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서화 독고
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1 KISEP Original Article 臨床耳鼻 : 第 16 卷第 2 號 2005 J Clinical Otolaryngol 2005;16: 비용에서세포고사체및 Bax 와 Bcl-2 의발현에관한연구 강일규 1 황유진 2 하종수 1 김동규 1 김선태 1 Expression of Apoptosis, Bax and Bcl-2 in Nasal Polyps Il-Gyu Kang, MD 1, Yu-Jin Hwang, PhD 2, Jong-Su Ha, MD 1, Dong-Gyu Kim, MD 1 and Seon-Tae Kim, MD 1 1 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery and 2 Molecular Biololy Laboratory, Gil Medical Center, Gachon Medical School, Incheon, Korea - ABSTRACT - Background and Objectives:Apoptosis is a programmed cell death and an active regulatory response by physiologic stimuli. Eosinophils are predominanat cells in the nasal polyp. However whether the apoptosis of the eosinophils could contribute to the increased numbers of eosinophils in the nasal polyp is not completely known. We have studied to reveal the relationship between the increase in the number of eosinophils and apoptosis. Materials and Methods:Subjects are 15 non-allergic nasal polyps and 10 normal inferior turbinates. We have used TUNEL method for apoptosis study and RT-PCR was used for the Bax and Bcl-2. Results:The apoptotic cell ratio (apoptotic cell numbers/total cell numbers) was in normal turbinate compared to 0.05 in nasal polyp (p=0.056). The apoptotic cell ratio was higher in normal turbinate compared to that of nasal polyp. The apoptotic bodies of eosinophils in nasal polyp were very scanty. The RT-PCR showed that Bax was increased in normal turbinate, however Bcl-2 was increased in nasal polyp. These results suggest that the apoptosis of eosinophils in nasal polyp was decreased compared to the normal turbinate. Conclusion:Apoptosis may be one of the contributing factors for the increased numbers of eosinophils in nasal polyp. (J Clinical Otolaryngol 2005; 16: ) KEY WORDS:Nasal polyps Apoptosis Bax Bcl-2. 서 론 264

2 - 대상및방법 대상 방법

J Clinical Otolaryngol 2005;16: 264-269 을 연장시켰다. 음성 대조군으로는 cdna대신 증류수와 사 반응을 시행하였다. 반응액을 혼합한 것을 사용하였다.

5 mm dntps, 각각의 Bax, Bcl-2 및 GAPDH RNA의 파괴여부 및 상대적 정량비를 구하기 위하여 대 의 sense와 antisense primer 20 ρmol, Taq polyme- 조군으로 GAPDH(glyceraldehydes-3-phosphate de- rase, 증류 수등을 넣어 중합효소 연쇄반응에 사용하였다

