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1 J Appl Biol Chem (2015) 58(2), Online ISSN Print ISSN Original Article: Bioactive Materials Antioxidant and Anti-wrinkling Effects of Extracts from Vitex trifolia L. Mi-Kyoung Lee Dong-Hee Kim Tae-Soon Park Jun-Ho Son* 만형자추출물의항산화및주름개선효과 이미경ㆍ김동희ㆍ박태순ㆍ손준호 * Received: 15 January 2015 / Accepted: 13 February 2015 / Published Online: 30 June 2015 The Korean Society for Applied Biological Chemistry 2015 Abstract In this study, the antioxidant and anti-wrinkling effects of fraction from Vitex trifolia L. were investigated. Among the fractions, ethyl acetate fraction showed the highest antioxidant activities in 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl, 2,2'-azino-bis(3- ethylbenzothiazoine-6-sulfonic acid) radical scavenging and elastase inhibition with 76, 89, and 74%, respectively, at a concentration of 1,000 µg/ml. This fraction, at the concentration of 25 µg/ml, inhibited 70% fibroblast cell viability and 86% the matrix metalloprotease (MMP)-1. In addition, the results from Western blot assay showed that this fraction (25 µg/ml) expressed the MMP-1 protein level by decreasing 50%. The findings suggest that the ethyl acetate fraction from V. trifolia has great potential as a cosmeceutical ingredient with antioxidant and anti-wrinkling effects. Keywords 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl 2,2'-azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) anti-wrinkle elastase matrix metalloprotease-1 Vitex trifolia L. M.-K. Lee D.-H. Kim T.-S. Park J.-H. Son Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry, Gyeongbuk , Republic of Korea *Corresponding author (J.-H. Son: bio115@kotmin.kr) This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 서 론 피부는시간이지남에따라호르몬분비가감소하고, 면역세포의기능활성이저하되어생체구성단백질들의생합성이줄어들게되어생기는내인성노화와외적으로오염된공기와약물, 자외선에의한광노화로나눠진다 (Gilchrest, 1990; Ha, 2006). 노화가진행될수록피부를구성하는물질인 collagen, elastin, hyaluronic acid 등구조단백질을생성하는능력이감소하고 type-1 collagenase 의생합성이증가하여 matrix metalloproteinases (MMPs) 의발현이증가되면진피내교원섬유, 탄력섬유, fibronectin 및 laminin 과같은기질단백질분해를유도하여피부탄력을떨어뜨리고피부주름생성을야기한다 (Brenneisen 등, 2002). 최근연구에의하면 elastase 가피부탄력성섬유의 3 차원적뒤틀림에중요한역할을한다고보고되어있다 (Philips 등, 2007). Elastase 의활성증가는피부탄력섬유를감소시켜피부주름형성에기여한다고알려져있으며산화적스트레스는피부노화를더촉진하게된다 (Emerit, 1992; Tsukahara 등, 2006). 피부주름개선효과가있는다양한소재연구가활발하게진행되고있으며, 주름개선으로쓰이고있는물질로는 retinol, retinyl palmitate, adenosine, epigallocatechin gallate 이있다 (Maeda 와 Fukada, 1991; Kim 등, 2010). 만형자 (Vitex trifolia L.) 는마편초과의순비기나무의열매이다. 만형자의기원식물인순비기나무는독특하면서강한향기를가지고있어예전부터잎과가지는목욕용재료나실내의습기를제거하기위한흡습제및방매제로사용하였으며, 종자인만형자는두통을완화시키는효과가있다고하여민간에서는베갯속으로사용하였다. 또한우리나라를포함한중국과일본등동양의학에서만형자는성질이차고맛은쓰면서맵고독이없어강장, 진정, 진통, 소염작용이있어감기, 만성중이염, 이명, 난청, 시력장애, 두통, 신경통, 습진및다양한염증과알러지성질환의치료에사용하고있다 (Park 과 Lee, 2000). 만형자에관한연구로는 monoterpene 류를포함한약 76 종의정유성분과골수성백혈병저해효과를나타내는 flavonoids 와식물생장을조

2 126 J Appl Biol Chem (2015) 58(2), 절하는 phenol 화합물등이분리동정된바있다 (Kang 과 Kim, 1994; Ono 등, 2000; Xin 등, 2006). 따라서본연구에서는만형자추출물의피부노화를억제시키는항산화효과와피부탄력및주름개선에관련된콜라겐생합성촉진및분해억제효능을평가하여기능성화장품원료로서의사용가능성을살펴보고자하였다. 재료및방법 실험재료. 본실험에사용한만형자 (Vitex trifolia L.) 는 2014 년 2 월초순에 ( 주 ) 휴먼허브 (Korea) 에서구입하여실험재료로사용하였다. 실험에사용된시약. 추출및용매분획에사용한 ethyl alcohol (EtOH), n-hexane, ethyl acetate (EtOAc), methanol (MeOH), n-butanol (n-buoh) 등의용매는국내덕산 (18 L, 공업용, Korea) 제품을사용하였다. 항산화능측정실험과주름억제효과측정에사용된시약인 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), potassium persulfate, porcine pancreas elastase, n-succinyl-(l-ala) 3 p-nitroanilide, collagenase, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazliumbromide (MTT) 등은 Sigma-Aldrich (USA) 에서구입하여사용하였으며, MMP-1 활성을측정하기위하여 MMP-1 kit (Amersham Bioscience, USA), tumor necrosis factor-α (TNF-α) 는 Sigma-Aldrich 에서구입하여사용하였다. 추출및분획. 건조된시료 300 g 을분쇄기를이용하여잘게파쇄한후 70% 에탄올을 3L 을넣어상온에서 24 시간씩동일용매로 3 회반복추출한다음 filter paper (Whatman No. 2, Japan) 로여과한뒤감압농축기를이용하여에탄올을제거하여농축액 7.24 g 을얻었다. 이후용매추출법 (solvent extraction method) 을이용하여극성도가낮은 n-hexane 으로추출한후, 다시 ethyl acetate 와 butanol 용매로순차적으로추출하였다. 각용매추출분획을감압농축하여 n-hexane 가용분획 ( 약 0.65 g), EtOAc 분획 ( 약 1.21 g), n-buoh 분획 ( 약 1.56 g), H 2 O 가용분 ( 약 1.02 g) 각각얻었다. DPPH radical scavenging ability 측정. DPPH radical scavenging 에대한실험은 Blois 의방법 (Blois, 1958) 을변형하여 96 well plate 에맞게수정하여측정하였다. 각시료용액 100 µl 에 0.2 mm 의 DPPH 용액 50 µl 를넣고교반한후 10 분간방치한다음 517 nm 에서흡광도를측정하였으며, 시료용액의첨가구와무첨가구사이의흡광도의차이를백분율로나타냈다. 전자공여능 (%)=(1 시료첨가군흡광도 / 무첨가군흡광도 ) 100 ABTS radical scavenging activity 측정. ABTS radical scavenging 을이용한항산화력측정은 ABTS radical scavenging (Re 등, 1999) 에의하여측정하였다. 7 mm 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 와 2.45 mm potassium persulfate 를혼합하여실온에서 24 시간동안방치하여 ABTS 를형성시킨후 ethanol 로희석하여사용하였다. 각시료용액 50 µl 에희석한 ABTS 용액 100 µl 를가하여 5 분동안방치한후 734 nm 에서흡광도를측정하였다. 전자공여능 (%)=(1 시료첨가군흡광도 / 무첨가군흡광도 ) 100 Elastase 저해활성측정. Elastase 저해활성측정은 Cannell 의방 법 (Cannell 등, 1998) 에따라측정하였다. 기질로서 n-succinyl- (L-Ala) 3 -p-nitroanilide 를사용하여 37 o C 에서 30 분간기질로부터생성되는 p-nitroanilide 의생성량을 445 nm 에서측정하였다. 각시료용액을일정농도가되도록조제하여 40 µl 씩 96 well plate 에취하고, 50 mm tris-hcl buffer (ph 8.6) 에녹인 2.5 U/mL porcine pancreas elastase 용액을 40 µl 을가한후기질로 50 mm tris-hcl buffer (ph 8.6) 에녹인 n-succinyl-(l-ala) 3 -pnitroanilide (0.5 mg/ml) 을첨가하여 30 분간반응시켜측정하였다. Elastase 저해활성은시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타내었다. 효소활성저해 (%)=(1 시료첨가군흡광도 / 무첨가군흡광도 ) 100 세포주배양. 본실험에서사용한섬유아세포 CCD-986sk 세포는 ATCC 에서구입하여사용하였다. 세포독성측정및배양을위해 dulbecco s modified eagle medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), phosphate buffer solution (PBS), penicillin/streptomycin, 0.4% trypan blue stain 은 Gibco BRL Co. (USA) 에서구입하였으며, hemacytometer (Marienfeld, Germany), MMP-1 primary antibody 와 secondary antibody 는 santacruz (USA) 에서구입하였다. 본실험에이용한각세포의배양은 10% FBS 과 1% penicillin/streptomycin (100 U/mL) 을첨가한 DMEM 배지를사용하였으며, 37 o C, 5% CO 2 incubator 에적응시켜배양하였다. MTT assay 에의한세포생존율측정. 세포를 96 well plate 에 cells/well 이되게 180 µl 씩분주하고, PBS 을첨가한다음자외선을조사하고시료를농도별로 20 µl 처리한후 37 o C, 5% CO 2 incubator 에서 48 시간배양하였다. 배양후 5mg/mL 농도로제조한 MTT 용액 20 µl 를첨가하여 3 시간배양한후배양액을제거하고각 well 당 DMSO 150 µl 를가하여실온에서 30 분간반응시킨뒤 microplate reader (Gen5, Bio-Tak Instruments, Inc., USA) 로 540 nm 에서흡광도를측정하였다. MMP-1 저해활성측정. 96 well plate 에각 well 당 cells/well 세포가되도록심어준후 24 시간을안정화하였다. 이후, 배양된배지를제거하고 PBS 을첨가한다음자외선을조사하고이때 MMP-1 의활성을높이기위하여 TNF-α 를 10 ng/ ml 의농도로첨가하고시료를농도별로처리한후 48 시간을배양하였다. 세포의배양액을수거하여실험에사용하였으며 Gross B.E. 등의방법 (Gross 와 Lapiere, 1962) 에따라 MMP-1 biotrack activity assay kit (Amersham Bioscience, USA) 을이용하여측정하였다. Western blot 을이용한단백질의발현측정. MMP-1 활성을보기위하여 cell line (CCD-986sk) 을 6 well 에 cells/well 이되도록분주하고 24 시간동안배양하였다. 배지를제거한후각 well 에시료를 48 시간동안처리한뒤 PBS 로 2 번세척해주었다. Lysis buffer 를이용하여 CCD-986sk 세포를용해시키고, 4 o C 12,000 rpm 에서 20 분간원심분리하였다. 원심분리하여얻은상층액은 Bradford assay 로정량하여 20 µg 의단백질을 10% 의 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis gel 에서전기영동하여분리하였다. 분리된단백질은 PVDF membrane 에옮긴다음실온에서 1 시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST) 에서 incubation 시켰다. MMP-1 각각의 1 차항체를 1:1000 으로희석하여 4 o C 에서 over night 한다음, 다시 10 분간격으로 TBST 로 3 회 washing 하고 mouse anti-rabbit IgG HRP 의각각의 2 차항체를 1:1,000 로희석하여실온에서 1 시간동안붙이고, 3 회 washing 한뒤 LAS 4,000 image

3 J Appl Biol Chem (2015) 58(2), Fig. 1 DPPH scavenging activity of fractions from Vitex trifolia L.. VR- H: Hexane layer, VR-EA: Ethyl acetate layer, VR-B: Butanol layer, VR- W: Water layer, vit. C: Ascorbic acid. Values are means of 3 replicates and those with different alphabet letters are significantly different at p <0.05. Fig. 2 ABTS cation radical activity of fractions from Vitex trifolia L.. VR-H: Hexane layer, VR-EA: Ethyl acetate layer, VR-B: Butanol layer, VR-W: Water layer, vit. C: Ascorbic acid. Values are means of 3 replicates and those with different alphabet letters are significantly different at p <0.05. analyzer (Fugifilm life science, Japan) 기기를이용하여밴드확인및정량하였다. 통계처리. 결과통계처리는 SPSS 10.0 을사용하였으며, 유의차검증은분산분석 (ANOVA: analysis of variance) 프로그램을이용하여 t-test 를이용하여통계적유의수준 p <0.05 에서검증하였다. 결과및고찰 DPPH radical scavenging ability 측정. DPPH 는짙은보라색을띄는비교적안정한 free radical 로서항산화제, 방향족아민류등에의해환원되어색이탈색이되는데이것은다양한천연소재로부터항산화물질을탐색하는데많이이용되고있다 (Kim 등, 1995; Aoshima 등, 2004). 본실험에서는만형자분획물의항산화효과를알아보기위하여 DPPH 를이용하여항산화효과를측정한결과 (Fig. 1), 1,000 µg/ml 에서 n-hexane 분획물의경우 46%, ethyl acetate 분획물 76%, butanol 분획물 37%, water 분획물이 29% 를나타내었으며, 대조군인 vitamin C (vit. C) 에서는 1000 µg/ml 에서 95% 의전자공여능을나타내었다. 만형자 ethyl acetate 분획물에서 DPPH free radical 소거율이높게나타나는것을확인할수있었다. ABTS radical scavenging activity 측정. ABTS radical scavenging 는 ABTS 와 potassium persulfate 와의반응으로생성된 ABTS + radical 이시료중의항산화물질에의해제거되어 radical 특유의청록색이탈색되는정도를 734 nm 에서흡광도를측정하였다 (Jeong 등, 1994). 만형자분획물의 ABTS radical scavenging 을측정한결과 (Fig. 2), 1,000 µg/ml 에서 n-hexane 분획물의경우 47%, ethyl acetate 분획물 89%, butanol 분획물 72%, water 분획물이 52% 를나타내었으며, 대조군인 vit. C 에서는 1,000 µg/ml 에서 95% 의전자공여능을나타내었다. 만형자분획물중 ethyl acetate 분획물이가장강한활성을나타내는것을확인할수있었다. Elastase 활성저해효과. Elastase 는단백질인엘라스틴을분해하는효소로다른중요한기질단백질인콜라겐을분해할수 Fig. 3 Elastase inhibition rate of fractions from Vitex trifolia L.. VR-H: Hexane layer, VR-EA: Ethyl acetate layer, VR-B: Butanol layer, VR-W: Water layer, EGCG: Epigallocate chin-3-gallate. Values are means of 3 replicates and those with different alphabet letters are significantly different at p <0.05. 있는비특이적가수분해효소이다. 피부의진피조직속에서는콜라겐과피부의탄력성에관련된엘라스틴이그물망구조로형성하고있는데, 엘라스틴이 elastase 에의해분해되어피부의그물망구조결합이끊어짐으로, elastase 가주름생성의주원인효소로알려져있다 (Kligman, 2000). 이러한주름생성과관련된 elastase 저해활성을측정한결과 (Fig. 3), 만형자분획물 1,000 µg/ml 에서 butanol 분획물 9%, water 분획물 8% 의낮은활성을나타낸반면 n-hexane 분획물에서는 1,000 µg/ml 농도에서 52% 저해활성을나타내었고, 특히만형자 ethyl acetate 분획물의경우 1,000 µg/ml 농도에서 74% 저해활성을나타내었다. 동일농도대조군인 EGCG (Epigallocatechin-3-gallate) 와비교시같은농도에서 elastase 저해활성이 62% 나타내었다. 만형자 ethyl acetate 분획물이대조군인 EGCG 보다 elastase 저해활성이더욱우수하는것을확인할수있었다. Fibroblast cell (CCD-986sk) 의생존율확인. 섬유아세포에서만형자분획물의처리가세포증식에미치는영향을확인하기위하여 MTT assay 를이용한세포생존율을측정하였다 (Fig. 4). 만형자 n-hexane, ethyl acetate, butanol, water 분획물을농도

4 128 J Appl Biol Chem (2015) 58(2), Fig. 4 Cell viability effects of Vitex trifolia L. fractions on fibroblast cell (CCD-986sk). CCD-986sk cells ( cells) were started in medium for 24 h the cells were treated with 5, 10, 15, 20, 25 µg/ml of fractions of Vitex trifolia L. for 48 h. VR-H: Hexane layer, VR-EA: Ethyl acetate layer, VR-B: Butanol layer, VR-W: Water layer. 별로 48 시간처리한결과 ethyl acetate 분획물 5, 10, 15, 20, 25 µg/ml 농도구간에서 100% 에가까운세포생존율을확인하였다. 따라서본실험에서는섬유아세포에만형자분획물 5, 10, 25 µg/ml 의농도로처리하여 MMP-1 저해활성측정과단백질발현실험을하였다. MMP-1 저해활성측정. 체내에서생성되는수종의 MMPs 가운데 MMP-1 은 collagen 에특이적으로작용하는 protease 로서 MMP-1 의활성을억제하여 collagen 의분해를감소시키면, 피부조직의탄력을유지하고주름생성을예방할수있는것으로알려져있다 (Talwar 등, 1995; Nagase 와 Woessner, 1999). 본연구에서만형자분획물이 MMP-1 생성에미치는영향을평가한결과 (Fig. 5), UV-B 를처리하지않은군과처리한군은각각 52, 100% 의 MMP-1 을생산하여 UV-B 를처리함으로써 MMP- 1 양이활성화됨을확인할수있었다. 만형자 ethyl acetate 분획물 25 µg/ml 에서 14% 의 MMP-1 의발현저해효과를나타내었다. 본연구결과를통해만형자 ethyl acetate 분획물이피부탄력및주름개선효능에기여할것으로판단된다. MMP-1 유전자발현의억제. MMPs 는활성중심부에아연을갖는금속단백질분해효소로서현재까지약 20 여종이상의종류가있는것으로알려져있으며, 구조와기능에따라 interstitial, collagenase, gelatinase, stromelysin, membrane type MMP 등으로구분하기도한다 (Nagase 와 Woessner, 1999). MMP- 1 은 collagenase 1 으로알려져있으며, type I 과 III collagen 을기질로하며, stromelysin 1 라고도불리는 MMP-3 은기저막의 type IV collagen 을분해하며 zymogen 인 pro MMP-1 을활성화시키는데, 이러한 MMPs 의발현증가는자외선에의해유도된다 (Fisher, 1996). 본연구에서는 MMPs family 중 MMP-1 의단백질발현을보기위하여 MMP-1 의단백질발현을만형자 ethyl acetate 분획물처리군에서 MMP-1 의 protein 발현모두 5, 10, 25 µg/ml 의농도의존적으로억제되는것을확인하였다 (Fig. 6). 따라서만형자 ethyl acetate 분획물이주름생성억제활성을보이는것으로판단된다. Fig. 5 MMP-1 inhibition rate of ethyl acetate fraction from Vitex trifolia L. on fibroblast cell (CCD-986sk). The cells were treated with various concentrations of ethyl acetate fraction for 48 h. The contents of MMP-1 in culture media was determined by the MMP-1 ELISA kit as detailed under the materials and methods. The data represent the mean ± SD of three separate experiments (Significant as compared to control. *p <0.05). Fig. 6 MMP-1 protein expression rate of Vitex trifolia L. on fibroblast cell (CCD-986sk). CCD-986sk cells ( cells) were started in medium for 24 h. The cells were treated with 5, 10, 25 µg/ml of ethyl acetate fraction of Vitex trifolia L. for 48 h. Histogram show the densitometry of MMP-1 protein normalized to β-actin. The data represent the mean ± SD of three separate experiments (Significant as compared to control. *p <0.05).

5 J Appl Biol Chem (2015) 58(2), 초 록 본연구에서는만형자분획물의항산화및주름개선효과에대하여알아보고자하였다. 만형자 ethyl acetate 분획물은 DPPH, ABTS 에서우수한항산화활성을나타내었으며, 주름개선효과를검증하기위하여 elastase 저해활성을측정한결과 1,000 µg/ ml 에서 74% 저해활성을나타내었다. 만형자 ethyl acetate 분획물의세포생존율을확인하기위하여섬유아세포로 MTT assay 에의해확인한결과 5, 10, 15, 20, 25 µg/ml 의농도구간에서 100% 에가까운세포생존율을확인하였다. 만형자 ethyl acetate 분획물의 MMP-1 저해활성을측정한결과 25 µg/ml 에서 14% 의저해효과를나타내었으며, 만형자 ethyl acetate 분획물의 MMP-1 의단백질발현억제효과를확인한결과 25 µg/ ml 의농도에서 50% 감소하였다. 이러한결과로보아만형자 ethyl acetate 분획물의주름개선효과를확인할수있으며, 천연기능성화장품소재로서의가능성을확인하였다. Keywords 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl 2,2'-azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) anti-wrinkle elastase matrix metalloprotease -1 Vitex trifolia L. References Aoshima H, Tsunoue H, Koda H, and Kiso Y (2004) Aging of whiskey increases 1,1 diphenyl-2picrylhydrazyl radical scavenging activity. J Agric Food Chem 52, Blois MS (1958) Antioxidant determinations by the use or a stable free radical. Nature 181, Brenneisen P, Sies H, and Scharffetter-Kochanek K (2002) Ultraviolet-B irradiation and matrix metalloproteinases:from induction via signaling to initial events. Ann N Y Acad Sci 973, Cannell RJ, Kellam SJ, Owsianka AM, and Walker JM (1998) Results of a large scale screen of microalgae for the production of protease inhibitors. Planta Med 54, Emerit I (1992) Free radicals and aging of the skin. In Free Radicals and Aging, Emerit I and Chance B (eds), pp , Experientia Supplementum, Birkhauser Basel, Switzerland. Fisher GJ, Datta SC, Talwar HS, Wang ZQ, Varani J, and Kang S (1996) Molecular basis of sun-induced premature ageing and retinoid antagonism. Nature 379, Gilchrest BA (1990) Skin aging and photoaging. Dermatol Nurs 2, Gross J and Lapiere CM (1962) Collagenolytic activity in amphibian tissues: a tissue culture assay. Proc Natl Acad Sci USA 54, Ha TY (2006) Development of functional food materials for healthy life. Korean J Crop Sci 51, Jeong JW, Lee YC, Jung SW, and Lee KM (1994) Flavor components of citron juice as affected by the extraction method. Korean J Food Sci Technol 26, Kang SS and Kim SJ (1994) Phytochemical Analysis of Viticis Fructus. Korean J Pharmaco gn 98, Kim BY, Kim TG, Kang WY, Baek H, Cheon HY, and Kim D (2010) Functional cosmetic effect of porcine placenta. Korean Chem Eng Res 48, Kim HK, Kim YE, Do JR, Lee YC, and Lee BY (1995) Antioxidative activity and physiological activity of some Korean medicinal plants. Korean J Food Sci Technol 27, Kli gman D (2000) Cosmeveuticals. Dermatol Clin 18, Maeda K and Fukada M (1991) In vitro effectiveness of several whitening cosmetic components in human melanocytes. J Soc Cosmet Chem 42, Nagase H and Woessner JF (1999) Matrix metalloproteinases. J Biol Chem 274, Ono M, Sawamura H, Ito Y, and Mizuki K (2000) Diterpenoids from the fruits of Vitex trifolia. Phytochemistry 55, Park JH and Lee CK (2000) The Encyclopedia of Medicinal Plants. Shinilbooks. Korea. Philips N, Keller T, Hendrix C, Hamilton S, Arena R, Tuason M et al. (2007) Regulation of the extracellular matrix remodeling by lutein in dermal fibroblasts, melanoma cells, and ultraviolet radiation exposed fibroblasts. Arch Dermatol Res 299, Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Yang M, and Rice-Evans C (1999) Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biol Med 26, Talwar HS, Griffiths CE, Fisher GJ, Hamilton TA, and Voorhees JJ (1995) Reduced type I and type III procollagens in photodamaged adult human skin. J Invenst Dermatol 105, Tsukahara K, Nakagawa H, Moriwaki S, Takema Y, Fujimura T, and Imokawa G (2006) Inhibition of ultraviolet-b-induced wrinkle formation by an elastase-inhibiting herbal extract: implication for the mechanism underlying elastase-associated wrinkles. Int J Dermatol 45, Xin YH, Zhang QY, and Huang BK (2006) Study on chemical constituents in fruits of Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham. Arch Pharm Res 29,

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