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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 27: 556 (22) 연구논문 패류로부터젖산세균의분리및특성 강창호, 정호건, 구자룡, 전은진, 곽대영, 홍채환 2, 김시환 2, 서지연 2, 한도석 2, 소재성 * Identification and Characteristics of Lactic Acid Bacteria Isolated from Shellfishes ChangHo Kang, Ho Geon Jeong, JaRyong Koo, Eun Jin Jeon, Dae Yung Kwak, Chae Hwan Hong 2, Si Hwan Kim 2, Ji Yeon Seo 2, Do Suck Han 2 and JaeSeong So * 접수 : 22 년 3 월 3 일 / 게재승인 : 22 년 5 월 7 일 22 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: ) Lactic acid is an important product arising from the anaerobic fermentation by lactic acid bacteria (LAB). It is used in the pharmaceutical, cosmetic, chemical, and food industries as well as for biodegradable polymer and green solvent production. The poly lactic acid (PLA) is an important material for bioplastic manufacturing process. For PLA production by new LAB, we screened LAB isolates from shellfish. A total of 28 LAB were isolated from various shellfishes. They were all Gram positive, oxidase and catalase negative. Based on API 5CHL kit, 7 strains among the 28 isolates were identified as, 6 strains as, 5 strains as Leuconostoc mesenteroides, 3 strains as, 2 strains as, strain as Lactobacillus salivarius, strain as Lactobacillus paracasei, strain as Lactobacillus pentosus, strain as Lactobacillus fermentum and strain as Pediococcus pentosaceu. Also, we examined the amount of total lactic acid produced by these new strains by HPLC analysis with Chiralpak MA column. One strain E3 from Mytilus edulis was indentified as 인하대학교생물공학과 Department of Biological Engineering, College of Engineering, Inha University, Incheon 4275, Korea Tel: , Fax: 현대자동차중앙연구소기반기술연구팀 2 Central Research Institute, Hyundai Motors, Uiwang, Gyeonggi, Korea and found to produce 2. g/l of Dform lactic acid from 2 g/l of dextrose. Further studies are underway to increase the Dlactic acid production by E3. Keywords: lactic acid bacteria (LAB), poly lactic acid (PLA), isolation, identification, Dform. 서론 젖산 (lactic acid) 은 L 형, D 형, DL 형의이성질체가있으며, 음료의산미제, 주류발효초기의부패방지제, 화장품등으로다양하게이용되고있는중요한화학물질이다. 젖산은화학적전환기술로 Poly lactic acid (PLA) 중합중간체인락타이드 (Lactide) 나아크릴산 (Acrylic acid) 등의유용화학물질로변환된다 []. L 형젖산과 D 형젖산을같이사용한경우, 폴리유산의융점이높아지고, 결정화도증가되는현상을보여결과적으로소재의높은열안정성확보가가능하게되었다 [2]. L 형젖산의경우식품산업에서대부분의응용분야에사용되기에많은연구가이루어져있는반면, D 형유산의경우응용성이낮아연구가거의이루어지지않았다. D 형젖산을생산하는연구방법중최근부각되고있는방법으로는자연계에서젖산을과량으로생산하는자연균주 (Lactobacillus spp. 등 ) 를선발하여생산하는방법이있다. 이방식으로접근할경우젖산균의특성상수율, 생산성면에서우수한것으로알려져있다. Kimura 연구팀의연구결과 [3] 에따르면 와 Sporolactobacillus inulinus 를이용하면발효반응으로생산

2 52 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 27: 556 (22) Table.Some morphological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria from shellfishes strain No. Gram stain Motility Facultative anaerobic Catalase Oxidase API5CHL kit A A3 A4 A5 A6 M M2 T T2 T4 E E2 E3 E4 E5 N N2 N3 N4 N5 C C2 C3 C4 C5 G G2 G4 Lactobacillus salivarius Pediococcus pentosaceus Lactobacillusparacasei Lactobacillus pentosus Lactobacillus fermentum A: Isolated from Arca avellana Lamarck, M: Isolated from Mactra veneriformis Reeve, T: Isolated from Tapes phillipinarum, N: Isolated from Neptunea arthritica cumingi, C: Isolated from Turbo cornutus, E: Isolated from Mytilus edulis, G: Isolated from Crassostrea gigas, growth;, no growth. Data are from triplicate experiments. 된젖산중 D 형젖산의함유량이 98% 이상의고순도로나타나는것을확인할수있었다. 젖산균은혐기적또는통성혐기성으로증식하는그람양성세균으로, 자연계에널리분포되어있는미생물이다. 전통적으로다양한발효식품에이용되어왔고, 일반적으로안전하다고인식되는미생물 (GRAS, generally recognized as safe) 로서 [4], Bergey s Manual [5] 에서는그람양성구균과그람양성간균에서다루고있다. Catalase 음성으로포자를형성하지않고, 혐기성병원성균주의생장을억제하기위해다양한억제물질들을생산하며, 글루코오즈대사과정에서생산된젖산을통해낮은 ph 을유지하는것으로알려져있다 [6]. 기존의젖산을생산하는균주의분리는김치등식음료에서분리하여상업적으로사용되었다 [7,8]. Leuconostoc 과 Lactobacillus vulgaricus 등은 D 형젖산을주로생산하며, Bacillus, Rhizopus, Streptococcus, Enterococcus 의미생물은 L 형젖산을생산하는것으로알려져있다 [7]. PLA 합성의경우 ph 와온도등다양한환경스트레스에강한젖산생산균주가요구된다. Lee 의연구결과 [9] 에따르면, 패류인굴에서분리한 Lactobacillus spp. 가다양한환경스트레스에내성이높은것을확인할수있었다. 이에본연구에서는패류에서분리한젖산균의젖산생산관련연구가전무한바, 다양한패류에서젖산균을분리 동정하여발효과정에서생산되는 L 형과 D 형의젖산생산량과총젖산생산량을확인해보았다. 이를통해환경스트레스내성이높은 D 형젖산생산균주를선별하여 PLA 연구의기초자료로이용하고자한다. 2. 재료및방법 2.. 배지및시약패류에서젖산균의분리를위하여 Rogosa SL media 와.% bromocresol purple (BCP) 이첨가된 Lactobacilli MRS media 는 Difco 사 (MI, USA) 제품을사용하였고, 계대배양에는 MRS media 를사용하였다. 균주의보존을위하여균배양액에 glycerol 이 25%(v/v) 가되도록조성하여 7 에서보관하며실험에사용하였다. 분리한균주의생화학적특성검사를위해서는 Gram stain sets 는 Difco 사 (MI, USA) 제품, oxidase reagent 는 SigmaAldrich 사 (MO, USA) 제품, API 5 CHL kit 는 BioMerieux 사 (France) 제품을사용하였다.