3 J Clinical Otolaryngol 2005;16: 을 연장시켰다. 음성 대조군으로는 cdna대신 증류수와 사 반응을 시행하였다. 반응액을 혼합한 것을 사용하였다. 최종 중합효소 연쇄반 응 산물을 2% agarose gel에서 전기영동을 한 후 ethi- 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 5 μl의 cdna에 10x PCR reaction buffer, 25 mm dium bromide용액으로 30분간 염색하여 확인하였다. 총 MgCl2, 2.5 mm dntps, 각각의 Bax, Bcl-2 및 GAPDH RNA의 파괴여부 및 상대적 정량비를 구하기 위하여 대 의 sense와 antisense primer 20 ρmol, Taq polyme- 조군으로 GAPDH(glyceraldehydes-3-phosphate de- rase, 증류 수등을 넣어 중합효소 연쇄반응에 사용하였다 hydrogenase)을 사용하였다. (Table 2). 중합효소 연쇄반응은 Gene Amp PCR sys- 통계학적 분석은 SPSS 7.5 for Windows(version 7.5, tem 2400(Perkin Elmer)에서 94 에서 5분간 변성시 SPSS Inc., Chicago, USA)을 이용하여 paired t-test 킨 후 94 에서 45초, 55 에서 30초, 72 에서 1분 주 를 시행하였고 p값이 0.05이하인 경우 통계학적으로 유 기로 약 35회 증폭한 후 최종 72 에서 약 7분간 반응 의하다고 하였다. Table 1. Apoptotic cell counts in nasal mucosa Apoptotic cells/total cells (ratio) Apoptotic cells/hpf ( 400) Control turbinate ±2.5* Nasal polyp * p< ±0.2* 결 과 세포고사체의 검출 세포고사체의 전체적인 수는 비용에서 평균 2.1±0.2/ HPF, 정상 하비갑개에서 8.2±2.5/HPF로 비용에서 의 미있게 낮은 수치를 보였으며, 또한 총 염증세포수에 대 Table 2. Primer sequences for PCR 한 세포고사체 수의 상대적인 비(세포고사비율)은 비용 5 ATG GAC GGG TCC GGG GAG CAG 3 Antisense 5 CAG TTG AAG TTG CCG TCA GA 3 Bcl-2 Sense 5 AGC TGC ACC TGA CGC CCT TCA 3 Antisense 5 AGC CAG GAG AAA TCA CAG AGG 3 GAPDH Sense 5 ATA GGA TCC GTG GAC ATT GTT GCC ATC AAC GAC CCC 3 Antisense 5 ATA GGA TCC GCC CCA GCC TTC TCC ATG GTG GT 3 GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Bax A Sense 에서 0.05, 정상 하비갑개에서 0.147로 정상에서 높게 나 왔지만 의미있는 차이를 보이지는 않았다(Table 1). 비용에서 H-E 염색상 호산구로 확인한 후 연속절편 에서 시행한 TUNEL염색상 이들과 유사한 부위에서 호산 구들에 대한 세포고사체의 발견은 드물었다(Figs. 1 and 2). Bax와 Bcl-2 mrna의 발현 세포고사를 증가시키는 인자인 Bax mrna는 정상군 에서, 세포고사를 억제하는 인자인 Bcl-2는 비용군에서 Fig. 1. In Situ apoptosis detection in normal turbinate. A Inferior turbinate shows some inflammatory cells in epithelium and stroma (H-E, 200). B Many apoptotic bodies are shown (arrows) in epithelial and stroma area (TUNEL stain, 200). B 266

강일규 외 비용에서 세포고사체 및 Bax와 Bcl-2의 발현에 관한 연구 Fig. 2. In Situ apoptosis detection in nasal polyp. A Nasal polyp shows many eosinophils (arrows), (H-E, 200).

Densitometry of Bax and Bcl-2 mrna expression Bax 320 bp Bax/ G Control turbinate Bcl-2 290 bp 3 4 5 6 7 8 Bax/ Bcl-2 0.79±0.17 0.35±0.11 1.40±0.43* Nasal polyp 0.47±0.15 0.50±0.12 0.96±0.11* * p<0.

3. RT-PCR of Bax, Bcl-2 in nasal mucosa. Bax was increased in control inferior turbinate, Bcl-2 was increased in nasal polyp (Normal inferior turbinate lane 1-6, Nasal polyp lane 7-12).

