특집 1 Lentiviral delivery system 에관한모든것은클론텍에서 Lenti-X TM Expression System [1] 클론텍의 Viral Gene Delivery Systems 클론텍은어떤세포에도적용할수있는모든바 이러스시스템을갖추고있다. Lenti

Transcription

1 Life Science & Biotechnology TaKaRa Membership Magazine March 2009 Vol. 44 ATTO AB-2550 Kronos Dio March 2009 Contents 특집 1. Lentiviral delivery system 에관한모든것은클론텍에서 2 Lenti-X Expression System 2. Yeast Two-Hybrid 시스템의결정판 8 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System Cover Story 한국전통의멋을느낄수있는전통방식의화로에서세계속 의한국을알리고, 우리한국의정서와아름다움을느낄수 있다. 사람들로부터가장아낌을받았던물건중의하나인 것처럼, 슬기로운힘을담아큰도움이되고자노력하는다 카라코리아가되겠습니다. 디자이너조경미 staff 발행인 윤경묵 편집인 이경미 디자인 조경미 발행처 다카라코리아바이오메디칼 ( 주 ) 주소 서울특별시금천구 가산동뉴티캐슬 601호 전화 / 팩스 / 홈페이지 Technical Tip 1. ProteoTuner TM System 의응용예 14 분비형단백질발현과 Knockout Phenotype 회복의정확한조절 2. 세포내바이러스도입효율을획기적으로높이는시약 18 RetroNectin R Reagent 3. ToxiLight R 와 ViaLight Plus R 를이용한 AK 및 ATP 모니터링 20 HUVEC 에서 DNA Topisomerase I 억제제인 Camptothecin 의영향측정 주목의신상품 1. CellAmp Direct RNA Prep Kit for RT-PCR (Real Time) SYBR R Premix DimerEraser (Perfect Real Time) E. coli HST08 Premium Competent Cells tdtomato-brightest Red Fluorescent Protein In-Fusion Advantage PCR Cloning Kits HisTALON Cartridge ATTO Light-Capture 43 TaKaRa 소식 / 신규판매점소개 46 신제품안내 47 License Notice 48

2 특집 1 Lentiviral delivery system 에관한모든것은클론텍에서 Lenti-X TM Expression System [1] 클론텍의 Viral Gene Delivery Systems 클론텍은어떤세포에도적용할수있는모든바 이러스시스템을갖추고있다. Lentiviral 이나 retroviral 또는 adenoviral systems 중에서선택가능 모든시스템이고발현구조를갖고있으며 inducible 시스템은옵션 바이러스생산이나형질전환유전자의발현 을형광이나선별마커로추적가능 바이러스 titration kit it 나 adenovirus purifica uri ica tion kit [2] 고효율의 Lentiviral Packaging System Lenti-X HT Packaging System 은다른렌티바이 러스벡터와병행하여도높은바이러스 titer 를 생산할수있다. 다른어떤패키징시스템보다도 25~50 배이상 의높은 titer 48 시간내에 VSV-G pseudotype 의렌티바이러 스를형성 독특한패키징구조로설계되어자가복제를 억제하기때문에안전한바이러스를생산 바이러스상청액 10 ul 만으로도플레이트내 의타겟세포를충분히감염 재조합렌티바이러스는 primary cultures 나비분 열세포, 줄기세포등을포함한거의모든종류 의포유류세포에유전자를도입시킬수있는대 표적인바이러스벡터이다. 클론텍의 Lenti-X system vector 와 Lenti-X HT Packaging System 을함께사용한다면다른어떤렌티바이러스시 스템보다도더높은 titer 의바이러스를생산할 수있으며, 특히 packaging system 은기존의다 른렌티바이러스시스템보다최고 50 배이상의 효율을나타낸다. 그예로, 비농축상층액 1 ml 당 5 x 10 8 IFU (infectious units) 까지생산할수 있다. 표 1. 클론텍의 Viral Gene Delivery Systems Lenti-X Retro-X Adeno-X Target Cells Cell Lines (Dividing) o o o Primary Cultures (Dividing) o o o Primary Cultures (Nondividing) o o Neurons o o Stem Cells o o o Transgene Expression Stable o o 1 Transient o Constitutive o o o Inducible o o o Bicistronic/Dual Expression o o Expression Levels oo oo ooo Fluorescent Fusion Proteins o o Fluorescent Marker Virus o o o shrna/rnai o o o System Features High Titers oo oo ooo Safe, Replication-Incompetent o o o Broadly Tropic o o o Titration Kits o o o Purification Kits o Custom Services o Long-Term Stability/Storage o 1 Stable in nondividing cells 시너지효과에의한최고의성능실현 Lenti-X HT Packaging System 의뛰어난바이러 그림 1. The Lenti-X HT Packaging System. A lentiviral vector (e.g. plvx-puro) and the Lenti-X HT Packaging Mix are cotransfected into 293T cells using the highly efficient Lentiphos HT transfection system. High titer supernatants are ready for use 48 hr after transfection. 2 Life Science & Biotechnology

3 특집 1 스생산은최적화된시스템구성성분들간의시너지효과에의한것이다 ( 그림 1). 첫째, 클론텍의새로운 Lenti-X HT Packaging Mix는 Gag-Pro, Tat, Rev, RT, IN과 VSV-G proteins을높은레벨로발현하는벡터에의해필수적인렌티바이러스패키징구성요소를완벽하게제공한다 1). 이처럼여러단백질들이분리된유전자로부터발현됨으로써바이러스의안전성을강화시키고, 또한플라스미드가이상적인비율로배합되어있어바이러스생산성을극대화시킨다. A B Constitutive cdna Expression Inducible cdna Expression RRE cppt /CTS 5' LTR Ψ WPRE P CMV IE MCS 3' LTR P Puro r PGK plvx-puro * P CMV IE rtta-adv IRES Neo r Lenti-X vector elements plvx-tet-on Advanced * 둘째, titer를더높이기위해 Tet-Off transactivator (tta) 를발현하는벡터를포함시켰다. 이벡터는테트라사이클린에반응하는프로모터가있어중요한바이러스단백질이고발현되도록유도한다. 셋째, 클론텍의 Lentiphos HT transfection sys tem은목적렌티바이러스벡터와함께혼합된 Lenti-X HT Packaging Mix의플라스미드가고효율로 293T cells에도입되도록한다. 이와같이, Lenti-X HT Packaging System의진보된구성요소의탁월한조합으로클론텍의 Lenti-X System 벡터와병행사용시 293T cells 에서고효율의안전한렌티바이러스를생산할뿐만아니라, 다른어떤렌티바이러스벡터와사용시에도고효율의렌티바이러스를생산하도록설계되었다. Lenti-X vectors 뛰어난발현능과도입효율을지닌바이러스를최상의 titer로생산하기위해선클론텍의 Lenti-X System 벡터를사용해야한다 (plvx- Puro; 그림 1). 이벡터는바이러스게놈프로세싱서열 (viral genome processing sequences) 을모두포함할뿐만아니라벡터의기능과발현을향상시킬수있는구성요소를가지고있다. RNA processing과핵외로내보내도록활성화시키는 WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element) 는 titer를높이도록바이러스게놈전사체의패키징을향상시킬뿐만아니라도입된유전자 (transgene) shrna Expression for RNAi P CMV IE tta-adv IRES Neo r P Tight P PGK plvx-tet-off Advanced * plvx-tight-puro * F P Neo/Hyg plvx-ires-puro/neo/hyg * CMV IE IRES Puro r Puro r C Puro r plvx-shrna1 * ProteoTuner Protein Control P U6 P PGK P U6 P CMV IE ZsGreen1 plvx-shrna2 ** D P plvx-ptuner ** CMV IE DD IRES Puro r Fluorescent Tag Expression P CMV IE DD IRES ZsGreen1 plvx-ptuner Green ** E AcGFP1 Puro r plvx-acgfp1-n1 & -C1** Bicistronic Expression P CMV IE P CMV IE DsRed-M P PGK P PGK P CMV IE IRES ZsGreen1 * Vectors available as part of an expression system. ** Vectors available separately. MCS MCS MCS MCS MCS MCS MCS MCS MCS Puro r plvx-dsred-monomer-c1 & -N1 ** plvx-ires-zsgreen1 ** 그림 2. Lenti-X vectors for many applications. Lenti-X vectors contain sequence elements that facilitate lentiviral packaging, boost transgene expression, or both. Among them are the HIV-1 LTRs and packaging signal (Y), a Rev response element (RRE), the central poly purine tract/central termination sequence (cppt/cts), and the woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element (WPRE). All vectors are designed to be used with the Lenti-X HT Packaging System and the Lenti-X 293T Cell Line, which will produce high titers of VSV- G-pseudotyped lentivirus for transducing virtually any cell type. See article text for vector descriptions and applications. March

4 특집 1 Lentiviral delivery system에 관한 모든 것은 클론텍에서 Lenti-XTM Expression System 의 발현을 지원한다2). Lenti-X vectors내 cppt/ 최고 효율의 패키징 시스템 덧붙여 클론텍의 독특한 트렌스펙션법은 293T CTS (central polypurine tract/central termina 클론텍의 Lenti-X HT Packaging System의 가 cell에 최적화된 변형 calcium-phosphate법으로, tion sequence)는 감염 후 바이러스 게놈의 핵 장 중요한 특징은 패키징 배양액내의 거의 모든 lipid 기반의 트렌스펙션법보다 독성이 적어 패 내 도입을 증가시켜, 결과적으로 벡터의 융합 세포에 원하는 Lenti-X expression vector와 함 키징 과정 동안 293T cells의 생존력을 높여 더 (integration)과 도입효율을 높인다3). 또한, 클론 께 패키징 벡터를 도입할 수 있는 고도로 최적 많은 바이러스를 생산할 수 있도록 한다. 텍에서는 inducible 발현, shrna 발현, 형광단 화된 트랜스팩션 프로토콜이다. 결과적으로, 각 Lenti-X HT Packaging System은 어떤 렌티바이 백질 tag, Bicistronic 발현 등 다양한 응용실험이 세포는 바이러스를 생산하는 공장이 된다. 매우 러스 발현 시스템에도 필수적인 구성요소이며, 가능한 Lenti-X 벡터들을 제공한다 (그림 2). 효율적인 Lentiphos HT transfection system은 거의 모든 렌티바이러스 벡터와 함께 사용될 수 99%에 가까운 293T cells에 도입 효율을 보이는 있다. 실질적으로 감염 후 다음 단계의 실험에도 안전하고 풍부한 렌티바이러스 생산 데, 이는 10 cm 플레이트의 293T cell에 5 x 108 적합하도록 안전한 높은 titer의 렌터바이러스 렌티바이러스 발현시스템은 이전에는 실험이 IFU/ml 까지 감염시키는 것을 말한다. 상층액을 쉽게 생산한다. 어려웠던 세포나 조직에 유전자 도입을 가능하 게 하고, 분리된 유전자 패키징 시스템을 통해 B A replicating viral genomes)를 방지함으로써 안전 Clontech s Lenti-X HT 성도 확보하였다. Lenti-X HT Packaging Mix는 으로 패키징할 수 있는 필수 발현 구성요소의 독 75 Untransduced Counts 모든 재조합 렌티바이러스 발현 벡터를 효과적 Competitor s packaging system 75 특한 조합으로 되어 있다. 안전성을 강화하기 위 해, 다른 상용화된 시스템과 달리 Gag-Pol 활성 이 분리되어 있어 타겟 세포로부터 바이러스성 Transduced Counts 재조합을 통한 바이러스 게놈의 자가복제(self- 10¹ 10² FL1-H 10³ 50 복제 기능이 전이되는 것을 철저히 방지하고 있 Transduced Untransduced 10¹ 10² FL1-H 10³ 104 다1). 그러므로 목적 재조합 바이러스로 감염된 타겟 세포는 새로운 바이러스를 만들기 위한 필 수적인 복제 구성요소가 충족되지 않을 것이다. 최상의 titer와 신경계의 형질도입 293T cells에서 이런 바이러스 구성성분들의 일시적인 고발현은 트렌스펙션 48~72시간 후 VSV-G pseudotype의 렌티바이러스가 높은 그림 3. High infectivity of supernatants produced by the Lenti-X HT Packaging System. The Lenti-X HT Packaging System (Panel A) and a packaging system from a competitor (Panel B) were each used to generate viral supernatants from their respective lentiviral system vector that was engineered to express the ZsGreen1 fluorescent protein. As little as 10 μl of supernatant from the Lenti-X HT Packaging System transduced the majority of these HeLa cells, whereas 10 μl of supernatant from the other system transduced only a small percentage of the cells. Transduced cells were quantified by flow cytometry A B titer로 생산될 수 있게 한다. 상층액의 titer는 농축과정 없이도 목적세포 에 감염시켜 사용할 수 있을 정도로 충분히 높 다. 예로, 바이러스 상층액 10 ul 정도로 배양액 내 대부분의 HeLa cell에 형질도입시킬 수 있다 (그림 3). Lenti-X HT System으로 생산된 렌티 바이러스는 광범위한 바이러스 친화성(적용성, tropism)을 유지할 뿐만 아니라 신경계에서 유래 한 형질도입된 세포의 특성을 잘 보존하고 있다 (그림 4). 4 Life Science & Biotechnology 그림 4. Transduction of neural progenitor cells by Lenti-X lentivirus. Recombinant lentivirus for expressing ZsGreen1 was produced from the Lenti-X HT Packaging System and used to transduce normal human neural progenitor cells. A single transduced cell is shown under phase contrast microscopy (Panel A) and fluorescence microscopy (Panel B).

5 특집 1 [3] Lenti-X Tet-On & Tet-Off Advanced Inducible Expression Systems Tet-Advanced inducible system 을적용하여 어떤세포형태에서도고효율의렌티바이러스 형질도입이가능 높은 titer 를위해 Lenti-X HT Packaging System 포함 뛰어난유도발현조절과매우낮은백그라 운드 Lenti-X Tet On & Tet Off Advanced Inducible Expression system 은다양한세포에적 용가능한강력한렌티바이러스유전자도입 기술과테트라사이클린에의해조절되는유전 자발현시스템의범용성이결합되었다 ( 그림 5). 렌티바이러스벡터는간, 뇌, 근육이나줄기 세포등과같은다양한조직에서유래한세포 의분열여부에상관없이모든세포에클론텍의 inducible 발현시스템을적용할수있다. 각시 스템은두개의렌티바이러스벡터로구성되어 있다. Tet-On Advanced (rtta-advancde) 또 는 Tet-Off Tet O Advanced (tta-advanced) (tta Advanced) tran scriptional activator 를안정적으로발현시키는 조절벡터와목적유전자의발현을조절하는반 응벡터 (plvx-tight-puro) 로구성되어있다. 또한 luciferase 를발현하는반응벡터의대조군 과클론텍의 Lenti-X HT Packaging System 을 포함하고있다. Lenti-X Tet-Advanced Lentivirus 의높은 titer 생산 클론텍의 Lenti-X HT Packaging System 의 Lenti-X Tet-Advanced System Vectors 는자가 복제되지않는안전하고매우높은 titer 의렌티 바이러스를생산한다. 이렇게높은수준의바이 러스가생산될수있는것은클론텍의 Lenti-X HT Packaging Mix 와병용하여사용되는최적화 된 Lentiphos HT transfection system 때문이다. Lenti-X HT Packaging Mix 는렌티바이러스패 키징단백질과복제단백질을고발현을위한최 적화된바이러스와비바이러스성발현구조의 독특한혼합물로되어있다. tta-advanced 3X (min VP16) Transcription Tet-Off Advanced Gene of interest rtta-advanced + Dox 3X (min VP16) Transcription TRE MOD CMV min TRE MOD CMV min P Tight Tet-On Advanced Gene of interest 그림 5. Induced expression in the Tet-Off Advanced and Tet-On Advanced Systems. The Tet-controlled transactivators are fusion proteins that contain a DNA-binding TetR domain joined to three minimal transcription activation domains from HSV VP16. Each transactivator has been optimized for expression in mammalian cells. In Tet-Off Advanced Systems, the basal state is maintained in the presence of doxycycline (Dox), and induced by its withdrawal. Tet-On Advanced Systems are activated in the presence of Dox. System induction produces high-level transcription of your gene from P Tight.. plvx- Tet-On Advanced Regulator 1. Produce regulator and response lentiviruses using 293T cells and the Lenti-X HT Packaging System 2. Harvest high-titer Lenti-X supernatants 3. Coinfect any target cell type and culture and + Dox 4. Harvest cells for analysis Neo r Dox Expression OFF No expression of transgene Lenti-X HT Packaging Mix + Dox 그림 6. Establishing an inducible gene expression system with Lenti-X Tet-On Advanced. Use the Lenti-X HT Packaging System and 293T cells to generate high-titer lentiviral supernatants from the plvx-tet-on Advanced Vector, and from the plvx-tight-puro Vector containing your gene of interest. Simultaneously coinfect cultures of your target cells with the two lentiviruses (~8 hr). Then, after culturing for an additional hr (+ and-dox), harvest the cells for analysis. These same procedures also apply to the Lenti-X Tet-Off Advanced System, but the effects of Dox are reversed. P Tight Target cells Expression ON High expression of transgene Pur r plvx- Tight-Puro Response 293T packaging cells Gene of interest Target cells containing Tet-On Advanced March

6 특집 1 Lentiviral delivery system 에관한모든것은클론텍에서 Lenti-X TM Expression System 상층액이만들었다. LVX-Tet-On Advanced 상층액과동량으로 LVX-Tight-Puro-Luc 상층액을섞은후, Dox가농도별로존재하는 HeLa Cell에감염시켰다. 낮은백그라운드와 inducible luciferase의고발현을통해 Lenti-X Tet 시스템의우수한성능을확인할수있다 ( 그림 7). 그림 7. The Lenti-X Tet-Advanced Systems are highly inducible. Using equal amounts of high-titer supernatants, HeLa cells cultured at the indicated concentrations of Dox were cotransduced for 8 hr with a LVX- Tight-Puro-Luc lentivirus and a LVX-Tet-On Advanced lentivirus. Cultures were harvested after 48 hr and assayed for luciferase activity. Luciferase was expressed at very high levels, while the basal/uninduced expression level was very low. Lenti-X Packaging Mix 와함께사용되는 Lenti-X Tet-Advanced System Vector 는 293T packaging cells 로거의 100% 코트랜스펙션된 다. 이결과매우높은 viral titer 를가진상층액 을만들수있어, 별도의농축과정없이상층액 을곧바로실험에사용할수있다. 이는높은도 입효율뿐만아니라 inducible 시스템셋업을위 한시간과노력을절약할수있게한다. 클론텍 에서는농축하지않은 Lenti-X HT 상청액 10 ul 만으로도 6- 웰플레이트의대부분의 HeLa cell 에형질도입할수있었다 ( 그림 3, 그림 6). Tet-Systems Overview 클론텍의 Tet-Advanced System 은 Gossen & Bujard 4) 의 inducible 발현법의상위버전으로 Urlinger, et al. 5-7) ( 그림 5) 에의해기술된여러가 지중요한개선점을포함하고있다. Inducible 시 스템을셋업하기위해선타겟세포의형질도입 에 plvx-tet Advanced Vector (Tet-On 또는 Tet-Off) 와 plvx-tight-puro Vector 로부터생 산된목적유전자를포함하고있는높은 titer 의 렌티바이러스상층액을이용한다 ( 그림 6). 높은 바이러스 titer 는동시감염 (coinfection) 동안두 바이러스를모두가진목적세포에높은효율로 충분히트렌스팩션 ( 형질도입 ) 시킬수있을것이 다. 이런높은효율로인해안정적인형질도입주 를선별하지않고도곧바로유전자유도발현실 험을진행할수도있다. 또는 G418 과 puromycin 으로형질전환된세포를선별할수도있다. Tet- On Advanced System 으로형질전환된세포는 Dox 처리시목적유전자의전사를빠르게개시 할것이다. 반면, Tet-Off Advanced System 은 Dox 가없을때높은수준의유전자발현을가능 하게할것이다. 뛰어난시스템성능 강력한유도성능을확인하기위해 HeLa cell 에서 luciferase 를발현할수있도록 Lenti-X Tet-On Advanced System 을만들었다. 먼저조 절벡터와 luciferase 유전자 (cdna) 를발현하 는 plvx-tight-puro 반응벡터 (LVX-Tight- Puro-Luc) 를포함한높은 titer 의렌티바이러스 동시감염법클론텍은 Retro-X Tet-Advanced Inducible Expression Systems에서의기술을기반으로 in ducible Lenti-X system을최적화시켰다. 반응벡터 (LVX-tight-Puro) 가조절벡터 (LVX- Tet-On 또는 Tet-Off Advanced) 보다많은비율의바이러스상층액으로타겟세포에감염시키면목적유전자를최대로발현시킬수있다. 반면조절벡터의비율이많은상층액의경우매우낮은백그라운드와최대의발현유도율을이룰수있다 8). Single- & Double-Stable Cell Lines 안정적인세포주를생산하기위해 Lenti-X Tet- Advanced System 내의조절렌티바이러스와반응렌티바이러스는독립적으로또는순차적으로사용된다. Lenti-X Tet-On 또는 Tet-Off Advanced virus로형질도입된세포들은다목적 single-stable Tet-Advanced host cell line을생성하기위해 G418로선별되어진다. 이세포주는다른 P Tight -controlled gene constructs의수용체로서작용한다. LVX-Tight-Puro lentivirus를가진 single-stable Tet-responsive host cell line 의형질도입과 puromycin으로의순차적인선별에의해각시스템으로부터의구성요소를모두포함한 double-stable inducible cell line를생산한다. 렌티바이러스의장점다양한형질도입이가능한렌티바이러스가클론텍의강력한 Tet-Advanced Inducible Expression Systems과결합되어, 연구자들은레트로바이러스감염이나일반적인유전자전달기술로이용하기힘들었던분화하는 primary cell과줄기세포와같은세포나조직에서의 inducible 발현시스템을적용할수있다. 렌티바이러스를이용한유전자도입은목적 6 Life Science & Biotechnology