3 패류로부터젖산세균의분리및특성 균주의분리 2 년 7 월부터 2 월까지인천서해안의양식어장에서채취한패류 ( 돌조개, 동죽, 바지락, 갈색띠매물고둥, 소라, 진주담치, 굴 ) 를냉장상태를유지하면서실험실로운반하여균주분리실험을진행하였다. 패류시료중패각이손상되지않은것을골라멸균된칼로내용물을 2 g 이될때까지탈각하여, 멸균된비커에넣은후 phosphate buffered saline (PBS; 2.5 mm KH 2 PO 4, ph 7.2) 2 ml 를부어혼합한다. 혼합후에멸균된 blending cup 에넣어 blender (7S, Waring, Torrington, CT) 를이용하여 9 초 (low speed 3 s, high speed 6 s) 동안갈아준다. PBS 로 2 까지희석한용액 μl 를 Rogosa 고체배지에도말한후, CO 2 치환하여 37 에서 2 일간배양한다. 생성된콜로니는.% BCP 가들어있는 MRS 평판배지에배양하여동정용균주로사용하였다. 순수분리된균주는 MRS 액체배지에서배양한후 25% glycerol 로조성하여 7 에서보관하며동정과생화학적특성시험에사용하였다 분리균주의동정분리된균주는 MRS 액체배지에서 37 로 24 시간배양한후그람염색 [] 을실시하여위상차현미경으로형태학적특성을관찰하였다. 또한분리한균주의생화학적특성을조사하기위하여, A Laboratory Method in Food and Dairy Microbiology [] 와 The Prokaryotes [2] 의방법을참고하여실험을실시하였다. Catalase test 는배양평판에 3% hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) 를첨가한후 O 2 발생유무를관찰하였고, oxidase test 는콜로니를비금속성막대를사용하여슬라이드에올려놓고 Kovac s reagent 를한방울떨어뜨려변색여부를관찰하였다. 최초분리한 28 균주의동정을위하여 API 5CHL kit 을사용하여배지의색변화를관찰한후, API web program ( Biomerieux) 을이용하여동정하였다. D 형젖산을가장많이생산하는균주는추가적으로 6S rrna gene sequencing 을이용하여분자동정하였다 HPLC 를이용한젖산생산량분석분리된 28 종의균주는 MRS 액체배지 5 ml 에서 48 시간동안정치배양한후, 배양액을.2 μm filter (Minisart, Satorius) 를사용하여필터링하여 HPLC (Younglin, Korea) 를통해 L 형과 D 형의젖산생산량과총젖산생산량을분석하였다. 분석에사용된컬럼은 Chiralpak R MA (reverse phase type, mm), 이동상으로는 2 mm CuSO 4 를.5 ml/min 의유속으로이용하였고, UV 검출기로 254 nm 에서검출하였으며, 시료주입량은.2 ml 였다. 3. 결과및고찰 3.. 패류에서유산균분리인천서해안에서양식되는돌조개 (Arca avellana Lamarck A), 동죽 (Mactra veneriformis Reeve M), 바지락 (Tapes phillipinarum T), 갈색띠매물고둥 (Neptunea arthritica cumingi N), 소라 (Turbo cornutus C), 진주담치 (Mytilus edulis E), 굴 (Crassostrea gigas G) 등총 6 종에서분리한 28 개의분리균주에대해서형태학적및생리화학적특성을조사하였다. 그람염색을실시하여위상차현미경으로관찰한결과, 모든분리균주들이그람양성으로나타났다. 분리균주에대한여러가지형태학적및생리화학적특성을조사한결과는 Table 2 에서보여주는바와같다. 분리균주모두에서 catalase 와 oxidase 는음성이었고, BCP 가들어있는 MRS 배지에서산을생산하여생성된콜로니주변이노란색으로변하는등젖산균의일반적인특징과잘일치하였다. Table 2. Species distribution of lactic acid bacteria isolated randomly from shellfishes Species A M T N C E G Total Lactobacillus salivarius Lactobacillus paracasei Lactobacillus pentosus Lactobacillus fermentum Pediococcus pentosacens 3 2 Total A: Isolated from Arca avellana Lamarck, M: Isolated from Mactra veneriformis Reeve, T: Isolated from Tapes phillipinarum, N: Isolated from Neptunea arthritica cumingi, C: Isolated from Turbo cornutus, E: Isolated from Mytilus edulis, G: Isolated from Crassostrea gigas 분리균주의동정분리한 28 종의균주에대하여 API 5CHL Kit 을이용한실험결과를웹프로그램을통해동정한결과는 Table 에나타내었다. 총 28 개의균주중 A3, 4, 5, T, E3, C, 3 의 7 개균주가 으로동정되었고, M2, N, 3, 4, 5, C5 의 6 개균주가, E2, G, 2, 4, C4 의 5 개균주가, A, 6, T4 의 3 개균주가, T2, E 의 2 개균주가 로동정되었다. 그외에는 E4 는 Pediococcus pentosaceu, E5 는 Lactobacillus paracasei, N2 는 Lactobacillus pentosus, M 은 Lactobacillus salivarius, C2 는 Lactobacillus fermentum 으로각각동정되었다. 28 개의균주중 D 형젖산을가장많이생산하는 E3 균주의경우 6S rrna gene sequencing 을이용하여추가동정결과, API 5CHL Kit 와같이 L. plantarum 으로재확인하였다 패류에서의젖산균종 (species) 의분포패류에서분리한젖산균 28 종을동정한결과를토대로하여패류에서의주요젖산균의종분포를살펴본결과는 Table 2 에나타내었다. 돌조개에서분리한 5 주중 Lactobacillus brevis 2 주, 3 주가동정되었다. 진