4 강일규 외 비용에서 세포고사체 및 Bax와 Bcl-2의 발현에 관한 연구 Fig. 2. In Situ apoptosis detection in nasal polyp. A Nasal polyp shows many eosinophils (arrows), (H-E, 200). B A few apoptotic bodies are present in subepithelial and stroma area (arrow), (TUNEL stain 200). A B Table 3. Densitometry of Bax and Bcl-2 mrna expression Bax 320 bp Bax/ G Control turbinate Bcl bp Bax/ Bcl ± ± ±0.43* Nasal polyp 0.47± ± ±0.11* * p<0.05, G GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) GAPDH 267 bp M 1 2 Bcl-2/ G cells/hr)로 적당한 숫자를 유지하고 기관의 항상성을 유 지하는데 중요한 역할을 한다.1)9) 그러나 병적 상태에서 P N 는 여러가지 생존인자가 많이 생산되어 정상적으로 일어 Fig. 3. RT-PCR of Bax, Bcl-2 in nasal mucosa. Bax was increased in control inferior turbinate, Bcl-2 was increased in nasal polyp (Normal inferior turbinate lane 1-6, Nasal polyp lane 7-12). GAPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. 나는 세포고사가 억제되면서 조직내에 염증세포가 많이 축 적되는 양상을 보이게 된다.7) 비용에서 호산구를 분리한 후 배양시킨 호산구의 세포 고사 연구에서 처음 7일간의 배양에서는 세포고사체를 발 높게 나왔다(Fig. 3). 이들의 농도를 densitometer로 측 견할 수 없었고 12일째에서도 약 50%에서 세포고사 소 정하여 hosue keeping gene인 GAPDH와 비교한 결과, 견을 보이지 않았다고 하였다. 이에 비해 대조군인 하비 Bax/G는 control군에서 Bcl-2/G는 비용군에서 비교적 갑개에서는 3일째에 모든 남아있는 호산구에서 세포고사 높게 나왔으나 양군간의 유의한 차이는 보이지 않았다. 를 볼 수 있었다고 하여 비용에서 세포고사가 억제됨을 그러나 Bax/Bcl-2 비가 정상군보다 비용군에서 의미있 보여주었다.1) 또한 비용에서 anti-il5 mab를 넣은 상 게 낮게 나와 비용에서 세포고사를 억제하는 Bcl-2가 증 태에서의 배양결과 호산구의 사멸이 의미있게 증가되어 가되 있음을 알 수 있었다(Table 3). IL-5가 세포고사를 억제하는 중요한 cytokine임을 밝혀 졌다.10) 지금까지 알려진 바로는 비용내에 증가되어 있는 고 찰 IL-3, IL-5, GM-CSF 등의 cytokine 등이 호산구의 세포고사를 억제하고 생존을 연장시키는 인자로 알려져 있 본 실험에서는 비용에서는 대조군에 비해 세포고사체 다.1)10-14) 본 실험의 결과는 TUNEL 염색을 이용하여 수의 감소가 보이며 특히 비용에 존재하는 호산구에 대한 비용내에 존재하는 호산구의 세포고사체를 직접 관찰하 세포고사가 감소된 소견을 보여주었다. 고자 하였고, 이러한 호산구의 세포고사가 억제되어 더 많 일반적으로 세포고사(apoptosis)는 정상적인 상태에서 9 조직내에 존재하는 세포가 매우 빠른 교체속도( 은 호산구가 비용내에 증가하면서 비용형성에 영향을 줄 수 있음을 보여주었다. 267

5 J Clinical Otolaryngol 2005;16: 결 중심단어 REFERENCES 1) Simon HU, Yousefi S, Schranz C, Schapowal A, Bachert C, Blaser K. Direct demonstration of delayed eosinophil apoptosis as a mechanism causing tissue eosinophilia. J Immunol 1997;158: ) Stoop AE, van der Heijden HA, Biewenga J, van der Baan S. Eosinophils in nasal polyps and nasal mucosa: an immunohistochemical study. J Allergy Clin Immunol 1993;91: ) Zhang S, Mohammed Q, Burbidge A, Morland CM, Roche WR. Cell cultures from bronchial subepithelial myofibroblasts enhance eosinophil survival in vitro. Eur Respir J 1996;9: ) Xaubet A, Mullol J, Lopez E, Roca-ferrer J, Rozman M, Carrion T, et al. Comparison of the role of nasal polyp and normal nasal mucosal epithelial cells on in vitro eosinophil survival: mediation by GM-CSF and inhibition by dexamethasone. Clin Exp Allergy 1994;24: ) Simon HU, Blaser K. Inhibition of programmed eosinophil death: a key pathogenic event for eosinophilia? Immunol Today 1995;16: ) Walsh GM. Mechanisms of human eosinophil survival apoptosis. Clin Exp Allergy 1997;27: ) Chao DT, Korsmeyer SJ. BCL-2 family: regulators of cell death. Annu Rev Immunol 1998;16: ) Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol 1992;119: ) Ebisawa M, Yamada T, Bickel C, Klunk D, Schleimer RP. Eosinophil transendothelial migration induced by cytokines. III. Effect of the chemokine RANTES. J Immunol 1994;153: ) Yamaguchi Y, Suda T, Ohta S, Tominaga K, Miura Y, Kasahara T. Analysis of the survival of mature human eosinophils: interleukin-5 prevents apoptosis in mature human eosinophils. Blood 1991;78: ) Yousefi S, Blaser K, Simon HU. Activation of signaling pathways and prevention of apoptosis by cytokines in eosinophils. 론 268

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence