg. 44: Teruo, Y., Kasuya, S., Noda, S., magano, I., Ohtsuka, S., and Ohtomo, H Newly Isolated Strains of Rickettsia tsutsugamushi in Japan Identified by Using Monoclonal Antibodies to Karp, Gilliam, and Kato Strains. J. Clin. Microbiol Thompson, J.D., Gibson, T.J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. and Higgins, D.G The CLUSTAL-X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic. Acids. Res. 25: Yamamoto, S., Kawabata, N., Ooura, K., Murata, M., and Minamishima, Y Antigenic types of Rickettsia tsutsugamushi isolated from patients with tsutsugamushi fever and their distribution in Miyazaki Prefecture. Kansenshogaku Zasshi. 63: Yamamoto, S., Kawabata, N., Tamura, A., Urakami, H., Ohashi, N., Murata, M., Yoshida, Y., and Kawamura, A. Jr Immunological properties of Rickettsia tsutsugamushi, Kawasaki strain, isolated from a patient in Kyushu. Microbiol Immunol. 30:

87 76 국립보건연구원보 Characterization of Orientia tsutsugamushi isolated by regions in Korea S.K. Shim, E.N. Choi, S.W. Han, K.J. Hwang, Y.S. Choi, S.H. Park, B.C. Lee, Y.S. Kim 1, H.Y. Kim 2, S.H. Wi 3, D.M. Kim 4, S.W. Kim 5 and M.Y. Park Division of zoonoses Center for Immunology & Pathology NIH, Seoul Korea, Chungnam National University Hospital 1, Wonju Christian Hospital 2, St. Vincent Hospital 3, Chosun University Hospital 4, Kyungpook National University Hospital 5, Korea Purpose : Incidences of tsutsugamushi disease have been increasing notably in Korea. In this study, O. tsutsugamushi was isolated from patients and vectors, from each province, then the serotype, genotype, cellular fatty acid profile, and antibiotics susceptibility was analyzed to find out its regional distribution and to verify whether there are any new variants. Also applying the new types to laboratory diagnosis and to vaccine candidates. Methods : The present study was performed to analyze 58 strains successfully isolated from patients (56 strains) and wild rodents (2 strains), by 56 kda gene sequence homologies, reactivities with type-specific monoclonalantibodies. Specific gene of O. tsutsugamushi detected from patients, wild rodents, and chigger by nested PCR and the amplicons were analyzed using DdeI. The cellular fatty acids of 6 strains of O. tsutsugamushi were examined through the gas chromatography. Boryong type and 3 isolates were tested for susceptibility to tetracycline, rifampicin, erythromycine, chloramphenicol, doxycycline, and azithromycin in cell culture. Results : Fifty-eight isolates were presented; Boryong (43 strains), Gunpo (8 strains), Pajoo (6 strains), and Karp (1strain) type. Detected specific genes (524 cases) of O. tsutsugamushi including 360 cases of Boryong (68.7%), 53 cases of Karp and Kawasaki (10.1%), 14 cases of Gunpo (2.7%), 17 cases of Pajoo (3.2%), and 5 cases of Kato (1.0%) type. All tested 6 strains contained C18:1ω9 C(57.3±3.5 %). C18:0(15.3±1.5 %),and C16:0(12.7±1.7 %) as major components, and none of the strains contained 3-hydoxy fatty acids. The results confirm the susceptibilities of tested strains to antibiotics. Conclusions : We demonstrated the presence of various types of O. tsutsugamushi in Korea. Boryong type, the majority type in Korea, was found primarily in Chungnam, Gyeongsang and Jeolla provinces. Strains belonging to the Pajoo, Yongworl, Gunpo, and Karp type were mainly found in Gangwon, Chungbuk and Gyeonggi provinces. The genes of Kato and Kawasaki type were found in several areas. These results suggest that there are different types in each region. The result of cellular fatty acid profiling of O. tsutsugamushi serves as an important source for identification. Antibiotic resistance was not confirmed among the isolates in Korea. Key words : O. tsutsugamushi, serotype, genotype, isolate, cellular fatty acid This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, 56-76, 2005

88 Ⅰ. 연구보고 77 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 77-94, 2005 Azole계 내성 Candida균의 내성기전 및 분자유전학적 특성 연구 국립보건연구원 감염병센터 약제내성팀 유재일, 최치원, 이영선, 이경민, 김봉수 목 적:임상에서 분리되는 칸디다 분리주의 균종 분포와 항진균제 내성 양상을 분석하고 azole계 항진균제 내성 균주를 대상으로 내성기전을 분석하고자 하였다. 방 법:국내 1,2차 의료원과 종합병원에서 분리된 칸디다 균주를 대상으로 분리 검체별로 분리된 칸디다균의 균종 분포를 분석하였으며, 미량액체희석법(CLSI)을 사용하여 항진균제에 대한 칸디다균 의 MIC를 측정하였다. Azole계 항진균제 fluconazole 내성을 나타낸 C. glabrata 내성관여 유전자를 분석하기 위하여 대상균주의 RNA를 분리하고 slot blot법을 사용하여 CgPDH1, CgCDR1 유전자에 대한 유전자 발현을 검사하였다. 또한 ergosterol 합성 관여 유전자인 ERG11, ERG3 유전자의 돌연 변이에 의한 내성 관여를 조사하기 위해 ERG 유전자를 PCR로 합성 증폭하여 염기서열 분석을 실시 하였다. Genomic 수준에서의 내성과 연관된 유전자 발현은 대상균주의 RNA를 분리하고 genefish primer 120개를 이용한 RT-PCR를 실시하였으며 유전자간 발현도가 증가 혹은 감소한 PCR 산물을 대상으로 염기서열을 분석하였다. 결 과:전국의 칸디다균 총 612 균종의 분포도 조사 및 항진균제 MIC 분석 결과 C. albicans가 가 장 높은 빈도로 검출되었지만 3차병원에서 NAC (non-albicans Candida)종의 분리율이 증가함을 확 인하였다. C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis종간 PFGE 형태는 다른 염색체 DNA 형태를 나타내어 종간 분별에 유용한 반면 항진균제 감수성 균주간 차이는 없었다. 항진균제 감 수성 시험 결과 칸디다균은 5-flucytosine, fluconazole에 내성을 갖는 균주가 관찰되었으며 5-flucytosine에 대해서는 C. albicans, C. tropicalis, C. krusei종이 주로 확인되었으며 fluconazole 에 대해서는 주로 C. glabrata와 C. krusei 균주에서 확인되었다. 결국 C. glabrata 균 주는 fluconazole에 내성을 보이는 경향이 강하며 C. albicans, C. tropicalis는 5-flucytosine 내성 을 나타내는 경향이 있는 것으로 확인되었다. C. krusei 균종은 fluconazole과 5-flucytosine에 모두 내성을 나타내는 것으로 확인되었으나 오히려 voriconazole 항진균제에 모두 2ug/ml의 MIC를 나 타냈다. fluconazole 내성 균주중 C. glabrata 균주를 대상으로 내성과 연관된 유전자 발현을 조한 결과 CgCDR1 유전자가 CgPDH1 유전자보다 더 먼저 약제내성에 관여하는 것으로 확인되었다. 그러 난 ERG3과 ERG11 유전자는 여러 돌연변이가 확인되었지만 아미노산 치환은 없어 본 연구에서 분 리된 내성주의 ERG3, ERG11 유전자에 의한 내성 관여는 없는 것으로 확인되었다. RT-PCR을 이용 한 감수성 균주간 발현이 증가 혹은 감소한 78개의 유전자가 확인되었고 21개의 유전자는 기능이 확 인된 유전자인 반면 57개의 유전자의 단백질 기능은 밝혀진 바 없다. 기능이 확인된 유전자중

89 78 국립보건연구원보 involved in cell wall biogenesis, gamma-glutamylphosphate reductase, acetyl-coa synthetase 등의 유전자는 발현이 증가한 반면 DNA dependent ATPase/DNA helicase B, RIB1 GTP cyclohydrolase II 관련 유전자 발현은 감소하였다. 결 론:전국에서 분리된 칸디다 균종의 분리빈도 분석 결과 non-albicans 칸디다 균종 분리율이 증가하고 있음을 확인하였으며 항진균제에 내성을 보이는 균종은 적지만 azole계에 대해 C. glabrata 종은 C. krusei 종과 더불어 높은 MIC를 나타냈다. C. glabrata 감수성 균주간 발현이 증가 혹은 감 소한 78개의 유전자가 확인되어 현재까지 알려진 내성 관련 유전자 외에 여러 유전자가 직, 간접으로 내성에 관여할 것으로 사료됨. 중심단어:Candida, fluconazole resistance, Differentially expressed gene 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

90 Ⅰ. 연구보고 79 서 론 칸디다 감염은 세계적으로 6번째의 병원감염 균으로 알려져 있으며(2) 응급실에서 4번째로 발생 빈도가 높은 감염균이고 미국에서는 혈류 감염균 중에서도 4번째로 분리 빈도가 높다 (4-5, 18). 특히 AIDS 환자, 장기 이식환자, 화 학요법 치료를 받는 암 환자 같이 면역 체계의 붕괴로 기회감염의 확률이 높은 환자의 칸디다 균을 비롯한 병원성 진균 감염으로 인한 사망 률이 40%에 달하고 있다 (1-3, 6, 7). 진균 감염 증은 지금까지 칸디다 균이 우세균을 점하고 있고 특히 C. albicans가 가장 많이 분리되는 것으로 알려져 왔으나, 최근 보고에 의하면 미 국과 캐나다에서는 Non-albicans 칸디다 (NAC) 종들중 C. glabrata의 혈류 감염이 급속 이 증가되어 C. albicans 다음으로 많이 분리되 고 있으며, 유럽에서는 1997년 혈류 감염을 야 기하는 칸디다균종 중 가장 분리률이 높은 균 주는 C. parapsilosis 이고 그 다음으로 C. glabrata가 많이 분리되는 것으로 보고되고 있 다 (9, 19-24). 혈류감염에서 NAC종들의 분 리 빈도가 높아지고 있고 혈류 감염으로 인한 사망률이 35%까지 알려지고 있으나 국내에서 는 아직까지 극히 일부 병원에서 칸디다의 분 리률만 보고될 뿐 분리주의 분자유전학적, 분자 역학적 특성 조사는 전혀 이루어지지 못하고 있다. 한편 1990년대부터 항진균제 내성은 HIV 감염, 결핵등 장기간 항진균제를 복용하는 환자에게서 높게 발생함으로서 진균감염 치료 를 위한 항진균제제의 개발이 매우 중요하게 대두되었고, 현재까지 5 class(9 agents)의 항 진균제제가 사용되고 있다 (8-9, 11, 14). 약 10여년 전부터 항진균제인 fluconazole이 광범 위하게 사용되기 시작하면서 세계적으로 이 약 제에 대해 내성을 나타내는 Candida albicans, C. dubliniensis, C. glabrata 균주 분리율이 급 속도로 증가하여 (10) 여러 집단의 환자에서 내성 진균으로 인한 사망률이 크게 문제시되고 있다. 특히 fluconazole에 대해 내성을 보이는 균은 azole계의 다른 항진균제에도 교차 내성을 나타내어 더욱 문제가 확산되고 있는 실정이다. 최근 amphotericin-b에 C. glabrata와 C. krusei등이 자연적 내성을 갖는 것으로 밝혀지 고 있고 fluconazole 내성 C. albicans 균주도 증가하며 5-flucytosine 내성 균주도 분리 되 는 등 칸디다 균종의 내성이 확산되고 있다 (12). 현재 항진균제는 9 종류 정도로 한정되 어 있고 부작용으로 인한 새로운 차세대 항진 균제의 필요성이 요구되고 있으므로 항진균제 내성 균주의 약제 내성 기전에 관한 연구가 매 우 필요한 실정이다 (15-17). 따라서 본 연구 에서는 임상에서 분리되는 칸디다 균종의 종별 분포, 분자유전학적 유연관계의 분석 및 azloe 계 항진균제 내성 기전의 분석으로 국내 칸디 다 분리주의 내성현황 및 추이분석과 azole계 항진균제의 분자유전학적 내성 원인을 분석하 고자 하였다. 재료 및 방법 (1) 칸디다 균주의 수집 및 확인동정 국내 대학병원과 1,2차 병의원을 포함한 전국 규모의 병원에서 분리되는 칸디다 분리주를 수 집하고 환자연령, 입원병동, 분리 검체명 등 수 집 가능한 임상정보를 함께 수집하여 실험 분 석 자료로 활용하였다. 임상에서 분리되는 Candida균 동정에는 기본적으로 vitek 동정기기, API 20C kit 및 균종 감별 배지를 사용하였으 며 추가 확인이 필요한 균주의 동정을 위해서 는 rrna 염기서열을 이용한 colony PCR법을 확립하여 동정하였다. Colony PCR법의 대상균 주로는 가장 분리 빈도가 높고 임상적으로 의 미가 있고 Candida 균종의 거의 90%를 차지하 는 주요 4대 분리주인 C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis를 대상 으로 하였다. (2) 칸디다균의 분자형별 조사 국내 분리주의 분자유전학적 특성 및 분리주

91 80 국립보건연구원보 간의 유사성을 파악하고, 항진균제 내성균주와 감수성 균주간 genotype 연관성을 분석하기 위 해 분리되는 칸디다 주요 4대 균종에 대해 PFGE를 실시하였으며 일부 균종에 대해서는 RAPD와 RFLP 시험법을 실시하였다. (3) 항진균제 감수성 시험 및 내성 양상 조사 임상에서 분리된 칸디다 균주의 항진균제 감수 성 검사로 미량액체 희석법(CLSI; 구 NCCLS)과 E-test법을 실시하였다. 시험 항진균제로 azole계 통의 fluconazole, voriconazole과 amphotericin-b, 5-flucytosine 등에 대한 감수성 검사를 실시하였다. (4) 내성 관여 유전자 발현 분석 임상에서 분리된 fluconazole 내성 C. glabrata를 대상으로 현재까지 알려진 내성관여 유전자를 확인하기 위해 C. glabrata의 genomic DNA를 분리하고 ABC transporter family인 CgCDR1, CgPDH1, ERG3, ERG11 유전자를 PCR을 이용하여 확인하였으며 내성 유전자의 발현은 RNA을 분리하고 slot blot을 통해 확인 하였다. 분리된 칸디다 균주와 2003년부터 2004년까지 전국 1,2차 병의원에서 분리된 칸디다균을 수집 하였다. 전국적으로 9개 종합병원에서 333 균주 가 수집되었고 95개 1,2차 병의원으로부터 279 균주가 수집되었다. 따라서 최종 칸디다균으로 확인된 균주는 총612 균주가 확인 동정되었다. (2) colony PCR 칸디다 균 동정에 소요되는 시간을 절약하고 (최소 48시간) 특이성을 높이고자 1차 생화학 적 동정에 의해 균동정이 되지않은 균의 rrna 을 이용한 Candida 균의 동정을 실시하였다. 대 상 균종으로는 칸디다증의 거의 90%를 차지하 는 주요 4대 분리주 C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis를 대상으로 하였고 Candida 4종에 대한 동정 PCR 결과 뚜렷한 균 종간의 차이를 확인하였으며(Fig. 1), 현재 국 내 임상분리주에 대해 적용하고 있다. (5) 발현 정도차를 이용한 내성 관여 유전 자 동정 Fluconazole 내성 C. glabrata의 발현 정도차 를 이용한 유전자 선별은 최근까지 알려진 내 성 유전자외에 내성에 직, 간접으로 관여하는 유전자를 동정하기 위해 RT-PCR을 실시하여 발현의 차이를 보이는 유전자를 분석하였다. 대 상 균주로는 fluconazole 감수성 균주, S-DD (susceptible dose-dependent) 균주, 내성균주 를 대상으로 발현실험을 실시하였다. 결 과 (1) 균주 수집 2002년부터 2004년까지 전국 종합병원에서 Fig. 1. Results of colony PCR of C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata isolates. Lane 1: 1kb plus DNA Ladder, Lane 2: C. glabrata, Lane 3: C. parapsilosis, Lane 4: C. albicans, Lane 5: C. tropicalis (3) 칸디다 균종 분포 수집된 612 균주의 주된 분리종으로는 C. albicans (51.4%), C. tropicalis (20.7%), C. parapsilosis (13.7%), C. glabrata (9.1%) 균 종이 주요 칸디다 균종으로 가장 많이 분리되

92 Ⅰ. 연구보고 81 었으며 전체 칸디다 균종의 95%의 비중을 차 지하였다 (Table 1). 3차 병원과 1,2차 병의원 을 비교하였을 때 모두 4대 주요 칸디다 균종 이 가장 빈번하게 분리되었으며 그중에서 C. albicans가 모든 병원급에서 가장 많이 분리되 었다. 그러나 3차 병원의 경우 C. albicans (46.6%)의 분리 빈도가 non-albicans(53.4%) 균 주 보다 낮은 빈도로 분리되었다(Table 1). C. albicans(46.6%)의 분리 빈도가 칸디다 주요 4 균종외에 3차 병원에서는 C. guilliermondii, C. famata, C. intermedia, C. krusei, C. lusitaniae, C. utilis, C. holmii, C. humicola, C. rugosa 등이 분 리되었고 1,2차 병원에서는 C. guilliermondii, C. krusei, C. lusitaniae 균주가 분리되었다. 검체별 로는 3차병원의 경우 50% 이상이 혈액검체에서 분리 되었으며 뇨와 객담 검체 순으로 칸디다 균 분리가 높게 확인된 반면 1,2차 병의원의 경 우 객담과 뇨 검체에서 전체 279 균주중 191 균주가 확인 동정되었다. 그밖의 분리 검체로는 여성의 질, 대변, 상처, 농양, 기관지액, 감염주 위, 농, 조직 등으로 다양한 부위에서 칸디다 균이 검출되었다. 1,2차 병의원과 3차병원을 서 로 비교했을 때 년도별 칸디다균의 분리 빈도 의 큰 차이는 없었으나 3차 병원의 혈액분리주 는 C. parapsilosis가 C. albicans 균주와 거의 유 사한 분리 빈도를 나타냈다 (Table 2). 수집된 균주와 더불어 3차 병원에서 분리된 균주의 환 자 연령대를 조사한 결과 신생아 19일생부터 91세까지 전 연령대에 거쳐서 균주가 분리되었 으며, 60세 이상의 환자에서 가장 높은 빈도 (49%)를 나타냈으며 41-60세(26.5%), 0-20세 (17%), 21-40세(7.5%)의 순으로 칸디다 균이 분 리되었다. 혈액 분리주의 경우 3차 병원에서는 주로 C. albicans와 C. parapsilosis가 가장 많이 분리되었으며 분리 빈도에 있어 두 균종이 거 의 유사하였다. 반면 년 1,2차 병의원 의 혈액분리주에서는 C. parapsilosis가 소수지만 우세종으로 확인되었다. 객담에서 분리된 칸디 다 균종은 3차병원에서는 C. albicans가 가장 많 이 분리된 반면 1,2차 병의원의 경우 C. albicans와 더불어 C. tropicalis가 많이 분리되고 C. glabrata가 위 3 균종의 50% 정도의 빈도로 분리되었다. 뇨 검체에서 분리된 주요 칸디다 균종으로는 3차 병원의 C. albicans와 C. glabrata 가 주된 분리주로 확인되었으며 1,2차 병의원에 서는 C. albicans, C. tropicalis가 우세종으로 분 리되었다. 특히 3차 병원의 경우 주요 칸디다 4 균종이 모두 분리된 반면 1,2차 병의원에서는 C. albicans와 C. tropicalis만이 주요 균종으로 분 리 동정되었다. Table 1. Species distribution of 612 Candida isolates from tertiary hospitals (333 isolates) and non-tertiary hospitals (279 isolates) from 2002 to 2004 C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis C. glabrata C. guilliermondii C. famata C. intermedia C. krusei C. lusitaniae C. utilis C. holmii C. humicola C. rugosa Species No. (%) of isolates Tertiary hospitals 155 (46.6) 74 (22.2) 46 (13.8) 37 (11.1) 5 (1.5) 5 (1.5) 1 (0.3) 3 (0.9) 3 (0.9) 1 (0.3) 1 (0.3) 1 (0.3) 1 (0.3) (4) 분자유전학적 형별 분석 1) PFGE Non-tertiary hospitals 160 (57.4) 10 (3.6) 81 (29) 19 (6.8) 2 (0.7) 5 (1.8) 2 (0.7)

93 82 국립보건연구원보 Table 2. Species distribution of Candida spp. in blood, sputum, and urine specimens ( ) Blood (209) Sputum (151) Urine (133) Species TH (192) NTH (17) TH (20) NTH (131) TH (73) NTH (60) C. albicans C. tropicalis C. parapsilosis C. glabrata C. famata C. guilliermondii C. holmii 1 C. humicola 1 C. rugosa 1 C. intermedia 1 C. krusei 1 3 C. lusitaniae C. utilis 1 TH; tertiary hospitals, NTH; non-tetiary hospitals 분리된 Candida균종 중 C. albicans 124주, C. parapsilosis 51주, C. glabrata 36, C. tropicalis 38주를 대상으로 PFGE를 실시하여 chromosomal DNA를 관찰하고 3차병원과, 1,2차 병의원 과의 균주특성 차이, 감수성 균주와 내성균주간 의 변화를 관찰하였다 (Fig. 2). PFGE 결과 C. albicans의 경우 전체 염색체 band의 분포를 보 면 I, II, III의 3 구획을 기준으로 분포하면서 각 범위내에서 다양한 band 크기를 나타내고 있었다. 그러나 일부 균주에서는 I과 II 사이에 일부 염색체 band가 관찰되었고 dendrogram을 통한 분석에 의하면 70% 이내 유사 범위내에 서 7개 정도의 group 으로 분류할 수 있었다. MIC별 균주간의 염색체 DNA의 특이적인 변이 는 관찰되지 않았다. C. glabrata의 염색체는 총 10-11개 정도의 염색체를 가지고 있었으며 대부분이 1.37mb (megabase) 이하는 일정한 band 양상을 보이는 반면 1.37mb 이상은 2개의 염색체가 서로 다른 크기로 분포하고 있었다. 본 연구에서 감수성 시험에 의해 SDD 균주로 확인된 C. glabrata 284, 296 균주와 내성 균주 인 C. glabrata 116, 149 균주는 모두 다른 PFGE type을 갖고 있었으며, 감수성 균주 32 균주의 PFGE 양상도 다양하게 관찰되었다. 전 체 36종의 PFGE 결과를 dendrogram으로 연관 성을 분석한 결과 29 가지의 다른 type으로 분 류할 수 있었고 총 36주중 29주는 75% 이상이 유사한 양상을 나타냈다. C. parapsilosis 51주 를 대상으로 PFGE을 실시한 결과 3가지 type 으로 분류 할 수 있었고 80% 범위의 유사성을 갖고 있었다. C. tropicalis의 PFGE를 분석한 결과 6-8개 정도의 염색체 DNA가 관찰되었고 크게 2개 group으로 분별할 수 있었다.

94 Ⅰ. 연구보고 83 Fig. 2. Dendrogram of PFGE patterns in Candida isolates. (A) C. albicans, (B) C. tropicalis, (C) C. glabrata, (D) C. parapsilosis 2) RAPD RAPD 분석은 PCR을 이용하여 실시하였으며 사용한 primer는 M13 phage primer을 사용하였 다(Fig. 3). C. albicans는 총 9개의 type으로 분 류할 수 있었다. 가장 많이 발견되는 type으로 는 2kb, 4kb의 두가지 band를 갖는 type이며 2kb main band가 없는 균주도 소수 관찰되었으 며 2kb, 4kb와 함께 약 1.5kb band를 갖는 type 도 관찰되었다. C. parapsilosis 분리균중 일부 51 주를 대상으로 실시한 결과4가지 정도 type이 분류되었다. 주요 band로는 약 1.6 kb의 band가 관찰되었으며 모든 균종에서 공통적으로 생성 되었다. 일부 균종에서는 1.6 kb와 4 kb가 주요 band로 나타났고 기타 다양한 PCR 산물도 관 찰되었다. C. glabrata의 경우 PFGE의 유형과는 다르게 2가지 type만이 관찰되었다. 약 2.9 kb 정도의 공통적인 band가 생성되고 이 band보다 작은 band가 나타났다. (A) M M bp M M bp

95 84 국립보건연구원보 Fig. 3. The RAPD patterns of Candida spp. (A) RAPD patterns of C. albicans, (B) RAPD patterns of C. parapsilosis, (C) RAPD patterns of C. glabrata : Lane 1, 26, 27, 39; 1kb plus DNA ladder, Lane 2-25, 28-38; C. glabrata isolates, fluconazole SDD isolate; 284(lane 36) and 296(laen 38), fluconazole resistance isolates ; 116(lane 20) and 149(lane 28). 3) RFLP RFLP 분석은 C. albicans 균주만을 대상으로 실시하였다. 분리된 염색체 DNA를 HinfI 제한 효소로 처리후 전기영동 관찰한 결과 C. albicans는 14 type까지 분류가 가능하였다. 가 장 많이 관찰된 type으로는 5.1 kb의 band을 갖는 유형, 5.4 kb의 band를 갖는 유형, 5.5 kb 의 band를 갖는 유형 등 3가지 형태를 나타낸 균주가 대다수를 나타내었다 (Fig. 4) bp bp M M Fig. 4. The RFLP patterns of C. albicans isolates. M; supercoiled DNA ladder marker (5) 항진균제 감수성 시험 결과 전국에서 수집된 칸디다 균주 총 612 균주에 대하여 항진균제 감수성 시험을 실시하였고 균 종별, 병원별 MIC 50, MIC 90 은 Table 3과 같으며, 주요 칸디다 균종의 항진균제에 대한 약제내성 정도는 Table 4와 같다. 모든 균종이 amphotericin B에 대해 1ug/ml 이하의 MIC를 나타냈으며 MIC 범위가 ug/ml인 균이 3차 병원 균 주중 83.1%로 나타난 반면 1,2차 병의원에서는 78.1% 칸디다 균종이 MIC 범위가 0.5-1ug/ml로 다소 높게 나타났다. 3차병원에서 분리된 C. glabrata 균주가 amphotericin B에 대해 낮은 MIC를 나타낸 반면 1,2차 병의원에서는 C. parapsilosis와 C. glabrata 균종이 다른 균종보다 낮 은 MIC를 나타냈다. 4종류의 실험 항진균제중 amphotericin B에 대해 거의 모든 균주들이 감 수성을 나타내었으나 5-flucytosine 제제에 대해 3차병원 칸디다 주요 균종 252 균주중 11 균주 에서 중간내성과 내성을 나타냈으며 이중 7 균 주는 C. albicans에서 3균주는 C. krusei 균종이 1균주는 C. humicola 균종에서 확인되었다. 1,2 차 병의원의 경우도 265 균주중 C. albicans, C. tropicalis, C. krusei 3 균종에서 확인되었으며 C.

96 Ⅰ. 연구보고 85 albicans에서 3균주, C. tropicalis에서 4균주, C. krusei에서 4균주가 중간내성과 내성을 나타내었 다. fluconazole과 voriconazole에 대한 감수성 시험 결과, fluconazole 내성주는 C. glabrata와 C. krusei 균주에서 3차, 1,2차 병의원 모두에서 검출 되 었으며 S-DD 균주는 C. glabrata, C. krusei 균주 외에 C. tropicalis, C. guilliermondii에서도 확인 되었다. voriconazole 항진균제에 대해서는 아직 까지 CLSI법에 breakpoint가 확립되어 있지 않지 만 대다수의 균주가 MIC 2ug/ml의 범위에 속했으며 6균주가 4 ug/ml MIC 8ug/ml을 나 타냈다. 전체적으로 C. glabrata 균주는 fluconazole에 내성을 보이는 경향이 강하며 C. albicans, C. tropicalis는 5-flucytosine 내성을 나타내는 경 향이 있는 것으로 확인되었다. C. krusei 균종은 fluconazole과 5-flucytosine에 모두 내성을 나타내 는 것으로 확인되었으나 오히려 voriconazole 항 진균제에 모두 2ug/ml의 MIC를 나타냈다.

97 86 국립보건연구원보 Table 4. MICs according to CLSI breakpoint categorization for Candida spp. isolated from tertiary hospitals and non-tertiary hospital Species amphotericin B 5-flucytosine fluconazole voriconazole S R S I R S S-DD R Tertiary hospitals C. albicans C. tropicalis C. glabrata C. guilliermondii C. famata C. krusei C. humicola Non-tertiary hospitals C. albicans C. tropicalis C. glabrata C. krusei S-DD : susceptible dose-dependent (6) C. glabrata fluconazole 내성주의 유 전자 발현 분석 내성 유전자의 발현양상을 분석하기 위해 C. glabrata의 RNA을 분리하여 slot blot을 실시하였 으며 내성 관련 유전자인 CgCDR1, CgPDH1을 probe로 사용하였다 본 실험에서는 fluconazole 내 성주(C. glabrata 116, 149)의 경우 감수성 균주 (C. glabrata 31)보다 CgCDR1, CgPDH1 유전자의 발현 양상이 높게 나타났다. CgCDR1의 경우 내 성균주 149에서 감수성 균주보다 2배 이상 많이 발현되는 것으로 확인되었으나 역시 내성주인 116 균주에서는 149 균주보다는 낮게 발현이 관 찰되었다 (Fig. 5. A). CgPDH1의 경우 감수성 균 주보다는 상대적으로 약간 발현이 많아 보이지 만 CgCDR1 유전자의 발현보다는 낮게 발현이 관 찰되어 CgCDR1 유전자의 발현이 내성에 더 깊 이 관여하는 것으로 나타났다. 또한 C. glabrata 감수성 균주 31, 33, 36 균주를 대상으로 단계별 MIC 농도를 높이면서 배양하여 내성 농도까지 fluconazole 약제 내성을 유도하여 가장 약제 내 성 유도가 잘 된 C. Glabrata 33번 균주의 단계별 내성 유전자의 발현양상을 관찰한 결과 (Fig. 5. B) CgCDR1 유전자의 경우 약제유도 초기인 8 ug/ml 농도에서부터 발현양이 증대함을 확인한 반면 CgPDH1 유전자는 약 16 ug/ml 약제 농도에 서부터 발현양이 증가함을 확인할 수 있었다. 따 라서 CgCDR1 유전자가 CgPDH1 유전자보다 더 먼저 약제내성에 관여하는 것으로 확인되었다. 약제 내성 관여 유전자중 ERG3, ERG11 유전자 의 돌연변이에 의한 약제 내성을 확인하기 위해 fluconazole 감수성균주 (lane 2, 5), SDD균주 (lane 3, 6), 내성주를 대상으로 ERG3과 ERG11 유전자를 PCR로 확인하여 (Fig. 5 C) 염기서열

98 Ⅰ. 연구보고 87 분석 결과 염기서열 돌연변이는 여러 위치에서 확인되었으나 아미노산 치환은 발견되지 않아 본 연구에서 분리된 내성주의 ERG3, ERG11 유전자 에 의한 내성 관여는 없는 것으로 확인되었다. (c) 3 kb 850 bp 650 bp Fig. 5. Slot blot analysis of CgCDR1 and CgPDH1 gene expression (A, B). PCR product of ERG3 and ERG11 gene from C. glabrata isolates (C). (A) fluconazole susceptible C. glabrata isolate (No. 31), SDD isolate (No 284, 296), resistant isolate (No 116, 149) (B) CgCDR1, CgPDH1 gene expression of fluconazole resistance induced C. glabrata isolate (No 33). (C) PCR products of ERG3 (lane 2-4), ERG11 (lane 5-7) gene from fluconazole susceptible isolate (lane 2, 5; No 31), SDD isolate (lane 3, 6; No 284), resistant isolate (lane 4, 7; No 116). (7) 발현 정도차를 이용한 내성 관여 유전 자의 검색 C. glabrata 균주중 감수성 균주, SDD 균주와 내성 균주를 선별하여 120개의 random primer 을 이용하여 발현되는 유전자의 상대적 비교를 실시하였고 (Fig. 6) 그 결과 258개의 발현량이 상대적으로 다른 유전자를 확인하였다. 전체 258개의 서로 다른 발현차이를 보인 유전자중 의미있게 발현이 증대하거나 감소한 유전자 78 개를 대상으로 2차적으로 다시 전기영동을 통해 발현량의 차이를 확인한 후 염기서열 분석을 실 시하였다. 감수성 균주보다 발현량이 점차적으 로 증가한 유전자는 최종적으로 44개의 유전자 가 확인되었고 감수성 균주보다 발현량이 상대 적으로 감소하는 유전자는 30개가 확인되었다. 또한 감수성 균주, SDD 균주, 내성균주 순으로 발현량이 감소 증가 감소의 양상을 보인 유전자 가 1개, 증가 감소 증가한 유전자가 2개가 확인 되었으나 SDD 균주에서만 발현량이 증가한 유 전자는 1개가 확인되었다 (Table 5). 발현량이 증가한 44개의 유전자의 단백질 산물에 대한 검색 결과 13개의 유전자는 Saccharomyces cerevisiae 균종의 단백질 기능이 밝혀진 유전 자와 상당부분 동일한 것으로 밝혀졌으며 (tryptophany-trna synthetase, carnitine O- acetyltransferase, peroxisomal long-chain fatty acid import protein 2, fumarate hydratase, manganese transporter, transcriptional regulation mediator, general transcriptional adaptor or co-activator, component of actin cortical patches, negative regulator of ras-camp pathway, AAC2 ADP/ATP carrier protein, involved in cell wall biogenesis and architecture, gammaglutamylphosphate reductase, acetyl-coa synthetase) 1개의 유전자는 C. glabrata carnitine acetyltransferase gene으로 또 1개의 유전자는 S. kluyveri putative citrate synthase gene과 동일한 것으로 확인되었다. 그밖의 29개의 유전자는 S. cerevisiae 균종의 단 백질과 유사하거나 또는 매우 유사한 단백질 유전자로 동정되거나 아직까지 C. glabrata에 서 명명이 안된 단백질인 것으로 확인되었다. 내성균주에서 상대적으로 발현량이 감소한 30 개의 유전자를 분석한 결과는 4개의 유전자는 S. cerevisiae 균종의 단백질과 거의 동일한 유 전자로 확인되었고(DNA dependent ATPase/DNA helicase B, RIB1 GTP cyclohydrolase II, YGR132c

88 국립보건연구원보 prohibitin antiproliferative protein, methionine aminopeptidase), 1개의 유전자는 C. glabrata ATP-binding cassette transporter로 동정되었다. 그 외에 25개의 유전자는 S.

99 88 국립보건연구원보 prohibitin antiproliferative protein, methionine aminopeptidase), 1개의 유전자는 C. glabrata ATP-binding cassette transporter로 동정되었다. 그 외에 25개의 유전자는 S. cerevisiae의 유전 자와 마찬가지로 동일하거나 거의 유사한 유전자 로 확인되었다. 한편, 감수성 균주, SDD균주, 내 성 균주 순으로 발현량이 감소, 증가, 감소의 양 상을 보인 유전자 1개, SDD 균주에서만 발현량이 증가한 유전자 1개는 모두 S. cerevisiae의 단백질 과 유사한 유전자로 확인된 반면 증가, 감소, 증 가한 유전자가 2개중 1개는 S. cerevisiae의 heat shock protein과 동일한 유전자로 확인되었다. 발 현량이 상이하여 확인 동정한 유전자는 C. glabrata의 chromosome중 13개 모든 염색체 DNA 에 분포되어 있었으나 (A-M) 주로 E, F, G chromosome에 30개의 발현량이 다른 유전자가 분포하는 것으로 확인되었다. Fig. 6. Repersentitive RT-PCR products of differentially expressed using gene fishing primers. RNA was prepared from fluconazole susceptible C. glabrata isolate (No 31), S-DD (No 284) and resistance isolates (No 116). Table 5. Results of BLAST search of differentially expressed RT-PCR products. Patterns Increased expression Identified gene S. cerevisiae tryptophany-trna synthetase carnitine O-acetyltransferase peroxisomal long-chain fatty acid import protein 2 fumarate hydratase manganese transporter transcriptional regulation mediator general transcriptional adaptor or co-activator component of actin cortical patches negative regulator of ras-camp pathway AAC2 ADP/ATP carrier protein involved in cell wall biogenesis and architecture gamma-glutamylphosphate reductase acetyl-coa synthetase C. glabrata carnitine acetyltransferase gene Unidentified gene 29 gene

100 Ⅰ. 연구보고 89 Decreased expression S. kluyveri putative citrate synthase gene S. cerevisiae DNA dependent ATPase/DNA helicase B RIB1 GTP cyclohydrolase II YGR132c prohibitin antiproliferative protein methionine aminopeptidase 25 gene 고 찰 본 연구에서 실시된 조사연구에 의하면 전국 에서 분리된 칸디다 균종의 분리빈도 분석 결 과는 여전히 C. albicans 균주가 가장 높은 분 리율을 나타냈지만 3차병원의 경우 nonalbicans 칸디다 균종이 53.4%로 C. albicans 보다 분리율에서 높게 나타났고 혈액분리주 내 에서도 높게 나타나 최근 C. albicans 보다 non-albicans인 C. parapsilosis와 C. glabrata 분리율이 상당히 증가하고 있음을 알 수 있었 다. 연령대별 칸디다 균주 분리율에서는 60세 이상의 연령대 (49%)에서 가장 높게 나타나고 가장 신체적인 조건이 양호한 연령대인 대 (7.5%)에서 낮게 나타난 것은 면역기전의 저하 등이 가장 중요한 칸디다 감염의 원인으 로 추정되며 전 연령대에서 칸디다 균이 분리 되는 것은 칸디다 균이 상재균임과 동시에 면 역기전 약화 등 여러요인에 의해 언제든지 칸 디다증을 유발할 것으로 분석된다. 또한 3차병 원의 경우 칸디다 주요 4대 균종외에 1,2차 병 의원에 비해 다양한 균종이 분리된 것은 병원 과 지역사회간의 특징적인 요인이 있을 것으로 보인다. 칸디다 4대 균종외에 3차병원과 1,2차 병의원에서 공통적으로 C. krusei와 C. lusitaniae, C. famata가 소수 분리된 것으로 보 아 계속적인 감시를 통한 추이 분석이 필요할 것으로 사료된다. 칸디다균의 항진균제에 대한 감수성 결과를 분석한 결과 국내에서 가장 많 이 분리되는 C. albicans 균주는 azole계 항진 균제인 fluconazole에 대해 내성을 보이는 균주 가 없는 것으로 판단된다. 이는 국내 여러 진균 관련 연구자를 통해서도 확인이 되고 있으나 또다른 한편으로는 칸디다균이 분리된 검체의 종류에 따른 원인도 일정부분 기여한 것으로 판단된다. 따라서 추후 연구에서는 국내 AIDS 관련 환자나, 당뇨환자, 이식환자, 암환자 등의 면역기전이 실제로 악화된 특정 환자군을 대상 으로 연구가 필요하다. C. albicans 균주의 경 우 오히려 5-flucytosine에 대한 약제 내성 을 보이는 균주가 다수인 것으로 보아 5- flucytosine의 표적 항원의 돌연변이로 인한 내성이 급증하는 것으로 확인되었다. 임상에 서 분리된 C. glabrata와 C. krusei 균주는 fluconazole 항진균제에 대해 다수의 균주가 내 성을 나타낸 것으로 확인되었다. C. glabrata 균주는 53%의 내성율 (SDD 포함)을, C. krusei 균주는 100% (SDD 포함)가 중간내성 및 내성의 MIC를 나타내었다. 현재까지 C. krusei와 C. glabrata 균주 모두 선천적 자연내 성을 많이 보이는 것으로 보고되고 있으나 항 진균제 치료에 의한 내성 또한 보고되고 있어 이에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사 료된다. 특히 C. glabrata 균주는 fluconazole 외의 항진균제에 대해 모두 감수성 MIC를 나 타낸 반면 C. krusei 균주는 flucytosine에 대해 서도 중간내성과 내성을 나타내었고 voriconazole 에 대해서는 모두 2 ug/ml 이하의 MIC를 나타 내 voriconazole 약제에 의한 치료가 유용할 것 으로 판단된다. 현재까지 국내에서는 진균 감염 증 치료에 amphotericin B가 가장 유용하게 사 용되는 것으로 판단되나 본 실험에서 확인된 균주의 amphotericin B에 대한 MIC 50, MIC 90의 범위가 3차병원, 1,2차 병의원 모두에서 0.5

101 90 국립보건연구원보 ug/ml (MIC 50), 1 ug/ml (MIC 90)의 MIC를 나 타내어 약제 독성과 더불어 더 이상 치료 약제로 의 위험성을 내포하고 있는 것으로 나타났다. 따 라서 향후 voriconazole 같은 새로운 항진균제의 임상 치료 대체 제제로의 유용성 평가가 필요 한 것으로 사료된다. 칸디다 균종간 PFGE 분 석에 의하면 주요 4대 균종별 (C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis) PFGE 양상이 확연하게 다르게 관찰되어 균종간 감별 이 유용한 것으로 판단된다. C. albicans는 세 가지 분자형별법을 사용하여 실험하고 각 방법 의 유형을 종합하여 genotyp을 설정한 결과 20 가지 이상의 genotype이 관찰되었다. 수집한 균주의 항진균제 감수성 시험결과 C. albicans 에서 내성 균주를 검출하지 못하여 분자유전학 적 형별과 내성 균주간의 비교 분석은 어려우 나 분자유전학적 형별이 다양하여 균주의 MIC 와의 연관성은 크게 없는 것으로 나타났다. 그 러나 추후 내성 관여 유전자를 probe을 이용한 southern blot 등을 통해 여러 chromosome DNA중 내성 유전자 위치 변이 등의 연구를 하는데 기초자료로 사용할 수 있을 것으로 판단된다. 본 연구에서 확인된 내성 균주중 fluconazole 내성을 나타낸 C. glabrata 균주를 대상으로 내성 관여 유전자의 발현을 조사하였 다. DEG primer을 이용한 RT-PCR 결과에서 C. glabrata 균주의 fluconazole 내성에 관여하 는 것으로 약 78개의 유전자를 확인하고 21개 의 유전자는 단백질을 확인하였으며 나머지 57 개 유전자는 해독되는 단백질을 확인하지 못하 였다. 이는 현재까지 C. glabrata 균주의 염색 체 DNA full sequencing은 세계적으로 2004년 에 프랑스의 파스테르 연구소에서 완료되었으 나 각 유전자의 기능 즉 단백질에 대한 기능은 지속적으로 연구중이므로 본 연구에서 확인한 유전자의 기능 또한 추후 연구되어야 할 것이 다. 특이한 사항으로 C. glabrata 균주의 총 13 개 염색체 DNA 중에서 30여개의 발현량이 다 른 유전자가 E, F, G 염색체에 있는 것으로 확 인되어 내성에 관여하는 유전자가 특정 부위에 위치해 있는 것은 아닌지에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다. 또한 감수성 균주에 비해 상대적으로 발현량이 감소한 유전자로 ATP-binding cassette protein을 확인하였는 데 이 단백질은 내성에 직,간접으로 관여하는 것으로 연구되고 있다. 본 연구의 결과로 확인 된 유전자가 직접적으로 fluconazole 내성에 관여하는지에 대한 결론은 유보적이며 추후 fluconazole에 의한 내성 유도 균주의 유도 MIC별 RT-PCR 결과를 본 연구 결과와 비교 분석할 필요가 있으며 감수성 균주와 내성균주 간의 단백체 비교 분석 연구 등을 통해 종합적 인 결론이 필요할 것으로 사료된다. 참고문헌 1. Richardson MD. Opportunistic and pathogenic fungi. J Antimicrob Chemother 1991; 28: Toscano CM, Jarvis WR. Nosocomial fungal infections. Curr Infect Dis Rep 1999; 1: Nucci M, Marr KA. Emerging fungal diseases. Clin Infect Dis 2005; 41: Banerjee SN, Emori TG, Culver DH et al. Secular trends in nosocomial primary bloodstream infections in the United States, National Nosocomial Infections Surveillance System. Am J Med 1991; 91: 86S-9S. 5.Pfaller MA, Jones RN, Messer SA et al. National surveillance of nosocomial blood stream infection due to Candida albicans : frequency of occurrence and antifungal susceptibility in the SCOPE Program. Diagn Microbiol Infect Dis 1998; 31: Epstein JB, Koimiyama K, Duncan D.Oral topical steroids and secondary oral candidiasis. J Oral Med 1986; 41:

102 Ⅰ. 연구보고 Feller L, Buskin A, Blignaut E. A review of candida and periodontal disease in immunocompetent and HIV-infected subjects. SADJ 2005; 60: Ruhnke M, Eigler A, Tennagen I et al. Emergence of fluconazole-resistant strains of Candida albicans in patients with recurrent oropharyngeal candidosis and human immunodeficiency virus infection. J Clin Microbiol 1994; 32: ChengMF, Yu KW, Tang RB et al. Distribution and antifungal susceptibility of Candida species causing candidemia from 1996 to Diagn Microbiol Infect Dis 2004; 48: Marichal P, Vanden BH, Odds FC et al. Molecular biological characterization of an azole-resistant Candida glabrata isolate. Antimicrob Agnets Chemother 1997; 41: White TC, Marr KA, Bowden RA. Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev 1998; 11: Kremery V, Barnes, AJ. Non-albicans Candida spp. Causing fungaemia: pathogenicity and antifungal resistance. J Hosp Infect 2002; 50: National Committee for Clinical Laboratory Standards : Reference Method for Broth dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeast: Approved Standard M27-A2. NCCLS, Wayne, PA, USA Pappas PG, Rex JH, Sobel JD et al. Guidelines for treatment of candidiasis. Clin Infect Dis 2004; 38: Marco F, Pfaller MA, Messer SA et al. Antifungal activity of a new triazole, voriconazole (UK-109,496), compared with three other antifungal agents tested against clinical isolates of filamentous fungi. Med Mycol 1998; 36: Kofla G, Ruhnke M. Voriconazole: review of a broad spectrum triazole antifungal agent. Expert Opin Pharmacother 2005; 6: McGunnis MR, Pasarell L, Sutton DA et al. In vitro evaluation of voriconazole against some clinically important fungi. Antimicrob Agents Chemother : Pfaller MA, Jones RN, Doern GV et al. Bloodstream infections due to Candida species: SENTRY antimicrobial surveillance program in North America and Latin America, Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: Kao AS, Brandt ME, Pruitt WR. et al. The epidemiology of candidemia in two United States cities: results of a population based active surveillance. Clin Infect Dis : Pfaller MA, Messer SA, Houston A. et al. National epidemiology of mycoses survey: a multicenter study of strain variation and antifungal susceptibility among isolates of Candida species. Diagn Microbiol Infect Dis 1998; 31: Diekema DJ, Messer, SA, Brueggemann, AB. et al. Epidemiology of candidemia: 3-year results from the emerging infections and the epidemiology of lowa organisms study. J Clin Microbiol 2002; 40: Pfaller MA, Diekema DJ, Jones RN. et al. Trends in antifungal susceptibility of Candida spp. Isolated from pediatric and adult patients with bloodstream infections: SENTRY antimicrobial surveillance program, 1997 to J Clin Microbiol 2002; 40:

103 92 국립보건연구원보 23. St-Germain G, Laverdiere M, Pelletier R. et al. Prevalence and antifungal susceptibility of 442 Candida isolates from blood and other normally sterile sites: results of a 2-year ( ) multicenter surveillance study in Quebec, Canada. J Clin Microbiol 2001; 39: Takakura S, Fujihara N, Saito T. et al. National surveillance of species distribution in blood isolates of Candida species in Japan and their susceptibility to six antifungal agents including voriconazole and micafungin. J Antimicrob Chemother :

104 Ⅰ. 연구보고 93 Antifungal resistant mechanism and moleculargenetic characterization of azole antifungal agent resistance Candida species J.I. Yoo, C.W. Choi, Y.S. Lee, K.M. Lee and B.S. Kim Division of Antimicrobial Resistance, Center for Infectious Diseases, NIH, Seoul Korea Purpose : In this study, we investigated the antifungal resistance mechanism against fluconazole from C. glabrata through molecular genetic typing, searching of gene related to resistance and characterization. Methods : We investigated the distributions of Candida species from specimen of non-tertiary and tertiary hospitals. The MIC was evaluated by broth microdilution method of CLSI. The RNA of fluconazole resistant C. glabrata isolates was isolated and measured the expression of CgPDH1, CgCDR1 gene by slot blot hybridization. To investigate the relation of ERG3, ERG11 gene with fluconazole resistance, the PCR products of ERG gene was sequenced. To identify the other gene related to fluconazole resistance, RNA was isolated and RT-PCR was done with genefish kit composed of 120 random primer sequence. The differentially expressed gene was sequenced and identified. Results : Among the 612 Candida isolates, C. albicans showed the most high frequency but the isolation frequency of NAC species was increased in tertiary hospitals. The PFGE patterns of C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis were different, respectively. Most Candida isolates were susceptible to antifungal agents, except a few species that were resistant to 5-flucytosine and fluconazole. C. glabrata isolates showed strong resistant tendency to fluconazole, C. albicans and C. tropicalis showed resistant tendency to 5-flucytosine. C. krusei showed resistance to fluconazole and 5-flucytosine but showed 2ug/ml MIC to voriconazole agent. The expression of CgCDR1 gene was higher than CgPDH1 gene of fluconazole resistant C. glabrata isolates. There are several gene mutation was investigated in ERG3 and ERG11 gene, but there was no amino acid substitution. The 78 differentially expressed genes was investigated by RT-PCR. Among them, the protein function of 21 gene was identified, but the function of 57 gene was not identified yet. The expression of gene involved in cell wall biogenesis, gamma-glutamylphosphate reductase, acetyl-coa synthetase was increased but the expression of gene involved in DNA dependent ATPase/DNA helicase B, RIB1 GTP cyclohydrolase II was decreased. Conclusions : The distributions of non-albicans Candida species was increasing in tertiary and

105 94 국립보건연구원보 non-tertiary hospitals for 3 years. Most of Candida species showed susceptible to antifungal agents, but C. glabrata and C. krusei species showed higher MIC than the other species to azole antifungal agents. The expression of 78 gene was increased or decrease between fluconazole susceptible and resistant isolates of C. glabrata isolates. Key word : Candida, fluconazole resistance, Differentially expressed gene This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, 77-94, 2005

106 Ⅰ. 연구보고 95 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 95-96, 2005 Ciprofloxacin 내성 Neisseria gonorrhoeae의 Non-target site 변이 내성기작 규명 국립보건연구원 병원체 방어연구팀, 생물안전평가팀 1, 약제내성팀 2 유정식 2, 김보림 1, 김윤정, 유천권 1, 성원근 1, 김봉수 목적:임균의 주요 치료제인 ciprofloxacin에 대한 내성기작은 gyra와 parc의 돌연변이에 의해 일 어나는 것으로 널리 알려져 있다. 그러나 이외의 내성기전이 다른 균종에서 보고된 바 있고 돌연변이 양상과 MIC값이 일치하지 않는 임균들이 다수 분리되어 또 다른 내성기전의 존재 가능성을 시사하였 다. 본 연구는 ciprofloxacin에 대한 gyra와 parc 돌연변이 이외의 내성기작을 조사하기 위해 수행 되었다. 방법:1차년도에 ciprofloxacin으로 내성을 유도한 균주를 대상으로 원균주와 내성유도주의 OMP를 sarkosyl method를 이용하여 추출하고 2차원 전기영동과 MS/MS를 통해 발현량이 차이나는 단백질 을 분석하였다. Transposon mutagenesis를 위해 Tn5를 포함하는 pmod-3와 pgfp를 cloning하여 transposon delivery vector를 제작하였다. 결과:92WT 과 isogenic 내성유도주 92mu13의 OMP를 SDS-PAGE와 2-DE 분석으로 비교한 결 과 29kDa에서 50kDa까지의 범위내에 존재하는 단백질의 발현수준에서 큰 변화를 나타내었다. 발현 량이 크게 차이 나는 주요 단백질로는 porin, porin precursor, pilus secretion protein등 물질의 막 투과와 관련된 단백질과 대사에 관련된 효소류 등이 MS/MS에 의해 동정되었다. 내성관련 유전자 규명을 위해 transposon을 임균의 genomic DNA에 도입하고자 Tn5를 포함하는 pmod-3에 marker 로서 GFP gene을 삽입하여 transposon delivery vector를 제작하였다. 결론:임균 OMP 단백질체 분석결과, porin 투과성 변이 및 pilus secretion protein 발현감소 등 이 포함된 새로운 내성기작이 임균의 ciprofloxacin 및 다제 내성에 영향을 미치는 것으로 추측되었 다. 향후 후보 단백질이 내성기작에 기여함을 증명하고 transposon을 이용한 random mutagenesis 를 통해 global regulator등 내성기작에 관여하는 유전자를 찾는 연구가 계속되어야 할 것이다. 중심단어:임균, 싸이프로플록사신, 외막단백질, 이차원전기영동, 트랜스포존 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

107 96 국립보건연구원보 Evidence for ciprofloxacin resistant mechanism associated with Non-target site in Neisseria gonorrhoeae J.S. Yoo 2, B.R. Kim 1, Y.J. Kim, C.K. Yoo 1, W.K. Seong 1 and B.S. Kim Division of Biodefense Research, Division of Biosafty evaluation and control 1, Division of antimicrobial resistance 2, NIH, Seoul Korea Purpose:The mutations in gyra and parc have been considered as the main cause of the ciprofloxacin resistant in N.gonorrhoeae. However, another resistant mechanisms have been reported in other organisms and also that was suspected in N.gonorrhoeae. The object of this study was to find the evidence for the resistant mechanisms to ciprofloxacin except for mutations in target sites in N. gonorrhoeae. Methods:OMPs were extracted by using modified sarkosyl method from the wild type susceptible strain and in-vitro induced isogenic mutant. Comparative proteomic analysis between two strains OMP was performed by two dimensional electrophoresis and MS/MS. Mascott was used for the identification of each spot. Results:Comparing the OMPs of 92WT with its isogenic mutant by using SDS-PAGE and 2-DE analysis, there was remarkable alterations in the expression level of proteins which located in the range from 29 to 50kDa. Porin, porin precursor, pilus secretion protein and several enzymes were identified as differently expressed protein by MS/MS, Mascott software. To investigate the gene involved in antimicrobial resistance of the mutant by transposon mutagenesis, we constructed the transposon delivery vector which gfp gene was inserted into pmod-3. Conclusions :Based on the proteomic analysis, it was strongly assumed that new mechanisms including porin permeability alterations or secretion protein reduction play an important role in fluoroquinolone or multi-drug resistance in N. gonorrhoeae. We expect that new genes involved in regulation of resistant mechanisms can be revealed by using transposon mutagenesis. Key words:n. gonorrheoea., Ciprofloxacin, OMPs, 2-DE, transposon This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, 95-96, 2005

108 Ⅰ. 연구보고 97 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, 97-98, 2005 Orientia tsutsugamushi 의 adhesion 관련 단백질의 발현 및 특성 연구 국립보건연구원 면역병리센터 인수공통감염팀 박상희, 김주심, 이지선, 이정현, 심수경, 최영실, 황규잠, 박미연 목 적:리케치아 속의 원인병원체에 대한 병원성 및 면역원성을 밝히기 위해 다양한 종류의 항원 및 adhesion 관련 단백질에 관한 연구가 보고되고 있으나, O. tsutsugamushi의 세포 표면에 존재할 것으로 보이는 adhesion 단백질에 대한 연구 자료는 보고되지 않고 있다. 이 연구는 쯔쯔가무시 균 체 단백질의 클로닝 및 발현을 통해 adhesion 특성을 분석하고, 숙주 세포 내에서 adhesion 관련 유 전자를 탐색하여 쯔쯔가무시증 예방을 위한 연구 기초 자료를 구축하고자 한다. 방 법:O. tsutsugamushi 의 형-특이항원인 56 kda 단백질을 pmal-p2e 에 클로닝하고 E. coli BL21에 발현시켰다. Maltose 항혈청과 O. tsutsugamushi 환자혈청을 이용하여 western blot을 수행하여 56 kda 단백질이 발현됨을 확인하였다. 확인된 클론을 대량 배양하여 amylose resin chromatography 방법에 의하여 56 kda 단백질을 정제한 후 cell adhesion assay를 수행하였다. O. tsutsugamushi Boryong주와 R. typhi VR144 Wilmington주는 세포배양으로 증균 배양 후 두 균을 BALB/c 에 감염시켰다. 감염 2주 후에 임상 증상을 보이는 마우스의 혈액에서 RNA를 추출하 고 mouse DNA chip을 적용하여 microarray로 분석하였다. 결 과:56 kda 단백질 첨가 시 농도에 비례하게 세포가 adhesion 되어 있는 것을 현미경 관찰 및 cell adhesion assay에서 확인하였다. Microarray 분석 결과 Boryong 주와 R. typhi 감염에서 음성 대조군인 Kuroki주 감염과 비교 시 2배 이상 발현의 증감을 보이는 공통 유전자는 505종이 선별되었다. 이 중 adhesion에 관여하는 유 전자는 endogrin 및 lectin 등 8종이 2배 이상의 발현 차이를 보였으며, receptor 관련으로는 tumor necrosis factor receptor superfamily 등 29종의 유전자가 발현 차이를 보였다. 결 론:기존의 혈청학적 type구분에 주로 이용된 56 kda 표면 항원이 이번 실험을 통해 adhesion과 관련됨이 증명되었다. 또한, microarray 분석에 의하여 O. tsutsugamushi 와 R. typhi 감염 시 숙주 증상 발현에 공통적으로 관여하는 분자들이 파악 되었고 O. tsutsugamushi adhesion 의 특성을 리케치아 감염에 연관 지어 연구하는 데 필요한 기초 자료를 확보하였다. 중심단어:O. tsutsugamushi, 56 kda, adhesion, microarray 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

109 98 국립보건연구원보 Characteristics and expression of proteins related with the adhesion of Orientia tsutsugamshi S.H. Park, J.S. Kim, J.S. Lee, J.H. Lee, S.K. Shim, Y.S. Choi, K.J. Hwang and M.Y. Park Division of Zoonoses, Center for Immunology & Pathology, NIH, Seoul Korea Purpose:There are many reports about antigens and proteins related with adhesion for revealing to pathogenicity and immunity of Rickettsia species. However, The adhesion protein of Orientia tsutsugamsuhi have not been studied. We characterized to bacterial proteins using cloning and protein expression, and surveyed adhesion related molecules of host cell response for studies of prevent to scrub thypus. Methods:O. tsutsugamushi type specific protein of 56 kda was cloned with pmal-p2e vector, and expressed in E. coli BL21. The expression of 56 kda protein confirmed by western blot with the maltose antiserum and serum of scrub thypus patient. The 56 kda protein purified by amylose resin chromatography after mass culture of the clone. Preceding the 56 kda protein purfication, the cell adhesion assay was carried out. The O. tsutsugamushi Boryong and R. typhi VR144 Wilmington infected to BALB/c mice. RNA samples were prepared to blood of mice showed clinical symptoms, infected after 2 weeks. Microarray analyzed using mouse DNA chip and these RNA samples. Results:The percents of cell adherence were increased by additive concentrations of 56 kda protein in the microscopic observation and adhesion assay. According to the Microarray analyzation, the common 505 genes with O. tsutsugamushi Boryong and R. typhi infected mice displayed at least 2-fold expression differences compared to negative control of O. tsutsugamushi Kuroki infected mice. The 8 genes, including endogrin and lectin, process by which a cell adheres to another cell or to the extracellular matrix. The 29 genes, including tumor necrosis factor receptor superfamily, are related with receptor characterized by selective binding of a specific substance and physiologic effect. Conclusions:The 56 kda protein, which used to differentiate with O. tsutsugamushi type, of cell adherence was revealed in this study. Microarray analyzation indicated common molecule expressions of O. tsutsugamushi and R. typhi infection, and provided important information of study on O. tsutsugamushi adhesion compared to Rickettsial infection with host response. Key words:o. tsutsugamushi, 56 kda, adhesion, microarray This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, 97-98, 2005

110 Ⅰ. 연구보고 99 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 프로테옴 분석으로 확인된 폐렴구균의 GrpE 단백의 기능유전체학적 접근 국립보건연구원 감염병센터 호흡기세균팀 배송미, 장미정, 강연호 목 적 : 폐렴구균의 스트레스 반응에 대한 프로테옴 분석을 통해 발굴한 GrpE 단백질의 특성 및 기능 규명과 함께 스트레스 반응에서의 GrpE의 방어기전 및 병원성과의 관련성 여부를 규명하기 위 하여 우선 grpe 유전자의 구조 분석을 실시하고 대량 발현시스템을 구축하고자 하였다. 방 법 : 병원성 균주인 D39 균주(혈청형 2)를 대상으로 grpe 유전자를 포함하는 dnak operon 부 위의 염기서열 분석을 실시하고, ORF 부위 및 전사조절 부위 등을 확인하였다. grpe 유전자의 ORF 가 포함되도록 primer를 제작한 후 PCR을 실시하여 pqe-30 vector에 클로닝하여 E. coli M15에 형질전환하여 재조합 클론을 제작하였다. IPTG 첨가하여 재조합 단백질 발현을 유도하고, 대량 발현 조건을 확립하였다. 한편, Ni-NTA agarose affinity chromatography를 이용하여 재조합 단백질을 native condition 하에서 정제하였으며, 분리정제한 재조합 단백질은 토끼에 피하면역하여 polyclonal antibody를 제조하였다. 결 과 : 폐렴구균 D39의 grpe 유전자를 포함하는 dnak operon 부위 (약 6.5kb)의 염기서열 분석 결과, ORF 1~4 부위가 확인되었으며 이는 분자량 약 39, 20, 65, 40kDa의 단백질을 암호화하며, BLAST search 결과 hrca, grpe, dnak, dnaj 유전자임을 확인하였다. 또한, hrca 유전자의 upstream 부위에서 -35 (TTGACA)와 -10 (TATAAT)에 해당하는 α A type promoter sequence와 2 개의 CIRCLE element (TTA GCA CTC N9 GAG TGC TAA)가 확인되어 dnak operon상의 유전자들 의 전사 조절에 관여할 것으로 추정된다. grpe 유전자의 ORF 부위의 삽입이 최종 확인된 E. coli SDGA14 (pqe30-ga14 plasmid) 균주에 0.1mM IPTG를 3시간 처리하였을 때 28 kda 부근에서 His-taq 융합 형태의 재조합 단백질의 발현이 유도되었다. 분리정제한 GrpE 단백질을 항원으로 이용 하여 토끼에 5주 간격으로 3회 피하주사하여 GrpE 단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 제조하였다. 결 론 : 본 1 차년도에는 폐렴구균에서 grpe 관련 유전자군의 특성 규명을 실시하고 재조합 GrpE 단백질 및 항체를 확보하였다. 이를 바탕으로 향후 GrpE 단백질의 생리활성기능 규명 및 병원성 인 자와의 관련성을 확인하고자 한다. 중심단어 : 폐렴구균, GrpE, 재조합단백질 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

111 100 국립보건연구원보 Functional genomic approach of Streptococcus pneumoniae GrpE identified by proteomic analysis S.M. Bae, M.J. Jang and Y.H. Kang Division of Bacterial Respiratory Infections, Center for Infections Diseases, NIH, Seoul Korea Purpose:By the proteomic approach, we previously identified that GrpE was involved in responses to several stresses in S. pneumoniae. To evaluate the its physiological function of GrpE in stress responses and in the pathogenesis of S. pneumoniae, we characterized the dnak operon and constructed the expression system of recombinant GrpE polypeptide. Methods:The dnak operon of S. pneumoniae D39 (type 2) was analyzed the genetic organization. The grpe gene was amplified from S. pneumoniae D39 by PCR with primers containing restriction sites (BamHI and PstI) to facilitate cloning into the plasmid expression vector pqe30 (QIAGEN). The resulting plasmid, which produced a recombinant protein with an in-frame fusion of six histidine residues to the N terminus of GrpE, was used to transform E. coli M15. His-tagged GrpE was purified from IPTG-treated cells under native conditions by following the protocols recommended by the supplier (QIAGEN). The recombinant protein was used to elicit a polyclonal antiserum in rabbits. Results:Sequencing and BLAST search analysis revealed that the dnak operon of S. pneumoniae D39 consisted of the hrca, grpe, dnak, and dnaj genes, encoding 39, 20, 65, and 40 kda, respectively. The promoter region of hrca was found to have CIRCE 1 (TTAGCACTC N9 GAGTGCTAA), -35 region (TTGACA), -10 region (TATAAT), CIRCE 2 (TTAGCACTC N9 GAGTGCTAA). These elements could be involved in the transcriptional regulation of the dnak operon. To produce large quantities of recombinant GrpE, BamHⅠ and HindⅢ fragment, including the full-length grpe gene, was cloned into pqe30 expression vector. rgrpe was overexpressed by adding 0.1mM IPTG to E. coli SDGA14 harboring the pqe30-ga14 plasmid. A recombinant protein band of the expected size (about 28 kda) was clearly detected by SDS-PAGE. The purified His 6-tagged GrpE under the native condition elicited anti-grpe polyclonal antibodies. Conclusions:In the first year, we analyzed the genetic organization of dnak operon and obtained recombinant GrpE and anti-grpe antiserum. Further studies will be performed to characterize its role of GrpE in the regulation of virulence factors expression in response to environmental stresses. Key words:s. pneumoniae, GrpE, His-tagged recombinant protein This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

112 Ⅰ. 연구보고 101 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 콜레라 백신 후보 균주 개발 및 경구용 다가 백신 delivery system으로서의 이용에 관한 연구 국립보건연구원 감염병센터 병원체방어연구팀, 장내세균팀 1, 생물안전평가팀 2 정혜미, 정경태, 전정훈, 이복권 1, 유천권 2, 성원근 2, 김봉수, 이기은 목 적:본 연구에서는 콜레라 독소 B subunit (CTB)가 Vibrio cholerae 백신 후보 균주 자체의 체 외 또는 체내에서 과량 발현되는 백신후보 균주를 개발하여 차세대 경구용 사균 콜레라 백신 균주로 사용하고자 한다. 개발된 V. cholerae에서 과량 발현되어 세포 외부로 방출되는 CTB는 정제 한 후 역시 백신의 조합 물질로 사용할 수 있다는 장점이 있다. 방 법:CTB가 과량 발현 되는 V. cholerae 백신 후보 균주 제작을 위하여 각 혈청형의 콜레라 균 주를 국내외에서 확보하며, 발현된 CTB를 균 내외에 집적할 수 있게 하기 위하여 필요한 자살벡터 및 transposon을 제작한다. 위의 자살 벡터는 CTB가 세포외로 방출될 때 사용되는 EPS pathway 중의 epse 유전자를 파괴하여 생성된 독소가 세포내에 집적되게 하려는 목적으로 제작하며, transposon에는 CTB 유전자를 삽입하여 세포내에서 random transposition을 시켜서 CTB가 과발현 되는 V. cholerae 세포를 ELISA 방법으로 스크리닝하고자 하였다. 결 과:백신후보 균주 제작을 위한 0395-N1 (Classical, O1, Ogawa 형), 569B-N1 (Classical, O1, Inaba), M7922 (El Tor, O1, Ogawa 형), (El Tor, O1, Inaba 형) 균주를 확보하였다. CTB를 균내외에서 과량 발현하는 균주 제작을 위한 벡터 및 transposon 등을 각기 pwm91 vector 와 Mariner based transposon을 이용하여 제작하였으며 pwm91 vector에는 Kanamycin cassette를 epse 유전자에 삽입되게 크로닝한 DNA를 삽입하여 chromosome 외에 삽입시 epse 유전자를 파괴 하고자 디자인 하였으며, Mariner-based transposon에도 MluI 제한효소 등을 이용하여 CTB 유전 자를 적절한 위치에 성공적으로 크로닝하였다. 결 론:위와 같이 콜레라 백신 후보 균주 제작을 위한 필요 균주 및 vector 등을 확보하였다. 본 연구는 전염성 질환의 국가 차원의 효과적인 대응을 가능하게 할 뿐 아니라, 질병관리본부의 백신 연 구, 개발 능력을 향상 시키는 데 도움을 준다. 중심단어:콜레라 백신, 콜레라 독소 B 절편, 백신전달 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

113 102 국립보건연구원보 Construction of Vibrio Cholerae Vaccine Candidate Strains in Which Cholera Toxin B Subnit is Overexpressed H.M. Jung, K.T. Jung, J.H. Chun, B.K. Lee 1, C.K. Yoo 2, W.K. Seong 2, B.S. Kim and G.E. Rhie Division of Biodefense Researches, Division of Enteric Bacterial Infections 1, Center for Infectious Diseases, Division of Biosafety Evaluation and Control 2, NIH, Seoul Korea Purpose : To develop cholera vaccine candidate strains, we were trying to construct four Vibrio cholerae strains in which the expressed cholera toxin B subunit (CTB) is either secreted, or accumulated in the periplasmic fraction of V. cholerae cells. Methods : For the construction of candidate strains, classical strains, 0395-N1 and 569B-N1, in which cta genes were deleted were used. For El Tor strains, and M7922 which lack both cta and ctb genes were used. For the accumulation of CTB in the periplasmic fractions of classical strains, the pwm91 vector was engineered to contain epse gene of type II secretion pathway in which kanamycin cassette was inserted in the middle of the gene. This vector will be used for knockout of epse gene in 0395-N1 and 569B-N1. For the expression of ctxb gene in El Tor strains, we used the mariner-based transposon system developed by Chiang and Mekalanos. The DNA which contains coding region of ctxb with ribosome binding site was cloned into MluI site of the transposon. The engineered transposon will be randomly transposed into the chromosome of V. cholerae to place the ctxb gene under the control of a strong promoter. The expression of the ctxb gene will be screened by ganglioside-dependent ELISA. Results : As described in the Methods section, we have obtained four V. cholerae strains, vector and transposon system which are necessary for the vaccine candidate strain constructions. Conclusions : The secretion or the accumulation of expressed CTB in the periplasmic fraction of V. cholerae strains may assist in preparing improved, effective and inexpensive cholera vaccine. Key words : cholera vaccine, cholera toxin B subunit, delivery system This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

114 Ⅰ. 연구보고 103 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 sirna에 의한 RNA interference 기법을 이용한 아데노바이러스(Adv) 증식억제에 관한 연구 국립보건연구원 감염병센터 인플루엔자바이러스팀 김민경, 정윤석, 강춘 목 적:국내에서 발생하는 호흡기 및 안과 질환 환자로부터 아데노바이러스(Adv)의 분리 및 분자역 학적 특성 연구 등을 지속적으로 실시함으로써 국내 분리주들에 대한 통합적인 역학정보체계를 구축 하고자 하였다. 또한 Adv 11형의 분리주 한 건에 대하여 sirna에 의해 유도되는 RNAi의 양상을 규 명하고 국내 분리주 및 표준주 Adv에 적용함으로써 바이러스 증식 억제 효과를 분석하여 향후 Adv 치료제로써의 가능성을 확인하고자 하였다. 방 법:국내에서 발생하는 Adv의 분리 동정을 실시하고 Hexon 유전자의 염기서열 분석에 의해 국 내 분리주의 혈청형을 확인하였다. 호흡기 Adv 11형의 E1A에 대한 sirna의 RNAi 효능을 확인하고 자 Real-Time PCR 및 Plaque assay를 실시하였으며, 안과 질환 Adv 8형의 E1A, E3, fiber 및 hexon 유전자의 염기서열을 근거로 sirna를 합성하였다. 결 과:2005년 호흡기 환자의 검체로부터 분리한 Adv 22주는 1, 2, 3, 4, 8형으로 확인 되었으며, 2형이 7주, 3형이 9주로서 비교적 높은 비율로 확인되었다. 또한 안과 질환자로부터 분리된 Adv는 15주로서 2004년에 비해 높은 비율로 분리되었으나 대유행은 없었으며 개별적인 발생에 의해 3, 4, 8, 34형으로 다양한 혈청형이 분리되었다. 호흡기 Adv 11형의 E1A에 대한 sirna의 효능 확인 결과, E1A mrna의 발현양과 바이러스의 복제정도가 sirna를 처리하였을 경우 60-70% 감소하였음을 확인 할 수 있었다. 2003년에 각결막염 환자로부터 분리된 Adv 8형의 E1A, E3, fiber 및 hexon의 염기서 열을 분석하여 이를 바탕으로 각 유전자에 대하여 서로 다른 두 가지의 sirna를 제작하였다. 각각의 sirna는 GC 함량이 30% 정도가 되고, 인간의 알려진 모든 유전자와 상동성이 없도록 고안하였다. 결 론:본 연구를 통한 국내 호흡기 및 안과 질환자에서 분리되는 Adv의 유행양상 파악은 역학정 보체계 구축 및 유행예측에 중요한 지표 자료로 이용될 것이며, 호흡기 Adv 11형에 대한 sirna의 바이러스 복제 저해 효과는 항바이러스제제로서 충분한 가능성이 있음을 제시하고 있다. 중심단어:아데노바이러스(Adv), sirna 이 연구는 질병관리본부 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

115 104 국립보건연구원보 Analysis of Inhibition mechanism for the Adenovirus(Adv) replication by RNA interference with sirna M.K. Kim, Y.S. Chung and C. Kang Division of Influenza and Respiratory viruses, Center for Infectious Disease, NIH, Seoul Korea Purpose : To investigate the epidemiological analysis of adenoviral epidemic and to characterize the prevailing strain, we isolated adenovirus from the respiratory and ocular disease patients in Korea and typed them. Also sirna-mediated gene silencing against Adv type 11 through the suppression of E1A mrna was analyzed for a potential therapeutic modality to control Adv infection in respiratory tract. As well, sirnas were designed against the main genes of Adv type 8 from Epidemic Keratoconjunctivitis (EKC) patients. Methods : We isolated and performed sequence analysis of 22 Adv strains isolated in respiratory specimens during 2005 based of the sequence of hexon gene. The sirna mediated inhibition analysis of virus replication was confirmed by Real-Time PCR and Plaque assay. Also, E1A, E3, fiber and hexon gene of Adv type 8 were amplified by PCR and sirna was designed based on sequences of each genes. Results : We typed 22 respiratory Adv isolates which consist of type 1, 2, 3, 4, and 8, and type 2 and 3 was major. From ocular disease patient 15 Advs isolates were serotyped and various types including type 3, 4, 8, and 34 were detected. As results of sirna inhibition effect against Adv 11, Adv E1A mrna transcription and virus replication level were reduced to about 60% and 70% upon sirna treatment respectively. And then, the sirnas were designed by corresponding with E1A, E3, fiber and hexon of Adv type 8. The G/C content of each sirna molecule was about 30% and the sirnas did not share homology with any known human genes. Conclusions : The results could be used for epidemiological data analysis and for epidemic indicator of adenoviral infection. And sirna-mediated gene silencing against Adv type 11 replication should be studied further as a potential therapeutic modality. Key words : Adenovirus, sirna This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