4 54 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 27: 556 (22) Table 3. Lactic acid productivities with lactic acid bacteria from shellfishes strain No. A A3 A4 A5 A6 M M2 T T2 T4 E E2 E3 E4 E5 N N2 N3 N4 N5 C C2 C3 C4 C5 G G2 G4 Species Lactobacillus salivarius Pediococcus pentosaceu Lactobacillus paracasei Lactobacillus pentosus Lactobacillus fermentum Lform lactic acid concentration (g/l) Dform lactic acid concentration (g/l) Total lactic acid concentration (g/l) A: Isolated from Arca avellana Lamarck, M: Isolated from Mactra veneriformis Reeve, T: Isolated from Tapes phillipinarum, N: Isolated from Neptunea arthritica cumingi, C: Isolated from Turbo cornutus, E: Isolated from Mytilus edulis, G: Isolated from Crassostrea gigas 주담치에서분리한 5 주는각각 주씩,,, Pediococcus pentosaceu, Lactobacillus paracasei 로동정되었다. 갈색띠매물고둥에서분리한 5 주중 Lactobacillus delbrueckii 4 주, Lactobacillus pentosus 주가동정되었다. 동죽에서분리한 2 주는 Lactobacillus salivarius, 로동정되었다. 바지락에서분리한 3 주는,, 로동정되었다. 소라에서분리한 5 주중 2 주, Lactobacillus fermentum,, 가각각 주씩동정되었다. 그리고굴에서분리한 3 주는모두 로동정되었다. Lee [9] 의연구결과를보면, 굴에서분리한젖산균의분포에서 Lactobacillus paracasei 가가장많았으며,, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus johnsonii 등이분포하는것을확인할수있었다 HPLC 에의한총젖산생산량확인동정된 28 주의젖산균을 MRS 배지에서배양하여, 대사물질로배양액에서생산되는총젖산량과젖산의형태별생산량을확인해보았다 (Table 3). 총젖산생산량을종별로보면, 에속하는 7 주는 g/l, 에속하는 6 주는 g/l, 에속하는 3 주는.83.2 g/l, Leuconostoc mesenteroides 에속하는 5 주는.63.7 g/l, Lactococcus lactis 인 2 주는.73.9 g/l 의젖산을생산하는것을확인할수있었다. Fu [3] 의연구결과를보면, Lactobacillus plantarum 은 37, ph 6 에서 525 시간발효후에총젖산이 2 g/l, Stenroos [4] 의연구에서는 Lactobacillus delbrueckii 가 2 시간발효후 L 형의젖산을 2 g/l, Garde [5] 의연구에서는 와 Lactobacillus pentosus 에서각각 9. g/l,.5 g/l 의젖산을생산하는것으로알려져있다. Lactobacillus salivarius, Pediococcus pentosaceu, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus pentosus 로동정된균주들은각각.9 g/l, 34.3 g/l, 34.4 g/l, 2.7 g/l,.6 g/l 의생산량을나타냈으며, 대부분 L 형의젖산을생산하고있었다. Ko [7] 의연구에서시판김치에서분리및동정된젖산균의젖산생산형태를보면,, Lactobacillus casei 에서는 L 형의젖산, Leuconostoc lactis, 에서는 D 형의젖산을주로생산하는것으로알려져있으며, Sung [6] 의연구결과에서,, Lactobacillus casei, Leuconostoc

5 패류로부터젖산세균의분리및특성 55 mesenteroides 에서 D 형젖산이주로생산되는것으로알려져있다. 본연구에서패류로부터분리 동정된젖산균의경우균주에따라서차이가있기는하지만, 기존에알려져있던젖산생산량보다많이생산하는균주들을확인할수있었다. 28 개의균주중 으로동정된 E3 균주의경우 D 형젖산을 2. g/l 를생산하여, 28 개의균주중 D 형젖산생산량이가장많았다 (Fig. ). 또한 으로동정된 G, 2, 4 의 3 주는 D 형젖산이.5.2 g/l 로 L 형젖산과비슷한생산량을보이는것을확인할수있었다. 4. 결론 패류로부터젖산을생산하는자연균주를분리 동정하고, HPLC 를통해생산되는젖산량을확인하고자하였다. 분리된균주는 MRS 배지에서배양되었으며, 형태학적관찰및생화학적특성을조사하였으며, API 5CHL kit 를통해균주를동정하였다. 분리된 28 개의균주를동정한결과, 7 개균주가, 6 개균주가 Lactobacillus delbrueckii, 5 개균주가, 3 개균주가, 2 개균주가 Lactococcus lactis 로동정되었다. 그외에 Pediococcus pentosaceu, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus fermentum 으로각각 균주씩동정되었다. 동정된 28 균주를배양하여생산되는젖산의형태및젖산생산량을확인해본결과, 균주에따라차이가있지만 g/l 의젖산을생산하는것을확인하였다. 28 균주대부분은 L 형의젖산을주로생산하였으며, Lactobacillus plantarum 으로동정된 E3 균주의경우 D 형젖산을 2. g/l 를생산하여 D 형젖산생산량이가장많았다. 또한 Leuconostoc mesenteroides 으로동정된 G, 2, 4 의 3 주는 D 형젖산이. 5.2 g/l 로 L 형젖산과비슷한생산량을보이는것을확인할수있었다. 차후본연구에서 D 형젖산을주로생산하는진주담치에서분리된 E3 균주에대해분자유적학적인방법으로젖산의생산에관여하는 lactate dehydrogenase (LDH) 유전자의과발현을진행하며, DL 형의젖산을생산하는굴에서분리된 G, 2, 4 의 3 균주에대해서는 L 형젖산을발현하는유전자의 knockout 을통해 D 형젖산의생산량과순도가증가되는것을확인해볼것이다. 감사 본논문은 ( 주 ) 현대엔지비와인하대학교의지원에의하여연구되었음. References Fig.. Determination of the configuration of Lactic acid converted from pyruvate using HPLC equipped with a chiral column. (a) Standard sample of Dform lactic acid, (b) standard sample of Lform lactic acid, (c) Dform lactic acid production from E3. 본연구를통해자연계인패류에서젖산균을분리하는방법과젖산의형태별생산량의확인결과자료는차후 PLA 의기초연구에참고자료로활용되길기대하며, 지속적으로자연계에서의젖산균의분리를진행하도록할것이다.. Korea Biotechnology Industry Organization. Bioproduct Market and Bio Technical Development Trend. (2). 2. Ikada, Y., K. Jamshidi, H. Tsuji, and S. H. Hyon (99) Stereocomplex formation between enantiomeric poly (lactides). Macromolecules. 2: Fukushima, K., K. Sogo, S. Miura, and Y. Kimura (24) Production of Dlactic acid by bacterial fermentation of rice starch. Macromol. Biosci. 4: Sandine, W. E., K. S. Muralidhara, P. R. Elliker, and D. C. England (972) Lactic acid bacteria in food and health: a review with special reference to enteropathogenic Escherichia coli as well as certain enteric diseases and their treatment with antibiotics and lactobacilli. J. Milk Food Technol. 35: 6972.

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1607 - 1 - - 2 - - 3 - 그림 1-4 - - 5 - 그림 3 농도에따른댓잎추출액의항세균효과 - 6 - 그림 4 한천확산법 그림 5 배지에균뿌리는과정 그림 6 배지에균스프레딩하는과정 표 1 실험에사용한미생물의종류와배양에사용한배지 Bacterial Strain Gram (+) bacteria Rothia dentocariosa G1201 Streptococcus

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