7 특집 1 벡터가숙주세포의게놈에효과적으로삽입되 는기능성형질도입주를높은빈도로만들수있 다. 높은 titer 의감염된바이러스를사용하면형 질도입된세포는최대가될것이고항생제선별 을통해안정적인형질전환주를선별하는단계 가필요하지않을것이다. Primary cell cultures 나형질도입이쉽지않은 세포에 inducible 시스템을적용하려하거나효 과적인렌티바이러스유전자전달법을이용하 려고한다면, 클론텍의 Lenti-X Tet-Advanced Gene Expression Systems 을추천한다. 제품구성 Lenti-X HT Packaging System Lenti-X HT Packaging Mix Lentiphos HT Lenti-X Tet-On or Tet-Off Advanced Inducible Expression System LVX-Tet-On Advanced Vector 또는 plvx-tet-off Advanced Vector plvx-tight-puro Vector plvx-tight-puro-luc Control Vector Lenti-X HT Packaging Mix Lentiphos HT Tet System Approved FBS 참고문헌 1. Wu, X. et al. (2000) Mol. Ther. 2(1): Zufferey, R. et al. (1999) J. Virol. 73 (4): Zennou, V. et al. (2000) Cell 101(2): Gossen, M. & Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(12): Urlinger, S., et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14): Inducible Gene Expression Systems (January 2007) Clontechniques XXII (1): Tet-On Advanced Inducible Gene Expression System (July 2006) Clontechniques XXI(2): Inducible Retroviral Gene Expression Systems (July 2007) Clontechniques XXII (3):2-3. 관련제품 제품명 용량 TaKaRa Code 20 rxn Lenti-X HT Packaging System 40 rxn Lentiphos HT 20 rxn Lenti-X Expression System each Lenti-X Bicistronic Expression System (Neo) each Lenti-X Bicistronic Expression System (Hyg) each Lenti-X Bicistronic Expression System (Puro) each Lenti-X Tet-On Advanced Inducible Expression System each Lenti-X Tet-Off Advanced Inducible Expression System each Lenti-X ProteoTuner System each Lenti-X ProteoTuner Green System each plvx-dsred-monomer-n1 Vector 10 μg plvx-dsred-monomer-c1 Vector 10 μg plvx-acgfp1-n1 Vector 10 μg plvx-acgfp1-c1 Vector 10 μg plvx-ires-zsgreen1 20 μl Lenti-X shrna Expression System each plvx-shrna2 Vector 10 μg Lenti-X 293T Cell Line 1 ml Lenti-X qrt-pcr Titration Kit 100 rxns * License Notice: [1], [2], [3], [4], [5], [7], [8], [9] March

8 특집 2 Yeast Two-Hybrid 시스템의결정판 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System [1] Matchmaker Gold Yeast Two- Hybrid System 4 개의 reporter 와 3 개의 promoter 로 false positive 가감소 융합단백질의결합을통해 Aureobasidin A( 강 력한항생제 ) 에저항성을나타냄 항생제, 영양소, blue/white 선별을통해간단 하면서도강력하게스크리닝가능 클론텍의 Matchmaker System 은새로운단백 질 - 단백질결합 (protein-protein interactions; PPIs) 을연구하는매우진보된기술이다. 최 근더욱더강력해진 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybird System 이발매되었다. 이는 2 개 의 nutritional reporter 와 blue/white color 선별 에추가로고감도의 Aureobasidin A (AbA) 1) 항 생제마커를더해쉽고도강력하게 yeast twohybrid (Y2H) screening 이가능한 4-reporter system 이다 ( 그림 1). Aureobasidin A 는효과적으로효모를박멸하 지만, GAL4-hybrid protein 간의결합이일어 나면 AUR1-C 유전자가발현되어효모가 AbA 에내성을가진다. Positive clone 을선별하기위 해 2 단계에서는 3 개의각기다른 GAL4-reporter promoter 에의해조절되는 4 개의 reporter 를 그림 1. Yeast two-hybrid system design. Library-derived, transcription-activating prey fusion proteins that interact with the DNA-binding bait fusion protein activate the expression of reporter genes. Promoters M1 M1 G1 G2 Prey Bait GAL Promoter 5' GAL4 AD GAL4 DNA-BD Reporter Genes Aureobasidin A Resistance α-galactosidase Histidine Biosynthesis Adenine Biosynthesis mrna RNA Pol II 그림 2. Four reporters give Matchmaker Gold its high stringency. Interacting bait and prey fusion proteins drive the expression of four different reporters from three different GAL4-responsive promoters (M1, G1, and G2), which are stably integrated in the genome of the reporter strain, Y2HGold. Aureobasidin A (AbA) resistance and the two auxotrophic reporters for histidine and adenine biosynthesis confer growth selection in the presence of AbA and on histidine-and adenine-deficient media, while the a-galactosidase reporter produces blue colonies in the presence of X-alpha-Gal. 채용하여확인한결과, False positive 를효과적 으로배제하여 positive clone 을더많이선별할 수있었다. 이와같이 screening 의질을높여간 단해진 Mate & Plate library screening 방법으로 시간을절약하면서도효과적으로 PPIs 실험을 진행할수있다. Two-hybrid system 의기초 Y2H system 은 DNA-binding domain (DNA- BD) 과 RNA Pol II-recruiting transcription activation domain (AD) 2,3) 로구성된진핵생물의 transcription factor의모듈을 이용한다. Match maker system 에서이미알고있는단백질은 GAL4 transcription factor 의 DNA-BD 와융합 하여 bait 단백질로사용한다. Bait 와결합시킬 prey 단백질은 GAL4 의 AD 와융합하여종종 library 형태로사용하기도한다 ( 그림 1). Bait 와 prey 융합단백질이서로상호결합할때, GAL4 기능이살아나고이들단백질이 reporter 유전자 의전사를활성화시킨다. Matchmaker Gold 에서 는 4 개의 reporter 의발현유무에따라단백질간 결합이이루어진효모주를선별할수있다 ( 그림 2). Library 를스크리닝할때는 library 와결합된 prey 단백질서열을포함하는플라스미드를이 용해실험하며선별된효모주에서플라스미드 를분리하여추가적인분석과염기서열결정등 의실험을진행한다. Background 를없애기위한 Aureobasidin A 의사용 Matchmaker Gold System 은 S. cerebisiae 에강 력한독성을가지는 AbA 의저항성유전자인 AUR1-C 유전자를새로운 reporter 로사용하는 유일한제품이다. 항균작용을하는 depsipeptide 에안정적으로내성을가짐으로서 nutritional selection 단독으로사용할때필요로했던최적 화과정없이직접 Y2H library 를스크리닝할수 있다. HIS3 를기반으로한 selection 시 1 차스크 리닝에서매우많은수의 background 클론이존 재했던반면, AbA 는 AUR1-C reproter 를발현 하지않는클론을효과적으로제거할수있다. 그결과 AbA 를이용하여낮은강도의초기스크 리닝에서도 background 의간섭없이높은확률 로 positive clone 을확보할수있었다. 8 Life Science & Biotechnology

9 특집 2 Mate & Plate Library Vial (Y187) Bait Culture (Y2HGold) + Combine overnight and plate 단백질을 발현하는 pgbkt7 플라스미드를 형질 높은확율로 확실한 positive clone을 선별 전환한다 Library prey 주인 Y187은 MAT α주 AbA 저항성에 의한 뛰어난 colony 선별로 1차 로 Y2HGold의 mating 파트너로 적합하다. 선별에서는 AbA-저항성 파란색 클론만이 선 클론텍에서는 Y187에 형질전환시킨 다양한 발된다. Positive로 추정되는 클론의 2/3는 4개 Mate and Plate Library를 판매하고 있다. 또 의 reporter 유전자를 전부 사용하는 high strin 한 스스로 library를 제작할 수 있는 Make Your gency screening에서 확인할 수 있다. 결과적으 Own Mate & Plate Library System (TaKaRa 로 low stringency screening으로 콜로니를 선별 Code )을 사용하거나, 먼저 선발된 prey 한 다음 high stringency로 확인할 것을 추천한 융합 단백질을 플라스미드에 넣어 형질전환시 다. 이러한 방법으로 보다 많은 진짜 positive와 킬 수도 있다. Y2HGold와 Y187의 조합으로 매 낮은 false positive를 구별해낼 수 있다(그림 4). 우 쉽게 mating이 가능하며, 배수체 효모내에서 bait와 prey 단백질을 같이 발현시킬 수 있다. A Low stringency B High stringency 그림 3. The Mate & Plate Protocol. To screen a Matchmaker Mate & Plate Library, an aliquot of the library in the Y187 strain (MAT α) is simply mixed with a bait-expressing culture of the Y2HGold strain (MAT α). The mated strains are cultured overnight and plated on selective agar medium (e.g.-leu/-trp + AbA + X-alpha-Gal). 4개의 reporter로 정확하게 positive clone 을 선별 AUR1-C, HIS3, ADE2 와 MEL1 (α-galactosi dase), 이렇게 총 4개의 reporter유전자를 사용 하는 Matchmaker Gold는 3개의 다른 GAL4- 그림 4. Secondary Matchmaker Gold screening confirms high numbers of positive clones. A Y2HGold bait containing the POU domain from the mouse Oct4 transcription factor (BD-POUmOct4) was used to screen the Mate & Plate Universal Mouse (Normalized) Library for Oct4-binding proteins. 32 colonies from a low stringency primary screen (DDO + AbA, 60 ng/ml + X-alpha-Gal) were selected and replated/patched onto fresh low stringency medium (Panel A) and onto high stringency medium (QDO + AbA, 60 ng/ml + X-alpha-Gal) (Panel B) to confirm the expression of all four Matchmaker Gold reporters. Of the 32 originally selected colonies, 25 were confirmed positive for the 4 reporters. DDO = Double dropout medium: SD/-Leu/-Trp. QDO = Quadruple dropout medium: SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp. binding promoter에 의해 발현이 조절된다. 이들 유전자는 Y2HGold reporter strain의 게놈내에 안정적으로 삽입되어 있다(그림 2). 4개 유전자 표 1. Mouse Oct4-Binding Proteins Identified in Matchmaker Gold Library Screening1 의 전략적인 조합으로 하나의 GAL4 promoter Protein Function E2I/Ubc9 Small ubiquitin-related modifier (SUMO) enzyme involved in sumoylation of Oct4; regulates Oct4 stability PIAS1 An E3 ligase protein inhibitor of activated STAT1; a potent inhibitor of Oct4mediated transcriptional activation PSMB5 Proteasome beta5 subunit; may mediate the interaction of Oct4 with proteasomes, which regulate cellular processes through protein degradation. 에 결합하지만 나머지 3개의 promoter에는 결합 하지 않는 false positive를 걸러내는데 탁월하다. Mate & Plate library & screening Matchmaker Gold의 또 다른 이점은 기존의 번 거로운 library-scale yeast transformation 방법 대신에 bait와 prey 융합 단백질을 각각 발현시 키는 두개의 단수성(haploid) 효모주를 이용한 Mate & Plate 라는 새로운 전략을 사용한다는 것이다(그림 3). Y2HGold 는 MAT α주로 4개의 reporter 유전자가 게놈내에 삽입되어 있고, bait 1 Mate & Plate Library - Universal Mouse (Normalized). March

10 특집 2 Yeast Two-Hybrid 시스템의결정판 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System Number of colonies (normalized) Null Strong Moderate DDO + AbA (ng/ml) 그림 5. Titration of Aureobasidin A for three different Matchmaker protein pairs. Y2HGold yeast clones coexpressing one of three bait/prey fusion protein pairs: a negative control (BD-POU moct4 + AD-null); a pair of putative interactors (BD-POU moct4 + AD-E2I); or a positive control (BD-p53 + AD-T-Ag), were grown on DDO agar (SD/-Trp/-Leu) in the presence of increasing concentrations of AbA. The relative ability of each strain to grow in the presence of AbA reflects the strength of the interactions between the bait and prey proteins. Libraries are usually screened in the presence of AbA at 60 ng/ml, which demonstrates definitive selection for interacting hybrids. POU moct4 = POU domain from the mouse transcription factor, Oct BD-POU moct4 + AD-null BD-POU moct4 + AD-E21 BD-p53 + AD-T-Ag 영양배지선별보다우수한선별법 Y2H 선별을위해영양요구성의 reporter만을사용하는것은종종최적화과정을필요로하며특히 HIS3-의존적인선별의경우여러단계의선별과정이필요하다. HIS3에의한선별은강도가약해이로인한누락을막으려면, background colony의증식을억제하는 3-AT (a competitive inhibitor of the His3 protein) 를배양배지에반드시포함시켜야한다. 하지만 AbA 와 Match maker Gold의 2가지 nutritional marker를사용함으로서 3-AT를사용하지않고도충분히 positive clone을선발해낼수있다. 클론텍에서는 Matchmaker Gold 시스템과조직특이적이면서도보편적으로적용할수있는 Mate & Plate Library와함께여러 Y2H screen ing 기술을선보이고있다. Make Your Own Mate & Plate Library System을사용한다면자신만의 library 제작도가능하다. 클론텍의진보된 Y2H 시스템으로짧은시간에효율적인 library screening을실현할수있다. Aureobasidin A 내성에의한특이성높은선별 AbA 저항성이높은선별특성을확인하기위해 각기다른 bait/prey 단백질쌍을발현하는 3 개의 배수체 Y2HGold 주의 AbA 를측정하였다 ( 그림 5). 상호결합하지않는단백질쌍 (BD-POU moct4 bait 와변형하지않은 GAL4 AD 단백질 ; ADnull) 을발현하는 negative control 주는 AbA 의 농도가 40 ng/ml 이상일때전혀자라지못하였 다. 반면 BD-POU moct4 bait 와상호결합할것으 로추정되는 prey 단백질 (AD-E21) 과결합했 을때 70~100 ng/ml 의 AbA 농도에서도잘자 관련제품 랐다. 이러한결과로단백질간상호결합할때 AUR1-C의발현이충분히활성화되어 AbA 배지에서콜로니가잘자라는것을확인할수있었다. Positive control에서는강력하게결합하는단백질쌍 (DNA-BD-p53과 AD-SV40 large T antigen) 으로 100 ng/ml의 AbA ( 테스트중가장높은농도 ) 존재하에서도콜로니의생장에영향이없었고이는매우높은수준으로 AUR1-C가발현됨을나타낸다. 제품구성 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System pgbkt7 DNA-BD Cloning Vector pgadt7 AD Cloning Vector pgbkt7-53 Control Vector pgbkt7-lam Control Vector pgadt7-t Control Vector Y2HGold Yeast Strain Y187 Yeast Strain YPDA Broth YPDA with Agar SD/-Trp with Agar SD/-Leu with Agar Yeastmaker Yeast Transformation System 2 제품명용량 TaKaRa Code Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System each Make Your Own Mate & Plate Library System 5 rxns Life Science & Biotechnology

11 특집 2 [2] Mate & Plate Yeast Two-Hybrid cdna Libraries Library 수준의플라스미드정제, 형질전환불 필요! human, mouse 등다양한 cdna 중선택가능 SMART 기술을이용해자신만의 retrans pretrans formed library 를간단하면서효과적으로 제작 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System 과의완벽한조합 최신버전인 Matchmaker Gold Yeast Two Hybrid System을포함한클론텍의 Match maker System 은 yeast 에서 cdna library 를스 크리닝하고새로운 DNA 결합단백질, 단백질간 결합 (protein protein interaction ; PPIs) 을찾 아내는최적화된기술이다. Yeast two hybrid (Y2H) screening 을위한기존의 GAL4 AD GAL4-AD fu u sion protein library 는 cdna 합성, yeast 용발현 vector 로의 cdna library 클로닝, E. coli 에서의 library 증폭, 플라스미드정제, yeast 에 library 를형질전환등 library screening 전에거쳐야할 실험단계가매우많다 4). MFU 55,000 45,000 35,000 25,000 15,000 5,000 Over 7,000 genes with MFU of >10,000 3,300 genes Standard cdna cdna Normalized Normalized cdna 그림 7. Normalization reduces the abundance of cdnas derived from highly expressed genes. Universal cdna, synthesized using RNA from mixed human tissues, was analyzed before and after normalization on a NimbleGen Homo sapiens microarray (Cat. No. A ). Data are shown for the 7,000+genes which exhibited greater than 10,000 Mean Fluorescence Units (MFU). The signal intensities for approximately 3,300 of the most highly represented genes were significantly reduced following normalization, reflecting a preferential reduction of these abundant cdnas. Mate & Plate Library Vial (Y187) + Bait Culture (Y2HGold) Combine overnight and plate 그림 6. The Mate & Plate Protocol. To screen a Mate & Plate Library, an aliquot of the library in the MATα Y187 strain is simply mixed with a baitexpressing, MATα reporter strain culture (Y2HGold or AH109). The two strains are co-cultured overnight and then plated on selective agar medium. Mate & Plate Library 의간편성 클론텍에서는 library construction, trans orma transforma tion 이완료된다양한 pretransformed cdna library 를판매하고있다. Mate & Plate Library 는 GAL4-AD GAL4 AD prey rey fusion usion protein rotein의 cdna li brary 로 Y2H 시스템의스크리닝에바로적용할 수있다. 이러한 library 는 MATα 배수체효모주 인 Y187 에형질전환되어있고, 배수체 MATα reporter 주인 AH109 나 Y2HGold 주와 mating 할수있다. Mate & Plate 실험이란, bait ex ressing bait-expressing re porter strain 과 Mate & Plate library 를혼합해 배양한것을 ( 그림 6), 두효모주를함께배양하 여 bait 와각각의 library prey 단백질을동시에 발현시킨후, clone pool 을선택배지에도말하 여 reporter 유전자를발현하는각각의클론을 선택함으로써단백질결합유무를판단할수있 다. 낮은 False Positives 를위한 Normalized Library 클론텍에서는보다간단하게단백질간의결합 을밝혀낼수있는 normalized Mate & Plate Library 도판매한다. Duplex-specific nuclease (DSN) normalization 은전체 cdna 에서특히 많은수의 cdna 를선택적으로제거하고, 적은 abundant 서열을증가시켜준다 ( 그림 7) 4,5). 이러한작업을통해잠재적은 false positive 의 주된원인을없애고, positive interaction 을선 별해야하는각각의클론수를줄여, 초기의 low stringency screening 에서나타날수있는 false positive 의빈도를낮춰준다. Matchmaker Gold 시스템에서제시하는강력한 스크리닝방법과함께 normalized Mate & Plate library 를사용함으로서, 초기의스크리닝에서도 positive 클론을찾아내고, false positive 로인한 background 콜로니가거의발생하지않게된다. March

12 특집 2 Yeast Two-Hybrid 시스템의결정판 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System Balanced Gene Representation DSN normalization 결과, 유전자의 representa re resenta tion의균형이증가했다는것을확인하기위해 47,633개의인간유전자를포함하는 NimbleGen microarray상에서 normalization 전과후를비교하였다 ( 그림 7). 분석결과, 높은수준으로발현되는유전자의 cdna는현저하게제거된반면, 낮은 abundant cdna는크게영향을받지않았다. 따라서, 낮은카피수를가지는서열의 representation은전체 cdna pool에서증가하였다. 그림 8은매우높은발현수준을유지하는 housekeeping 유전자 ( actin, (β-actin, GAPDH) 가 nor malization을통해효과적으로감소되었음을나타내는예이다. 보편적인유전자를모두포함하는 Library 클론텍의일반적인 library는거의모든조직에서발현되는유전자를완전히충족하며보편적으로사용할수있다. Normalized library는다양한범위의유전자를발현하는모든인간조직또는쥐의조직에서분리한 RNA에 SMART 기술을적용하여 cdna를합성하고증폭하여 library 를제작하기전에 cdna를 normalize한다 6). 낮은카피수의 cdna를증폭시킨클론텍의 normalized library를이용하여목적단백질에결합하는단백질을효과적으로선별할수있다. 효과적인 Two-Hybrid Screening 진보된 normalized library 의 Y2H screening 효과를확인하기위해 Mate & Plate Library- HeLa S3 (Normalized) 를이용해 murine p53- bait 와결합실험을진행하였다. 279,000 개의클 론으로부터 p53- 결합단백질이포함됐을것으로 추정되는 62 개의클론이선별되었다 4). 일반적 인 library 에서는 1~2 백만개의클론을스크리닝 할것을추천하는것과는대조적이다. 추가실 험을통해선별된 8 개의콜로니중 4 개는 p53 과 결합하는것으로알려진 3 개의단백질 (PCNA, PRMT3, PTEN) 을포함하였다. 따라서 normal ized library 에서는적은수의클론선별과정을통 해서도충분한결과를도출할수있었다. 관련제품 직접제작하는나만의 "Mate & Plate" Library Library 를직접제작해야하는경우, 클론텍 의 Make Your Own Mate & Plate Library System 을추천한다. SMART 기술을적용시킨 이시스템을이용하면효모내에서높은효율 로 homologous recombination 이일어나효과 적으로 cdna 를합성하고 pgadt7-rec AD Cloning Vector 에클로닝할수있다. Library 는 construction 후 Y187 효모주로한번에형질전 환할수있고, 이렇게만들어진 library 는쉽게 Mate & Plate protocol 에적용할수있다. Mate & Plate Library 는클론텍의 Matchmaker Gold 시스템과함께단백질간의새로운상호결 합을연구하기위한진보된실험법을제공한다. 이러한기술을통해적은시간과노력으로큰결 과를가져올수있게되었다. 제품명용량 TaKaRa Code Mate & Plate Library - Universal Human (Normalized) Mate & Plate Library - Universal Mouse (Normalized) 2 x 1 ml x 1 ml x 1 ml x 1 ml C β-actin N C GAPDH N Mate & Plate Library - HeLa S3 (Normalized) 5 x 1 ml Mate & Plate Library - Human Bone Marrow 5 x 1 ml Mate & Plate Library - Human Fetal Brain 5 x 1 ml Mate & Plate Library - Human Heart 5 x 1 ml Mate & Plate Library - Human Liver 5 x 1 ml 그림 8. DSN-Normalization removes highly abundant cdnas. Normalized (Lanes N) and nonnormalized (Lanes C) human HeLa S3 cdnas were compared using virtual Northern blot analysis and 32P-labeled probes. The levels of these two highly abundant cdnas were sharply reduced following normalization. Mate & Plate Library - Human Skeletal Muscle 5 x 1 ml Mate & Plate Library - Human Testis 5 x 1 ml Mate & Plate Library - Human Ovary 5 x 1 ml Mate & Plate Library - Mouse Embryo 11-day 5 x 1 ml Mate & Plate Library - Mouse Embryo 17-day 5 x 1 ml Life Science & Biotechnology

13 특집 2 [3] Convenient Premixed Yeast TwoHybrid Media Sets Ready-to-Go Media Pouches Yeast Media Set 2 Plus Yeast Media Set를 이용하면 500ml의 ddh2o에 Yeast Media Set 2 Ready-to-go: ddh2o 첨가 후 고압멸균만 하 파우치 하나를 녹이고 고압멸균하여 식히는 것 Aureobasidin A (1 mg) 으로 배지를 완성할 수 있다. 또한 일반적인 멸 X-alpha-Gal (250 mg) 면 배지가 완성! Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System 전용 배지 셋트 Aureobasidin A과 X-alpha-Gal을 포함하여 편리성이 증가된 "Plus" 형태 제공 균수를 사용한다면 별도로 ph를 조정하지 않아 도 된다. Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid 참고문헌 System과 함께 Yeast Media Set 2, Yeast Media 1. T akesako, K. et al. (1991) J. Antibiot. 44 (9): F ields, S & Song, O. (1989) Nature 340 (6230): Chien, C. T. et al. (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88(21): P retransformed Normalized Matchmaker Library (January 2007) Clontechniques XXII (1): P retransformed Normalized Matchmaker Libraries (January 2008) Clontechniques XXIII (1): H igh-performance Reference RNA and cdna (July 2008) Clontechniques XXIII (2): Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System. (January 2009) Clontechniques XXIV (1):1-3. Set 2 Plus를 사용한다면 yeast two-hybrid 스크 리닝 효율을 극대화 할 수 있을 것이다. 이제 Yeast Media Set 2와 Yeast Media Set 2 Plus를 이용하여 yeast two-hybrid screening을 제품구성 편리하게 진행할 수 있다. 각각 8종류의 액체, 고 Yeast Media Set 2 (0.5 L pouches) 체배지를 만들 수 있는 모든 성분을 포함하고 YPDA Broth (2 each) 있으며(표 2) 클론텍의 Matchmaker Gold Yeast YPDA with Agar Two-Hybrid System7)과 함께 사용한다. 각 배지 SD/-Leu Broth 혼합물은 10개의 호일파우치에 나누어 포장되 SD/-Leu with Agar 어 있다(그림 9). 또한 Yeast Media Set 2 Plus는 SD/-Trp Broth 효모 항생제 선택마커인 Aureobasidin A를 포 SD/-Trp with Agar 함하여 4개의 reporter 유전자를 모두 사용한 스 SD/-Leu/-Trp (DDO; 10 each) 크리닝에 적용할 수 있으며, GAL4-based two- SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp (QDO) hybrid interaction을 확인하기 위한 X-alphaGal도 포함되어 있다. 관련제품 제품명 TaKaRa Code Yeast Media Set 2 each Yeast Media Set 2 Plus Each YPDA Broth 10 pouches YPDA with Agar 10 pouches SD/ Leu Broth 10 pouches SD/ Leu with Agar 10 pouches SD/ Trp Broth 10 pouches SD/ Trp with Agar 10 pouches SD/ Leu/ Trp Broth 10 pouches SD/ Leu/ Trp with Agar 10 pouches SD/ Ade/ His/ Leu/ Trp Broth 10 pouches SD/ Ade/ His/ Leu/ Trp with Agar 10 pouches mg mg mg Aureobasidin A X-alpha-Gal 그림 9. Specialized yeast media mixes are avaiable in convenient, ready-to-go pouches. 용량 * License Notice: [12], [15], [17] March

14 Technical Tip 1 ProteoTuner TM System 의응용예분비형단백질발현과 Knockout Phenotype 회복의정확한조절 Cell Biology Group Clontech Laboratories, Inc. ProteoTuner System은 DNA 혹은 mrna의레벨에서단백질의발현을조절하는것보다더정확하고, 직접적으로목적단백질의발현레벨을조절할수있는새로운기술이다. 이기술의특징을보다잘설명하기위하여, Shield1이세포독성이없음을증명하였고, 또한본시스템이 cytosolic protein 뿐만아니라분비형단백질에도적용가능함을확인하였다. 마지막으로정확한조절능력을보여주기위해 Knockout Phenotype 의회복에본시스템을사용하였다. Absorbance (450/690) NIH 3T3 HEK 293 CHO-K1 Cell Line U2-OS No Shield1 50 nm Staurosporine 1 µm Shield1 3 µm Shield1 5 µm Shield1 ProteoTuner System은세포내에서 ligand 의존적이고, 조절가능하며, 가역적인방법으로목적단백질의안정적인발현과분해를가능하게한다. 본시스템은 MCS의 upstream에 ProteoTuner destabilization domain(dd) 을포함한 vector와 DD의 stabilizing ligand인 Shield1 으로구성되어있다. DD는변형된 FKBP 단백질을기본으로한 12 kda (107 aa) tag이다. 목적단백질이 DD tag와융합단백질로발현되면, proteosome에의해빠르게분해된다. 하지만작고 (750 Da), 세포막을자유롭게통과할수있는 ligand인 shield1을세포배양액에첨가하면, 이 Shield1은가역적으로 DD tag와결합하여 DDtag가붙어있는목적단백질의분해를막아빠르게세포내에축적되게한다 1). No Detectable Side Effects ProteoTuner 기술은다양한세포주와생물체에성공적으로사용되고있다 1~6). 최근 Wandless와연구자들은 Shield1의영향으로인한유전자발현상의교란을찾기위해 microarray를이용하였다. 1 μm~10 μm의 Shield1을처리하였을때단지몇개의유전자만이 RNA 레벨에서미세한변화를나타냈다. 100 nm Shield1을처리했을때는어떤유전자도변화를나타내지않았다 2). 이번연구뿐아니라여러다른논문의저자들은 Shield1이 tumor-bearing mice에서치료성과에어떤영향도주지않으며, Shield1을처리한 mouse가정상적인몸무게와활동성및섭식행동을유지하고있음을보고했다 3). 그림 1. Shield1 does not affect viability, even at 5-10 times the recommended concentration. Each indicated cell type (1 x 10 4 cells/well of a 96-well plate) was treated with 0, 1, 3, or 5 μm Shield1. Staurosporine (50 nm), a known apoptosis inducer, was used as a negative control. 48 hr later, cell proliferation was measured using the Premixed WST-1 Cell Proliferation Reagent. RLU 50,000 45,000 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5, ,000 2,000 Shield concentration (nm) 그림 2. Shield1 has a stabilizing effect on secreted Metridia luciferase protein, implying a similar mechanism for Shield1-based stabilization of secreted and cytosolic proteins. Shield1 stabilizes secreted proteins in a tunable manner. Cells were transiently transfected with the DD-Metridia luciferase construct, and treated with increasing concentrations of Shield1. Six hr later, media samples were collected and the amount of secreted DD-Metridia luciferase in the media was determined using the Ready-To-Glow Secreted Luciferase Reporter Assay. RLU = relative light units. 이러한최근의연구보고를확인하기위해, 실험 에많이사용하는 NIH-3T3, HEK 293, CHO- K1, U2OS 세포주에 Shield1 의농도를증가시 켜처리한후, 그영향을관찰하였다. 세포독성 은 Premixed WST-1 Cell Proliferation Reagent (TaKaRa Code ) 를사용해확인하였다. 조 직배양시사용권장량의 5-10 배의 Shield1 을처 리했을때도세포의증식에는문제가없었다 ( 그 림 1). 기존의연구결과와같이이번실험에서도 Shield1 은세포독성이없고, 부작용도없는것으 로나타났다. 14 Life Science & Biotechnology