116 Ⅰ. 연구보고 105 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 한국인 HIV 감염자에서의 HIV dynamics와 면역반응 분석 국립보건연구원 면역병리센터 에이즈 종양바이러스팀 김갑정, 이학성, 남정구, 기미경, 주재신, 서순덕, 김성순 목 적:한국인 HIV 초기 감염자의 인체 내에서 나타나는 바이러스 증식과 인체 면역반응의 변화를 분석하여 HIV/AIDS 치료제와 치료법 개발을 위한 기초 자료로 활용하고자 한다. 방 법:혈청학적 특성에 따라 선정한 HIV 초기 감염자군을 대상으로 CD4+ T 세포수, CD8+ T 세 포수, RNA viral load, HLA type 그리고 시기별 유전자의 변이를 측정하여 각 요인간의 연관관계를 통계학적 방법을 이용하여 분석하였다. 결 과:항바이러스제를 투여하지 않은 12명의 초기감염자에서 CD4+ T 세포수와 바이러스 증식 간 에는 9명의 감염자에서 역상관관계(평균 r=-0.48)를 나타내었으며, 3명의 감염자에서는 양상관관계 (평균 r=0.44)를 나타내었다. 그러나 CD8+ T 세포수와 바이러스 농도와는 뚜렷한 상관성을 찾을 수 없었다. 12명의 초기감염자들 중 대부분은(8명) 바이러스 안정기 농도가 log4-5에서 결정되었고, 3.43개(/월)의 CD4+ T 세포수가 감소하였다. 항바이러스제를 투여하지 않은 KRC2037을 대상으로 면역학적 선택압에 의한 바이러스의 진화 및 변이양상을 연구하기 위하여 감염이 확인된 후 58개월 까지 6시점을 분석한 결과, 질병진전에 따라 바이러스 다양성이 증가하였다. 그리고 env 유전자 부위 의 시기별 분석에서 N-glycosylation과 바이러스 변이와는 연관성이 없었으나 질병진전에 따라 V1-V2 부위에서 아미노산의 소실이 관찰되었다. 한편 16명의 초기감염자에 대한 HLA형을 확인한 결과, A2 type을 가진 감염자는 5명(33%)이었고, A24형은 11명(73%)에서 나타났으며, A11, A26, A29, A31, A33 등의 형이 일부 확인되었고, 확인된 HLA형을 기초로 ELISPOT 분석방법을 확립하 였다. 결 론:한국인 HIV 감염자군의 바이러스 증식과 면역반응 분석을 통해 HIV 감염 초기에 결정되는 바이러스 안정기 농도가 이후의 질병진전과 밀접한 연관이 있으며 감염자의 면역학적 선택압이 유전 자 변이에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 확립된 세포독성면역반응 측정법은 한국인에 적합한 HIV 치료제 및 백신 개발 시에 고려해야 할 중요한 HIV 특이적 면역반응을 확인할 수 있는 유용한 방법으로 제공될 수 있을 것이다. 중심단어:HIV, 바이러스 농도, 세포독성면역반응 측정법 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

117 106 국립보건연구원보 Analysis of HIV Dynamics and Immune Responses of HIV-1 infected Koreans G.J. Kim, H.S. Lee, J.G. Nam, M.K. Kee, J.S. Chu, S.D. Suh and S.S. Kim Division of AIDS, Department of Immunology and Pathology, NIH, Seoul Korea Purpose:This research aims to analyze the viral replication and the change of subsequent immune responses in the early HIV-infected Koreans, so that we utilize the results as basis for the development of HIV/AIDS vaccine and treatment Methods:The subjects were selected according to serological characteristics. We measured CD4+ T-cell counts, CD8+ T-cell counts, RNA viral loads, HLA type and sequential variation of HIV env genes and analyzed the correlation statistically among factors. Results:Among 12 early HIV infected subjects with no antiretroviral treatment, CD4+ T-cell counts and the viral load increase were inversely correlated(r = -0.48) in 9 persons, and correlated (r = 0.44) in 3 persons. There was no distinct correlation between CD8+ T-cell count and viral loads. In most (n = 8) of the 12 early HIV-infected, the viral set point were determined between log 4 and log 5, and 3.43 CD4+ T-cell counts per month decreased. For the subject KRC2037 with no antiretroviral treatment, we analyzed viral evolution and variation by immunological selection pressure and found that genetic variation of virus increased with disease progression. In the sequential analysis of env gene, number of N-glycosylation and viral variation were not correlated, but we observed loss of amino acids in V1-V2. We identified HLA type for 16 early HIV-infected persons, and found 5 subjects (33%) with A2 type, 11 (73%) with A24 type, while A11, A26, A29, A31 and A33 type were identified in some subjects. With these identified HLA types, we established ELISPOT assay. Conclusions:Through analysis of viral replication and immune response, We found that viral set point which was determined in an early stage of HIV infection was closely related with disease progression. We also identified immunological selection pressure of the infected gave influences on the genetic variation of virus. Key words:hiv, Viral load, CTL response assay This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

118 Ⅰ. 연구보고 107 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 국내 유행 HCV를 사용한 Replicon cell 제작 및 유전자 변이 분석 국립보건연구원 간염 폴리오바이러스팀, 가톨릭대학교 성가병원 1, 한국혈우재단병원 2, 국립암센타 3 강수진, 김소연, 김선옥, 조영주, 조경아, 김대진 1, 김은주 2, 신해림 3, 지영미 목 적:본 연구는 국내 HCV 감염 환자들의 혈청을 genotyping하고 국내 환자에서 유행하는 HCV genotype 1b와 genotype 2a의 replicon cell을 제작하고자 수행되었다. 방 법:국내 정맥주사 약물복용 환자, 혈액투석 환자, 혈우병 환자 및 국립 암센타에서 의뢰한 1996년부터 2003년까지의 국내(춘천, 함안, 여항, 충주, 의령) 일반인 anti-hcv 양성 코호트 377명 의 가검 혈청으로 C형 간염 유전자 검사에서 양성으로 확인된 204명의 혈청에서 HCV RNA를 추출 하고 RT-PCR을 통해 cdna를 합성한 후 nested PCR을 수행하여 INNO-LiPA의 방법으로 유전자형 을 결정하였다. 국내 유행 HCV의 replicon cell을 만들기 위해 genotype 1b와 2a의 혈청에서 RNA 를 추출하고 cdna를 제조한 후, 5'UTR, Core, E1, E2, NS2, NS3, NS4, NS5, 3'UTR의 6개 fragment로 나누어 overlap되게 증폭하고 각각의 region을 pcr2.1-topo vector에 subcloning한 후 sequencing 하였다. 결 과:국내 C형 간염 환자 204명의 혈청에서 RNA를 추출하고 INNO-LiPA의 방법으로 genotyping 한 결과 국내의 C형 간염 환자에서 가장 흔한 유전자형으로 알려져 있는 1b와 2a가 각 4개의 환자군에 서도 가장 많은 비율을 차지하였다. 1999년 수집한 혈우병 환자군 검체에서는 genotype 2a보다 1b가 월등하게 많았다. 특히 2005년 정맥주사 약물복용 환자군에서 국내에서는 현재까지 보고된 바 없는 genotype 3a가 국내 최초로 검출 되었으며 국내에서는 드문 genotype 2b가 검출되었다. HCV genotype 1b strain중 한 개의 full genome을 6개의 fragment( kb)로 나누어 증폭하고 pcr2.1-topo vector에 subcloning 한 후 염기서열 분석을 통해 full sequence를 확인하였다. 결 론:본 연구로 국내 다양한 감염 경로의 C형 간염 환자들의 유전자형 분포를 알 수 있었고 국내 유행하는 HCV 유전자형 1b와 2a의 full genome sequence를 확보하였으며 각각의 region을 subcloning하여 replicon system을 구축하기 위한 기반을 확보하였다. 중심단어:C형간염, Replicon, 유전자형 분석 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

119 108 국립보건연구원보 Genotyping and Development of Replicon system for Hepatitis C Viruses S.J. Kang, S.Y. Kim, S.O. Kim, Y.J. Cho, K.A. Cho, D.J. Kim 1, E.J. Kim 2 H.R. Shin 3 and Y.M. Jee Division of Enteric and Hepatitis viruses, Center of Infectious Diseases, NIH, Seoul Korea, Holy Family Hospital 1, Korea Haemophilia Foundation 2, National Cancer Center 3, Korea Purpose:Hepatitis C virus(hcv) causing chronic liver diseases is a global public health problem. Analysis of HCV genome have been hampered by the lack of HCV culture system. Subgenomic replicon system for HCV has been widely used for HCV genome study. In this study, we investigated the distrubution of HCV genotypes in Korea and aimed to develop the full genomic replicon system of genotype 1b and 2a that are most common in Korea. Methods:We determined genotypic distribution of 204 HCV strains : intravenous drug users (IVDU) and 20 hemodialysis patients in 2005, 26 hemophiliacs in 1999 and 97 anti-hcv positive individuals from 1996 to 2003 in Korea using a genotype-specific probe-based assay(inno-lipa HCV II; INNOGENETICS, Ghent, Belgium). To develop the HCV full genomic replicon system, we performed reverse transcription and nested PCR to amplify the HCV genome of genotype 1b and 2a. Subcloning of 6 fragments was performed using pcr2.1-topo vector and confirmed by nucleotide sequencing. Results:Genotypes 1a, 1b, 1, 2a/2c, 2b, 2, and 3a were found in 2%(n=4), 36%(n=69), 1.5%(n=3), 47%(n=90), 0.5%(n=1), 3%(n=6) and 1%(n=2), respectively. Mixed infections with multiple genotypes were detected from 12 cases: 1b&2a/2c in 6%(n=11), 1&2a/2c in 3%(n=7). Overlapping six fragments ranging kb covering the full sequence of genotype 1b strain of HCV were amplified and subcloned in the pcr2.1-topo vector. We have determined the full sequences of one genotype 1b strain to produce the full genomic HCV replicon system. Conclusions:The most common HCV genotype in Korea were 1b and 2a. HCV genotype 3a was detected for the first time in intravenous drugusers in Korea. We are establishing the full genome replicon system of genotype 1b and 2a of HCV to study the mechanism of HCV replication. This system will provide a powerful tool for the analysis of host-virus interactions that will facilitate the discovery of antiviral drugs and vaccines for the hepatitis C virus. Key words:hcv, Replicon, genotype This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

120 Ⅰ. 연구보고 109 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 국내 발생 바이러스성 식중독의 분자역학적 특성 분석 연구 국립보건연구원 감염병센터 간염 폴리오바이러스팀 김경창, 안정배, 이정수, 이회규, 정아용, 엄홍기, 천두성, 지영미 목 적:본 연구에서는 국내에 유행하는 바이러스성 식중독 원인체인 노로바이러스의 유행양상을 파 악하고 유행주의 분자역학적 특성을 분석하여 질병관리연구에 활용하고자 하였다. 방 법:국내에서 발생한 집단 발병 및 급성 위장관염 환자를 대상으로 노로바이러스의 캡시드 유전 자를 증폭하고 염기서열을 분석하여 국내에 유행하는 노로바이러스 유전자형의 분포 와 다양성 및 recombination을 확인하였으며 또한 국내 유행주에서 GI-4, GII-3, 6형에 대한 캡시드 전체유전자 를 클로닝하여 baculovirus 발현체계를 통해 재조합 단백질을 제조하였다. 결 과:2004년과 2005년도 국내에서 발생한 집단식중독 환자 검체와 산발적으로 발생한 환자의 검 체를 채취하여 염기서열분석과 계통학적 분석을 실시한 결과 국내에 유행하는 노로바이러스주는 GI 인 경우 9개 유전자형 (GI-1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 14)이 검출되었으며 GII 인 경우도 9개의 유전 자형 (GII-2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 15, 16)이 검출되어 전년도 결과에 비하여 다양한 유전자형이 유행 하고 있음을 알 수 있었다. GI-4, GII-3, 6형에 대한 VLP(virus-like-particle) 합성을 위해 baculovirus 발현체계를 통하여 재조합 단백질을 발현하였으며 웨스턴블롯과 전자현미경 사진을 통하 여 발현을 확인하였다. 결 론:국내에 유행하는 노로바이러스 캡시드 유전자의 염기서열을 분석한 결과 GI, GII 각각 9개 의 유전자형을 확인하여 국내에 노로바이러스 유전자형이 다양하게 존재함을 알 수 있었으며 3개의 노로바이러스 VLP를 합성하였다. 중심단어:바이러스성 장염, 노로바이러스, 캡시드, 유전자형, VLP 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임

121 110 국립보건연구원보 Genetic Analysis of Epidemic Strains Causing Foodborne Viral Gastroenteritis K.C. Kim, J.B. Ahn, J.S. Lee, H.K. Lee, A.Y. Jeong, H.K. Um, D.S. Cheon and Y.M. Jee Division of Enteric and Hepatitis Viruses, Center for Infectious Diseases, NIH, Seoul Korea Purpose:The aim of this study was to investigate the genotypic prevalence and sequence diversity of the capsid gene of noroviruses, which caused sporadic cases of viral diarrhea or outbreaks of acute gastroenteritis in Korea. Methods:Stool specimens were collected from sporadic cases and outbreaks of gastroenteritis in Korea between 2004 and Amplified capsid gene products were obtained by using RT-PCR one-step kit with norovirus group specific primer set which could react to 3' end of ORF1 and 5' end of ORF2 of norovirus genome. We determined a 300bp region of capsid gene by automatic sequencing and compared sequences with prototype of norovirus using DNAstar software to analyze the diversity and recombination of norovirus. We cloned the complete capsid gene of norovirus which belongs to GI-4, GII-3 and GII-6 and produced virus like particles CLLPS by using baculovirus expression system. Results:Comparison with nucleotide sequences of Korean strains to prototype strains of norovirus revealed that two major genogroups of norovirus with high degree of sequence diversity were circulated in Korea. From the phylogenetic analysis, of the capsid gene we confirmed that 18 genetic clusters within genogroup I (GI-1, 3, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 14) and within genogroup II (GII-2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 15, 16) strains were circulated in Korea. Recombinant proteins were expressed in baculovirus expression system to produce virus-like particle of norovirus GI-4, GII-3 and GII-6 strains. Expression of recombinant proteins were confirmed by western blotting and electron microscopy. Conclusions:From the phylogenetic analysis, We found that norovirus strains with the high degree of sequence diversity were circulated in Korea. We confirmed that nine genetic clusters genogroup I and nine genetic clusters of genogroup II stains were circulated in Korea during We produced virus-like-particles of GI-4, GII-3 and GII-6 strains. Key words:viral gastroenteritis, Norovirus, Capsid gene, genogroup, VLP This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

122 Ⅰ. 연구보고 111 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 도심서식 질병매개모기(Diptera:Culicidae)에 대한 방제전략 수립 및 모기발생 network 구축 국립보건연구원 면역병리센타 질병매개곤충팀 신이현, 이희일, 이욱교, 장규식, 김용기, 송봉구, 김태균, 홍한기, 이원자 목 적:도시화에 따른 대형건물의 증가 및 난방 공간의 확대, 그리고 이로 인한 도심온도의 상승은 빨간집모기(Culex pipiens pallens)의 생존기간을 연장시켰고, 도시환경에 적응하여 발생하는 지하집 모기(Culex pipiens molestus)의 출현을 초래하였다. 모기의 방제를 위해서는 지역적, 시간적, 공간 적 및 환경적 요인의 분석과 방제 대상 질병매개모기류의 생리 생태적인 정보 등 다양한 정보가 필요 하고, 이들 정보를 활용한 살충제의 선정 및 방제방법 등이 적절하게 운영되어야 효과적인 방제를 할 수 있다. 따라서 이러한 주요 요소를 토대로 도심발생 매개모기류 에 대한 방제체계 및 전략을 수립 하기 위해 본 연구를 수행하였다. 방 법:선정된 조사지역에 유문등을 설치하여 성충모기를 채집하였고, 다양한 발생원을 대상으로 유충을 채집하여 서식종을 확인하였다. 성충채집은 4월부터 10월까지 유문등을 이용하여 발생밀도를 조사하였다. 주요모기에 대한 살충제 감수성 실험을 위해 조사지역에서 채집된 모기종을 온도 26± 1, 상대습도 70±5%조건의 사육실내에서 적응시켜 계대사육 및 대량 사육하여 공시충을 확보하였 다. 확보된 모기를 대상으로 WHO에서 제시하는 점적법에 의해 살충제에 대한 감수성 실험을 실시하 고 결과를 Probit analysis를 통해서 LC 50과 LC 95 CL을 산출하여 효율적인 살충제를 선발하였다. 결 과:중국얼룩날개모기 유충은 수질이 양호한 장소에서 많이 채집되었고, 빨간집모기는 수질이 악화된 장소에서 가장 많이 채집되었다. 흰줄숲모기(Aedes albopictus)와 한국숲모기(Ochlerotatus koreicus)는 숲이나 숲의 근처에서 채집되었다. 그리고 건물의 지하에 만들어진 부패식 정화조에서는 지하집모기가 집단적으로 발생하고 있는 것이 확인되었다. 서울시 9개 구에 대한 지역별 모기종의 분 포를 보면 모두 빨간집모기가 우점종이었으며 종로구, 성동구 그리고 중랑구의 경우 90%이상을 차지하 였다. 중국얼룩날개모기(Anopheles sinensis)는 37.9%를 나타낸 강동구가 가장 높았으며, 큰검정들모 기(Armigeres subalbatus)는 도봉구와 서대문구가 각각 31.7%와 20.5%로 높았으며 동양집모기(Culex orientalis)는 도봉구에서만 1개체 채집되어 도심주거환경에서는 발생율이 매우 낮았다. 계절적 발생밀 도는 5월 첫 주인 연중 19주째부터 모기가 채집되기 시작하여 연중 27주와 30주에 각각 일일평균 12.0 개체와 11.9개체로 가장 높았으며, 연중 지속적으로 발생하며, 여름철이 지나 9월말에서 10월 중순에 비교적 높은 밀도로 연속적인 발생밀도를 보였다. 정화조에서는 지하집모기가 연중 발생하였다. 결 론:도시에서 발생하는 모기는 종수가 적고 종에 따라 발생하는 발생원 환경이 매우 다르게 나 타났다. 따라서 특정 종에 대한 효과적인 방제를 위해서는 유충 발생환경을 불리하게 하는 물리적인 방법을 우선 도입하고, 서식환경과 모기의 발단단계를 고려한 종합적 방제법을 적용하는 것이 중요하 다고 생각된다. 중심단어:도심모기, 방제, 발생원, 발생밀도 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

123 112 국립보건연구원보 Establishment on Control Strategy and Mosquito-net of Urban mosquitoes E.H. Shin, H.I. Lee, W.G. Lee, K.S. Chang, Y.K. Kim, B.G. Song, T.K. Kim, H.K. Hong and W.J. Lee Division of Medical Entomology, Center for Immunology and Pathology, NIH, Seoul Korea Purpose : Increase of the huge buildings and the heating area to urbanization are extending a life of Culex pipiens pallens until early winter season, bring about appearance of Culex pipiens molestus, an autogeny and stenogamy species. For effective mosquito control, analysis on geographical, timely, spatial and environmental factors of breeding site, and physiological and ecological information of mosquito species are specially necessary. The main study objective was to establish on control strategy of urban mosquitoes based on informations above-mentioned. Methods : The adult mosquitoes collected by the black light trap, the larvae collected at the various breeding sites. Weekly population densities of mosquito measured as number of mosquito collected from April to October. For insecticide susceptibilities, mosquito larvae reared at insectarium (26±1, RH 70±5%), and susceptibilities tested by a topical method recommending at WHO, and then calculated LC 50 and LC 95 CL. Results : Anopheles sinensis larvae were collected at the clean water of ground pools and streams, Cx p. pallens larvae were collected at the polluted water of ground pools and artificial containers. Aedes albopictus and Ochlerotatus koreicus were collected at forest area or near sites. Cx. p. molestus was collected at the underground room with sewage disposal tank. Cx p. pallens were dominant species in Seoul, showing above 90% at Jongro-gu, Sungdong-gu and Jungrang-gu. An. sinensis was the highest at Gangdong-gu showing 37.9%, Armigeres subalbatus was 31.7% and 20.5% at Dobong-gu and Sudeamun-gu, respectively, and Cx. orientalis was collected only 1 individual at Dobong-gu. In seasonal population density of mosquito totally, mosquitoes were collected firstly in 1st week of May (19th week in an year), the peak of the population was marked in the 27th and 30th week in an year, average 12.0 and 11.0 individuals, respectively, and mosquitoes collected continuously until late autumn season. Cx. p. molestus breeding in the basement of an apartment was collected by black light trap continuously through the whole year. Conclusions : Urban breeding mosquitoes showed that species diversity is simple and breeding habitats are very different to mosquito species. So, for effective mosquito control on some species, I think that firstly, introduce a physical vector control method in the species, the integrated vector control based on informations, physiological and ecological characteristics including breeding habitat and developmental stage to mosquito species is the most important. Key words : urban mosquito, control, breeding habitat, population density This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

124 Ⅰ. 연구보고 113 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 사스(중증급성호흡기증후군) 재조합 단백질을 이용한 dual antigen/antibody detection ELISA 진단체계 구축에 관한 연구 국립보건연구원 감염병센터 인플루엔자바이러스팀 신구철, 정윤석, 김인수, 최장훈, 강춘 목 적:사스의 조기진단을 위한 진단항원의 대량 생산 및 사스코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백 질의 기능 연구를 위하여, 베큘로바이러스를 이용하여 재조합 사스코로나바이러스 누클레오캡시드 (rsars-n) 단백질을 발현하였고 이 단백질의 진단용 항원으로써의 유용성을 조사하였다. 방 법:역전사 중합효소연쇄반응으로 증폭된 사스코로나바이러스 뉴클레오캡시드 전체 유전자를 베 큘로바이러스 발현벡터인 His-tagged pentr_bhrnx에 삽입하여 pentr_np7을 구축하였고, pentr_np7 벡터와 베큘로바이러스 DNA를 이용하여 곤충세포에서 재조합 베큘로바이러스를 생산하 였다. rsars-n 단백질의 발현율과 항원성은 SDS-PAGE 및 western blot법으로 분석하였으며 rsars-n 단백질의 진단항원으로서의 유용성은 ELISA법으로 분석하였다. 결 과:곤충세포에서 발현된 rsars-n 단백질은 니켈 이온 흡착크로마토그래피법으로 손쉽게 대량 으로 정제할 수 있었으며 정제된 단백질은 약 49kDa의 분자량을 갖는 수용성 단백질이었다. 이 단백 질은 대장균에서 발현된 rsars-n 단백질에 비해 최대 2.5배의 높은 항원성을 보였다. 또한, 대장균 에서 발현된 rsars-n 단백질은 인간코로나바이러스에 대한 혈청과 높은 교차반응을 보이는 반면, 곤충세포에서 발현된 rsars-n 단백질은 교차반응을 보이지 않는 높은 특이성을 보였다. 결 론:본 연구에서 생산된 곤충세포 유래 rsars-n 단백질은 고도의 항원성을 갖는 상태로 대량 발현 및 정제가 용이하며 인간코로나바이러스에 대한 감별진단을 할 수 있는 특이성이 높은 항원으로 서 기존의 진단항원인 대장균에서 발현된 rsars-n 단백질을 대체할 수 있는 유용한 항원임을 알 수 있었고, 이 단백질은 재조합 사스 백신연구를 위해서도 유용할 것으로 생각되었다. 중심단어:사스, 코로나바이러스, 뉴클레오캡시드 단백질, 진단 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

125 114 국립보건연구원보 Development of dual antigen/antibody detection ELISA system with SARS-CoV recombinant protein G.C. Shin, Y.S. Chung, I.S. Kim, J.H. Choi and C. Kang Division of Influenza and Respiratory Viruses, Center for Infectious Disease, NIH, Seoul Korea Purpose:To facilitate the studies on the function of the SARS-CoV nucleocapsid protein (SARS-N) and early diagnosis of SARS, the authors expressed and purified the recombinat SARS nucleocapsid (rsars-n) protein using the baculovirus expression system. And we valuated the usefulness of this recombinant protein on diagnostic assay for detection of SARS positive serum. Methods:Full length cdna of SARS-N was amplified through reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and cloned into baculovirus expression vector His-tagged pentr_bhrnx to construct plasmid of pentr_np7. rsars-n was generated and amplified in Sf21 cells. The expression level and antigenic activity were detected by SDS-PAGE and western blot. In addition, diagnostic usefulness of rsars-n protein was evaluated by using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results:6 histidine-tagged recombinant SARS-N (rsars-n) with a molecular mass of 49 kda was produced using the recombinant baculovirus system in Sf21 insect cells. Most rsars-n protein was obtained in a soluble fraction and was easily purified to near homogeneity by Ni-NTA affinity chromatography. The antigenic activity of rsars-n expressed in insect cells (BrSARS-N) was, at maximum, 2.5-fold higher than that expressed in E. coli (ErSARS-N) when the same amount of rsars-n was used. Additionally, ErSARS-N exhibited a strong cross-response with human coronavirus sera, but BrSARS-N exhibited little or no cross-response. Conclusions:We could successfully express highly active-form rsars-n protein in insect cells and found that BrSARS-N protein may be useful for the development of serodiagnostic assays to discriminate between SARS and HCoVs infection and for further research toward the development of SARS vaccines. Key words:severe acute respiratory syndrome, Coronavirus, Nucleocapsid protein, Diagnosis This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

126 Ⅰ. 연구보고 115 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 진드기매개뇌염바이러스(Tick-Borne Encephalitis Virus)에 대한 실험실 진단 및 국가 감시체계 구축에 대한 연구 국립보건연구원 면역병리센터 신경계바이러스팀 연세대학교 의과대학 기생충학연구실 1 주영란, 김수연, 윤석민, 이인용 1, 유정희, 정영의, 이대연 목 적:뇌염을 일으키는 진드기매개뇌염바이러스 (TBEV)가 국내에서 분리 보고된 바 없으나 TBEV 를 매개하는 참진드기 종이 국내에 분포하고 있고, 매년 불명뇌염환자에 대한 검사 의뢰가 증가하고 있으며, 우리나라와 인근한 국가에서 지속적인 TBEV에 의한 뇌염 발병과 TBEV가 분리 보고 되고 있다. 이러한 상황을 고려해 볼 때 국내에도 진드기매개뇌염 발병 가능성이 매우 높다고 판단된다. 본 연구에서는 TBEV에 대한 신속, 정확한 실험실 진단 및 감시체계를 구축하여 국내 TBEV 존재 여 부를 확인하고 바이러스 분리를 시도하며 분리주에 대한 특성을 연구하고자한다. 방 법:TBEV의 각 형 (subtype)에 대한 표준주와 표준 혈청을 확보하고 고도면역 항혈청을 제작하 여 혈청학적 진단법 (간접면역형광항체법, 효소면역흡착시험법, 중화항체시험법) 개발 연구에 이용하 였다. 또한 외피단백질을 검출 하는 RT-nested PCR 법을 확립하였다. 확립된 혈청학 및 유전학적 진단법을 참진드기, 숙주, 임상검체에 적용하여 TBEV 검출에 이용하였다. 유전자 시료 중 검출 시료 는 젖먹이 마우스에 뇌내 접종하여 바이러스 분리를 시도하였다. 결 과:혈청항체가 조사 결과 불명뇌염검체 280건 중 간접면역형광항체법에서 2건, 효소면역흡착시 험법에서 IgG 4건, IgM 6건, 중화항체가시험법으로 3건의 양성을 확인하였다. 유전학적 검사 결과 진드기 검체 973건 중 9건에서, 불명뇌염 검체 227건 중 10건에서 TBEV의 유전자가 검출되었다. 검 출된 유전자의 염기서열을 비교 분석한 결과 Western subtype과 98% 상동성이 있었다. 결 론:본 연구에서 확립된 TBEV의 혈청 유전학적 진단법을 이용하여 야생 검체와 불명뇌염검체에 서의 TBEV 감염여부를 처음 확인하였다. 또한 국내 TBEV에 대한 발병현황과 유행 가능성을 예측할 수 있을 것으로 판단된다. 중심단어:진드기매개뇌염바이러스, 참진드기, 진단 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

127 116 국립보건연구원보 Construction of diagnostic methods and national surveillance for tick-borne encephalitis virus in Korea Y.R. Ju, S.Y. Kim, S.M. Yun, I.Y. Lee 1, C.H. Yu, Y.E. Jeong and D.Y. Lee The Division of Arboviruses, Center for Immunology & Pathology, NIH, Seoul Korea, Department of Parasitology, College of Medicine, Yonsei University, Korea 1 Purpose:It has been not reported the isolation of tick-borne encephalitis virus (TBEV) in Korea. However, its vector has been recorded since 1940s and TBEVs have been isolated near the countries including Japan, China and Russia. To determine the prevalence of TBEV in Ixodid species and humans showing unknown encephalitis it is required to establish serological assays and RT-nested PCR which are sensitive and specific for TBEV and to perform a national surveillance. Methods:We examined samples of vectors Ixodes sp. and Heamaphysalis sp., and sera of humans who showed unknown encephalitis by serological assays, IFA, ELISA and plaque reduction neutralization test (PRNT). RT-nested PCR was used to detect TBEVs from vectors and sera of humans. For controls of serological assays and RT-nested PCR, we used reference TBEVs, monoclonal and polyclonal antibodies, and designed subtype specific primers. Results:Among 280 of patient two, ten and three were positive for TBEV antibodies by IFA, ELISA and PRNT, respectively. TBEVs were detected from nine in 973 tick vectors and ten in 227 human samples. Phylogenetically the detected TBEVs were clustered with the Western subtype of TBEV. Conclusions:These results suggest that there may be an evidence for human infection of infection in Korea. Further studies are required to isolate and characterize TBEVs for developing preventive strategies. Key words:tick-borne encephalitis virus, tick vector, diagnosis, surveillance This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

128 Ⅰ. 연구보고 117 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 HIV 전파양상에 따른 HIV 유행주의 변화 및 특성에 대한 분자역학적 연구 : 남성 동성 감염자 국립보건연구원 면역병리센터 에이즈 종양바이러스팀 남정구, 김갑정, 신보경, 백진영, 기미경, 김성순 목 적:우리나라의 HIV 감염은 주로 성 접촉에 의해 이루어지고 있으며, 이중 98.4%가 남성 감염 자이고, 성 접촉에 의한 남성 감염자 중 42.4%는 동성 감염자이다. 본 연구는 국내 고위험군인 남성 동성 감염자군에서 subtype의 유행양상과 염기서열의 특성을 분석하기 위하여 HIV-1 env 유전자를 분석하였다. 방 법:국내 남성 동성 HIV 감염자 228명의 PBMCs로부터 genomic DNA를 추출한 후 HIV-1 env 유전자의 염기서열을 결정하고, Neighbor-Joining 방법을 이용한 phylogenetic tree로 subtype 및 유전적 유연관계를 분석하였다. 또한 내국인에 의해 감염된 남성 동성 감염자군과 외국인에 의해 감 염된 남성 동성 감염자군 사이의 유전적 diversity와 divergence를 비교하였고, V3 loop 염기서열의 특징을 분석하였다. 결 과:228명의 남성 동성 감염자 중 212명 (93.0%)은 내국인에 의해 감염되었고, 나머지 16명은 외국인에 의해 감염되었다. HIV-1 subtype은 B가 226명 (99.6%)이었고, A와 AE가 각 1명씩 이었다 (발견 년도 : 1993년, 1999년). HIV-1 subtype B env 유전자의 염기서열을 phylogenetic tree로 분 석한 결과, 226명 중 212명의 염기서열들이 고유한 clade를 형성하였다 (93.8%). 내국인에 의해 감 염된 남성 동성 감염자군과 외국인에 의해 감염된 남성 동성 감염자군의 유전적 diversity는 각각 13.80±2.38% ( )과 16.96±4.26% ( )이었고, 두 군간의 유전적 divergence는 15.51±3.61% ( )이었다. 또한, V3 loop의 tetrameric motif는 GPGS (44.2%), GPGR (37.2%), 그리고 APGS와 GPGK 등으로 구성되었다 (18.6%). 결 론:국내 남성 동성 HIV 감염자의 subtype은 B가 주류를 이루고 있으며, Non-B subtype의 전 파는 1999년 이후에는 발견되지 않았다. 그러나 남성 동성 감염자군이 국내의 주요한 HIV 감염경로 이므로 이들을 대상으로 새로운 subtype의 유행에 대한 지속적인 모니토링이 필요하다. 중심단어:남성 동성 HIV 감염자, subtype, env 유전자, 유전적 diversity와 divergence 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

129 118 국립보건연구원보 Molecular Epidemiological Investigation on the Trends and Characteristics of Prevalent HIV Strains by Transmission Mode : HIV-infected MSM J.G. Nam, G.J. Kim, B.K. Shin, J.Y. Baek, M.K. Kee, and S.S. Kim Division of AIDS, Center for Immunology and Pathology, NIH, Seoul Korea Purpose:HIV infection was attained mainly by sexual contacts, and 98.4% of HIV-infected people were men in Korea. 42.4% of men infected by sexual contacts were MSM. To investigate on the trends and characteristics of HIV subtypes, we analyzed the HIV-1 env gene of MSM, a high-risk group of HIV infection in Korea. Methods:We extracted the genomic DNAs from PBMCs in 228 HIV-infected MSM and sequenced the HIV-1 env gene. The sequences were analyzed by phylogenetic tree using the Neighbor-Joining method for subtypes and genetic relationship. We also analyzed both MSM infected by Koreans and MSM infected by foreigners with comparison of the genetic diversity and divergence between the two groups. In addition, the nucleotide sequences of V3 loop were characterized. Results:212 of 228 MSM (93.0%) were infected by Koreans and the remaining 16 infected by foreigners. 226 HIV-1 subtype B (99.6%), 1 subtype A in 1993, and 1 subtype AE in 1999 were found. In phylogenetic tree analysis of HIV-1 subtype B, 212 of 226 MSM (93.8%) were formed a monoclade. The genetic diversity of MSM infected by Koreans and MSM infected by foreigners was 13.80±2.38% ( ), 16.96±4.26% ( ), respectively. And the genetic divergence between MSM infected by Koreans and MSM infected by foreigners was 15.51±3.61% ( ). The tetrameric motifs of the V3 loop were comprised of GPGS (44.2%), GPGR (37.2%), and others (APGS, GPGK, 18.6%). Conclusions:HIV-1 subtype B viruses are prevailing predominantly in MSM who were infected inside Korea. The infection of HIV-1 Non-B subtypes has increased in heterosexuals, but Non-B subtype transmission has not been discovered in MSM since However, continuous monitoring of new subtype prevalence is necessary because MSM is a major route of HIV transmission in Korea. Key words:hiv-infected MSM, subtype, env gene, genetic diversity and divergence This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

130 Ⅰ. 연구보고 119 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 바이러스 감염진단을 위한 다목적 DNA chip 개발 국립보건연구원 감염병센터 면역병리센터 정윤석, 최우영, 김기순, 지영미, 신영학, 강춘, 김성순, 조해월, 이주실 목적:사람에게 감염되어 급성 또는 만성 감염 질병을 유발하는 수 많은 바이러스에 대한 현재의 진단 시스템은 다양한 바이러스를 동시에 진단하는 데는 한계가 있다. 또한 현재의 DNA chip은 PCR 증폭 단계를 필요로 하여 target virus 가 제한되어 있다. 따라서 본 연구에서는 국내에서 발생하는 주요 바이러스성 질환의 원인 바이러스 typing/subtyping과 새로운 유형의 바이러스의 동시 진단이 가능한 다목적 DNA chip 진단제를 개발하고자 한다. 방법:8종의 호흡기 바이러스 (PIV 1 (C-35), PIV 2 (Greer), PIV 3 (C-243), RSV A (long), RSV B (CH-18537), HCoV (229E, OC43), SARS-CoV와 7종의 echovirus 를 연구 대상 바이러스 로 사용하였다. Viral RNA는 QIAmp Viral Mini Kit를 사용하여 분리하고 정제하였으며, 바이러스 의 cdna 합성중에 cy5-dutp를 cdna에 통합시켜 50bp-70bp의 바이러스 특이 oligonucleotide와 2시간 동안 hybridization 시켰다. 바이러스 특이 DNA chip에서의 반응은 Axon 4000 스캐너로 측 정하고 GenePix 4.0 software 로 분석하였다. 결과:cDNA direct labelling에 의한 DNA chip 의 경우는 Echo 6, 13, 30과 호흡기바이러스 HCoV OC43, SARS-CoV의 경우 정확한 바이러스 검출 결과를 나타내었으나 Echo 7, 9, 11, 25의 경우 교차반응을 나타내었다. 그러나 PCR 단계를 포함하는 7종의 Echovirus genotype DNA chip은 사용한 표준주 모두 다른 type과 교차반응을 나타내지 않았으며, 호흡기 바이러스 8종 구분 진단도 사용한 표준주 모두 교차반응 없이 각각의 probe와 반응하였다. 3회의 반복 시험에서 재현성을 나타 내었다. 결론:현행 DNA chip의 최대 단점인 PCR 증폭 단계를 생략하고 cdna를 적용하는 시스템을 개발 하였다. 향후 이 방법의 더 개선된다면 임상학적 및 역학적으로 연관이 있는 바이러스성 질환의 종합 적인 진단체계 개발로 원인병원체의 신속 정확한 진단을 가능하게 되어 임상에서 원인불명 또는 감별 진단이 향상될 것으로 기대된다. 중심단어:바이러스, DNA chip, 동시진단 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임

131 120 국립보건연구원보 서 론 감염질환의 원인 병원체를 찾는 전통적인 방 법은 예측 가능한 또는 관련성을 배제하기 위 한 원인체를 진단하는 각각의 방법을 적용하는 것이다. 전통적으로 바이러스 진단을 위해서는 세포배양에 의한 바이러스 분리 또는 IFA와 EIA 등 면역반응에 의한 항원 항체 탐지를 적 용해 왔다. 바이러스 진단에서의 중요한 요소는 감도와 특이도, 편리성과 신속성이라고 할 수 있다. 최근까지 이러한 중요한 요소를 충족하기 위해서 새로운 진단방법과 진단제의 개발이 이 루어져서 감도와 특이도에서 크게 개선되었고 또한 편리성과 신속성에 있어서도 많은 발전이 이루어졌다(1). 그러나 다양한 바이러스 Type 및 subtype, 새로운 유형확인, 같은 증상을 유 발하는 다양한 바이러스의 구분 진단 등은 많 은 제한점을 갖고 있다. 최근에 PCR 방법이 바이러스 진단에 도입되 면서 바이러스 진단의 감도 향상과 더불어 multiplex PCR 방법과 degenerate primer를 이 용한 동시진단의 적용범위가 확대되었다(2). 그러나 바이러스의 type과 subtype을 구분하기 위해서는 PCR을 수행한 후 염기서열 분석, hybridization blotting 등 많은 시간과 노력이 필요하다. 더구나 이러한 방법도 PCR 에 사용 되는 primer에 의한 증폭 대상의 한계에 묶이 게 된다 (3). 따라서 이러한 동시진단과 type 구분 진단의 목적에 부합되는 진단제 개발로 DNA chip의 개발이 가장 가능한 방법 중 하나 일 것으로 주목받고 있다 (4,5). 본 연구는 인체에 다양한 질병을 유발하는 바이러스를 진단하기 위한 DNA chip으로 유사 한 임상증상을 나타내는 바이러스의 구분진단, 유행하는 바이러스의 유전형 또는 혈청형의 구 분을 위한 DNA chip을 개발하고자 시도되었다. 혈청형이 매우 다양한 echovirus와 감별진단이 어려운 호흡기바이러스를 대상으로 이러한 용 도의 chip 개발의 가능성과 효용성을 검증하고, 현재 시중에 보급되고 있는 PCR 단계를 포함하 는 DNA chip 방법의 제한점을 개선하고자 Fluorscent labelling cdna를 이용한 microarray (6) 결과를 보고하고자 한다. 재료 및 방법 1. 표준주 및 임상분리주 국내에서 유행하는 echovirus 혈청형은 현재 국립보건원에서 수행하고 있는 감시체계와 연구 사업 결과를 바탕으로 국내에서 흔히 분리되는 주요 혈청형 7가지를 선정하였다. Echovirus 표 준주 [echovirus 6 (D'Amori), echovirus 7 (Wallace), echovirus 9 (Hill), echovirus 11 (Gregory), echovirus 13 (Del Carmen), echovirus 25 (JV-4), echovirus 30 (Bastianni)]를 ATCC로 부터 분양받아 실험에 사용하였다 (Table 1). 바 이러스는 단일층을 형성한 Rd 또는 BGM 세포 에 접종하여 증식하였으며 세포상층액은 수집 하여 -70 에 보관하였다. 또한 echovirus 임상 분리주는 2002년과 2004년에 무균성 수막염 환 자로부터 분리한 양성 검체 (분변, CSF, 인후도 찰물, 결막검체 등) 중에서 52주(echo6 19주, echo7 6주, echo9 5주, echo11 3주, echo13 8주, echo25 5주, echo30 6주)를 선정하여 실험에 사 용하였다. 호흡기 바이러스는 Parainfluenzavirus 1(C-35), Parainfluenzavirus 2 (Greer), Parainfluenzavirus 3 (C-243)을 LLC-MK2에서 배양하여 사용하였고, Respiratory syncytial virus A (Long), Respiratory syncytial virus B(CH-18537)는 Hep-2 세포에, 그 리고 Coronavirus 229E와 OC43은 MRC-5에, SARS-Coronavirus는 Vero 세포에서 각각 배 양하여 사용하였다. 2. 유전자형 구분을 위한 probe 고안 유전자형을 구분하기 위한 probe 선정 시 probe 길이, Tm 값 (73-96 ), 혈청형 간에 mismatch 염

132 Ⅰ. 연구보고 121 기수가 3개 이상될 것, hairpin 형성하지 말 것 등의 사항들을 고려하여 probe를 제작하였다. Oligo DNA는 DNA synthesizer로 합성하였으며 OPC column을 통해서 정제하였다 (Hokkaido System Science Co., Ltd). 각 바이러스의 분석 대상 유전자 부위 및 고안된 probe 등은 Table 1과 같다. Table 1. Virus specific 50bp oligonucleotides probes sequences Virus Sequence (5'-3') Target gene Echo6 Echo7 Echo9 Echo11 Echo13 Echo25 Echo30 CAAAACCCGGGACACGACTCCCGACAAGATGTATGATAGCTGGATTATCAAT ACCAAACAAGTGGCGCAG CTACACCAAGGACCAAGACAATGTTAATAGGTACATGTCGTGGACAATAAA TGCCAGAAGAATGGTGCAA TGAAGCAAGGGGTGACCCTGAGAGCACAGATCGCTTTGATGCATGGGAGAT AAGCGTGCGTGACATGGTT GCCTCATGGACTATTAGTGCACGACGCATGGTTCAAATGAGACGCAAGCTAG AGATCTTCACTTACGTCC TGACACTCACGGGGATGCAGCCGACGCAAAGTACGCCAGTTGGACGATAACC ACCCGAAAAGCTGCACAG TGGGACAAAAGAGAATGGTGACATCAAGCGCTTCACCAACTGGAGAATAAA CACACGTCAGGTCGTGCA TGCCACAGAAAAGGCTAATGATGATTTGGACAGATACACTAACTGGGAGAT CACAACTAGGCAGGTGGCA VP1 PIV1 CACACACTTAGTGTCGCCTTGGAGCGGAGTTGTTAAGCCACCGTACCCTA HA PIV2 TAGATCAGTTGTGGCATAATCTTCTTTCTCAGATCTTGTAGCTACATAGC HA PIV3 TCCATTTGGACATGAATGTCCCCATGGACATTCATCGTTTCCTGGTCTTG HA RSV A ATAATAATGATGCTTTTGGGTTGTTCAATATATGGTAGAATCCTGCTTCA N RSV B AAGATTCCTTCAACTCTACTACCCCCTCTTGTGGATGATTGTGCAATGCC N HcoV (229E) ATTGGGCCTTTGTTGCATTTAGCCTTCTTATGGCCGTATCAACACTCGTT M HcoV (OC43) TACTCTGACGGTCACAATAATACGCGGCCATCTTTACATTCAAGGTATAA M SARS ATGCTGCCACCGTGCTACAACTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGC N

133 122 국립보건연구원보 3. DNA microarray 제작 슬라이드는 GeneSlide(Tokyo Kohan Co., Ltd) 제품을 사용하여 음성 대조군을 포함한 대상 바이러스 probe DNA를 슬라이드에 4ul씩 spotting(200 pmol/ul)하였다. Spotter는 OmiGrid 100을 사용하였으며, 각 Spot의 크기는 약 300um 정도로 subarray의 크기는 약 25,000um 이다. Agilent Microarray Scanner를 이용하여 슬 라이드의 spot 상태를 확인한 후 80 dry oven 에서 하룻 밤 동안 spot을 고정시켰다. 0.2% SDS를 포함한 2XSSC 용액으로 슬라이드를 세 척 후 95 에서 15분 동안 가열하여 변성시켰 다. 증류수로 슬라이드를 3번 세척하고 원심분 리하여 건조 후 상온에 보관하였다. 4. Viral RNA 추출 및 cdna 합성 바이러스 배양액 250μl에 Tri reagent(gibco BRL) 750μl를 첨가한 후 vortex하고 상온에서 10분간 정체시키고, chloroform을 250μl 첨가하 여 vortex한 후 상온에서 15분간 정체시켰다. 14,000rpm으로 4 에서 15분간 원심하여 상층액 을 취하고 다시 상층액과 동량의 isopropranol을 첨가하고 상온에서 30분간 핵산을 침전시켰다. 14,000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전된 바 이러스의 RNA를 수거하고 ethanol 세척 및 건 조과정을 거친 후 DEPC 처리된 증류수를 첨가 하여 완전히 녹인 후 cdna의 합성을 위한 주 형으로 사용하였다. 바이러스 유전자로부터 cdna를 합성하기 위해서 바이러스 특이적 primer 를 사용하였으며, 반응을 위해서는 5x buffer 3ul, 0.5ul RNase inhibitor 0.5ul, dt-dntp 4ul, 10pM primer 1ul, AMV RT(reverse transcriptase) 0.5ul, RNA 5ul를 사용하여 총 부피를 DEPC 처리 증류 수로 15ul로 조정하여 20 에서 10분, 42 에서 90분간 반응시킨 후 95 에서 5분간 효소를 불 활성화 시켰다. 5. PCR 방법에 의한 target DNA labeling 각각의 바이러스의 target 유전자 부위를 PCR 로 증폭한 후 전기영동으로 확인하고 isopropanol 침전으로 정제하여 1/10 vol 의 sodium acetate 와 동일 부피의 isopropanol 첨가하여 혼합하였 다. 15,000rpm 으로 20min간 원심분리하고 상층 액 제거 후 70% ethanol 500ul를 넣고 10min간 원심분리하고 상층액 제거 후 건조시켰다. 증폭 된 aminoallyl-labelled PCR 산물을 labeling buffer (0.2M sodium bicarbonate) 5ul에 녹이고 동량의 Cy5 monofunctional reactive dye (Amersham Bioscience)를 첨가하여 상온의 암실에서 60분간 반응시켰다. QIAquick PCR purification kit (QIAGEN)를 사용하여 Cy5-labelled DNA를 정 제하고 흡광도를 측정하였다. 정제된 각 cdna(table 4) 및 공통 primer를 사용하여 aminoallyl-labelled PCR 산물을 합성한 후 probe가 부착된 슬라이드에 반응시켰다. 전술 한 바와 같이 hybridization 반응은 60 에서 14-16시간 동안 수행하였으며 PCR 반응산물의 농도는 5ng으로 하였다. 6. Reverse transcription 방법에 의한 target cdna direct labeling 각 바이러스의 정제된 RNA로부터 역전사 (reverse transcription) 반응시 cy5-dutp를 사 용하여 직접 labeling하였다. RNA는 Tri reagent (Gibco BRL)를 사용하여 추출하여 주형으로 사용 하였다. 바이러스 유전자로부터 cdna를 합성시 labeling하기 위해서 5x buffer 8ul, random hexamer 1ul, 0.1M DTT 1.5ul, RNase inhibitor 1ul, low dttp 2ul와 cy5-dutp 1ul(Amersham), AMV RT(reverse transcriptase) 2ul, RNA 20ul를 사용하여 25 에서 10분, 50 에서 2시간 반응시 킨 후 0.5M EDTA 5ul, 1N NaOH 10ul를 가하여 65 10분간 반응 시켜 RNA hydrolysis시킨 후 1M Tri-HCl (ph7.5) 25ul로 중화반응을 시켰다. QIAquick PCR purification kit (QIAGEN)를 사용

134 Ⅰ. 연구보고 123 하여 Cy5-labelled cdna를 정제하여 에탄올 침전 을 시킨 후에 hybridization buffer(20x SSC 7.5ul, 10% SDS 0.5ul, 50X denhardt's solution 2.5ul, 10X human Cot1 genomic DNA 2.5ul)에 넣고 잘 섞은 후 95 에서 2분간 가열한다. Hybridization chamber에 probe가 부착된 test용 slide를 넣고 Cy5-labelled cdna를 넣은 후 50 에서 14-16시 간 hybridization하였다. 반응이 끝난 후 Microarray의 세척은 2X SSC/0.2% SDS로 10분간 2회 세척하였다. 린스는 0.05X SSC로 실온에서 5 분간 세척하고 슬라이드를 원심(650rpm, 2분)하여 건 조하였다. Microarray의 Scan은 Axon사 의 GenePix scanarray 5000B를 사용하였다(PMT vol:100%). 7. Microarray hybridization Cy5-labelled DNA를 hybridization buffer (20X SSC 7.5ul, 10% SDS 0.5ul, 50X denhardt's solution 2.5ul, 10X human Cot1 genomic DNA 2.5ul)에 넣고 잘 섞은 후 95 에서 5분간 가열 하였다. Hybridization chamber에 probe가 부착 된 test용 slide를 넣고 Cy5-labelled DNA를 넣은 후 60 에서 14-16시간 hybridization 하였 다. 반응이 끝난 후 Micro array의 세척은 2X SSC/0.2% SDS로 10분간 2회 세척하였다. 린스는 0.05 X SSC로 실온에서 5분간 세척하고 슬라이드 를 원심(650rpm, 2분)하여 건조하였다. Microarray 의 Scan은 아질런트사의 microarray scaner를 사용 하였다(PMT vol: 100%). 결 과 바이러스 진단을 위한 chip으로 Echo virus 유전자형 분석 chip 및 HCoV, SARS, RSV, PIV 등 호흡기 바이러스 동시 진단 chip을 개 발하였고, DNA chip의 제한점으로 작용하는 PCR 단계를 생략하는 방법으로 개선하였다. Echo virus 유전자형 분석 chip과 호흡기 바이 러스 동시 진단 chip은 PCR 방법에 의한 target DNA labeling 하였고, DNA chip의 제한 점으로 작용하는 PCR 단계를 생략하는 방법으 로 개선을 위하여는 Reverse transcription 방 법에 의한 target cdna direct labeling 하였다. 1. Echovirus 유전형 동정 DNA chip echovirus 표준 바이러스를 이용하여 DNA chip 검사를 시행한 결과를 Fig. 1에 표시하였 다. 7가지 종류의 Echovirus 혈청형 모두 해당 probe 위치에서 양성 결과를 나타내었으며, 다 른 형과의 교차반응을 나타내지 않았다. 표준바 이러스를 이용한 DNA chip 에 의한echovirus 유전형 동정 실험을 3회 반복한 결과 재현성을 확인하였다. 음성 E6 E9 E11 E7 E13 E25 E30 E7 E11 E25 CB1 Fig. 1. Detection and typing of echovrius by DNA chip. 2. 호흡기 바이러스 동시 진단 chip 호흡기 바이러스 중에서 Parainfluenzavirus 1, Parainfluenzavirus 2, Parainfluenzavirus 3, Respiratory syncytial virus A, Respiratory syncytial virus B Coronavirus와, SARS-Coronavirus를 동시 에 감별진단이 가능한 DNA chip을 고안하였다. (fig. 2) E6 E9 E13 E30

124 국립보건연구원보 Fig. 2. Lay out of Respiratory viruses detection DNA chip 재료 및 방법에 기술된 방법으로 제작된 호 흡기 바이러스 감별진단 DNA chip 의 특이도 평가를 위하여 각각의 표준 바이러스를 이용하 여 DNA chip 검사를 시행하였다. DNA chip 결 과는 Fig. 3과 같다.

135 124 국립보건연구원보 Fig. 2. Lay out of Respiratory viruses detection DNA chip 재료 및 방법에 기술된 방법으로 제작된 호 흡기 바이러스 감별진단 DNA chip 의 특이도 평가를 위하여 각각의 표준 바이러스를 이용하 여 DNA chip 검사를 시행하였다. DNA chip 결 과는 Fig. 3과 같다. 표준바이러스를 각각 적용 한 결과 해당 probe 위치에서 양성 결과를 나 타내었고 다른 바이러스와의 교차반응을 나타 내지 않았다. 을 적용하여 기존의 진단용 DNA chip의 단점을 해소하는 신속한 진단용 DNA chip의 가능성을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다. DNA chip 결과는 Fig. 4와 같다. 표준바이러 스를 각각 적용한 결과 해당 probe 위치에서 background signal에 비해 3배이상 결과를 양 성으로 판정한 결과 여덟 개의 표준 바이러스 시료 모두 정확하게 바이러스가 검출되었다. 또 한 교차반응은 일어나지 않아 chip 상에 나타 난 유전형 또한 표준바이러스 유전형과 일치하 여 높은 특이도를 나타내었다. 표준바이러스를 이용하여 DNA chip 검증실험은 여러번 반복실 험을 통하여 재현성을 확인하였다. A ctin N.C P IV 1 P IV 2 P IV 3 R S V L R S V B 2 29E O C 4 3 S A R S N.C N.C PIV 1 PIV 2 Fig. 3. The diagnosis results of DNA chip PIV 3 3. DNA chip 실험 단축 system 개발에 의 한 신속 진단용 DNA chip 제작 및 평가 PCR 과정을 생략하고 RNA 바이러스의 Reverse Transcription 과정시 labelling 하는 방법 RSV A RSV B

SARS Actin Fig. 4. Detection of 7 respiratory viruses using oligonucleotide DNA chip. DNA probes were spotted in duplicate in an six-by-four grid.

136 Ⅰ. 연구보고 125 HcoV(229E) HcoV(OC43) 4. Echo 바이러스 및 호흡기바이러스 진단을 위한 다목적 DNA chip 개발 Echo 바이러스와 호흡기 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 chip 제작을 위하여 사용한 probe는 앞서 echo 바이러스 chip 제작에서 사 용한 70mer probe와와 호흡기 바이러스 chip 제작에서 기술한 50mer probe를 사용하였다. SARS Actin Fig. 4. Detection of 7 respiratory viruses using oligonucleotide DNA chip. DNA probes were spotted in duplicate in an six-by-four grid. Beta actin probe was identified as experimental positive control. DNA chip의 민감도는 HCoV(OC43)으로 평 가하였으며, 128HA unit까지 검출이 되었다. 또한 DNA chip의 재현성은 HCoV (229E), RSV A, PIV 2샘플을 가지고 3번의 독립적인 칩을 사용하여 확인 하였으며, probe시퀀스나 바이러스 농도의 차이에 따라 signal의 정도가 차이가 있으나 표준편차의 오차의 범위는 25% 이내를 나타냈다 (fig. 2). Signal intensity at 650 nm HCoV 229E RSV A PIV 2 Fig. 5. Reproducibility of oligonucleotide DNA chip. Three independent experiments were performed with 3 respiratory viruses. The mean ± standard deviation was calculated from the signal intensity of each probe at 650nm. Fig. 6. Lay out spots for Multichip for the detection of Echovirus and respiratory viruses DNA chip 평가를 위하여 각각의 바이러스를 확인할 수 있는 표준 (reference) 바이러스를 이 용하였다. DNA chip 결과는 Fig. 13과 같다. 표 준바이러스를 각각 적용하여 해당 probe 위치 에서 background signal에 비해 3배이상 결과를 나타낼 때 양성으로 판단하였다. Echo 6, 13, 30과 호흡기바이러스 HCoV OC43, SARS- CoV의 경우 정확하게 바이러스가 검출되었으 나 Echo 7, 9, 11, 25의 경우 교차반응이 나타 나 Probe 조정이 필요한 것으로 확인되었다. Fig. 7. Profile of Echo and respiratory viruses detection chip

137 126 국립보건연구원보 고 찰 현재 개발되어 사용되는 바이러스 진단을 위 한 DNA chip은 HPV, HBV, 등과 같은 고위험 바이러스에 국한되어 개발되어있다. 이러한 DNA chip 진단의 경우 환자의 검체로부터 유 전자를 추출하고 그 유전자를 진단용 PCR로 증폭하며 labelling 한 후 chip에서 hybridization 하는 방법을 사용하고 있는데, 이 방법은 병원 체 진단에 있어서 매우 중요한 요소인 신속함 에서 기존의 유전자 진단법인 PCR 후에 다시 hybridization 하는 방법을 적용함으로 기존의 유전자 진단법 보다 떨어진다. 또한 민감도 면 으로 유전자 진단법을 그대로 적용하고 그것을 확인함으로 기존의 진단법에서 특이하게 달라 진 것이 없다. 또한 현재 DNA chip을 확인하는 방법으로는 형광 염료를 유전자에 끼어 넣어 형광으로 확인하는 방법을 일반적으로 이용하 는데 이러한 형광 염료의 경우 일반적인 진단 법에서 요구되는 비용보다 매우 고가임으로 비 용 면에서도 많은 문제점을 가지고 있다. 그러나 위에서 언급한 여러 가지 문제점에도 불구하고 DNA chip을 바이러스 진단에 적용하 고자하는 가장 중요한 이유는 동시에 매우 다 양한 바이러스를 확인할 수 있는 DNA chip 특 성을 이용하고자 하는 것이다. 따라서 이러한 기존의 DNA chip의 한계를 극복하기 위해서는 PCR 방법을 생략하는 방법의 개발, subtyping 이 가능한 공동의 primer 개발, 공동 prime 를 사용한 multiplex 적용 등이 이루어져야하며 이 러한 제한점을 극복하려는 다양한 시도가 이루 어지고 있다 (7). 또한 이러한 다양한 시도를 검증하기 위해서는 DNA chip에 올리는 probe 의 특이도와 감도에 대한 사전 검색 시스템이 필요하다. 그 이유는 DNA chip 제작은 고가이 므로 모든 실험을 chip을 제작하여 실험한다면 비용효과 면에서 매우 효율적이지 못하며, 또한 이러한 검색 시스템 자체가 하나의 진단법으로 개발 될 수 있기 때문이다. 본 연구에서는 Echovirus를 대상으로 Dot blot 으로 genotyping을 위한 primer의 최적조건을 위 하여 20-70mer primer(8)의 특이도를 검색하여 DNA chip 제작에 적용하였다 (fig 8). Fig. 8. Detection in reference strains with type-specific probes 그 결과 선택된 primer는 PCR 증폭단계를 거 치는 DNA chip 시험에서는 모든 echovirus의 genotype이 정확하게 표준 바이러스가 chip 상 의 probe와 반응하고 교차반응을 나타내지 않 았다(fig.1). 그러나 cdna를 이용한 DNA chip 시험에서는 Echovirus 7, 9, 11, 25에서 교차반 응이 확인되었다. 이러한 결과는 본 시험에서 제작한 probe가 echovirus의 VP1 부위를 대상으 로 하였기 때문에 VP1 이 아닌 다른 부위와 교 차 반응이 있었던 것으로 생각된다. 따라서 cdna를 활용하고 PCR 단계를 생략하는 DNA chip을 제작하기 위해서는 primer 개발 시 바이 러스 유전자 전체를 대상으로 probe의 특이도 를 검증하여야 할 것으로 판단된다. 본 연구 결과 개발된 DNA chip이 널리 적용 되고 개선된다면 DNA chip을 이용한 microarray 방법으로 단한번의 검사에 의해 빠르고 간편하 면서 많은 정보를 정확하게 제공할 수 있는 진 단 kit 개발이 가능할 것이다. 즉, RNA 바이러 스 또는 DNA 바이러스 단위의 전체 로 확인할 수 있는 DNA chip의 개발이 가능할 것으로 생

138 Ⅰ. 연구보고 127 각된다. 향후 이러한 chip이 개발된다면 현재의 정보 보급 속도로 미루어 DNA chip에 의한 진 단이 현재의 EIA 방법이나 PCR 진단만큼 널리 보급되는 것은 시간 문제이며, 이러한 DNA chip을 이용하여 다양한 형태의 진단제가 향후 의 진단 방법의 주류를 이룰 것으로 판단된다. 이러한 DNA chip의 multiple detection 기능을 바이러스 진단에 적용함으로서 환자 증상을 유 발할 수 있는 매우 다양한 바이러스의 진단을 간편하게 할 수 있을 것이다. 참고문헌 reproducibility is improved by optimising purification steps in RNA amplification and labelling. (2004) BMC Genomics. 5:9. 7. Gary J.V, Carolyn E.M, David A.S, Joanne D, Andreadis. Nucleic Acid Amplification Strategies for DNA Microarray-Based Pathogen Detection. (2004) Applied and Environmental Microbiology. May Martin J.H, Vineet K.S, Xujing W, Shehnaz K, Michael R.T, Thomas C.Z. Utilization of a labeled tracking oligonucleotide for visualization and quality control of spotted 70-mer arrays. (2004) BMC Genomics. 5:12. 1.감염병실험실진단 질환별시험법 제 4부 바 이러스질환 (2005) 2. Elnifro, E.M., Asishi A.M., Cooper R.J. Klapper P.E.. (2002) Clinical Micrebiol. Rev, 13, Kenji O, Ulrich M. VirOligo: a database of virus-specific oligonucleotides. (2002) Nucleic Acid Research. vol.30. 1: David W, Laurent C, Maxine Z, Pedro C.A, Homer A.B, Don G, Joseph L.D. Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens. (2002) PNAS. vol : Elena C, Majid L, Vladimir C, Ekaterina K, Eugenia D, Vadim I.A, Konstantin C. Microarray analysis of evolution of RNA viruses: Evidence of circulation of virulent highly divergent vaccine-derived polioviruses. (2003) PNAS. August5. vol : peter A.C.H, Floor de K, G.J.B. van O, Johan T. den D. Fluorescent labelling of crna for microarray applications (2003) Nucleic Acid Research. vol.31. 5:e20. Ali N, Ahmed A.A, Nuno L.BM, Samuel A, James D.B, Carlos C. Expression microarray

139 128 국립보건연구원보 Development of oligonucleotide DNA chip for Rapid and multiple detection of viral pathogen Y.S. Chung, W.Y. Choi, K.S. Kim, Y.M. Jee, Y.H. Shin, C. Kang, S.S. Kim, H.W. Cho and J.S. Lee Center for infectious disease, Center for Immunology and Pathology, NIH, Seoul Korea Objective:There are numerous viruses that lead to acute infection and chronic diseases in human. However, current diagnostic methods have some limitation to determine the large number of viruses. Previously developed DNA chip methods need PCR amplification and have narrow application range because of specific primers against target virus. However, we require multiple detection and a differential diagnosis about similar clinical symptoms as well as identification of unknown etiology. To address these limitations, we developed simple oligonucleotide DNA chip able to detect several RNA viruses simultaneously without any amplification. Methods:A total of 8 respiratory viruses and 7 echoviruses were used in this study, which included PIV 1 (C-35), PIV 2 (Greer), PIV 3 (C-243), RSV A (long), RSV B (CH-18537), HCoV (229E, OC43). Viral RNA isolation and purification were carried out by using a QIAmp Viral RNA Mini Kit. During viral cdna synthesis, cy5-dutp was incorporated into cdna. The labeled probes were hybridized with Virus specific oligonucleotide probes (50bp sequences), which were designed based on GenBank sequence database, for 2 hours. The RNA viruses detection DNA chip was imaged by Axon 4000 scanner and analyzed by using GenePix 4.0 software. Results:The specificity of this method was assessed by hybridization of each reference respiratory viruses and echoviruses. Each respiratory specific oligonucleotide probes independently hybridized according to each viruses and there was no cross hybridization with other respiratory viruses. However, echovirus 7, 9, 11, 25 showed cross reactivity while PCR emplfied echovirused react specifically to each virus. Since there were slight sequence diversities between probes hybridization signal intensities varied. The reproducibility of this assay was performed three independent experiments with same amount of viral RNA sample. The mean standard deviation was calculated from the signal intensity of each probe at 635 nm. Conclusion:It is very important to detect rapidly and simultaneously new emerging and/or known viruses from patients who suffer from viral infection and need for subsequent treatment. Development of a broad spectrum of RNA virus detection DNA chip which may even screen unknown RNA viruses can simply provides rapid diagnosis of a single RNA viruses infection, co-infection and a differential diagnosis. Therefore it will be very useful method to verify viral

140 Ⅰ. 연구보고 129 pathogens and distinguish some viral subtypes in clinical fields. Key words : Virus, DNA chip, Simultaneous detection This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

141 130 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 JEV 국내분리주와 prototype주들에 대한 감염 세포에서의 유전자 발현과 면역학적 특성에 관한 비교분석 국립보건연구원 면역병리센터 신경계바이러스팀 유정희, 김연희, 조정은, 이대연, 정영의, 주영란, 박근용, 신영학 목 적:JEV는 (+) RNA 바이러스로 연간 0.03~2%의 비율로 돌연변이주가 나타날 수 있다고 알려 져 있다. 또한 자연계에 존재하는 매개모기에서 JEV가 분리되고 있는 점 등을 감안할 때 일본뇌염의 급격한 발생 가능성은 항상 존재하고 있다. 따라서 본 연구에서는 최근 국내에서 분리된 JEV의 여러 특성을 분석하고 백신으로 사용하고 있는 다른 prototype주와 비교하여 바이러스 진화 연구, 백신의 효용성 문제 등에 중요한 정보를 제공하고자 하였다. 방 법:2001년도 국내분리주의 특성을 비교하기 위해 HA 역가 측정, Plaque assay 실험 및 실험 동물을 이용한 virulence 실험 실시, TaqMan 법에 의한 바이러스 유전자 발현 정도 분석 및 일본뇌 염 바이러스의 E 유전자 클로닝을 실시하였다. 결 과:2001년도 분리주와 prototype주에 대한 특성을 분석한 결과 2001년 분리주 중 환자에서 분 리된 바이러스 주인 K01-pc 주가 항원성 및 세포 독성, 유전자 발현율 등이 떨어짐을 알 수 있었다. 그러나 유전자 염기서열 및 단백질 서열상에 있어 다른 분리주와 prototype주들과 90%이상의 상동성 을 보였다. 결 론:국내의 바이러스 진화연구, 불활화 백신의 효용성 문제, 진단항원 개발, 일본뇌염 치료제 개발 등에 중요한 정보를 제공할 수 있으며 새로운 백신개발을 위한 기반기술을 확립할 수 있는 기초 연구로 질병의 예방 및 관리를 위한 공중보건학적 측면에서 매우 중요하다. 중심단어:일본뇌염 바이러스, 국내분리주, HA 역가, TaqMan 법 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

142 Ⅰ. 연구보고 131 서 론 일본뇌염은 Flaviviridae의 일본뇌염바이러스 (Japanese encephalitis virus, JEV)에 의해 감염되 는 질병이다. 일본뇌염 감염자 발생이 감소추세 에 있음에도 불구하고 자연계에 일본뇌염을 매 개하는 매개 모기가 존재하고 이들 매개모기로 부터 JEV가 분리되고 있어 1982년 1,197명의 환자 발생과 같은 갑작스런 폭발적 발생 가능 성이 있다. 또한 한두 명이기는 하지만 지속적 으로 환자 발생이 보고되고 있는 점, 기후 변화 등의 여러 환경조건의 변화로 매개 모기의 개 체 밀도가 증가할 가능성 등으로 인하여 일본 뇌염 발생이 증가할 수 있기 때문에 일본뇌염 에 대한 국가사업을 유지하는 것은 매우 중요 한 일이다. 현재와 같은 일본뇌염 환자의 감소 는 백신접종, 개인위생 유지, 살충제 효과 등 인위적인 많은 요소에 의한 억제효과로 볼 수 있다. 그러나 자연계 매개체 및 증폭 숙주 등 일본뇌염을 발생시킬 수 있는 원인이 항존하고 있어 근원적인 근절은 어려운 질병이다. 일본뇌염 백신은 마우스 뇌 조직을 이용한 불활성백신과 생바이러스 백신이 생산되고 있 다. 최근까지는 Nakayama주가 일반적인 백신으 로 사용되어 왔으나 현재는 Beijing주 등 도 백 신으로 사용하고 있는 추세에 있다. 일본뇌염은 치명성과 후유증에 따른 사회적 파장이 대단히 큰 질병임에도 불구하고 환자 발생이 적어 관 심도가 낮아 국내의 경우 연구보고가 미비한 실정이다. 인도, 일본 등을 비롯한 동남아 일부 국가들에서만 일본뇌염에 대한 연구가 진행되 고 있다. 자연계에서 분리한 분리주는 일정한 비율로 자연발생적인 변이가 발생하기 때문에 항원단 백에 구조적인 영향을 미칠 수 있는 심각한 변 이가 발생하고 있는지에 대한 분석은 질병의 확산과 연계하여 생각할 수 있는 문제로서 중 요한 문제이다. 그 예로 1994년 분리한 JEV에 대한 cross-hi test의 결과 Nakayama-NIH주의 hemagglutination (HA) 항체는 비슷한 억제효과 를 보이지만 염기서열 분석에 의한 phylogenetic tree 작성 결과 국내분리주와 Nakayama주가 다 른 subgroup을 형성하여 유전학적으로는 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 최근에 국내에서 분리 된 JEV의 유전적, 생화학적, 항원적 특성을 분 석하고 바이러스가 감염된 세포에서 바이러스 의 유전자 발현 변화를 조사하여 백신으로 사 용하고 있는 다른 prototype주와 비교하여 바이 러스 진화 연구, 백신의 효용성 문제 등에 중요 한 정보를 제공하고자 한다. 또한 JEV에 있어 E 단백은 HA, 바이러스의 중화, 바이러스 입자 형성의 최종 단계인 바이러스 조립, 감염을 위 한 막 융합 등 바이러스의 특징을 나타내는 중 요한 부분이다. 국내분리주의 E 단백 특성을 분석하기 위해 분리주와 prototype (Nakayama-NIH, Beijing-1)의 E 단백을 발현시키고 특이 항체를 생성하여 JEV의 면역학적 특성을 분석함으로서 새로운 백신개발을 위한 기반기술을 확립할 수 있는 연구의 기반을 조성하고 국내 분리주의 약독화 등에 활용하고자 한다. 재료 및 방법 1. 바이러스주 국내 서식 매개모기 (Culex tritaeniorhynchus)와 환자로부터 분리된 일본뇌염바이러스주(K94P05, 2001년 모기 분리주 3주, 환자 분리주 2주)와 현재 백신주로 사용 중인 Nakayama-NIH주와 Beijing-1주를 사용하였다. 2. 바이러스 증식 생후 24시간 이내의 영아 마우스의 뇌에 일 본뇌염바이러스를 접종하고 3~4일 후 뇌염증상 이 나타난 마우스 뇌를 무균적으로 채취하여 PBS buffer(ph 7.4)를 넣고 homogenizer로 갈아 4 에서 12,000 rpm으로 30분간 원심분리하여

143 132 국립보건연구원보 상층액을 취하고 소량씩 분주하여 -70 에 보 관하였다. 3. Viral hemagglutination (HA)와 hemagglutination inhibition (HI) test HA titer는 바이러스 샘플은 2배씩 단계적으 로 희석한 50μl와 0.33% 거위 혈구와 똑같은 양으로 혼합해서 37 에서 1시간동안 반응시켜 결과를 판독하였다. HI titer는 거위혈구와 반응 시킨 시료 혈청을 2배씩 단계 희석한 25μl와 항원 바이러스 25μl를 상온에서 30분 반응시킨 후 0.33% 거위 혈구와 똑같은 양으로 혼합해서 37 에서 1시간 동안 반응시켜 결과를 판독하 였다. 4. 바이러스 역가 측정 및 증식 곡선 작성 바이러스 감염성은 Vero 세포를 이용하여 plaque asssay에 의해 측정하였으며 다음과 같이 실시하였 다. Vero 세포를 6-well plate에 cells/well이 되도록 분주하여 3일 정도 배양하였다. 바이러 스는 10배 단계 희석하여 0.1ml 씩 접종하고 15 분마다 흔들어 주면서 90분 동안 감염시켰다. 감염 후 plate의 각 well에 overlay medium (0.6% agarose, Earle's salt-mem, 5% FBS, 8mM L-glutamine, Non-essential amino acids, penicillinstreptomycin(pen-strep))을 첨가하여 상온에서 굳도록 한 후 잠시 방치하고 37, 5% CO 2 배 양기에서 배양하면서 세포 병변현상을 관찰하였 다. 7일 후 6-well plate를 꺼내어 고정 용액 (10% formaldehyde in PBS)를 1 ml 씩 첨가하여 상온 에서 4시간 동안 반응시킨 후 흐르는 물로 overlay medium과 고정 용액을 제거하였다. 다시 각 well은 1% crystal violet (in 70% methanol) 염 색 용액으로 4시간 이상 염색한 후 흐르는 물로 염색용액을 제거하고 형성된 plaque 수를 계수하 여 바이러스 역가를 측정하였다. 증식 곡선 작성을 위한 plaque assay는 일본뇌 염 바이러스를 각각 0.1 m.o.i(multiplicity of infection)로 세포에 감염시켜 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 9일에 배양액을 약 500μl씩 취해 -70 에 보 관하였다. 미리 준비한 Vero, A549, SK-N-BE(2) 세포를 6-well plate에 cells/well이 되게 분 주하고 3일 정도 배양한 후 -70 에 보관했던 1~9일에 걸쳐 얻은 바이러스 배양액을 10배 단 계 희석하여 0.1ml씩 배양한 세포에 접종하여 15분마다 흔들어 주며 90분 동안 바이러스를 흡착시켰다. 흡착이 끝난 각 well에 overlay medium을 첨가하고 상온에서 agarose가 굳도록 잠시 방치한 다음 37, 5% CO 2 배양기에서 7 일간 배양하여 위에서 기술한 방법에 따라 plaque 수를 계수하여 증식곡선을 작성하였다. 5. Trypan blue exclusion법으로 세포 생 존성 및 마우스 뇌에 접종한 바이러스 의 virulence 비교 각 바이러스 주의 virulence는 in vitro에서 trypan blue exclusion 방법을 이용하여 세포 생존률을 조사하였으며 in vivo에서의 바이러스 독력을 확인하기 위해 3주령의 마우스 5마리를 한 그룹으로 하여 각 마우스의 뇌에 100 p.f.u. (plaque forming unit) 바이러스를 주사한 후 시간이 지남에 따라 죽는 마우스의 수를 %로 환산하였다. Trypan blue exclusion 방법은 Vero 세포를 35mm 세포 배양용 dish에 cells이 되도록 분주하여 3일간 배양한 후 바이러스를 0.1 m.o.i로 접종하여 1, 3, 5 및 7일 간격으로 세포를 회수하여 0.4% trypan blue solution과 1:1로 혼합하여 생존한 세포수를 계수하여 세포 생존률을 조사하였다. 6. TaqMan real-time PCR에 의한 유전자 발현 비교 바이러스가 감염된 세포에서 유전자 발현을 알아보기 위해 세포에 0.1 m.o.i.로 바이러스를 감염시킨 후 1, 3, 5 및 7일 간격으로 세포를 회수하여 RNeasy Mini kit(qiagen)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 즉, 세포 배양용 35 mm dish에 350 μl의 RLT 용액을 넣고 ice 위에

144 Ⅰ. 연구보고 133 서 5분간 방치하였다. 350μl의 70% ethanol을 넣고 잘 혼합한 후 700μl의 시료를 RNeasy mini spin column에 옮긴 후 12,000rpm에서 15 초 간 원심하여 column을 통과한 액을 제거하 였다. RW1 용액으로 QIAamp column을 세척하 고 500 μl의 RPE 용액으로 column을 세척하였 다. RNase-free water 30μl를 column에 넣고 10,000rpm에서 1분간 원심하여 TaqMan real-time PCR에 사용하였다. 7. 바이러스 RNA 추출 및 cdna 합성 바이러스를 감염시켜 얻은 배양액 250μl에 Trizol 750μl를 첨가한 후 vortex하고 상온에서 10분간 정체시켰다. 여기에 chloroform 250μl를 첨가하여 다시 vortex하고 상온에서 15분간 정 체시켰다. 14,000rpm으로 4 에서 15분간 원심 하여 상층액 600μl을 취하고 동량의 isopropanol 을 첨가하여 상온에서 30분간 정치시켰다. 14,000rpm에서 30분간 원심 하여 침전된 바이 러스의 RNA를 수거하고 70% ethanol로 세척한 후 건조시켜 DEPC 처리된 증류수를 첨가하여 cdna 합성을 위해 사용하였다. cdna 합성을 위해서는 일본뇌염 바이러스 특이 primer (3 -R : 5 -CAG CTT CGA GGG GGC TTG GGC CG-3 )를 사용하였다. 반응을 위해서는 5 buffer 3μl, RNase inhibitor 0.5μl, 2.5mM dntp 3μl, 10pmol primer 1μl, SuperScript II 1μl, RNA 5μl를 섞은 후 DEPC 처리 증류수로 15μl 를 맞추고 15 에서 15분, 42 에서 90분간 반 응시킨 후 95 에서 5분간 효소를 불활성화 시 켰다. 8. Polymerase chain reaction (PCR)과 염기서열 분석 만들어진 cdna를 이용하여 일반적인 PCR 방법으로 target 유전자를 증폭하고 염기서열 분석을 실시하였다. 반응 mixture는 다음과 같 이 제조하였다. Ingredients Volume (μl) Template cdna 5 10 Taq buffer 5 10 mm dntp 2 Primer F (10 pmol/μl) 5 Primer R (10 pmol/μl) 5 Taq polymerase 0.5 D.W. Up to 50 국내 분리주와 prototype주의 E 단백을 증폭 하기 위한 primer sequence는 다음과 같다. Table 1. Primers to amplify glycoprotein E gene Primer Direction Sequence (5 3 ) name K94-EF Sense TTT AAC TGT CTG GGA ATG GGG AAT CG K94-ER NAK-EF Sense Anti-sense AGC ATG CAC ATT GGT CGC TAA AAA CAC G TTC AAC TGT CTG GGA ATG GGC AAT CG NAK-ER Anti-sense AGC ATG CAC ATT GGT CGC TAA GAA CAC Bei-EF Sense TTC AAC TGT CTG GGA ATG GGC AAT CG Bei-ER Anti-sense AGC ATG CAC ATT GGT CGC TAA GAA CAC PCR 반응조건은 94 5min/94 1min/52 1min/72 1.5min 35cycle/72 10min으로 조정 하여 실시하였다. PCR 실시 후 1% agarose gel 상에서 확인하고 band를 오려 elution하였으며 염기서열 확인을 위한 PCR 실시 후 DNASTAR program으로 염기서열 분석을 실시하였다. 9. E 단백 발현을 위한 PCR 선정된 균주에서 합성한 cdna를 이용하여 위에 기술한 방법과 동일하게 PCR을 실시하였 다. 이때 PCR products의 염기서열 변이를 최소 화하기 위해 pfu DNA polymerase 0.5μl를 사용 하는 것으로 방법을 약간 변형하여 사용하였다. PCR 반응에 사용한 primer는 Table 1의 E 단백 발현 primer를 10pmol/μl의 농도로 사용하였다. PCR 산물을 pbad/topo Thio fusion vector

145 134 국립보건연구원보 (Invitrogen Co.)에 클로닝하기 위해 A-overhang 반응을 실시하였다. PCR product purification kit 를 이용하여 정제한 후 10 TaKaRa PCR buffer(takara) 5μl, 10mM dntp 3μl, Taq DNA polymerase 0.5μl, 정제한 PCR 산물 41.5μl를 섞 어 반응량을 50μl로 만든 후 72 에서 30분~1 시간가량 반응하였다. 10. 클로닝과 형질전환 E 단백의 발현을 위해 A-overhang 반응이 끝 난 PCR 산물을 pbad/topo Thio fusion vector 에 클로닝 하였다. pbad/topo Thio fusion vector 1μl와 salt solution 1μl, PCR 산물 4μl를 섞은 후 상온에서 5분간 반응하였다. 반응이 끝 난 후 2μl의 ligation product를 TOP10 competent cell에 넣어 섞은 후 얼음에 30분간 두었다가 42 에서 30초로 열을 가하고 얼음에서 2분 동안 안정화하였다. 250μl의 SOC 배지를 넣어 주고 1시간 동안 200rpm으로 진탕 배양한 후 100μl와 200μl를 50μg/ml의 ampicillin (Amp) 포함 LB plate에 spreading하고 37 배양기에서 18~ 20시간 배양한 후 얻어진 colony 중 5개씩을 멸 균 이쑤시개로 찍어 Amp(50μg/ml)이 포함된 2 ml LB 배지에 접종하여 200 rpm으로 18시간이 상 배양하여 균이 자란 것을 확인하고, 1ml을 취해 alkaline lysis method에 의해 plasmid DNA 를 추출한 후 제한 효소 절단과 염기서열 분석 등으로 원하는 insert가 제대로 클로닝 되었는지 확인하였다. 결 과 1. 국내 분리주 및 prototype의 HA 역가 측정 국내 분리주 및 prototype의 HA 역가 측정을 위해 사용한 바이러스 주는 백신주 JEV Nakayama- NIH, Beijing-1주와 국내 분리주 K94P05, K01-GN, K01-JB, K01-JN, K01-pb, K01-pc로 Table 2에 표시하였다. Table 2. List of virus strains used in this study Strain JEV Nakayama-NIH JEV Beijing-1 K94P05 K01-GN K01-JB K01-JN K01-pb 1 K01-pc 2 Remarks Vaccine strain Vaccine strain Isolated in 1994 (Gyeongnam, Mosquito) Isolated in 2001 (Gyeongnam, Mosquito) Isolated in 2001 (Jeonbuk, Mosquito) Isolated in 2001 (Jeonnam, Mosquito) Isolated in 2001 (Gyeongnam Jinjoo, Patient) Isolated in 2001 (Jeonbuk Iksan, Patient) 1 : Isolated in Blood 2 : Isolated in cerebrospinal fluid 2001년 분리주 중 환자에서 분리된 바이러스 가 2주 있었으며 환자에 대한 정보는 Table 3 에 정리하였다. 이들 바이러스 주들을 사용하여 HA titer를 분석한 결과 K01-pc주에서 항원성이 약간 떨어지는 것을 알 수 있었으며 다른 바이러 스주들은 거의 비슷한 HA titer를 보였다(Table 4).

146 Ⅰ. 연구보고 135 Table 3. Information of Japanese encephalitis patient Sex Age Location Outbreak Sample Female 53 GN-JJ Blood Male 4 JB-IS CSF 3 1 : Gyeongnam Jinjoo 2 : Jeonbuk Iksan 3 : Cerebrospinal fluid Table 4. HA titer of JEV strains used in this study Strain HA titer JEV Nakayama-NIH 1:640 JEV Beijing-1 1:1,280 K94P05 1:1,280 K01-GN 1:320 K01-JB 1:640 K01-JN 1:640 K01-pb 1:640 K01-pc 1: 세포주들 (Vero, A549, SN-K-BE(2))에 따른 각 바이러스 주들의 증식 세포 기원이 다른 Vero, A549, SN-K-BE(2) 세포들에서 바이러스 감수성의 차이를 분석하 기 위해 증식곡선을 작성하여 비교하였다. 백신 주 2주를 비롯한 분리주들 모두가 Vero 세포와 A549 세포 등에서 비슷한 정도로 증식되었으나 Neuroblastoma 세포인 SN-K-BE(2) 세포에서는 바이러스 증식이 떨어짐을 알 수 있었다. 또한 K01-pc주의 경우 A549 세포와 SN-K-BE(2) 세 포에서는 현저하게 바이러스 증식이 감소되었 다 (Figure 1).

147 136 국립보건연구원보 Figure 1. Growth curve of JEV strains in Vero, A549 and SK-N-BE(2) cells. A, JEV Nakayama-NIH strain; B, JEV Beijing-1 strain; C, Korean strain K94P05; D, Korean strain K01-GN; E, Korean strain K01-JB; F, Korean strain K01-JN; G; Korean strain K01-pb; H; Korean strain K01-pc. 3. 각 바이러스주가 감염된 Vero 세포의 생존률 Vero 세포에 백신주 및 국내 분리주들을 감 염시킨 후 세포 생존률을 조사한 결과 K01-pc 주는 세포 생존률이 약 75% 이상이었으나 다른 바이러스주들의 경우 약 20% 정도 밖에 되지 않음을 알 수 있었다(Figure 2). 이는 증식곡선 에서 본 바와 같이 K01-pc주가 세포에 미치는 영향이 다른 바이러스 주들에 비해 미미함을 알 수 있었다. Figure 2. Kinetics of surveillance of Vero cells by JEV strains. The trypan blue cell exclution assay was done by trypan blue staining method as described in methods. All assay were done in triplicate., JEV Nakayama-NIH;, JEV Beijing-1;, K94P05;, K01-GN;, K01-JB;, K01-JN;, K01-pb;, K01-pc.

148 Ⅰ. 연구보고 각 바이러스주들의 감염성 작성하여 figure 4에 나타내었다. In vitro 상에서 보이는 바이러스 주들의 감염 성 결과와 in vivo에서의 바이러스 독성을 비교 하기 위해 5 마리 마우스를 한 그룹으로 각 바 이러스주들을 접종하여 12일간 개체 생존실험 을 실시한 결과 모든 바이러스 주들은 7~8일째 실험군의 모든 개체가 죽었으나 K01-pc 주의 경우 12일째까지도 약 30%의 개체가 생존하였 다(Figure 3). 위 결과들을 종합할 때 바이러스 독성은 in vitro나 in vivo에서 K01-pc 주가 다 른 바이러스주들보다 떨어짐을 알 수 있었다. Figure 3. Kinetics of surveillance of Mouse by JEV strains. Three-week-old mouse were inoculated intra-cerebrally with 100 p.f.u. viruses. Five mice from each group were sacrificed daily to observe mouse surveillence. All assay were done in triplicate., Control;, JEV Nakayama-NIH;, JEV Beijing-1;, K94P05;, K01-GN;, K01-JB;, K01-JN;, K01-pb;, K01-pc. 5. 각 바이러스주들의 유전자 발현 바이러스 증식의 차이나 독성의 차이 등이 유전자 발현과 어떤 상관관계가 있는지 알아보 기 위해 백신주와 1994년, 2001년 국내 분리주 들을 이용하여 TaqMan real-time PCR을 실시하 였다. 먼저 바이러스 양에 따라 그 변화를 검출 할 수 있는지 알아보기 위해 standard curve를 Figure 4. Standard plot and amplification plot. A, Plot of the crossing threshold quantity of virus in the sample on the x-axis and cycle threshold (Ct) on the y-axis. The linearity of the slope allows quantitation of virus in samples. Slope: ; y-intercept: ; Correlation coefficient: B, Amplification plot at serial dilution of JEV. 바이러스 유전자 양의 차이에 의한 변화를 TaqMan real-time PCR로 검출한 결과 백신주 및 1994년, 2001년 분리주들(K94P05, K01-GN, K01-JB, K01-JN, K01-pb)은 바이러스 감염 후 7 일까지의 유전자 발현이 10,000~50,000 배까지 증가하였으나 K01-pc주의 경우 약 2,000배까지 만 증가함을 알 수 있었다(Figure 5, Table 6).

149 138 국립보건연구원보

Figure 5. Kinetics of viral RNA synthesis in JEV-infected vero cells. Vero monolayers were infected with virus (m.o.i.~0.1) or mock-infected with EMEM followed by incubation in growth medium at 37.

150 Figure 5. Kinetics of viral RNA synthesis in JEV-infected vero cells. Vero monolayers were infected with virus (m.o.i.~0.1) or mock-infected with EMEM followed by incubation in growth medium at 37. At intervals, monolayers were harvested and practiced TaqMan PCR as described in method. A-1, Standard vs JEV Nakayama-NIH amplification plot; A-2, JEV Nakayama-NIH amplification plot. B-1, Standard vs JEV Beijing-1 amplification plot; B-2, JEV Beijing-1 amplification plot. C-1, Standard vs K94P05 amplification plot; C-2, K94P05 amplification plot. D-1, Standard vs K01-GN amplification plot; D-2, K01-GN amplification plot. E-1, Standard vs K01-JB amplification plot; E-2, K01-JB amplification plot. F-1, Standard vs K01-JN strain amplification plot; F-2, K01-JN amplification plot. G-1, Standard vs K01-pb strain amplification plot; G-2, K01-pb amplification plot. H-1, Standard vs K01-pc strain amplification plot; H-2, K01-pc amplification plot. Ⅰ. 연구보고 139

151 140 국립보건연구원보 Table 6. Replication fold of TaqMan assays about JEV strains 석하였다. 그 결과는 다음과 같다 (Figure 6 and 7). Sample name Day Ct Quantity Amplification fold JEV Nakayama-NIH JEV Beijing K94P05 K01-GN K01-JB Figure 6. Identification of the PCR products for full E gene from the JEVs. M : 1kb ladder, 1 : JEV Nakayama, 2 : JEV Beijing-1, 3 : JEV K94P05, 4 : JEV K01-GN, 5 : JEV K01-JB, 6 : JEV K01-JN, 7 : JEV K01-pb, 8 : JEV K01-pc, NC : negative control, PC : positive control. K01-JN K01-pb K01-pc E 단백 유전자 염기서열 상동성 비교 및 E 단백 발현을 위한 균주 선정 국내 분리주 및 prototype주들에 대한 E 단백 부 분의 유전자를 PCR에 의해 모두 증폭한 후 sequencing에 의해 1,501 bp의 염기서열을 모두 분

152 Figure 7. Comparison of the nucleotide sequences of the E protein of JEVs. Ⅰ. 연구보고 141

153 142 국립보건연구원보 모기 분리주들 사이에서는 유전자 염기서열 상에서 98~99%의 상동성을 보였으며 prototype 과 환자 분리주 사이에서는 95~97%의 염기서열 상동성을 보였다(Table 7). Table 7. Homology of the nucleotide sequence of the E protein of different JEV isolates 01-GN 01-JB 01-JN 01-pb 01-pc K94 Bei Nak 01-GN JB JN pb pc K Bei 97.7 Nak 또한 분리주들의 계통 유전학적 관계를 알아 보기 위하여 DNASTAR에서 간단하게 dendrogram 으로 분석하였다(Figure 8). Table 8. Homology of the amino acid sequence of the E protein of different JEV isolates 01-GN 01-JB 01-JN 01-pb 01-pc K94 Bei Nak 01-GN JB JN pb pc K Bei 98.8 Nak 각 단백에 대한 상동성은 97~99%였으며 계통 진화적으로는 환자에서 분리된 일본뇌염 바이 러스주, 전남, 전북에서 채집된 모기에서 분리 된 바이러스주들과 prototype 바이러스주인 Nakayama, Beijing-1 주가 한 그룹을 이루고 있 었다. 경남에서 채집된 모기에서 분리된 바이러 스주는 아미노산 서열에서 다른 분리주 및 prototype주들과 별도의 그룹을 형성하고 있었 다. 그 결과는 다음 그림과 같다(Figure 9). Figure 8. Dendrogram analysis of the JEVs using the nucleotide sequences of the E protein. 그 결과 국내 분리주 중 모기에서 분리한 바 이러스주인 K94P05주와 K01-GN, K01-JN, K01-JB주가 한 그룹을 형성하였고 prototype주 인 Nakayama, Beijing-1주와 환자 분리주인 K01-pc, K01-pb주가 한 그룹을 형성하였다. 염기서열 분석을 마친 각 바이러스 주의 유 전자를 웹상에서 translation 하여 E 단백의 상 동성은 분석하였다(Table 8). Figure 9. Dendrogram analysis of the JEVs using the amino acid sequences of the E protein. 7. E 단백 유전자 클로닝 E 단백 유전자를 다양한 expression vector에 클로닝 함으로 E 단백을 다량 발현시킬 수 있는 시스템을 확립하고자 하였다. 클로닝은 figure 10 과 같이 실시하였다.

154 Ⅰ. 연구보고 143 Figure 10. Construction scheme of pbad-jev E proteins. 다양한 expression vector에 cloning을 시도함으 로 E 단백을 다량 발현시킬 수 있는 시스템을 확립하고자 하였으나 E 단백 유전자가 정확하 게 클로닝 된 클론을 확인할 수 없었다. 일본뇌 염 바이러스 E 단백의 expression system을 확립 하는데 있어 가장 큰 문제점으로는 E 단백을 잘 발현시키면서도 유전자를 안정적으로 클로 닝 할 수 있는 expression vector를 선택하는데 어려움이 있다는 것이다. 추후 진행되는 실험을 통하여 안정적이고 발현율이 좋은 expression vector를 선정하고 E 단백 발현을 확인하고자 한다. 고 찰 2001년 분리주와 K95P05주, prototype주들을 분석한 결과 각 바이러스주들 사이의 염기서열 변화 등은 두드러지게 나타나지 않았으나 약간 의 항원성 차이와 유전자 복제 등에서 조금씩 차이가 나는 바이러스 주(K01-pc주)를 확인할 수 있었다. 또한 K01-pc주의 유전자 발현률은 다른 바이러스주들과 비교하여 현저하게 떨어 지는 것으로 확인되었다. 이는 세포에 감염된 후 progeny를 만드는데 차이가 있을 수 있다는 결과를 예측할 수 있고 바이러스 증식이나 독 성을 나타내는데 충분한 양의 바이러스를 만들 수 없다는 의미이기도 하다. 이런 차이가 유전 자 발현 하나만으로 단정할 수 있는 것은 아니 지만 바이러스가 증식을 위해서 가장 필수적인 요소가 유전자 발현임을 감안할 때 유전자 발 현의 차이는 바이러스 증식이나 독성과도 큰 연관관계가 있을 것으로 생각된다. RNA 바이러스의 유전자는 다른 DNA 바이 러스 등과 비교하여 변화가 심하게 나타나고 변이률 또한 높은 것으로 보고되고 있어 현재 미미한 변화들이 치명적인 바이러스의 출현을 예측할 수 있게 한다. 따라서 자연계 존재하는 바이러스의 유전학적 변이 등을 조사하는 것은 질병의 예방 및 관리차원에서 매우 중요한 일 이다. 자연계 유행하는 바이러스의 변화로 야기 될 수 있는 문제 중 가장 중요한 것은 기존 사 용하고 있는 백신의 효용성 문제이다. 현재 국 내 존재하거나 유행하고 있는 바이러스에 대한 유전자 타입과 바이러스의 특성을 파악하고 이 를 바탕으로 보다 유용하고 효과 있는 백신을 선정하여 보급하는 것은 국민 보건 향상을 위 해 매우 중요한 일이 될 것이다. 결 론 국내 분리주들에 대한 특성 분석은 완료되었 으나 E 단백 발현을 위한 expression system 확 립은 현재 연구의 결과 완성되지 못하였다. 그 러나 본 연구를 통하여 현재 국내에서 유행하 고 있는 일본뇌염 바이러스 주가 백신주와 얼 마나 차이가 있으며 이를 통하여 백신의 효용 성에 대한 간접 평가 및 우리나라 향후 백신을 결정하는데 기초 자료를 제공할 수 있으며 일

155 144 국립보건연구원보 본뇌염에 대한 향후 유행 경향을 예측하고 적 절한 예방 및 치료 대책을 수립하는데도 도움 이 될 것이다. 향후 국내 유행하는 바이러스주에 적합한 백 신 및 효과적인 진단 방법 및 진단제 개발을 위하여 E 단백에 대한 특이성 및 활용도를 검 증할 연구를 진행할 필요가 있다. 이를 위해 E 단백 유전자의 발현 system 확립한은 것은 무엇 보다 중요한 과제이다. 비록 본 과제에서 E 단 백 발현 system을 확립하지는 못하였으나 발현 system 확립을 위한 연구는 계속 진행되어야 할 것이다. 본 연구 및 추후 진행되는 E 단백 발현 system 확립 등의 연구는 국내의 바이러스 진화 연구, 불활화 백신의 효용성 문제, 진단항원 개 발, 일본뇌염 치료제 개발 등에 중요한 정보를 제공할 수 있다. 또한 앞으로 새로운 백신개발 을 위한 기반기술을 확립할 수 있는 기초연구 로 질병의 예방 및 관리를 위한 공중보건학적 측면에서 매우 중요하며 Flaviviridae에 속하는 다른 바이러스들의 백신개발 연구와의 비교분 석을 통하여 이들 바이러스의 공통된 특성을 파악하는데 중요한 역할을 할 것으로 기대된다. 참고문헌 1. Burke, D.S. and C.J. Leake Japanese encephalitis, p In T.P. Monath(ed.), The arbovirus sees : epidemiology and ecology, vol.3. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla. 2. Chambers, T.J., C.S. Hahn, R. Galler, and C.M. Rice Flavivirus genome, organization, expression, and replication. Annu. Rev. Microbiol. 44: Kobayashi, Y., H. Hasegawa, T. Oyama, T. Tamai, and T. Kusaba Antigenic analysis of Japanese encephalitis virus by using monoclonal antibodies. Infection and Immunity 44(1): Kobayashi, Y., H. Hasegawa, and T. Yamauchi Studies on the antigenic structure of Japanese encephalitis virus using monoclonal antibodies. Microbiology and Immunology 29(11): Konishi, E., S. Pincus, B.A.L. Fonseca, R.E. Shope, E. Paoletti, and W. Mason Comparison of protective immunity elicited by recombinant vaccinia viruses that synthesize E or NS1 of Japanese encephalitis virus. Virology 185: Konishi, E., S. Pincus, E. Paoletti, W.W. Laegreid, R.E. Shope, and P.W. Mason A highly attenuated host-range resricted vaccinia virus strain, NYVAC, encoding the prm, E and NS1 genes of Japanese encephalitis virus prevents JEV viremia in swine. Virology 190: Konishi, E., M. Yamaoka, K.S. Win, I. Kurane, and P.W. Mason Induction of protective immunity against Japanese encephalitis in mice by immunization with a plasmid encoding Japanese encephalitis virus premembrane and envelope genes. J. Virol. 72: Maniatis, T., E.F. Fritsch and J. Sambrook Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

156 Ⅰ. 연구보고 145 Studies of the replication and immunological characterization in infected cells by JEV isolated in Koreas and JEV prototypes C.H. Yu, Y.H. Kim, J.E. Cho, D.Y. Lee, Y.E. Jeong, Y.R. Ju, K.Y. Park and Y.H. Shin The Division of Arboviruses, Center for Immunology & Pathology, NIH, Seoul Korea Purpose:The Japaenese encephalitis viruses (JEV) are (positive-sense) RNA viruses and mutation rate is a possibility of appearing about % ratio per year. The JEV was isolated from the mosquito which exists in the natural world and the occurrence possibility of Japanese encephalitis (JE) exists always. This study was analyzed the character of the isolated JEVs on natural world, and were compared the isolated JEVs and vaccine strains. The research was provided the important information at the researches of the JEV evolution and vaccine effect. Methods:This study which compared the character of isolated virus strains and prototype strains was executed the HA test, the plaque assay, a in vivo virulence test, the comparison of virus gene expression ratio by using TaqMan method, and E gene cloning. Results:The results of researches were showed that the decreased antigenicity, cytotoxicity and gene expression ratio of K01-pc strain. The characters of other isolated strains was one identical with the K94P05 strain. The E gene sequence and amino acid sequence were showed the homologous characteristic above 90% from all isolated viruses and prototype strains. Conclusions:This study was provided the important information about virus evolution research and the problem about effect of inactivated vaccine, development of diagnosis antigen and treatment, new vaccine. Key words:japanese encephalitis virus, Isolates in Korea, HA titer, TaqMan method This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

157 146 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 전염병 매개모기관리를 위한 방역용 살충제 감수성 조사 국립보건연구원 면역병리센터 질병매개곤충팀 장규식, 박재선, 문승국, 이혜은, 신이현, 이희일, 이욱교, 박근용, 이원자 목 적 : 방역용으로 사용되는 살충제 성분에 대한 전국적인 감수성자료를 주요 매개모기를 대상으 로 확보함으로서 지역별, 매개체별 특화된 살충제의 개발을 위한 기초자료를 제공하고 보건소에서 방 역용 살충제를 구입할 때 구입기준을 제시할 수 있으며, 전국적인 살충제 저항성 발달 모니터링 구 축을 위한 기초 자료로 활용한다. 방 법 : 국내 방역용 살충제의 사용 현황과 WHOPES 자료를 조사하여 모기 구제 방역용 살충제 선정에 대한 조사연구를 통해 살충제 감수성 시험자료를 수집하고, 국내 10개 도시에 유문등을 설치 하여 월 별 모기 발생밀도를 조사하고 감수성 모기 조사를 위한 지역을 선정하였다. 공시충과 연구 목적에 가장 합리적인 생물검정법을 확립하여 중국얼룩날개모기(Anopheles sinensis), 작은빨간집모 기(Culex tritaeniorhynchus), 빨간집모기(Culex pipines) 성충과 유충에 대한 감수성 실험을 실시하 였다. 유문등 설치 주변지역에 5년 동안 사용되어진 살충제 사용 현황을 파악하였다. 지역별 모기의 살충제 감수성에 대한 실내실험을 기초로 하여 준야외 실험을 실시하고, 야외 조건에서 실제 살충제 를 사용하기 위한 변수를 조사한다. 결 과 : 모기구제 방역용 살충제의 선정에 대한 조사연구에서 WHOPES에서 권장하고 있는 살충제 와 2004년 방역업체에서 사용되어진 살충원제를 비교하여 국내 모기 감수성 실험에 적합한 살충제 10개와 살유충제 10개를 선정하였다. 국내 10개 지역에 유문등을 설치하여 7월과 8월에 작은빨간집 모기의 밀도가 가장 높은 곳 전주와 기장을 감수성 조사 지역으로 선정하였다. 연구목적에 가장 합리 적인 생물검정법을 실시하여 전주와 기장에서 채집되어진 모기 성충에 가장 감수성이 뛰어난 살충제 chlorpyrifos-methyl과 유충에 가장 효과적인 deltamethrin을 선정하였다. 감수성이 뛰어난 살충제 3종을 선택하여 야외 실험을 실시한 결과 실내실험에서와 비슷한 살충력을 확인하였다. 결 론 : 본 연구를 통하여 질병매개모기의 대발생시 적절한 방제 프로그램의 기초자료로 제공하고 살충제 살포시 효율적 적용방법에 따른 방제효과의 극대화를 이루며, 국가차원의 방역 guideline을 설정한다. 각 지역별 살충제 감수성 자료를 얻음으로서 보건소가 자기 지역에 적합한 살충제 선정지 침 받고 특화된 살충제를 개발 보급할 수 있는 기초 자료를 제공한다. 중심단어 : 살충제, 작은빨간집모기, 감수성, 국소처리법 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

158 Ⅰ. 연구보고 147 서 론 모기의 방제법으로 현재 가장 효과적이고 선진 화한 방법은 종합적 방제법 (Integrated Control) 으로 여러 가지의 방제법을 동시에 실시하는 방 법이다. 즉, 모기의 성충과 유충을 치사시킬 수 있는 살충제를 사용하는 화학적 방제 (Chemical Control)와 천적을 이용하여 주로 모기의 유충 을 지속적으로 포식하게 하여 모기유충 밀도를 저밀도 이하로 감소 유지하게 하는 생물학적 방제 (Biological Control), 모기의 발생장소가 되 는 장소나 인공물을 변경 또는 제거시켜 모기 의 발생장소를 없애는 물리적 방제 (Physical Control) 등을 함께 사용하는 포괄적인 방제방 법을 말한다. 화학적 방제법은 가장 흔히 사용되고 있는 방법으로 크게 유충방제와 성충방제가 있는데 경제적이며 효과적인 모기의 방제를 위해서는 성충방제를 부분적으로 실시하되 유충방제를 위주로 실시하여야 한다. 모기의 유충은 물에서 만 발견되기 때문에 상대적으로 적은 공간에서 많은 수의 모기를 발견할 수 있으므로 모기유 충 발생장소만 찾아낸다면 방제효과 면에서 훨 씬 효율적이고 경제적이기 때문이다. 이를 위해 서는 지역의 행정기관에서 해당 구역 내에 있 는 지역을 먼저 조사하여 모기유충이 발견되는 장소를 찾아내야 한다. 특히 특정 살충제의 지 속적인 사용은 말라리아매개모기 (중국얼룩날 개모기;Anopheles sinensis), 일본뇌염매개모기 (작 은빨간집모기;Culex tritaeniorhynchus) 및 빨간집 모기(Culex pipiens pallens) 등을 비롯한 주요모 기에 대한 살충제 저항성을 일으키므로 정기적 인 살충제 감수성 실험을 통하여 해당 모기 종 에 감수성이 높은 살충제 종류를 선택하여야 한 다 (심 등, 1995a, b; Lee 등, 1997). 국내에서 모 기에 대한 감수성 및 저항성 실험이 주로 대학이 나 국립보건연구원에서 실시되고 있는데, Juvenile hormone mimics(심 등, 1975)와 pyriproxyfen(이 등, 2002)등 기타 유기합성 살충제(이 등, 1997)에 의한 감수성 실험이 유충에 대해 실시되고 있 다. 성충에 대한 조사는 이루어지지 않았고, 몇 몇 지역에서 채집된 성충에 대해서 WHO kit의 접촉법을 이용하여 단지 각 농도에서 치사율을 구하였다. 외국에서는 살충제 감수성 조사가 주 기적으로 이루어지며 자주 사용되고 다량의 소 비가 있는 살충제에 대한 저항성 발달 모니터 링을 실시하고 있다. 최근에는 저항성 발달 유 전자 발현을 억제하는 살충제 조사가 활발히 이루어지고 있는 실정이다. 국내에서의 모기에 대한 살충제 감수성과 저항성에 관한 연구는 방제용 살충제를 대상으로 지역별로 채집된 모 기들의 독성을 평가하여 각 살충제에 대한 감 수성과 지역별 또는 기간 및 사용살충제와 사 용기간에 따른 살충제 저항성의 발현정도를 분 석하는 형태로 연구가 진행되어왔다. 그러나 이 러한 연구들도 대부분 국립보건연구원과 몇몇 대학을 중심으로 매우 제한적으로 시행되어져 왔으며, 최근 5년 사이에는 이와 관련된 연구보 고가 거의 없는 실정이다. 그나마 비교적 국내에 서 말라리아나 일본뇌염과 같은 의학적인 문제 와 관련이 있는 중국얼룩날개모기(An. sinensis) (심 등, 1995; Lee etc., 1996, 이와 유, 1999)와 작은빨간집모기(Cx. tritaeniorhynchus)(shim etc., 1982; 심 등, 1995; Lee etc., 1996; 이와 유, 1999)에 대한 연구는 일부 보고가 이루어진 반 면, 국내에서 특별한 의학적 문제를 일으키지 않았던 빨간집모기(Cx. pipiens pallens)와 지하집 모기(Cx. pipiens molectus)에 대한 살충제 감수성 및 저항성에 관한 연구는 매우 부족한 실정이다. 이성옥(1999)은 전통적인 살충제인 Dichlorvos, Chlorpyrifos 등의 유기인계와 카바메이트계인 Propoxur 그리고 합성피레스로이드계인 Fenvalerate와 Permethrin에 대한 살충제에 대한 감수성 조사 를 빨간집모기(Culex pipiens) 유충을 대상으로 금강유역에서 실시한바 있으며, 말라리아를 매개하 는 중국얼룩날개모기(Anopheles sinensis)에 대한 살 충제 감수성 조사는 말라리아 유행지역에서 채 집한 성충과 유충에 대하여 lambdacyholothrin

159 148 국립보건연구원보 을 비롯한 10여종의 살충제에 대해서 실시된 바 있다(1999, 김정림). 또한 말라리아가 발생 하기 전인 1992년도에 경기도 고양과 완도지역 에서 채집된 유충에 대하여 살충제 감수성 시 험이 실시되었다. 일본뇌염을 일으키는 작은빨 간집모기(Culex tritaeniorhynchus)에 대한 살충 제 감수성 조사는 전남 지역의 야외에서 채집 된 개체를 대상으로 실시되었다. 집파리에 대한 살충제 저항성을 chlorpyrifos 외 5종에 대하여 Topical test를 이용하여 감수성을 조사한 결과 chlorpyrifos의 경우 42배, dichlorvos 는 3.8배, permethrin은 18.7배의 저항성이 유발되었으며, 지역별로는 최고 100배가 넘는 차이가 나타났 다(이용규 외, 1994) 이런 조사는 조사방법이 일정하지 않고, 조사 장소 역시 차이가 많아서 전염병 매개모기에 사용되는 살충제에 대한 저항성발달을 모니터 링하기에는 부적합하며, 과거에 사용되던 살충 제가 현재는 사용되지 않고 있으므로, 현재 사 용되는 방역용 살충제에 대한 자료는 매우 미 약하다. 표 1. 우리나라의 모기에 대한 살충제 감수성과 저항성에 관한 논문 번호 저 자 제 목 발표년도 저널명 1 박동우 Studies on the Effctiveness of Insecticides against Public Health Important Insects in Korea 1968 Kor. J. Pub. Heal. 5(2): 심재철 외2명 Study on the Susceptibility of Insecticides against Culex tritaeniorhynchus Larvae 1982 Kor. J. Entomol. 12(2): 심재철 외2명 작은빨간집모기(Culex tritaeniorhynchus) 유충의 살충제에 대한 감수성 1995 Kor. J. Entomol. 25(1): 심재철 외3명 중국얼룩날개모기(Anopheles sinensis) 유충의 살충제에 대한 감수성 1995 Kor. J. Entomol. 25(1): 이관우 외4명 Susceptibility and Resistance to Diagnostic Doses of Insecticides on Vector and Nuisance Mosquitoes in Korea Kor. J. Entomol. 26(3): 이동규 외2명 Insecticide Susceptibility of Culex pipiens pallens (Culicidae, Diptera) larvae in Seoul 1997 Kor. J. Entomol. 27(1): 이동규 외1명 Susceptibility of Medically Important Mosquito Larvae and Larvivorous Fishes to AbateR and Abate-SR in Korea 1999 Kor. J. Appl. Entomol. 38(2): 모기의 살충제 저항성에 관한 해외의 최근 연 구동향은 단순히 모기종별 각 살충제의 독성 평가를 통한 살충제 저항성 발현 모니터링에 그치지 않고, 분자생물학적 기술을 이용한 살충 제 저항성의 생화학적 측면과 유전자수준의 분 자생물학적 측면의 저항성 발현 메커니즘에 관 한 연구에 집중하고 있는 양상을 보이고 있다. 저항성의 생화학적 측면의 저항성 연구에는 곤충 대사에 의한 저항성, 분해효소기반 저항성발현, Glutathitone S-Transferase기반 저항성발현, Monooxygenase기반 저항성발현, Target-Site 저항 성, Acetylcholinesterase, GABA Receptor, 이온 채 널과 관련된 저항성발현 등 매우 구체적인 저항 성 발현 메카니즘을 대상으로 연구를 진행하고 있으며, 분자생물학적 측면에서의 살충제 저항성 연구는 물질대사카니즘(Metabolic Mechanisms), 유전자구조의 변성(Mutations in Structural Genes), 저항성유전자의 증폭(Gene Amplification), 전사조 절분해효소(Transcriptional Regulation Esterases 등과 관련된 저항성 발현 메카니즘을 대상으로 연구가

160 Ⅰ. 연구보고 149 이루어지고 있다. 이러한 연구 결과들을 토대로 기 존의 in vivo기반 저항성 발현측정을 대신하는 PCR과 microarray 등의 분자생물학적 기술을 이용 한 in vitro기반 살충제 저항성 발현 측정 기술개발 에 활용하고 있는 추세이다. 지역적 저항성 자료가 확보되어 응용 기술의 단계로 넘어간 외국의 실정에 비해 국내 살충 제 저항성 조사와 관리는 아주 미약한 단계이 다. 본 연구를 통해서 국내 주요 모기 종에 대 한 살충제 저항성정도를 지역별로 파악하여 감 수성이 우수한 살충제를 선별함으로서 효과적 인 방제가 이루어질 수 있도록 기초자료를 제 공하고, 전국적인 살충제 저항성 발달 모니터링 구축을 위한 기초자료를 확보하여 모기 저항성 과 관련된 방제법의 기술적 수준을 선진국이상 으로 발전시키고자한다. 또한 적은 양의 살충제 를 사용하여 최대의 방제효과를 얻음으로서 국 민 보건 복지 향상과 환경보호를 함께 생각 할 수 있을 것으로 사료된다. 재료 및 방법 1) 공시충 확보 - 조사 지역으로 선정된 지역에서 공시충을 유문등(black light)을 이용하여 24h동안 채 집한다. - 축사에서 흡혈한 성충을 흡충관을 이용하여 채집한뒤 실험실로 이동 한다. - 사육실에서 산란을 유도하여 유충으로 사육 한다. - 모기 유충은 송아지 사료(삼양(주))를 마쇄 하여 사육용기( cm)에 넣어 주었 고 성충은 마우스를 넣어주어 흡혈시켰으며 3% 설탕물을 제공하여 사육하였다. 2) 조사지역 선정 1년차는 무작위 채집지역을 선정하였으며, 2 년차에는 강원도, 경기도, 충청북도, 충청남도, 경상남도, 경상북도, 전라북도, 전라남도, 부산, 제주 10개 지역에 유문등을 설치하였다. 7월과 8월을 중심으로 빨간집모기(Culex pipiens)의 밀도가 높은 지역을 선정하였으며, 3년차에는 7월달 가장 밀도가 높은 지역이고, 1, 2년차 실 험의 연계성을 위해 동래와 전주 지역을 선정 하였다. 3) 살충제 감수성 조사 성충(Adult) 방역용 살충제 원제의 성충 공시충에 대한 감수성(susceptibility) 조사를 위해 다음과 같이 크게 3개 부분으로 나누어 살충제 및 시약, 시 험방법, 시험 결과로 크게 나누어 실험을실시 하였다. - 시약 및 기구 살충제 및 시약 실험에 사용되어지는 살충제 및 시약을 살펴 보면 희석용매로서 보통의 경우 Acetone(Merck co., Germany, 99.8%)을 사용하였으며 만약 Acetone에 희석이 되지 않는 약제는 다른 유기 용매나 증류수를 이용하여 희석 시켰다. 모기를 마취 시킬 때는 Chloroform, Co2 gas 또는 Ether 등 3가지 용매를 이용해도 되나, 모기에 대한 살충력이나 마취시간을 고려하여 Ether(Merck co., Germany, 99.8%)로 사용하였다. 모기의 먹 이로서는 10% 설탕물을 제공해야 하였다. 초자 및 기구 살충제의 용적을 측정하기 위해 사용되는 10, 1ml, 200μl, 100μl용 마이크로피펫(Gilson co., France)을 사용하였으며. 희석을 위한 병은 보 관을 위해 50ml 적갈색의 유리병(Wheaton, U.S.A)을 사용하여야 하였다. 미량 점적기는 수 동방식과 자동방식이 있는데, 현재 국내의 정황 으로 봐서 일정한 전압이 실험실에 공급되지 않아 자동점적기를 사용할때는 처리량이 달라 질수가 있다. 그래서 본 실험을 위해서는 수동

161 150 국립보건연구원보 방식의 자동 점적기(Microapplicator ; Burkard, UK)와 1ml 용량의 미량 주사기(Microsyringe: Burkard, UK)를 사용하였다. 실험 실시 후 공시 충 보관 용기로서는 종이컵(250ml 이상,) 을 사 용하였으며. 흡충관(John W hock co. U.S.A.)은 직경이 1cm, 길이가 28cm인 여과기가 달려있는 것을 사용하였다. 성충에게 먹이를 제공하기 위 하여 솜과 스폰지를 사용하는데, 설탕물의 증발 시간을 고려하여 스폰지를 사용하였다. 마취시 킨 성충을 자동 점적기로 이동 시키기 위하여 딱딱한 갈색종이(Hard board, 5cm 7cm)를 사 용 하였다. 살충제를 용매에 희석시키기 위해 볼텍스 믹서(Vortex mixer ; Vision, U.S.A.)를 사 용 하였고. 실험을 하기 위한 장소는 항온 (27±2 ), 항습(RH, 75±5%)이 유지되는 규격 chamber에서 실시 하였다. 마취시간을 연장하기 위하여 Chill table를 사용 하였다. 공시충 공시충은 2세대 이상 누대 사육종(모기)을 사 용하였으며, 가장 좋은 공시충의 상태를 유지하 며 실험하기 위해서는, 파리, 모기는 우화한지 2일에서 5일사이의 성충을 사용하였다. - 시험방법 살충제 준비 표준품을 준비하기 위하여 검체를 아세톤에 희석하여 1% 표준품 50ml을 만들었다. 아세톤 이 증발하지 않도록 밀봉을 잘 해야 하며, 4 냉장고에 보관하고, 예비 실험 검체를 준비하기 위하여 2ml의 표준품과 아세톤 18ml을 볼텍스 믹서(Voltex mixer)에서 희석하여 0.1%를 만들 었다. 그리고 제조된 제품(0.1%)에서 2ml를 분 주한 후 아세톤 18ml와 희석하여 0.01%를 조제하 였다. 같은 방법으로 0.001%, %, % 를 제조하였다. 예비 실험을 실시하였고, 결과가 0%에서 100%의 치사율을 보이는 구간을 확인 하였다. 치사율을 보인 구간을 5농도 나누어 재 실험하였다. 공시충 준비 예비 실험의 경우 각 농도에서 2컵(25마리/ 컵)을 시험하였으며, 본 실험의 경우 3컵(25마 리/컵)을 준비하였다. 대조군으로 처리군과 동 일한 개체수가 들어있는 2-3컵을 준비하고 온 도와 습도(27±2, RH, 75±5%)가 잘 유지되 도록 규격 chamber 내에서 공시충을 준비하였 다. 준비된 공시충을 실험에 사용하기 위하여 마취를 시켜야 되는데 Ether 2~3ml을 종이컵 (250ml 이상)의 2/3정도 차지하는 부피의 솜에 다 처리하고 1분 30초간 마취를 시킨다. 2분이 넘게 되면 살충률에 영향을 미친다. 마취된 공 시충의 상태를 지연 시키기 위하여 chill table에 옮겨놓고 살충률에 영향을 미치지 않도록 5분 이상 방치하지 않았다. 두꺼운 종이에 공시충 암컷을 10마리씩 옮겨 놓고 등 부분이 위로 향 하도록 하여 약재를 처리하였다. 살충제 노출 원하는 농도의 살충제를 미량 주사기에 200~ 250ml 흡력하고 미량 점적기에 장착하였다. 미 량 점적기의 점적양을 공시충의 살충률에 영향 을 주지 않는 최소 양으로 처리해야 하는데 이 때 모기는 0.3μl로 조정한 후 마취된 공시충에 점적하였다. 이때 공시충의 다리 부분이나 날개 부분에 처리 되지 않도록 조심하면서 흉배판 (scutum)에 점적하였다. 점적은 저농도부터 고 농도로 올라가면서 실시하였고, 점적이 다 끝난 농도의 실린지는 100% 아세톤과 메탄올로 세정 을 실시한뒤 건조시킨후 다른 농도의 실험을 실시하였다. 대조군에는 처리구와 동일한 양의 살충제를 처리하였으며, 점적을 마친 공시충은 라벨을 한 뒤 컵에 넣은 후 망(60-mesh)으로 덮어, 항온 항습실(27±2, RH, 75±5%)로 옮 겨 24시간 후에 치사율을 조사하였다. 이때 다 리 부분이 경미하게 움직이거나 이동이 거의 불가능한(Moribund) 공시충은 죽은 것으로 간 주하였다.

162 Ⅰ. 연구보고 151 유충(Larvae) 살충제 원제의 유충 공시충에 대한 감수성 (susceptibility) 조사를 위해 다음과 같이 크게 3 개 부분으로 나누어 살충제 및 시약, 시험방법, 시험 결과로 크게 나누어 실험을 실시하였다. - 시약 및 기구 살충제 및 시약 실험에 사용되어지는 살충제 및 시약을 살펴 보면 희석용매로서 보통의 경우 Ethanol(Merck co., Germany, 99.8%)을 사용하였으며 만약 Ethanol에 희석이 되지 않는 약제는 다른 유기 용매나 증류수를 이용하여 희석 시켰다. 살충제 와 증류수 사이의 결합 촉매 반응을 위하여 10000ppm의 Triton-x 100(Sigma-aldrich, U.S.A.) 1ml을 사용하였다. 초자 및 기구 살충제의 용적을 측정하기 위해 사용되는 초 자류 중 10ml, 1ml, 200μl, 100μl용 마이크로피 펫(Gilson co., France)을 사용하였으며, 희석을 위한 병은 보관을 위해 50ml 적갈색의 유리병 (Wheaton, U.S.A)을 사용하였다. 살충제를 용매 에 희석시키기 위해 볼텍스 믹서(Vortex mixer; Vision, U.S.A.)를 사용하였다. 실험을 하기 위한 장소는 항온(27±2 ), 항습(RH, 75±5%)이 유 지되는 규격 chamber에서 실시하였으며, 유충을 포획하기 위하여 스포이드(10ml, =0.3cm)를 이용하였다. 포획한 유충을 20ml의 polyethylene cup에 넣고 안정을 시킨 후 250ml의 종이컵에 처리를 하였다. 공시충 공시충은 2세대 누대 사육종을 사용하였으며, 사용 모기 유충은 3령 말기나 4령 초기인 건강 한 유충을 사용하였다. - 시험 방법 살충제 준비 표준품을 준비하기 위하여 에탄올에 triton-x 100을 10000ppm 되도록 수용액을 만들고, 1000ppm의 triton-x 100에 살충제 1%의 비율로 희석시켰다. 이때 표준품의 양을 50ml되도록 만 들어 에탄올이 증발하지 않도록 밀봉을 잘 해 50ml의 적갈색 유리 용기(Wheaton, U.S.A)에 넣 어 4 냉장고에 보관하였다. 예비실험의 검체를 준비하기위해서 표준품에서 2ml과 1000ppm의 triton x-100 용액 18ml을 볼텍스 믹서(Vortex mixer;vision, U.S.A.)에서 잘 희석한 후 0.1%를 만들고, 제조된 제품(0.1%)에서 2ml을 분주한 후 1000ppm의 triton x-100 용액18ml과 희석하여 0.001%를 조제하였다. 같은 방법으로 0.001%, %, %를 조제 하였다. 본실험의 검 체를 준비하기 위해서는 예비실험의 결과가 0% 에서 100% 치사율을 보이는 구간의 농도를 기 준으로 적정 농도를 조제하였다. 공시충 준비 공시충(모기 유충)을 물 20ml이 들어있는 polyethylene cup에 25-30마리씩 넣고, 공시충의 살충률에 영향을 미치지 않도록 최대 우호 조 건인 습도(75±5%)와 온도(27±2 )를 유지시 켜 주었다. Polyethylene cup 내에서 1시간의 적 응 시간을 주고, 예비실험의 경우 각 농도에서 2컵(25마리/컵), 본 실험의 경우에 3컵(25마리/ 컵)을 준비하였다. 대조군은 2컵(25마리/컵) 이 상을 준비하였다. 살충제 노출 준비된 250ml 컵에 물 230ml을 용적 시켰다. (물깊이는 2.5cm에서 7.5cm사이 이어야 한다). 사용되는 물은 증류수, 빗물, 수돗물을 사용해도 무방하나, 단지 염소나 유기오염원을 제거하기 위하여 하룻동안 침적 시킨 물을 사용하였다. 실험하고자 하는 농도를 기록한 컵에 준비된 살충제 희석액 1ml을 표면에 떨구고, 피펫을 사 용해서 30초 동안 고루 섞어 주었다. 각 농도 별로 3컵씩을 만들고, 대조군에는 10000ppm의 triton-x 100을 1ml 처리하였다. 1시간 전에 준 비해둔 유충 25마리를 살충제가 처리된 컵에 처리하였다. 24시간 동안 RH 75±5%, 온도가

163 152 국립보건연구원보 27±2 인 항온 항습실의 암실에서 보관한 후 살충률을 검사하였다. 각 농도에 치사율을 정할 때 사용되어진 모든 컵내에 있는 죽거나 거의 움직이지 않는 충의 숫자를 계산하여 전체 사용 되어진 충의 숫자로 나누어 주고, 죽은 유충은 호흡관(siphon)을 건드려도 아래로 내려가지 않 거나, 물위로 올라오지 않는 유충을 나타내었다. 4) 살충제 연막 실험 실내 실험에서 살충력이 강한 살충제의 성충 공시충에 대한 연막 유효성(susceptibility)을 조 사하기 위하여 다음과 같이 크게 3개 부분으로 나누어 살충제 및 시약, 시험방법, 시험 결과로 크게 나누어 실험이 실시되어야 한다. - 시약 및 기구 살충제 및 시약 희석용매로서 경유를 사용하였으며, 살충제 는 일정한 농도로 희석되어 사용되었다. 실험 후 성충의 먹이를 위해 10% 설탕(삼양사, 울 산)물을 솜에 처리하여 24h사용하였다. 초자 및 기구 살충제의 용적을 측정하기 위해 사용되는 초 자류는 500mlMess cylinder(superior, germany) 을 사용하였으며, 실험을 실시한 후 살충제를 노출시킨 모기를 보관하기 위하여 종이컵 (250ml)을 사용하였으며 항온(27±2 ), 항습 (RH, 75±5%)이 유지되는 규격 chamber에 보관 해서 살충제 외에 다른 요소가 살충률에 영향 을 주지 않도록 하였다. 생물검정용 노출장 (Bioassay cage)을 지지해 줄 수 있는 높이 1m 이상 1.5m 이하인 폴대를 사용하였다.. 망을 지 지해주는 철재 빔은 원통형으로 아래위가 개방 되어 있으며 직경 7~10cm, 높이 10~15cm 정도 이다. 휴대용 연막기는 연막 분사량이 시간당 59L인 연막기를 사용하였다. 공시충 공시충은 2세대 누대 사육종을 사용하였고, 사용 모기 성충은 우화한지 2-5일 된 것을 사 용하며, 먹이는 10% 설탕물을 사용한다. 모든 공시충은 암컷과 수컷이 살충력에 있어 차이가 있는데 생존력이 강한 암컷을 사용하였다. - 시험 방법 살충제 준비 살충제를 경유에 희석하여 적정 농도로 희석 하였다. 용매의 양은 연막기의 용량을 감안하여 1L 이상으로 하였다. 공시충 준비 공시충(파리, 모기)을 생물검정용 노출장 (Bioassay cage)에 25마리 정도를 잡고, 살충제 방사 위치에서 3회에 걸쳐서 시험을 실시하며, 1회에 2개 이상의 노출장을 실험하였다. 공시충 은 실험직전까지 생물검정실에서 온도와 습도 (27±2 와 75±5%)를 일정하게 유지하면서 살 충률에 영향을 미치지 않도록 보관하였으며. 대 조군은 3 cage 이상 준비하고 생물검정용 노출 장(Bioassay cage)에 약제명과 설치 위치를 기재 하였다. 살충제 노출 경유에 희석된 일정량의 살충제를 연막기 통 에 넣고 연막기를 가동시킨후, 공시충(파리, 모 기)이 들어있는 생물검정용노출장(Bioassay cage) 을 연막기로부터 10m의 위치에 2개씩 폴대에 매달았다. 두 폴대 간 설치 위치는 1m였으며. 연막기를 폴대로부터 10m 떨어진 지점에서 바 람을 등지고, 연막을 실시하고 이동속도는 1km/h를 넘지 않도록 하였다. 이때 분사시간 은 30초로 하였다. 연막후 10분이 경과한 후에 생물 검정용 노출장(Bioassay cage)을 항온 항습 실(27±2 와 75±5%)로 옮긴 후 망 위에 10% 설탕물을 적신 솜을 처리하였으며. 대조군에는 살충제가 들어있는 경유를 넣어서 연막을 실시 하였다. 연막을 마친 공시충은 24시간 후에 치 사율을 조사한 뒤 잘 걷지 못하는 공시충은 죽 은 것으로 간주하였다. 안전복과 방독 보호 장 치, 보호 장갑, 안전 장화를 착용하고 실험을

164 Ⅰ. 연구보고 153 실시하며 생물검정용노출장을 수거하였다. 실험 은 표준 풍속 1-4m/sec(시간당 km)에서 실시하였으며 만약 풍속이 시간당 15km를 넘으 면 실험은 중단하였다. 실험의 시간은 각 날에 해당하는 온도와 습도에 맞게 실시되어지는데 보통 일몰 후 30분부터 오후 7시30분까지 실시 하였다. 온도는 25~27 였다. - 시험결과 시험결과 각농도의 치사율은 실험에 사용된 모든 충의 수를 합친 후 각 컵의 사망 충수를 나누어 주고, 각 농도의 치사율을 SAS(sas institute, U.S.A.)system 중 프로빗 분석(Probit analysis)을 사용하여, LD50, 실험에 사용된 충 의 수, 표준편차, slope 등을 구하였다. 이러한 실험의 공정성을 기하기 위하여 3회 이상의 실 험을 실시하였다. 5) 살충제 잔류효과 시험 살충제의 성충 공시충에 대한 잔류 효과 (efficiency)를 조사하기 위하여 다음과 같이 크 게 3개 부분으로 나누어 살충제 및 시약, 시험 방법, 시험 결과로 크게 나누어 실험이 실시되 었다. - 시약 및 기구 살충제 및 시약 실험에 사용되어지는 살충제 및 시약을 살펴 보면 희석용매로서 증류수를 사용하였으며 살 충제는 일정 농도로 희석을 시켜 사용하였다. 실험 후 성충의 먹이를 위해 10% 설탕(삼양사, 울산)물을 솜(1m2)에 처리하여 24h사용하였다. 초자 및 기구 살충제의 용적을 측정하기 위해 사용되는 초 자류 중 500m Mess cylinder(superior, germany) 을 사용하였다. 살충제를 목표 처리면에 처리하 고 나서 공시충을 노출시키기 위하여 WHO 노 출 깔때기(WHO Conical exposure chamber)를 사용하였다. 재질이 다른 부위에 살충제를 처리 하기 위하여 붓을 사용하였다. 공시충 공시충은 2세대 이상 누대 사육종을 사용하 였으며, 사용 모기 성충은 우화한지 2-5일 된 것을 사용하였다. 먹이는 10% 설탕물을 사용하 였으며, 모든 공시충은 암컷과 수컷이 살충력에 있어 차이가 있는데 생존력이 강한 암컷을 사 용하였다. - 시험 방법 살충제 준비 실험에 사용되어진 살충제를 증류수에 희석 하여 적량의 농도로 희석하였다. 공시충 준비 공시충(모기, 파리)을 각 노출 깔대기에 25마 리 정도를 넣을 정도로 준비하고, 각각의 재질 이 다른 표면에서 3회에 걸쳐서 시험을 실시하 였으며, 1회에 3개 이상의 노출 깔대기로 실험 하였다. 공시충은 실험직전까지 생물검정실에서 온도와 습도(27±2 와 75±5%)를 일정하게 유 지하면서 살충률에 영향을 미치지 않도록 보관 하였으며. 대조군은 3 cage 이상 준비하여 생물 검정용 노출장(Bioassay cage)에 약제명과 설치 위치를 기재하였다. 살충제 노출 송판과 타일에 약재를 붓으로 처리하였다. 각 살충원제는 증류수에 각 농도별로 희석되어 사 용되었다. PPP 붓을 사용하였다. 약재 처리량 은 원래 1m2당 40cc가 처리되도록 WHO에서 권 장하고 있지만 송판과 타일의 크기가 20cm2이므 로 1m2 당 16ml이 처리되도록 하였다. 노출 깔대기를 이중 테이프로 벽면에 붙인 후 흡충관을 사용하여, 20마리의 공시충을 처 리하였다. 솜으로 구멍을 폐쇄 시킨 후 30분 간 공시충을 살충제에 노출시켰다. 흡충관을 사용하여 다시 망사가(60메쉬) 씌워진 종이 컵에 공시충을 옮긴 후 항온항습실(27±2, 습도 75±5%)에 보관하였다. 망 위에 10% 설

165 154 국립보건연구원보 탕물을 적신 솜을 올려 놓아 깨어난 성충의 먹이가 되도록 하였다. 시험은 살충제 살포후 LD 50 값을 구하기 위하여 24시간후 사충률을 확인하였고, 잔류기간을 확인하기 위하여 5 일, 10일, 15일, 20일, 25일, 30일, 35일, 40일, 45일, 50일, 55일, 60일, 65일, 70일, 75일, 80 일, 85일, 90일의 간격을 두고 사충률을 조사 하였다. 대조군은 살충제를 뿌리지 않은 처리 면에 노출 깔대기를 설치하고 처리구와 같은 시간 벽면에 노출시켰다. 대조구와 같은 기간 사충률을 조사하였다. 각 실험은 3반복을 실 시하였으며. 공시충은 잘 걷지 못하거나 움직 이지 않으면 죽은 것으로 간주하였다. - 시험결과 시험결과 각농도의 치사율은 실험에 사용된 모든 충의 수를 합친 후 각 컵의 사망 충수를 나누어, 각 농도의 치사율을 SAS(sas institute, U.S.A.)system 중 프로빗 분석(Probit analysis)을 사용하여, 50%를 치사케 하는 시간(ET50)을 구 하였다. 실험에 사용된 충의 수, 표준편차, slope 등을 구했으며. 이러한 실험의 공정성을 기하기 위하여 3회 실험을 실시하였다. 대조군의 치사 율이 20% 이상인 경우에는 재실험을 실시하였 다. 대조군의 치사율이 5-20% 사이인 경우에는 아보트공식(Abbott's formula)을 사용하여 치사 율을 보정하였다. 실험치사율(%)-대조군의치사율(%) 100%-대조군의치사율(%) 100 처리군은 대조군과 비교해서 살충력이 70% 이상 차이를 보일때 유효성을 가지며, 30% 이 하일 때는 동일한 군으로 처리하였다. 6) 지역별 살충제 사용정보 수집 지역별 살충제 현황을 파악하기 위하여 부산 지역과 전북 지역의 보건소에 대해 전화방문을 실시하여 유문등 설치 지역 주위에 5년동안 사 용되어진 살충제 사용 현황을 파악. 결 과 1년차 (1) 살충제 선정 중국얼룩날개모기에 대한 1년차 살충제 감수 성 시험에 사용되는 살충제는 약사법이 개정됨 에 따라서 공공보건분야에서 사용될 약제와 현 재 사용되는 약제 위주로 선정하기 위하여 WHOPES(WHO Pesticide Evaluation Scheme), 또 는 WHO와 같은 공공기관의 권장약제는 아니 지만 국내에서 사용되는 약제 중에서 선정하였 다. 이렇게 선정된 약제는 모두 16종이며, 이중 가장 많은 것이 합성피레스로이드계로 8종이며, 유기인계가 7종, 카바메이트계 2종, 그리고 새 로운 살충제 형태인 피라졸이 1종이었다. 조사 결과 합성피레스로이드계인 zeta-cypermethrin이 가장 좋은 감수성을 보여서 반수치사농도 (LD50)가 ug/ 를 보인 반면에 가장 감수 성이 낮은 유기인계인 fenithrotion는 ug/ 으로 조사되어 zeta-cypermethrin에 비해서 무 려 1000배나 낮은 감수성을 보였다. 대부분의 합 성피레스로이드계 약제들의 ug/ 의 반수치사농도(LD50)를 보여 높은 감수성을 보인 반면에 사용한지 오래된 permethrin은 이들 보다 10배정도 저항성을 보여서 LD50값이 ug/ 로 나타났다. 또한 WHOPES의 목록 에는 없으나 피라졸계인 chlorfenapyr역시 LD50 값이 ug/ 으로 합성피레스로이드계와 유 사한 높은 감수성을 보이는 것으로 조사되었다. 반면에 유기인계인 Fenthion의 경우 다른 유기 인계 약제에 비해서는 높은 감수성을 유지하는 것으로 조사되었고 dichlorvos, diazinon은 반수 치사농도가 0.3ug/ 이상으로 나타나 저항성이 매우 발달한 것으로 조사되었다.

166 Ⅰ. 연구보고 155 표 2. 점적법(Microapplication)에 의한 말라리아매개모기 살충제 감수성 조사 (전주) Insecticide Type Results LD50/ LD90/ alphacypermethrin PY bifenthrin PY chlorfenapyr Pyrazol d-phenothrin PY deltamethrin PY diazinon OP dichlorvos OP etofenprox OP fenitrothion OP fenthion OP lambda-cyhalothrin PY permethrin PY pirimiphos-methyl OP zeta-cypermethrin PY 고성지역 말라리아매개모기에 대한 살충제 감수성조사 결과 본 실험을 수행하기 위하여 고성지역에서는 15종의 살충제에 대한 감수성 예비시험을 실시 하였으며, 이 경우 전주지역에 비해서 낮은 농 도구간이 설정됨을 알 수 있었다. 그러나 금 년 기온이상으로 자연계에 모기발생이 적어 고성에서 공시충의 부족으로 6종의 살충제에 대해서만 반수치사농도(LD 50 )와 90%치사농도 (LD 90 )를 산출하였다. 고성도 전주지역과 마찬 가지로 다른 합성피레스로이드계(PY)에 비해서 permethrin의 감수성이 5~10배 낮은 것으로 조사 되었다. 표 3. 점적법(Microapplication)에 의한 말라리아매개모기 성충에 대한 살충제 감수성 조사(고성) INSECTICIDE Type Results LD50/ LD90/ lambda-cyhalothrin PY deltamethrin PY chlorfenapyr Pyrazol bifenthrin PY permethrin PY pirimiphos-methyl OP ) 살충제 저항성지수 판정 고성, 전주지역의 살충제 감수성 비교 말라리아매개모기인 중국얼룩날개모기(An. sinensis)에 대한 살충제 감수성 시험이 고성과 전주에서 모두 실시된 제제는 6종으로 유기인계 (OP)1종, 합성피레스로이드계(PY) 5종이었으며, 이들에 대한 살충제 감수성을 비교한 결과 모든 살 충제에서 고성지역이 전주지역에 비해 감수성이 최 고 6배나 높게(lambda-cyhalothrin) 나타났다. 이것은 전주지방의 기온이 고성보다 높고, 모기 발생원인 논 이 많이 분포하고 있음으로 농약을 비롯한 살 충제의 살포가 많은 관계로 전주 지역의 모기에 서 보다 빠르게 저항성이 발달한 결과로 생각할

167 156 국립보건연구원보 수 있다. 이러한 결과에서 보듯이 각 지역은 지 역의 여건에 따라서 살충제의 사용량이 다르므 로 일률적으로 방역용살충제의 농도를 고정하 여 사용하는 것보다는 지역 특성에 맞는 결과 를 바탕으로 방역활동을 실시하는 것이 좋다. 표 4. 전주와 고성지역에서 채집된 중국얼룩날개모기(Anopheles sinensis)에 대한 살충제 감수성조사, 2003 Area LD50(ug/ ) Insecticide Type 고성 전주 SRLD (1) bifenthrin PY chlorfenapyr Pyrazol deltamethrin PY lambda-cyhalothrin PY permethrin PY pirimiphosmethyl OP (1) Susceptibility ration of LD50 = 전주 LD50 / 고성 LD50 당진, 통일촌, 전주 지역의 살충제 감수성 비교 1999년도에 당진과 통일촌 지역에서 채집한 중국얼룩날개모기(An. sinensis)에 대한 살충제 감수성 자료를 기초로 하여 전주지역의 저항성 정도를 산출한 결과는 표 5와 같다. bifenthrin의 경우에 1999년도에 조사된 당진의 자료에 비해 서 27배나 높은 저항성이 발생하였으며, 통일 촌에 비해서는 75배의 저항성을 보였으나 반수 치사농도는 아직도 ug/ 로 우수한 상태를 유지하고 있었다. 반면에 diazinon, etofenprox, lambdacyhalothrin, permethrin은 전주지역이 당 진지역과 유사한 정도의 감수성을 보여주었다. 표 5. 당진, 통일촌 지역(1999)의 중국얼룩날개모기에 대한 살충제 감수성 자료를 기초로 한 전주지역 의 저항성 지수 LD50/ SRLD50(1) Insecticide 당진 통일촌 전주 (1999) (1999) (2003) 당진 (1) 통일촌 (2) bifenthrin deltamethrin diazinon dichlorvos etofenprox fenthion lambda-cyhalothrin permethrin (1) Susceptibility ration of LD50=전주 LD50/당진 LD50 (2) Susceptibility ration of LD50=전주 LD50/통일촌 LD50

168 Ⅰ. 연구보고 157 3) 농약생산량 및 출하량 2002년도의 농약생산량은 전년도에 비해서 4.3%감소하였으며, 출하량도 8.4% 감소하였다. 특히 매개모기 발생에 영향을 많이 줄수 있는 수도용 살충제의 경우 생산량은 10.3% 감소하 였으며, 출하량도 7.6%가 감소하여 평균감소율 을 초과하였다. 지역별 농약의 사용량이 가장 많은 지역은 경북으로 나타났으며, 다음으로 전 남, 전북 순으로 나타났다. (1) 살충제의 선정 살충제(Pesticide, insecticide)는 곤충을 비롯한 광범위한 생물에 대하여 강한 생리적 활성을 가지고 있는 물질로서 인간의 복지에 장해가 되고 있는 각종의 해충을 구제하는데 사용목적 이 있다. 살충제는 천연물질로부터 추출하였거 나 화학적으로 합성된 것 등이 있으나 최근에 는 특수한 경우를 제외하면 사용되고 있는 대 부분의 살충제는 합성살충제로서 종류의 다양 성과 함께 서로 다른 특성을 가지고 있다. 살충 제는 적용대상에 따라 농업용 살충제, 방역용 살충제, 가정용 살충제 및 동물용 살충제로 대 별하며 이중에서 위생해충의 구제를 목적으로 하여 사용하는 살충제를 방역용 살충제( 防疫用殺蟲劑 )라고 한다. 방역용 살충제의 경우에도 사람과 가축에 독성을 나타냄으로서 무엇보다 도 안전성이 최우선으로 고려되어야 하기 때문 에 살충제를 안전하게 사용하기 위하여서는 살 충제의 종류와 성질을 명확하게 파악하는 것이 매우 중요하다. 살충제 사용의 최종적 목표는 각 종의 해충을 방제하고 그 피해를 최대한으 로 막는데 있으므로서 살충효과는 빠르게 그리 고 명확하게 나타나며 그 효과가 지속적으로 유지되는 것이 바람직하다. 1국내 모기 성충에 대한 살충력 실험에 적합 한 살충원제 alpha-cypermethrin, bendiocarb, carbosulfan, chlorpyrifos-methyl, cypermethrin, deltamethrin, lambda-cyhalothrin, permethrin, pirimiphos-methyl, propoxur 등을 국내 모기 성충의 살충력 실험에 적합한 살충원제로 제시한다. 2국내 모기 유충에 대한 살충력 실험에 적합 한 살충원제 B. thuringiensis H-14 chlorpyrifos, chlorpyrifosmethyl, deltamethrin, etofenorox, fenitrothion, fenthion, methoprene, permethrin, pirimphos-methyl 등을 국내 모기 유충의 살충력 실험에 적합한 살충 원제로 제시한다. (2) 감수성 조사 지역 선정 감수성 모기 채집 조사 지역을 선정하기 위 해서 강원도, 경기도, 충청북도, 충청남도, 경상 남도, 경상북도, 전라북도, 전라남도, 부산, 제주 10개 지역에 유문등을 설치하여 7월과 8월을 중심으로 작은 빨간 집모기의 밀도가 가장 높 은 지역인 전주(39,998마리)와 최초 출현지역인 기장(12,214마리)을 선정하였다. (3) 작은빨간집모기(Culex tritaeniorhynchus)성 충에 대한 10가지 살충제와 유충에 대한 9가지 살충제의 감수성 조사 (가) 부산 지방에서 채집된 작은빨간집모기 (Culex tritaeniorhynchus) 성충에 대한 10가지 살충제의 감수성 10가지 살충제의 부산 지방에서 채집되어진 작 은빨간집모기(Cx. tritaenioryhnchus)의 성충에 대 해 국부미량처리법(topical test)을 이용해 살충활 성을 검정하여 각각 표 6에 제시하였다. carbosulfan 외 3가지 살충제는 충당 10μg 이상에서 50% 치사량 을 나타내었다. Chlorpyrifos-methyl( μg /adult), deltamethrin(0.0004μg/adult)과 λ-cyhalothr in(0.0002μg/adult)이 높은 활성을 나타내었는데, chlorpyrifos-methyl이 λ-cyhalothrin 과 deltamethrin 보다는 각각 5배, 10배 높은 활성을 보였다 (표 6).

169 158 국립보건연구원보 표 년도 8개 도(provinces)와 2개 시(cities)에서 채집되어진 작은빨간집모기 (Culex tritaeniorhynchus) Month Culex tritaeniorhynchus week Collecting regions 1 * * 1. 강원도; 2. 경기도; 3. 충청북도; 4. 충청남도; 5. 경상북도; 6. 경상남도; 7. 전라북도; 8. 전라남도; 9. 부산; 10. 제주시 표 7. 부산 기장 지방에서 채집된 작은빨간집모기 성충의 10가지 살충제에 대한 감수성 Compound Chemical type n Slope±SE LD50,ug/adult 95% CL alpha-cypermethrin ± bendiocarb ± carbosulfan ±0.09 >10 chlorpyrifos-methyl ± cypermethrin ±0.10 >10 deltamethrin ± lambda-cyhalothrin ± permethrin ± pirimiphos-methyl ±0.08 >10 propoxur ±0.07 >10 (나) 전주 지방에서 채집된 작은빨간집모기 (Culex tritaeniorhynchus) 성충에 대한 10가지 살충제의 감수성 전주지방에서 채집되어진 작은빨간집모기의 10가지 살충제에 대한 감수성 실험을 국부미량 처리법(topical test)을 이용하여 실시하여 얻은 결과를 표 7에 나타내었다. 기장지방에서 채집 되어진 모기와 비슷하게 carbosulfan 외 3종 실 험약재에 대해 10μg이상의 높은 약량에서 반수 치사량을 나타내었다. Chlorpyrifos-methyl (0.0006μg) 과 λ-cyhalothrin (0.0021μg), deltamethrin ( μg)이 높은 감수성을 나타내었는데, chlorpyrifosmethyl이 λ-cyhalothrin과 deltamethrin에 비해 각각 3.5배와 14.5배 높은 활성을 보였다. 기장 지방에서 채집되어진 모기와 비교해 볼 때 10배의 살충 활성 차이를 나타내었다(표 7).

170 Ⅰ. 연구보고 159 표 8. 전북 전주 지방에서 채집된 작은빨간집모기 성충의 10가지 살충제에 대한 감수성 Compound n Slope±SE LD50,ug/adult 95% CL alpha-cypermethrin ± bendiocarb ± carbosulfan ±0.09 >10 chlorpyrifos-methyl ± cypermethrin ±0.09 >10 deltamethrin ± lambda-cyhalothrin ± permethrin ± pirimiphos-methyl ±0.09 >10 propoxur ±0.07 >10 (다) 기장에서 채집된 작은빨간집모기(Culex tritaeniorhynchus) 유충에 대한 9가지 살충제의 감 수성 조사 9가지 살충제를 이용해 기장 지방에서 채집되 어진 작은빨간집모기(Culex tritaenior hynchus) 유충에 대해 현탁법(Emulsion test)을 이용해 살유충 실험을 실시하였다. 성충에 대한 실험결 과는 다르게 methoprene과 deltamethrin이 높 은 살유충 활성을 나타냈는데, deltamethrin이 50배 이상의 높은 활성을 나타내었다 (표 8). 표 9. 부산 기장 지방에서 채집된 작은빨간집모기 유충의 10가지 살충제에 대한 감수성 Compound Chemical type n Slope±SE LD50,ppm 95%cl chlorpyrifos OP ± chlorpyrifos-methyl OP ± deltamethrin PY ± etofenprox PY ± fenitrothion OP ± fenthion OP ± permethrin PY ± primiphos-methyl OP ± (라) 기장에서 채집된 작은빨간집모기(Culex tritaeniorhynchus) 유충에 대한 9가지 살충제의 감 수성 조사 9가지 살충제를 이용해 전주 지방에서 채집되 어진 작은빨간집모기(Culex tritaeniorhyn chus) 유충에 대해 현탁법(Emulsion test)을 이용해 살유 충 실험을 실시하였다. 부산 지방에서 채집되어 진 모기 유충에 대한 감수성과는 다르게 모두 10배 이하의 살유충력 차이를 나타내었다. deltamethrin이 높은 활성을 나타낸 fenthion 보 다 100배 높은 활성을 나타내었다.

171 160 국립보건연구원보 표 10. 전북 전주지방에서 채집된 작은빨간집모기 유충의 10가지 살충제에 대한 감수성 Compound Chemical type n Slope±SE LD50, (ppm) 95%cl chlorpyrifos OP ± chlorpyrifos-methyl OP ± deltamethrin PY ± etofenprox PY ± fenitrothion OP ± fenthion OP ± permethrin PY ± primiphos-methyl OP ± ) 지역별 살충제 현황 부산 기장군 보건소와 전북 전주 보건소 방 역계에 5년 동안 유문등 설치지역에서 살충 제 사용을 문의하여 살충력과 비교하였다. 보통 pyrethroid 계통의 살충제가 많이 사용되고 있었 는데 한 가지 약제를 3년 이상 사용 한곳은 없 었으며 매년 일정 비율로 살충제 원제를 교체 해가며 사용하고 있었다. 방역용 살충제에 의한 저항성 발달에 따른 감수성의 차이는 없었다. 표1. 기장 지방 유문등 설치지역 주위에서 5년간 살충제 사용 현황 연도별 살충제 구분 (연막, 분무용) 성분명(주성분, 함량) 1,000ml 기준 사용량 (l) 분무용 B.t. i 활성결정 단백질-35g 300 분무용 올소디크로벤젠 370g; 크씨네롤 75g; 크레솔 55g 100 분무용 델타메스린 25g; 클로르피리포스 27g; 카데스린 5g 900 분무용 비펜스린 10g; 알파메스린 20g; 다이아지논 220g 650 분무용 비펜스린 10g; 싸이퍼메스린 90g; 카보설판 100g 650 분무용 알파사이포메스린 50g; 하이시스싸이포메스린 100g; 클로러피비포스 100g 분무용 델타메스린 25g; 다이아지논 70g; 카데스린 5g 726 분무용 베타싸이플루스린 30g; 알파싸이퍼메스린 120g 80 분무용 올소디크로벤젠 370g; 크씨네롤 75g; 크레솔 55g 100 분무 연막겸용 람다-싸이할로스린 25g; 프리미엄피미포스메칠 25g 565 분무 비펜스린 10g; 싸이퍼메스린 90g; 카보설판 100g 100 분무용 펜프로파트린 100g; 클로르피리포스 200g 60 분무용 플루발리네이트 75g; 싸이퍼메스린 75g; 클로르피리포스 50g 600 분무용 아세타미프리드 30g; 펜치온 200g 800 분무용 올소디크로벤젠 370g; 크씨네롤 75g; 크레솔 55g 100 분무용 람다-싸이할로스린 25g; 프리미엄피미포스메칠 25g 526 분무용 비펜스린 10g; 알파메스린 20g; 다이아지논 220g

172 Ⅰ. 연구보고 161 분무용 펜프로파트린 100g; 클로르피리포스 200g; 360 분무용 플루발리네이트 75g; 싸이퍼메스린 75g; 클로르피리포스 50g 분무용 아세타미프리드 30g; 펜치온 200g 84 분무용 페녹시카브 50g; 플루싸이트린에이트 100g; 480 분무 살균겸용 싸이퍼메스린 15g; 아세타미프리드 30g; 클로르피리포스 155g; 벤잘코늄크로라이드 100g 분무용 베타싸이플루스린 30g; 알파싸이퍼메스린 120g 390 분무 연막겸용 페녹시카브 50g; 펜프로파트린 50g; 1,500 분무용 로치온 25%; 에토펜프록스 5% 240 분무용 싸이페노스린 1.5g; 델타메스린 2.5g; 디클로르보스 27.0g 90 분무용 델타메스린 25g; 다이아지논 70g; 카데스린 5g 200 분무용 스피노사드 0.5%; 포로치오포스 22%; 싸이플루스린 2.5% 360 분무용 델타메스린 25g; 카데스린 5g; 클로르피리포스 270g 비축물량 분무용 페녹시카브 50g; 플루싸이트린에이트 100g 비축물량 360 표 12. 전주 지방 유문등 설치지역 주위에서 5년간 살충제 사용 현황 연도별 살충제 구분 (연막, 분무용) 성분명(주성분, 함량) 1,000ml 기준 사용량 (l) 분무용 펜프로파트린 5g; 디디브이피 15g; 에토펜프록스 5g 600 분무용 연막용 람다싸이할로스린 2.5g; 프레미엄피리포스 2.5g 300 분무용 비펜스린 1g; 알파메스린 2g; 다이아지논 22g 300 연막용 카데스린 0.5g; 델타메스린 2.5g; 디클로르보스 10g; 다이아지논 7g 300 분제 델타메스린 0.05g; 다이아지논 2.0g; 디플루벤주론 0.5g 550 연막용 프로페노포스 33g; 싸이퍼메스린 7g 300 연막용 알파싸이퍼메스린 5g; 하이씨스싸이퍼메스린 5g; 펜치온 15g 살균제 살균제 100ml; 오루소디크로벤젠 37g 150 유충구제용 활성결정성단백 3.5g 100 분무 연막겸용 베타싸이플루스린 4g; 알파메스린 10g; 펜치온 12g 288 분무 연막겸용 프로페노포스 7.5g; 에토펜프록스 2.5g; 푸시링 10g 468 분무용 메토스린 0.5g; 베타싸이플루스린 2.5g; 펜치온 20g 456 분무 연막겸용 람다싸이할로스린 3.5g; 프리미엄피리미포스메칠 2.5 g; 알폭시레이트 7.5g; 프랄레스린 0.5g 연막용 비펜스린 1g; 싸이퍼메스린 9g; 카보설판 10g 180 분무 연막겸용 베타싸이플루스린 4g; 알파메스린 10g; 펜치온 12g 350 분무 연막겸용 프로페노포스 7.5g; 에토펜프록스 2.5g; 푸시링 10g 396 분무용 에토펜프록스 15g; 피리다펜치온 10g 230 분무용 싸이페노스린 1.5g; 아세타미프리드 3g; 클로르피리포스 15.5g 324 분무 연막겸용 람다싸이할로스린 2.5g; 프리미엄포스메칠 2.5g 540 연막용 스피노사드 0.5g; 펜치온 22.0g; 델타메스린 2.5g

173 162 국립보건연구원보 3년차 (1) 살충제의 선정 2년차 실험 연계를 위해 WHOPES에서 권장하 는 살충제 종류와 국내 방역용 살충제 사용현황 파악 결과를 비교함으로서 실험에 적합한 성충 방제용 약재 10가지 유충 9가지 약재 선정 1 국내 모기 성충에 대한 살충력 실험에 적 합한 살충원제 alpha-cypermethrin, bendiocarb, carbosulfan, chlorpyrifos-methyl, cypermethrin, deltamethrin, lambda-cyhalothrin, permethrin, pirimiphos-methyl, propoxur 등을 국 내 모기 성충의 살충력 실험 에 적합한 살충원제로 제시한다. 2 국내 모기 유충에 대한 살충력 실험에 적 합한 살충원제 B. thuringiensis H-14 chlorpyrifos, chlorpyrifosmethyl, deltamethrin, etofenorox, fenitrothion, fenthion, permethrin, pirimphos-methyl 등을 국 내 모기 유충의 살충력 실험에 적합한 살충원 제로 제시한다. 표 13. List of insecticides tested against Culex pipiens adults and their purities and LD50 against rats. Insecticides Chemical typea Purity Toxicityb: Oral LD50 of A.I. for rats (g/kg of body weight) α-cypermethrin PY 99.0% 79 bendiocarb C 99.0% 55 carbosulfan C 95.0% 250 chlorpyrifos-methyl OP 98.0% 3,000 cypermethrin PY 99.0% 250 deltamethrin PY 99.0% 135 λ-cyhalothrin PY 98.0% 56 permethrin PY 99.0% 500 pirimiphos-methyl OP 99.0% 2,018 propoxur C 98.0% 95 a C=carbamate; OP=organophosphate; PY=synthetic pyrethroid b Toxicity and hazard are not necessarily equivalent 표 14. List of insecticides tested against Culex pipiens larva and their purities and LD50 against rats. Insecticides Chemical typea Purity Toxicityb: Oral LD50 of A.I. for rats (g/kg of body weight) B. thuringiensis M.I. - 30,000 chlorpyrifos OP 98.0% 135 chlorpyrifos-methyl OP 98.0% 3,000 deltamethrin PY 99.0% 135 et(h)ofenprox PY 99.0% 10,000 fenitrothion OP 99.0% 503 fenthion OP 98.0% 586 permethrin PY 99.0% 500 pirimiphos-methyl OP 99.0% 2,018 a C=carbamate; OP=organophosphate; PY=synthetic pyrethroid b Toxicity and hazard are not necessarily equivalent

174 Ⅰ. 연구보고 163 (2) 감수성 조사 지역 선정 감수성 모기 채집 조사 지역을 선정하기 위 해서 강원도, 경기도, 충청북도, 충청남도, 경상 남도, 경상북도, 전라북도, 전라남도, 부산, 제주 10개 지역에 유문등을 설치하였다. 7월과 8월을 중심으로 빨간집모기(Culex pipies)의 밀도가 높 고 1, 2년차 실험의 연계성을 위하여 전북 전주 (1,080마리)지역과 부산 동래 지역(12,052마리) 을 선정하였다. 표 년도 8개 도와 2개 시에서 채집되어진 빨간집모기 (Culex pipiens) Month week Culex pipiens Collecting regions Total 1 * * 1. 강원도; 2. 경기도; 3. 충청북도; 4. 충청남도; 5. 경상북도; 6. 경상남도; 7. 전라북도; 8. 전라남도; 9. 부산; 10. 제주시 June 4 July 4 August 강원도 경기도 충청북도 충청남도 경상북도 경상남도 전라북도 전라남도 부산 제주시 No. of Culex pipiens 그림 1. 8개 도와 2개 시에서 채집되어진 빨간집모기 (Culex pipiens) (3) 빨간집모기(Culex pipiens) 성충에 대한 10 가지 살충제와 유충에 대한 9가지 살충제 의 감수성 조사 (가) 전북 전주 와 부산 동래 지역에서 채집 된 빨간집모기(Culex pipiens) 성충에 대한 10가 지 살충제의 감수성 국부미량처리법(Topical test)을 이용해 부산 지 역에서 채집되어진 빨간집모기(Culex. pipiens)의 성충에 대해 10가지 살충제의 효력을 비교 실 험하여 표 6 에 제시하였다. 약재간 비교실험에 서 부산 지역에서 채집된 성충 모기에 대해 chlorpyrifos-methyl이 가장 살충력이 높았으며,

175 164 국립보건연구원보 전주지역에서 채집된 성충모기에 대해서는 deltamethrin이 가장 살충력이 높았다. 부산지 역에서 채집된 성충 모기에 대해 chlorpyrifosmethyl은 cypermethrin보다 300,000배 이상 살충 활성이 높았다. 전주 지역에서 채집된 성충모기 에 대해 deltamethrin은 carbosulfan 보다 270,000 이상 살충력이 높았다. 지역간 모기의 저항성 차 이는 전주지역에서 채집된 모기 성충이 부산지방에서 채집된 모기 유충에 대해 약재 저항성이 높게 나타 났으며, alpha-cypemethrin과 carbosulfan, cypermethrin, deltamethrin을 제외한 6가지 약재는 20배 이상 차이가 났다. chlorpyrifos-methyl에 대해 전주지 역에서 채집된 모기는 부산 지역에서 채집된 모기보다 최고 300배 이상의 저항성을 나타냈 다. 쥐에 대한 경구독성과 모기에 대한 감수성 을 함께 고려해 본다면 부산과 전주지방에서 모기 성충에 대한 가장 효력적 감수성을 나타 낸 chlorpyrifos-methyl(3,000 g/kg of body weight) 이 두 번째로 효력이 좋은 deltamethrin 보다 모 기 방제에 적합한 살충제로 선정되었다. 표 16. 전북 전주 지역과 부산 동래 지역에서 채집된 빨간집모기 (Culex pipiens) 성충의 10가지 살충 제에 대한 감수성 bendiocarb carbosulfan Compound Region n Slope±SE LD50,ug/adult chlorpyrifos-methyl cypermethrin deltamethrin lambda-cyhalothrin permethrin alphacypermethrin pirimiphosmethyl propoxur Folds of less susceptibility Busan ± Jeonbuk ± Busan ± ,769 Jeonbuk ± ,000 Busan ± ,923 Jeonbuk ± ,000 Busan ± Jeonbuk ± Busan ± ,461 Jeonbuk ± ,470 Busan ± Jeonbuk ± Busan ± Jeonbuk ± Busan ± Jeonbuk ± Busan ,000 Jeonbuk Busan ± ,076 Jeonbuk ± ,750 SRLD

176 Ⅰ. 연구보고 LD50, ug/adult Alphacypermethrin Carbosulfan Cypermethrin Lambdacyhalothrin Pirimiphosmethyl Pesticides 부산기장 전북전주 그림 2. 전북 전주와 부산 동래 지역에서 채집되어진 빨간집모기 (Culex pipiens) 성충에 대한 10가지 살충제에 대한 감수성 (나) 전북 전주와 부산 동래 지역의 빨간집모 기(Culex pipiens) 유충에 대한 9가지 살충제의 감수성 조사 9가지 살충제를 이용해 전주와 동래 지역에 서 채집되어진 빨간집모기(Culex pipiens) 유충 에 대해 현탁법(emulsion test)을 이용해 살유충 실험을 실시하였다. 살충제에 대한 성충의 저항 성 결과와 같이 동래지역에서 채집된 모기는 chlorpyrifos-methyl에 가장 높은 감수성을 나타 냈으며 전주 지역에 채집된 모기는 deltamethrin 에 가장 높은 감수성을 나타냈다. 전주지역에서 채집된 모기는 B. t., Chlorpyrifos, deltamethrin과 etofenprox를 제외한 5가지 약제에 대해 동래지역 에서 채집된 모기 보다 10배 이상의 높은 저항 성 차이를 나타냈다. 전주에서 채집된 모기는 chlorpyrifos-methyl에 대해 chlorpyrifos보다 배 이상의 감수성 차이를 보여주었고, 동래에서 채집된 모기는 deltamethrin에 대해 chlorpyrifos 보다 50000배 이상의 감수성 차이를 보여주었 다. 쥐에 대한 경구독성과 모기에 대한 감수성 을 함께 고려해 본다면 부산과 전주지방에서 모 기 유충에 대한 가장 효력적 감수성을 나타낸 chlorpyrifos-methyl(3,000 g/kg of body weight)이 두 번째로 효력이 좋은 deltamethrin 보다 모기 방제에 적합한 살충제로 선정되었다.

177 166 국립보건연구원보 표 17. 전주와 동래 지역에서 채집된 빨간집모기(Culex pipiens) 유충의 10가지 살충제에 대한 감수성 Compound Region n Slope±SE LD50, Folds of less ppm susceptibility B. t. Busan ± Jeonbuk ± chlorpyrifos Busan ± Jeonbuk ± SRLD chlorpyrifos-methyl Busan ± Jeonbuk ± deltamethrin Busan ± Jeonbuk ± etofenprox Busan ± Jeonbuk ± fenitrothion Busan ± Jeonbuk ± fenthion Busan ± Jeonbuk ± permethrin Busan ± Jeonbuk ± primiphos-methyl Busan ± Jeonbuk ± LD50, ug/adult B. t. Deltamethrin Fenthion Pesticides 부산기장 전북전주 그림 2. 전주와 동래 지역에서 채집된 빨간집모기(Culex pipiens) 유충의 10가지 살충제에 대한 감수성

178 Ⅰ. 연구보고 167 고찰 및 결론 국내 모기에 대한 살충제 감수성과 저항성에 관한 연구는 방제용 살충제를 대상으로 지역별 로 채집된 모기들의 독성을 평가하여 각 살충 제에 대한 감수성과 지역별 및 사용살충제와 사용기간에 따른 살충제 저항성의 발현정도를 분석하는 형태로 연구가 진행되어왔다. 본 연구 는 국내에서 발생하는 질병매개곤충 3종에 대 한 살충제 저항성에 대해 조사하였다. 1, 2, 그 리고 3년차 연구에 대한 실험방법은 동일하지만 3년차 실험에서는 연막 및 잔류실험이 추가되 었다. 1년차는 남부지방의 고성과 전주 지역의 중국얼룩날개모기(Anopheles sinensis)에 대한 23종 살충제의 살충활성을 측정하였으며, 매개체 발생 시기 및 지역에 따른 우점종을 조사하였다. 2006년 현재 약사법에 따르면 식약청에 사용 등록 허가된 방역용 살충제 6종을 제외한 살충 제는 사용하지 못하도록 하고 있다. 실험에 사 용된 살충제 선정은 실험당시 약사법의 미비로 현재 식약청에 등록된 살충제 외에 세계보건기 구에서 사용권장하는 모기방제용 살충제와 2004년 당시 조달청과 계약된 모기방제용 살충 제의 공통된 부분을 기준으로 실시하였다. 앞으 로 약사법에 의거 식약청에 등록 허가된 살충 제의 살충력에 대한 계속적인 모니터링이 필요 하다. 방역용 살충제 사용현황과 벼 생육에 사 용되는 농약의 사용량과 사용시기를 조사하여 지역별 살충제 사용정보를 수집하였고 당진 등 타 지역의 과거 자료를 수집하여 살충제에 대 한 감수성 비교를 통해 저항성 지수를 조사한 결과 다량의 살충제를 사용하는 전주 지방이 고성지방보다 살충제에 대한 감수성이 떨어지 는 것으로 나타났다. 하지만 공시충이 채집된 지역에 사용되어진 살충제의 종류와 양은 판매 유통 구조상 정확히 파악되지 않아, 살충제 사 용과 저항성의 정확한 관계에 대한 연구가 진 행되어야 될 것으로 사료된다. 또한 본 실험에 대한 결과로 두 지역 간의 중국얼룩날개모기에 대한 살충제 감수성 지수의 차이를 바탕으로 하여 각 지역마다 전염병매개체 모기를 방제하 기 위한 살충제 선정에 기본 자료로 활용 할 수 있다고 사료된다. 2년차는 WHOPES 자료와 국내 방역용 살충제의 사용현황을 조사하여 살 충제 감수성 시험자료를 수집하였으며, 10개의 지역에 유문등을 설치하여 월 발생하는 모기의 밀도를 조사하여, 7월과 8월 달을 기준으로 작 은빨간집모기의 밀도가 가장 높은 지역을 선정 하였다. 특히, 부산 기장지방은 8월 중순에 작 은빨간집모기의 밀도가 다른 지역에 비해 최대 250배까지 높은 것으로 나타났다. 모기밀도가 높아지는 8월달을 중심으로 기장 지역 모기에 대한 감수성 살충제를 사용하여 방제를 한다면 효과적인 결과를 취할수 있을것이며 환자 발생 예방이나 감소에도 큰 역할을 할것이라고 사료 된다. 1년차의 연구 결과를 바탕으로 국부미량 처리기(Microapplicator)를 이용하여 공시충과 연구 목적에 가장 합리적인 생물검정법을 확립 하여 성충에 대한 10가지 살충제의 모기에 대한 감수성 실험을 실시하였으며, 현탁법(emulsion test)을 이용하여 공시충과 연구 목적에 가장 합 리적인 생물검정법을 확립하여 유충에 대한 10 가지 살충제의 모기에 대한 감수성 실험을 실 시하였다. 1년차 결과와 비슷하게, 두 지역간 모기의 살충제 저항성 차이를 확인할수 있었으 며, 성충과 유충에 있어 감수성 있는 살충제가 같은 것으로 확인되어 감수성이나 저항성이 유 전되는 것으로 추정되며, 앞으로 이 부분에 있 어 많은 연구가 선행되어야 할 것으로 사료된 다. 전주지방에서 채집된 모기는 부산 기장지방 에서 채집된 모기보다 높은 살충제 저항성을 나타내었는데, 전주지방에 채집지 부근에는 대 규모의 논들이 많이 있지만, 기장지방은 소규모 의 논이 존재한다. 그러므로, 전주지역에는 다 량의 살충제가 사용되어 채집지 주변의 모기는 오랫동안 많은 살충제에 노출되어왔고 여러 가 지 살충제에 대해 저항성을 발달시켜왔다. 살충 제 노출 정도에 따라 두 지역간 모기의 살충제

179 168 국립보건연구원보 저항성이 달라진 것으로 사료된다. Huqi(2004) 등은 미국의 Alabama와 Florida 지역의 모기중 노출된 살충제의 양과 종류에 따라 두 지역간 살충제 저항성이 달라진다고 말하고 있다. 전 주 및 기장 지방의 유문등 설치 지역 주위에서 5년동안 사용되어진 살충제 사용 현황을 파악 하여 지역별 살충제 사용 현황을 조사하였다. 부산 기장군 보건소와 전북 전주 보건소 방역 계에서 5년동안 유문등 설치 지역에서 살충제 사용을 문의하여 살충력과 비교를 실시하였고, 방역용 살충제는 보통 3년마다 교체가 되었으 며, 가지 살충제를 3년 이상 사용한 곳은 없었 다. 이상의 결과로 볼 때 모기의 저항성 발달 정도 차이는 방역용 살충제 사용에 의한것이라 기 보다는 실제 논에서 사용되어지는 살충제 종류와 양에 따라 달라진다고 사료되어진다. 3 년차는 2년차 실험의 연계를 위하여 전북 전주 지역과 부산 동래 지역을 모기 채집지역을 선 정하였고, 국부미량 처리기(Microapplicator)과 현탁법(Emulsion test)를 이용하여 빨간집모기 성충과 유충에 대한 19가지 살충제의 감수성 실내 실험을 실시하였다. 2년차 시험결과와 비 슷하게 모기의 살충제 저항성 발달 정도를 확 인 하였으며, 각 지역의 모기 유충과 성충에 동 일한 감수성 약제가 선정되었다. 저항성 인자의 유전에 대한 연구는 wirth(1998)에 의해 발표된 적이 있다. Wirth는 빨간집모기의 유기 염소인 계 살충제에 대한 저항성 인자 2개에 대해 설 명하고 있는데 유충에서 성충으로 유전한다고 말하고 있다. 저항성이 높은 전주 지방의 모기 종에 대해 가장 감수성이 뛰어난 살충제 3종을 선정하여 연막과 분무의 준야외 실험을 실시하 였다. 휴대용 연막기를 이용해 연구 목적에 가 장 부합되며, 2004년 식약청 보고서로 제출되어 진 생물검정법으로 연막 실험을 실시하였다. 잔류실험은 송판과 타일을 이용해 살충제의 잔 류시험을 농도별로 실시하여 반수치사량을 결정 해 3가지 약재의 살충력을 확인하였다. 또한 잔 류기간을 비교하였다. 연막실험에서 deltamethrin 이 가장 높은 살충 효력을 나타내었으며, chlorpyrifos-methyl, λ-cyhalothrin 순으로 살충 효력이 나타났다. 실내 실험과는 다르게 공기의 흐름이 발생하고 온도에 영향을 받는 야외의 상 황을 고려해 볼 때, 분자량이 높은 deltamethrin 이 chlorpyrifos- methyl과 λ-cyhalothrin보다 훨 씬 살충력이 높아야 하지만, 다량으로 처리되어 지는 상황하에서는 분자량 보다 살충력 본성에 더 영향을 받는 것으로 사료된다. 잔류시험에 있어 같은 약재를 사용하였을때 송판보다 타일 에서 살충력이 더 높게 나타났으며, 잔류기간은 송판이 길었다. 송판의 표면보다 타일의 표면이 더 휘발성이 높기 때문인 것으로 사료된다. 심 등(1983)에 의하면 살충력은 타일에서 송판보 다 높지만, 잔류기간은 송판이 높다고 말하였 다. 본 야외실험은 앞으로 좀더 실험이 필요하 여 실험 결과는 구체적으로 제시하지 않았다. 연구사업 3년간 4지역의 모기 종간의 살충제 감수성 비교 실험을 통하여 기술적 측면으로 지역별 모기에 대한 살충제의 저항성 연구에 체계적인 새로운 연구방향을 제시하였으며, 저 항성 발달 모니터링 구축을 위한 기본적인 활 용 자료를 제공하였다. 또한 다각적인 모기의 화학적 방제를위한 새로운 접급 방법을 모색하 고 모기 저항성 연구에 국내기술 수준을 선진 국 수준으로 끌어올릴 방제에 합리적 살충제 선정에 기초자료를 제공하였다. 사회경제적 측 면으로는 지역별 모기의 저항성을 조사하여 적 합한 살충제를 선정함으로서 최소양의 살충제 를 사용하여 최대 방제 효과를 도출하여 원제 수입감소 효과로 인한 국고 낭비를 최소화 할 수 있고, 방역활동의 효율화로 인한 타 예산의 간접 자본 증대와 국고 예산의 효율화에 기여 할수 있는 기본 자료를 제공하였다. 결과, 간접 자본의 지역 및 시 도 보건소내의 복지 향상 투 자에 도움을 줄것으로 사료된다. 국민보건복지 측면에서 국내모기의 살충제에 대한 저항성 문 제 해결로 인한 살충제 노출 기회를 감소시켜 국토의 환경을 보존함과 동시에 기존의 유기합

180 Ⅰ. 연구보고 169 성 살충제의 과다 사용에 따른 질병의 발생을 극복하고 국민복지 증진에 기여 할 것으로 사 료되는 자료를 도출하였다. 참고문헌 1.김정림, 이희일, 신이현, 이욱교, 이종수 국내 삼일열말라리아 확산 방제 및 근절을 위한 종합방제 방안에 관한 연구. 국 립보건원보 36: 심재철, 윤영희, 김정림, 이원자, 임성빈 농약이 일본뇌염매개모기와 수답 서식 동물에 미치는 영향. 국립보건원보, 22: 심재철, 윤영희, 김정림, 이원자, 이복임, 김순 천 농약이 일본뇌염매개 모기와 수답서 식동물에 미치는 영향에 관한 연구(수답과 미나 리밭을 중심으로). 국립보건원보, 24: 심재철, 윤영희, 김정림, 이원자, 이복임, 신이 현 농약이 Culex tritaeniorhynchus와 수 답서식동물에 미치는 영향에 관한 연구(도시 지방을 중심으로). 국립보건원보, 25: 심재철, 홍한기, 구성회, 이동규, 1995a. 중국 얼룩날개모기 (Anopheles sinensis)유충의 살 충제에 대한 감수성. 한국곤충학회지, 25(1): 심재철, 홍한기, 이동규, 1995b. 작은빨간집모 기(Culex tritaeniorhynchus) 유충의 살충제에 대한 감수성. 한국곤충학회지, 25(1): 이동규, 전진화, 강혜숙, 유효석, 유기 및 재래농법 수답의 수서생태계와 모기유충의 서 식밀도 분석. 한국곤충학회지, 27(3): 이동규, 유효석, 국내 주요 모기유충과 천적어류의 Abate와 Abate-S에 대한 감수성. 한국응용곤충학회지, 38(2): 이성옥 금강에 인접한 지역에서 발생 하는 빨간집모기(Culex pipiens)의 살충제 저 항성에 대하여. 충북대학교 석사학위논문. 10. 이용규, 김정화, 이형래, 집파리에 대 한 Chlorpyrifos, Dichlorvos, 및 Perme thrin의 저항성 유발과 교차저항성. 한국응용곤충학 회지, 33(3) : 이 한일 위생곤충학. 3판. 고문사. 서 울. 498pp. 12. Arnason, J. T., Philogene, B. J., and Morand, P Insecticides of Plant Origin. ACS Symp. Ser. No. 387, Amer. Chem. Soc., Wachington, D.C., Brogdon WG and McAllister JC Insecticide resistance and vector control Emerg. Infect Dis 4: Elliot, M Synthetic pyrethroids, pp. 1-28, in M. Eliott (ed.). Synthetic Pyrethroids. ACS Symp. No. 42, Amer. Chem. Soc., SanFrancisco, C.A. 15. Gubler DJ and Clark GG Dengue/dengue hemoragic fever : the emegence of a global health problem. Emerg Infect Dis 1: Harborne, J. B Introduction to Ecological Biochemistry, 4th Ed. Academic Press, New York. 17. Hedin, P. A New concepts and trends in pesticide chemistry. J. Agric. Food Chem. 30: H. K. Hong, J. C. Shim, C. L. Kim, and W. J. Lee Study of Control Effectiveness on the Residual Insecticide Treatment in Animal Sheds against J. E. Vector Mosquitoes 19. Huqi liu, Eddie W. Cupp, Kelly M. micher, Aiguang guo and Nannan Liu Insectiicde Resistance and Cross-Resistance in Alabama and Florida Strains of Culex quinquefaciatus. J. Med. Entomol. 41(3): Hennessey, M.K., N.H. Nigg and D.H. Habeck Mosquito(Diptera; Culicida) Adulticide drift into widelife refuges of the Florida keys. Environmental, 2(4): Isman, M. B Leads and prospects for the development of new botanical insecticides.

181 170 국립보건연구원보 Rev. Pestic. Toxicol. 3:1ー20.탄자니아, 나이 지리아 22. Jacobson, M. and Crosby, D. G Naturally Occurring Insecticides. Marcel Decker, New York. 23. Krogstad DJ Malaria as a reemerging disease. Epidemiol Rev 18: Lacey, L.A. and Lacey, C.M The Medical importance of riceland mosquitoes their control using alternatives to chemical insecticides. J. of the American Mosquito Control Association, Supplement No.2: Laird, M. and J. W. Miles, Integrated mosquito control methodelogies, Vol 2. Academic Press, London, 444pp. 26. Lee, Dong-Kyu and Won Ja Lee, Overwintering mosquito population of Culex pipiens molestus in the underground structures in Pusan. Korean J. Entomol., 22(4): Lee, Dong-Kyu, Effect of two culture methods on the seasonal occurrence of mosquito larvae and other aquatic animals in rice fields of Southwestern Korea. J. of Vector Ecology 23(2): Meisch, M.V. and A. Inman Surveillance results from mosquito abatement program in the Grand Prairie. Ar.Farm. Res., 39(1): Padmavathi, G., S.R.G. Muralidharam and B.V. Rao Predatory efficacy of certain indigenous fishes for the control of mosquito larvae. Cheiron., 18(3): Sanders EJ, Borus P, Ademba G, Kuria G, Tukei PM, LeDuc JW Sentinel surveillance for yellow fever in Kenya, 1983 to Emerg Infect Dis 2: Sentinel surveillance for yellow fever in Kenya, 1993 to Emerg Infect Dis 2: Weathersbee III, A.A., M.V. Meisch, A. Inman and D.A. Dame Activity of Lambada-Calothrin applied as an ultra low volume ground treatment against Anopheles quadrimaculatus adult. Journal of the American Mosquito Control Association, 7(2): Wirth Mc Isolation and characterization of two novel organiphosphate resistance mechanisms in Culex pipiens from Cyprus 34. WHO Climate change and human health. WHO, Geneva. pp Worthing C. R. and Hance, R. J The Pesticieds Manual. British Crop Protection Council.

182 Ⅰ. 연구보고 171 Study on susceptibility of disease vector mosquito against insecticides used for public health K.S. Chang, J.S. Park, H.E. Lee, E.H. Shin, H.I. Lee, W.K. Lee, K.Y. Park and W.J. Lee Division of Medical Entomology, NIH, Seoul, Korea Purpose:First, it is to provide basic data to develop appropriate insecticide specialized according to vector and region as susceptibility test perform, then to suggest standard of purchase when a public health center buy insecticide, finally to construct basal information to monitor resistance of vector on insecticide. Methods:Information on insecticidal susceptibility test against Culex tritaeniorhynchus was collected as surveying WHOPES data and study on domestic present state of insecticide used for public. As test regions, it was selected two regions which extremely much mosquitoes were collected as setting up black-light trap around 10 local public health center. The most appropriate bioassay methods for purpose of study were made and then insecticidal susceptibility test was done against adult and larva of Culex tritaniorhynchus. Results:In study to select insecticides for mosquito control, 10 insecticides and larvicides were chosen through comparison between insecticides suggested by WHOPES and made a deal between ministry of health & welfare and PCO. As test regions for susceptibility of mosquito on insecticides used for public, Jeonju and gijang, in which extremely much mosquitoes were collected at July and august, were chosen. Chlorpyrifos-methyl and Deltamethrin showed the effective insecticidal activity against adult and larva of mosquitoes collected from two regions, respectively. Conclusions:Through this study, basal data of the most suitable control program will be offered as disease vector mosquito is raging, maximization of control efficacy are going to get accomplished as providing strategic efficiency according to applying methods and control guideline will be set up in a national point of view. Information of the most suitable insecticidal susceptibility according to vector species will be given to the local public health centers as supplying list of insecticide selected by susceptibility test. Key words:insecticide, Culex tritaeniorhynchus, susceptibility, Topical test This study was supported by the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

183 172 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 덱사메타손과 비타민 C를 방출하는 생분해성 고분자 지지체와 인간골수줄기세포를 이용한 생체 내 골형성 연구 국립보건연구원 생명과학센터, 연세대학교 의과대학 1, 아주대학교 의과대학 2 김형범, 서활 1, 안상미, 김현우 1, 이정민, 김은혜, Yvonne Reinwald, 박상혁 3, 민병현 2, 조인호 목 적:줄기세포를 이용한 골조직의 조직공학적 재생에 있어서 풀리지 않은 문제 중의 하나는 어떻 게 하면 다능성 줄기세포가 골세포로 분화할 수 있는 미세환경을 제공하느냐하는 것이다. 이전에 우 리는 생물학적 활성이 있는 덱사메타손과 비타민 C (ascorbate-2-phosphate)를 분비하는 다공성 PLGA (poly(d,l-lactide-co-glycolide)) 지지체를 제작하였고, 제작된 지지체는 골유도지지체로서 의 역할을 하고 있는 것을 관찰하였다. 방 법:본 실험은 덱사메타손과 비타민 C (ascorbate-2-phosphate)를 분비하는 다공성 PLGA (poly(d,l-lactide-co-glycolide)) 지지체가 생체 내에서도 골유도지지체로서 사용가능한 것인지를 확 인하기 위하여 다능성 인간 골수줄기세포를 뿌린 이들 지지체를 무흉선 마우스의 피하에 이식하였다. 결 과:일반 지지체와 비교해서 골유도지지체를 사용한 경우 높은 양의 알카리 인분해효소 (alkaline phosphatase)가 관찰되었다. 뿐만 아니라, 이들 골유도지지체에서는 더 많은 양의 칼슘이 침착되었으며, 강한 폰 코자(von Kossa) 염색을 관찰할 수 있었는데 이런 결과는 미네랄화된 뼈가 더 많이 생성되었음을 의미하였다. 그러나 사프라닌(Safranin O)에 염색되는 연골조직은 관찰되지 않 은 것으로 보아 본 실험의 프로토콜에 의해서는 막성골형성이 일어났음을 암시하였다. 결 론:본 연구는 생체 내에서 덱사메타손과 비타민 C가 분비되는 PLGA지지체를 이용하여 성공적 인 골형성을 입증한 첫 번째 연구이다. 중심단어:골수줄기세포, 지지체, poly(d,l-lactide-co-glycolide), 덱사메타손, 비타민 C, 골형 성, 골, 분화, 알카리성 인분해효소, 조직 공학 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원 받은 과제임. 지원 과제명 : Pericytes와 Mesenchymal stem cell (MSC)를 이용한 Angiopoietin-1에 의한 혈관 신생 조절기전 규명 및 동물모델에서의 조직공학적 적용 학회지 게재 : 2005년, Biochemical and Biophysical Research Communications, 332:

184 Ⅰ. 연구보고 173 In vivo bone formation by human marrow stromal cells in biodegradable scaffolds that release dexamethasone and ascorbate-2-phosphate H.B. Kim, H. Suh 1, S.A. Jo, H.W. Kim 1, J.M. Lee, E.H. Kim, Y. Reinwald, S.H. Park 3, B.H. Min 2, and I.H. Jo Cener for Biomedical Sciences, NIH, Seoul Korea, Yonsei University College of Medicine, Seoul Korea 1, School of Medicine, Ajou University, Suwon Korea 2 Purpose:An unsolved problem with stem cell-based engineering of bone tissue is how to provide a microenvironment that promotes the osteogenic differentiation of multipotent stem cells. Previously, we fabricated porous poly(d,l-lactide-co-glycolide) (PLGA) scaffolds that released biologically active dexamethasone (Dex) and ascorbate-2-phosphate (AsP) and that acted as osteogenic scaffolds. Methods:To determine whether these osteogenic scaffolds can be used for bone formation in vivo, we seeded multipotent human marrow stromal cells (hmscs) onto the scaffolds and implanted them subcutaneously into athymic mice. Results:Higher alkaline phosphatase expression was observed in hmscs in the osteogenic scaffolds compared with that of hmscs in control scaffolds. Furthermore, there was more calcium deposition and stronger von Kossa staining in the osteogenic scaffolds, which suggested that there was enhanced mineralized bone formation. We failed to detect cartilage in the osteogenic scaffolds (negative Safranin O staining), which implied that there was intramembranous ossification. Conclusions:This is the first study to demonstrate the successful formation of mineralized bone tissue in vivo by hmscs in PLGA scaffolds that release Dex and AsP. Key words:marrow stromal cells, scaffolds, poly(d,l-lactide-co-glycolide), dexamethasone, ascorbate-2-phosphate, osteogenesis, bone, differentiation, alkaline phosphatase, tissue engineering This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea Supported original title : Study on the mechamism for angiopoietin-induced blood vasculogenesis and application of tissue engineering to animal model using pericytes and mesenchymal stem cell (MSC) This study was printed in Biochemical and Biophysical Research Communications 332: The Report of National Institute of Health 42, , 2005

185 174 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 한국인의 endothelial nitric oxide synthase내의 유전적 다형성인 -786TC과 심근경색에 대한 흡연과의 관계 연구 국립보건연구원 생명의과학센터 1, 유전체연구센터 2, 연세대학교 심혈관 연구소 3, 고려대학교 안산건강센터 4 조인호 1, 문제성 1, 윤수인 1, 김흥태 1,2, 김은경 1, 박현영 1,3, 신철 4, 민지호 1, 진윤미 1, 차승헌 2, 안상미 1 목 적:혈관내피세포에서 발생하는 NO는 심혈관계질환의 예방과 치료에 중요한 역할을 한다고 알 려져 있다. 또한 이런 NO를 발생하는 enos 유전자의 SNP sites가 실제로 고혈압, 심근경색 등의 심혈관계 질환을 일으키는 중요한 유전적 위험요소로서의 역할이 알려져 있기 때문에 enos의 SNP 부위에 대한 집중적인 분자세포생물학적 연구는 심혈관질환의 발병의 기전을 이해하는데 중요하다. 따라서 본 연구에서는 enos promoter내에 존재하는 single nucleotide polymorphism (SNPs) (-786TC, -922AG, -1468TA)과 심근경색의 발병정도 및 흡연과의 관계성을 분석하고자 하였다. 방 법:서울 및 수도권지역에 거주하는 932명을 연구대상을 하였다. 대상군의 혈액으로부터 유전자 를 분리하여 PCR-RFLP를 이용하여 exon7내의 894GT missense mutation을 분리하였다. 또한 각 각의 샘플에서 enos 유전자 promoter 부위에 존재하는 3가지 SNPs (-786TC, -922AG, -1468TA) 에 대한 분석을 minisequencing protocol (SNaPshot)을 이용하여 실시하였다. 결 과:eNOS 유전자의 promoter 부위에 존재하는 3가지 SNPs(-786TC, -922AG, -1468TA)은 서로간의 연결정도가 r 2 = 으로 완벽하게 linkage disequilibrium 관계에 있음을 확인하였다. 또한 연령, 성별과 관계없이 3가지 mutant SNPs를 가지고 있는 사람의 경우 심근경색이 발병할 확 률이 정상인에 비하여 1.69배 정도가 높았다. 뿐만 아니라, mutant SNPs을 지닌 흡연자의 경우는 심근경색이 발병할 확률이 2.04 (Odds ratio)로 더 증가하는 것으로 확인되었다. 결 론:eNOS promoter내의 3가지 SNPs (-786TC, -922AG, -1468TA)는 한국인의 심근경색 발 병에 중요한 요인으로 작용한다. 또한 흡연의 경우 그 정도를 증가시키는 것으로 확인되어 이에 대 한 분자생물학적 연구가 필요할 것이다. 중심단어:Endothelial nitric oxide synthase gene, 다형성 유전질환, 심근경색, 흡연, 한국인 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원 받은 과제임. 지원 과제명:심근경색과 관련있는 endothelial nitric oxide synthase (enos)의 promoter region 에 존재하는 single nucleotide polymorphism (SNP)의 기능에 관한 분자생물학적 연구 학회지 게재:2006년, Clinica Chimica Acta, 365:86-92

186 Ⅰ. 연구보고 175 Interaction between -786TC polymorphism in the endothelial nitric oxide synthase gene and smoking for myocardial infarction in Korean population I.H. Jo 1, J.S. Moon 1, S.I. Yoon 1, H.T. Kim 1,2, E.K. Kim 1, H.Y. Park 1,3, C. Shin 4, J.H. Min 1, Y.M. Jin 1, S.H. Cha 2 and S.A. Jo 1 Center for Biomedical Sciences 1 and National Genomic Research Institute 2, NIH, Seoul Korea, Cardiovascular Research Institute, Yonsei University Medical Center, Seoul Korea 3, Ansan Health Center, Korea University Hospital, 516 Gojan-dong, Ansan-city, Kyonggi-do Korea 4 Purpose:Nitric oxide (NO) produced by endothelial nitric oxide synthase (enos) mediates endothelium-dependent vasodilation and antithrombotic action. Controversial results regarding the association of enos gene polymorphisms with myocardial infarction (MI) have been reported. Methods:A total of 932 individuals living in Seoul and the suburb, Korea were randomly selected. Genomic DNA was prepared from blood leukocytes. A GT missense mutation in exon 7 (894GT)was screened using PCR-restriction fragment length polymorphism analysis. The genotypes of three mutations (-786TC, -922AG, and -1468TA) in the 5'-flanking region were determined by a minisequencing protocol (SNaPshot), respectively. Results:Pair-wise linkage analysis revealed that three mutations of -786TC, -922AG, and -1468TA were completely linked with each other ( D' =1, r 2 = ). Furthermore, each of these mutant alleles (-786C, -922G, or -1468A), but not 894T allele, was associated with the risk of MI. Multiple logistic regression analysis revealed that each of these mutant alleles was a predictive independent risk factor for the risk of MI (odds ratio, 1.69 for dominant effects, P=0.0148) after age and sex adjustments. Smoking further increased the odds ratio by 2.04 for the risk of MI when it was combined with the mutant alleles. Conclusions:Each of three mutations (-786TC, -922AG, or -1468TA) in the 5'-flanking regionof enos gene may play a role in the pathogenesis of MI in Korean population, and also provides an evidence for a significant interaction between these mutations and smoking. Key words:endothelial nitric oxide synthase gene, Polymorphism, Myocardial infarction, Smoking, Korea

187 176 국립보건연구원보 This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea Supported original title : A study on the function of single nucleotide polymorphism (SNP) in the promoter region of endothelial nitric oxide synthase related with myocardial infarction This study was printed in Clinica Chimica Acta 365: The Report of National Institute of Health 42, , 2005

188 Ⅰ. 연구보고 177 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 배아줄기세포를 이용한 심장근육세포로의 분화기전 및 이를 이용한 심근재생에 관한 연구 국립보건연구원 생명의과학센터 난치성질환팀, 건국대학교 분자생명공학과 1 박윤신, 강성기, 이수재 1, 김광표 1, 박상익 목 적 : Mouse embryonic stem cell line인 P19CL6를 이용하여 심근분화와 관련한 새로운 분화조 절기전을 밝히고, 향후 줄기세포를 in vivo에 적용하여 심근재생 및 심장 기능향상을 도모할 수 있는 최적화 조건들을 확립하고자 하였다. 심근세포 분화와 관련하여 nitric oxide (NO)는 심혈관 항상성 에 있어서 중요한 조절인자로 작용하는 것으로 심근세포 분화에 있어서 중요한 신호전달물질로 제시 되고 있다. NO가 P19CL6의 심근으로의 분화과정에 미치는 영향 및 작용기전에 관해 연구하고자 하 였다. 방 법 : P19CL6 cell을 개로 60mm2 dish에 plating한 후 FBS를 10%로 유지한 상태에서 1% 의 DMSO를 첨가하여 심근으로의 분화를 유도하고, 동시에 NO donor인 SNAP과 NOS inhibitor인 L-NAME를 처리하여 심근세포분화에 대한 NO의 효과를 조사하였다. 또한, Griesse reagent 방법 으로 심근으로의 분화과정동안 생성되는 NO의 양을 조사하였다. 1D-LC-MS/MS를 이용하여 NO에 의해 modification 되는 단백질 및 아미노산 잔기를 동정하였다. 결 과 : P19CL6 cell에 DMSO를 첨가하여 심근으로 분화하는 동안 분화 8일 이후에서 12일까지 enos의 발현 및 활성이 증가하는 것으로 조사되었으며, endogenous한 NO의 생성 역시 enos 단백 질의 발현 양상과 유사하게 증가하는 것으로 조사되었다. 생성된 NO에 의한 단백질의 modification 중 분화과정동안 tyrosine nitration 반응이 증가하는 것을 알 수 있었고, nitration반응이 일어난 단 백질은 1D-LC-MS/MS 분석 결과, beta2-tubulin인 것으로 분석되었다. 특히, beta2-tubulin 중 106번과 340번의 tyrosine이 nitration됨을 확인할 수 있었다. 결 론 : 본 연구결과, 심근세포로의 분화와 관련하여 NO의 조절기전 중, 분화과정 동안 NO가 내재 적으로 생성되며, 생성된 NO가 세포내의 cytoskeletal protein인 beta2-tubulin을 nitration 시킨다 는 새로운 연구결과를 얻었으며, 이는 NO에 의한 새로운 분화조절기전 연구의 근간을 제공해 줄 것 이다. 중심단어 : P19CL6, Nitric oxide, 심근분화, nitration, beta2-tubulin 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

189 178 국립보건연구원보 Identification of a target protein β2-tubulin and specific tyrosine residues under nitration modification by NO produced during DMSO-induced cardiomyocyte differentiation in embryonic stem cell line P19CL6 Y.S. Park, S.K. Kang, S.J. Lee 1, K.P. Kim 1 and S.I. Park Division of Intractable Diseases, Department of Biomedical Sciences, NIH, Seoul Korea Department of Molecular Biotechnology, Konkuk university, Seoul Korea 1 Purpose:Nitric oxide (NO) is a precursor of reactive nitrating species, peroxynitrite and nitrogen dioxide, which could lead to protein modification containing 3-nitrotyrosine. Little is known about the generation of endogenous NO in a physiological process and furthermore, about the target proteins of tyrosine nitration during cardiac differentiation. Methods:Cardiomyocytes differentiation from P19CL6 cells was induced by the addition of 1% DMSO. The content of NO produced during cardiomyocytes differentiation was measured in nitrite form by Griesse method in the supernatant of cultured cells. Expression patterns of RNA and protein for enos were examined by RT-PCR and western blot analysis, respectively. One dimensional LC-MS/MS was performed to identify the target protein and further specific amino acid residues under nitration modification. Results:NO was endogenously produced by enos expression and its activation (p-ser 1179). Consistently, the NO level increased from differentiation day 4 and peaked day 8 and returned to basal level thereafter. Concomitantly, the tyrosine nitration level also increased as the cardiac differentiation proceeds. However, the treatment of NOS inhibitor, L-NAME, suppressed the NO production and subsequent tyrosine nitration, leading to reduction of the cardiomyocytes population exhibiting beating. More importantly, we for the first time confirmed that major target protein of the tyrosine nitration is β2-tubulin and, furthermore, Tyr 106 and Tyr 340 are specifically undergone nitration modification. Conclusions:Present study provides the first evidence that the tyrosine nitration of β2-tubulin could be a novel mechanism involved in the NO-mediated cardiac differentiation in P19CL6. Key words:p19cl6, Nitric oxide, Cardiac differentiation, tyrosine nitration, beta2-tubulin This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

190 Ⅰ. 연구보고 179 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 TGF-β에 의한 cardiac remodeling의 기전 연구를 통한 심부전 억제제 개발 국립보건연구원 생명의과학센터 난치성질환팀, 가톨릭대학교 생명공학과 1, 고려대학교 생명공학원 2 임중연, 박성준, 황하영, 박은정, 남재환 1, 김준 2, 박상익 목 적 : 심장근육세포의 remodeling 과정 중 하나에 속하는 심비대증 (hypertrophy)은 심부전증 진행과정 중 수반되는 중요한 특징 중 하나이다. 본 연구에서는 multifunctional cytokine인 TGF- β 에 의한 심비대증 유도과정에 관련된 새로운 신호전달 인자를 탐색하고 그 기능을 밝힘을 목적으로 하 였다. 방 법 : TGF- β에 의한 심비대증 유도과정 중 ATF2의 관련성을 확인하기 위해 ATF2의 활성화정 도를 조사하고, ATF2의 활성억제유전자에 의한 심비대증 유도변화를 비교하였다. 또한 ATF2의 상위 조절인자를 inhibitor처리를 통한 활성억제실험과 kinase assay를 통해 조사하고, 이 상위조절인자 에 의한 심비대증 유도조절을 관찰하였다. 결 과 : TGF- β에 의한 심비대증 발생시 ATF2가 활성화되며, 이를 억제시켰을 때 심비대증 유도 가 저하됨을 확인하였다. 이러한 ATF2의 활성에 PKC가 관여함을 확인하였고, 이것이 TGF- β에 의 한 TAK1-MKK3/6-p38MAPK-ATF2 신호전달 기전의 활성화에도 관여함을 확인하였다. 또한 PKC inhhibitor 처리시 심비대증 표지인자의 발현과 promoter 활성이 억제됨을 확인함으로써 PKC가 TGF- β에 의한 심비대증 유도에 중요하게 작용함을 알 수 있었다. 결 론 : TGF- β는 심근세포에서 TAK1-MKK3/6-p38MAPK-ATF2로 이어지는 신호전달기전을 통하 여 심비대증을 유발할 수 있으며, 이 기전에는 PKC가 중요한 상위조절인자로 작용함을 알 수 있다. 중심단어 : Cytokine, 심비대증, 심근세포, 단백질 인산화 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임. 학회지 게재 : J Mol Cell Cardiol. 39(4):627-36, 2005

191 180 국립보건연구원보 TGF- β induces cardiac hypertrophic responses via PKC-dependent ATF2 activation J.Y. Lim, S.J. Park, H.Y. Hwang, E.J. Park, J.H. Nam 1, J. Kim 2 and S.I. Park Division of Intractable Diseases, Department of Biomedical Sciences, NIH, Seoul Korea, Division of Biotechnology, Catholic Seoul University, Bucheon, Gyeonggi-do, Korea 1 Laboratory of Biochemistry, School of Life Sciences and Biotechnology, Korea University, Seoul Korea 2 Purpose:Despite several reports, the effects of exogenous TGF-beta on cardiac hypertrophy and associated signaling mechanisms have not been demonstrated directly. In this study, we investigated the potential involvement of protein kinase C and activating transcription factor-2 in TGF-beta1-induced cardiac hypertrophic responses in cultured neonatal rat ventricular cardiomyocytes. Methods:Primary cultures of cardiac myocytes were prepared from ventricles of neonatal rat hearts. Hypertrophic marker genes were analysed to examine hypertrophic responses. Immunoblotting and Luciferase assay were used for examination of protein activation. Results:TGF-beta1 treatment induces ATF2 activation through the TAK1-MLL3/6-p38MAPK signal transduction pathway, and that activated ATF2 plays a functional role in TGFbeta1-induced hypertrophic responses in neonatal rat ventricular myocytes. PKC was found to be involved throughout the signaling system, and it was shown that it acts by mediating upstream TAK1 activation and leads to ATF2 activation. PKC-dependent ATF2 activation was shown to be involved in TGF-beta1-induced cardiac hypertrophic responses. Conclusions:Our results suggest that PKC is involved in TGF-beta1-induced cardiac hypertrophic responses and that ATF-2 activation plays a role. Key words:cytokine, hypertrophy, myocyte, protein phosphorylation This study was supported by the grant of the National Institute of Health, Korea This study was printed in J Mol Cell Cardiol. 39(4):627-36, 2005 The Report of National Institute of Health 42, , 2005

192 Ⅰ. 연구보고 181 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 The role of ERK1/2 activation in the infection of HeLa cells with human coxsackievirus 국립보건연구원 생명의과학센터 난치성질환팀, 성균관의대 삼성서울병원 심혈관센터 1, 가톨릭대학교 생명공학과 2 정선구, 김주영, 황하영, 전은석 1, 임병관 1, 남재환 2, 박상익 목 적 : 심근염을 일으키는 바이러스 중의 하나인 coxsackievirus B3 (CVB3)는 감염시 biphasic mode - early phase에 transient 하게 그리고 이후에 오래 동안 지속되는- 로 ERK1/2를 활성화 (인산화) 시키는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 숙주세포로 바이러스가 침투해 들어갈 때 및 바 이러스 복제시, ERK1/2 활성화의 역할을 탐색해 보고자하며, 또한, ERK1/2의 활성화에 의해서 영향 을 받는 유전자들을 조사해 보고자 하였다. 방 법 : ERK1/2 inhibitor인 PD98059의 처리를 통해서 early phase 및 late phase의 지속적인 ERK1/2의 활성화가 각각 virus entry 및 바이러스 복제에 어떻게 관여하는 지를 살펴보았다. 또한, ERK1/2의 활성화를 통해서 발현의 조절을 받는 유전자를 알아보기 위하여 cdna chip을 이용하여 PD98058의 처리 유무에 따라 CVB3 감염시 발현되는 유전자들을 분석하였다. 결 과 : 초기의 ERK1/2 활성화는 최소한 virus entry에는 관여하지 않지만, 말기의 활성화는 virus replication에 관여함을 알 수 있었다. cdna 분석결과, PD98059 처리 유무에 따른 early phase (10 min post infection) 및 late phase (9 h post infection) 의 발현의 차이를 보이는 유전 자들이 각각 15 vs 77 및 347 vs 91으로 나타났다. 결 론 : Biphasic 하게 조절되는 ERK1/2 활성화는 CVB3 감염과 관련하여 각각 다른 역할을 담당 할 뿐 만 아니라 이들의 활성화는 숙주세포의 여러 다른 유전자들의 발현에도 각각 다르게 작용함을 알 수 있었다. 중심단어 : coxsackievirus B3, cdna microarray, ERK1/2 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임. 지원 과제명 : Coxsackievirus에 의한 cell death 기작 연구 학회지 게재 : Acta virology 49: (2005)

193 182 국립보건연구원보 The role of ERK1/2 activation in the infection of HeLa cells with human coxsackievirus S.K. Chung, J.Y. Kim, H.Y. Hwang, E.S. Jeon 1, B.K. Lim 1, J.H. Nam 2, S.I. Park Division of Intractable Diseases, Department of Biomedical Sciences, NIH, Seoul Korea, Department of Medicine, School of Medicine, Cardiac and Vascular Centers, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University, Seoul Korea 1, Division of Biotechnology, Catholic University, Bucheon, Gyeonggi-do, Korea 2 Purpose : Human coxsackievirus B3 (CVB3) is known to trigger in host cells biphasic activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2); i.e., early transient and late sustained activation. In this study, we explored (i) the role of ERK1/2 activation in virus entry into cells and virus replication and (ii) cellular genes influenced by this activation in CVB3-infected HeLa cells. Methods : Pretreatment of the cells with an ERK1/2 inhibitor, PD98059 showed that early transient ERK1/2 activation is not be related to virus entry, but late sustained ERK1/2 activation plays a role in virus replication. To identify which cellular genes are influenced by the ERK1/2 activation after virus infection, cdna microarray analysis was performed. Results : In HeLa cells pretreated with PD98059 and then infected with the virus, the number of influenced cellular genes were higher compared to that in infected cells not pretreated with the inhibitor (15 vs 77 at 10 mins post infection (p.i.) and 347 vs 91 at 9 hrs p.i.) Conclusions : The early transient ERK1/2 activation is apparently not related to virus entry into cells, but the late sustained ERK1/2 activation plays a role in virus replication. Many cellular genes are influenced by the late ERK1/2 activation. However, some cellular genes influenced by CVB3 infection are not related to the ERK1/2 activation. Thus the virus infection affected several host genes through ERK1/2 activation. Key words : coxsackievirus B3 (CVB3), ERK1/2, cell death This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea Supported original title : A study on the mechanism of cell death induced by Coxsackievirus This study was printed in Acta virology 49: (2005) The Report of National Institute of Health 42, , 2005

194 Ⅰ. 연구보고 183 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 Coxsackievirus and adenovirus receptor(car)와 coxsackievirus의 결합을 방해하는 DNA vaccine 개발 국립보건연구원 생명의과학센터 난치성질환팀 1, 성균관의대 삼성서울병원 심혈관센터 2, (주)ViroMed 기술영업팀 3,가톨릭대학교 생명공학과 4 김주영, 전은석 1, 임병관 1, 김선미, 정선구, 김종묵 2, 박상익, 조인호, 남재환 3 목 적:Coxsackievirus (CVB3)는 심근염을 일으키는 바이러스중의 하나로서 궁극적으로 박리형 심 근증 (DCM)을 초래하는 것으로 알려져 있다. 임상 적용을 위한 vaccine이 개발되지 않은 상태에서 본 연구는 CVB3에 대한 DNA vaccine을 개발하는 데 초점을 두었다. 방 법:CVB3 의 capsid proteins (VP1, VP3)을 coding 하고 있는 4개의 recombinant plasmid를 제작하여 electroporation 방법을 이용하여 BALB/c mice의 우측 대퇴부에 2주 간격으로 주입하였 다. 주입 후 28일째 혈액을 채취하여 항체 생성 여부를 western blotting으로 확인하였다. 또한 42 일째 CVB3를 감염시키고 최종 88일째 mice의 생존율을 산출하였다. 결 과:VP1, VP3, VP1-1, VP1-2 모두 각각의 해당 단백질에 대한 특정 항체들의 생성을 유도하 였으며, VP1-1(12.5%)을 제외한 나머지들은 42%-75% (p<0.05)의 범위의 유의한 생존율을 보여주었 다. 또한 이들은 CVB3 감염으로 인한 심근세포의 손상을 억제하는 것으로 나타났다. 결 론:본 연구 결과에 기초해 볼 때, CVB3 감염에 대한 DNA vaccine 개발의 가능성을 제시해 주며, 특히 VP1 및 VP3에 대한 vaccine이 유용한 후보일 것으로 사료된다. 중심단어:Coxsackievirus B3, DNA vaccine, 심근염 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임. 학회지 게재:2005년, Vaccine, 23:

195 184 국립보건연구원보 Immunogenicity of a DNA vaccine for coxsackievirus B3 in mice : protective effects of capsid proteins against viral challenge J.Y. Kim, E.S. Jeon 1, B.K. Lim 1, S.M. Kim, S.K. Chung, J.M. Kim 2, S.I. Park, I.H. Jo and J.H. Nam 3 Division of Intractable diseases, Department of Biomedical Sciences, NIH, Seoul Korea 1, Department of Medicine, School of Medicine, Cardiac and Vascular Center, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University, Seoul Korea 2, ViroMed Limited, Technology Business Incubator, Seoul Korea 3, Division of Biotechnology, Catholic University, Bucheon, Gyeonggido 4 Purpose:Coxsackievirus (CVB) 3 induces viral myocarditis and ultimately dilated cardiomyopathy (DCM). However, there is no vaccine in clinical use. Methods:We constructed recombinant CVB3 plasmids using a highly effective mammalian expression vector and evaluated their immunogenicity in vivo on the basis of survival rate. Four recombinant plasmids were constructed, which encode CVB3 capsid proteins (VP1 or VP3) or VP1 partial proteins (VP1-1 or VP1-2), and used to immunize BALB/c mice by electroporation. Although VP1, VP3, VP1-1, and VP1-2 induced specific antibodies against the corresponding proteins in mice, neutralizing antibodies were not present in the sera. Results:These recombinant plasmids, except VP1-1 (12.5%), dramatically increased the survival rate in mice at 46 days after challenge ( %, p<0.05). VP3 (75.0%) protected mice against viral infection and the middle regions of VP1 (VP1-2, 50.5%) conferred a protective effect like that conferred by VP1 (42.9%), suggesting that the epitopes in VP3 as well as in the middle of VP1 protect against CVB3 infection in vivo. Conclusions:Some recombinant CVB3 plasmids used in this study reduced the destruction of myocytes and improved the survival rates in mice immunized and challenged compared with the control. Thus, pca-vp3 as well as pca-vp1 are good candidates for a CVB3 DNA vaccine. Key words:coxsackievirus (CVB)3, DNA vaccine, VP(viral protein) This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea Supported original title : Development of DNA vaccine that interrupts the binding between CAR(coxsackievirus and adenovirus receptor) and coxsackievirus. This study was printed in Vaccine Feb 25;23(14): The Report of National Institute of Health 42, , 2005

196 Ⅰ. 연구보고 185 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 알츠하이머 치매의 증상 심화에 따른 Rab6 발현의 증가 국립보건연구원 생명의과학센터 뇌질환팀, 을지대학교 의과대학 1 채산숙, 백태경 1, 안상미 목 적 : 치매의 원인질환으로는 여러 가지가 있으나 알츠하이머성 치매 (Alzheimer's disease, AD) 가 약 50%를 차지한다고 보고되어 있다. Amyloid peptide (Aβ1-40, 42, 43)는 AD 환자의 뇌에 나타 나는 노인반의 주성분으로, amyloid precursor protein (APP)이라는 단백질의 절단에 의해 생성된 펩타 이드이다. APP processing이 세포내 Golgi/ER, 세포막 사이에 trafficking과정에서 조절될 것이라는 보 고와 Rab6가 관여한다는 보고가 있어 AD 환자의 뇌에서의 Rab6의 발현을 조사하고자 하였다. 방 법 : AD와 Rab6 발현과의 연관성을 조사하기 위하여 AD 환자의 뇌조직 (초기, 중기, 말기 환 자)을 anti-rab6 항체를 사용하여 면역조직염색법으로 조사하였다. 결 과 : Rab6의 면역염색이 정상인의 뇌에서는 hippocampus CA2, CA3, basal forebrain cholinergic neuron에서 약하게 staining 되었으나 CA1에서는 거의 나타나지 않았다. 초기 AD 환자 의 뇌에서는 CA1에서 약하게 염색이 되는 것을 볼 수 있었고 치매의 정도가 심해지는 환자의 뇌에서 염색 정도가 점점 증가하는 것을 볼 수 있었다. 다른 CA2, CA3, basal forebrain cholinergic neuron에서도 CA1에서와 비슷하게 치매의 정도가 심해지면서 염색이 증가하였다. 결 론 : 따라서 본 결과로부터 Rab6의 발현이 AD발병과 연관성이 있음을 확인할 수 있었다. 중심단어 : 알츠하이머 치매, Rab6, 면역염색 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임. 지원과제명 : RAB6와 알츠하이머치매 발병과의 연관성 연구

197 186 국립보건연구원보 The expression of Rab6 protein is increased in AD brain S.S. Chae, T.K. Baek 1 and S.A. Jo Division of Brain Diseases, Center for Biomedical Sciences, NIH, Seoul Korea, School of Medicine, Eulji University, Dae-jeon, Korea 2 Purpose:Alzheimer's disease is the most popular type of dementia. Amyloid peptide (Aβ40, 42, 43) is a major component of senile plaque, a hallmark in AD brain and synthesized by proteolytic cleavage from amyloid precursor protein(app). It has been reported that APP processing is regulated by vesicle trafficking among Golgi, ER, and plasma membranes and by Rab6, a protein involved in transport route from the Golgi back to the ER. In the present study, the protein expression of Rab6 in AD brain was investigated. Methods:The immunostaining of Rab6 protein in AD brain was performed using anti-rab6 antibody. Sections were prepared from the AD brain stored in 4% paraformaldehyde. Results:The immunoreactivity of Rab6 in hippocampus, CA2, CA3, basal forebrain cholinergic neruron in normal brains was almost not detectable. In contrast, the immunoreactivity in brains from early stage AD was weak but increased in moderate and severe patients and all the areas examined in all area examined. Conclusion:Rab6 protein level is likely to be associated with AD pathogenesis. Keywords:Alzheimer s disease, Rab6, immunostaining, membrane trafficking This study was supported by the intramural grant from National Institute of Health, Korea Supported original title : Study on the relations between RAB6 and Alzheimer's disease The Report of National Institute of Health 42, , 2005

198 Ⅰ. 연구보고 187 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 베타 아밀로이드 펩타이드 (β-amyloid peptide)를 분해하는 Streptomyces sp. KK565 aminopeptidase (SKAP)의 작용기전 연구 국립보건연구원 생명의과학센터 뇌질환팀 유철배, 안경숙, 안상미 목 적:알츠하이머 (Alzheimer's disease; AD) 치매의 특징적 증상의 하나는 베타 아밀로이드 펩 타이드(Aβ)가 뇌에서 축적, 응집됨으로서 플라크가 형성되어 신경의 퇴행과 사멸을 유발하는 것이 다. 치매증상을 완화시키고 치료하기 위한 한 방법은 Aβ의 응집을 저해하고 응집된 Aβ를 효과적으 로 제거하는 것이다. 본 연구실에는 미생물에서 찾아낸, Aβ의 응집을 감소시키는 단백질의 유전자를 클로닝하였는데 (Streptomyces sp. KK565 aminopeptidase, SKAP) 이 재조합 단백질을 제작하여 그 생화학적 기전을 밝히고자 하였다. 방 법:E. coli에서 발현시킨 SKAP (69~351 a.a.) 단백질을 정제하여 그 특징을 조사하고 MALDI-TOF를 이용하여 Aβ의 절단 위치를 확인하였다. Congo Red, Thioflavin-T assay를 이용 하여 Aβ의 응집에 미치는 SKAP의 영향을 조사하였다. Aβ에 의한 신경독성에 미치는 SKAP의 영 향은 SH-SY5Y neuronal cell을 사용하여 alamarblue로 측정하였다. 결 과:본 연구실에서는 Streptomyces sp. KK565에서 얻어진 media에서 aggregation된 Aβ를 줄이는 물질이 단백질임을 확인하였고 이 단백질의 유전자를 클로닝하여 SKAP라 명명하였다. SKAP 의 단백질의 분자량은 약 50 kda이나 단백질 발현이 잘 안되어 효소활성 domain을 포함하는 아미 노산 69~351에 해당하는 DNA sequence (약 30 kda)를 pet26b vector에 클로닝한 후 E.coli에서 발현시키고 Ni-NTA column affinity chromatography로 정제하였다. 이 효소는 Straptomyces griseus나 Streptomyces fradia에서 발견된 metallopeptidase family인 M28 domain을 갖고 있으 며, 두 종에서 밝혀진 염기서열과 비교해 보았을 때 80% 이상의 높은 유사성이 있다는 것을 확인할 수 있었다. SKAP의 효소 활성을 L-Leucine p-nitroanilide을 기질로 사용하여 측정 시, Ca2 + 에 의 해 증가하며 EDTA나 EGTA 또는 1,10-phenanthroline에 의해서 억제되었다. 또한 ph 8.0 이상의 염기성 용액에서 높은 활성을 나타내었다. 이 효소의 Aβ의 응집억제 기전을 이해하기 위하여 MALDI-TOF를 분석을 수행하였는데 SKAP는 Aβ40과 Aβ42의 N-말단 염기서열 7번째 아미노산까 지 분해하였고, 신경세포에 첨가된 응집 Aβ에 의한 신경독성을 저해하였다. 결 론:Streptomyces sp. KK565에서 분리한 aminopeptidase인 SKAP는 M28 domain을 갖는 효 소로서 Aβ의 응집을 억제하고 Aβ에 의한 신경독성을 감소시키고 Aβ의 N-말단 염기서열 7번까 지 절단함을 확인하였다. 따라서 이러한 SKAP의 응집억제 및 신경독성억제 효과는 SKAP가 Aβ를

199 188 국립보건연구원보 분해함으로서 Aβ의 응집을 억제하고 따라서 신경독성도 저해시키는 것으로 추정되었다. Aβ를 분해 하는 새로운 효소의 발견은 앞으로 치매 치료제 개발을 위한 연구에 기여할 것으로 기대된다. 중심단어 : Alzheimer's disease, beta amyloid peptide, aminopeptidase 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임. 지원과제명 : 아밀로이드 분해에 작용하는 새로운 효소의 클로닝과 그 작용기전에 관한 연구

200 Ⅰ. 연구보고 189 서 론 노인성 치매란 뇌의 기능 저하로 발생하는 질환으로서 대개는 만성적이고 퇴행성으로 나 타나며 기억력 뿐 만 아니라, 사고력, 이해력, 판단력, 학습능력, 언어능력 등에 장애가 나타 난다. 치매의 원인질환으로는 여러 가지가 있으 나 알츠하이머성 치매가 약 50%를 차지하고 혈 관성 치매가 약 30%를, 기타원인에 의한 치매 발생이 약 20%를 차지한다. 대표적 치매의 원 인 질환의 하나인 알츠하이머 질환(Alzheimer's Disease, AD)은 기억, 인지기능과 관련된 해마 와 대뇌피질 신경세포의 심각한 소실이 발견되 며, amyloid plaque, neurofibrillary tangle이라는 병리적인 현상을 특징으로 한다. 알츠하이머병의 발병요인으로는 amyloid precursor protein (APP), apolipoprotein E (ApoE), presenilin 및 α2-macroglobulin 등의 유전자 변이가 보고 되었으나 실제로 노인성 치매환자들 중 이러한 유전자들의 변이를 수반하는 경우는 약 10% 미 만이다. 따라서 이러한 위험 유전자변이 외에 다른 원인이 있을 것으로 추정되는데 아직 정 확한 원인은 밝혀지지 않고 있으나 amyloid plaque의 주성분인 beta-아밀로이드 펩타이드(A β)의 과다 생성으로 인한 신경조직에의 축적 이 알츠하이머병의 발병과 긴밀한 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 아직까지 Aβ의 생성기전 은 확실히 밝혀져 있지 않으나 amyloid precusor protein이 γ-secretase와 β-secretase에 의해 절 단되어 세포 밖으로 분비되어 세포밖에 침착되 는 것이다. 즉, 세포밖에 축적된 불용성의 Aβ 가 세포내에 산화적 스트레스를 유발하여 세포 독성을 야기하는 것으로 알려져 있으며 Aβ의 초기응집형태인 protofibrills이 pathogenic 하다는 보고도 있다. 또한 최근의 연구에 의하면 Aβ 의 세포내 축적도 세포 독성을 유발하는 것으 로 보고되었다 (reviews; Gouras et al., 2005, Vetrivel KS and Thiakaran G., 2006). 최근까지 아밀로이드 펩타이드를 분해하는 것 으로 알려진 효소 단백질로서는 neprilysin (Iwata et al., 2000), IDE (insulin degrading enzyme, Farris et al., 2003), ECE (endothelin- converting enzyme, Eckman et al., 2003) 등이 있으며 이들 효소 단백질들은 대부분 Zinc-metalloprotease로서 M-14 family protease에 속한다. Neprilysin의 경 우 Swedish mutant APP 과발현 치매마우스와 neprilysin knock out 마우스의 교배를 이용한 in vivo 연구를 통하여 neprilysin이 뇌에서 아밀로 이드 펩타이드를 분해하는 기능이 있음을 보여 주었다 (Iwata et al., 2001, 2005). 앞서 말했듯이 aggregation된 Aβ의 생성억제 또는 분해하는 물질을 찾기 위하여 우리는 2000 종의 미생물 대사산물을 Congo Red와 Thioflavin T assay로 screening 하였고, 토양 미생물인 S. sp. KK565의 대사산물 중 water-soluble 층에서 효과가 있는 물질을 분리할 수가 있었다 (Hwang et al. 2003). 이 과정에서 우리는 얻어 진 물질이 amino- peptidase라는 것을 확인하였 고, molecular cloning, purification, 그리고 characterizaton을 통해서 물질을 규명하였다. Aminopeptidase는 면역반응 (inflammation), 암 (cancer), 백내장 (cataract), 발작 (stroke), 당뇨 병 (diabetes), 그리고 HIV 감염과 같은 많은 비 정상적 반응들에서 중요한 위치를 차지하고 있 다. 그러나 아직 이런 효소들은 그 특징이 많이 규명되어있지 않은 상태이다.

201 190 국립보건연구원보 가. 미생물 배양 재료 및 방법 종균은 TSBY media(3% triptic soy bean, 0.5% yeast extract, 1.75% dextrose, 1% soluble starch) 에서, E. coli(bl-21)은 TB media(3% triptic soy bean, 2.4% yeast extract)에서 3일 동안 30, 150RPM에서 배양하였다. 나. Αβ aggregation 측정 Congo red assay:assay buffer (150 μ M NaCl, 50 μ M Tris-HCl, ph 8.0)에 Congo red 를 25 μ M이 되도록 녹여서 침전물이 없을 때까 지 섞어주고, pyrex glass filter를 사용하여 걸 러준 후 사용하였다. Assay buffer 192 μ l 와 sample 8 μ l를 96 well plate에 넣어준 후 30분 동안 반응시키고, 540nm와 480nm에서 각각 흡 광값을 측정하여 aggregated Αβ의 값을 측정 하였다. Congo red에 결합한 양은 Cb ( μ M ) = ((A540 x 25295) (A480 x 46306)) x 106 이었다. Thioflavin-T assay: 50 μ M Tris-HCl buffer, ph 8.0에 Thioflavin-T를 30 μ M이 되도록 넣어준 후 사용하였다. Assay buffer 95 μ l 와 sample 5 μl 를 96 black well plate넣어준 후 Ex=450nm, Em=482nm에서 바로 측정하였다. 다. SKAP의 sequencing/cloning Inverse PCR에 의한 염기서열을 결정하고 염 기서열로부터 다시 primer를 작성하여 PCR를 이용하여 cloning 하였다. 2 μ g의 genomic DNA 를 제한효소인 BamHI, KpnI, PvuⅡ로 절단하 여 agarose gel 전기영동을 진행해서 fragmentation을 확인하였다. 절단된 total DNA의 phenol/ chroloform extraction과 ethanol precipitation 단계를 거친 후, 순수 정 제된 DNA pellet을 100 μ l ligation mix에 녹여 에서 overnight 배양하고, 5 μ l ligation mixture의 Inverse PCR과 PCR 실험을 수행하 였다. Reaction mixture는 10 EF-Taq buffer 5 μ l, 10 mm dntp mix 1 μl, forward primer(10 pmole/μl) 2 μ l, reverse primer (10 pmole/ μ l ) 2 μl, 5 DMSO 1-20 μl, template 5 μl, ddh2o up to 50 μ l이다. cycle의 온도는 predenaturation 95 /2 minutes, denaturation 9 5 /20 seconds, annealing 60 /40 seconds, extention 68 /5minutes(30 cycles), final extention 72 /10 minutes의 조건에서 실험 수 행하였다. 라. SKAP의 단백질 발현을 위한 pet-26b(+) vector로의 subcloning pqe-32에 cloning되어 있는 SKAP를 배지로 secretion하는 pelb leader 염기 서열이 있는 pet-26b(+)로 subcloning 하였다. SKAP와 pet-26b(+)의 염기 서열을 포함하고 있는 2개 의 primer (SKAP-4: 5 -GGCCATGGATGCGCC CGACATCCCCG-3, SKAP-5: 5 -GGCTCGA GCGTGGGCGGTTCCGTATC-3 )를 합성하여 PCR을 수행하였다. Reaction mixture는 10 rtaq buffer 2 μ l, SKAP-4 primer (10 pmole/ μl ) 1 μl, SKAP-5 primer (10pmole/ μl )1 μl, template (100 ng/ μ l ) 1 μl Taq polymerase (5unit/ul) 0.2 μ l 를 넣고 ddh2o을 넣어 20 μl 로 맞추었다. cycle의 온도는 pre-denaturation 9 5 /5 minutes, denaturation 94 /45 seconds, annealing 59 /45 seconds, extension 72 /80 seconds (25 cycles), final extension 7 2 /10 minutes의 조건에서 실험 수행하였다. 2 μ g의 SKAP PCR product와 pet-26b(+)를 제한 효소 Nco I, Xho I으로 절단하여 agarose gel 전기영동으로 확인 후 두 fragment를 ligation 하였다. Ligation된 DNA는 E. coli DH5α로 형질 전환하였다. plasmid를 minipreparation한 후 subcloning시 사용한 primer로 PCR하고 제한 효소 Nco I, Xho I으로 절단하여

202 Ⅰ. 연구보고 191 agarose gel 전기영동으로 확인 후 Insert를 확 인하였다. 또한 최종적으로 sequencing하여 SKAP 의 염기서열과 재조합 SKAP 단백질의 생성이 가 능한 open reading frame을 확인하였다. 마. 재조합 단백질 (AKAP30)의 발현 및 정제 재조합 단백질 발현:단백질 발현을 위해 E. coli strain XL1-Blue MRF 과 BL21(DE3)pLys 를 사용하였다. TY media (3% triptic soy bean, 2.4% yeast extract) (+Kan)에서 30, 150 RPM 에서 1시간 동안 배양한 후 1 mm IPTG를 첨 가하여 induction 시키고 같은 조건에서 15시간 동안 더 배양하였다. 배양액과 cell extract의 효 소 활성을 측정을 통해 배양액에 다량의 활성 단백질이 포함되어 있음을 확인하였다. 정제:Ni-NTA column(1.7x5cm)을 column volume(cb) 5배의 loading buffer(50 mm Tris-HCl, ph 8.0)로 안정화 시킨 후 sample을 loading하였다. 이때 column의 flow rate는 1 ml/min의 속도를 유지하였 다. Sample loading이 끝난 후 다시 CB 5배의 loading buffer로 washing해준 후 2 mm imidazole이 들어있는 buffer (50 mm Tris-HCl, ph 8.0)와 20 mm imidazole이 들어있는 buffer를 각각 CB의 3배 loading하여 non-specific 단백질을 제거해주었다. 마 지막으로 250mM imidazole이 들어있는 buffer로 elution하였다. 바. 효소활성 측정 및 단백질 정량 효소의 활성 측정은 L-Leucine p-nitroanilide (Leu-pNA)를 기질로 이용하여서 측정하였다. 1 mm CaCl2, 1 mm Leu-pNA을 포함한 50mM Tris-HCl buffer 90μl를 96-well plate에 넣은 후 sample을 10μl 넣고 상온에서 섞은 후 405nm 의 흡광에서 변하는 값을 측정하였다. 효소활성 측정은 각 sample당 두 번씩 실행하였다. 각 과 정에서 단백질의 정량은 Bovine Serum Albumin (BSA)를 standard로, Bradford reagent (Biorad)를 사용하여서 결정하였다. 사. MALDI-TOF 분석 Αβ의 Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight(maldi-tof) 분석은 Applied Biosystems Voyager-DE STR을 사용하였으며 10-20μl의 반응액 중에서 1μl를 취하여서 crystallization matrix (500μl의 acetonitrile, 500μ l의 0.1%(v/v) trifluoroacetic acid, 10mg α -Cyano-4-hydroxycinnamic acid(chca))와 sample 을 9:1의 비율로 섞어주고 1μl를 matrix에 붙이 고 완전히 말린 후 측정하였다. protein의 분자 량을 측정할 때에는 CHCA 대신 Sinapinic acid crystallization matrix (300 ul의 acetonitrile, 700 μl의 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid에 10 mg Sinapinic acid)를 사용하였다. 결과는 Voyager- DE PRO mass spectrometer (Applied Biosystems, Japan)의 software를 이용하여 기록하였다. MALDI-TOF를 이용하여 얻어진 peak는 data base로부터 molecular mass를 이용해 잘려지는 염기의 위치를 확인하였다. 아. 신경 모세포종 세포주 배양 및 독성 측정 실험에 사용할 세포는 사람의 신경조직을 얻 을 수 없으므로 human neurblastoma cell line인 SH-SY5Y cell(atcc number : CRL-2266)을 이용하 였다. SH-SY5Y cells은 fetal bovine serum(10%), penicillin(100 units/ml), streptomycin(100μg/ml)을 함유하는 Dulbeco's modified Eagle's medium (Gibco-BRL) 배지에서 37, 95% air-5% CO 2 조 건에서 배양하였다. 2~3일 동안 48-well plate에 서 키운 세포의 배지를 제거하고 응집된 Αβ 1-42 (1μM)를 넣어 한 시간 동안 반응시킨 후 Αβ1-40 (30μM Αβ40 Biosource Inc., USA) 를 포함하는 배지(0.4 ml/well)로 교환하였다. 37 에서 3일간 배양한 후 alamarblue (Biosource Inc., USA)용액을 배양 배지로 10배 묽힌 용액 을 한 well 당 0.2 ml을 넣고 37 에서 3~5시간 반응 시킨 후 FLx800 Microplate Fluorescence Reader(Bio-Tek Instruments, Inc., USA)를 사용 하여 형광을 측정하였다 (excitation, nm; emission, 590 nm). 자. Analytical methods

203 192 국립보건연구원보 12% NuPage Bis-Tris gel (Invitrogen) 또는 16-20% tris-tricine gel (Αβ 분석시)을 사용하 여 100V에서 전기영동 하였다. 전기 영동된 단 백질은 nitrocellulose (NC) membrane에 transfer 시 킨 후 5% non-fat dry milk와 TBS/Tween 20에서 30분간 blocking시켰다. 일차 항체 (6E10, 4G8, anti-skap antibody), 이차 항체(horseradish peroxidase-conjugated Ig anti-mouse(or rabbit) antibody) 와 반응시킨 후 enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham Bioscences)를 사용하여 antigen을 확인 하였다. 결 과 가. 활성 단백질의 cloning 및 재조합 단백질 의 분리 및 정제 생리활성을 갖는 것으로 추정되는 N-term- APDIPVANVK TEPP-C-ter 의 SKAP 30 kda 에 해당되는 부분을 TOPO-PCR 2.1 vector에 cloning하여 sequence를 확인하였다. 또한 30 kda 에 해당되는 부분인 951 bp를 N-terminal 6 His tag constructs를 포함한 pqe 32, (Type Ⅳ) 에 cloning하여 단백질을 발현시켰으나 inclusion body를 형성하여 soluble한 SKAP를 얻을 수 없었다. 이후에 배지로 secretion하는 pelb leader 염기 서열 이 있는 pet-26b(+)로 subcloning 하여 발현된 단 백질을 Ni-NTA affinity column으로 정제하였다. 활성이 있는 각각의 fraction은 12.5% SDS-PAGE 를 이용하여서 전기영동 하여 Coomassie staining 으로 정제된 SKAP band를 확인할 수 있었고, 이 부분을 dialysis한 후 농축하였다. 최종 농축된 단백질 농도는 약 μg/ml 정도였다. Original media와 각각의 imidazole 농도별 fraction, 최종으로 얻어진 SKAP sample을 전기영동 하여 coomassie로 staning하고 (그림 1A). Anti-(His)6 rabbbit antibody (1:1000)확인 하였다 (그림 1B, C). Table 1. The purification of SKAP. Crude Flow through 250mM IDZ Total Volume (ml) Total Protein (mg) recombinant SKAP. (A) Coomassie-stained SDS gel. (B) Immunoblot with anti-his tag antibody. (C) Immunoblot with anti-skap tag antibody. Lanes: M, molecular weight marker (pre-stained protein ladder); 1, Ni-NTA column load; 2, Ni-NTA flow-through; 3, buffer wash; 4, 2mM imidazole; 5, 20mM imidazole; 6, 250mM imidazole fractions. 나. 효소의 활성 및 저해 SKAP의 활성 측정은 Leu-pNA를 substrate로 사용하여 측정하였다. Leu-pNA가 1분 동안 1 μmol의 기질이 생성된 정도를 1 Unit으로 정 하였다. 배양 배지를 Ni-NTA column에 통과시켜 50배의 purification fold와 45%의 yield를 얻었다 (표 1). 405 nm에서 p-nitroanilide의 extinction coefficient = 10.8 이었다. Total Activity (U) Figure 1. SDS-PAGE and immunoblot of

204 Ⅰ. 연구보고 193 저해제와 cofactor들이 SKAP활성에 미치는 영 향을 조사하기 위하여 aminopeptidase의 inhibitor 인 p-phenanthroline과 cofactor로 알려진 CaCl 2 의 SKAP 활성에 대한 효과를 조사하였다. 상 온에서 동일한 조건하에 p-phenanthroline의 농 도가 10 μ M일 때 활성이 50% 정도 감소하는 것을 확인할 수 있었고, 100 μm 이상의 농도 에서는 활성이 거의 나타나지 않았다 (그림 2A). CaCl 2의 경우에는 Ca 2+ 의 농도가 2 mm 이상일 때 활성이 가장 좋았고, 100 μm일 때 50% 정도의 활성을 나타내었다 (그림 2B). Ca 2+ 이 SKAP에 끼치는 영향을 확인하기 위 하여 1 mm의 CaCl 2와 SKAP가 포함된 반응액에 EGTA의 농도를 증가시키며 활성을 측정하였 다. EGTA의 농도가 1 mm일 때 활성이 50% 감소하였고, 2 mm일 때 90% 까지 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (그림 2C). EDTA를 이용한 동일한 실험에서도 EGTA와 같이 비슷 한 실험결과가 나왔다 (data not shown). ph에 대한 SKAP의 활성은 ph가 8.0 일 때 가장 높 았으며, ph가 7.0보다 낮은 산성인 경우 활성이 급격하게 줄어들었다 (그림 2D). 이상의 실험으 로서 SKAP는 ph 8.0 이상의 염기성인 조건에 서 Ca 2+ 와 같은 cofactor가 존재할 때 가장 높 은 활성을 나타냄을 알 수 있었다. (A) (B) (C) (D) Figure 2. Effects of aminopeptidase inhibitors and cofactors

205 194 국립보건연구원보 다. MALDI-TOF를 이용한 분석 정제된 SKAP의 정확한 MW을 측정하기 위하 여 SKAP 1μl와 Sinapinic acid 9μl를 섞어준 후 1μl를 plate에 loading하고, 완전히 말린 후 MALDI-TOF를 사용하여 측정하였다. 분석 범위는 10 kda에서부터 40kDa까지였으며, 30 kda 부 분에서 main peak와 15 kda 부분에서 half peak 를 확인되었다. 이로부터 SKAP의 MW이 30kDa 임을 확인할 수 있었다 (그림 3). Figure 3. Molecular weight of the SKAP (MALDI-TOF) SKAP에 의한 Αβ분해 산물을 확인하기 위 하여 150μM의 Αβ40또는 Αβ42를 반응시켜 시간별로 측정하였다 (그림 4). 나타나는 peak 의 MW은 ExPASy의 FindPept tool을 사용하여 서 Αβ의 염기서열에서 분해되는 위치를 분석 하였다. 초기 1시간동안 Αβ42의 분해 결과 나 타나는 peak는 N-terminal의 말단 염기인 D (Aspartic acid)가 없어진 크기의 peak 이었다. Αβ40도 유사한 결과를 나타내었다 (그림 5). 이후 시간이 경과함에 따라 peak가 계속 생성 되고, 이것을 분석하면, N-term.의 끝 부분부터 잘린 product의 피크가 순차적으로 나타나는 것 을 확인할 수 있었다. 그러나 N-term.에서 3번 째와 4번째 아미노산인 E (glutamic acid)와 F (Phenylalanine)의 위치에서 분해 된 product의 peak는 확인되지 않았다. 오랜 시간 반응시킨 후에도 11번 이상이 잘리는 product의 peak는 측정하기 어려웠다. 생성되는 peak의 MW에 따 른 Αβ의 분해 산물을 정리 표시하였다 (표 2).

206 Ⅰ. 연구보고 195 Figure 4. Identification of the cleaved products of amyloid peptide by SKAP (MALDI-TOF analysis). Table 2. Cleavage Site of Aβ40 and Aβ42 by SKAP. User mass DB mass Δmass (Da) Peptide position (H)DSGYEVHHQKLVF`FAEDVGS NKGAIIGLMVGGVV IA (R)HDSGYEVHHQKLVFFAEDVG SNKGAIIGLMVGGVV IA (F)RHDSGYEVHHQKLVFFAEDV GSNKGAIIGLMVGGVV IA (A)EFRHDSGYEVHHQKLVFFAE DVGSNKGAIIGLMVGGVV IA (D)AEFRHDSGYEVHHQKLVFFA EDVGSNKGAIIGLMVGGVV IA DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF AEDVGSNKGAIIGLMVGGVV IA 1-42

207 Voyager Spec #1[BP = , 3909] Mass (m/z) Voyager Spec #1[BP = , 3356] Mass (m/z) 국립보건연구원보 (A) Voyager Spec #1[BP = , 5414] % Inte nsity % In ten sity Mass (m/z) Aβ 40 + SKAP after 3hours (B) Voyager Spec #1[BP = , 3059] % Intensity % In te n s ity Mass (m/z) Aβ 42 + SKAP after 3hours Figure 5. Cleavage of Aβ40 and Aβ42 by SKAP. Aβ40 or Aβ42 was incubated with SKAP for 3 hours and were analyzed by MALDI-TOF. (A) 150μM of Aβ40 and 0.1μM of SKAP; (B) 150μM of Aβ42 and 0.1μM of SKAP, insert boxes, each control peak;

208 Mass (m/z) Mass (m/z) Mass (m/z) 9.4E Mass (m/z) Mass (m/z) Mass (m/z) Ⅰ. 연구보고 197 위와 같은 방법으로 SKAP와 유사한 염기서 열과 M28 도메인을 갖고 있는 SGAP에 대해 동일한 실험을 실행하였다. Αβ40과 Αβ42 모 두 1.5시간 배양 후 측정하였을 때 이미 여러 peak가 생성되는 것을 확인할 수 있었다 (그림 6). 3시간 배양 후 생성된 peak를 분석해 보았 을 때 생성될 수 있는 여러 product들 중에서 N-term.이 아닌 C-term. 방향의 중간부분이 잘려지는 생성되는 peak가 많이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 초기반응에서는 Αβ의 N-terminal에서 34번째 위치한 아미노산인 L (Leucine)에서 잘려진 product가 먼저 확인이 되 었고, 이후 13-23번째 위치한 아미노산이 잘려 져 생성되는 product들이 확인되었다 (그림 7). 따라서 SGAP는 아미노산 염기서열은 SKAP와 매우 비슷하나 (87% homology in M28 domain) Αβ분해에 대한 작용 기전은 다름을 알 수 있 었다. (A) Ab40 + SGAP (B) Ab42 + SGAP Voyager Spec #1[BP = , 9382] Voyager Spec #1[BP = , 8699] % Intensity Cont. % Intensity Voyager Spec #1[BP = , 4311] Voyager Spec #1[BP = , 7255] % Intensity hour % Intensity Voyager Spec #1[BP = , 2947] Voyager Spec #1[BP = , 2355] % Intensity hour % Intensity Figure 6. Identification of the cleaved products of amyloid peptide by SGAP (MALDI-TOF analysis).

209 198 국립보건연구원보 100 Voyager Spec #1=>NF1.0[BP = , 6061] % Intensity Mass (m/z) (A) Aβ40 + SGAP after 3hours Voyager Spec #1=>NF1.0[BP = , 2871] % Intensity Mass (m/z) (B) Aβ42 + SGAP after 3hours Figure 7. Cleavage of Aβ40 and Aβ42 by SGAP (A) 100μM of Aβ40 and 0.05μM of SGAP; (B), 100μM of Aβ42 and 0.05μM of SGAP.

210 Mass (m/z) Mass (m/z) Mass (m/z) Mass (m/z) E+4 Ⅰ. 연구보고 199 SKAP의 기질특이성 조사를 위하여 뇌에 존재하는 Αβ외에 다른 기질에 대한 분해 product를 MALDI-TOF로 분석하였다. 실험 에 쓰인 neuropeptide로는 somatostatin, vasoactive intestinal peptide (VIP), neuropeptide Y (NPY) 이었으며, 각각 50 μ M, 50 μ M, 70 μ M의 기질들 에 SKAP를 넣은 후 시간별로 측정하였다. Somatostatin의 경우는 총 14개의 염기 중에서 시간이 지남에 따라 원래의 peak가 사라지면서 N-term.의 2번과 3번 아미노산이 잘려 생성되 는 product를 확인할 수 있었다 (그림 8A). VIP의 경우는 28개의 염기 중에서 N-term. 방향에서 2번, 7번, 8번, 11번이 잘려 생성되는 peak를 확인할 수 있었다 (그림 8B). 반면에 NPY의 경우는 36개의 염기 중에서 24번과 25 번을 중심으로 생성된 peak만 확인되어서 Aβ 와는 매우 다른 양상을 나타내었다 (그림 8C). Voyager Spec #1[BP = , 7014] Reflector mode Voyager Spec #1[BP = , 3410] % Intensity % Intensity h 2.5h Voyager Spec #1[BP = , 6083] Voyager Spec #1[BP = , 11451] % Intensity % Intensity h 7.5h atching peptides for unspecific cleavage: User mass DB mass Δmass (daltons) peptide position modifications (G)CKNFFWKTFTSC (A)GCKNFFWKTFTSC AGCKNFFWKTFTSC 1-14 Figure 8 A. Cleavage of somatostatin by SKAP

211 Voyager Spec #1[BP = , 11794] Mass (m /z) Voyager Spec #1[BP = , 8415] Mass (m /z) 1.2E Voyager Spec #1[BP = , 6139] Mass (m /z) Voyager Spec #1[BP = , 8786] Mass (m /z) 국립보건연구원보 % Intensity % Intensity h 2.5h % Intensity % Intensity h 7.5h Matching peptides for unspecific cleavage: User mass DB mass Δmass (daltons) peptide position (H)SDAVFTDNYTRL(R) (H)SDAVFTDNYTRLRKQ(M) (D)AVFTDNYTRLRKQMA(V) (H)SDAVFTDNYTRLRKQM(A) (Y)TRLRKQMAVKKYLNSILN (H)SDAVFTDNYTRLRKQMAVK(K) (T)DNYTRLRKQMAVKKYLNSIL N (F)TDNYTRLRKQMAVKKYLNSI LN (H)SDAVFTDNYTRLRKQMAVKK YLNSILN 2-28 Figure 8 B. Cleavage of VIP by SKAP

212 Mass (m/z) Mass (m/z) Mass (m/z) Mass (m/z) 1042 Ⅰ. 연구보고 201 Voyager Spec #1[BP = , 1508] Voyager Spec #1[BP = , 3315] Reflector mode % Intensity h % Intensity h Voyager Spec #1[BP = , 2250] Voyager Spec #1[BP = , 1042] % Intensity % Intensity h 7.5h Matching peptides for unspecific cleavage: User mass DB mass Δmass (daltons) peptide position (L)RHYINLITRQRY YPSKPDNPGEDAPAEDMARY YSAL(R) YPSKPDNPGEDAPAEDMARY YSALRHYINLITRQRY 1-36 Figure 8C. Cleavage of NPY by SKAP

213 202 국립보건연구원보 Voyager Spec #1[BP = , 5432] Reflector mode Voyager Spec #1[BP = , 3581] % Intensity 50 % Intensity Mass (m/z) 0h Mass (m/z) 2h 100 Voyager Spec #1[BP = , 1510] % Intensity Mass (m/z) 4h Matching peptides for unspecific cleavage: User mass DB mass Δmass (daltons) peptide position (A)VKKYLNSIL(N) (D)NYTRLRKQ(M) (D)NYTRLRKQM(A) (Y)TRLRKQMAVK(K) (D)NYTRLRKQMAVK(K) (Y)TRLRKQMAVKKYLN(S) (H)SDAVFTDNYTRLRKQ(M) (D)AVFTDNYTRLRKQMA(V) (H)SDAVFTDNYTRLRKQM(A) (H)SDAVFTDNYTRLRKQMA(V) (H)SDAVFTDNYTRLRKQMAVK(K) (H)SDAVFTDNYTRLRKQMAVKK YLN(S) (S)DAVFTDNYTRLRKQMAVKKY LNS(I) (H)SDAVFTDNYTRLRKQMAVKK YLNSILN HSDAVFTDNYTRLRKQMAVK KYLNSILN 1-28 Figure 9A. Cleavage of VIP by SGAP

214 Mass (m/z) Mass (m/z) Mass (m/z) Ⅰ. 연구보고 203 Voyager Spec #1[BP = , 2470] Reflector mode Voyager Spec #1[BP = , 6769] % Intensity h % Intensity h Voyager Spec #1[BP = , 8271] % Intensity 4h Matching peptides for unspecific cleavage: User mass DB mass Δmass (daltons) peptide position (L)RHYINLITRQRY YPSKPDNPGEDAPAEDMAR(Y) (Y)PSKPDNPGEDAPAEDMARY(Y) YPSKPDNPGEDAPAEDMARY(Y) (Y)PSKPDNPGEDAPAEDMARYY(S) (A)RYYSALRHYINLITRQR(Y) YPSKPDNPGEDAPAEDMARY Y(S) (A)RYYSALRHYINLITRQRY YPSKPDNPGEDAPAEDMARY YS(A) (K)PDNPGEDAPAEDMARYYSAL RH(Y) YPSKPDNPGEDAPAEDMARY YSA(L) YPSKPDNPGEDAPAEDMARY YSAL(R) YPSKPDNPGEDAPAEDMARY YSALRHYINLITRQRY 1-36 Figure 9B. Cleavage of NPY by SGAP SKAP와 유사한 SGAP의 경우에는 neuropeptide에 대해 어떤 반응을 보이는지 비교하기 위하여 VIP와 NPY로 실험을 하였는데 조건은 위와 동 일하였다. 먼저 VIP의 경우에는 N-term.의 H (histidine)이 잘려져 나간 후 C-term. 방향에서부터 4번, 8번, 10번, 11번, 12번째 염기가 잘려진 peak 가 확인되었다 (그림 9A). 그밖에도 N-term.의 특정부위가 잘린 후 C-term.이 잘려져 나간 peak가 확인되었다. NPY의 경우에는 4시간이 경과하면서 원래의 peak가 사라지고 C-term.의 12번째가 잘려진 후 17번까지 순차적으로 잘려 진 peak가 확인되었다 (그림 9B). 이상의 MALDI-TOF를 이용한 실험에서 SKAP와 SGAP 는 다른 단백질에 대해서도 다른 분해 product를

215 204 국립보건연구원보 생성함을 알 수 있었다. SKAP는 대체적으로 N-term. 방향에서 염기가 잘려지는 양상을 나타 내는 반면, SGAP의 경우에는 peptide의 중간이 잘리거나 C-term. 방향에서 잘려지는 양상을 나 타내었다. 이는 SKAP는 aminopeptidase (AP)의 활성을, SGAP의 경우 carboxypeptidase (CP)와 더 유사한 활성을 나타내는 것을 보여준다. 여 SKAP와 반응시킨 경우 Αβ에 의한 세포 독성이 감소하여 세포의 생존을 약 43% 증가 시켰다. SKAP와 유사한 단백질인 SGAP도 Α β의 독성을 저해하는 효과 (88% 생존 증가) 를 보였다 (그림 11). 라. 응집된 Aβ의 분해 및 cell toxicity 감소 SKAP와 SGAP가 응집된 Αβ를 자르는 것을 Congo red assay로 확인하였다. 50μM의 aggregation 된 Αβ42와 반응시킨 후 15시간 동안 37 에 서 반응 시키고, Congo red solution을 넣고, 30분 후에 540nm와 480nm에서 확인하였다. SKAP와 SGAP의 경우에는 aggregation된 Αβ를 30%이 상 줄여주는 효과를 나타내었다(그림 10). 효소 반응 후 Thioflavin-T(Th-T)를 넣어주고, Ex=450 nm, Em=482 nm에서 바로 측정하였을 때에도 약 20%이상 Αβ의 응집을 줄여주는 효과를 확 인하였다(data not shown). Figure 11. Protection of Aβ-induced neuronal cell death by aminopeptidases. The SH-SY5Y human neuronal cell cultures were pre-incubated with 1μM of aggregated Aβ1-42 for one hour. Then, 30μM (final concentration) of Aβ 1-40peptide (Aβ40) or aminopeptidase treated (Aβ40 + SKAP, Aβ40 + SGAP, 5h at 37 ) Aβ1-40 was added into the cell cultures. After 3 days, the viability of the cells was assayed with alamarblue reagent. Each bar represents mean + SEM of four wells. Figure 10. Reduction of aggregated Aβ by SKAP Αβ40의 독성은 낮은 농도(1 μ M )의 응집된 Αβ42를 미리 전처리하였을 때(약 50%), 전 처리하지 않은 경우(약 60%)보다 더 높게 나 타났다. 300 μ M Αβ1-40 (160 μ l )를 SKAP 4μg (0.52 units; μmole/min with Leu-pNA substrate) 또는 SGAP와 37 에서 5시간동안 반 응 시킨 후 배양 배지에 10배 묽혀 세포에 처 리하였다. 효소와 반응시키지 않은 경우에 비하

216 Ⅰ. 연구보고 205 마. 아미노산서열 비교 SKAP의 전체 아미노산서열을 protein BLAST를 이용해 분석해 보았을 때, SGAP와 80% 이상의 유사성을 나타내었다 (그림 12). SKAP peptidase 의 활성 도메인으로 알려진 M28 family 도메인 을 포함하는 유사 효소들, 즉, bacterial SGAP (Streptomyces griseus aminopeptidase), mammalian PGCP (Plasmid glutamate carboxypeptidase), PSMA (prostate-specific membrane antigen, Glutamate carboxypeptidase II)를 ExPASy의 PRALINE 프로그램으로 비교하였다. SGAP가 86.4%, PGCP가 23.1%, PSMA가 22.8%의 유 사성을 나타내었고, 구조상 Zn2 + 와 결합하는 자리 와 catalytic residue가 보전되어 있었다. 이것으로 서 SKAP는 M28 도메인을 갖는 SGAP와 구조적 으로 유사하며, 또한 Zn2 + 를 포함하는 구조일 것 으로 추측되어진다. Figure 12. Amino acid sequence comparison of M28 family peptidases. The alignment was obtained using PRALINE. M28 domains of SKAP (Streptomyces Sp. KK565 aminopeptidase), SGAP(Streptomyces griseus aminopeptidase), PGCP(Plasmid glutamate carboxypeptidase), PSMA (prostate-specific membrane antigen, Glutamate carboxypeptidase II). (* Zn-binding sites, ** Catalytic residues) were aligned.

217 206 국립보건연구원보 고 찰 AD의 치료를 위해서는 뇌에서 생성되는 Aβ 의 생성을 낮추거나 축적되는 것을 막고, 분해 를 유도하는 등의 치료법이 효과적일 것으로 예상된다 (Forman et al., 2004, Vardy et al., 2005). Aβ의 분해를 촉진하여 Aβ의 독성을 없애는 물질로는 현재 neprilysin이 가장 잘 알 려져 있는데, 이와 같은 물질은 박테리아가 생 산하는 물질에서 발견된 적이 없었다. 그러므로 이 연구에서는 Aβ의 독성을 줄여서 궁극적으 로는 AD를 치료하기 위하여 1000여종의 박테 리아 대사산물에서 효과 있는 물질을 스크린 하였다. 그 중에서 S. sp. KK565의 배양액에서 aggregation된 Aβ를 줄여줄 수 있는 물질을 찾 아내었고, 염기서열 분석으로 그 물질이 aminopeptidase (SKAP)라는 것을 확인할 수 있 었다. 이 효소는 이미 알려진 SGAP와 80% 이 상의 유사성을 갖고 있으며, SGAP이외에 human carboxypeptidase 계열인 GCPII, PGCP등 도 M28 domain을 갖고 있는 peptidase familiy에 속한다는 것이 알려져 있다. cofactor로 알려진 Zn 2+ 를 binding하는 아미노산들도 보전 된 것을 확인할 수 있었다. SKAP를 E. coli 에서 발현시 켜 Ni-NTA affinity column으로 정제한 결과, 40% 이상의 높은 회수율을 얻을 수 있었다. 얻어진 효소는 Ca 2+ 에 의존적으로 활성을 나 타내었으며, 반대로 metal chelator로 알려진 p-phenanthrolin, EDTA, EGTA에의해서는 활성 이 억제되는 것을 알 수 있었다. 이것으로 SKAP가 Ca 2+ 과 같은 metal을 cofactor로 하는 aminopeptidase라는 것을 다시 한 번 확인할 수 있었다. Aβ에 어떻게 작용하는지를 알아보기 위하여 MALDI-TOF를 이용하여서 분석하였으 며, SKAP가 Aβ monomer N-term.부분의 아미 노산을 차례로 자르는 것을 확인할 수 있었다. 아미노산 서열이 유사한 SGAP의 경우에서는 전혀 다른 결과가 나와 비슷한 구조를 갖는 효 소임에도 반응이 다르다는 것을 확인할 수 있었 다. 그밖에 뇌에 존재하는 여러 가지 neuropeptide 들에 대해서도 두 효소에 대한 활성을 조사하였 는데, SGAP가 무분별하게 neuropeptide를 분해하 는 반면 SKAP는 VIP를 제외하고는 나머지 peptide에 대해서는 활성이 높지 않았다. 그밖에 reverse Aβ (40->1)의 경우 SKAP는 전혀 peptide를 분해하지 못하였다. 이로서 SKAP는 Aβ에 더욱 specific 하다는 것을 추측할 수 있 었다. SKAP와 SGAP 모두 aggregation된 Aβ 양을 감소시키며, Aβ의 monomer 및 oligomer도 줄 이는 것을 확인하였다 (data not shown). 이와 같은 활성은 SH-SY5Y human neuronal cell에서 Aβ의 cytotoxicity를 감소시키는 효과로 나타났 다. cell의 절반이상이 Aβ의 독성에 의해서 죽 는 반면에 SKAP나 SGAP를 처리한 Aβ의 독성 은 현저히 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 지금까지의 실험으로 SKAP가 specific하게 aggregation된 Aβ를 줄이고, Aβ에 의한 cell의 생존에 유리한 조건을 유도한다는 것을 알 수 있었다. 이는 박테리아에서 분리된 효소에서는 처음으로 보고된 것이다. SGAP와 같은 다른 aminopeptidase에서도 비슷한 효과가 관찰되었으 나 Aβ를 분해하는 양상이 다르고, 다른 peptide에 대한 활성도 다른 것으로 보아 SKAP 의 작용 기전에 차이가 있는 것으로 보여 진다. 이 연구는 향후 유사한 mammalian enzyme들의 활성을 연구 하는데 도움이 될 것으로 기대되 며 치매치료에 적용하기 위해서는 그 작용 기 전을 더욱 면밀히 조사해 나가야 할 것이다. 참고문헌 1. Eckman EA, Watson M, Marlow L, Sambamurti K, Eckman CB (2003). Alzheimer's disease beta-amyloid peptide is increased in mice

218 Ⅰ. 연구보고 207 deficient in endothelin-converting enzyme. J Biol Chem. 278: Farris W, Mansourian S, Chang Y, Lindsley L, Eckman EA, Frosch MP, Eckman CB, Tanzi RE, Selkoe DJ, Guenette S.(2003) Insulin-degrading enzyme regulates the levels of insulin, amyloid beta-protein, and the beta-amyloid precursor protein intracellular domain in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 100: Forman MS, Trojanowski JQ, Lee VM. (2004) Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10: Gouras GK, Almeida CG and Takahashi RH (2005) Intraneuronal Abeta accumulation and origin of plaques in Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 26: Hwang SE et al. (2003) Isolation of Streptomyce sp. KK565 as a producer of β -amyloid aggregation inhibitor. J. Microbiol. Biotechnol. 13: Iwata N, Tsubuki S, Takaki Y, WatanAβe K, Sekiguchi M, Hosoki E, Kawashima-Morishima M, Lee HJ, Hama E, Sekine-Aizawa Y, Saido TC (2000) Identification of the major Aβ eta1-42-degrading cataβolic pathway in brain parenchyma: suppression leads to biochemical and pathological deposition. Nat. Med. 6, Iwata N, Tsubuki S, Takaki Y, Shirotani K, Lu B, Gerard NP, Gerard C, Hama E, Lee HJ, Saido TC.(2001), MetAβolic regulation of brain Aβeta by neprilysin, Science 292: Iwata N, Higuchi M, Saido TC. (2005) Metabolism of amyloid-beta peptide and Alzheimer's disease. Pharmacol Ther. 108: Vetrivel KS and Thiakaran G (2006) Amyloidogenic processing of beta-amyloid precursor protein in intracellular compartments. Neurology. 24;66 (2 Suppl. 1): S Vardy ER, Catto AJ, Hooper NM. (2005) Proteolytic mechanisms in amyloid-beta metabolism: therapeutic implications for Alzheimer's disease. Trends Mol. Med. 11:

219 208 국립보건연구원보 An aminopeptidase from Strepomyces sp. KK565 (SKAP) inhibits β-amyloid peptide aggregation by cleaving Aβ N-terminal amino acids C.B. Yoo, K.S. Ahn and S.A. Jo Division of Brain Disease, Center for Biomedical Sciences, NIH, Seoul Korea Purpose : The central pathological cause of Alzheimer disease (AD) is an accumulation of beta-amyloid (Aβ) into toxic fibrillar deposits inbrain. These deposits disrupt neural and synaptic function and ultimately lead to neuronal degeneration and dementia. Previously, we discovered and cloned the gene for an activity that inhibits Aβ aggregation from Streptomyces sp. KK565 growth media and named it Streptomyces sp aminopeptidase (SKAP). Therefor, the purpose of in this stury is the evaluation of the mechanism involved in inhibition of Aβ aggregation by SKAP. Methods : The recombinant SKAP (rskap 30) corresponding aa -aa was expressed in E. coli as a secreted form with 6-Histidines on C-terminus and purified by Ni-NTA affinity chromatography. The enzyme activity was measured with Leu-pNA as a subtrate. The cleavage of Aβ peptides by rskap was analyzed by MALDI-TOF. SH-SY5Y cell viability was measured using alamarblue (Biosource Inc.). Results : The amino acid sequence revealed high degree of similarity to aminopeptidases from Streptomyces fradia and Streptomyces griseus that belong to M28 family of metallo-peptidases. The molecular weight of rskap protein was approximately 30 kda by SDS-PAGE. The enzyme was activated by Ca 2 +and strongly inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenathroline, an inhibitor of aminopeptidases. The purified rskap cleaved soluble Aβ peptides and consequently inhibited A β aggregation. MALDI-TOF analysis showed sequential digestion of amino acids 1-7 of both Aβ 40and Aβ42 by rskap. In addition, preincubation of the rskap with Aβ reduced Aβ-induced cytotoxicity in neuronal cells. Conclusions : The activity of SKAP toward Aβ peptide in vitro suggests the possible role of M28 family peptidases in cleaving brain Aβ, hence preventing the pathogenesis of AD. Key words: Alzheimer s disease, amyloid beta, aminopeptidase This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea Suported original title : Cloning of the novel enzyme involved in the cleavage of soluble Aβ and identification of the mechanism. The Report of National Institute of Health 42, , 2005

220 Ⅰ. 연구보고 209 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 간질발작 후 MARCKS와 PKC의 세포유형별 발현양상 규명 국립보건연구원 생명의과학센터 뇌질환팀 김은해, 김화정, 강기석, 안상미, 은수용 목 적:간질발생 기전을 이해하기 위하여 kainic acid (KA)에 의해 유발되는 중첩경련 후 간질발 생과 신경가소성에 있어서 중요할 것으로 생각되는 단백질 인산화효소 C (PKC)의 세부유형들과 PKC 의 주요한 기질로 알려진 MARCKS의 세포 유형별, 뇌 영역별 및 시간경과별 발현 및 인산화 양상을 해마의 뇌절편 상에서 조사하여 보고자 하였다. 방 법:8주령 C57BL/6 마우스에 glutamate 유사체인 kainic acid(ka, 25 mg/kg, i.p.)를 투여하 여 중첩경련을 유도하고, 경련 후 4시간, 1일, 4일, 1주, 2주 및 한달 후에 관류고정하여 면역조직 화학염색법과 이중면역형광표지법을 이용하여 분석하였다. 결 과:간질경련 후 PKC alpha, beta, delta 효소들이 해마의 CA3 영역 미세신경교세포 (microglia)에 현저하게 증가하였다. PKC epsilon은 해마의 과립신경세포의 신경섬유인 mossy fiber 의 말단과 CA1 추체 신경세포의 수상돌기의 시냅스가 존재하는 stratum lucidum에 특이적으로 발현 되나 KA 유발 경련에 의해서는 발현상의 차이는 없었다. 또한 PKC zeta는 해마의 신경세포에서 발 현되며 KA유발 간질에 의해 현저하게 발현이 증가하였다. PKC의 주요한 기질로 알려진 MARCKS의 발현과 인산화는 미세신경교세포에서 간질발작 후 발현이 현저하게 증가하였으며 PKC alpha, beta, delta와 colocalization되었다. 결 론:간질경련에 의한 여러 유형의 PKC 효소들과 MARCKS의 신경세포, 성상교세포 및 미세신경 교세포별 발현상의 변화는 간질 경련에 의한 신경흥분독성 및 해마의 시냅스 가소성적 변화와 간질발 생 기전을 이해하는데 기초 자료가 될 것이다. 중심단어:간질, 신경흥분독성, 신경가소성, 유전자 발현, PKC, MARCKS 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임. 지원과제명:간질발생기전(epileptogenesis)에서의 신경가소성 관련 신호전달계의 규명 학회지 게재:Exp Mol Medicine 38에 게재 예정

221 210 국립보건연구원보 Cell Type-specific Upregulation of Myristoylated Alanine-rich C Kinase Substrate(MARCKS) and Protein Kinase C-alpha, -betaⅠ, -betaⅡ and -delta in Microglia Following Kainic Acid-induced Seizures E.H. Kim, H.J. Kim, K.S. Kang, S.A. Jo and S.Y. Eun Division of Brain Diseases, Center for Biomedical Science, NIH, Seoul Korea Purpose:Protein kinase C (PKC) family has been implicated in neural plasticity and excitotoxicity in central nervous system (CNS). The functional roles of PKC isozymes depend on the characteristics of the cell type and the type of external stimulation. Therefore, we examined the exact expressional profile of three PKC isozyme subgroups (conventional, novel, atypical) and a major PKC substrate MARCKS following systemic kainic acid (KA)-induced seizures. Methods:Eight week-old C57BL/6 mice were once administered with kainic acid (KA, 25 mg/kg B.W., i.p.), a glutamate analogue, to induce seizure activities. After behaviour seizure activities were observed, animal brains were prepared for immunohistochemistry and double-labeling immunofluorescent analysis. Results:PKC alpha, beta, delta isozymes were predominantly upregulated in glial cells, mostly in microglia, at CA3 region of hippocampus 1 day after KA injection. PKC epsilon expression was specifically localized at mossy fiber axon terminalsin stratum lucium of hippocampus and never be altered following seizure activities. On the other hand, atypical subtype PKC zeta is basally localized and also strongly upregulated only in neuronal cells following kainic acid treatment. The expression and phosphorylation of MARCKS was dramatically upregulated in microglia and colocalizd with PKC alpha, beta, delta. Conclusions:These findings suggest the individual PKC isozymes and MARCKS might play a distinctive cellular role in the excitotoxic processes and synaptic plastic changes following KA treatment and seizure activities. Key Words:epilepsy, excitotoxicity, plasticity, gene expression, PKC, MARCKS This study was supported by the intramural grant from National Institute of Health, Korea Supported original title : Identification of signal transduction pathways in epileptogenesis. This study was printed in Exp Mol Med 38 (in press). The Report of National Institute of Health 42, , 2005

222 Ⅰ. 연구보고 211 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 세포간극 유전자 돌연변이에 의한 유전성 난청 유발 기전 연구 국립보건연구원 생명의과학센터 심혈관질환팀 진현석, 엄상미, 박현영, 구수경 목 적:GJB2 (Connexin 26) 유전자의 돌연변이는 유전성 난청의 주된 원인으로 알려져 있다. 본 연구에서는 한국인에서 관찰된 GJB2 돌연변이체의 funtional mapping 수행을 통하여, 주요 난청 원 인 유전자인 GJB2가 청각장애 및 세포 증식에 작용하는 역할을 규명하였다. 방 법:난청과 더불어, 피부 이상을 동반하는 GJB2 N54K와 R75Q 돌연변이 construct를 Hela 세 포에 transfection 하여, gap junction의 기능 및 세포 증식에 미치는 영향을 살펴보았다. 결 과:Connexin 26의 N54K와 R75Q 돌연변이를 중심으로 gap junction 단백질의 기능과 세포 증식을 살펴본 결과, 이러한 돌연변이에 의해 생성된 gap junction 단백질은 정상군에 비해 세포간 물질 전달 기능이 현저하게 감소되어 있음을 관찰하였다. 또한, wild-type connexin 26에 각 돌연변 이 connexin 26이 dominant-negative effect를 보이고 있음을 확인하였다. 마지막으로, 세포 증식 을 살펴 본 결과, 두 종류의 돌연변이가 세포 성장을 촉진시키는 것을 관찰하였다. 결 론:GJB2 유전자가 다른 connexin과 조합되어 connexon을 만들어 가는 과정에서 상호 작용하 는 부위에 돌연변이가 발생하는 경우, 이는 우성 유전으로 나타날 수 있다. 또한 돌연변이 GJB2가 다른 connexin과 heteromer connexon을 이루어 gap junction channel의 기능에 영향을 줌으로써 다양한 조직에서 증상을 보이는 증후군성으로 나타난다고 볼 수 있다. 중심단어:GJB2, connexin 26, 유전성 난청, 돌연변이 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

223 212 국립보건연구원보 서 론 세포 간에 그리고 세포내 구조물과 연결이 되어 조직의 구조를 유지하고 신호전달 기능을 하며, 유기적인 반응을 나타내기 위한 muti-unit 막 단백질에는 gap juction, tight junction, adheren junction, desmosome, hemi-desmosome, focal adhesion, chemical synapse, immunological synapse 등이 있다. 이러한 단백질들의 중심에 는 복합체를 이루어 배열하고 특징적인 형태로 구성될 수 있는 특정한 세포막을 가로지르는 단백질이 존재한다. 포유동물에 있어서 gap junction은 두 개의 hemi-channel로 구성되어 있는데, 이는 각각 이 웃하는 두 개의 세포에서 connexon의 형태로 제공되어 완전한 기능적 단위인 막 단백질을 이루게 된다. 다른 세포에서 유래한 두 개의 connexon이 상호 작용하여 맞물리게 되고, 외부 환경과는 격리시키면서 이중막 세포간 channel 을 이루게 된다(Goodenough DA et al., 1996; Kumar NM et al., 1996). 구조적 관점에서 보면 각각의 connexon은 connexin이라 부르는 6개의 transmembrane protein subunit으로 구성되어 있 다(Sosinsky G et al., 1995). Connexin은 대단위 유전자 집단에 의해 encoding되고 있는데 사람에서는 적어도 20종류 의 isoform이 있음이 밝혀졌다. 모든 isoform은 glycosylation 과정이 존재하지 않으며, 구조적으 로 매우 유사성을 보이고 있고, 25 kda에서 62 kda의 범위에서 크기의 차이를 보이지만 이것 은 주로 connexin 단백질의 C 말단 길이의 다 양성에 기인한 것이다(Willecke K et al.,2002). 이러한 connexin들 중에서 connexin 26은 GJB2(Gap Junction Protein, Beta-2)라고도 불리 는데 이러한 명명에서 숫자 26 부분은 분자량 에 의해서 결정이 되었고, 아미노산 서열의 유 사성에 의해 크게 2개의 그룹으로 나누어, alpha와 beta로 명명한다. GJB2 유전자는 염색체상에서 13q11-q12에 위 치하며(Hsieh CL et al., 1991; Mignon C et al. 1996), 226개의 아미노산으로 구성되어 26 kd 의 분자량을 지니고 있다. 포유동물 상피세포에 서 발현되는 전사체는 kb에 이른다. 사 람의 달팽이관내의 세포(cochlear cell)를 면역조 직화학염색하여 이곳에서 connexin 26의 발현이 높게 나타남을 증명하였다(Kelsell DP et al,. 1997). 마우스와 랫의 달팽이관에서 connexin 26과 connexin 30이 달팽이관의 지지세포 (supporting cell)에서 발현되고 있다는 것과 이 러한 gap junction protein이 endolymph에서 칼륨 순환의 역할을 하고 있다는 것을 제시하고 있 다(Rabionet R et al., 2000). 일반적으로 GJB2 유전자 돌연변이는 열성 유 전의 양상을 보이고 있으나, 일부는 우성 유전으 로 나타나기도 한다(Gerido DA et al., 2004). 그 리고 이러한 우성 열성으로 나타나는 돌연변이 중 일부는 다른 임상 증상도 동반하는 증후군성 난청의 형태를 보이기도 하는데 이 경우 대체로 피부 질환이 자주 관찰된다(Maestrini E et al., 1999; Heathcote K et al., 2000; Rouan F et al., 2001). 이러한 현상은 서로 다른 종류의 gap junction들이 hetero 형태의 connexon을 구성 한 경우 돌연변이를 지닌 특정 gap junction이 hetero-connexon의 기능에 영향을 미칠 수 있음 을 설명 할 수 있다. 따라서 난청에 피부 질환이 동반되는 현상도 connexin 26의 특정 돌연변이가 피부에 발현되는 다른 gap junction에 영향을 미 친 결과로 보고 있다(Thomas T et al., 2004). Wild type의 connexin과 이상을 가진 connexin 과의 connexon assembly 분석으로 실제 조합된 connexon이 기능을 제대로 수행하는 지를 살펴 보는 것을 통해 동일한 connexin과 서로 다른 종류의 connexin간의 dominant negative 효과를 살펴 볼 수 있다(Lagree V et al.,2003). 본 연구에서는 가계가 한국인 난청환자를 대 상으로 GJB2 유전자 돌연변이 검색을 하였고, 여기에서 발견된 돌연변이 중 우성 유전과 증후 군성 난청을 보이는 GJB2의 N54K와 R75Q 돌

224 Ⅰ. 연구보고 213 연변이 유전자를 각각 Hela 세포에 tranfection을 하여 gap junction의 기능여부와 GJB2 정상 유전 자에 대해 N54K와 R75Q 돌연변이가 dominant negative 효과를 나타내는지 살펴보았다. 또한 N54K와 R75Q 돌연변이가 피부 질환을 동반하 는 원인을 규명하기 위하여 세포 증식의 관점에 서 어떠한 변화가 있는지 살펴보고자 하였다. 재료 및 방법 1. 연구 대상 가. 진단법 확립 유전성 난청 연구를 위해 청력의 정도, 가족 력 및 가계도의 형태, 그리고 동반되는 표현형 (피부과적 특성 또는 CT 결과에 따른 내이 기 형 판정)의 진단기준을 확립하여 청각장애 환 자 및 그 가족의 표현형을 결정하고 이들의 동 의를 얻어 혈액 시료를 확보하였다. 열성 유전의 경우 sporadic pattern과 구분하기 어려우며 또한 미토콘드리아성 유전의 경우에 도 우성 유전과 구분하기 어려운 점이 있으므 로 가족력의 조사는 그 가계도를 그림으로써 기초 자료를 확보하였다. 그 밖에도 일부 환자 의 경우 과각화증(hyperkeratosis), 갑상선종 (goiter) 등의 특징적 소견을 보이는 경우에는 이러한 표현형도 함께 기록하였다. 나. 시료 수집 이비인후과에 내원한 난청환자에게 본 연구 의 목적 등에 대하여 설명하고 본인 혹은 부모 로부터 DNA 유전자 조사 및 관련 연구 동의 서를 받은 후, 상박에서 해당 병원 의료진에 의하여 채혈을 시행하였다. 그 밖에 표현형에 대한 임상결과는 개인정보 (이름, 주민등록번 호)를 제외한 나이, 성별, 주요 증상, 검사결과, 가족력 등에 대한 결과를 받아 분석에 함께 이 용하였다. 2. 돌연변이 분석 가. Genomic DNA 추출 Puregene DNA Purification Kit (Gentra, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 genomic DNA를 백혈구에서 분리 정제하였는데 genomic DNA 추출 방법은 제조사의 실험 과정을 참고 하였는데, 전체적인 흐름은 다음과 같다. Cell lysis 과정을 통해 혈액에 존재하는 적혈구 를 용혈 시킨 후 원심분리를 통해 제거하여, 백 혈구를 분리하였다. 그런 다음 백혈구내의 genomic DNA를 얻기 위해 백혈구를 용출시켰 다. RNase 처리 과정은 DNA 염기분석에 영향 을 미치지 않기 때문에 생략하였다. 단백질 침 전을 위해 상온에서 시료의 온도를 낮추어 주 었다. 세포 용출액에 단백질 침전 용액을 첨가 하였다. 원심분리를 하고나서 침전된 단백질을 제외한 상층액을 다른 용기로 옮겼다. DNA 침전을 위해 100% Isopropanol(2-propanel) 을 첨가하고, 하얀 실타래 같은 것이 눈에 보일 때까지 약 50여회 정도 조심스럽게 위아래로 섞어주었다. 그리고 원심분리 후 상층액을 버린 후, 70% 에탄올을 첨가하여 세척과정을 하고 잘 말렸다. 마지막으로 DNA Hydration 용액을 첨가하였다. DNA 시료 보관을 위해 가볍게 원심분리를 해서 1.5 ml microfuge tube로 옮겼다. 그리고 나서 4 에 보관하였다. 장기간의 보관을 위해 서는 -20 나 -80 냉동고에 보관하였다. 나. GJB2, GJB3, GJB6 유전자의 염기서열 분석 (1) Exon 부위 PCR PCR에 사용된 primer는 각 gap junction 유전 자를 증폭할 수 있는 염기서열을 주문 제작 (Bioneer Co., Daejeon, Korea)하여 사용하였다. 증폭 반응은 20ng의 genomic DNA, 1.5mM MgCl2, 2.5pmol primers, 0.2mM dntp, 10 buffer, 0.5U Taq DNA polymerase(takara Shuzo Co., Otsu, Shiga, Japan)에 멸균증류수로 전체 50μl로 맞춘 다음 thermal cycler(perkin Elmer

225 214 국립보건연구원보 9700, Norwalk, CT, USA)에서 DNA를 증폭하였 다. PCR 반응은 총 35 cycle을 시행하였으며 첫 cycle이 시작하기 전에 94 에서 5 분간 반응시 켜 완전히 denaturation 시킨 후, 매 cycle 당 9 4 에서 30초간 denaturation, 60 에서 30 초간 annealing, 72 에서 1 분간 extension 반응을 시 행하였다. 그리고 완전한 extension을 위해 35 cycle의 DNA 증폭과정이 끝난 후 72 에서 5 분간 반응을 지속하였다. (2) PCR 증폭산물의 분리 및 정제 PCR 반응이 종료된 후 DNA 증폭산물을 확인하였다. 증폭산물의 크기를 예상 크기와 비교하고, 다른 non-specific band의 유무를 살펴본 후 DNA band 부분만을 칼로 오려 내어 1.5 ml microfuge tube로 옮겼다. 그 후 DNA 정제는 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 제조사 의 실험과정을 참고하여 사용하였다. (3) DNA sequencing Sequencing을 위한 PCR 산물 증폭에는 BigDye Terminator Cyclic Sequencing Kit(PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하였다. 과정이 종료된 후 시료를 ABI Prism 310(PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 전기영동을 시행하였다. (4) Sequencing 결과 분석 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 사이트( 염기서 열 비교 분석 프로그램인 BLAST를 이용하여, GJB2 유전자의 염기서열(Gene Bank: NM ), GJB3 유전자의 염기서열(Gene Bank : AF099730), GJB6 유전자의 염기서열(Gene Bank : NM ) 과 실험결과 나온 염기서열 결과 데이터를 비교 분석하였다. 염기서열 분석을 통해 일단 환자에 서 돌연변이가 확인되면 확보된 부모 및 형제의 genomic DNA를 염기서열 분석을 하여 동일한 돌연변이가 존재하는지의 여부를 확인하였다. 돌 연변이의 확인은 Connexin-deafness 홈페이지 내 의 GJB2 유전자 돌연변이에 대한 돌연변이 데이 터베이스( 실험을 통해 발견된 변이와 비교하여 확인하였다. 3. Connexin 26 클로닝 가. PCR Cloning은 GJB2 유전자의 wild type과 GJB2 유전자의 두 종류의 돌연변이인 N54K와 R75Q 를 대상으로 하였다. GJB2 유전자의 coding 지 역을 포함하고 제한 효소 인식부위를 가진 primer를 제작 주문(Bioneer Co., Taejun, Korea) 하였다. 제한 효소 인식 부위로는 5 말단 부위 에는 EcoRⅠ(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)을 3 말단 부위에는 HindⅢ(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)를 지정하여 다음과 같이 primer를 제작하였다. Cx-EcoRⅠ: TTAGGAATTCCCTCATCCCTCTCATGCTGT Cx-HindⅢ : GCATAAGCTTTCTTTTCCAGAGCAAACCGC 증폭 반응은 20ng의 genomic DNA, 1.5mM MgCl2, 2.5pmol primers, 0.2mM dntp, 10 buffer, 0.5U Taq DNA polymerase(takara Shuzo Co., Otsu, Shiga, Japan)에 멸균증류수로 전체 50μl로 맞춘 다음 thermal cycler(perkin Elmer 9700, Norwalk, CT, USA)에서 DNA의 증폭을 시도하였다. PCR 반응은 총 30 cycle을 시행하 였으며 첫 cycle이 시작하기 전에 94 에서 5 분간 반응시켜 완전히 denaturation 시킨 후, 매 cycle 당 94 에서 30 초간 denaturation, 60 에 서 30초간 annealing, 72 에서 1 분간 extension 반응을 시행하였다. 그리고 완전한 extension을 위해 35 cycle의 DNA 증폭과정이 끝난 후 72 에서 5 분간 반응을 지속하였다. PCR 반응이 종료된 후 1.5% agarose gel에 전 기 영동하여 UV transilluminator (Viber Lourmat, Marne La Vallee, France)에서 관찰되는 DNA

226 Ⅰ. 연구보고 215 증폭산물을 확인하였다. 증폭산물의 크기를 예 상 크기와 비교를 하고, 다른 non-specific band 의 유무를 살펴본 후 DNA band 부분만을 칼로 오려내어 1.5 ml microfuge tube로 옮겼다. 그 후 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 DNA 정제를 하였다. 나. 제한 효소 처리 본 연구에 사용할 벡터인 pcdna3.1(+) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), pcdna3.1(+)/ Hygro(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 insert DNA로 사용할 GJB2 유전자의 wilde type과 GJB2 유전자의 두 종류의 돌연변이인 N54K와 R75Q를 각각 EcoRⅠ(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)과 HindⅢ(New England Biolabs, Beverly, MA, USA)로 제한효소처리를 하 였다. 제한효소처리 조건은 다음과 같이 하였다. 2μg의 대상 DNA, 10 buffer(neb2), 각 1unit의 EcoRⅠ과 HindⅢ에 멸균증류수로 전체 20μl로 맞춘 다음 37 에서 2시간 동안 반응시켰다. 다. Ligation 제한효소 반응이 종료된 후 1.5% agarose gel 에 전기 영동하여 UV transilluminator(viber Lourmat, Marne La Vallee, France)에서 관찰되 는 DNA 증폭산물의 크기를 확인하여 제한효소 처리가 잘 되었는지 점검한 후 원하는 DNA band 부분만을 칼로 오려내어 1.5ml microfuge tube로 옮겼다. 그 후 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 insert DNA(GJB2 유전자 wilde type, N54K, R75Q)와 vector DNA(pcDNA3.1(+), pcdna3.1(+)/hygro)를 분리 정제 하였다. 이렇게 insert DNA와 vector가 준비된 후 각 각 Ultrospec 2100(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)로 흡광도를 측정하여 DNA 농도를 계산하였다. 그리고 나서 다음과 같이 ligation 반응을 진행하였는데, 나중에 cotransfection을 위해 GJB2 유전자의 wilde type 은 pcdna3.1(+)(invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 와 반응을 시켰고, GJB2 유전자의 두 종류의 돌연변이인 N54K와 R75Q는 pcdna3.1(+)/ Hygro(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) vector에 ligation을 하였다. Vector와 insert DNA의 비를 1:3으로 하여 1.5ml microfuge tube에 10 buffer, T4 ligase(promega, Madison, WI, USA) 1μl, 10mM ATP 1μl에 멸균증류수로 전체 10μl 로 맞추어 16 에서 4시간 반응시켰다. 라. Transformation -70 에 보관되어 있는 competent cell(e. coli DH5α)을 꺼내 얼음에 5분간 반응 시켰다. 100ng의 ligation 산물을 첨가하여 30분간 얼음 에서 계속 반응시켰다. 그 후 42 에서 1분간 heat shock을 준 다음, 다시 얼음에서 15분간 반 응 시킨 후 800μl의 LB broth를 첨가하여 37 배양기에 shaking하면서 배양하였다. 그 후 ampicillin이 첨가된 LB plate에 접종하고, 37 배양기에 16시간 동안 배양하였다. 그 후 생성 되는 colony들을 몇 개 선택하여 각기 다른 3ml 의 LB broth에 접종하여 37 배양기에 진탕하 면서 배양시켰다. 마. Plasmid preparation QIAprep spin miniprep kit(qiagen, Valencia, CA, USA)을 사용하여 제조사의 실험 순서에 따라 plasmid DNA를 분리 정제하였다. 4. Transfection Transfection하기 전날에 항생제가 없고 10%의 FBS(fetal bovine serum:gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)이 첨가된 DMEM Dulbecco's modified eagle medium: Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)배지 5 ml에 숫자의 세포를 분 주하여 transfection시에는 전체 배지 면적의 90-95%를 배양된 세포가 차지하도록 했다. 실험 당일에 FBS가 없는 500μl의 Opti-MEMI medium 에 8.0μg의 recombinant DNA를 첨가하여 잘 섞

227 216 국립보건연구원보 어 주고, 또 다른 1.5ml microfuge tube에는 500 μl의 Opti-MEMI medium에 20μl의 Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 넣어 잘 섞어 주었다. 그런 다음 상온에서 5분간 방치하였다. 다음으로 두 개의 1.5ml microfuge tube에 있 는 용액들을 한 곳으로 섞어서 20분간 상온에서 방치하였다. 그런 다음 각 transfection할 세포에 혼합액을 넣어주어 앞뒤로 잘 흔들어 주었다. CO2 배양기에서 37 로 시간 동안 배양 시켰다. Transfection 시점에서 24 시간 후에 항 생제가 첨가된 신선한 배지로 바꾸어 주었다. 5. 기능 분석 GJB2 유전자 돌변변이의 기능 분석은 el Fouly 등(el Fouly EH et al., 1987)이 제시한 scrape-loaded dye transfer 방법을 사용하였는데 실험 방법은 다음과 같았다. Transfection된 Hela 세포를 60mm plate에 분주하여 CO2 배양기에서 37, 24시간 동안 배양시켰다. 세포가 배양된 면적의 정도는 거의 100%에 이르도록 하였다. 배양 상태를 도립현미경인 Olympus CK2 (Olympus, Melville, NY, USA)로 확인한 후 PBS(phosphate-buffered saline)로 2회 세척을 하 였다. 그런 다음 0.5% lucifer yellow(sigma, St.Louis, MO, USA) 용액을 배양된 모든 세포를 덮을 만큼 충분한 양을 배양접시에 분주하였다. 그리고 나서 수술용 칼로 세포가 자란 부위를 가볍게 대어 칼자국을 내어, 상온에서 10 분간 반응시키고, PBS로 2회 세척을 한 다음 10% formalin으로 고정시켜, 형광 현미경인 Olympus Ⅸ70(Olympus, Melville, NY, USA)으로 관찰하 였고, 컴퓨터 화면에 나타나는 이미지는 IPLab (scanalytics, Fairfax, VA, USA)으로 작업하여 이미지 파일을 저장하였다. 저장된 이미지 파일 은 나중에 Jasc Paint Shop Pro(Corel, Eden Prairie, MN, USA)를 사용하여 작업하였다. 6. Immunocytochemistry 형광 면역세포화학 실험은 connexin 26의 세 포내의 위치와 발현을 확인하기 위하여 사용하 였다. 본 실험에서 슬라이드는 Lab-TekⅡ Chamber Slide System(Nalge Nunc International, Naperville, IL, USA)을 사용하였고, 제조사의 방 법을 참고 하였다. Transfection된 Hela 세포를 24 시간 동안 Lab-TekⅡ Chamber Slide System(Nalge Nunc International, Naperville, IL, USA)에 배양한 후 PBS로 세척을 하고 4% paraformaldehyde로 15 분간 고정하였다. 그 후 100 mm glycine으로 5 분간 3회 세척을 하고, 0.1% Triton X-100에 4 분간 반응 시킨 후, PBS 로 5 분씩 3회 세척하였다. 그리고 나서 1% BSA로 30 분간 blocking을 시킨 후에 용액을 제 거하고 나서 1차 항체인 rabbit anti-connexin 26(Zymed, South San Francisco, CA, USA)을 10 μg/ml의 농도로 각 시료에 20 μl를 떨어뜨려 1 시간 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응 후 PBS로 10 분간 3회 세척하고, 2차 항체인 Fluorescein isothiocyanate(fitc)-conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G secondary antibody(santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA)를 1:100의 비율로 희석하 여 20 μl를 떨어뜨려 1 시간 동안 암실에서 반 응시킨 후 PBS로 10 분간 3회 세척하고 10μl glycerol로 mount하였다. 이러한 과정들을 마치고 나면 슬라이드를 confocal microscope인 Axivert 200 inverted High-end Microscope(Carl Zeiss, Jena, Germany) 에서 관찰하여 컴퓨터에 이미지를 저장하였다. 위의 과정은 Hela 세포내에서 transfection된 connexin 26의 발현여부를 알아보기 위한 실험 이었고, 여기에 세포막과 골지체를 각각 connexin 26과 이중 염색하여 관찰하였는데, 세포막의 경 우 Vybrant Dio Cell-labeling Solutions(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)을 사용하였는데, 모든 과정은 동일하였고 2차 항체 반응 시간 후 Vybrant Dio Cell-labeling Solutions(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)을 1:200의 비율로 희

228 Ⅰ. 연구보고 217 석하여 각 시료에 20μl를 떨어뜨려 37 에서 8 분간 반응시킨 후 세척과 mount과정을 하고 난 뒤에 confocal microscope로 관찰하였다. Connexin 26의 세포내 위치 확인을 위해 골지 체를 관찰하는 경우에는 anti-human golgin-97 mouse monoclonal antibody(molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하였는데 이것은 골지 체에 존재하는 golgin-97이라는 단백질에 대한 항체로서 실험과정 상에 connexin 26에 대한 1 차 항체 반응과정에, anti-human golgin-97 mouse monoclonal antibody(molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 1:100의 비율로 희석하여 동시에 반응시키고 2차 항체는 Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin G secondary antibody(santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA)를 1:100의 비율로 희석하여 사용하였 다. 세포막과 골지체를 connexin 26과 동시에 보 는 경우에는 모두 connexin 26에 대한 2차 항체 와 파장이 겹치지 않도록 Cy3 goat anti-rabbit IgG(Biomeda, Foster City, CA, USA)를 1:250의 비율로 희석하여 사용하였다. 결 과 1. 기능 연구 대상 돌연변이 선별 청각이상 환자 중 EVA가 관찰되지 않았으며 열성 혹은 sporadic pattern으로 발생한 가계가 서로 다른 환자들을 대상으로 GJB2 유전자의 돌연변이 검색을 하여 발견된 6종류의 돌연변 이를 발견하였는데, 이 중 4종류(235delC, V37I, delAT, R143W)는 열성 유전을 보이고 있으나, N54K와 R75Q 돌변변이 경우에는 우성 유전을 보이고 있으며, 동시에 palmoplantar keratoderma를 동반하였다(Figure 1). 7. 세포 성장 분석 Hela 세포, Hela 세포에 벡터만을 transfection 한 것, wild type의 GJB2 유전자, N54K 돌연변 이, R75Q 돌연변이를 transfection 한 것과 wild type과 N54K를 cotransfection 한 것, wild type 과 R75Q를 cotransfection 한 것 이렇게 모두 7 종류의 세포들을 6 well plate에 각 well당 숫자의 세포를 배양하였다. 그 후 일정 시기가 지나고 나서 세포 수를 계산하였는데, 그 시기는 초기 배양 후 3일, 5일, 8일, 10일이 되는 시점에서 실험을 시행하였다. 세포 수를 계산하는 과정은 다음과 같이 하였다. 세포를 모으고 나서 5,000 rpm에서 5 분간 원심분리를 하였다. 상층을 버리고, pellet을 배양액으로 현 탁하였다. 균일하게 혼합된 현탁액과 0.4% trypan blue solution을 1:1로 혼합하였다. 이렇게 만들어진 용액을 멸균 팁으로 소량 취하여 혈 구계산판에 넣어 계산하였다. Figure 1. A patient and her mother with GJB2 gene N54K mutation. (A) Patient's hand with palmoplantar keratoderma. (B) Chromatograph of a patient and her mother with N54K. Both the patient and her mother showed the palmoplantar keratoderma, and the patient with GJB2 gene R75Q mutation also showed the palmoplantar keratoderma.

229 218 국립보건연구원보 2. Connexin 26 돌연변이의 기능 연구 Gap junction을 통과 할 수 있는 저분자량의 형광물질인 lucifer yellow를 이용하여 Hela 세 포에 GJB2 유전자의 wild type과 N54K, R75Q 돌변변이를 transfection 시킨 후 발현된 gap junction의 기능을 살펴보았다. 그 결과 wild type은 칼자국을 중심으로 먼 거리의 세포까지 형광을 관찰 할 수 있었으나, 두 종류의 돌연변 이는 상대적으로 가까이에 위치한 세포까지만 형광이 관찰 되었다(Figure 2). Figure 2에서 보듯이 wild type과 돌연변이 간의 lucifer yellow 확산의 차이를 볼 수 있었다. 여기에 더 하여 dominant negative 효과를 보기 위해 wild type이 transfection된 Hela 세포에 다시 N54K와 R75Q 돌연변이를 각각 transfection을 한 후 lucifer yellow를 사용하여 실험한 것에 서도 gap junction의 기능이 저하되는 것을 관 찰할 수 있었다(Figure 2). 이러한 결과들을 객 관화하기 위해 각 형광 이미지 상에서 동일한 면적 부분에 대해 5곳에서 형광을 나타내는 세 포의 수를 세어 평균을 낸 값을 비교하여 보았 는데, wild type이 transfection된 것을 100%로 가정하였을 때 N54K 돌연변이는 35.6%, R75Q 돌연변이는 42.6%, wild type과 N54K가 cotransfection된 것은 34.7%, wild type에 R75Q가 cotransfection된 것은 44.6%의 비율을 나타내었 고, wild type에 다시 wild type을 transfection을 한 상태에서 관찰한 경우가 121.8%를 보여 주고 있다(Figure 3). Figure 2. Functional analysis of GJB2 using scrape-loaded dye (Lucifer yellow) technique. (A) Hela Cell, (B) Wild-type (WT), (C) N54K, (D) WT-N54K, (E) R75Q, (F) WT- R75Q transfected cells (fluorescent microscopic view). Cell communication was examined by scrape-loaded lucifer yellow dye transfer into adjacent cells. Transfer of lucifer yellow into contiguous cells was detected in WT, but not in the others transfected Hela cells. Figure 3. Functional analysis of wild-type, mutant Cx26, and mutant Cx26 co-expressed with wild-type. The bars represent the number of cells received dye. The relative functional activity of gap junctional channels is given in percent. wt/wtcx26 is a transient cell state but the others are stable cell lines. 3. Connexin 26의 Immunocytochemistry Connexin 26 유전자의 wild type이 Hela 세포 에 transfection된 것과 N54K, R75Q 돌변변이가 transfection된 세포, 그리고 wild type과 각 돌연 변이를 cotransfection한 세포들에 대해 immunocytochemistry 실험을 시행하였다. Connexin 26

Ⅰ. 연구보고 219 단백질의 N 말단에 대한 1차 항체를 사용하였 는데, Hela 세포에서는 특정한 형광을 관찰 할 수 없었고, wild type과 다른 돌연변이를 비교 하여 보면, wild type의 connexin 26이 transfection된 세포는 세포막 부분까지 형광을 나타낸 것 에 반하여, N54K와 R75Q가 transfection된

230 Ⅰ. 연구보고 219 단백질의 N 말단에 대한 1차 항체를 사용하였 는데, Hela 세포에서는 특정한 형광을 관찰 할 수 없었고, wild type과 다른 돌연변이를 비교 하여 보면, wild type의 connexin 26이 transfection된 세포는 세포막 부분까지 형광을 나타낸 것 에 반하여, N54K와 R75Q가 transfection된 세포에 서는 세포막 부분의 모습이 wild type의 형광에 의 한 것만큼 명확한 결과를 보여 주지 못하였다 (Figure 4). Gap junction의 turn-over 과정을 살펴보면 소포체에서 아미노산으로 번역이 된 후, 골지체 로 이동이 되어 단량체의 connexin이 hexamer 상태인 connexon으로 조합을 이루고 나서 trans-golgi에서 microtubule을 따라 세포막으 로 이동한 다음, 세포막에서도 수평이동을 통해 동일하거나 조합 가능한 connexon끼리 plaque Membrane Overlay A B wtcx26 C D E N54K-Cx26 F G H R75Q-Cx26 I Figure 4. Immunocytochemistry of Hela cells using primary antibody against N- terminal portion of Cx26. (A) untransfected Hela cell, (B) Wildtype(WT), (C) N54K, and (D) R75Q transfected cells. Untransfected Hela cells showed no reaction. 세포막 부분의 존재 유무를 확실히 검증해 보기 위해 세포막을 관찰할 수 있는 Vybrant DiO cell labeling solution을 사용하였다. 그 결 과 wild type이 transfection된 connexin 26은 세포막 부위 중 일부분에서 형광이 겹쳐 노란 색으로 관찰 되는 것을 확인 할 수 있었다. 그 러나 N54K, R75Q 돌변변이가 transfection된 Hela 세포와, wild type에 N54K, R75Q 돌연변 이를 cotransfection한 Hela 세포에서는 세포막 과 connexin 26간에 겹치는 부분이 관찰되지 않아 세포막으로의 이동에 문제가 있음을 알 수 있었다(Figure 5). J K Wt/N54K-Cx26 L M N Wt/R75Q-Cx26 O Figure 5. Cx26 mutants N54K, R75Q, wt/n54k, and wt/r75q exhibit distinct subcellular localizations Ⅰ. Hela cells expressing Cx26, N54K, R75Q, wt/n54k, or wt/r75q(a,d,g,j,m) were fixed and labeled for the cell membrane. The overlay of Cx26 (C) was colocalized by a cell membrane and Cx26, but the others didn't show colocalizing regions in the cell membrane.

231 220 국립보건연구원보 를 이루면서 완전한 gap junction channel을 만 들게 되는 것이다. 따라서 세포막에서 connexin 26이 발견되지 않을 경우 골지체에 머물러 있 을 가능성을 의심할 수 있었다. 이에 골지체에 존재하는 golgin-97 단백질에 대한 항체인 anti-human golgin-97 mouse monoclonal antibody를 사용하여 알아본 결과, wild type의 connexin 26 유전자가 transfection된 Hela 세 포에서는 두 종류의 형광이 겹치는 부분을 관 찰 할 수 없었다. 그러나, N54K, R75Q 돌연변 이가 transfection된 Hela 세포, wild type에 N54K, R75Q 각 돌연변이를 cotransfection한 Hela 세포에서는 골지체와 connexin 26간의 겹 치는 부분이 관찰됨으로써 돌연변이형 connexin 26이 세포막으로 이동하지 못하고 골지체에 머 물러 있음을 알 수 있었다(그림 6). 4. 세포 성장 분석 결과 GJB2 유전자의 N54K와 R75Q 돌변변이는 난 청과 피부질환을 동반한다. 피부질환의 경우는 돌연변이에 의해 세포 성장 속도를 다르게 하 여 피부에서 세포가 사멸하여 떨어져나가는 정 도가 동시에 일어나지 않고, 곳곳의 부분에서 다른 시기로 이러한 현상이 발생함으로 인해 가시적으로 관찰할 수 있으며, 이러한 돌연변이 에 의한 효과는 세포성장을 더욱 빠르게 유발 시킴으로써 일부 부위의 피부가 상대적으로 잘 벗겨지는 것으로 보고 있다. 이에 Hela 세포, Hela 세포에 벡터만을 transfection 한 것, wild type의 GJB2 유전자, N54K 돌연변이, R75Q 돌 연변이를 transfection 한 것과 wild type과 N54K를 cotransfection 한 것, wild type과 R75Q 를 cotransfection 한 것 이렇게 모두 7종류의 세 포에 대하여 세포 수를 세어 분석하였다. 그 결과 Hela 세포의 성장 속도가 가장 빠르 며, 그 다음은 Hela 세포에 공벡터를 transfection 한 것이였다. 그리고 N54K와 R75Q 돌연변이의 성장 속도가 뒤를 이었고, wild type은 그 다음 이였다. 따라서, 이러한 결과를 볼 때 두 종류의 Figure 6. Cx26 mutants N54K, R75Q, wt/n54k, and wt/r75q exhibit distinct subcellular localizationsⅡ. Hela cells expressing Cx26, N54K, R75Q, wt/n54k, or wt/ R75Q(A,D,G,J,M) were fixed and labeled for the golgi apparatus. The overlay of Cx26(C) wasn't colocalized by a golgi and Cx26, but the others showed colocalizing regions in the cell. 돌연변이에 의해 세포 성장 속도가 빨라짐을 알 수 있었다. 그러나 wild type에 N54K와 R75Q 돌연변이를 각각 cotransfection 한 세포는 모두 wilde type보다 세포 성장 속도가 느림을 나타내 었는데, 이것은 이러한 돌연변이에 의한 세포 성장의 관점에서는 dominant negative 효과가 존재하지 않음을 알 수 있었다(그림 7).

232 Ⅰ. 연구보고 221 total cell number 1,000, , , , , , , , , ,000 0 Hela Vector N54K-Cx26 R75Q-Cx26 wtcx26 wt/r75q-cx26 wt/n54k-cx days Figure 7. Cell growth analysis of wild-type, mutant Cx26, and mutant Cx26 co-expressed with wild-type. For analysis of cell proliferation, the cells were plated in 6-well plates in triplicate and were counted at day 3, 5, 8 and 10 after plating. 결 론 Connexin 26은 N말단과 C말단 그리고, 한 개 의 세포질 방향으로의 intercellular loop, 두 개 의 extracellular loop로 구성되어 있다(Figure Ⅱ -1). 이 중 첫 번째 extracellular loop는 connexin 26의 세포막으로의 이동뿐만 아니라 gap junction channel의 기능에도 중요한 역할을 하 고 있다고 알려져 있다(Thomas T et al., 2004). 54번째 아미노산인 아스파라긴은 첫 번째 extracellular loop에 위치하고 있다. N54K와 R75Q 돌연변이는 이미 보고가 된 적 이 있었으나, gap junction의 기능을 살펴본 예 는 없었다. 대개의 GJB2 유전자 돌연변이가 비 증후군성이면서 열성 유전으로 나타나는데 비 해 N54K와 R75Q 돌연변이는 특징적으로 피부 질환을 동반하는 증후군성이면서 우성 유전을 보여주고 있다(Rouan F et al., 2001; Marziano NK et al., 2003). 본 연구대상 환자의 경우 이러한 증후군성을 보이는 이유가 피부에서 발현되는 다른 connexin의 영향에 의한 여부를 확인하기 위하 여 피부에서 발현되는 connexin 30(GJB6)과 connexin 31(GJB3)에 대하여 염기서열을 분석하 였으나 N54K와 R75Q를 보이는 돌연변이 환자 와 가족들 모두에서 돌연변이를 찾아 볼 수 없 었다. 따라서 피부에 발현되는 다른 connexin에 의해 피부 질환이 동반되기 보다는 connexin 26 의 특정한 아미노산 부위의 돌연변이가 다른 connexin에 영향을 미쳐 증후군성 난청을 유발 하는 것으로 보여진다. 이러한 피부질환 동반의 경중의 차이는 connexin 26 돌연변이가 피부에 서 발현되는 다른 종류의 connexin에 대한 trans-dominant negative 작용에 의한 것이다 (Thomas T et al., 2004). 본 연구를 통해 N54K와 R75Q 돌변변이가 Hela 세포에 tranfection되었을 때, connexin 26 이 기능을 하지 못하는 것을 관찰 할 수 있었 고, wild type의 connexin 26과 cotransfection을 하여 관찰하였을 때에도 기능을 하지 못한다는 것을 알아볼 수 있었다. 이러한 연구결과를 바 탕으로 이 부위의 돌연변이가 우성 유전의 양 상을 보인다는 것을 설명 할 수 있었다. 본 연구의 대상이 된 N54K와 R75Q 돌연변이 환자는 손에 피부 질환을 가지고 있었고, 이러 한 현상은 청력 손실과 함께 우성 유전의 형태 를 보여 주고 있다(Figure Ⅱ-3). 75번째 아미노 산인 아르기닌도 기능적 gap junction channel을 형성하는데 중요한 역할을 한다. 특히 Arg-75는 connexon간의 상호작용에 중요한 역할을 한다 고 알려져 있다. 75번째 아미노산인 아르기닌을 다른 아미노산으로 교체해 본 결과 gap junction channel의 활동이 저하되는 것으로 알려져 있다 (Oshima A et al., 2003). 따라서 GJB2 유전자 돌연변이의 표현형이 다양하게 나올 수 있는

233 222 국립보건연구원보 것은 connexin 26의 부위별 기능과 밀접한 영향 이 있는 것으로 보고 있다. 따라서 다른 connexin과 조합되어 connexon을 만들어 가는 과정에서 상호 작용하는 부위에 돌연변이가 발생할 경우 우성 유전으로 나타날 수 있고, 이것이 더 나아가 다른 connexin과 heteromer connexon을 이루어 gap junction channel의 기능에 영향을 미쳐 증후군성으로 나 타난다고 볼 수 있다. 참고문헌 1. Abe S, Usami S, Shinkawa H, Kelley PM, Kimberling WJ. Prevalent connexin 26 gene (GJB2) mutations in Japanese. J Med Genet 2000; 37(1): Brink PR, Cronin K, Banach K, Peterson E, Westphale EM, Seul KH, Ramanan SV, Beyer EC. Evidence for heteromeric gap junction channels formed from rat connexin43 and human connexin37. Am J Physiol 1997; 273(4 Pt 1):C1386-C Carrasquillo MM, Zlotogora J, Barges S, Chakravarti A. Two different connexin 26 mutations in an inbred kindred segregating non-syndromic recessive deafness: implications for genetic studies in isolated populations. Hum Mol Genet 1997; 6(12): el Fouly MH, Trosko JE, Chang CC. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp Cell Res 1987; 168(2): Estivill X, Fortina P, Surrey S, Rabionet R, Melchionda S, D'Agruma L, Mansfield E, Rappaport E, Govea N, Mila M, Zelante L, Gasparini P. Connexin-26 mutations in sporadic and inherited sensorineural deafness. Lancet 1998; 351(9100): Gellhaus A, Dong X, Propson S, Maass K, Klein-Hitpass L, Kibschull M, Traub O, Willecke K, Perbal B, J.Lye S and Winterhager E. Connexin43 Interacts with NOV. J Biol Chem 2004; 279(35): Gerido DA, White TW. Connexin disorders of the ear, skin, and lens. Biochim Biophys Acta 2004; 1662(1-2): Goodenough DA, Goliger JA, Paul DL. Connexins, connexons, and intercellular communication. Annu Rev Biochem 1996; 65: He DS, Jiang JX, Taffet SM, Burt JM. Formation of heteromeric gap junction channels by connexins 40 and 43 in vascular smooth muscle cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96(11): Heathcote K, Syrris P, Carter ND, Patton MA. A connexin 26 mutation causes a syndrome of sensorineural hearing loss and palmoplantar hyperkeratosis (MIM ). J Med Genet 2000; 37(1): Hsieh CL, Kumar NM, Gilula NB, Francke U. Distribution of genes for gap junction membrane channel proteins on human and mouse chromosomes. Somat Cell Mol Genet 1991; 17(2): Kelsell DP, Dunlop J, Stevens HP, Lench NJ, Liang JN, Parry G, Mueller RF, Leigh IM. Connexin 26 mutations in hereditary non-syndromic sensorineural deafness. Nature 1997; 387(6628): Kumar NM, Gilula NB. The gap junction communication channel. Cell 1996; 84(3): Lagree V, Brunschwig K, Lopez P, Gilula NB, Richard G, Falk MM. Specific aminoacid residues in the N-terminus and TM3

234 Ⅰ. 연구보고 223 implicated in channel function and oligomerization compatibility of connexin43. J Cell Sci 2003;116(Pt 15): Lee SW, Tomasetto C, Paul D, Keyomarsi K, Sager R. Transcriptional downregulation of gap-junction proteins blocks junctional communication in human mammary tumor cell lines. J Cell Biol 1992; 118(5): Liu Y, Ke X, Qi Y, Li W, Zhu P. Connexin26 gene (GJB2): prevalence of mutations in the Chinese population. J Hum Genet 2002; 47(12): Maestrini E, Korge BP, Ocana-Sierra J, Calzolari E, Cambiaghi S, Scudder PM, Hovnanian A, Monaco AP, Munro CS. A missense mutation in connexin26, D66H, causes mutilating keratoderma with sensorineural deafness (Vohwinkel's syndrome) in three unrelated families. Hum Mol Genet 1999; 8(7): Mignon C, Fromaget C, Mattei MG, Gros D, Yamasaki H, Mesnil M. Assignment of connexin 26 (GJB2) and 46 (GJA3) genes to human chromosome 13q11-->q12 and mouse chromosome 14D1-E1 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet 1996; 72(2-3): Oguchi T, Ohtsuka A, Hashimoto S, Oshima A, Abe S, Kobayashi Y, Nagai K, Matsunaga T, Iwasaki S, Nakagawa T, Usami S. Clinical features of patients with GJB2 (connexin 26) mutations: severity of hearing loss is correlated with genotypes and protein expression patterns. J Hum Genet 2005; 50(2): Park HJ, Hahn SH, Chun YM, Park K, Kim HN. Connexin26 mutations associated with nonsyndromic hearing loss. Laryngoscope 2000; 110(9): Rabionet R, Gasparini P, Estivill X. Molecular genetics of hearing impairment due to mutations in gap junction genes encoding beta connexins. Hum Mutat 2000; 16(3): Rouan F, White TW, Brown N, Taylor AM, Lucke TW, Paul DL, Munro CS, Uitto J, Hodgins MB, Richard G. trans-dominant inhibition of connexin-43 by mutant connexin-26: implications for dominant connexin disorders affecting epidermal differentiation. J Cell Sci 2001; 114(Pt 11): Shi GZ, Gong LX, Xu XH, Nie WY, Lin Q, Qi YS. GJB2 gene mutations in newborns with non-syndromic hearing impairment in Northern China. Hear Res 2004; 197 (1-2): Sosinsky G. Mixing of connexins in gap junction membrane channels. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92(20): Thomas T, Telford D, Laird DW. Functional domain mapping and selective trans-dominant effects exhibited by Cx26 disease-causing mutations. J Biol Chem 2004; 279(18): Wang XG, Peracchia C. Chemical gating of heteromeric and heterotypic gap junction channels. J Membr Biol 1998; 162(2): Willecke K, Eiberger J, Degen J, Eckardt D, Romualdi A, Guldenagel M, Deutsch U, Sohl G. Structural and functional diversity of connexin genes in the mouse and human genome. Biol Chem 2002; 383(5): Xiao ZA, Xie DH. GJB2 (Cx26) gene mutations in Chinese patients with congenital sensorineural deafness and a report of one novel mutation. Chin Med J (Engl ) 2004; 117(12): Zelante L, Gasparini P, Estivill X, Melchionda

235 224 국립보건연구원보 S, D'Agruma L, Govea N, Mila M, Monica MD, Lutfi J, Shohat M, Mansfield E, Delgrosso K, Rappaport E, Surrey S, Fortina P. Connexin26 mutations associated with the most common form of non-syndromic neurosensory autosomal recessive deafness (DFNB1) in Mediterraneans. Hum Mol Genet 1997; 6(9): Connexins-deafness homepage (http// es/deafness) 31. NCBI (National Center for Biotechnology Information) homepage ( nih.gov)

236 Ⅰ. 연구보고 225 Functional study of syndromic GJB2 mutant alleles detected in Korean deaf patients H.S. Jin, S.M. Eom, H.Y. Park and S.K. Koo Division of Cardiovascular Diseases, Department of Biomedical Sciences, NIH, Seoul Korea Purpose : GJB2 (connexin 26) gene is probably a major responsible gene for genetic hearing loss in Korean, but the rest of causative gene is over 80%. In this study, we investigated the pathogenic mechanism of two mutations ( N54K and R75Q ) in GJB2 gene. Methods : We generated HeLa cells expressing a mutant connexin 26 with N54K and R75Q mutant. Functionality of the mutated connexin 26 was determined by the method of scrape-loaded dye transfer. Fluorescent immunocytochemistry was used to verify expression and subcellular localization of Connexin 26. Results : To functional study of these two alleles, we transfected normal or the mutant type of GJB2 genes into the gap junctional intercellular communication (GJIC) deficient HeLa cells. When we examined the GJIC with scrape-loading transfer of Lucifer yellow, the transfectant with normal connexin 26 showed the active GJIC whereas the transfectant with mutant form of connexin 26 or vector only control did not show any sign of GJIC. Moreover, the co-transfectant with mutant and normal form of connexin26 also showed the blocking of GJIC. The immunocytochemistry examination of transfected cells showed that these mutations of GJB2 resulted in the changes of the subcellluar localization of GJB2, which indicated that the failure of membrane targeting or plaque formation result in the impaired GJIC. Conclusions : This study clearly demonstrates the loss of GJB2 function in which transfected into Hela cells with mutants and reaffirms the dominant negative effect of GJB2 with mutations. Key words : GJB2, connexin 26, genetic hearing loss, mutation This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

237 226 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 임신성 고혈압 발생에 있어서 leptin과 leptin receptor 유전자의 다형성 분석 국립보건연구원 생명의과학센터 심혈관질환팀, 이화여자대학교 의과대학 1, 성균관대학교 의과대학 2 이광수, 엄상미, 김영주 1, 류현미 2, 박현영 목 적 : 임신성 고혈압은 임신 20주 이후에 고혈압과 단백뇨가 동반되는 질환으로서, 모성 및 주산 기 사망률과 이환율을 높이는 중요한 원인이다. 임신성 고혈압의 위험인자로 체질량지수의 증가가 알 려져 있으며, 환자의 태반에서 leptin 유전자의 발현이 증가함이 보고되어 있다. 따라서 본 연구에서 는 leptin, leptin receptor 유전자의 다형성 연구를 통해 환자와 정상 임부에 있어서 대립자의 빈도 를 조사하고, 임신성 고혈압 발생과의 상관성을 분석하였다. 방 법 : Genomic DNA는 임신성 고혈압을 나타낸 임산부 226명과 정상적 임신과정을 진행한 임산 부 238명의 말초혈액에서 얻었다. 유전형 분석은 SNP-IT와 SNaPshot assay 방법을 사용하였다. 통 계처리는 SPSS12.0 프로그램을 사용하여, χ2 test를 수행하였으며, haplotype 구성을 위하여 Haploview3.2를 사용하였다. 결 과 : 평균 체질량지수는 임신성 고혈압 환자의 경우 28.0kg/m 2 으로 정상 그룹 26.0kg/m 2 에 비 해 의미 있게 증가되어 있었다 (P<0.001). 그러나 leptin 유전자의 promoter region과 3 UTR region 에서 선정된 3개 SNP의 다형성 및 leptin receptor 유전자의 promoter와 intron 1, exon 3, 5, 13 에 위치한 5개 SNP의 다형성은 임신성 고혈압 임산부와 정상 임산부 그룹간의 차이를 발견할 수 없 었다. 결 론 : 본 연구의 결과를 통해 leptin 및 leptin receptor 유전자의 다형성이 임신성 고혈압의 발 생과정에 직접적인 영향을 주기 보다는, 아직 확인되지 않은 다른 유전자들과의 상호작용을 통하여 임신성 고혈압을 유발할 것으로 예상된다. 중심단어 : 임신성 고혈압, leptin, leptin receptor, 유전자 다형성 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

238 Ⅰ. 연구보고 227 Association study of LEP and LEPR gene polymorphisms in patients with pre-eclampsia K.S. Lee, S.M. Eom, Y.J. Kim 1, H.M. Ryu 2 and H.Y. Park Division of Cardiovascular Diseases, Department of Biomedical Sciences, NIH, Seoul Korea, College of Medicine, Ewha Womans University, Seoul Korea 1, Sungkyunkwan University School of Medicine, Seoul Korea 2 Purpose:Pre-eclampsia is known as a major cause of maternal and fetal mortality and morbidity, and affects 2-7% of all pregnancies. Body mass index (BMI), one of the risk factors, is higher in women with pre-eclampsia. Leptin gene expression also increases in the placenta of women with pre-eclampsia. In this study, we investigated the association between leptin and leptin receptor gene polymorphisms and risk of pre-eclampsia. Methods:Genomic DNA was obtained from 226 women with pre-eclampsia and 238 healthy women with normal pregnancy. Genotyping was analyzed by SNP-IT and SNaPshot assay. Genotype distribution and allele frequencies were conducted by χ 2 test using SPSS12.0 and estimates of haplotype were performed using Haploview3.2 software. Results:The mean BMI in the pre-eclampsia and control group were 28.0kg/m 2 and 26.0kg/m 2, respectively (P<0.001). We selceted three polymorphisms in promoter and 3' UTR region in leptin gene and five polymorphisms in promoter, intron 1, exon 3, 5, and 13 in leptin receptor gene. No significant association between genotype distributions or haplotype frequencies in women with pre-eclampsia relative to controls was found. Conclusions:Leptin and leptin receptor gene polymorphisms studied are unlikely to be major predisposing factors for pre-eclampsia. Key words:pre-eclampsia, leptin, leptin receptor, polymorphism This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

239 228 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 비만과 당뇨병 관련 유전자들의 기능 연구 국립보건연구원 생명의과학센터 대사영양질환팀 서영호, 조명국, 정명호 목 적:비만과 제 2형 당뇨병의 분자수준에서의 원인을 규명하기 위하여 비만 모델 쥐에서 특이적 으로 발현되는 두개의 유전자들의 기능에 관한 분석을 하였다. 방 법:비만형성과 제 2형 당뇨병의 발병 중의 후보 유전자인 neuronatin과 ATF3의 역할을 증명 하기 위하여 우선은 이들 각각의 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 제작하였으며 이를 3T3-L1 지방 세포에 도입시켜 각각의 유전자들을 과량 발현 시켰다. 그리고 이들 유전자 발현의 결과로 미분화된 3T3-L1 세포의 지방형성과정과 분화된 3T3-L1 지방세포의 기능에 미치는 영향을 확인 하였다. 결 과:Neuronatin의 과량발현은 세포내 칼슘의 양을 증가시켜 CREB의 활성화를 유발시키는 것 을 확인 하였다. 이에 따라 지방형성과정에 필수적인 전사인자인 C/EBPβ, C/EBPδ, C/EBPα 와 PPARγ의 발현을 증가시켰다. 이러한 작용으로 neuronatin은 3T3-L1 세포의 지방세포로의 분화과 정을 촉진시킬 수 있을 것으로 예상된다. 또 다른 후보 유전자인 ATF3는 아디포넥틴의 프로모터에 결합하여 아디포넥틴의 전사를 억제시킬 수 있는 것을 확인 하였다. 따라서 ATF3는 지방조직에서 아 디포카인의 발현을 조절하는 핵심적인 기능을 가지고 있을 가능성이 매우 높다. 결 론:본 연구의 결과들은 후보 유전자인 neuronatin과 ATF3는 지방세포로의 분화과정과 지방세 포의 내분비 기능을 조절하는 중요한 기능을 가지고 있을 가능성을 보여 주었다. 그러므로 이들 유전 자들을 대상으로 한 향 후 연구는 분자수준에서의 비만과 제 2형 당뇨병의 기전을 이해하는 데 중요 한 단서를 제공해 줄 수 있을 것으로 기대된다. 중심 단어:지방형성과정, ATF3, 당뇨병, neuronatin 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

240 Ⅰ. 연구보고 229 Functional study on the genes associated with obesity and type 2 diabetes Y.H. Suh, M.K. Jo and M.H. Jung Division of Metabolic Diseases, Center for Biomedical Science, NIH, Seoul Korea Purpose:To understand the molecular basis of obesity and type 2 diabetes, we characterized the functions of differentially expressed genes in Zucker diabetetic fatty (ZDF) rats. Methods:In an effort to identify the roles of candidate genes (neuronatin and activating transcription factor 3, ATF3) in the adipogenesis and the pathogenesis of type 2 diabetes, firstly, we constructed vectors expressing each gene. Each gene was overexpressed in 3T3-L1 cells by transfection and retroviral infection. The effects of overexpressing each gene on the adipogenesis of 3T3-L1 preadipocytes and the functions of 3T3-L1 adipocytes were investigated. Results:Overexpression of neuronatin stimulated the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes into mature adipocytes with early induction of adipogenic transcription factors such as CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP)β, C/EBPδ, C/EBPγ, and peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) through the elevation of intracellular free calcium level and enhanced phosphorylation of camp Response Element-Binding Protein (CREB). The other gene, ATF3 could bind to the promoter region of adiponectin and repress its expression in our system. Therefore, it is highly possibility that ATF3 is a key regulator to control the expressions of adipokines in adipose tissue. Conclusions:These data suggest that candidate genes (neuronatin and ATF3) have important functions for the differentiation and the endocrine function of adipocytes. Thus, Further studies of these genes will provide novel molecular clues to understand the mechanism of obesity and type 2 diabetes. Key words:adipogenesis, ATF3, diabetes, neuronatin This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

241 230 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 KLF에 의한 hepatic gluconeogenesis 조절연구 국립보건연구원 생명의과학센터 대사질환팀 서영호, 방정현, 문창숙, 정명호 목 적 : 간에서의 glucose 합성 조절은 혈중의 glucose 농도를 적절하게 유지하는데 아주 중요한 과정으로 이 과정에서 병적인 변화가 제2형 당뇨병 발병의 중요원인으로 작용한다. 그러므로 gluconeogenesis에 key enzyme인 PEPCK의 유전자발현을 조절하는 기전을 규명하면 당뇨병을 치료 할 수 있는 치료제개발이 가능할 것이다. 그러므로 본 연구에서는 지금까지 연구되어 있지 않은 Kruppel-like factor (KLF)에 의한 PEPCK 조절기작을 연구하여 당뇨병의 치료 및 예방에 응용하고 자 하였다. 방 법 : KLF에 의한 PEPCK 유전자 발현 및 조절기작을 밝히기 위해 PEPCK promoter내 KLF responsible region을 규명하고 그것의 기능을 연구하였다. 또한 KLF와 다른 transcription factor 와의 상호연관성도 규명하여 KLF에 의한 PEPCK 조절기작을 이해하고자 하였다. 결 과 : KLF4가 PEPCK promoter 활성을 현저히 증가시킴을 PECK promoter 활성 측정 및 PEPCK mrna 측정을 통해서 확인할 수 있었다. PEPCK 발현에 미치는 영향을 다양한 길이의 PEPCK promoter response를 통해 조사한 결과 -465 base pair길이 안쪽의 PEPCK promoter region에 KLF response element가 존재함을 확인하였고, 그 binding motif가 CACCC임을 mutation의 도입을 통해 증명하였으며 EMSA를 통해 그 binding을 확인하였다. 또한 camp나 dexa 에 의한 PEPCK promoter활성의 증가가 KLF4 expression에 의해 현저히 증가함을 알 수 있었으며 PGC-1과 CBP (CREB binding protein), CREB 등이 KLF에 의한 PEPCK promoter 활성증가를 현 저히 증가시키는 것을 알 수 있었다. 결 론 : 이상의 결과에 의하면 따라서 KLF4는 PEPCK의 유전자발현을 증가시킬 뿐만아니라 특히 fasting 때의 PEPCK 유전자조절에 CREB, PGC-1등과 함께 중요한 역할을 함을 알 수 있었다. 중심단어 : 제2형 당뇨, PEPCK, KLF4. 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

242 Ⅰ. 연구보고 231 서 론 제2형 당뇨는 insulin 저항성에 의해 특성화되 어지는데 glucogenic enzyme의 활성을 조절하기 위한 insulin의 inability를 유도함으로써 hepatic glucose output이 증가하고 그러므로 혈중내 glucose level의 상승을 초래한다. 제2형 당뇨환 자의 경우, hepatic gluconeogenesis의 rate가 일반 환자와 비교하여 상당히 증가되었기 때문에 당 뇨병환자는 fasting때에도 현저한 hyperglycemia 를 초래한다. 그러므로 gluconeogenic 효소들을 조절하는 signaling mechanism이 중요한데, 그것은 insulin sensitivity를 회복시키기 위한 약리학적 intervention 을 위한 주요한 target이 되기 때문이다. 예를들어, metformin (40년 이상 임상적으로 이용되어진, 작용 기작은 잘 알려지지 않은 항 당뇨제)는 hepatic glucose 생성을 감소시킨다고 알려져있다. 물론, metformin이 glycogenolysis를 감소시키는 것으로도 알려져 있으나 주로 gluconeogenesis의 rate를 감소시 킴으로써 당뇨병치료제의 역할을 한다고 알려지고 있다. gluconeogenic gene인 PEPCK와 G-6-Pase gene 의 transcriptional regulation은 다양한 전사인자와 다 른 단백질의 복잡한 interaction을 통해 일어난다. KLF는 DNA-binding transcriptional regulator로 서 분화와 발생등을 조절하는 것으로 알려져 있 다. KLF는 Cys2/His2의 zinc fingers motif를 가지 는 데 human genome에서 두 번째로 transcription factor에서는 가장 많은 Cys2/His2의 zinc fingers motif를 가지고 있다. 수많은 finger protein들과 homolog을 가지지만 KLF protein은 각 finger들 사이에 추가의 conserved residue를 가지며 이것 으로 KLF protein은 다른 그룹과 구별되는 family로 규명된다. KLF family는 Sp1 binding site인 GC-box, CACCC-boxes등의 conserved sequence에 binding하여 서로 다른 전사 능력을 가지며 다양한 mechanism을 통해 기능을 한다 (1,2,7). 그러므로 본 연구에서는 지금까지 연구 되어 있지 않은 KLF에 의한 PEPCK 조절기작을 연구하여 당뇨병의 치료 및 예방에 응용하고자 하였다(3). 본 연구에서는 당뇨병발병에 관련된 유전자를 발굴하기 위해 cdna chip (5,000 개의 유전자가 집적된 rat cdna chip)을 사용하여 당뇨병 쥐 모델인 ZDF 와 대조쥐인 ZL의 liver, skeletal muscle, adipocyte에서 발현차이를 나타내는 유전 자들을 발굴하여 보고한 바 있다(9,10). 그 중 transcription factor인 KLF5가 ZDF의 liver에서 ZL보다 높게 발현되어 당뇨병 발병에 관련성이 있을 것으로 추정하였다(4,5,6,8). 그러므로 KLF 에 의한 당뇨병발병 가능성을 검증하기 위해 KLF에 의한 gluconegenesis gene의 발현을 살펴 본 결과 expression vector을 이용하여 HepG2에 KLF을 overexpression시켰을 때 gluconeogenic gene인 PEPCK 유전자의 발현이 증가함을 보였 다. 앞에서 언급한 바와 같이 지금까지는 KLF에 의해 gluconeogenic gene의 발현이 조절되어진다 는 보고가 없었기 때문에 본 연구는 KLF에 의 한 gluconeogenic gene 조절기작을 밝힘으로 당뇨 병의 치료에 도움을 줄 수 있을 것이다. 따라서 PEPCK promoter를 분리하고 이를 이 용하여 KLF에 의해 response하는 region 찿아 분석하면 새로운 gluconeogenesis 조절기작을 밝 혀내고자 한다. 재료 및 방법 1. 세포 배양 실험에 사용하는 세포는 간암 세포인 HepG2 을 사용하였. 37, 5% CO 2 에서 배양하였으며 사용한 배지는 10% FBS, 2 mm glutamine, 그 리고 penicillin-streptomycin이 든 DMEM 배지 (GIBCO BRL)에서 배양하였다. 2. 대상유전자의 프로모터인자 분석 대상유전자의 프로모터인자는 대상유전자의 human cdna의 mrna가 만들어 지는 부분의

243 232 국립보건연구원보 앞쪽부분을 예상 프로모터로 결정하였다. Human genomic DNA을 template으로 대상유전자의 mrna가 만들어 지는 부분의 2000base pair nucleotide 앞쪽부터 PCR하여 증폭하였다. 이렇 게 얻은 예상 프로모터를 template으로 Tess ( 통한 컴퓨터 분석으로 전사조절인자 결합부위를 예측하고 이 를 기준으로 순차적으로 절단된(serial truncation) 프로모터를 PCR을 통하여 증폭하였다. 합성된 예상 프로모터는 pgem-t easy vector에 삽입한 후, luciferase 유전자와 융합 시킬 수 있는 pgl3 basic vector(promega)에 KpnI과 XhoI의 제한효소 (restriction enzyme)를 이용하여 삽입하였다. 3. 과발현 벡터(expression Vector) 제조 및 세포주 내 발현 HepG2 간암 세포의 mrna로부터 RT-PCR 통한 cdna를 합성하여 대상전사조절인자의 open reading frame을 포함하는 부분을 PCR을 통해 증폭한 후, pgem-t easy vector에 삽입 하였다. 이렇게 얻은 대상전사조절인자의 유전 자를 포유동물 세포에서 단백질 과발현시키는 vector인 pcdna3(invirogen)에 BamHI과 EcoRI 의 제한효소를 이용하여 삽입하였다. 얻어진 벡 터는 미생물에서 대량생산 후, HepG2 간암세포 에 LIPOFECTAMINE plus (GIBCOBRL)를 사용 하여 과발현시켰다. 요약하면 /6well의 세포에 1ug의 DNA와 PLUS 시약을 혼합한 후 LIPOFECTAMINE을 다시 혼합하고 15분간 방 치한다. 우혈청배지를 넣지 않은 세포에 고르게 뿌린 후 3시간 후에 우혈청을 첨가하였다. 4. 면역 분석법(Western blotting analysis) 500μg의 lysates를 3μg의 antibody와 18시간동 안 4 에서 반응 시킨 후 protein A bead를 넣 어 2시간동안 반응시킨 후 binding buffer로 여러 번 씻어준 후 sample을 boliling 한 후 SDS-PAGE 를 수행하였다. Immunoblotting analysis는 40μg의 cleared lysate 단백질을 10 또는 12%의 SDS- polyacrylamide gel로 분리한 후에 수행하였다. nitrocellulose membrane으로 transfer한 후 4 에 서 5% non-fat dry milk 가 든 PBST 용액을 넣 고 밤새도록 blocking 하며 Primary antibody를 1:1000의 비율로 secondary antibody는 1:2500의 비율로 희석하여 사용하였다. 6. Luciferase 분석법 프로모터가 삽입되어 있는 pgl3 vector와 대 상 전사조절인자의 과발현 벡터를 HepG2 간암 세포에 삽입 시킨 후, 48시간 후에 세포를 모았 다. 이렇게 모은 세포는 PBS buffer로 세척 후, reporter lysis buffer(promega)을 이용하여 분쇄여 luciferase 활성을 측정하였다. luciferase 활성은 Dual-Luciferase reporter assay system을 이용하여 Luminometer (Berthold LB950)로 측정하였다. 7. EMSA Cell로부터 nuclear extract는 antipain, chymostatin, pepstatin A, leupeptin(2μg/ml each)과 trypsin inhibitor (4μg/ml)를 포함한 용액을 이용하여 분 리하였다. 단백질의 양은 bovine serum albumin 을 standard로 한 bradford protein assay (Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다. 10mmol/L Tris ph7.8, 50mmol/L NaCl, 1mmol/L EDTA, 5%(v/v) glycerol, 0.5mmol/L dithiothreitol, 0.5μg poly (di-dc)를 포함한 용액에 nuclear extract 5 μg을 넣고 실온에서 5분간 방치한 후 0.5ng의 방사성 동위원소로 표지한 oligonucleotide를 첨 가하였다. Oligonucleotide의 한 가닥을 T4 polynucleotide kinase와 [γ-32p]-atp를 이용하 여 표지한다. Competition 실험을 하기 위하여 50배의 표지되지 않은 oligonucleotide를 이용하 였다. 25 에서 20분간 반응한 후 dye solution 5μl(0.01% bromophenol blue, 0.05% xylene cyanol, 5% ficoll)를 첨가하였다. Sample을 5% polyacrylamide gel에 loading 한 후 140V 4, 2시 간 동안 전개시킨 후 건조 시켜 autoradiograph 하였다. Supershift assay를 위해서는 표지된

244 Ⅰ. 연구보고 233 oligonucleotide와 반응시키기 전에 nuclear extract 를 미리 30분간 1μg의 항체와 반응시켰다. 8. 실험동물 및 실험식이 6주령의 쥐를 12시간씩의 밤낮주기를 조정하 고 22 에서 사육하였다. 마우스를 체중에 따라 난괴법을 이용하여 6군으로 나눈 다음 8주 동 안 실험계획에 따라 각각의 실험식이로 사육하 였다. 절식 상태 쥐는 물은 자유롭게 섭취하되 48시간 동안 금식을 시켰다.. 9. 혈액 및 조직채취 혈액은 복부대정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈장을 분리하여 -20 에 보관하였다. 혈액채취 후 쥐를 CO 2 gas로 마취한 후 위 조직을 분리 하여 액체질소에 재빨리 담가 -70 에 보관하 였다. 10.통계처리 통계는 SAS statistical analysis program을 이용하 여 군간의 유의성을 one-way analysis of variance (ANOVA)를 이용, 0.05에서 유의수준을 검증하였 으며, 군간의 유의성은 Duncan's multiple range test를 이용하여 군간의 차이를 평가하였다. 11. Genomic DNA PCR Human leukocyte로부터 genomic DNA purification kit (QIAGEN)를 사용하여 genomic DNA를 분리한 후, PCR template로 사용하였다. 증폭시키고자 하 는 유전자에 특이적인 염기서열들을 이용하여 primers를 제작하였으며, 비 특이적 산물이 나타나 지 않도록 반응조건과 반응횟수를 최적화하였다. KLF5를 포함하여 어떤 family의 KLF가 PEPCK 발현에 관여하는지를 측정하기 위해 KLF5, KLF2, KLF4, KLF15의 cdna expression vectors 을 제조한 다음 HepG2 cell에 각각의 expression vector를 transfection하여 KLF family들을 HepG2에 overexpression 시킨후 1.3 Kb의 PEPCK promoter 활성을 측정하였다 E E E E E E E E E E+00 pcdna3.1(+) klf5 klf15 BTEB2 klf4 Fig. 1. Effect of KLF family on promoter activity of PEPCK Fig. 1에서 보는 바와 같이 KLF4가 PEPCK의 promoter활성을 가장 크게 증가시킴을 알 수 있 었다. KLF4에 의한 PEPCK expression 증가는 KLF4 expression vector의 양에 의존하여 증가하 였다 (Fig. 2). 1.20E E E E E+07 결 과 2.00E E+00 0ug 0.1ug 0.4ug 0.8ug 1.2ug 1.6ug 1. KLF family에 의한 PEPCK 발현 측정 DNA chip 실험에서 발현차이를 나타내는 Fig. 2. Effect of KLF4 on promoter activity of PEPCK

245 234 국립보건연구원보 2. 당뇨동물모델의 간에서의 KLF4 발현 측정 KLF4에 의한 당뇨병발병 관련성을 추정하기 위해 당뇨동물모델인 ZDF (Zucker diabetic fatty rat)의 liver에서 KLF4의 발현을 control rat인 ZL(Zucker lean rat)과 비교하였다. Fig. 3 에서 보는바와 같이 ZDF liver에서 KLF4의 발 현이 ZL보다 증가함을 확인하였다. 또한 Expression vector을 이용하여 HepG2에 KLF4을 overexpression시켰을 때 gluconeogenic gene인 PEPCK 유전자의 발현이 증가함을 보였다 (Fig. 4). 이러한 결과는 KLF4에 의해 gluconeogenic gene의 발현이 조절되어진다는 것을 알 수 있다. Fig. 4. Effect of KLF overexpression on PEPCK expression 3. KLF respose region 확인 KLF4에 의해 response하는 region을 identification 하기위해 1.3 Kb PEPCK promoter을 5 부터 일정 부분이 deletion된 promoter constructer들을 제조하 였다 (Fig. 5). Fig. 3 Expression of KLF4 in liver of ZDF rats Fig. 5. Construction of 5 deleted PEPCK promoters deleted construct들을 KLF4 expression vector와 함께 FaO cell에 transfection한 후 promoter activity를 측정한 결과 -158 PEPCK promoter에 서도 KLF4 expression vector에 의해 promoter 활성이 증가하였다. 이는 KLF4에 response하는 region이 -158 region내에 존재함을 알 수 있었 다 (Fig. 6).

246 Ⅰ. 연구보고 E E E E E E E E+07 pcdna klf4-158 region내에 KLF4의 responsive region을 identificaton하기 위해 TRANSFEC program으로 search한 결과 +24/+34 region에 KLF consensus binding site (CACCC)를 확인할 수 있었다 (Fig. 7). 0.00E Fig. 6. Effect of KLF4 on activities of 5 deleted PEPCK promoters Fig. 7. Putative KLF binding site on the PEPCK promoter +24/+34 region에 존재하는 putative KLF site 가 실질적으로 KLF4에 response 하는지를 검증 하기 위해 CACCC를 포함한 24bp를 deletion시 킨 -158 PEPCK promoter construct (Fig. 8)을 제조한 후 KLF4에 의한 promoter activity 변화 를 측정하였다. Fig. 8. Construction of -158 mutant PEPCK promoter deleted putative KLF binding site

247 236 국립보건연구원보 Fig. 9. Effect of KLF4 on the activity of -158 PEPCK promoter deleted putative KLF responsive region Fig. 9에서 보는 바와 같이 24bp의 putative binding site을 deletion시킨 mutant에서는 KLF4 에 의한 promoter 활성 증가를 볼 수 없었다. 그러므로 +24 region에 존재하는 CACCC이 KLF4에 의해 response하는 region임을 확인 할 수가 있었다. 실질적으로 +24 region에 KLF4가 binding 하는지를 확인하기 위해 HepG2 nuclear extract을 분리한 후 EMSA를 행하였다. CACCC region의 24bp를 probe로 하여 HepG2 nuclear extract와 반응을 시켰을 때 Fig. 10에서 보는 바와 같이 24bp와 결합된 band를 확인할 수 있 었고 이는 homologous한 region의 24bp sequence 나 consensus KLF sequence에 의해 competition 하였으며 KLF4 antibody에 의해 binding band가 shift됨을 관찰할 수 있었다. 이 결과로 +24 region 24bp에 KLF4가 실질적으로 binding함을 확인할 수 있었다. Fig. 10. EMSA using 24 bp of putative KLF site of PEPCK 4. KLF에 의한 PEPCK 유전자의 조절기작 지금까지 알려진 바로는 gluconeogenic gene인 PEPCK gene의 transcriptional regulation은 다양한 전사인자와 다른 단백질의 복잡한 interaction을 통해 일어난다. HNF-3 family protein은 PEPCK promoter내의 insulin responsive site (IRS)와 부분 적으로 overlap되는 부위에 작용함으로써 HNF-3 는 PEPCK의 insulin response를 중개하는 transcription factor로서 보고되어졌다. 또한 Foxo 은 phosphorylation 에 의한 nuclear exclusion 등 을 통해 insulin에 의한 PEPCK의 response을 매 개하는 transcription factor로 알려져 있다. 특히 PEPCK는 fasting 상태에서 발현이 증가하기 때 문에 fasting 상태에서 증가되어지는 camp 등에 의한 transcriptional regulation 기작들이 많이 보 고되어졌다. PGC-1은 camp에 의해 발현이 증가됨으로써 PEPCK 의 발현을 증가시키는 것으로, PGC-1의 recruitment 또는 modifcation, 또는 PGC-1의 발

248 Ⅰ. 연구보고 237 현 자체가 gluconeogenesis의 조절에 중요한 역 할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 또한 camp에 의해 활성화되는 CREB (camp responsive element binding protein)은 직접 PEPCK promoter의 responsive site에 binding 하 여 PEPCK 발현을 증가시킬 뿐만아니라 PGC-1 의 발현을 증가시킴으로 PEPCK의 발현을 조절 하는 중요한 transcription factor로 알려져 있다. 그러므로 간에서 CREB에의한 PGC-1의 activation이 당뇨병의 phathogenesis에 중요하게 관여하고 있음을 암시해 주고 있다. 따라서 PEPCK의 expression을 증가시키는 KLF4도 fasting 상태에서의 PEPCK 유전자 발 현에 영향을 미치는 지를 조사하였다. 이를 위 해 glucocorticoid, camp 등이 KLF에 의한 PEPCK 발현에 어떤 영향을 미치는지를 PECK promoter 활성을 측정함으로써 확인하였다. Fig. 11. Effect of camp and dexametazone on KLFmediated PEPCK expression Fig. 11에서 보는 바와 같이 camp나 dexa에 의한 PEPCK promoter활성의 증가가 KLF4 expression에 의해 현저히 증가함을 알 수 있었 다. 그러므로 KLF4는 fasting상태에서의 PEPCK 발현 조절에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다. fasting상태에서 KLF에 의한 PEPCK 발 현조절을 다시 증명하기 위해 PEPCK promoter 에 존재하는 KLF responsive region을 deletion시 킨 PEPCK promoter을 이용하여 camp나 dexa 에 의한 영향을 살펴보았다. Fig. 12. Effect of camp and dexametazone on the activity of KLF4-mediated PEPCK promoter in -158 PEPCK deleted KLF binding site Fig. 12에서 보는 바와 같이 KLF responsive region을 deletion시킨 -158 PEPCK promoter에서 camp나 dexa에 의한 promoter 활성증가는 있 으나 KLF4에 의한 PEPCK promoter 활성증가 는 볼 수 없었다. 이와같은 결과로써 KLF4가 camp나 dexa에 의한 PEPCK 활성조절에 중요 한 역할을 함을 확인할 수가 있었다. Fasting 상 태에서의 KLF4 발현을 측정한 결과 Fig. 13에 서 보는 바와 같이 PEPCK 및 PGC-1의 expression은 증가하였으나 KLF4의 발현은 큰 차이를 보이지 않았다. 그러므로 fasting 때 KLF4에 의한 PEPCK 발현조절은 fasting 상태 에서 증가하는 PGC-1 등에 의해 이루어지는 것으로 판단되어진다. Fig. 13. Expression of KLF4 in the liver of fasted mice

249 238 국립보건연구원보 앞서 언급하였듯이 fasting 때의 PEPCK 발현 에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PGC-1 등의 coactivator가 KLF4에 의한 PEPCK promoter 활성 증가에 영향을 미치는지를 살펴 보았다. 이를 위해 각 coactivator의 expression vector를 KLF와 함께 cotransfection하여 PEPCK promoter 활성을 측정하였다 (Fig. 14). Fig. 14에서 보는바와 같이 PGC-1과 CBP (CREB binding protein)은 KLF에 의한 PEPCK promoter 활성증가를 현저히 증가시키는 것을 알 수 있었다. KLF4에 의한 PEPCK 발현조절 에 camp에 의해 activation되는 CREB (camp responsible element binding protein)이 관여하는 지를 알기위해 CREB과 KLF4의 expression vector을 cotransfection한 후 promoter 활성을 측 정하였다. Fig. 15에서 보는 바와같이 PGC-1과 CBP가 KLF4에 의한 외에 KLF4가 중요한 역할을 함을 확인할 수 있었다. 5.00E E E E E E E E E E E+00 cotransfection with KLF4 (-158) ctrl PGC1 CBP SHP CREB ACREB pcdna3.1(+) KLF4 Fig. 15. Effect of CREB on the activity of KLF4- mediated PEPCK promoter 결 론 Fig. 14. Effect of coactivators on the activity of KLF4-mediated PEPCK promoter PEPCK 발현을 증가시킴을 다시 확인하였을 뿐만아니라 CREB 역시 KLF에 의한 PEPCK promoter활성을 현저히 증가시킴을 알 수 있었 다. 이러한 결과는 CREB의 dominant negative mutant인 ACREB에 의해 저해되는 것을 확인할 수 있어 CREB이 KLF4에 의한 PEPCK 발현조 절에 관여함을 알 수 있었다. 따라서 이상의 결과들을 종합해 볼 때 fasting 때의 PEPCK 유전자 발현의 증가는 기 존에 보고되어진 PGC-1, CREB등에 의한 조절 DNA chip 실험에서 발현차이를 나타내는 KLF4를 포함하여 어떤 family의 KLF가 PEPCK 발현에 관여하는지를 측정하기 위해 HepG2 cell 에 각각의 expression vector를 transfection하여 PEPCK의 promoter 활성을 측정한 결과 KLF4 가 PEPCK 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었 다. KLF에 의해 response하는 promoter region 확인하기 위헤 KLF expression vector와 deleted promoter construct plasmid을 cotransfection한 후 promoter activity을 측정하여 KLF에 의해 promoter 활성변화가 있는 deleted consruct와 없는 deleted construct을 비교하여 KLF4 responsive site을 확인하였다. KLF4 putative response region에 KLF4가 binding하는지를 확인하기위해 HepG2에서 nuclear extract을 분리한 후 putative response region을 probe로 하여 electrphoresis mobility shift assay (EMSA)을 수행하여 putative response region에 KLF가 binding 함을 확인하였 다. 다른 nuclear factor와의 관련성을 분석을 통 한 KLF에 의한 PEPCK 조절기작을 이해하기

250 Ⅰ. 연구보고 239 위해 fasting 때 induction 혹은 activation되는 인 자들을 중심으로 살펴보았다. 이를 위해 먼저 glucocorticoid, camp 등이 KLF에 의한 PEPCK 발현에 어떤 영향을 미치는지를 PECK 발현 및 promoter 활성을 측정함으로써 확인하였다. Liver hepatic gluconeogenesis의 조절에 중요한 nuclear factor로 알려진 PGC-1, CREB 등이 KLF에 의한 PEPCK 유전자조절에도 관여하는 지를 측정하였다. 이들 factor들이 coimmunoprecipitation을 행해 KLF4와 Binding 하는지를 직 접적으로 확인하였다. KLF4가 PEPCK의 유전 자발현을 증가시킬 뿐만아니라 특히 fasting 때 의 PEPCK 유전자조절에 CREB, PGC-1등과 함 께 중요한 역할을 함을 새롭게 발견하였다. 당뇨병 발병에 있어서 glucose homeostasis는 혈중의 glucose 농도를 유지하는데 아주 중요하 다. glucose는 간에서 gluconeogenesis라는 대사를 통해 만들어지기 때문에 간에서의 gluconegenesis 조절은 혈중의 glucose 농도를 일정하게 유지하 여 insulin resistance 유발을 못하게 하는데 중요 한 과정이다. 그러므로 지금까지 알려진 조절 기작과 다른 새로운 기작을 밝히면 학문적 가치 가 높을 뿐 아니라 당뇨병의 예방과 치료에 활 용할 수 있을 것이 다. 본 연구의 결과, 당뇨병 발병에 있어서 glucose homeostasis는 혈중의 glucose 농도를 유지 하는데 아주 중요하다. glucose는 간에서 gluconeogenesis라는 대사를 통해 만들어지기 때문에 간에서의 gluconegenesis 조절은 혈중의 glucose 농도를 일정하게 유지하여 insulin resistance 유 발을 못하게 하는데 중요한 과정이다. 그러므로 지금까지 알려진 조절기작과 다른 새로운 기 작을 밝힘으로 당뇨병의 예방과 치료에 활용할 수 있을 것이다. 참고문헌 1. Zhang P, Basu P, Redmond LC, Morris PE, Rupon JW, Ginder GD, Lloyd JA. A functional screen for Kruppel-like factors that regulate the human gamma-globin gene through the CACCC promoter element. Blood Cells Mol Dis Sep-Oct;35(2): Saifudeen Z, Dipp S, Fan H, El-Dahr SS. Combinatorial control of the bradykinin B2 receptor promoter by p53, CREB, KLF-4, and CBP: implications for terminal nephron differentiation. Am J Physiol Renal Physiol May;288(5):F Teshigawara K, Ogawa W, Mori T, Matsuki Y, Watanabe E, Hiramatsu R, Inoue H, Miyake K, Sakaue H, Kasuga M. Role of Kruppel-like factor 15 in PEPCK gene expression in the liver. Biochem Biophys Res Commun Feb 18;327(3): Ghaleb AM, Nandan MO, Chanchevalap S, Dalton WB, Hisamuddin IM, Yang VW. Kruppel-like factors 4 and 5: the yin and yang regulators of cellular proliferation. Cell Res Feb;15(2):92-6. Review. 5. Oishi Y, Manabe I, Tobe K, Tsushima K, Shindo T, Fujiu K, Nishimura G, Maemura K, Yamauchi T, Kubota N, Suzuki R, Kitamura T, Akira S, Kadowaki T, Nagai R.Kruppel-like transcription factor KLF5 is a key regulator of adipocyte differentiation. Cell Metab Jan;1(1): Chen C, Zhou Y, Zhou Z, Sun X, Otto KB, Uht RM, Dong JT. Regulation of KLF5 involves the Sp1 transcription factor in human epithelial cells. Gene Apr 14;330: Miyamoto S, Suzuki T, Muto S, Aizawa K, Kimura A, Mizuno Y, Nagino T, Imai Y,

251 240 국립보건연구원보 Adachi N, Horikoshi M, Nagai R. Positive and negative regulation of the cardiovascular transcription factor KLF5 by p300 and the oncogenic regulator SET through interaction and acetylation on the DNA-binding domain. Mol Cell Biol Dec;23(23): Zhang Z, Teng CT. Phosphorylation of Kruppel-like factor 5 (KLF5/IKLF) at the CBP interaction region enhances its transactivation function. Nucleic Acids Res Apr 15;31(8): Dang DT, Zhao W, Mahatan CS, Geiman DE, Yang VW.Opposing effects of Kruppel-like factor 4 (gut-enriched Kruppel-like factor) and Kruppel-like factor 5 (intestinal-enriched Kruppel-like factor) on the promoter of the Kruppel-like factor 4 gene.nucleic Acids Res Jul 1;30(13): Conkright MD, Wani MA, Anderson KP, Lingrel JB. A gene encoding an intestinalenriched member of the Kruppel-like factor family expressed in intestinal epithelial cells. Nucleic Acids Res Mar 1;27(5):

252 Ⅰ. 연구보고 241 Regulation of hepatic gluconeogenesis by KLF Y.H. Suh, J.H. Bang, C.S. Moon and M.H. Jung Division of Metabolic Disease, Department of Biomedical Sciences, NIH, Seoul Korea Purpose : The regulation of hepatic gluconeogenesis is an important process in the adjustment of the blood glucose level and pathlogiocal changes in the glucose production of the liver are a central characteristic in the type 2 diabetes. The pharmacological intervention in signaling events that regulate the expression of the key gluconeogenic enzyme phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPCK) is regarded as a potential strategy for the treatment of metabolic aberration associated with this disease. However, the intervention requires a detailed understanding of the molecular mechanism involved in the regulation of this process. For understanding the regulation mechanism of PEPCK, we studied the regulation of PEPCK gene expression by Kruppel-like factor (KLF). Methods:We investigated the effects of KLF family on expression of PEPCK gene and analyzed PEPCK promoter to characterize molecular mechanism involved in the process. Results:We showed that KLF4 increased the activity of PEPCK promoter and mrna. We analyzed the effects of KLF4 expression on the promoter activities of 5' serial deletion constructs and identified KLF responsive region located at -450 of the promoter. Electrophoresis mobility shift assay (EMSA) showed the binding of KLF4 to the promoter whose binding motif was CCAAT. The increase of the promoer activity by camp or dexamethasone was augmented with KLF4 expression. Furthermore, camp responsive element binding protein (CREB), CREB binding protein (CBP) and PGC-1 potentiated the increase of promoter activity by KLF4. Conclusions:Taken together, these results suggested that KLF4 play a important role in regulation of PEPCK under fasting. Key words:type 2 diabetes, PEPCK, KLF4, fasting This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Heath, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

253 242 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 난소절제 랫드에서 제니스테인과 콩단백질이 지질 대사에 미치는 영향 국립보건연구원 생명의과학센터 대사영양질환팀 1, 서울대학교 식품영양학과 2 이영민 1,2, 정명호 1, 이연숙 2, 송지현 1 목 적 : 폐경기후 여성 호르몬이 감소하면 비만등 인슐린저항증 유발가능성이 높아지나 이에 관한 발생기전과 예방방법에 대한 연구는 부족한 상태이다. 에스트로겐이 부족한 상태에서 인슐린저항상 태가 유발되는 지와 난소절제 랫드에서 이소플라본과 콩단백질이 혈중과 간 중 지질 농도에 미치는 영향을 관찰하여 페경기에서의 지질 대사변화에 대한 대처 방안을 발굴하고자 하였다. 방 법 : 실험 Ⅰ에서는 Sprague Dawley 계 암컷 쥐를 sham 수술이나 난소절제수술하고 3주 후 0.1% 제니스테인이 첨가된 고 콜레스테롤, 고지방식이를 4주간 공급하였다. 실험 Ⅱ에서는 난소절제 수술후 카제인식이나 이소플라본이 강화된 콩단백질함유 고지방식이를 6주, 12주동안 공급한 후 간 및 혈액을 채취하여 인슐린 저항증 관련 생화학적 지표와 관련 단백질의 발현을 관찰하였다. 결 과 : 폐경상태를 유발한 쥐에게 고지방식이를 투여하면 체중및 지방 조직이 증가하며 혈중 지 질과 간 중 지질 함량이 증가하는 등 대사증후군 및 심혈관질환의 위험인자가 관찰되지만 식이 중 카 제인을 콩단백질로 대체시키면 혈중 지질 및 간 조직의 지질 수준이 개선되고 간의 CPT1과 HMGR의 mrna를 증가시켰다. 그러나 제니스테인만 첨가하면 혈중 지질을 크게 개선시키지 못하여 혈중지질 및 간지질 개선 효과는 콩단백에 든 이소플라본 외의 다른 성분에 의하거나 과도한 콜레스테롤이 포 함된 식이로 인해 제니스테인의 혈중지질 감소효과를 관찰하지 못한 것으로 고려된다. 결 론 : 폐경기 여성에게서 콜레스테롤 농도를 저하와 최종적으로 인슐린 저항증 및 심혈관질환을 예방하려면 제니스테인 만을 보충하는 것보다는 콩단백이나 제니스테인 강화 콩단백질을 섭취하여야 그 효과가 클 것으로 고려된다. 중심단어 : 난소절제, 제니스타인, 콩단백질, CPT1, HMGR 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임. 지원과제명:인슐린저항증과 sex steroid hormone과의 관계 학회지게재:한국영양학회지,38(4): ,2005

254 Ⅰ. 연구보고 243 Effect of genistein and soy protein on lipids metabolism in ovariectomized rats Y.M. Lee 1,2, M.H. Jung 1, Y.S. Lee 2 and J.H. Song 1 Division of Metabolic Disease, Department of Biomedical Sciences, NIH, Seoul Korea 1, the Department of Food and Nutrition, Seoul National University, Seoul Korea 2 Purpose : Increased prevalence of metabolic syndrome after menopause might be associated with estradiol deficiency. Harmful effect of estradiol hampers the casual usage of hormone to prevent the metabolic syndrome. Soy protein has been reported that it has several beneficial effects on health, however it is unclear which components of soy protein are responsible for anti-obesity and hypocholesterolemic effects. Soy isoflavone, genistein are suggested to have anti-obesity and hypocholesterolemic effects but with inconsistency. Methods:The present study investigated whether the supplementation of genistein (experiment Ⅰ) and soy protein containing isoflavones (experiment Ⅱ) to the high fat diet affected body weight gain, food intake, liver and fat tissue weight and the lipid levels in ovariectomized rats. We measured plasma and hepatic lipid contents and examined the mrna levels of lipid metabolism related protein gene, such as CPT1 and HMGR. Results : Ovariectomy increased body weight, fat tissue weight and plasma and hepatic lipid levels which increase the risk of metabolic syndrome. Soy protein could improve plasma and hepatic lipids levels. Soy protein also increased hepatic CPT1 and HMGR mrna levels. Conclusions :With the observation that isoflavone-fortified soy protein could but dietary genistein alone could not decrease lipid levels, the ingestion of isoflavone-fortified soy protein gives more benefit for protecting postmenopausal women from metabolic syndrome. Key words : ovariectomy, genistein, soy protein, CPT1, HMGR This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea Original title: Studies on sex steroid hormone and insulin resistance This study was printed in Korean J Nutrition 38(4): , 2005 The Report of National Institute of Health 42, , 2005

255 244 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 Pancreatic β cell에서 chronic high glucose가 유도하는 apoptosis가 당뇨병 발병에 미치는 영향과 그 관련 기전에 관한 연구 질병관리본부 국립보건연구원 생명의과학센터 대사영양질환팀 김원호, 이준우, 송지현, 정명호 목 적 : 당뇨병의 특징인 hyperglycemia에 의한 췌장 β 세포의 apoptosis 기작을 연구함으로써 당 뇨병 발병 원인을 규명하며 당뇨병의 치료제개발에 응용하고자 한다. 이를 위해 high glucose에 의한 pancreatic β세포의 apoptosis와 glucose 대사에 중요한 GCK 와의 관련성을 조사하고 그 관련 조절 기작을 연구하고자 하였다. 방 법 : Insulinoma 세포인 MIN6N8 β세포에서의 glucose의 효과를 조사 하였다. Chronic high glucose에 의해 β세포의 apoptosis가 유도됨을 증명하기 위해 apoptosis에 관련된 유전자발현 변화 분석과 미토콘드리아의 outermembrane으로의 Bax의 translocation이 이루어짐을 조사하였다. 또한 Glucose metabolism에 관여하는 유전자들의 발현과 GCK와 미토콘드리아의 binding을 조사하였다. High glucose가 유도하는 apoptosis에서 GCK의 overexpression이 미치는 효과를 알아보기 위해 GCK 가 overexpression된 MIN6N8 세포를 제작하였다. High glucose에 의해 유도되는 Bax translocation 및 oligomerization과 Bad 인산화에 GCK overexpression이 미치는 효과를 알아보았다. ICR mice 로부터 분리한 pancreatic islet cell에서의 high glucose에 의해 유도되는 apoptosis의 조절 기작을 확인 하는 연구를 수행하였다. 결 과 : Mouse pancreatic β세포주인 MIN6N8 세포에 chronic high glucose를 처리하면 Bax oligomerization, cytochrome C release, 그리고 caspase-3 활성에 의하여 apoptosis가 일어남을 확인하였다, 이 과정 동안 세포내 ATP 생성과 insulin 분비가 감소하였고, 동시에 glucokinase (GCK) 발현이 크게 감소하였다. 또한, 미토콘드리아와 Bax의 결합을 증가시켜 cytochrome C release를 증가시키는 반면에, GCK와 미토콘드리아와의 결합은 감소시켰다. 그런데 이들 현상들은 GCK 과발현에 의해 억제됨을 알 수 있었고 분리한 primary islet 세포들에서도 이와 유사한 결과들 을 얻을 수 있었다. 결론적으로, chronic high glucose에 의한 β세포 apoptosis는 GCK 발현의 감 소를 통한 미토콘드리아와의 결합의 감소에 의해 유발됨을 알 수 있었다. 결 론 : Hyperglycemia를 통한 Insulin 생성에 관여하는 췌장의 β세포의 죽음의 원인과 관련 기 작을 연구함으로써 제 1형뿐 만아니라 제 2형 당뇨병의 발병 기전을 규명할 수 있는 기초를 제공할 수 있다. 또한 β세포의 죽음에 관련하는 기전 연구 결과를 토대로 제 1 형 및 제 2형 당뇨 발병과 병인을 밝혀 치료할 수 있는 치료제 개발에 기초 자료로 제시할 수 있다. 중심 단어 : Hyperglycemia, Glucokinase, Apoptosis, ROS 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임. 학회지 게제:Diabetes, Vol. 54, September 2005

256 Ⅰ. 연구보고 245 Exposures to Chronic High Glucose Induces β-cell Apoptosis Through Decreased Interaction of Glucokinase with Mitochondria Downregulation of Glucokinase in Pancreatic β-cells W.H. Kim, J.W. Lee, J.H. Song and M.H. Jung Division of Metabolic Disease, Department of Biomedical Science, NIH, Seoul Korea Purpose:Chronic hyperglycemia is toxic to pancreatic β cells, impairing cellular functioning as observed in type 2 diabetes; However the mechanism underlying β- cells dyfunction and the resulting apoptosis via glucose toxicity are not fully characterized. Methods:Here, using MIN6N8 cells, a mouse pancreatic β-cell line, we show that chronic exposure to high glucose(33.3 mm) induced apoptosis, correlated with the decreased interaction of glucohinase with mitochondria. Results:We show that chronic exposure to high glucose increases cell death mediated by Bax oligomerization, cytochrome C release, and caspase-3 activation. During apoptosis, glucokinase expression decrease in high-glucose-treated cells, concomitant with a decrease in cellular ATP production and insulin secretion. Moreover, exposure to a chronically high dose of glucose decreases interactions between GCK and mitochondria with an increase in Bax binding to mitochondria and cytochrome C release. These events are prevented by GCK overexpression, and phosphorylation of pro-apoptotic Bad proteins in GCK-overexpressing cells is prolonged compared with Neo-transfected cells. Similar results were obtained using primary islet cells. Collectively, these data demonstrate that β-cell apoptosis from exposure to chronic high glucose occurs in relation to lowered GCK expression and reduced association with mitochondria. Conclusions:Our results show that this may be one mechanism by which glucose is toxic to β -cells and suggests a novel approach to prevent and treat diabetes by manipulating Bax- and GCK-controlled signaling to promote apoptosis or proliferation. Key words:hyperglycemia, Glucokinase, Apoptosis, ROS This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea This study was accepted in Diabetes. The Report of National Institute of Health 42, , 2005

257 246 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 Mitochondria 이상이 Pancreatic β 세포의 기능에 미치는 영향 국립보건연구원 생명의과학센터 대사영양질환팀 이준우, 김원호, 정명호, 임주현 목 적:Mitochondria dysfunction에 의한 당뇨병의 병인기전 연구를 pancreatic β-cell을 이용하 여 증명하고자 하였다. 즉 Mitochondria dysfunction에 의한 pancreatic β cell의 기능이상을 βcell 의 apoptosis에 촛점을 맞추어 βcell의 insulin 분비와 apoptosis를 측정하고 glucose metabolism에 중요한 역할을 하는 glucokinase의 변화등 규명하였다. 방 법:정상적인 glucose 자극에 의한 pancreatic β-cell의 기능과 glucose metabolism에 관련된 물질들의 변화등을 측정하여 mitochondria dysfunction을 pancreatic β-cell에서 유도했을 때 βcell 의 기능 및 glucose 대사 물질 등의 변화를 비교분석하였다. 또한 mitochondria dysfunction에 의해 유도되는 pancreatic β-cell의 apoptosis를 측정하고 apoptosis에 관련되는 기작을 상기의 변화등을 통해 분석하였다. 즉 glucose metabolism에 관련 유전자들의 발현변화, 특히 glucokinase(gck)의 발현 및 mitochondrial translocation/binding등을 측정하고 또한 Bax의 mitochondrial translocation/ binding을 측정함으로써 mitochondria dysfunction에 의한 β-cell의 apoptosis 기작 을 연구하였다. 결 과:Mitochondria dysfunction에 의해 pancreatic β cell의 glucose 대사에 중요 효소인 GCK의 발현이 급격히 감소하였으며 이는 GCK의 mitochondria outermembrane으로의 이동이 저 하와 GCK-VDAC의 interaction의 감소을 유발하였다. GCK-VDAC의 interaction이 감소함으로써 Bax-VDAC interaction이 증가하여 pancreatic β 세포의 apoptosis는 증가하였다. mitochondria dysfunction에 의한 pancreatic β 세포의 apoptosis의 증가는insulin 분비 저하을 유발하였으며, 이 러한 현상은 항산화제에 의해 저해됨으로써, mitochondria dysfunction에 의한 ROS의 증가가 GCK 발현을 저해시키며 이로인한 mitochondria와의 결합이 감소함으로써 apoptosis가 일으남을 알 수 있었다. 결 론:Mitochondria dysfunction이 insulinoma cell인 MIN6N8 cell에 유발되면 insulin content가 감소되며, 세포의 apoptosis가 진행됨을 알 수 있었으며 glucose 대사의 중요 효소인 GCK와 mitochondria에서 생성되는 ROS가 관여함 알 수 있었다. 이상의 연구결과는 mitochondria dysfunction이 pancreatic 당뇨발병을 유도하는 그 생물학적 기전을 밝혀 매우 의미 있는 결과라 할 수 있다. 중심 단어:mitochondria dysfunction, pancreatic β cell, apoptosis, glucokinase, ROS 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

258 Ⅰ. 연구보고 247 서 론 당뇨병은 인슐린 분비 또는 인슐린 작용의 이상에 의한 고혈당을 특징으로 하는 질환 군 으로 당뇨병의 발병에는 유전적 소인과 환경인 자 들이 함께 관여하는 것으로 이해되고 있다. 당뇨병의 유전적 소인을 찾기 위해 많은 연구 들이 진행되어 왔는데 현재까지 인슐린, 인슐린 수용체, glucokinase 등 유전자 이상 등이 알려 져 있으나 이들로 설명할 수 있는 당뇨병 환자 는 전체 당뇨병 환자중 극히 일부에 불과하다. 미토콘드리아 DNA가 당뇨병의 발병과 관련 이 있으리라는 것은 미토콘드리아 질환에서 당 뇨병이 흔히 발견되고, 또 인슐린비의존형 당뇨 병 환자 중 모계유전이 더 유세한 사실로 추측 되어 왔다. 그러나 미토콘드리아 DNA와 당뇨 병과의 관계에 대해 본격적인 연구가 진행된 것은 1992년 Ballinger 등이 모계 유전이 뚜렷한 난청을 동반한 당뇨병에서 10.4kb의 미토콘드리 아 DNA의 결손을 보고하고, van den Ouweland 등이 MELAS에서와 발견되는 것과 같이 leucine 을 운반하는 trnaleu을 코드하는 3243번째의 염기가 A에서 G로 치환됨을 발견하면서부터이 다. 이후 미토콘드리아 DNA의 점 돌연변이나 결손, 삽입 그리고 미토콘드리아 DNA 양적감 소 등 여러 형태의 이상이 당뇨병 환자에서 보 고되고 있다. 최근 개정된 미국당뇨병 학회의 진단기준에는 미토콘드리아 DNA의 이상에 의 한 당뇨병이 당뇨병의 분류에 처음으로 포함되 었다 Pancreas는 insulin 분비 기능이 이루어지고 있 고, β 세포 (단백질 호르몬인 인슐린(insulin)을 분비)와, α세포 (글루카곤(glucagon)이라는 호 르몬 분비)로 구성되어 있다. 혈당이 높을 때는 insulin이 분비되어 혈당을 내리는 작용을 하고 혈당이 떨어졌을 때는 glucagon이 분비되어 liver에서의 당 생산을 증가시켜 혈당을 올리는 작용을 하여 항상 일정한 혈 중 glucose농도를 유지시켜 주는 역할을 한다. 인슐린 의존성 당 뇨병인 제 1형 당뇨병은 pancreas의 islet에서 발 생하는 국소적 염증반응과 이로 인한 인슐린을 생성하는 β세포의 선택적인 apoptosis 과정을 통하여 발생된다고 알려져 있지만, 최근 β세포 의 apoptosis에 자가 면역성 파괴 뿐 만아니라, 제 2형 당뇨질환을 가진 환자에게서도 심각한 β세포의 apoptosis가 나타난다는 보고가 된 바 가 있다. 그러나 그 정확한 조절 기작에 관한 연구는 아직까지 확실하게 밝혀지지 않았다. Hexokinase가 apoptosis와 관련성이 있음이 여 러 연구를 통해 증명이 되었는데, 특히 HK-I, II 가 mitochondria의 VDAC (voltage-dependent anion changer)에 binding 함으로써 pro-apoprotic protein인 Bax가 mitochondria 에 binding하지 못 하게 함으로써 apoptosis을 저해함이 보고되었 다. 최근에는 postic et al.,과 Danial et al.,등에 의해 그림에서 보는바와 같이 HK-IV인 glucokinase 가 세포질내에서 인산화된 Bad와 WAVE1, PKA, PP1과 함께 complex를 형성함으 로써 미토콘드리아로 translocation을 한다고 보 고한 바 있다. 이들은 in vitro binding assay를 통하여 GCK 가 미토콘드리아로 translocation을 한다고 보고하였지만 그 정확한 역할에 관한 보고는 하지를 못하였다. 그리고 Korsmeyer et al., 등은 2003년 GCK와 인산화된 Bad의 interaction은 Bax가 미토콘드리아로 translocation 하는 것을 억제할 수 있는 것으로 제안하였다. 그러므로 본 연구는 Mitochondria dysfunction 에 의한 당뇨병의 병인기전 연구를 pancreatic β cell의 apoptosis 에 촛점을 맞추어 미토콘드리아 이상에 의한 β cell의 insulin 분비와 apoptosis를 측정하고 관련된 기작을 β cell의 glucose metabolism 에 중요한 역할을 하는 glucokinase의 변화등을 통해 규명하고자 하였다.

259 248 국립보건연구원보 재료 및 방법 1. Insulinoma 세포 주인 MIN6N8 세포의 배양 및 mouse에서 췌장의 Islet 세포 분 리 및 배양 NOD mice로부터 얻은 MIN6N8 세포는 SV-40 T로 향질 전환시켜 만든 세포로서, 15%FBS, 2 mm glutamine, 그리고 penicillin-streptomycin이 든 DMEM medium에서 배양을 하였다. 췌장의 Islet 세포의 분리는 12시간 동안 공복 상태를 유지시킨 ICR mice로부터 췌장 을 분리 한 후 collagenase로 digestion 시켜 주었다. 간단히 요약하면, collagenase P (0.8 mg/ml) 2.5 ml을 마취를 시킨 mouse의 bile duct을 통하여 injection을 시킨 후, 부 풀려진 췌장을 조심스럽게 분리하였다. Mouse로부터 분리된 췌장에 collagenase를 첨가 시켜 준 후 37 C에서 15분간 shaking incubation한 후 차가운 HBSS 액을 첨가하 여 collagenase의 효소 활성을 저해 시켜 주 어 digestion을 중지시켰다. 조직을 400-μm screen을 통과 시킨 후 각각 25, 23, 21.5, 그 리고 11.5 %의 Ficoll을 사용 하여 원심분리 한 후 중간층에서 췌장의 Islet 세포를 분리 하였다. 분리된 Islet 세포를 M199 medium 에서 씻어주고 각 각의 Islets들은 마이크로 파이펫을 사용하여 분리하였다. 분리된 췌장 의 Islet을 단일 클론의 islet 세포로 만들기 위해 trypsin-edta를 5 분 동안 처리해 주 었다. 2. Cytotoxicity 측정과 MTT assay MIN6N8 세포 (3 X 104) 와 단일 췌장 islet 세포 (2 X 104)를 96-well plate 에 심은 다음 high glucose를 처리하였다. 각 농도의 glucose를 처리 후, medium을 제거 하고 MTT (0.5 m/ml) 를 첨가 해 준 뒤 37 C에서 2 시간동안 incubation하였다. 간단한 원심 분리 후 상층액 을 조심스럽게 제거하고 DMSO를 첨가하여 insoluble crystal을 완전히 분해시킨 후, Thermomax microplate reader을 이용하여 흡광 도을 540nm 에서 측정하였다. 3. Apoptosis-morphology 측정 세포의 핵 내에 존재 하는 chromatin의 형태 적인 변화는 2.5 ug/ml Hoechst staining을 이용하여 형광 현미경에서 관찰하였다. 그리고 apoptosis가 발생한 세포는 Apop Tag, in situ apoptosis detection kit 등을 사용하여 확인하였 다. 세포를 고정시킨 후 terminal transferase 와 avidine이 label된 dutp를 같이 incubation 시켰 다. 이를 FITC-labeled anti-avidine antibody로 incubation 시킨 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 4. Flow cytometry 분석 및 DNA fragmentation 세포를 모은 후, PBS 액으로 씻어준 세포를 70% 에탄올에서 고정시켰다. 세포를 PBS로 씻 은 후 1 mm EDTA가 첨가된 PBS 완충 용액 200ul로 세포를 풀어준 후 40 ug/ml RNase A를 넣어주어 30 분간 incubation 시켰다. 50 ug/ml 의 Propidium iodide(pi)를 넣어주어 염색 후 FACS를 사용 하여 분석하였다. 또한 DNA fragmentation 실험을 위해 세포를 모은 후, PBS 완충 용액으로 2번 씻어 준 후 lysis buffer (100 mm NaCl, 10 mm Tris-HCl, ph8.0, 25 mm EDTA, 0.5% SDS, and 0.1 mg/ml proteinase K)를 넣어 lysis을 하였다. 그 후 37 의 온도로 water bath에서 16-18h 동안 incubation 한 후 DNA를 phenol/chloroform을 이 용하여 추출하고 -70 에서 침전시켰다. DNA pellet을 TE buffer로 resuspension 시켜 준 뒤 RNase A 1ug/ml을 넣어 RNA를 제거하였으며 분리한 DNA를 1.5% agarose gel에서 전기영동 시켜 준 후 EtBr로 염색 하여 UV 상에서 확인 하였다.

260 Ⅰ. 연구보고 ROS 측정 및 mitochondria membrane potential (Δψm) 의 측정 세포 내에서 ROS의 생성 여부는 DCFH-DA라 고 불리는 형과 염색 물질을 사용하여 정량하 였는데, DCFH-DA dye는 dichlorodihydrofluorescein diacetate로서 산화 과정을 거 친후 DCF 로부터 생성 되는 형광을 flow cytometry를 사용하여 정 량 분석하는 것이다. 세포를 harvest 30분 전에 5 um/ml의 DCFH-DA를 첨가하여 형광염색 시킨 후 세포를 trypsin-edta를 사용하여 trypsinization 시켜 준 뒤 세포를 모았다. 세포를 PBS 완충용액 으로 2번 씻어 준 후 flow cytometry를 사용하여 분석하였다. Δψm 측정을 위해, 세포에 DiOC6 (100nM/ml) 또는 Rhodamine123(5 ug/ml)를 세포의 harvest 30 분 전에 처리하여 염색을 시켜 준 뒤 후, PBS 완 충 용액으로 씻어 준 후 25 ug/ml PI가 든 PBS 완충 용액으로 resuspension 시켜 준 뒤 flow cytometry를 사용하여 분석하였다. 6. Cytosolic fraction 과 mitochondrial fraction 분리 세포를 PBS 액으로 씻은 후, isolation buffer (20 um/ml Hepes, ph 7.4, 10 um/ml KCl, 1.5 um/ml MgCl2, 250 um/ml sucrose, 1 um/ml sodium EDTA, 1uM/ml DTT, 10 um/ml PMSF, 10 ug/ml leupeptin, and 10 ug/ml aprotinin)에서 lysis 시켰다. 얼음에서 5 분 동안 incubation 시 킨 후 homogenization 시킨 후 homogenate를 4oC 2,500 g에서 원심 분리하여 깨지지 않은 세포와 핵을 제거하였다. 다시 9,000 g 4oC 에 서 30 분간 원심분리를 한 후 pellet 부위가 mitochondria가 들어 있는 fraction인 반면, 상층 액을 다시 100,000 g에서 원심분리를 함으로써 cytosol fraction을 얻을 수 있었다. 7. Insulin release 와 content 측정 Glucose stimulation으로 인한 acute insulin release를 측정하기 위해, MIN6N8 세포 또는 isolate된 islet 세포에 glucose를 4 일 동안 처리한 후 3.3 mmol/l glucose를 포함 한 Krebs-Ringer bicarbonate buffer (KRB-HEPES [ph 7.4]: 4.8 mmol/l KCl, 134 mmol/l NaCl, 5 mmol/l NaHCO3, 1.2 mmol/l MgSO4, 1.2 mmol/l KH2PO4, 1 mmol/l CaCl2, 0.5% BSA, and 10 mmol/l HEPES)로 씻어 준 후 같은 buffer에서 30분간 preincubation 하였 다. Krebs-Ringer buffer를 제거 하고 3.3 mmol/l glucose를 포함하는 fresh buffer를 1 시간 동안 처리하였다. 이후, 16.7 mmol/l glucose 포함하는 Krebs-Ringer buffer로 1시간을 더 incubation 시켜 준 뒤 상층액을 모아 insulin assays를 위해 사용하 였다. Insulin의 측정은 mouse insulin을 standard로 사용하는 radioimmunoassay을 통해 정량하였다. 8. Immunocytochemistry MIN6N8 세포와 isolated primary islet 세포를 poly-d-lysine-coated coverslip에서 배양하였다. 세포에 100 nm MitoTracker CMXRos로 30분 동안 전 처리한 후, PBS 로 washing 하여 3.7% formaldehyde-pbs로 10분 동안 room temperature에서 고정하였다. coverslip을 blocking solution (PBS containing 5% bovine serum albumin and 0.2% Triton X-100)에 30 분 동안 담군 후 anti-bax, anti-gck, 또는 anti-p53 (1:300)로 4 C에서 밤새도록 배양하였다. 그 이후 Alexa-488 anti-rabbit IgG antibody (1:400) 로 30 분 동안 blocking solution에서 배양한 후 측정하였다. Fluorescence는 confocal microscopy 를 이용하여 사진 촬영을 하였다. 결 과 1. Glucose가 insulinoma 세포인 MIN6N8 에 미치는 영향 췌장 insulinoma 세포 주인 MIN6N8 세포에 glucose가 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각 0 mm, 2.2 mm 5.5 mm, 16 mm의 glucose를 농

261 250 국립보건연구원보 도별로 24시간 처리 해 준 후 western blot을 통 해 glucose metabolism과 mitochondria에 관련된 유전자들의 발현 변화를 살펴보았다. Fig.1.에서 보는바와 같이 glucose의 농도가 증 가함에 따라 glucokinae와 hexokinase I의 발현이 증가함을 보여 glucose의 처리로 췌장 β세포에 서 glucose 대사가 활발히 이루어지며, 활성된 glucose 대사에 의해 췌장 β세포에서 ATP 합 성이 증가할 것이라 유추 할 수 있었다. 대사가 활성화 되어 효율적인 ATP 생성을 위 해 cytoplasm의 GCK가 mitochondria의 outer membrane으로 이동할 것이라 추측하였다. 췌장 β세포에서 세포내의 Ca2+의 양은 췌장 β세포의 생리적 기능인 insulin의 합성과 분비 에 관여하는 것으로 알려져 있다. 췌장 β세포 내에 Ca2+의 양이 증가하면 granule 상태의 proinsulin이 insulin으로 되어 세포 밖으로 분비 되기 때문에 glucose 농도의 증가에 따라 세포 내의 Ca2+의 양이 증가하는 지를 측정하였을 때 Fig. 3에서 보는바와 같이 glucose 농도 의존 적으로 Ca2+의 양이 증가하였다. Fig. 1. Effect of glucose on expression of hexokinases and VDAC in MIN6N8 cells 그리고 최근의 보고들에 의하면 glucose의 대 사의 효율을 증가시키기 위해 cytoplasm의 GCK 가 mitochondria의 outer membrane으로 이동한 다고 알려져 cytosolic fraction과 mitochondria fraction을 분리하여 GCK의 발현을 살펴보았다 (Fig. 2.). Fig. 3. Effects of glucose on intracellular Ca2+ levels in MIN6N8 cells. 따라서 MIN6N8 세포에서 glucose 자극에 의 한 insulin 분비가 증가할 것으로 판단되어 MIN6N8 세포내의 insulin content를 측정하였다 (Fig. 4.) Insulin content 1.5 Ins ulin ( ug/ml ) mM glu 2.2mM glu 5.5mM glu 16mM glu Fig. 2. Effects of glucose on GCK amount of mitochondria in MIN6N8 cells. Fig. 2.에서 보여주는 바와 같이 MIN6N8 세포 에서 glucose의 농도가 증가함에 따라 mitochondria에서 GCK 양이 증가하는 반면 cytoplasm에서의 GCK 양이 감소하는 것을 확인 하였다. 이는 16mM의 glucose 처리 시 glucose Fig. 4. Effects of glucose on insulin contents in MIN6N8 cells. Fig. 4.에서 보는바와 같이 glucose의 농도가 증가함에 따라 MIN6N8 세포에서 insulin의 content가 증가함을 알 수 있었다. 이는 glucose 대사가 활성화 되어 세포에 필요한 ATP를 합 성하게 되며, 생성된 ATP를 이용하여 MIN6N8

262 Ⅰ. 연구보고 251 세포가 췌장 β 세포의 본연의 기능인 insulin의 분비를 촉진하는 것으로 판단되었다. 2. Glucose가 GCK-pBad complex 형성에 미치는 영향 앞에서 언급하였듯이 세포내에서 효율적인 ATP 합성을 위해 cytoplasm의 GCK가 mitochondria의 outermembrane으로 이동함을 알 수 있었다. 그 런데 GCK가 mitchondria로 translocation을 위해 서는 AKT의 phosphorylation과 Bad의 phosphorylation이 필요한 것으로 알려져 있다. phosphorylation된 Bad는 cytoplasm의 GCK와 complex를 형성하여 mitochondria의 outermembrane으로 이 동하게 되며, 이동된 GCK가 mitochondria의 VDAC와 interaction을 함으로 glucose의 농도 증 가에 따른 Bad의 phosphorylation과 Akt의 phosphorylation을 살펴보았다. Fig.6.에서 보는바와 같이 AKT와 Bad의 phosphorylation이 glucose의 농도가 증가함에 따라 증가함을 볼 수 있었다. 또한 insulin receptor substrate (IRS)에서 ser307 의 phosphorylation은 insulin 신호전달의 감소를 의미하는데 glucose의 농도가 증가함에 따라 IRS ser307의 phosphorylation이 감소함을 알 수 있었다. 이를 통하여 glucose는 GCK와 p-bad의 complex 형성을 조절 할 수 있으며 췌장 β 세 포의 insulin 신호전달을 조절할 수 있음을 알 수 있었다. 다음으로 glucose 농도증가에 따른 apoptosis 에 관련된 protein들의 발현을 western blot으로 살펴본 결과 Fig. 7에서 보는 바와 같이 anti-apoptotic protein인 Bcl-2와 Bcl-xL의 발현이 5.5mM과 16mM의 glucose 첨가시 0mM의 glucose와 2.2mM의 glucose 첨가된 세포보다 더 많이 발현 되었으나 pro-apoptosis protein인 Bax 의 양은 변하지 않았다. Fig. 7. Effects of glucose on expression of apoptosisrelated proteins in MIN6N8 cells. 또한 앞서의 data에 의하면 GCK가 glucose 농 도 의존적으로 mitochondria로의 이동이 증가함 을 보였으므로 mitochondria에서 GCK와 VDAC 의 interaction이 증가하는지를 측정하였다. Fig.8. 에서 보는 바와 같이 glucose 농도가 증가함에 따라 GCK와 VDAC의 interaction이 증가함을 보 여 glucose를 효과적으로 이용하기 위해 GCK가 cytoplasm에서 mitochondria의 outermembrane으로 이동하여 VDAC에 interaction함을 알 수 있었다. GCK와 VDAC의 interaction하는 이유는 mitochondria내에서 생성된 ATP가 VDAC를 통하 여 밖으로 신속히 배출되고 GCK가 이를 사용 하여 glucose를 glucose-6-phosphate로 전환시켜 glucose 대사를 활성화시키기 때문으로 추정할 수 있었다. Fig. 6. Effects of glucose on phosphorylation of Bad in MIN6N8 cells.

263 252 국립보건연구원보 Fig. 11. Mitochondria dysfunction induces apoptosis in MIN6N8 cells. Fig. 8. Effects of glucose on GCK-VDAC interaction in MIN6N8 cells. 3. Mitochondria dysfunction이 MIN6N8 세포에 미치는 영향 다음은 mitochondria dysfunction이 MIN6N8세 포의 생존에 어떠한 영향을 주는 지, 그리고 mitochondria dysfunction에 의해 위에서 살펴본 glucose metabolism에 관련된 현상들이 어떻게 변화되고 이들이 apoptosis에 영향을 주는지 등 을 살펴보았다. Fig. 10에서 보는바와 같이 MIN6N8 세포에 mitochondria 내의 전자전달계 complexi과 ATPase의 저해제인 antimycin과 oligomycin을 처리하여 mitochondria dysfunction 을 유도하였을 때 DNA fragmentation이 일어남 을 알 수 있었고 TUNEL assay를 행하여도 apoptosis를 확인할 수 있었다(Fig.11.). Mitochondria dysfunction의 결과로 MIN6N8 세포내의 insulin contents가 감소하는지를 측정 한 결과 Fig. 12에서 보는 바와 같이 mitochondria dysfunction에 의해 insulin의 양이 급격하게 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. Fig. 12. Effects of mitochondria dysfunction on insulin contents in MIN6N8 cells. M C Glu A/G O/G 4. MIN6N8 세포에서 mitochondria dysfunction 이 유도하는 apoptosis의 기작 Fig. 10. Effects of mitochondria dysfunction on apoptosis of MIN6N8 cells Mitochondria dysfunction에 의해 MIN6N8세포 의 apoptosis가 유도되었으므로 apoptosis에 관련 된 유전자들의 발현을 western blot으로 측정하 였다. Fig. 13에서 보는바와 같이 anti-apoptotic protein인 Bcl-2와 Bcl-xL의 발현이 mitochondria dysfunction에 의해 감소되나 pro-apoptotic protein인 Bax의 발현은 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 caspase 3의 활성 역시 증가함을 확인할 수 있었다.

264 Ⅰ. 연구보고 253 Fig. 14. Effects of mitochondria dysfunction on ROS generation in MIN6N8 cells. Fig. 13. Effects of mitochondria dysfunction on expression of apoptosis-related proteins and activity of caspase-3 Tumor suppressor 유전자로 알려진 p53이 mitochondria dysfunction이 유도된 MIN6N8 세포에 서 발현이 증가한 것으로 나타났으며 antioxidant 인 SOD와 catalase의 발현은 감소하는 것을 알 수 있었다. 많은 보고 들에 의하면 p53 유전자가 ROS 생성과 관련이 있는 것으로 증명되었으므로 mitochondria dysfunction이 세포내 ROS의 생성과 깊은 연관이 있을 것으로 추정하여 MIN6N8 세포 에 mitochondria dysfunction을 유도하였을 때 ROS 생성과 mitochondria membrane potential의 손상등 을 측정하였다. 이를 위해 DCFH-DA 형광 dye (Fig.14)와 Rhodamine123 형광 dye를 사용하여 mitochondria membrane의 potential의 손상(Fig.15.) 을 FACS를 사용하여 측정하였다. Fig. 15.에서 보는바와 같이 mitochondria dysfunction이 유도된 MIIN6N8 세포에서 ROS의 생 성이 급격히 증가하였고 이는 antioxidant인 NAC 의 처리를 통해 ROS의 생성이 저해됨을 알 수 있었다. Fig. 15. Effects of mitochondria dysfunction on loss of mitochondria membrane potential (Δψm) in MIN6N8 cells. 또한 Mitochondria dysfunction에 의해 생성되는 ROS와 mitochondria membrane potential(δψm)의 손상(Fig. 15)이 MIN6N8 세포의 apoptosis와의 상관관계를 밝히기 위해 PI 형광 dye를 사용하 여 cell cycle을 측정하였다(Fig.16.).

265 254 국립보건연구원보 Fig. 16. Effects of mitochondria dysfunction on cell cycle of MIN6N8 cells. MIN6N8 세포의 cell cycle을 측정한 결과 mitochondria dysfunction에 의해 sub G0 content 가 증가함을 보여 apoptosis가 일어남을 알 수 있었으나 anti-oxidant인 NAC와 catalase 첨가 시 저해 된 것을 Fig.16.을 통하여 알 수 있었다. 따라서 mitochondria dysfunction에 의해 증가되 어지는 ROS가 췌장 β세포의 apoptosis와 밀접 한 상관관계가 있음을 알 수 있었다. 5. MIN6N8 세포에서 mitochondria dysfunction 이 glucose 대사에 미치는 영향 다음은 glucose 대사에 연관된 protein들의 발 현에 mitochondria dysfunction이 미치는 영향을 western blot을 통하여 분석하였을 때 Fig. 17에 서 보는바와 같이 glucose 대사에 중요 효소인 GCK와 glucose의 uptake에 관여하는 receptor인 GLUT 2의 발현이 mitochondria dysfunction에 의해 크게 저해됨을 알 수 있었다. 이를 통하여 mitochondria dysfunction이 췌장 β 세포의 apoptosis 뿐만 아니라 glucose 대사의 이상도 유 도함을 알 수 있었다. Fig. 17. Effects of mitochondria dysfunction on glucose metabolism-related protein in MIN6N8 cells. Fig.2.의 결과를 통하여 GCK가 glucose 농도에 의해 cytoplasm에서 mitochondria의 outermembrane 으로 이동하는 것을 확인하였는데 이러한 현상이 mitochondria dysfunction에 의해 영향을 받는지 알 아보기 위하여 cytosolic fraction과 mitochondria fraction을 분리 하여 western blot을 행하였다. Fig.18.에서 보는바와 같이 mitochondria dysfunction 에 의해GCK의 mitochondria로의 translocation이 저 해되고. pro-apoptotic protein인 Bax의 양이 증가 함을 알 수 있었다. 이결과를 통하여 mitochondria dysfunction은 GCK의 translocation을 저해하여 세 포내의 효율적인 ATP 합성을 저해할 뿐만 아 니라 Bax의 mitochondria로의 이동을 증가시켜

266 Ⅰ. 연구보고 255 apoptosis를 촉진하는 것을 알 수 있었다. 은 GCK와 VDAC의 결합을 감소시킴으로써 VDAC와 Bax의 interaction을 증가시켜 apoptosis 를 유발시킴을 알 수 있었다. Fig. 18. Effects of mitochondria dysfunction on GCK translocation to mitochondria in MIN6N8 cells. 6. MIN6N8 세포에서 mitochondria dysfunction 이 GCK-VDAC interaction에 미치는 영향. GCK와 mitochondrial VDAC와의 interaction이 apoptosis에 중요한 역할하며 앞서의 결과에 의 해서도 glucose에 의해 GCK와 mitochondria의 VDAC와의 interaction을 증가시킴을 살펴보았다. 그러므로 mitochondria dysfunction이 GCK와 VDAC의 interaction에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 먼저 GCK의 mitochondria translocation에 중요한 작용을 하는 Bad의 phosphorylation을 측정하였다. Fig.19에서 보는바 와 같이 mitochondria dysfunction에 의해 Bad의 phosphorylation이 저해되는 것을 알 수 있었다. 이를 co-immunoprecipitation을 행해 GCK와 VDAC의 interaction을 다시 한번 더 확인한 결과 Fig. 20에서 알 수 있듯이 mitochondria dysfunction 에 의해 GCK와 VDAC의 interaction이 현저히 감 소하는 것을 확인할 수 있었다. Mitochondria dysfunction에 의해 GCK의 발현이 감소하고 Bad 의 phosphorylation이 감소하여 GCK와 mitochondria VDAC의 결합이 감소하였기 때문에 mitochondria VDAC에 GCK와 경쟁적으로 결합하는 pro-apoptotic protein인 Bax의 mitochondria VDAC와의 interaction을 살펴보았다. Fig.21 에서 보는바와 같이 mitochondria dysfunction에 의해 Bax와 VDAC의 interaction이 증가함을 보였으므로 mitochondria dysfunction Fig. 19. Effects of mitochondria dysfunction on Bad phosphorylation in MIN6N8 cells. Fig. 20. Effects of mitochondria dysfunction on GCK-VDAC interaction in MIN6N8 cells. Fig. 21. Effects of mitochondria dysfunction on Bax-VDAC interaction in MIN6N8 cells.

267 256 국립보건연구원보 7. Mitochondria dysfunction에 의한 apoptosis 에 ROS가 미치는 영향 MIN6N8 세포에서 mitochondria dysfunction이 유도하는 apoptosis가 ROS와 관련됨을 증명하기 위해 antioxidant NAC을 처리하였을 때 GCK의 level과 mitochondrial VDAC와의 interaction등을 측정하였다. Fig.22에서 볼 수 있듯이 mitochondria dysfunction에 의해 감소되던 GCK와 HKI의 발현이 antioxidant인 NAC의 첨가로 회복되었으며, Fig. 23. Effects of antioxdant on GCK-VDAC interaction reduced by mitochondria dysfunction in MIN6N8 cells. 8. Islet 세포에서 mitochondria dysfunction 이 insulin 분비에 미치는 영향. Fig. 22. Effects of antioxidant on expression of proteins mediated by mitochondria dysfunction in MIN6N8 cells. ICR mice로부터 췌장의 Islet 세포를 분리 하 여 mitochondria dysfunction이 insulin 분비에 어떠 한 영향을 미치는지 immunocytochemistry를 통하 여 살펴보았다. Fig.26을 통하여 islet 세포에서도 MIN6N8 세포와 같이 mitochondria dysfunction이 insulin 양을 저해함을 알 수 있었다. Mitochondria dysfunction에 의해 저해되던 GCK와 VDAC의 결합 역시 NAC의 처리를 통 해 회복되는 것을 알 수 있었다 (Fig. 23). 그러 므로 mitochondria dysfunction이 유도하는 apoptosis는 ROS에 의해 GCK와 mitochondria와의 interaction이 감소함으로써 일어남을 확인할 수 있었다. Fig. 26. Effects of mitochondria dysfunction on insulin contents in islet cells. 참고문헌 1. Kurrer MO, Pakala SV, Hanson HL, and Katz JD: Beta cell apoptosis in T cellmediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(1):213-8, 1997

268 Ⅰ. 연구보고 Eizirik DL and Darville MI: Beta-cell apoptosis and defense mechanisms:lessons from type 1 diabetes. Diabetes 50 Suppl 1:S , Gurgul E, Lortz S, Tiedge M, Jorns A, and Lenzen S: Mitochondrialcatalase overexpression protects insulin-producing cells against toxicity of reactive oxygen species and proinflammatory cytokines. Diabetes 53(9): , Zhou YP and Grill VE: Long-term exposure of rat pancreatic islets to fatty acids inhibits glucose-induced insulin secretion and biosynthesis through a glucose fatty acid cycle. J. Clin. Invest. 93: , Cnop M, Hannaert JC, Hoorens A, Eizirik DL, and Pipeleers DG: Inverserelationship between cytotoxicity of free fatty acids in pancreaticislet cells and cellular triglyceride accumulation. Diabetes 50: , Ganesan S, Calle R, Zawalich K, Greenawalt K, Zawalich W, Shulman GI, andrasmussen H: Immunocytochemical localization of -protein kinase C in rat pancreatic -cells during glucose-induced insulin secretion.j Cell Biol. 19 (2): , Matschinsky FM: Regulation of pancreatic -cell glucokinase: from basics totherapeutics. Diabetes 51: S394-S404, Efrat S: Regulation of insulin secretion: insights from engineered beta-cell lines. Ann N Y Acad Sci. 1014:88-96, Maedler K, Sergeev P, Ris F, Oberholzer J, Joller-Jemelka HI, Spinas GA, Kaiser N, Halban PA, and Donath MY:Glucose-induced beta cell production of IL-1beta contributes to glucotoxicity in human pancreatic islets. J Clin Invest. 110(6):851-60, Faradji RN., Havari Evis, Chen Q, Gray J, Tornheim K, Corkey BE, Mulligan RC, and Lipes MA: Glucose-induced Toxicity in Insulin-producing Pituitary Cells That Coexpress GLUT2 and Glucokinase. J Biol Chem.276 (39): , Tsakiris D and Ioannou K: An underdiagnosed type of diabetes: the MODY syndromes. Pathophysiology, clinical presentation and renal disease progression. J Nephrol. 17(5):637-41, Gottsater A, Kangro M, and Sundkvist G: Early parasympathetic neuropathy associated with elevated fasting plasma C-peptide concentrations and lateparasympathetic neuropathy with hyperglycaemia and other microvascular complications. Diabet Med. 21(12):1304-9, Eastman RC, Garfield SA. Prevention and treatment of microvascular andneuropathic complications of diabetes. Prim Care. 26(4): , Matschinsky FM, Glaser B, and Magnuson MA: Pancreatic beta-cell glucokinase: closing the gap between theoretical concepts and experimental realities. Diabetes 47(3):307-15, Postic C, Shiota M, and Magnuson MA: Cell-specific roles of glucokinase in glucose homeostasis. Recent Prog Horm Res.56: , Wang MY, Koyama K, Shimabukuro M, Mangelsdorf D, Newgard CB, Unger RH: Overexpression of leptin receptors in pancreatic islets of Zucker diabetic fatty rats restores GLUT-2, glucokinase, and glucose-stimulated insulin secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(20): , Jetton TL, Liang Y, and Cincotta AH: Systemic treatment with sympatholytic dopamine agonists improves aberrant beta-cell

269 258 국립보건연구원보 hyperplasia and GLUT2, glucokinase, and insulin immunoreactive levels in ob/ob mice. Metabolism 50(11): , Jorns A, Tiedge M, Ziv E, Shafrir E, and Lenzen S: Gradual loss of pancreatic beta-cell insulin, glucokinase and GLUT2 glucose transporter immunoreactivities during the time course of nutritionally induced type-2 diabetes in Psammomys obesus (sand rat). Virchows Arch. 440(1):63-9, Kaneto H, Xu G, Song KH, Suzuma K, Bonner-Weir S, Sharma A, and Weir GC: Activation of the hexosamine pathway leads to deterioration of pancreatic beta-cell function through the induction of oxidative stress. J Biol Chem. 276(33): , Danial NN, Gramm CF, Scorrano L, Zhang CY, Krauss S, Ranger AM, Datta SR., Greenberg ME, Licklider LJ, Lowell BB, Gygi SP, and Korsmeyer SJ: BAD and glucokinase reside in a mitochondrial complex that integrates glycolysis and apoptosis. Nature 424(6951):952-6, Downward J: Cell biology: metabolism meets death. Nature 424(6951):896-7, Majewski N, Nogueira V, Robey RB, and Hay N: Akt inhibits apoptosis downstream of BID cleavage via a glucose-dependent mechanism involving mitochondrial hexokinases. Mol Cell Biol. 24(2):730-40, Vyssokikh V, Zorova L, Zorov D, Heimlich G, Jurgensmeier J, Schreiner D, and Brdiczka D: The intra-mitochondrial cytochrome C distribution varies correlated to the formation of a complex between VDAC and the adenine nucleotide translocase: this affects Bax-dependent cytochrome C release. Biochimica Biophysica Acta 1644: 27-36, Antonsson B, Montessuit S, Lauper S, Eskes R, and Martinou JC: Bax oligomerization is required for channel-forming activity in liposomes and to trigger cytochrome c release from mitochondria. Biochem J. 345: , 2000

270 Ⅰ. 연구보고 259 Mitochondria Dysfunction Induces Pancreatic β-cell Apoptosis Through decreased Interaction of GCK with Mitochondria J.W. Lee, W.H. Kim, M.H. Jung and J.H. Lim Division of Metabolic Diseases, Center for Biomedical Science, NIH, Seoul Korea Purpose:Mitochondria dysfunction has been considered a critical component in the development of diabetes. In an effort to elucidate molecular mechanism involved in the development of diabetes, we investigate molecular mechanism involved in the apoptosis of pancreatic β cell induced by mitochondria dysfunction. Methods:Mitochondria function of pancreatic β cell, MIN6N8 cells, were impaired by treatment with inhibitor of mitochondrial electron transport chain, oligomycin, for 24hours. In the cells, the expression and interaction with mitochondria of glucokinase (GCK) were investigated as well as the apoptosis. Results:Oligomycin treatment increased cell death by Bax oligomerization, cytochrome C release, and caspase-3 activation. During apoptosis, GCK expression decreased, concomitant with a decrease in cellular ATP production and insulin secretion. Moreover, exposure to a oligomycin decreased interaction with GCK and mitochondria with an increase in Bax binding to mitochondria and cytochrome c release. These events were prevented by GCK overexpression and treatment with antioxidant, N-acetyl-cysteine (NAC). Conclusions:Our results show that mitochondria dysfunction by metabolic stress leads to lowered GCK expression by ROS and reduced association with mitochondria and results in the apoptosis of pancreatic β cell. Key words:mitochondria dysfunction, pancreatic β cell, apoptosis, glucokinase, ROS This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

271 260 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 당뇨병 병인기전 관여 유전자의 정량적 특성 분석 (quantitative trait analysis)을 통한 발현조절 전사조절 네트워크 복합체 연구 국립보건연구원 유전체센터 유전체역학팀 김영열, 유길미, 김상배, 김영진, 김동준, 박성준, 박찬, 김규찬 목 적:전 세계적으로 당뇨질환은 크게 증가하고 있으므로 본 연구에서는 마이크로어레이 기술과 전사체 관련 연구 기법들을 이용하여 당뇨 질환 관련 유전자의 발현 조절 및 전사조절 네트워크 복합 체를 구축하고자 한다. 방 법:당뇨 질환 연관 유전자의 정량적 분석을 위하여 알려진 질환 연관 데이터베이스인 OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)과 GAD(Genetic Associated Database)로부터 당뇨 연관 유전자를 수집한 후 후보 유전자들의 전사인자 및 전사인자 결합부위 정보를 바탕으로 전사체 정보를 분석 할 수 있는 시스템을 개발하였다. 이 시스템을 통하여 당뇨병 연관 유전자의 보존된 발 현 조절 패턴을 분석하고 당뇨 연관 조절 인자를 통해 조절되는 유전자 후보군을 선별하였으며 ChIP(chromatin immunoprecipitation) 기법으로 후보군 유전자를 검증할 수 있다. 당뇨 연관 전사 인자 결합부위를 찾기 위하여 Fisher's exact test와 Gene Ontology 방법을 사용하여 신뢰도가 높은 전사인자 결합부위를 예측하였다. 결 과:OMIM과 GAD 데이터베이스를 통하여 당뇨 질환 관련 245개의 유전자를 수집하였으며 이 유전자를 바탕으로 전사인자 및 결합 부위를 예측하고 전사인자 결합부위의 기능적 클러스터를 분석 하여 통합 전사체 분석 시스템(InterTFBS)을 개발하였다. 이 시스템을 통하여 당뇨 연관 전사인자에 의해 조절되는 후보군 유전자를 발굴할 수 있으며 ChIP 기법을 통해 당뇨 관련 전사인자에 의한 유 전자 발현 유무를 확인 할 수 있다. 결 론:본 연구를 통하여 당뇨 질환과 연관된 유전자의 발현을 조절하는 전사인자를 발굴하여 전사 인자에 의해 조절되는 새로운 당뇨병 유전자를 검증 할 수 있으며 당뇨병 관련 유전자 발현의 메카니 즘 및 조절 네트워크를 구축할 수 있다. 중심단어:당뇨병, 전사인자, 전사인자 결합부위, 전사조절 네트워크 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

272 Ⅰ. 연구보고 261 Gene expression and regulatory network analysis through quantitative trait analysis of diabetes associated genes Y.Y. Kim, G.M. Ryu, S.B. Kim, Y.J. Kim, D.J. Kim, S.J. Park, C. Park and K.C. Kimm Division of Epidemiology and Health Index, Center for Genomic Science, NIH, Seoul Korea Purpose : The purpose of this study is to construct the diabetes gene network in terms of gene expression profile and transcriptional regulation using all technology such as microarray, chromatin immunoprecipitation (ChIP), etc. Methods : We collected diabetes related genes from OMIM and GAD. The genes are analyzed to predict of transcriptional regulation of transcription factor binding sites(tfbs). We developed the user-friendly analysis system to provide a functional analysis. To study diabetic expression regulation on the transcriptional level, putative TFBS candidates are identified by the system and it is successively going to be verified by ChIP. Results:We collected 245 diabetes related candidates from OMIM and GAD and developed Integrating TFBS Analysis System(InterTFBS). This system effectively identifies putative TF target genes and target TFBS based on the statistical approaches. Experimental evidences would remove unreliable false positives from the results of in silico analysis. Validated candidates as diabetes related genes are then functionally clustered in the context of gene regulatory network. Conclusions : This study performs the thorough analysis on the mechanism of the transcriptional regulatory network and gene expression profiling of diabetes. The infrastructure constructed through this study would be great aid to study of the genetic network association of diabetes. Key words : diabetes, transcription factor, binding site, regulatory network This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

273 262 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 인간게놈에서 리간드와 상호작용하는 단백질을 암호화하는 유전자 추출 및 분석 국립보건연구원 유전체센터 바이오과학정보팀 정종선, 박찬, 김규찬 목 적:현재 인간게놈에서 알려진 유전자수는 대략 23,000 이다. 이중 많은 유전자가 리간드에 의 해 기능이 조절되는 것으로 보고되어 있다. 본 연구는 4가지 주요 데이터베이스(3차원구조 복합체, pathway, 3차원 도메인 구조, 인간게놈서열)를 사용하여 리간드에 의해 기능이 조절되는 단백질들을 암호화하는 유전자를 추출하는 방법에 대한 연구결과를 보고한다. 방 법:본 연구에서 특이적으로 결합하는 리간드를 추출하는 두 가지 방법을 소개하면 다음과 같 다. 첫째, 리간드가 특정 단백질 family에서 발견이 되는 정도와 다른 단백질 family에서 발견 될 수 있는 정도는 다르다. 이러한 원리를 이용한 것이 LOR(log odds ratio)방법이다. 둘째, 특정 리간드와 결합하는 여러 개의 다른 단백질에서 결합에 관여하는 아미노산의 보존성을 이용하는 방법이다. 결 과:위의 특이적으로 결합하는 리간드-단백질 복합체를 이용하여 리간드에 의해 기능이 조절되 는 4천여 개의 유전자 (LIPgene)를 추출하였다. 또한 총 229개의 알려진 pathway 데이터베이스에서 150개 이상의 pathway에서 위의 LIPgene이 존재함을 확인 하였고, 그중 많은 경우가 아직 보고되지 않은 고유한 경우임을 발견하였다. 결 론:본 연구를 통하여 확보한 LIPgene은 표적단백질 추출, 리간드을 이용한 pathway 조절 등 에 활용 가능하다. 또한 단백질 상호작용만으로 유전자 간의 기능 연결이 안 되는 경우에도 LIPgene 을 활용하여 기능연결이 가능하다. 본 연구는 대량의 질환(당뇨) 관련 유전자들의 기능연관성 분석을 위하여 개발되었다. 중심단어:표적단백질, 리간드, LIPgene, 3차원구조, 특이결합리간드, 인간게놈 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

274 Ⅰ. 연구보고 263 서 론 급속히 증가 추세에 있는 Protein data bank(pdb)의 단백질-리간드 복합체들은 리간드 에 의해 영향을 받는 유전자들 간의 네트워크 생성을 위한 유용한 정보를 제공하고 있다[1,2]. 또한 지방족 탄화수소, 뉴클레오티드, 아니노산, 이온, 당 등으로 나눠지는 리간드는 단백질 상 호작용, 신호전달, 약물표적화, 막 단백질 결합 과정에서 중대한 영향을 주고 있다[3,4]. 최근 많 은 단백질-리간드 복합체를 기초로 한 연구들이 보고되고 있다, MOAD(mother of all databases), PDBsum, bindingdb, PDBbind, LPDB(ligand-protein database), PDB-ligand [5-10]. 특히, PDBsum은 PDB code, hetgroup, ligand, enzyme과 species정보 를 제공하는 PDB내에 존재하는 macromolecular구 조를 담고 있는 데이터베이스이다. 또한 PDB-ligand도 PDB내에 protein-ligand complexes 를 기반으로 하는 3차원 구조 데이터베이스이 다. 특히 MOAD는 PDB database에서 추출한 2,630개의 리간드와 5,331개의 단백질-리간드 복합체로 구성되어 이들 리간드들은 curator들 에 의해 검증되었다. 리간드에 의한 유전자 발현을 측정하는 실험 결과들은 많은 연구자들에 보고되어지고 있다 [11-17]. 그러나 발현을 증가시키거나 감소시키 는 조절작용을 어떤 리간드가 특이성이 있는지 직접적인 작용을 하는지에 대한 내용은 불명확 하다. 하나의 유전자는 여러 다른 유전자들에게 직접 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있으며 영 향을 받은 다른 유전자들은 또 다른 유전자들 에게 영향을 주는 연속적인 효과를 얻을 수 있 다. 이에 따라 유전자들의 기능을 조절하기 위 해 상호작용에 의해 영향을 주고받는 것에 있 어서 리간드의 역할은 중요하다. 모든 단백질의 기능은 다른 분자들의 결합에 의해 의존하고 있다. 그리고 많은 다른 단백질 들은 리간드들의 결합에 따라 유전자 발현정도, 효소 활성도, transport molecule의 정도가 조절 된다. 각각의 단백질들은 도메인 부분에 리간드 결합부위를 하나 또는 그 이상을 가지고 있다. 리간드들은 단백질의 리간드 결합부위의 구조, 리간드의 크기와 구조에 따라 결합 친화도는 달라지며 리간드-단백질의 상호작용은 리간드 와 단백질간의 수소결합, 반데르발스, 전기적 상호작용, 소수성에 따라 영향을 받는다. 이와 같이 리간드의 결합에 따라 단백질의 구조의 변화로 인한 기능변화, 유전자의 발현정도가 달 라짐을 알 수 있다. 2003년 cell biology에 실린 논문에 따르면 c-abl은 SH3 도메인과 SH2 도메인 리간드에 의해 활성화 된다고 알려졌다[18]. Myristoyl/ phosphotyrosine의 SH3 와 SH2 도메인의 전환에 따라 kinase의 활성된 형태가 변한다. myristic acid(myr)은 SH3 도메인의 carboxyl terminal에 공유결합을 한다. (그림1-E). SH3 도메인에 공 유결합된 긴 유동성이 있는 꼬리부분은 c-abl 의 tyrosine kinase 도메인의 hydrophobic pocket 에 결합되어 기능변화를 일으킨다. 그러므로 tyrosine kinase 도메인에 결합되는 myristic acid(myr)는 신호활성의 열쇠가 되며 MYR과 ATP 모두 두개의 기능적으로 다른 유전자를 조절할 수 있는 리간드이다. tyrosine kinase 도 메인의 두개의 다른 MYR 결합부위와 여러 다 른 ATP binding kinase 도메인은 그림1에서 보 였다. AMP, ADP, ATP과 같이 전형적인 뉴클 레오티드 리간드들은 약 500개의 알려진 인간 유전자들로부터 형성된 다양한 kinase 도메인들 과 상호작용을할 수 있다. kinase인 ACAS2, IR, PDK, RHOQ (그림 1-A,B,C,D) 같은 유전자들 은 insulin signaling pathway에 포함되어 있으며 3차원 구조와 생리적 역할은 모두 다르지만 동 일 pathway에 속해 있다[19]. 이와 같이 서로 다른 유전자이지만 동일한 도메인의 리간드 결 합부위를 가지거나 서로 다른 도메인을 가지고 있지만 동일한 리간드 결합부위를 가지게 될 경우 수많은 리간드가 생체 내에서 존재하거나 분비되면서 신호전달에 영향 주어 여러 유전자

275 264 국립보건연구원보 들에게 영향을 줄 수 있는 가능성을 제공할 것 이다. 드들은 연구 대상에서 제외하였다. Log Odds Ratio (LOR) LOR은 하나의 리간드가 전체SCOP family에 결합할 확률에 대한 특정 SCOP family에 결합 할 확률로서, 하나의 리간드가 특정 단백질 도 메인(SCOP family)에 얼마나 자주 결합하는지 를 측정하는 기준으로 사용되었다. 본 연구에서 정의한 LOR의 의미는 다음과 같다 : <그림 1> ATP and MYR binding protein domains LOR ij = ln ij j i n n n n 방 법 단백질-리간드 복합체 분석 PDB(Protein Data Bank)에 등록되어 있는 단 백질 3차원 구조 데이터는 단백질 Chain 단위 로 구분되어 있다[5]. 본 연구에서는 SCOP 데 이터베이스(v1.69)에 등록되어 있는 70,859 개 의 3차원 단백질 도메인 구조(이하, SCOP도메 인)를 기준으로 작업을 수행하였다. PDB 데이 터로부터 각각의 SCOP도메인에 결합하는 리간 드 목록을 얻기 위해서는, SCOP도메인-리간드 결합 거리의 threshold 값을 선정하는 작업이 선 행되어야 한다. 이를 위하여 SCOP도메인-리간 드 결합 거리를 3.0~6.0A 으로 변화시키면서 SCOP도메인-리간드 복합체의 개수를 측정하였 다. 그 결과, SCOP도메인-리간드 복합체의 개수 가 플라토 지점인 4.5 A 값을 SCOP도메인-리 간드 거리의 threshold 값으로 삼았다. 위에서 선정한 기준(SCOP도메인-리간드 거리 = 4.5A ) 에 따라 70,859개의 SCOP 도메인 중, 44,215개 의 SCOP 도메인이 리간드와 결합하고 있음을 확인하였고, H2O, oligo-nucleotides, peptide리간 여기서, n : the number of SCOP domains with a specified index type, (하나의 SCOP domain이 동일한 리간드를 두 개 이상 가지더라도 nij값 은 1로 간주함), i : a ligand type, j : a SCOP family type, dot : any ligand (or any SCOP family type) 이다. LOR 값이 크다는 것은 리간드가 특정 SCOP family에 더 자주 결합하는 것을 의미하므로, LOR 값을 이용하여 리간드 결합 특이성을 정 량적으로 측정 할 수 있다. 하나의 리간드는 여 러 종류의 SCOP family에 서로 다른 빈도로 결 합하므로, 각각의 경우에 서로 다른 LOR 값을 가지게 된다 Conservation of Ligand-binding Residue (CLR) 단백질(SCOP도메인)-리간드 복합체에서 리간 드와 상호작용하는 단백질 아미노산의 보존 여 부를 확인하기 위한 작업을 수행하였다. 하나의 리간드에 결합하는 두 개 이상의 SCOP domain 가 주어진다면 CLR 계산은 다음과 같이 수행 할 수 있다.

276 Ⅰ. 연구보고 265 s = lk m max( n lk k, n' k ) 간드와 결합할 가능성이 있는 유전자는 4,204개 이다. clr ε i i = T N l = 1 k = 1 = ( s + ε ) lk T N κ i κ max i w 여기서, l : protein pair type(두 개의 SCOP domains), k : atom type in a ligand, m : the number of atom-residue matches between protein pair in an atom type k, n : the number of residues that are in contact with the atom type k, N : the number of atoms in a ligand that shares two proteins, T: is the number of domain pair types. e is the weight for ligand size effect and k is the average number of atoms that are in contact with proteins, w is a weight for e (=1.0) and kmax is the maximum number of k in the database. 단백질 3차원 도메인 구조 vs. 인간 게놈 인간 유전자 서열의 3차원 도메인 구조를 알 기 위하여, BLAST 프로그램을 이용하여 NCBI 에 등록되어 있는 23,441개의 인간 reference 유 전자 서열과 34,112개의 SCOP 도메인(리간드 복합체) 서열과의 상동성비교 작업을 수행하였 다. 이 BLAST 작업 결과 중, 다음 세 가지 조 건을 만족하는 유전자 서열과 SCOP도메인 서 열을 상동성이 있는 것으로 간주하였다. 1) e-value 값이 10-4 이하인 것, 2) sequence idenity가 30% 이상인 것, 3) 유전자와 SCOP도 메인 간 배열된 서열 길이(Gap 개수 제거)가 SCOP도메인 서열 길이의 90% 이상인 것. 위의 작업 결과, 5,925개의 인간 유전자가 SCOP 도 메인 구조를 상동성이 있는 것을 확인하였다. 이중 LOR 3.0 & CLR>=0.1을 만족시키는 리 결 과 인간게놈에서의 Ligand-interacting protein들을 암호화하는 유전자 추출을 위한 전체 계략도 는 아래 <그림 2>와 같다. 아래 계략도 에서 회색 박스는 input 및 output을 의미하며 전체 LIPgene이 전체 유전자의 4분의 1에 해당함을 알 수 있다. <그림 2>에서 Filter1, 2 그리고 3 는 제거를 위한 작업을 의미하고 주어진 식을 만족하면 모두 제거 하였다. Ligand-interacting proteins (Domain : 24,763) SCOP families: 1567 Ligands: 3142 SCOP family-ligands: 9909 Assigning to all family members Calc. LORs (Domain : 39,260) Filter3: 1). E-value > ). %Match < 90 3). %SeqID < 30 Human genes (Gene : 23,441) LIPgenes (Gene : 4,204) SCOP (v1.69) (Domain : 70,859) Ligand-interacting proteins (Domain : 44,215) Filter1: Distance > 4.5A Filter2: 1). Poor binding 2). %SeqID > 90 Ligand-sharing domain pairs (Pair : 64 Million) Calc. CLRs (Ligand : 3142) LOR 3.0 & CLR 0.1 (Domain : 34,112) LIPpathways (Pathway : 154) Pathways (pathway : 229) <그림 2> Schematic Representation of Collecting LIP genes

277 266 국립보건연구원보 전체 PDB내에 존재하는 단백질 구조에서 SCOP도메인이 존재하는 것만 선정하고, 그리고 리간드 결합 부위가 존재하는 도메인을 계산하 여 44,215개를 찾아내었다. 인간 유전체내에서 알려진 유전자와 도메인간의 유사성을 측정하 여 하나의 유전자 안에서 존재 할 수 있는 SCOP family를 선정하였으며, 특히 같은 SCOP family에 속하는 SCOP 도메인에서는 리간드 결 합부위를 예측하였다. 그중에서 특정 리간드가 특정 SCOP family에 결합 할 수 있는 가능성을 측정한 값인 LOR과, 또한 특정 리간드에 대하 여 특이적으로 결합하는 정도치를 CLR를 사용 하여 특이적 결합력을 측정하였다. 따라서 CLR이 0.1보다 크고 LOR이 3이상인 리간드가 결합 할 수 있는 4,204개의 유전자를 최종 선정 하였다. 이와 같이 리간드에 의해서 영향을 받 을 수 있는 유전자들을 예측하여 LIPgene 이라 고 정하였다. LIPgene들은 구조적 도메인-리간 드 복합체안에서 리간드가 영향을 줄 수 있는 SCOP family의 형태의 수에 따라 T01~T46 의46개의 type으로 분류하였다. T1의 경우 리간 드가 결합될 수 있는 그룹인 SCOP family의 형 태의 수가 하나일 때를 말한다. T2~T46의 type 은 SCOP family의 형태의 수가 2개에서 46개 일 때 분류하였으며 이들은 하나의 유전자에 여 러 도메인이 존재할 수 있음을 나타낸다. T2부 터는 두개 이상의 두개의 다른 도메인과 하나의 리간드가 상호작용할 수 있다고 할 수 있다. 다음 표 1 과 2와 같이 각각의 리간드별 결 합할 수 있는 SCOP family 형태와 family에 속 하는 도메인이 존재할 수 있는 유전자 및 pathway들을 나타내었다. 표 1은 전체 LIPgene 중에 가장 특이적으로 결합하는 10개의 리간드 들을 선정하였다. 놀랍게도 대부분의 LIPgene에 서의 리간드들은 단백질을 표적으로 하는 신약 이나 약물치료용 목적으로서 중요한 유전자들 임을 알 수 있다. <표 1> The 10 most specific protein-ligand interactions in human genome lig name family CLR LOR gene pathway ITP 1hyiA_ g FGD1 N/A FGL 1auk c ARSA glycosphingolipid metabolism OAD 1m2nA_ c SIRT1 N/A DMJ 1fo2A_ a MAN1A1 N-Glycan biosynthesis IFG 1nowA1 c HEXA, HEXB N-Glycan degradation LEA 1b4eA_ c ALAD porphyrin and chlorophyll metabolism ASK 1jxqA_ c CASP6 CASP3 caspase cascade in Apoptosis AKT signaling pathway CHF 2jxrA_ b CTSD N/A I84 1l3A_ c AKR1C1 glycolysis/gluconeogenesis pentose and glucuronate interconversions bile acid biosynthesis BMP 1dqxA_ c UMPS pyrimidine metabolism ITP: PHOSPHORIC ACID MONO-(2,3,4,6-TETRAHYDROXY-5-PHOSPHONOOXY-CYCLOHEXYL) ESTER, FGL: 2-AMINOPROPANEDIOIC ACID, OAD: 2'-O-ACETYL ADENOSINE -5-DIPHOSPHORIBOSE, DMJ: 1-DEOXYMANNOJIRIMYCIN, IFG: (2R,3R,4S,5R)-2- ACETAMIDO-3,4- DIHYDROXY-5- HYDROXYMETHYL-PIPERIDINIUM, LEA: LEVULINIC ACID, ASK: DEHYDROXYMETHYLASPARTIC ACID, CHF: CYCLOHEXYLFLUOROSTATONE, I84: [2,6-DIMETHYL-4- (2-O-TOLYL-ACETYLAMINO)- BENZENESULFONYL]-GLYCINE, and BMP: 6-HYDROXYURIDINE-5'-PHOSPHATE

278 Ⅰ. 연구보고 267 알려진 pathway에 속하는 LIPpathways LIPgene이 metabolic pathway나 regulatory pathway상에 존재할 때 그 유전자들은 특정 리 간드에 의해 조절됨을 간접적으로 설명할 수 있을 것이다. 본 연구에서는 KEGG와 BioCarta 데이터베이스에서 LIPgene이 존재하는 229개의 생체대사조절pathway를 얻어서 각pathway 상에 서의 리간드, 유전자, 단백질의 관계들을 LIP gene(4,204)들과 비교하였다. <표 2 >에서 BH4 는 cofactor고, 두개의 다른 pathway에서 BH4가 서로 다른 유전자를 연결 시켜준다[20, 21]. 또 한 CU의 경우도 CCS 와 SOD1는 CU를 cofactor로 사용하므로 CU의 농도의 변화에 민감 하게 발현되는 실험이 보고되어있다[22]. 다른 예로는 KEGG database에서 존재하는 urea cycle 과 amino group의 대사는 <그림 3>에서 보여진 다. urea cycle에서 OAT (ornithine aminotransferase)와 ODC1 (ornithine decarboxylase1)은 L-glutamate-5-semialdehyde 와 putrescine을 생산하 는 PLP (pyrodoxyl-5-phosphate)와 같은 cofactor가 요구된다. 그러므로 리간드에 의해 조절되는 LIPgene은 pathway내에서 작용하는 유전자들의 기 능적 분석실험에 이용할 수 있을 것이다. <표 2> Some examples of ligand-mediated signaling pathways ligands gene sysmbols pathways BH4 BH4 CU PLP PAH, TH NOS1, PAH CCS, SOD1 OAT, ODC1 serotonin and catecholamine metabolism competition of NOS1 and PAH up or down regulation by Cu exposure urea cycle and metabolism of amino group PLP CBS, SDS glysine, threonine, and serine metabolism FMN DHODH, DPYD pyrimidine metabolism TPO YWHAB, CH2K2 reponse to DNA damange GDP a.116.1, c.37.1 GDP-mediated signaling pathway L-arginino-succinate ASS (EC: ) Citrulline ASL (EC: ) Arginine OTC1 (EC: ) ARG1 (EC: ) Ornithine OAT (EC: ) PLP PLP ODC1 (EC: ) L-glutamate-5- semialdehyde Putrescine <그림 3> Urea cycle and metabolism of amino group 그 이외에도 KEGG에서 PLP, FMN, TPO를 cofactor로 하는 pathway가 보고 되어있고[23], 또한 GDP-mediated signaling pathway에서 두개 의 SCOP도메인 superfamily a.116.1(rho GTPase activating gene family,gap), c.37.1(ras homolog gene family)는 너무 많은 유전자가 관여를 하 여서 유전자를 암호화하는 주요단백질의 3차원 도메인 superfamily로 표시하였다. RAS-GAP system은 SH3 도메인을 통해서 Rho-mediated cytoskeletal reorganization을 조절한다. 단백질-리간드 결합 특이성 본 연구에서는 새롭게 단백질-리간드 결합 친 화도의 정량적 분석 방법을 도입하였다. 즉, 특 정 리간드가 단백질 도메인에 얼마나 자주 결 합하는지를 측정하는 기준으로서 LOR 값을 사 용하였다. 또한 리간드가 결합하는 단백질의 아 미노산의 보존성을 위한 CLR을 계산하였다. 리 간드가 결합 될 수 있는 SCOP family의 개수 (PFPL)가 1인 경우와 1이상 인 경우에 대한 분 포도가 <그림 4>에서 보여준다. CLR의 경우 CLR값이 0.2가 되는 지점에서 정규분포를 보이 고 있고, 0.1근처에서 PFPL이 1인 경우와 2이 상인 경우에서 두개의 피크의 꼬리(tail)이 일치 하므로 threshold로서 적절하다. 그리고 LOR의 경우에도 LOR 수치가 3에서 크게 변함을 알

279 268 국립보건연구원보 수 있다. 따라서CLR 0.1과 LOR 3.0이 두개의 분포의 경계가 됨을 알 수 있다. <그림 5>는 CLR 과 LOR의 상호연관성을 보여준다. 본 실 험의 목적은 낮은 특이성을 주는 리간드를 제거 하는 것이 목적이므로 전체 dot의 분포에서 두 개의 특이적 결합 측정방법의 결합은 서로간의 약점이 보완이 되므로 본 연구의 목적과 잘 일 치됨을 볼 수 있다. Frequency PFPL>=2 PFPL=1 Frequency ' PFPL>=2 PFPL= CLR LOR <그림 4> Distribution of CLR and LOR for ligand-interacting proteins 1 LOR>=3.0 & CLR>=0.1 LOR < 3.0 & CLR < CLR LOR <그림 5> Distribution of CLR and LOR for ligand-interacting proteins

280 Ⅰ. 연구보고 269 또한 <그림 6>은 각 LIPgene 타입에서 리간 드의 결합 특이성 측정값들을 모두 더하고 평 균을 낸 값이다. 놀랍게도 각 LIPgene타입의 수 치가 증가함에 따라 리간드결합 특이성 측정값 들의 평균 CLR과 LOR값들이 감소함을 보여준 다. 리간드가 여러 개의 다른 SCOP family 도메 인에 결합을 하면 결합력이 감소함을 의미한다. 수행했다. 결과적으로 154개의 유전자(LIPgene) 가 mapping이 되었다. LIPgene들을 분석한 결과 LIPgene들은 유전자 기능연결을 비롯해서 다양 한 응용들을 가지고 있음을 밝혀냈다. 참고문헌 Accumulated CLR*10 and LOR T01 T02 T03 T04 T05 T06 T07 T08 T09 T10~ LIP Ty pe me an CLR me an LO R <그림 5> Distribution of CLR and LOR for ligandinteracting proteins 결 론 인간게놈의 알려진 유전자수는 대략 23,000 이다. 전체 유전자의 4분의 1정도는 기능을 위 해서 최소한 한 개의 리간드를 가지는 것으로 밝혀졌다. 그중 본 연구에서 개발한 새로운 특 이성을 정하는 기준에 의하여 리간드가 꼭 필 요할 유전자를 4,204개를 추출하였다. 이 유전 자들을 리간드 당 가질 수 있는 최고의 SCOP family 타입의 개수를 기준으로 분류작업 및 통 계작업을 하였다. 여기서, 리간드 당 SCOP family 타입의 개수와 리간드결합 특이성과는 반비례 관계에 있다는 것을 본 실험을 통하여 증명하였다. 또한 리간드가 꼭 필요한 유전자들 (LIPgene)을 전체 알려진 regulatory 와 metabolic pathway들에서 mapping하는 작업을 1. De Wolf FA, Brett GM Ligand-binding proteins: their potential for application in systems for controlled delivery and uptake of ligands. Pharmacol Rev. 52: Berman HM, Westbrook J, Feng Z, Gilliland G, Bhat TN, Weissig H, Shindyalov IN, Bourne PE The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28: Duplus E, and Forest C Is there a single mechanism for fatty acid regulation of gene transcription?. Biochem. Pharmacol. 64: Storch J, and Thumser AE, The fatty acid transport function for fatty acid- binding protein. Biochem Biophys Acta. 1486: Res. 28: Laskowski RA PDBsum: summaries and analyses of PDB structures. Nucleic Acids Res. 29: Roche O, Kiyama R, Brooks CL 3rd Ligand-protein database: linking protein-ligand complex structures to binding data. J Med Chem. 44: Chen X, Lin Y, Gilson MK The binding database: overview and user's guide. Biopolymers. 61: Wang R, Fang X, Lu Y, Wang S The PDBbind database: collection of binding affinitiesfor protein-ligand complexes with known three-dimensional structures. J Med Chem. 47: Shin JM, Cho DH PDB-Ligand: a

281 270 국립보건연구원보 ligand database based on PDB for the automated and customized classification of ligand-binding structures. Nucleic Acids Res. 33:D238-D Hu L, Benson ML, Smith RD, Lerner MG, Carlson HA Binding MOAD (Mother Of All Databases). Proteins. 60: Aranda A, and Pascual A Nuclear Hormone receptors and gene expression. Physiol Rev. 81: Weitzel JM, Radtke C, Seitz HJ Two thyroid hormone-mediated gene expression patterns in vivo identified by cdna expression arrays in rat. Nucleic Acids Res. 29: Sreekumar R, Halvatsiotis P, Schimke JC, Nair KS Gene expression profile in skeletal muscle of type 2 diabetes and the effect of insulin treatment. Diabetes. 51: Ruan H, Hacohen N, Golub TR, Van Parijs L, Lodish HF Tumor necrosis factor-alpha suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappab activation by TNF-alpha is obligatory. Diabetes. 51: Frederiksen KS, Wulff EM, Sauerberg P, Mogensen JP, Jeppesen L, Fleckner J Prediction of PPAR-alpha ligand-mediated physiological changes using gene expression profiles. J Lipid Res. 45: Florholmen G, Andersson KB, Yndestad A, Austbo B, Henriksen UL, Christensen G Leukaemia inhibitory factor alters expression of genesinvolved in rat cardiomyocyte energy metabolism. Acta Physiol Scand. 180: Lee HS, Park MH, Yang SJ, Jung HY, Byun SS, Lee DS, Yoo HS, Yeom YI, Seo SB Gene expression analysis in human gastric cancer cell line treated with trichostatin A and S-adenosyl-L-homocysteine using cdna microarray. Biol Pharm Bull. 27: Hantschel O, Nagar B, Guettler S, Kretzschmar J, Dorey K, Kuriyan J, Superti-Furga G A myristoyl/phosphotyrosine switch regulates c-abl. Cell. 112: Caenepeel S, Charydczak G, Sudarsanam S, Hunter T, Manning G The mouse kinome: discovery and comparative genomics of all mouse protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 101: Pastor CM, Williams D, Yoneyama T, Hatakeyama K, Singleton S, Naylor E, Billiar TR Competition for tetrahydrobiopterin between phenylalanine hydroxylase and nitric oxide synthase in rat liver. J Biol Chem. 271: Brautigam C, Wevers RA, Jansen RJ, Smeitink JA, de Rijk-van Andel JF, Gabreels FJ, Hoffmann GF Biochemical hallmarks of tyrosine hydroxylase deficiency. Clin Chem. 44: Tapia L, Gonzalez-Aguero M, Cisternas MF, Suazo M, Cambiazo V, Uauy R, Gonzalez M Metallothionein is crucial for safe intracellular copper storage and cell survival at normal and supra-physiological exposure levels. Biochem J. 378: Kanehisa M, Goto S, Hattori M, Aoki- Kinoshita KF, Itoh M, Kawashima S, KatayamaT, Araki M, Hirakawa M From genomics to chemical genomics: new developments in KEGG. Nucleic Acids Res. 34:D354-7.

282 Ⅰ. 연구보고 271 Genes for ligand-interacting proteins in Human genome J.S. Jung, C. Park and K.C. Kimm Division of Bio-Medical Informatics, Center for Genomic Science, NIH, Seoul Korea Purpose:The human genome is currently known to contain more than 23,000 well-defined genes. Given the number of protein-ligand complexes listed in the Protein Data Bank, a large portion of these genes could be annotated to encode at least one protein that requires a ligand for its function. Methods:We have developed a novel method for relating the functions of these genes by means of ligands with specificity. The specificity for protein-ligand interaction is described based on two in silico measures such as, occurrence of ligands in one protein family over all other families, and conservation of ligand-binding residues in different domains that share ligands. Results:In this study, we identified over 4,204 genes encoding proteins that interact with 2,397 different ligands at or above our specificity threshold and classified them according to the number of protein family types their ligands interact with. Of these genes for ligand-interacting proteins (LIP), 841 genes were mapped into 154 out of 229 known metabolic and regulatory pathways. Conclusions:Overall, the analysis of the LIPgenes proves the importance of ligands as a valuable resource for determining functional relationships between proteins and cellular pathways. Modulation of ligands could also be applied to controlled-release drug systems or to the design of studies on protein competition or synergism. Key words:drug target, ligand, LIPgene, 3D protein structure, ligand-binding specificity, human genome. This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

283 272 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 핵내 전사체의 발현 및 alternative splicing 분석을 통한 세포내 대사 조절기작에 관한 연구 국립보건연구원 유전체센터 유전체역학팀 김영열, 김동준, 박성준, 오경수, 김규찬, 박찬 목 적:Alternative splicing variants 인 c-flip L과 c-flip S의 암발생과정에서의 기능연구로서, NF-κB에 의해 유도된 c-flip L 발현은 어떻게 사멸수용체를 유도하고 세포사멸에 활성화된 NF-κ B에 의해 중단되는지를 설명한다. c-flip L과 다르게 c-flip S은 효과적으로 TNFR1 유도의 세포사멸 을 저해하고 TRAF-2와의 반응을 통하여 JNK 활성화를 자극한다. 따라서, 본 연구에서는 c-flip S 조절과 TNFR1 신호전달경로의 관계를 규명하고자 하였다. 방 법:세포배양에 사용된 암세포주는 ATCC회사것으로, RPMI-1640 에 10% FBS를 첨가하여 3 7 에서 5%의 CO 2로 배양하였다. c-flip L과 c-flip S 발현실험을 위하여 RT-PCR을 기반으로 둔 cloning방법으로 pcdna 3.1 topo His/V5 벡터(Invitrogen)를 사용하였다. c-flip L 과 c-flip S 발 현량 실험은 Real-Time PCR 을 이용하여 측정하였다. 세포사멸분석실험은 DNA fragmentation 분 석방법을 이용하여 FACS 로 실험군당 20,000 세포를 측정하였다. 결 과:다양한 인간 암 세포주에서 c-flip의 발현을 Real-Time PCR 실험으로 관찰한 결과 TNFR1 유도 세포사멸은 c-flip S의 발현 정도에 의존하는 것으로 나타났다. 또한 c-flips의 발현 정도와 TNF에 대한 세포의 민감도 연관이 있는 것으로 나타났고, c-flips의 기능은 TNFR1 유도의 JNK 활성화가 일어났다. 그 결과로서 c-flip S과 c-flip L은 TNFR1 유도 세포 사멸을 저해한다. 그 중에서도 c-flip S이 더 효율적으로 세포사멸을 막고 세포생존에 기여한다. 결 론:본 연구 결과는 TNFα 유도 세포사멸경로에 있어서 TRAF-2의 c-flips와의 친화도가 c-flip L보다 높으며 JNK 활성화를 억제하고 TNFα 유도 세포사멸에 저항을 동반한다는 새로운 기 작에 대한 증거를 제시하고 있다. c-flip S는 c-flip L과는 다른 역할을 가진 것으로 보이는데 이러 한 결과는 주로 TNF 유도에 의한 JNK 활성화의 지지 역할로 보여진다. 이러한 결과와 부합하는 이 전 데이터에서도 c-flip S의 특이적인 CD40 신호전달 역할을 포함하여 각 c-flip에 따른 상이한 기 능을 보여주고 있다 중심단어:종양궤사인자수용체(TNFR1), 세포사멸(Apoptosis), JNK, FLIP, TRAF-2 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

284 Ⅰ. 연구보고 273 The Association of TRAF-2 with the Short form of Cellular FLICE-like Inhibitory protein prevents TNFR1-mediated apoptosis Y.Y. Kim, D.J. Kim, S.J. Park, K.S. Oh, K.C. Kimm and C. Park Division of Epidemiology and Health Index, Center for Genomic Science, NIH, Seoul Korea Purpose : Tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1) performs pleiotropic activities such as the induction of apoptosis and activation of the transcription factor NF-κB, leading to the induction of a number of anti-apoptotic factors. In contrast to c-flip L, c-flip S effectively inhibits TNFR1-mediated apoptosis and triggers JNK activation through its interaction with TRAF-2. In our current study, we demonstrate that there is a relationship between the regulation of c-flips and the TNFR1 signaling pathway. Methods : Human cancer cell lines were obtained from ATCC and maintained in RPMI-1640 containing 10% FBS (Gibco BRL) containing 10% heat inactivated fetal bovine serum at 37 C in humidified chamber containing 5% CO2. c-flip L and c-flip S expression constructs were generated by RT-PCR based cloning into the pcdna 3.1 topo His/V5 vector. To study c-flip L and c-flip S expression level by Real-time PCR. We using FACS system For cell Death assay. Results : The inhibition of TNFR1-mediated apoptosis is dependent on the expression levels of c-flip S. The sensitivity of cells to TNF is associated with the expression levels of c-flips. The function of c-flip S is exerted via TNFR1-mediated JNK activation. The suppression of c-flip restored TNFα-induced JNK activation indicating that high expression of c-flip inhibits this activation. Conclusions : The short form of c-flip (c-flip S) is a more efficient inhibitor of TNF-receptor 1 (TNFR1) mediated apoptosis signaling than the long form of the protein (c-flip L). Therefore, the induction of c-flip L in response to TNFα is achieved in a more delayed manner than that of c-flip S. Our present study therefore suggests that alternative splicing variants of c-flip perform different roles in spite of fact that they operate in the same pathway. Key words : TNFR1, Apoptosis, JNK, FLIP, TRAF-2 This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

285 274 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 질병 및 질병유전자의 발현에 영향을 주는 요인 발굴 및 위험요인 평가도구 개발 국립보건연구원 유전체센터 유전체역학팀 김효미, 박선주, 박윤주, 민해숙, 곽혜경, 박용철, 김규호, 오경수, 안윤진, 김규찬, 박찬 본 연구는 한국인유전체역학조사의 추적조사 자료를 이용하여 질병의 발생율과 질병의 발생에 영향 을 미치는 위험요인을 파악하고 질병에 대한 고위험군을 분류할 수 있는 평가도구를 개발하기 위하여 수행되었다. 대상질병은 고혈압으로 설정하였다. 고혈압에 대한 발병율을 지역사회코호트 2기 추적사 업을 통해 수집된 자료를 이용하였고, 고혈압의 분류기준은 JNC 7차 보고서(2003)에서 제안한 고혈압 진단기준을 이용하였다. 수축기혈압(SBP) 및 이완기혈압(DBP)을 각각 누운 상태에서 2회씩 측정하여 그 값을 평균하여 이용하였다. 고혈압의 발병률은 1,000명당 78.14명으로 나타났다. 두 지역을 비교하 면 고혈압 발병률은 중소도시(안산)지역보다 농촌(안성)지역이 2배 이상 높았다. 연령별로 보았을 때 65세 이상에서 발병률이 가장 높았으며 연령이 증가 할수록 발병률도 증가하는 것으로 나타났다. 성별 과 연령을 보정한 전국 표준화 발병률 에서도 안성지역이 1,000명당 98.21명으로 안산지역 50.80보다 높게 나타났다. 안성과 안산지역의 발병율은 78.14명이며, 성별과 연령을 보정한 전국 표준화 발병률 은 1000명당 78.81명이다. 일변량 로지스틱 회귀분석에서 고혈압 발병에 영향을 미치는 요인으로는 결혼상태와 음주여부를 제외한 8개의 변수 즉 지역, 성별, 연령, 직업, 교육수준, 소득수준, 흡연여부, 운동여부가 각 각 통계적으로 유의하게 나타났고 다변량 로지스틱 회귀분석에서 다른 독립변수들의 영 향력을 통제한 결과 지역, 성별, 연령, 소득주준의 4개 요인이 고혈압의 발병에 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 신체계측치에서는 특히 허리/엉덩이둘레 비의 위험도는 35.8로 고혈압의 발병률에 가 장 큰 영향을 미치는 신체계측 요인으로 나타났다. 혈액성분중에는 공복혈당, 1시간인슐린, 총단백질, AST, 염소, 헤마토크릿은 고혈압 발병률에 대한 양의 영향요인으로 나타났으며, 알부민, 레닌, 총 빌리 루빈, 칼륨은 음의 영향요인으로 나타났다. 특히 혈액성분중 총단백질의 위험도는 1.978로 고혈압의 발 병률에 가장 큰 영향을 미치는 요인으로 나타났다. 지방, 탄수화물, 칼슘, 비타민 A, 티아민, 니아신, 섬 유소는 고혈압의 발병률에 대한 양의 영향요인으로, 에너지, 철분, 리보플라빈, 비타민 C, 카로틴은 음 의 영향요인으로 나타났다. 특히 티아민의 경우 위험도는 2.254로 가장 고혈압의 발병률에 가장 영향력 이 큰 영양소 섭취요인으로 나타났다. 질병의 위험요인에 대한 고위험군을 분류하기 위한 위험요인 평가 도구로 식품섭취에 대한 패턴을 분류하고 유형별 고혈압의 위험도(OR)을 구했다. 식품섭취패턴에 따라 4가지 패턴을 나눌 수 있었고 각 패턴의 특징을 많이 가지거나 적게 가지는 특징을 가지며 대상자는 3 군집으로 나누어졌다. 군집 1은 '밥과김치식' 군, 군집 2는 육류를 제외하고 다양하게 식사를 하는 '혼합 식(mixed diet)' 군, 군집 3은 '육류섭취(meat eater)' 군을 특징을 가지고 있었고 혼합식의 특징을 가진 군이 고혈압에 대한 유병위험도가 가장 높게 나타났다. 이러한 구체적 분류기준은 위험요인을 평가할 수 있는 예측도구 사용할 수 있으며, 개발된 평가기준은 질병의 발생을 확인할 수 있는 추적자료를 이용하 여 타당성을 확인할 수 있을 것이다. 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

286 Ⅰ. 연구보고 275 서 론 만성질병은 유전적 요인과 환경적 요인, 그리 고 숙주요인 등 세 가지 인자의 상호작용에 의 해 발병하는 것으로 알려져 있으며, 이를 예방 하고, 치료하기 위한 질병의 원인발굴을 위하여 는 질병의 발병 유무에 대한 정보수집이 선행 되어야 한다. 질병의 분포와 발생정도에 대한 자료는 국가적 데이터로서 우리나라를 대표할 수 있는 자료를 양산해 내는 것이 매우 중요하 다. 현재 국민건강영양조사와 같은 대규모 연구 가 이루어지고 있으나 국민건강영양조사의 특 성상 질병의 발생률의 추정은 불가능하며, 고혈 압 등에 대한 유병률과 발생률을 파악할 수 있 는 연구사업이 부족한 실정이다. 현재의 유병률을 파악하고 유병률에 영향을 준 요인에 대한 연구가 매우 중요하다. 유병률 에 의해 질병에 대한 부담정도를 파악할 수 있 으며, 이미 발병한 사람들과 발병하지 않은 사 람들에 대한 비교분석 연구를 통하여 유병률에 영향을 미치는 요인을 파악함으로써 발병에 영 향을 주는 요인을 예측해볼 수 있기 때문이다. 또한 추적조사를 통하여 질병의 발생유무를 확 인할 수 있게 되면 기초조사를 통하여 수집되 었던 여러 환경적 요인과 유전자의 변이특성을 함께 고려하여 단위 인구당 질병의 발생율 및 질병이 발생하는데 영향을 준 위험요인들을 발 굴해낼 수 있다. 단, 이러한 연구는 질병의 발 병이 단시간에 확인되는 질병이 아니므로 발병 에 미치는 영향과 그 위험정도를 확인하기까지 는 상당한 기간을 기다려야만 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있다. 국내에서는 환자-대조군 연구를 통한 질병의 위험요인 예측결과를 다수 보고하고 있는데,환 자-대조군연구를 통해 나타난 결과들은 위험요 인에 대한 기초적인 연구에는 유용하나, 인구집 단에 대한 대표성이 부족하며 위험요인에 대한 충분한 고려가 불가능할 수 있으므로 그 결과 에 대한 신뢰정도가 추적을 통한 코호트연구에 의한 역학연구에 비해 낮다. 코호트를 통한 추적조사를 통한 발병과 위험 요인에 대한 보고가 있으며(김동현, 1999; 김현 창, 1999; 오희숙, 2000) 이들은 10,000명이 넘 는 비교적 큰 규모에 해당하는 자료에 의한 분 석결과이나, 비슷한 혹은 규모가 더 큰 집단을 대상으로 한 연구를 통하여 이들 선행연구의 결과에 대한 위험요인의 확인이 필요하다. 유전체센터에서 구축중인 코호트는 국내외 약 20만명을 목표로 하고 있으며, 그 중 지역사 회코호트의 경우 10,000명에 대한 심층적인 기 초조사 및 1차 추적조사가 완료되어 현재 질병 의 발병에 대한 2차 추적이 이루어지고 있으므 로, 질병의 발병율이나 위험요인을 분석을 통해 예측하거나 확인된 위험요인이 발병에 미치는 영향을 확인할 수 있다. 고혈압은 우리나라 주요 질환 중 유병률이 가장 높을 뿐만 아니라, 특히 40세 이후 유병률 의 현저한 증가를 보이고 있는 것이 특징이다. 또한 고혈압과 관련된 국내외의 여러 연구 결 과들을 통해, 고혈압은 뇌혈관 질환, 관상동맥 질환, 울혈성 심질환, 신장 질환 등에 대한 독 립적인 위험 인자라는 사실이 밝혀지고 있으며, 특히 뇌혈관 질환에서는 가장 중요한 위험 인 자로 알려져 있다. 지금까지 고혈압의 위험인자 에 대한 국내외의 많은 연구들은 비만, 음주, 흡연, 사회경제적 수준, 교육수준, 가족력, 연령, 성, 혈청 콜레스테롤 수준 등을 중심으로 진행 되어 왔으며, 최근에는 이와 더불어 유전적 요 인, 염분 섭취량, 뇨단백 등이 고혈압의 위험 요인으로 정의되고 있다. 우리나라에서 고혈압성 질환 자체로 인산 사 망률은 지난 10년간 감소하는 양상을 보였지만 허혈성 심질환이나 뇌졸중으로 인한 사망률은 증가하고 있는 추세이다. 또한 고혈압이 뇌혈관 질환 및 허혈성 심질환의 위험인자임을 감안할 때, 고혈압이 우리나라의 국민 보건에 미치는 영향은 매우 크다고 하겠다. 국외에서는 고혈압의 유병률과 인식, 치료 및

287 276 국립보건연구원보 관리 등에 관한 국가 차원의 대규모 연구가 이 미 오래 전부터 실시되고 있으나, 국내에서는 이에 관한 몇몇 연구가 이루어졌을 뿐, 우리나 라 성인을 대표할 만한 집단을 대상으로 한 연 구는 드물고 무엇보다도 고혈압의 발생률과 그 위험인자에 관한 지속적인 장기 추적조사를 수 행한 연구가 거의 없는 실정이다. 심혈관질환에서 고혈압 및 동맥경화성 질환 은 생활습관이나 환경적요인의 영향과 함께 유 전적 요인에 의해 질병발생률에 차이를 보이고 있어, 유전적위험요인의 규명으로 고위험군을 예측하고 이들에 대한 교육 및 환경적요인의 조절은 질병발생과 질병의 경과에 영향을 미칠 수 있다. 국민보건의 측면에서도 유전체연구의 결과는 심혈관질환의 발생에서의 유전적 요인 을 밝혀냄으로써 질병의 발생을 예방, 조기진단 하고 유전체 기능연구로 새로운 치료법의 개발 로 질병치료 수준의 향상 등을 기대할 수 있다. 본 연구는 우리나라 정상 인구 집단에서 고 혈압의 발생률과 발병 양상을 조사 파악하고, 이들 질환의 발병에 관여하는 위험 요인의 규 명을 통하여 고위험군을 예측하고 이들에 대한 교육 및 중재 프로그램의 마련을 위한 기초자 료를 제공하고자 한다. 표 1. 1차 추적조사 추적검사 현황 지역 추적검사 추적검사 대상자 검사자 사망자 불참자 안성 안산 5,018 5,020 4,580 4, 추적율 (%) Total 10,038 8, , ) 고혈압의 진단 본 보고서에서 사용한 고혈압의 분류기준은 JNC 7차 보고서(2003)에서 제안한 고혈압 진단 기준을 이용하였다. JNC-6에서와 달리 고혈압 정도를 단계를 두 단계로 나누었고, 고혈압의 전단계인 pre-hypertension 상태를 따로 분류하 였다. 표 2. 고혈압 진단기준 (JNC 7차보고서, 2003) 분류 정상 (Normal) 전 고혈압 (Pre-Hypertension) 1단계 고혈압 (Stage 1 Hypertension) 2단계 고혈압 (Stage 2 Hypertension) 수축기혈압 (SBP) 확장기혈압 (DBP) < 120mmHg and < 80mmHg 120~139 or 80~89 140~159 or 90~ or 100 방 법 1) 대상자 본 연구의 대상자는 지역사회 코호트 1기 기 초조사 추적대상자 10,038명중 추적 조사에 참 여한 8,690명이며 추적율은 86.57%이다. 안성의 경우 기초조사 추적검사 대상자 5018명 중 총 4,648명이 추적되었고 이들 중 68명이 기초검사 이후 사망자이며 추적검사 불참자는 370명으로 추적율은 92.63%이다. 안산의 경우 기초조사 추 적검사 대상자 5,020명 중 총 4,042명이 추적되 었고 이들 중 19명이 사망자이며 추적검사 불 참자는 978명으로 추적율은 80.49%이다(표 1). 본 연구에서 고혈압의 분류는 크게 기진단군, 진단군, 정상으로 분류하였다. 고혈압을 분류하 기 위하여 수축기혈압(SBP) 및 이완기혈압(DBP) 을 각각 누운 상태에서 2회씩 측정하여 그 값을 평균하여 이용하였다. 기존에 혈압강하약물(anti-hypertensive drug)을 복용하고 있는 사람과 기초조사 기초검사에서 고혈압으로 판정된 사람은 '기진단군'으로 분류 하였으며, 혈압측정치가 없거나, 혈압약복용여 부에만 답하고 그 자세한 기록이 빠진 경우는 결측치 로 처리하였다. 고혈압 기진단군과 혈압 으로 고혈압을 진단받은 사람들을 모두 고혈압 환자 로 분류하였고 약을 복용하지 않고 혈압이 정상인 사람들을 정상 으로 분류하여 유병률을

288 Ⅰ. 연구보고 277 산출하였으며, 혈압의 정도에 따라 정상군 (normal), 전 고혈압군(pre-hypertension), 1단계 고 혈압군(stage 1hypertension), 2단계 고혈압군(stage 2 hypertension)으로 분류하였다. 3) 고혈압의 발병률의 위험요인 분석 기초조사에서 질환이 없다고 분류된 사람들 중 1차 추적조사에서 고혈압의 진단기준에 의 하여 질환자로 분류된 사람들에 대한 발병률 파악한 후 고혈압에 영향을 미치는 위험요인을 분석하기 위하여 기초조사로 측정된 일반적특 성, 신체계측, 혈액성분, 영양소 등에 대해서 simple and multiple logistic regression을 이용하여 OR(odds ratio)와 β값 제시하였다. 분석대상이 된 항목은 다음과 같다. 1 일반사항 : 지역, 성별, 연령, 결혼상태, 직 업, 교육수준, 소득수준 2 생활습관 : 음주여부, 흡연여부, 간접흡연 3 신체계측 : 키, 체중, 허리둘레, 엉덩이둘레, 허리둘레/엉덩이둘레비, 체질량지수, 견갑 골 피부두겹두께, 장골 피부두겹두께, 수 축기혈압, 이완기혈압 4 혈액성분 : 공복혈당, 1시간 후 혈당, 2시간 후 혈당, 공복 인슐린, 1시간 후 인슐린, 2 시간 후 인슐린, 당화혈색소, 총 콜레스테 롤, HDL 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, 중 성지방, BUN, 크레아티닌, 총 빌리루빈, AST, ALT, 백혈구, 적혈구, 헤모글로빈, 헤마토크릿, 혈소판, 혈중 칼슘, 혈중 나트 륨, 혈중 칼륨, 혈중 클로라이드, 총 단백 질, 총 알부민, CRP, 레닌, γ-gtp 5 영양소 : 에너지, 단백질, 지방, 탄수화물, 섬유소, 칼슘, 인, 인/칼슘, 철분, 칼륨, 나 트륨, 비타민 A, 레티놀, 카로틴, 티아민, 리보플라빈, 나이아신, 비타민 C, 아연, 비 타민 B6, 엽산, 비타민 E, 콜레스테롤 4) 고혈압의 고위험군 분류를 위한 평가도구 개발 고혈압에 대한 위험요인을 분류하는 대상 요 인으로 식품섭취를 선정하고 고위험군을 분류 하기 위하여 식품섭취패턴을 파악하였다. 위험요인으로 분류한 식품의 섭취패턴에 따 라 대상자를 클러스터링(Clustering) 하여 대상 자 군집이 질병의 유병율에 대해 가지는 위험 도(OR)로 위험군의 분류를 설정하였다. 식품섭취를 설명하는 요인 찾기 위하여 요인 분석(factor analysis)를 실시하였다. 103개의 식 품을 비슷한 특성을 가지는 식품 군별로 묶어 17개의 식품군으로 분류하였다. 섭취무게 를 기준으로 섭취무게를 기준으로 주성분분 석(principle component analysis)를 통하여 고유 치(Eigenvalue) 1 이상인 것과 Scree test 결과 및 설명가능성을 고려하여 4 요인을 추출하였 다. 고유값 (Eigenvalue)는 각각의 요인으로 설 명할 수 있는 변수들의 분산의 총합으로 각 요 인별로 모든 변수의 요인적재값을 제곱하여 더 한 값이다 (Hu et al., 2000). Varimax rotation 을 이용한 인자회전 후 요인적재값의 절대값 0.2 이상인 식품군 종류를 요인특성 파악에 이 용하였다. 요인점수 (factor score)는 몇 개로 축소된 추 상적인 각 요인에 대해 점수로 환산된 값으로 이 요인 점수를 이용하여 회귀분석, 상관분석, 군집분석 등 다른 분석을 실시할 수 있다 (Sung, 2002). 본 연구에서는 대상자의 분류를 위하여 군집분석(Cluster Analysis)을 이용하였 다. K-means clustering 이용하여 대상자들 분류 하여 3개의 군집으로 분류하여 그 특징을 비교 하고 질병에 대한 위험도를 구하기 위하여 로 지스틱회귀분석(logistic regression analysis)을 이 용하여 OR 값을 산출하였다.

289 278 국립보건연구원보 결 과 1) 고혈압의 발병율 본 연구의 조사대상자 8,603명중 기초조사에 서 기진단자로 밝혀진 자들을 제외한 후 새롭 게 고혈압이 발생한자들에 대한 고혈압 발병률 에 대한 분석 결과 고혈압의 발병률은 1,000명 당 115.2명으로 나타났다. 두 지역을 비교하면 고혈압 발병률은 중소도시(안산)지역보다 농촌 (안성)지역이 2배가량 높음을 알 수 있다. 연령 별로 보았을 때 65세 이상에서 발병률이 가장 높았으며 연령이 증가 할수록 발병률도 증가하 는 것으로 나타났다. 본 조사에서의 발병률(crude incidence per 1,000)을 전국 인구표(2000년, 통계청 인구주택 총조사)를 기준으로 성별과 연령을 보정하여 전국 표준화 발병률(standardized incidence rate per 1,000)을 구해보면 다음과 같다. 두 지역의 연령구조가 다른 점을 고려하여 각 연령별로 고혈압의 발병률을 지역별로 비교하여 보았을 때 모든 나이 대에서 안성지역이 안산지 역보다 높게 나타났다. 성별과 연령을 보정한 전 국 표준화 발병률 에서도 안성지역이 1,000명당 130.4명으로 안산지역 100.5명 보다 높게 나타났 다. 안성 안산지역의 성별과 연령을 보정한 전 국 표준화 발병률은 116.3명이다(표 3). 표 3. 연령별 성별 지역별 고혈압 발병률 성별 지역 남 여 안성 안산 [1000명당 발병률] 전체 40-44세 세 세 세 세 세 세 이상 조발병률 전국 표준화 발병률 ) ) ) ) ) 1) national standardized incidence adjusted by age 2) national standardized incidence adjusted by age and sex

290 Ⅰ. 연구보고 279 1,000명당 발병률 남자 여자 세 이 상 그림 1. 연령별, 성별 발병률의 변화 2) 고혈압 발병률과 위험요인 특성 일반적 특성요인으로는 지역, 성별, 연령, 결 혼상태, 직업, 교육수준, 소득수준, 음주여부, 흡 연여부, 운동여부의 10개 변수를 고려하였으며 고혈압 발병에 대한 이들의 영향력을 파악하기 위해서 고혈압 발병에 대한 각 변수들의 일변 량 로지스틱 회귀분석을 각 각 실시한 다음 10 개 변수들을 동시에 고려한 다변량 로지스틱 회귀분석을 실시하였다. 다변량 로지스틱 회귀 분석에서는 일차적으로 10개 변수를 모두 독립 변수로 포함하는 모형을 고려한 후 변수선택 단계를 거쳐서 최종적으로 고혈압의 발병에 유 의한 영향을 미치는 독립변수들만을 포함하는 모형을 추정하였다. 일변량 로지스틱 회귀분석에서 고혈압 발병 에 영향을 미치는 요인으로는 결혼상태, 성별, 흡연여부, 음주여부를 제외한 6개의 변수 즉 지 역, 연령, 결혼상태, 직업, 교육수준, 소득수준, 운동여부가 각 각 통계적으로 유의하게 나타났 다. 고혈압 발병의 위험도를 각 요인에서 비교 해 보면 지역은 안성은 안성의 0.53배, 성별에 서는 여자가 남자의 0.95배로 나타났으며, 연령 의 경우 50대와 60대는 40대에 비해 각 각 2.36배, 3.41배로 연령이 증가할수록 위험도가 증가하는 것으로 나타났고, 결혼 상태는 기혼자 에 비해 미혼, 사별, 이혼, 별거 기타의 경우 1.39배 위험도가 증가하는 것으로 나타났다. 직업군별 비교에서 주부에 비해 농업과 무직 의 위험도는 각 각 1.41배, 1.58배로 더 높게 나 타났다. 교육수준별로는 중 고등학교 및 전문대 이상의 위험도는 초등학교 이하에 비해 각 각 0.50배, 0.41배로 나타나 교육수준이 높을수록 발병의 위험도가 줄어드는 것으로 나타났다. 소 득수준에서는 소득이 증가할수록 100만원 미만 의 소득수준에 비해 각 각 0.49배, 0.45배, 0.39 배로 소득이 증가할수록 위험도가 감소하는 것 으로 나타났다. 운동여부에 따라서는 운동을 하지 않는 그룹이 하는 그룹보다 위험도가 1.34배 높게 나타났다. 다변량 로지스틱 회귀분석에서 다른 독립변 수들의 영향력을 통제한 결과 지역, 연령, 소득 주준의 3개 요인이 고혈압의 발병에 유의한 영 향을 미치는 것으로 나타났다. 지역에서는 안산 의 위험도가 안성의 0.58배로 더 낮았으며, 성 별에서는 여자가 남자에 비해 0.81배로 낮게 나 타났다. 연령에서는 50대와 60대의 위험도는 40 대에 비해 각 각 2.00배, 2.62배로 연령이 증가 할수록 위험도가 높게 나타났다. 소득수준에 따라서는 월평균 소득수준이 100 만원 미만인 그룹에 비해 만원인 군은 0.71배 낮았으며, 월평균 소득수준이 300만원 이상의 군은 0.72배로 낮게 나타났다.

291 280 국립보건연구원보 표 4. 고혈압 발병률과 일반적 특성 지역 안성 안산 성별 남자 여자 연령 40-49세 50-59세 60-69세 결혼상태 기혼 미혼/사별/이혼/별거/기타 직업 주부 사무직 농업 자영업 판매직 (공장)생산직 전문직 무직 기타 교육수준 초등학교 이하 중 고등학교 전문대 이상 소득수준 100만원 미만 100~200만원 미만 200~300만원 미만 300만원 이상 음주여부 금주 과거 음주 현재 음주 흡연여부 금연 과거흡연 가끔 흡연 습관적 흡연 운동여부 예 아니오 발병률 명(%) 478(14.67) 278(8.42) 376(11.78) 380(11.29) 230(6.68) 241(14.47) 285(19.63) 664(11.16) 85(14.83) 202(11.18) 22(7.56) 278(15.04) 78(7.77) 12(7.59) 30(8.09) 16(9.14) 26(16.56) 86(12.11) 336(17.20) 342(9.40) 72(7.77) 360(17.21) 178(9.24) 106(8.60) 89(7.51) 351(11.91) 352(11.17) 47(11.33) 422(11.22) 122(12.29) 29(14.43) 175(11.45) 582(12.32) 174( 9.47) OR 1) OR(95%신뢰구간) ( )*** Adjusted OR 2) OR(95%신뢰구간) ( )*** ( )** ** ( ) *** 3.41( ) *** ( ) ( ) 1.41( ) *** 0.67( ) 0.65( ) 0.70( ) 0.80( ) 1.58( ) 1.09( ) * ( ) *** 0.41( ) *** ( ) *** 0.45( ) *** 0.39( ) *** ( ) 0.95( ) ( ) 1.33( ) * 1.02( ) ** ( )** ( ) ** 2.62( ) *** ( ) *** 0.79( ) 0.72( ) * 1) Simple logistic regression was processed for OR. 2) Multiple logistic regression was processed for adjusted OR and stepwise method is used for variable selection. *; p<0.05, **; p<0.01, ***; p<.0001

292 Ⅰ. 연구보고 281 연령 및 다른 신체계측치의 영향을 통제한 상태에서 고혈압 발병률에 대한 각 신체계측치 의 영향을 분석하기 위하여 일차적으로 9개의 신체계측치와 연령을 모두 포함하는 다변량 로 지스틱 회귀모형을 고려하였다. 그리고 단계적 선택법(stepwise selection)을 이용한 변수선택 결과 표 5와 같이 연령 및 3개의 신체계측치가 고혈 압 발병률에 통계적으로 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 특히 연령 중 60대의 위험도 는 3.077으로 고혈압의 발병률에 가장 큰 영향 을 미치는 신체계측 요인으로 나타났다. 표 5. 고혈압 발병률과 신체계측 β S.E p Exp(β) Exp(β)의 95% 신뢰구간 하한 상한 연령 중 50대 연령 중 60대 허리둘레 Suprailiac 맥박 <.0001 <.0001 <.0001 <.0034 < Multiple logistic regression was processed and stepwise selection was used for variable selection. 연령 및 다른 혈액성분의 영향을 통제한 상 태에서 고혈압 발병률에 대한 각 혈액성분의 영향을 분석하기 위하여 일차적으로 30개의 혈 액성분과 연령을 모두 포함하는 다변량 로지스 틱 회귀모형을 고려하였다. 그리고 단계적 선택 법(stepwise selection)을 이용한 변수선택 결과 표 6과 같이 연령 및 11개의 혈액성분이 고혈 압 발병률에 통계적으로 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 1시간 혈당, 공복 인슐린, 1시간 인슐린, 중성 지방, 총 단백질, BUN, 염소, CRP정량은 고혈 압 발병률에 대한 양의 영향요인으로 나타났으 며, 알부민, 레닌은 음의 영향요인으로 나타났 다. 특히 혈액성분 중 총 단백질의 위험도는 1.561로 고혈압의 발병률에 가장 큰 영향을 미 치는 요인으로 나타났다. 표 6. 고혈압 발병률과 혈액성분 연령 중 50대 연령 중 60대 1시간 혈당 공복인슐린 1시간 인슐린 중성지방 총 단백질 알부민 BUN 레닌 염소 CRP 정량 적혈구 β S.E p Exp(β) <.0001 < < < < < Exp(β)의 95% 신뢰구간 하한 상한 Multiple logistic regression was processed and stepwise selection was used for variable selection

293 282 국립보건연구원보 연령 및 다른 영양소 섭취량의 영향을 통제 한 상태에서 고혈압 발병률에 대한 각 영양소 섭취량의 영향을 분석하기 위하여 일차적으로 24개의 영양소 섭취량과 연령을 모두 포함하는 다변량 로지스틱 회귀모형을 고려하였다. 그리 고 후진제거법(backward elimination)을 이용한 변수선택 결과 표7와 같이 연령 및 3 영양소 섭취량이 고혈압 발병률에 유의한 영향을 미치 는 것으로 나타났다. 탄수화물, 비타민 B1은 고혈압의 발병률에 대 한 양의 영향요인으로 나타난 반면, 에너지는 음의 영향요인으로 나타났다. 표 7. 고혈압 유병률과 영양소 섭취 β S.E p Exp(β) Exp(β)의 95% 신뢰구간 하한 상한 연령 중 50대 연령 중 60대 에너지 (kcal) 탄수화물(g) 비타민B1(mg) <.0001 < Multiple logistic regression was processed and backward selection was used for variable selection. 3) 식품섭취패턴을 통한 고혈압에 대한 고 위험군 분류 대상자의 식품섭취습관을 유형(pattern)화 하 고 그 유형에 따른 질병의 위험도를 파악하는 것은 질병에 대한 위험요인의 유형을 파악하는 효과를 가져온다. 유형화된 식품섭취습관이 위 험도를 파악하는 도구가 되는 것이다. 질병에 대한 위험요인 평가도구 개발의 한 시도로 식품섭취 습관을 유형화 하고 그 유형에 따른 대상자의 분류결과와 대상자의 특징을 제시한다. 우선 식품유형화를 위한 factor analysis를 위 하여 식품섭취빈도조사지의 식품목록 103가지 를 식품군별로 묶어주었다(표 8). 표 8 식품섭취빈도조사지의 식품군 분류 식품군 명 식품가지수 식품군 명 식품가지수 Cereal-Rice 3 Mushrooms 2 Cereal-Oriental 8 Fruits 12 Cereal-Western 6 Meats 9 Snack 3 Eggs 1 Potatoes 3 Fishes and Seafood 15 Seeds and Nuts 2 Seaweeds 2 Legumes 3 Milk and dairy products 4 Kimchi 4 Beverages 7 Vegetables 19 Total 103

294 Ⅰ. 연구보고 개의 식품군에 대해 섭취무게를 기준으로 요인분석을 실시하였다. 주성분분석(고유치 1)을 이용하여 17개의 식품군으로부터 4개 의 요인이 추출되었으며, varimax rotation을 이 용한 인자회전 후 요인적재값 0.2 이상을 기 준으로 했을때, 4개의 요인은 다음과 같은 특 성을 갖는 것으로 파악되었다(표 9). 표 9. 식품군별 요인점수 Factor1 Factor2 Factor3 Factor4 Cereal-Rice Cereal-Oriental Cereal-Western Snack Potatoes Seeds and Nuts Legumes Kimchi Vegetables Mushrooms Fruits Meats Eggs Fishes and Seafood Seaweeds Milk and dairy products Beverages 요인 1은 야채, 버섯, 고기, 생선류, 음료 등 여러 식품군에 골고루 높은 적재 값을 보이나 밥보다는 동양식 곡류제품을 섭취하는 특성을 가지고 있으며, 요인 2는 육류를 제외한 채소, 과일 생선 등의 식품군에 높은 적재값을 보이 는 특성을 가지고 있었다. 요인 3은 밥을 제외 한 곡류식품 및 종실류에 높은 적재값을 보였 으며, 요인 4는 밥과 김치에 높은 적재값을 보 이나 기타 식품의 적재값이 낮고 버섯과 유제 품에서 음의 적재값을 보이는 특성을 보였다. K-means clustering을 이용하여 4 개의 요인에 따라 대상자들을 세 군집으로 분류할 수 있었 는데, 군집 1(n=5,372)은 요인 4의 요인점수가 제일 높아 '밥과김치식' 군으로 명명하였고, 군 집 2(n=838)는 요인 3의 요인점수가 제일 높으 며 요인 2의 요인점수도 비교적 높아 육류를 제외하고 다양하게 식사를 하는 혼합식(mixed diet) 군으로 명명하였으며, 군집 3(n=663)은 요 인 4의 점수가 가장 낮고 요인 1, 2의 요인점수 가 높아 역시 다양하게 섭취하는 특징은 군집 2와 비슷하나 요인 1이 육류의 요인값이 높은 특징을 가지고 있어 '육류섭취(meat eater)' 군 으로 정의하였다(표 10). 표 10. 군집별 요인평균 Cluster 1 (n=5,372) Cluster 2 (n=838) Cluster 3 (n=663) Factor ± ± ± Factor ± ± ± Factor ± ± ± Factor ± ± ±

295 284 국립보건연구원보 표 11. 군집별 일반특성 Cluster 1 (n=5,372) Cluster 2 (n=838) Cluster 3 (n=662) p 성별 남 녀 (83.8) (72.5) (10.9) (13.5) (5.28) (14.0) <.0001 안성 안산 1,984 3,388 (82.09) (76.03) (10.22) (13.26) (7.70) (10.70) <.0001 Age Mean ± SD (years) a ± b ± ab ± s 50s 60s 2,667 1,325 1,380 (77.42%) (76.95%) (80.89%) (12.89) (12.20) (10.79) (9.70) (10.86) (8.32) 직업 주부 사무직 농업 자영업 판매직 (공업)생산직 전문직 무직 기타 (25.2) (5.73) (24.7) (17.6) (2.48) (5.75) (2.70) (3.98) (11.8) (30.9) (5.22) (19.0) (15.9) (3.39) (6.21) (2.68) (3.24) (13.4) (42.4) (3.92) (13.1) (17.0) (2.99) (4.10) (2.43) (2.80) (11.4) <.0001 가족수 1명 2명 3명 4명 5명 6명 (3.00) (16.1) (16.9) (38.5) (16.1) (9.38) (3.35) (14.8) (15.0) (45.0) (14.7) (7.18) (3.63) (15.9) (18.1) (38.5) (15.7) (8.16) 교육수준 초등학교 이하 중학교 고등학교 전문대학이상 (31.7) (21.2) (31.9) (15.2) (21.1) (18.6) (37.3) (23.1) (24.7) (24.5) (36.6) (14.2) <.0001 소득수준 100만원 미만 만원 이상 (32.3) (27.9) (19.2) (20.6) (23.4) (29.0) (22.5) (25.2) (24.9) (30.7) (21.4) (23.0) <.0001 군집별 특징을 살펴보면 군집 1은 남성이 많 았으며, 군집 3은 여성이 많은 특징을 보였다. 지역별로는 군집 1은 안성지역이 군집 2,3은 안 산지역주민이 많이 분포하고 있었다. 연령은 군 집 1의 평균연령이 가장 높았으며, 60대가 많았 다. 군집 2는 가족수가 4명인 경우가 두드러졌 으며, 군집 1은 초등학교 이하의 교육수준을 가 진 대상자가 많았던 반면 고학력자일수록 군집 2,3에 분포하는 경향이 두드러졌다. 소득수준은 100만원 미만인 사람들은 군집 1에 많이 분포 하고 있었고 군집 2,3에는 만원의 소득 수준을 가진 사람들이 많았다. 영양소의 섭취량은 에너지, 단백질, 지방, 탄 수화물, 레티놀의 경우 군집 2에서 가장 높게 나타났고 군집 3, 군집 1의 순이었으며, 칼슘, 비타민 A, 비타민 C, 카로틴의 경우 군집 3이 가장 높게 나타났다.

296 Ⅰ. 연구보고 285 표 12. 군집별 영양소 섭취량 비교 Cluster 1 (n=5,372) Cluster 2 (n=838) Cluster 3 (n=662) Energy(kcal) 1784 ± ± ± 674 Protein(g) 60.4 ± ± ± 32.7 Fat(g) 27.6 ± ± ± 19.3 Carbohydrate(g) ± ± ± Ca(mg) ± ± ± Vit.A (R.E.) ± ± ± Vit.C(mg) 107 ± ± ± Folate(ug) ± ± ± Retinol(ug) 52.7 ± ± ± 84 Carotene(ug) 2527 ± ± ± 3752 표 13. 고혈압 환자의 클러스터별 분포와 유병율에 대한 위험도 Normotensives Hypertensives OR(CI) Adjusted OR(CI) Cluster (87.2) 612(12.8) 1 1 Cluster 2 686(90.0) 76 (10.0) 1.32( ) 1.25( ) Cluster 3 525(91.6) 48 (8.38) 1.60( ) 1.48( ) 각 군집의 식품섭취유형에 따른 대상자의 고 혈압 유병률에 대한 위험도는 밥과김치식 군에 대하여 혼합식 군과 육류섭취군 의 OR이 성별과 연령을 보정한 후 각각 1.25, 1.48로 나타났다. 고 찰 본 연구에서는 고혈압의 발병정도, 발병에 관 련된 위험요인 및 위험요인을 통한 고위험군 분류도구의 개발을 목적으로 수행되었다. 발병율을 알기 위해서는 고혈압이 없었던 사 람들을 대상으로 일정기간 후 고혈압의 발생유 무를 확인하여 그 비율을 파악하여야 하나, 현 재까지 고혈압의 발생을 추적한 연구는 많지 않다. 1년 혹은 2년간의 추적조사를 통한 고혈압의 발생비율은 남녀별로 모두 본 연구보다 낮게 보고되었으나(오희숙 등, 2000, 천병렬 등, 2002), 기초조사시 평균 30대 중반인 성인을 대 상으로 12년간의 추적을 통한 발생율 보고는 각각 41.5%(남), 25.8%(여) 이었다(김현창 등, 1999). 그러나 이들 연구는 추적조사의 기간이 매우 짧거나, 대상집단의 규모가 매우 작아 일 반적인 우리나라의 발병율로 확대해석하기 어 려운 점이 있다. 본 연구도 1차 추적조사기간이 2년으로 매우 짧은 편이나 1000명당 발생비율이 78.14이며 추적조사기간이 길어질수록 연인년의 발병율이 확실하게 드러날 것으로 기대된다. 현재까지 알려진 고혈압과 관련된 주요 위험 요인으로는 고혈압의 가족력, 연령의 증가, 염 분 섭취, 과도한 알콜섭취, 비만, 운동 등이 있 다. 고혈압은 가족력과 연관성이 많으므로 가족 력을 조사함으로서 고혈압을 일찍 발견할 도록 하는데 중요한 단계가 될 것이다. 또한 고혈압 의 예방을 위해서는 multiple risk factor를 가지 고 있는 비고혈압 대상자와 multiple risk factor 를 가지고 있는 고혈압 대상자들을 정확하게 판단 할 수 있도록 하는 것도 중요할 것이다.

297 286 국립보건연구원보 현재까지 다른 여러나라에서 발표된 논문들 로 근거하여 볼 때 BMI와 나이역시 주요 위험 요인으로 나타나고 있다. Annual Health Examination을 기반으로 한 일본 남성 사무직 근로자들에 대한 연구에서는위험요인에 많이 노출될수록 위험도역시 증가하는 것으로 나타 났다 (Nakanishi et al.,, 2003). 우리나라의 보고 에서도 BMI가 매우 중요한 고혈압의 위험요인 으로 보고되고 있으나 (김현창, 1999), 본 연구 에서는 단계적 선택법을 통한 위험요인 발굴에 서 BMI는 나타나지 않아 보다 심층적이고 다각 적인 접근방법이 필요할 것으로 보인다. 본 연 구에서는 위험요인의 수준별 위험도가 아닌 설 명가능성에 중점을 두고 분석을 하였으므로, 각 각의 위험요인에 중점을 두고 보다 심층적인 분석이 요구된다. 질병의 위험요인 중 영양요인에 대한 고위험 군 평가도구로 식품섭취패턴에 따른 위험도를 살펴보았는데, 식품섭취패턴분석은 근래에 질병 에 대한 식이요인 연구에 많이 응용되고 있다. 기존의 식이자료연구의 주된 관심은 단일 영양 소 또는 몇 개의 식품과 질병의 연관성을 규명 하는 것이었으나 몇가지 제한점을 가지게 된다. 우선 사람들은 독립된 영양소가 아닌 식품 혹 은 식품이 혼합된 음식을 섭취하게 되며, 영양 소 사이의 상관성이 매우 높아 한 영양소만으 로 그 효과를 설명하기 어렵다(Hu, 2002). 본 연구에서는 고혈압 유병에 대한 위험도가 가장 높은 위험군은 식품을 다양하게 섭취하는 특징을 가지고 있으며, 비교적 육류의 섭취가 다른 군에 비해 높고, 교육수준과 수입이 중간 층에 분포하는 것으로 특징지을 수 있었다. 그러나 본 결과는 횡적 조사에 의한 유병률 위험도이므로 위험도가 높은 식품섭취유형이 질병의 발생과 관계된다고 결론내릴 수는 없으 나 자신의 질병상태를 인지하지 못하여 식습관 을 변화시키지 않았다고 가정한다면 절대적 영 양소 섭취량과 별개로 식품섭취유형이 질병의 발생에 영향을 줄 수 있음을 시사하고 있다. 결 론 본 과제는 유전체센터에서 수행 중인 지역사 회유전체역학연구의 자료를 바탕으로 수행되었 다. 본 연구는 추적조사기간이 2년으로 매우 짧 은 편이으로, 1차 추적에서 고혈압으로 발병된 사람들이 2년간의 영향으로 발병되었다고 단언 하기는 어려우나, 본 연구와 같이 대규모로 고 혈압에 대해 추적연구를 수행한 경우가 우리나 라에서 보고된 바 없으므로, 매우 큰 의미를 가 진다고 하겠다. 또한 현재 2차 추적이 진행되고 있으므로, 본 연구 자료는 향후 고혈압의 발생 율 및 발생위험을 파악하는 기반이 되는 매우 중요한 자료라 할 수 있다. 본 연구에서 발굴된 위험요인들은 추후에 시 행예정으로 있는 지역사회 코호트 내 중재-예 방프로그램에 활용할 수 있으며, 본 연구 및 향 후 진행될 추적조사 연구에서 발굴된 위험요인 은 유전체분석연구를 위한 대상자 분류에 응용 될 수 있으며, 위험요인의 수준별로 분류된 위 험군의 유전체분석을 통하여 질병예방에 적용 할 수 있는 실질적 결과를 도출할 수 있을 것 으로 기대한다. 위험요인과 노출정도별 위험도를 이용하여 분류된 고위험집단은 질병의 위험에 대한 연구 를 집중할 수 있게 되어 연구결과를 확인할 수 있는 기간이 단축될 수 있으며, 향후 유전체형 의 특성이 결합된 위험요인분석결과는 실제 인 구집단에서 소규모 집단을 대상으로 타당성을 검증하여야만 유용성을 판단할 수 있으므로, 위 험요인 별 타당성 연구가 필요하다. 참고문헌 1.김기순, 류소연, 박종, 박종구, 김춘배, 천병 렬, 이태용, 이강숙, 이덕희, 고광욱, 지선하, 서일 심혈관질환 예방 및 관리 연구회 관상 동맥질환 위험요인 구명을 위한 코호트내

298 Ⅰ. 연구보고 287 환자-대조군 연구 예방의학회지 34(2); , 김동현, 안윤옥, 박성우, 최문기, 김대성, 이 무송, 신명희, 배종면. 우리 나라 성인 남성 당뇨병의 발생양상과 위험요인에 관한 전향 적 코호트 연구. 예방의학회지 32(4); , 김현창, 서일, 지선하, 이강희, 김창수, 남정 모. 강화지역 성인남녀의 12년간 고혈압 발 생률과 위험요인 [강화연구] 예방의학회지 32(4); , 박종구, 김기순, 김춘배, 이태용, 이덕희, 고 광욱, 이강숙, 지선하, 서일, 류소연, 박기호. 뇌혈관질환 발생 위험요인 구명을 위한 코 호트내 환자-대조군 연구. 예방의학회지 34(2); , 신찬수, 김원배, 박경수, 김성연, 조보연, 이 홍규. 경기도 연천지역에서 당뇨병의 발생률 당뇨병 20: , 오희숙, 천병렬, 감신, 예민해, 강윤식, 김건 엽, 이영숙, 박기수, 손재희, 이상원, 안문영. 농촌지역 주민들의 고혈압 발생 위험요인 -1년간 전향성 추적 조사-. 예방의학회지 33(2); , 천병렬, 감신, 오희숙, 이상원, 우극현, 안문 영. 성인코호트에서 고혈압 발생률. 예방의 학회지 35(2); , Gordis L. Epidemiology W.B. Saunders Company. Pennsylvania, Hu FB, Rimm EB, Stempfer MJ, Ascherio A, Spiegelman D, Willett WC. Prospective study of major dietary patterns and risk of coronary heart disease in men. Am J Clin Nutr 72: , Hu FB. Dietary pattern analysis: a new direction in nutritional epidemilogy. Current opinion in Lipidology 13:3~9, Noriyuki NAKANISHI1, Wenjuan LI1, Hideki FUKUDA1,Toshio TAKATORIGE1, Kenji SUZUKI2 and Kozo TATARA1. Multiple Risk Factor Clustering and Risk of Hypertension in Japanese Male Office Workers. Industrial Health 2003, 41, Sung WH. Applied multivariate analysis. Tamjin, Seoul, WHO. Report of a WHO consultation on obesity-obesity: Preventing and managing the global epidemic. Geneve. 1997

299 288 국립보건연구원보 Methods for searching and evaluating risk factors to express genes related to diseases H.M. Kim, S.J. Park, Y.J. Park, H.S. Min, H.K. Kwak, Y.C. Park, K.H. Kim, K.S. Oh, Y.J. Ahn, K.C. Kimm and C. Park Center for genome Science, NIH, Seoul Korea This study is for identifying the risk factor to affect the occurrence and incidence of diseases and developing the evaluation method to classify the risk group for diseases by using the data from Korean Genomic Epidemiology Study (KoGES). The disease target is hypertension and its incidence is made by 2year-follow up data from the cohort. Hypertension is classified by JNC 7th report (2003). Systolic blood pressure and diastolic blood pressure were measured twice and the mean value was used. The incidence of that is 78.14/1,000 persons and the farm village (Ansung : 98.21) was two fold than the middle city (Ansan : 50.80). The incidence rate was the highest in the group of the aged over 65 age and increased by the age. By univariate logistic regression analysis, eight factors (area, age, sex, occupation, education, income, smoking, exercise) were to affect the occurrence of hypertension. And by multi-variate logistic regression analysis, four factors as area, sex, age, and income were significant. The relative risk of waist-hip ratio is and is the highest factor to the incidence rate of hypertension. Among the blood indices, total protein affected to hypertension incidence with Fat, carbohydrate, calcium, vitamin A, thiamin, niacin and fiber showed positive relation to hypertension incidence, and energy, iron, riboflavin, vitamin C and carotene showed negative relation. To screening the high risk group for hypertension, we studied dietary pattern of cohort population. Their eating characteristics were classified to four patterns. And on the basis of four patterns, the subjects were divided into 3 clusters. Cluster 1 was characterized as 'rice and kimchi diet', cluster 2 was as 'mixed diet, and cluster 3 was as 'meat eater'. The odds ratio for hypertension prevalence was highest in cluster 2. This kind of risk assessment can be applied to predict the incidence in the population and using follow-up data would be helpful to confirm the validity of the assessing methods. Keywords: KoGES, hypertension, incidence rate, relative risk, odds ratio This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

300 Ⅰ. 연구보고 289 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 지역사회 코호트 여성의 요골과 경골에서의 골다공증 유병률과 관련 요인 분석 -Quantitative Ultrasound 방법을 이용하여- 국립보건연구원 유전체센터 유전체역학팀, 아주대학교 의과대학 예방의학교실 1 박선주, 안윤진, 민해숙, 오경수, 박찬, 조남한 1, 김규찬 목 적:본 연구는 지역사회 유전체 역학연구에 참여한 여자 대상자들의 요골과 경골의 골밀도를 QUS를 이용하여 골밀도를 측정하고 골다공증의 유병률에 영향을 미치는 요인들을 분석하였다. 방 법:측정된 골밀도는 WHO 기준에 따라 정상(T값 -1.0), 골감소증군(-1.0 < T값 < -2.5), 골다공증군(T값 -2.5)으로 나누어 차이를 비교한 후 유병율을 산출하고, 세 군간의 특징을 비교하 였다. 요골과 경골의 골다공증에 영향을 미치는 요인을 파악하기 위하여 단변량 로지스틱 회귀분석을 실시하였다. 결 과:1) 골감소증과 골다공증의 표준화 유병률은 각각 요골 18.3%, 6.3%, 경골 29.5%, 18.8%로 요골보다 경골의 유병률이 높게 나타났다. 2) 연령, 폐경후 기간, BMI는 골다공증군이 가장 높았으 며, 신장, SoS값, T값,Z값은 정상군이 유의적으로 높았다. 체중은 세 군 간에 차이가 없었다. 3) 골 다공증에 미치는 영향을 파악하기 위하여 로지스틱 회귀분석을 실시한 결과, 일반사항에서는 나이가 1세 증가할수록(요골 1.16배, 경골 1.12배), 기혼자에 비해 미혼자(요골 2.69배, 경골 2.35배)의 위험 도가 높았으며, 7년 이상의 교육을 받거나, 100만원 이상의 소득을 가진 사람이 그렇지 않은 사람에 비해 위험도가 낮았다.4) 신체 계측치에 대해 단변량 로지스틱 회귀분석 결과, 키가 1 cm 증가할수록 위험도가 감소하였고(요골 0.93배, 경골 0.92배), BMI가 1단위 증가할수록(요골 1.07배, 경골 1.09 배), 허리둘레가 1 cm 증가할수록(요골 1.04배, 경골 1.05배) 위험도가 증가하였다. 5) 영양소 중 골 다공증의 위험도를 감소시키는 영양소는Ca/P, 티아민, 리보플라빈, 나이아신, 비타민 B6, 비타민E 등이었다. 6) BMI를 한국비만학회와 WHO 기준으로 나누어 비교하였을 때, BMI가 18.5~23인 사람 에 비해 BMI 18.5 미만(요골 2.60배, 경골 2.23배)이거나 BMI 25~30(요골1.75배, 경골 1.67배), BMI 30 이상(요골 2.51배, 경골2.62배)인 사람의 골다공증 위험도가 증가하여, BMI가 너무 높거나 낮은 경우 모두 골다공증의 위험도가 높아지는결과를 보였다. 7) Ca, P, Ca/P의 섭취수준을 사분위 로 나누어서 골다공증 유병률의 위험도를 비교했을 때, 요골은 칼슘을 가장 적게 섭취하는 군에 비해 삼분위군과 사분위군의 위험도가 각각 0.60배, 0.65배로 감소하였고, 경골에서는 칼슘, 인, 칼슘/인 비율 모두 가장 낮은 군에 비해 섭취가 증가할수록 위험도가 감소하는 경향을 보였다. 결론:이상의 연구 결과를 토대로 사회경제적 수준이 낮을수록, BMI가 정상에 비해서 너무 낮거나 높은 경우 골다공증의 위험도가 증가하였으며, 칼슘, 칼슘/인, 비타민 등의 섭취가 골다공증의 예방 에 좋은 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 따라서 적절한 BMI를 유지하고, 칼슘과 비타민이 풍부한 식품의 섭취를 증가하는 것이 지역사회 코호트 여성의 골다공증 위험도를 감소시키는데 도움이 될 것

301 290 국립보건연구원보 으로 사료된다. 주요어:골다공증, 유병율, QUS (Quantitative Ultrasound), BMI, 칼슘, 칼슘/인 비율 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임 지원과제명:코호트 연구자료의 분석전략 수립 학회지 게재:2005년 대한지역사회영양학회지 10(4):536~545

302 Ⅰ. 연구보고 291 Osteoporosis Prevalence of Radius and Tibia and Related Factors Using Multiple Bone Sites Quantitative Ultrasound Measurement of the Korean Health and Genome Study Cohort Women S.J. Park, Y.J. Ahn, H.S. Min, K.S. Oh, C. Park, N.H. Cho 1, K.C. Kimm Division of Epidemiology and Health index, Center for Genome Science, NIH, Seoul Korea, Department of Preventive Medicine, Ajou University School of Medicine & Hospital, Suwon Korea 1 Purpose:This study was conducted to investigate osteopenia and osteoporosis prevalence of radius and tibia using Quantitative Ultrasound(QUS) and to identify affecting factors of osteoporosis. Methods and Results:A total of 4,340 women aged years, living in Ansung(rural) and Ansan (mid-sized) area, and free of illnesses affecting bone metabolism participated in the community-based cohort study. Among them 4,059 subjects measured radius bone density and 4,089 measured tibia. The T-score threshold, defined as < -1.0 and -2.5, was used to identify subjects with osteopenia and osteoporosis by WHO criteria. The crude prevalence of osteoporosis in radius and tibia was 8.4% and 23.3% respectively; after adjustment for age, it changed 6.3% and 18.8%. In simple logistic regression analysis, the prevalence of osteoporosis increased by aging, non-marital status, low education, low income. Otherwise, high intakes of Ca/P, thiamin, riboflavin, vitamin B6, and vitamin E were decreased osteoporosis prevalence. Compared to the normal BMI (body mass index) group (18.5 BMI < 23), the odds ratio (ORs) of the low BMI group (BMI < 18.5), and high BMI groups (BMI 25-30, BMI 30) were significantly increased. The OR of osteoporosis decreased across increasing quartiles of intakes of Ca, P and Ca/P. Conclusion:Therefore, maintaining normal BMI and increasing Ca intake and Ca/P ratio may have a beneficial effect on bone health of Korean women. KEY WORDS:osteoporosis prevalence, QUS (Quantitative Ultrasound), BMI, Ca, and Ca/P intake This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea Supported original title : Strategy for cohort data This study was printed in Korean J Community Nutrition 10(4) : 536~545, 2005 The Report of National Institute of Health 42, , 2005

303 292 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 한국인 호발 만성질환의 병리생리학 모델연구를 위한 전사체와 단백체의 발현연구 기반구축 국립보건연구원 유전체센터 형질연구팀 김연정, 최정원, 박성규, 황민영, 오범석 목 적 : 단일 염기서열 다양성 (SNP)과 같은 인간 유전체 변이와 질병 간의 연관성 분석을 통한 유 전체 연구는 천식, 당뇨, 고혈압과 같은 복합 형질 질환의 원인 유전자 규명을 위해 효과적으로 널리 이용되어 왔고, 이로부터 해당 질환의 유전적 인자에 대해 많은 유용한 정보를 얻을 수 있었다. 이와 같은 유전체 연구를 통해 얻은 결과와 더불어 기능 유전체 연구는 다른 각도에서 상호 보완적인 정보 를 제공할 수 있는 연구 전략이며, 질환의 치료 및 예방을 위한 맞춤의학의 실현을 한층 앞당기는 중 요한 정보를 제공할 것으로 기대된다. 방 법 : 본 연구과제의 수행은 세포주 모델을 이용한 유전체 변이의 질환관련성에 대한 기능연구와 호발성 만성질환 중 천식 질환과 관련하여 동물 모델을 이용한 연구로 크게 두 파트로 나누어 진행되 었다. 결 과 : 유전체 변이에 관한 분석을 통해 제시된 DCNP1, CXCR3, PPARGC1B와 같은 질환 관련 후보 유전자를 세포주 모델을 사용하여 해당 질환과의 연관성을 기능적으로 증명하였다. 또한 급성 과 만성천식에 대한 동물모델을 구축하고 천식유발과 관련된 동물 조직의 전사체를 분석함으로써 질 병의 생물학적 마커를 발굴하기 위한 기초 자료를 마련하였다. 결 론 : 본 연구과제로부터 기능적으로 질환 연관성이 확립된 원인 유전자들은 질병의 병리생리학 적 기작을 확립하고 더 나아가 예방의학이나 개인의 유전적 배경을 고려한 맞춤의학의 구현을 위한 중요한 기초 정보로 활용될 것으로 기대된다. 중심단어 : 단일 염기서열 다양성 (SNP), 복합 형질 질환, 세포주 모델을 이용한 기능연구, 동물모 델을 이용한 기능연구 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

304 Ⅰ. 연구보고 293 Functional studies for identifying genetic risk factors associated with complex trait diseases Y.J. Kim, J.W. Choi, S.K. Park, M.Y. Hwang and B.S. Oh Division of Structural and Functional Genomics, Center for genome science, NIH, Seoul Korea Purpose : Complex-trait diseases such as asthma, diabetes and hypertension have emerged as threatening concerns to the public health. Much has been learned about genetics of the diseases by analyzing correlations between genetic variations including single nucleotide polymorphisms and susceptibility to the clinical outcomes. In addition to the genetic approaches, functional genomics will provide us with valuable information about molecular basis of the disease pathophysiology and mechanisms for potential clinical therapy. Methods : We conducted the functional studies by using bidirectional experimental approaches: in vitro cell-based and animal model-based systems. The cell-based strategy involves analyses of various effects of the disease-associated genetic variations, which includes changes in gene expression levels and protein-protein interactions. The animal model-based approaches were also used to study disease-related alterations in gene expression profiles in a physiological environment. Results and conclusion: We demonstrated functional evidence of associations of several disease candidate genes that have been previously implicated by genetic studies. Those include DCNP1 and CXCR3 suggested as risk factors for asthma, and PPARGC1B for the type 2 diabetes. We also examined gene expression profiles of acute or chronic asthmatic model mice resulted from exposures to asthma-inducing allergen in short or long-term periods of time. The genes identified from our functional studies are expected to be used as bio-markers for diagnosis of the diseases and the related clinical phenotypes. Key words : Complex-trait diseases, single nucleotide polymorphism, and cell-based and animal model-based functional studies This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

305 294 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 한국인에서 새로운 HLA-DOB-allele 발굴 국립보건연구원 유전체센터 형질연구팀 구해옥, 이종극, 오범석 목 적 : 인간 백혈구 항원(HLA)은 외부의 항원을 인체의 면역 세포가 인식할 수 있도록 전달하는 기능을 하는 중요한 유전자 그룹으로 다양한 유전형의 분포를 지닌다. HLA-DO 분자는 HLA-DOα 사슬과 HLA-DOβ 사슬의 이형이합체(heterodimer)로 구성된 non-classical class Ⅱ로서, HLA class Ⅱ 지역에 위치하는 DOA와 DOB 유전자에 의해서 암호화되 고, HLA-DM과 결합하여 음성 조절자 역할을 한다. 따라서 한국인 집단에서 이 유전자에 존재하는 새로운 대립유전자를 발굴하고자 본 과제가 수행되었다. 방 법 : 한국인 114명의 DNA 시료를 사용하여 direct sequencing 방법과 Polyphred software를 사용하여 DOB 유전자의 새로운 대립형질을 발굴하였다. 발굴된 새로운 대립형질은 TOPO cloning kit를 이용한 클로닝으로 확인하였다. 결 과 : 114명의 한국인 중에서 24명에서 새로운 대립형질이 발견되었고 DOB*010103로 명명되었 다. DOB*010103은 DOB* 의 exon2 염기 서열과 비교 하였을때 96 위치에서 Thymidine이 Cytosine으로 치환된 것을 제외한 모든 서열이 동일하였고, T C로의 치환은 codon 6에서 Aspartic acid Aspartic acid로의 동일한 아미노산 변화를 보였다. 결 론 : 본 연구에서 HLA-DOB 유전자의 새로운 allele이 발굴되었고, 이 allele은 다양한 면역질 환 연구에 유용하게 사용될 것으로 기대된다. 중심단어 : HLA-DOB*010103, 한국인, new allele, sequence-based typing 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임. 지원 과제명 : 복합형질 질환과 연관된 인간 유전체 일배체형 분석과 한국인 유전체형의 확립 및 관 련 통합정보의 전달 학회지 게재 : 2005년, 조직 항원, 65:

306 Ⅰ. 연구보고 295 Identification of a novel HLA-DOB-allele, DOB*010103, by sequence-based typing in the Korean polulation H.O. Gu, J.K. Lee, and B.S. Oh Center for genome science, NIH, Seoul Korea Purpose : Human leukocyte antigen (HLA) is an extended locus containing highly polymorphic genes which play a central role in the human immune response system. HLA-DO is a non-classical class Ⅱ heterodimer consisted of α and β chains, which are encoded by the DOA and DOB genes located in the HLA class-Ⅱ region of major histocompatibility complex (MHC). HLA-DO may act as a negative regulator by binding to HLA-DM and inhibiting the exchanging reaction of class Ⅱ-associated invariant chain peptides for antigenic peptide. So, we screened allele type of the HLA-DO region from the Korean polulation. Methods : Exon 2 of DOB was polymerase chain reaction (PCR) amplified in 114 Korean samples. The PCR product was subsequently sequenced and its polymorphism was detected by POLYPHRED software. DOB* was further confirmed by PCR amplification of one individual's cdna, cloning of PCR products using TOPO cloning kit, and sequencing. Results : We identified a new DOB allele (DOB*010103) in 24 individuals among 114 Korean samples and its allelic frequency was 0.1 in the Korean population. DOB* was identical to DOB* at exon2 except one mismatch at nucleotide position 96 (T C). This substitution shows synonymous amino acid change at codon 6 (Asp Asp). Conclusions : This report describes a new allele type of DOB* from the Korean polulation. This new DOB allele would be valuable for association studies with several immune-mediated human disease. Key words : HLA-DOB*010103, Korean, new allele, sequence-based typing This study was supported by then intramural grant of the National Institute of Health, Korea Supported original title : Haplotype analysis of Korean genome for human complex disease This study was printed in Tissue Antigens 65: The Report of National Institute of Health 42, , 2005

307 296 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 Transforming Growth Factor Beta-Induced 유전자의 다형성과 체질량지수와의 연관성 서울대학교 의과대학 내과, (주)에스엔피제네틱스 1, 국립보건연구원 유전체센터 2 박경수, 신형두 1, 박병래 1, 정현섭 1, 조영민, 이홍규, 이종영 2, 이종극 2, 김흥태 2, 한복기 2, 김준우 2, 고인송 2, 김영진 2, 김규찬 2, 오범석 2 목적 및 방법:제2형당뇨병 후보유전자의 유전적 다형성을 확인하기 위하여, transforming growth factor beta-induced (TGFBI) 유전자의 염기서열을 분석하였고, 제2형당뇨병 환자 775명과 정상 대조군 316명을 대상으로 제2형당뇨병 및 관련 표현형과의 연관성을 조사하였다. 결 과:TGFBI 유전자에서 28개의 다형성이 확인되었다. 제2형당뇨병 위험도와의 유의한 연관성은 관찰되지 않았으나, 정상 대조군에서 intron 16에 위치하는 단일염기다형성 (c c>t)과 3 UTR에 존재하는 단일염기다형성 (c.2589t>g)이 인슐린 농도 및 체질량지수와의 유의한 관련성을 보 였다. 소수 대립유전자를 하나 또는 두 copy 가지는 개체에서 낮은 인슐린 농도와 체질량지수가 관찰 되었다. 예를 들어, 가장 높은 체질량지수 (24.21 kg/m 2 )는 c.2589t>g의 T 대립유전자 동형접합체 를 가지는 개체에서 (n=99), 중간 체질량지수 (23.68 kg/m 2 )는 이형접합체 개체에서 (n=156), 가장 낮은 체질량지수 (22.69 kg/m 2 )는 G 대립유전자 동형접합체 개체에서 관찰되었다 (n=57, P=0.005). 결 론:본 연구에서 처음으로, TGFBI의 유전적 다형성에 관한 정보와 한국인에서의 인슐린 농도 및 체질량지수와의 양의 연관성이 제공되었다. 중심단어:제2형당뇨병, TGFBI, 단일염기다형성, 인슐린, 체질량지수 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원 받은 과제임. 지원 과제명:복합형질 질환과 연관된 인간유전체 Haplotype (일배체형)과 한국인 유전체형의 확립 및 관련 통합정보의 전달 학회지 게재:2005년, Hum Mutat. 25(3):

308 Ⅰ. 연구보고 297 Genetic Polymorphisms in the Transforming Growth Factor Beta-Induced Gene Associated With BMI K.S. Park, H.D. Shin 1, B.L. Park 1, H.S. Cheong 1, Y.M. Cho, H.K. Lee, J.Y. Lee 2, J.K. Lee 2, H.T. Kim 2, B.G. Han 2, J.W. Kim 2, I.S. Koh 2, Y.J. Kim 2, K.C. Kimm 2, B.S. Oh 2 Department of Internal Medicine, Seoul National University College of Medicine, Seoul Korea, Department of Genetic Epidemiology, SNP Genetics, Inc, Korea 1, National Genome Research Institute, NIH, Seoul Korea 2 Purpose and Methods:In an effort to identify genetic polymorphisms in potential candidate genes for type 2 diabetes mellitus (T2DM), we have sequenced the transforming growth factor beta-induced gene (TGFBI), and examined the association with T2DM and diabetic phenotypes in a Korean T2DM study (775 T2DM patients and 316 normal controls). Results:Twenty-eight polymorphisms were identified in TGFBI. Although no significant associations were detected with the risk of T2DM, one SNP in intron 16 (c c>t) and one SNP in the 3'untranslated region (UTR) (c.2589t>g), showed significant association with the levels of insulin and body mass index (BMI) among nondiabetic controls. The lower insulin and BMI were observed in individuals who carry one or two copies of minor alleles than others. For example, the highest BMI (24.21 kg/m 2 ) in individuals with homozygote major alleles (T) of c.2589t>g (n=99), the intermediate BMI (23.68 kg/m 2 ) in individuals with heterozygote alleles (n=156), and the lowest BMI (22.69 kg/m 2 ) in individuals with homozygote minor alleles (G) (n=57, P=0.005) were observed. Conclusions:The present study provides, for the first time, information about genetic polymorphisms in TGFBI and positive associations of those polymorphisms with levels of insulin and BMI in the Korean population. Key words : type 2 diabetes mellitus, TGFBI SNP, insulin, BMI This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea Supported original title : 복합형질 질환과 연관된 인간유전체 Haplotype (일배체형)과 한국인 유전체 형의 확립 및 관련 통합정보의 전달 This study was printed in Hum Mutat. 25(3): The Report of National Institute of Health 42, , 2005

309 298 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 천식 후보 유전자에서 유전 변이의 발굴 및 특성 규명 국립보건연구원 유전체센터 형질연구팀, 순천향대학병원 폐 및 호흡기 질환 유전체센터 1 김재정, 김현희, 박주현, 유하정, 김주영, 문송민, 구해옥, 김흥태, 이종영, 한복기, 박찬, 김규찬, 박춘식 1, 이종극, 오범석 목 적:천식은 호흡기 계통에서 발생하는 만성적인 염증 질환으로 유전적 소인과 환경적 인자가 복 합적으로 작용하여 발생한다. 연관성 연구는 천식과 같은 복합형질을 연구하는 효과적인 방법으로 여 겨지고 있는데, 이를 수행하기 위해서는 후보 유전자의 유전적 변이와 구조에 대한 정보가 필요하다. 따라서 기존에 밝혀진 genome-wide scanning의 결과와 천식 질환 특이적으로 발현되는 후보 유전 자 정보를 분석하여 중첩되는 37개의 후보 유전자에서 유전적 변이를 발굴하고 그 특성을 규명하고 자 한다. 방 법:기능적으로 중요하다고 여겨지는 exon과 promoter 영역, splice junction에 중점을 두어 12명의 천식 환자와 정상인 12명의 유전체 시료를 이용하여 PCR, direct sequencing을 수행하였고, PolyPhred" 프로그램을 이용하여 유전 변이를 규명하였다. 결 과:약 200kb의 유전체 영역에서 총 418개의 SNP를 발굴하였다. 그 중, 270개는 기존의 dbsnp database에 등록된 것이었으며 148개는 새로 발굴된 것이었다. Nucleotide diversity 정도는 유전자마다 다양하였으나 ( ~ ), 아미노산을 코딩하는 영역과 코딩하지 않는 영 역의 nucleotide diversity 값은 각각 과 으로 두 영역에서 비슷하였다. 한 편, 아미노산을 코딩하는 영역을 codon degeneracy에 따라 나누었을 때 fourfold degenerate sites는 nondegenerate sites보다 nucleotide diversity 값이 약 3배가 높음을 관찰할 수 있었다 ( vs ). 유전자 수준에서 haplotype의 분석 결과, 5% 이상의 빈도를 나타내는 common haplotype이 전체 염색체의 90.5%를 포함하고 있어 염색체의 대부분이 common haplotype에 의해 나타내어졌고, 이것들을 구분해주는 common haplotype tagging SNP의 개수는 유전자당 평균 2.76 개이었다. 결 론:위 결과를 통해서 한국인에서 천식 후보 유전자의 DNA 변이와 haplotype의 특성을 알아볼 수 있었고, 이는 앞으로 대규모의 시료를 이용하여 연관성 연구를 수행할 때 적절한 후보 유전자와 SNP 마커를 선택하는데 있어 중요한 정보를 제공해줄 것으로 기대된다. 중심단어:천식, 후보 유전자, SNP, Haplotype, 한국인 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원 받은 과제임. 지원 과제명 : 복합형질 질환과 연관된 인간유전체 일배체형분석과 한국인 유전체형의 확립 및 관련 통합정보의 전달 학회지 게재 : 2005년, 면역유전학, 57(9):

310 Ⅰ. 연구보고 299 Large-scale identification and characterization of genetic variants in asthma candidate genes J.J. Kim, H.H. Kim, J.H. Park, H.J. Ryu, J.Y. Kim, S.M. Moon, H.O. Gu, H.T. Kim, J.Y. Lee, B.G. Han, C. Park, K.C. Kimm, C.S. Park 1, J.K. Lee and B.S. Oh Division of Structural and Functional Genomics, Center for Genome Science, NIH, Seoul Korea, Genome Research Center for Allergy and Respiratory Diseases, Soonchunhyang University Hospital, Bucheon Korea 1 Purpose : Asthma is a chronic inflammatory disorder of the airways, and a number of genetic loci are associated with the disease. Candidate gene association studies have been regarded as effective tools to study complex traits. Knowledge of the sequence variation and structure of the candidate genes is required for association studies. Thus, we investigated the genetic variants of 37 asthma candidate genes selected by colocalization of positional and functional candidate genes. Methods : To identify common SNPs in 32 asthma candidate genes and 5 control genes, we resequenced all exons and promoter regions of those genes using 12 healthy individuals and 12 asthma patients. The PolyPhred program ( was used to assemble the sequences and identify SNPs. Results : We identified a total of 418 single nucleotide polymorphisms (SNPs), including 270 known SNPs and 148 novel SNPs. Levels of nucleotide diversity varied from gene to gene ( ~ ), but the average nucleotide diversity between coding SNPs (csnps) and noncoding SNPs was roughly equivalent ( vs ). However, nucleotide diversity of csnps was strongly correlated to codon degeneracy. Nucleotide diversity was much higher at fourfold degenerate sites than at nondegenerate sites ( vs ). Gene-based haplotype analysis of asthma associated genes in this study revealed that common haplotypes (frequency >5%) represented 90.5% of chromosomes, and they could be uniquely identified with five or fewer haplotype-tagging SNPs per gene. Conclusions : Our results may have important implications for the selection of asthma candidate genes and SNP markers for comprehensive association studies using large sample populations. Key words : Asthma, Candidate gene, SNP, Haplotype, Korean This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea Supported original title : Haplotype analysis of Korean genome for human complex disease This study was printed in Immunogenetics 57(9): The Report of National Institute of Health 42, , 2005

311 300 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 한국인 집단에서 제 이형 당뇨에 대한 연관 분석 국립보건연구원 유전체센터 형질연구팀 박미현, 김광중, 김경선, 이혜자, 오범석, 김규찬, 조영민, 이홍규, 박경수, 이종영 목 적:유전적 인자와 환경적 인자가 복합적으로 작용하여 나타나는 현대인의 만성 질환의 상당수 는 최근 20여년 사이에 그 발생율이 증가해 왔다. 만성질환의 원인 유전자를 발굴하기 위하여 질환 환자와 정상인간의 유전자 발현 변화를 이용한 방법 등의 다양한 연구가 진행되고 있으며, 질환을 나 타내는 가족력 시료를 확보하여 연관 분석을 통해 질환 후보영역을 밝히고 이 후보영역에 존재하는 SNP 정보 등을 이용한 genome-wide scan법이 가장 효율적으로 후보유전자를 발굴하는 방법으로 부각되고 있다. 본 과제는 Genome-wide scan을 이용한 연관분석을 통하여 질환 후보유전자 영역을 밝히는 연구사업을 수행하여, 당뇨병 원인 영역이 이미 밝혀진 타 인종의 결과와 비교하여 새로운 후 보 유전자 영역을 찾고자 한다. 방 법:한국인 당뇨 샘플 202명(129 형제 쌍, 92 가계)의 DNA 시료를 사용하여 400개의 microsatellite 마커를 가지고 fragment analysis를 행하였다. ABI 3730을 사용하였으며, 분석된 결과 는 Gene Mapper Software Version 3.5를 이용하여 각 마커의 sizing data를 먼저 분석한 다음, genotype을 결정하였다. 당뇨 형제 쌍의 연관 분석을 위해 Genehunter plus 프로그램을 사용하였다. 결 과:400개 마커 중, 2개는 한국인에서의 frequency가 낮았고, 398개 마커를 이용한 23 쌍의 염 색체에서 당뇨형제 샘플과의 연관분석 결과 1q, 4q, 7p, 12p, 18q 영역에서 질환과 연관되는 부분이 나왔다. 이중에서 4q, 7p, 18q는 타 인종에서 연관분석의 결과와 동일한 영역으로 확인되었고, 1q, 12p는 한국인에서의 새로운 질환 후보 영역으로 밝혀졌다. 결 론:본 연구에서 한국인에서의 제 2형 당뇨에 대한 새로운 후보 영역이 밝혀졌고, 앞으로 microsatellite 마커로 영역을 더 좁히고, 이들 영역에 tagging SNP 정보를 활용하여 이 영역에 존 재하는 당뇨 후보유전자와 SNP을 발굴하고자 한다. 이 후보 유전자 정보는 제 2형 당뇨 질환의 예측 ㆍ예방에 유용하게 사용될 것으로 기대된다. 중심단어:제 2형 당뇨, 연관 분석, 후보유전자 영역 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임. 지원 과제명 : Genome-wide scan법을 이용한 복합형질 질환의 원인유전자 탐색 기반기술 구축

312 Ⅰ. 연구보고 301 Genome-Wide Linkage Analyses of Type 2 Diabetes in Korean population M.H. Park, K.J. Kim, K.S. Kim, H.J. Lee, B.S. Oh, K.C Kimm, Y.M. Cho, H.K. Lee, K.S. Park and J.Y. Lee Center for genome science, NIH, Seoul Korea Purpose : The incidence of complex diseases, whose origin is multifactorial with both genetic and environmental contributions, has constantly been increasing during the last twenty years. In search for a candidate gene of a complex disease, different kind of association studies are applied. Recently, nonparametric methods have been widely used for studying complex traits where the mode of inheritance is usually unknown. The affected sib-pair analysis based on identity-by-descent relationships is currently applied as the most effective form of nonparametric linkage analysis. In this study, we performed a genome-wide scan of microsatellite markers of 129 Korean sib-pairs who are affected by type 2 diabetes and compared the results with those of other ethnic groups in an effort to define novel candidate genes for type 2 diabetes. Methods : We performed a genome-wide scan for type 2 diabetes in 202 affected individuals (129 sib-pairs) from 92 Korean families, using 400 microsatellite markers. The marker alleles were assigned by Gene-Mapper software 3.5(Applied Biosystems). The NPL calculations were carried out using GENEHUNTER Plus. Results : Nonparametric linkage analysis showed five evidences for linkage to chromosomes 1q, 4q, 7p, 12p and 18q. Among them, chromosomes 4q, 7p and 18q have already been found as susceptibility loci in previous linkage analyses of other ethnic groups. An NPL score of 1.28 (equivalent to a maximum likelihood lod-score [MLS] 2.48) was observed near marker D1S249 on chromosome 1q Conclusions : The results identify novel genetic domains for type 2 diabetes on chromosomes 1q and 12p in Korean population, and also support an overlap of susceptibility regions for linkage on chromosomes 4q, 7p and 18q among Korean and other ethnic groups. words : Type 2 diabetes, Linkage analysis, Candidate gene region This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea Supported original title : The study of genome-wide linkage studies of complex disease. The Report of National Institute of Health 42, , 2005

313 302 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 DNA 형광염색법을 이용한 mycoplasma 검출 염색기법에 관한 연구(바이오자원은행의 효율적 관리 및 활용에 관한 연구) 국립보건연구원 유전체센터 생물자원은행팀 남혜영, 심성미, 전재필, 김준우, 한복기 목 적 : 바이오 자원중에서 세포주를 배양 시 세균, 효모, 곰팡이나 마이코프라즈마에 의해 오염이 발생한다. 다른 원인과 달리 마이코플라즈마에 의한 오염은 단순히 광학현미경을 이용한 검경법으로 는 관찰이 어렵다. 이에 좀 더 신속하고 정확한 방법의 도입이 필요하여 본 실험을 수행하였다. 방 법 : 본 실험에서는 형광염색법을 도입하여 배양중인 불멸화된 B-세포주에서 MycoFluor Mycoplasma Detection kit를 이용하여 마이코플라즈마의 오염유무를 관찰하였으며 기존의 PCR 방 법과 비교하였다. 결 과 : Hoechst 33258을 이용한 DNA 형광염색법을 통하여 기존의 마이코플라즈마 오염이 밝혀 진 몇 가지의 세포를 사용하여 확인하였다. 본 실험에 사용된 샘플은 positive control로 사용된 샘 플 보다 오염정도가 훨씬 작아서 염색에 의해 마이코플라즈마를 관찰하였을 때 낮게 나타났다. 이런 경우는 형광현미경으로 관찰시 negative로 판단할 가능성이 있으며 실제 실험시에는 이러한 점을 고 려해야 할 것으로 생각된다. 결 론 : DNA 형광 염색법을 통한 mycoplasma 검색 방법은 눈으로 직접 관찰할 수 있다는 장점이 있으나 mycoplasma 오염이 미세한 경우는 PCR을 이용한 mycoplasma detection방법이 sensitivity 가 더 높을 것으로 생각된다. 그러므로 위의 두 가지 방법을 병행해서 수행하는 것이 세포의 오염을 판별하는데 도움이 될 것으로 생각된다. 중심단어 : 세포주, 마이코플라즈마, 형광염색법, PCR 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

314 Ⅰ. 연구보고 303 The studies of mycoplasm detection method by DNA fluorescent staining : Studies on the efficient management and application of bio-resource bank H.Y. Nam, S.M. Shim, J.P. Jeon, J.W. Kim and B.G. Han Division of BioBank for Health Sciences, Center for Genome Science, NIH, Seoul Korea Purpose:During the culture of cell-lines, cells were contaminated bacteria, yeast, fungi, and mycoplasma. Different with other causes, the contamination of mycoplasma was not detected with optical microscope. So, we needed the rapid and accurate method for mycoplasma detection. Methods:Introducing the fluorescent staining method, we observed the mycoplasma contamination from immortalized B-cell culture using MycoFluor Mycoplasma Detection kit and compared with the established PCR method. Results:We confirmed the identification of several case of previously contaminated cells by DNA fluorescent staining method using Hoechst Compared with positive control, the degree of mycoplasma contamination from samples was detected more low than that. In this case, it is possible of deciding negative result from specimen by fluorescent microscopy. To apply to the experiment, it must be consider the fact. Conclusions:By through the DNA fluorescent staining method, the advantage of mycoplasma detection method was observed directly from samples. But in the case of a minimum contamination, PCR method was more higher sensitivity. Therefore, it is helpful detecting the mycoplasma using DNA fluorescent staining method in parallel with PCR. Key words:cell-line, mycoplasma, fluorescent staining method, PCR This study was supported by the intramural grant of the National Institute of Health, Korea The Report of National Institute of Health 42, , 2005

315 304 국립보건연구원보 국립보건연구원 제42권 The Report of National Institute of Health 42, , 2005 EBV에 의해 변형된 림포블라스토이드 세포주의 어레이 CGH 프로파일의 특징 국립보건연구원 유전체센터 생물자원은행팀 남혜영, 심성미, 전재필, 김준우, 한복기 목 적 : 어레이 CGH는 암이나 유전병의 염색체 이상을 감지하는데 주로 적용되어 왔다. EBV에 감 염된 B 림포사이트는 지속적으로 번식하는 림포블라스토이드 세포주화되는데 이러한 세포주는 인간 의 유전학 연구에 일상적으로 사용되는 지놈 소스가 된다. 방 법 : BAC 어레이 CGH를 사용하여 EBV 감염에 의해 B 세포가 불멸화되는 과정에서 염색체 변 화가 유발되는지를 조사하였다. 결 과 : LCLs는 초기 B 세포와 비교시 1p36.33에 카피수의 변화를 보였다. 정량 PCR을 통해 1p36.33의 카피수가 증가한 사실을 확인하였는데 미토콘드리아 DNA의 카피수의 증가와 연관이 있었 는데 그 이유는 1p36.33 조각이 미토콘드리아 DNA 일부와 거의 동일하기 때문이었다. 미토콘드리아 DNA의 카피수 증가는 버킷 림포마 세포주의 증식력을 설명하여 주는데 아마도 증가된 미토콘드리아 생성이 B 세포의 변형에 필요한 것으로 여겨진다. 더군다나 LCLs의 어레이 CGH는 정상인에서의 염 색체 조각의 카피수 이형성을 밝혀주었다. 결 론 : 이러한 어레이 CGH 프로파일 연구는 LCLs이 초기 B 세포의 염색체 보존을 지니고 있다는 것을 알려주는 것이다. 그리고 특이적으로 1p36.33의 카피수 다양성은 증가된 미토콘드리아 생성에서 유래된 것으로 생각된다. 중심단어 : 어레이 CGH, LCL, 미토콘드리아 DNA, B 세포 이 연구는 국립보건연구원으로부터 지원받은 과제임.

316 Ⅰ. 연구보고 305 서 론 EBV-변형 림포블라스토이드 세포주(EBVtransformed lymphoblastoid cell lines; LCLs)는 다양한 인간의 유전학 연구에 있어 지놈 소스 로서 널리 사용되어 왔다. 그러나 초기 B 세포 와는 다른 LCLs의 지놈과 생물학적인 특징은 아직까지 잘 밝혀져 있지 않다. 비록 EBV가 감 염된 세포에서 에피좀 상태로 유지되고 거의 드물게 숙주의 염색체에 끼워 들어가긴 하지만 많은 보고에 의하면 EBV 감염된 세포에서는 바이러스와 유사하게 들어가는 것으로 알려져 있다. 염색체 불안정성은 바이러스와 유사하게 들어가는 현상에 의해 증가되며 이러한 원인에 의해 간염바이러스나 EBV 감염처럼 끼워 들어 가는 부위에 인접한 숙주와 바이러스의 지놈 염기서열이 삭제되거나 복제가 되기도 한다. LCLs는 오랫동안 배양되어 passage doubling time (PDL)이 160에서 180이 되는 동안 빈번하 게 염색체 변이가 발생하여 불멸화가 일어나며 이렇게 된 LCLs는 궁극적으로 불멸화된 LCLs 가 된다. 비록 LCLs는 대부분이 EBV 감염된 B 세포에서 유래하지만 LCLs는 대부분 초기의 PDLs에서는 형태가 다각형에 가깝다. 어레이 CGH는 유전병과 암에서 지놈 스케일 로 염색체 변이를 발견하는데 매우 유용하다. 예를 들면 segmental deletion에 대한 1:8의 빈도 와 segmental duplication에 대한 1:50에 대한 빈 도는 추정하기를 신생아에서 많은 카피수의 다 양성을 유발한다. 최근에는 대형 스케일의 copy number polymorphisms (CNPs) 또는 (large-scale copy number variations) (LCVs)이 올리고 또는 BAC 어레이 CGH 접근에 의해 형태적으로 정 상인 개인에서 확인되었다. 어레이 CGH는 전 체 혈액세포, LCLs, 그리고 포르말린과 파라핀 에 고정된 조직 등에서 나온 다양한 DNA을 사 용하여도 성공적으로 분석이 가능하다. 본 연구에서 정상인에서 유래한 LCLs의 segmental copy number의 다양성을 관찰하였다. LCLs은 지놈 연구에서 주요 유전재료중에 하나 이므로 초기 B 세포와 거기서 유래한 LCLs 사 이의 어레이 CGH 프로파일의 차이를 발견하고 자 하였다. mt DNA 증가와 연관이 있는 1p36.33에 대한 시그널의 변화를 제외하고는 초 기 B 세포와 LCLs에서 염색체 segments의 카피 수는 변화가 없었다. 반면에 건강한 시료제공자 에서 유래한 LCLs에서 염색체 segments는 약간 의 다양한 카피수의 변화를 발견하였는데 이것 은 이미 알려진 CNPs의 목록에 추가가 가능할 것으로 생각된다. 재료 및 방법 1. 세포 혈액은 건강한 시료제공 동의서에 확인한 제 공자로부터 채취하였다. peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)는 ficoll-paque gradient 원심분리를 수행하여 얻었으며 EBV stock은 EBV 변형된 B95-8 원숭이 세포주에서 준비하였 다. PBMCs의 EBV 감염에 의해 림포블라스토이 드 세포주 (LCLs)를 얻었으며 사이클로스포린 (0.5μg/ml), 10% FBS, 그리고 페니실린-스트렙토 마이신(100μg/100unit)이 첨가된 RPMI-1640 배지 에서 45일동안 배양하였다. 확립된 LCLs은 10% FBS가 포함된 RPMI-1640배지에서 유지하였다. 2. 어레이 CGH 본 연구에 사용된 MAcArrayTM Karyo4000는 4030개의 BAC 클론을 포함하며 이는 대략 1Mb 의 해상도라고 가정시 사람의 지놈 전체를 커버 한다. 지놈 DNA는 PUREGENE DNA 분리 키 트를 사용하여 분리하였다. Probe 레이블, hybridization과 어레이 CGH의 해석은 제조자의 지침 또는 그 밖의 설명을 따라 수행하였다. 간 단하게 정리하면 불멸화된 LCLs에서 분리한 테 스트 샘플 DNA은 Cy3-dCTP로 표지를 하고 초

317 306 국립보건연구원보 기 B 세포 또는 남성의 혈액에서 분리한 DNA pool에서 유래한 참조 DNA는 Cy5-dCTP로 표지 하였다. 염색체 변이는 정상화된 log2 transformed 형광비가 0.25 보다 높은 경우 copy number 증가로서 분류하였고 0.25 보다 낮은 경 우는 감소로 분류하였다. 이런 두 가지 threshold 값은 30명의 정상 남자에서 정상 여자를 hybridization 실험을 통해 계산된 3xSD 값을 선 택하였다. 각각의 copy number 다양성은 dye swap hybridization에 의해 false와 positive를 최 소화하여 결정하였다. 3. 정량 PCR 염색체의 segments의 상대적인 copy number는 SYBR green 방법을 사용하여 실시간 정량 PCR 로 분석하였다. 간단히 정리하면 PCR은 ABIPrism 7900HT sequence detection systems를 사용하여 384-well 투명 반응 플레이트에서 10 μl의 부피로 수행하였다. 1p36.33에 사용된 프 라이머는 LOC Fw (5'- CCTCTACCTGCA CGACAACA-3')와 LOC Rev (5'-GTGG CCTTGGTATGTGCTTT-3')이며 mtdna에 대한 프라이머는 MtDNA-3441-Fw (5'-ACTACAAC CCTTCGCTGACG-3'), MtDNA-3610-Rev (5'-GC CTAGGTTGAGGTTGACCA-3')이다. 그리고 참 조로 한 Factor VIII 유전자에 대한 프라이머는 F8-F (5'-TACCATCCAGGCTGAGGTTTAT-3'), F8-R (5'-AAAGAGTTGTAACGCCACCATT-3')이다. 한 반응당 세개의 샘플을 준비하여 혼합액을 만들 어 사용하였는데 8 μ M의 forward와 reverse 프 라이머, 2X SYBR green PCR master mix 및 50ng의 지놈 DNA을 섞어서 제조하였다. 그리 고 상대적인 copy number는 적어도 3번의 정 량 PCR을 반복하여 결정하였다. 결 과 1. 어레이 CGH 분석 불멸화된 B 세포에서 지놈의 copy number 변 화를 관찰하기 위해 BAC 어레이 CGH는 pool 한 사람의 혈액에서 유래한 DNA와 4개의 다른 LCLs의 지놈 프로파일을 먼저 비교하였다(그림 1. 표 1.). 본 연구에서 각각의 LCL은 1p36.33 과 2p11.2의 두개의 segment에서 비교적 다른 염색체 copy number 다양성의 프로파일을 보여 주었다. 이러한 현상은 네 개의 LCLs에서 공통 으로 나타났다. 다음으로 공통의 다양성을 보여 준 것은 13q21.1과 14q32.33 segment에서 copy number의 감소를 보여주는 것으로 이는 3개의 LCLs에서 나타났다. 물론 이러한 segment중에서 2p11.2와 14q32.33는 light chain kappa (GKV1-6, IGKV3-7, IGKV1-8, IGKV1-9, IGKV2-10, IGKV3-11, IGKV1-12)와 heavy chain (ADAM6, LOC192133, IGHV1-2, IGHVIII-2-1, IGHV1-3, IGHV4-4, IGHV2-5, IGHVIII-5-1)의 면역글로불 린 위치와 각각 대응된다. 이러한 염색체 위치는 B 세포가 항체의 다양 성을 위해 플라즈마 세포로 분화될 때 심한 염 색체 재배치가 일어난다. 다른 지놈 copy number의 빈번한 변화는 5q.11에서 증가되고 5q13.2, 8p23.1과 Xq23 segments에서는 감소한 경향을 보여준다. 반면에 전체 혈액에서 뽑은 것과 비교시 모든 LCLs에서 일어나는 1p36.33 의 copy number의 공통적인 증가는 흥미가 있 다. 1p36.33 segment의 copy number의 변화가 LCLs에서 특이적으로 발생하는지가 궁금하였 다. 이러한 궁금증을 해소하기 위해 LCL의 지 놈 프로파일은 LCL의 제공자에 해당하는 초기 B 세포와 비교하였다. 1p36.33 segment를 제외 하고는 어떠한 염색체 segments도 LCL과 B 세 포사이에서 지놈의 copy number 변화를 보이는 것을 관찰하지 못하였다. 이러한 데이터는

318 Ⅰ. 연구보고 307 1p36.33가 EBV에 의해 변형된 림포블라스토이 드 세포주의 지놈 copy number 변이의 타겟이 라는 것을 제시함을 알 수 있었다. 흥미있게도 BLAST 검색을 통해 1p36.33데 대한 BAC 클론 서열이 미토콘드리아 지놈과 매우 높은 유사성 을 가지며 대응됨을 알 수 있었다. 그러므로 이러한 결과는 증가된 미토콘드리아 합성이 1p36.33 segment의 증가된 copy number를 설명 한다고 할 수 있다. a) Reference DNA Pooled male DNA b) Pooled DNA c) Pooled DNA d) Pooled DNA e) B-cells 그림 1. LCLs의 어레이 CGH의 프로파일

319 308 국립보건연구원보 표1. LCLs에서 염색체 segments의 copy number 변화 Ig locus Ig locus : Known polymorphic segments : Chromosomal Gain : Chromosomal Loss 2. LCLs에서 증가된 미토콘드리아 DNA copy number Copy number 변이가 증가된 것을 정량 PCR 하기 위해 염색체 1p36.33과 미토콘드리아 DNA에 상응하는 프라이머를 사용하였다. 1p36.33 대한 프라이머는 1p36.33과 mtdna 모 두에 대응하게 고안하였는데 1p36.33 segment는 핵의 미토콘드리아 DNA 유사 서열을 가지고 있는데 이는 거의 미토콘드리아의 3914에서 9755에 상응하는 5842bp와 유사하기 때문이다. 그러나 미토콘드리아에 증폭하는 프라이머는 특별히 미토콘드리아만 증폭할 수 있게 고안하 였다. 정량 PCR에 의해 결과는 1p36.33 서열의 copy number는 초기 B 세포와 비교시 LCLs에 서 1.9배 증가함을 보여주었다. Copy number의 증가는 어레이 CGH 결과와 일치한다. 더군다 나 미토콘드리아 지놈의 copy number는 또한 LCLs에서 1.8배 증가하였는데 B 세포보다 LCLs에서 미토콘드리아 DNA가 많이 있음을 제시한다 (그림 2). 이러한 결과는 어레이 CGH 가 환자의 샘플에서 미토콘드리아 copy number 변이와 염색체 이상을 발견할 수 있음을 시사 한다.

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