15 Technical Tip 1 분비형단백질에적합한시스템 ProteoTuner 시스템이 cytosolic protein의발현레벨을조절할수있다는것은이미널리보고되고있고, 최근에는분비형단백질의연구에도적용되고있다 3). 본실험에서는 secreted reporter 단백질인 Metridia luciferase을 ProteoTuner 시스템에적용하여, Ready-To-Glow Secreted Luciferase Reporter System (TaKaRa Code ) 으로확인하였다. 먼저 N-terminal signal peptide와 Metridia luciferase 사이에 DD 를삽입한 vector를제작하여, secreted pathway 에사용될수있도록하였다. Cell Line Jurkat 116 Jurkat ZAP70( ) 116 Jurkat ZAP70( ) infected with DD-ZAP70 Cause Signal transduction pathway Effect PMA/CD3 induction PMA/CD3 induction PMA/CD3 induction ZAP70 ZAP70 Shield1 Interleukin 2 secretion NO Interleukin 2 secretion ZAP70 DD-ZAP70 Interleukin 2 secretion 이 vector를도입한세포에다양한농도로 Shield1을처리하고, 세포배양액으로분비된 DD-Metridia luciferase의양을 Ready-To- Glow assay 방법으로측정하였다. 이결과는 Shield1이 DD-Metridia luciferase 단백질의안정에미치는영향을반영하는것이다. 세포배양액의 Shield1 농도는 bioluminescence와직접적으로연관이있었으며 ( 그림 2), 이결과는농도의존적으로 Shield1이 DD-tagged secreted protein의안정에관여함을나타낸다. 그러나분비형단백질의안정성은 cytosolic protein의안정성보다는약간낮을수도있다소포체 (ER) 를통해수송되는동안분비형단백질이가장높은안정성을갖기위해서는높은농도의 Shield1 (2 μm) 이필요한반면, cytsolic protein의완전한안정성에필요한 Shield1 농도는 500-1,000 nm이다. 그러나그림 1에서나타난것과같이, Shield1은 5 μm까지세포생존력에영향을주지않는다 ( 그림 1). Knockout Phenotype의회복 Knockout 모델은단백질기능연구에강력한연구방법이다. 그러나 Knocked-out 단백질이조절가능한방법으로재도입되어표현형이회복된다면, 단백질기능에대해보다자세하게연구할수있다. 본실험에서는 ZAP70 knockout 세포주 (116 Jurkat) 에 DD-tagged ZAP70 protein 을재도입시키는데 ProteoTuner System을사용하였다. ZAP70 (Zeta chain-associated protein kinase 70) 은 T세포와 NK (natural kille) 세포에서기본적으로발현되는 tyrosine kinase로, IL-2 그림 3. Tunable rescue of the ZAP70 signal transduction pathway in the ZAP70 deficient 116 Jurkat cell line. IL-2 secretion after PMA/CD3 induction 분비에관여하는 T-cell signaling 의시작에중요 한역할을한다 ( 그림 3). 0 본실험에서는 116 Jurkat 에서 DD-ZAP70 을발 현시키기위해 Lenti-X ProteoTuner System 과 RetroNectin Reagent 를사용하여, 형질도입이 ,000 Shield1 Concentration (µm) 어려운이러한세포에서형질도입효율을 90% 까 지높였다. Shield1 의양이증가함에따라 DD- ZAP70 이안정화되었고, PMA/CD3 유도에의해 ZAP70 의존적인신호전달이회복되는것을확 인하였다 ( 그림 4). 116 Jurkat cells + DD-ZAP70 DD-ZAP70 그림 4. Rescue of the ZAP70-dependent signaling pathway with the ProteoTuner system. The level of rescue is proportional to the amount of ZAP70 that is rescued. 116 Jurkat cells (ZAP70-negative) were infected or mock-infected with a construct for DD-ZAP70, cultured in varying concentrations of Shield1, and induced with PMA and CD3. The extent of recovery was measured by IL-2 secretion into the culture media, via an ELISA assay. March

16 Technical Tip 1 ProteoTuner TM System 의응용예분비형단백질발현과 Knockout Phenotype 회복의정확한조절 세포배양액에서 IL-2 의양을반영하여산출 한회복율은 Shield1 의농도와정비례하였으 며, 이는곧세포내의안정된 DD-ZAP70 의양 과정비례함을나타낸다. 위의실험으로 ZAP70 signaling pathway 는 on/off switch 가아니라 ZAP70 발현을통해조절될수있음을밝혀낸것 이다. Shield1 이없을때형질도입된세포내의 DD-ZAP70 레벨은매우낮아, signal pathway 를회복시킬수없었다. 형질도입되지않은 116 Jurkat 세포와비교하여 IL-2 레벨이낮았다. 다재다능한시스템 ProteoTuner 시스템은광범위한단백질과다양 한실험에적용할수있고, Shield1 이세포독성 이없기때문에실험에의해관찰된결과가목적 단백질의변화에의한것이라고확신할수있다. 또한 ProteoTuner 시스템은 cytosolic protein 의 양뿐만아니라분비형단백질의양을조절하는 데도사용할수있다. 본실험에서는 Knockout 시스템에서단백질회복율을빠르고정확하게 조절하여, 목적단백질의회복을미세하게조절 할수있었다. 참고문헌 1. Banaszynski, L. A. et al. (2006) Cell 126 (5): Maynard-Smith, L. A. et al. (2007) J. Biol. Chem. 282 (34): Banaszynski, L. A. et al. (2008) Nature Med. 14 (10): Armstrong, C. M. and Goldberg, D. E. (2007) Nature Meth. 4 (12): Berdeaux, N. et al. (2007) Nature Med. 13(5): Herm-Gotz, A. et al. (2007) Nature Meth. 4(12): 관련제품 제품명용량 TaKaRa Code ProteoTuner System each ProteoTuner IRES2 System each Retro-X ProteoTuner System each Retro-X ProteoTuner IRES System each Lenti-X ProteoTuner System each Lenti-X ProteoTuner Green System each Shield1* Lenti-X HT Packaging System 60 μl μl μl rxns rxns Premixed WST-1 Cell Proliferation Reagent 2,500 rxns Ready-To-Glow Secreted Luciferase Reporter System RetroNectin 100 rxns rxns ,000 rxns mg T100A mg T100B * The number of reactions depends on the concentration of Shield1 used. At the maximum * License Notice: [1], [2], [3], [5], [6], [7], [8], [9], [13], [14], [16] 16 Life Science & Biotechnology

17 Berthold Detection Systems Your Partner for Luminescence Measurement FB12 Tube Luminometer The Gold Standard for Glow Luminescence Ultrasensitive Photon Counting Detector Total Flexibility in Sample Format Standalone Operation or PC Operation Sirius Tube Luminometer Highest Performance and Flexibility same features as FB12, PLUS: Built-in Printer Up to Two Automated Reagent Injectors Safe Operation through Sample Presence Detection Orion L Microplate Luminometer All You Need for Luminescence Measurement Ultrasensitive Photon Counting Detector Up to Two Automated Reagent Injectors Sophisticated PC Software Orion II Microplate Luminometer The Top Instrument in the Field same features as Orion L, PLUS: Up to Four Automatic Reagent Injectors Two Temperature Control Options And Many More Powerful Functions March

18 Technical Tip 2 세포내바이러스도입효율을획기적으로높이는시약! RetroNectin R Reagent Recombinant fibronectin molecule 감염이어려운세포나줄기세포의유전자도입효율을높임 세포-바이러스간접촉을최대화하여 transduction 효율극대화 Lenti-X, Retro-X Expression System에적합 Retroviral과 lentiviral vector를이용하면많은종류의세포에안정적이고효율적으로유전자를도입할수있다. 그러나줄기세포, 부유세포등몇몇세포타입에서는일반적인방법을사용한 transduction이어려운경우가있다. 이러한 retrovirus 매개유전자도입에다카라의 RetroNectin Reagent를사용하면 retrovirus 와 len tivirus의도입효율을획기적으로높일수있다 ( 특히부유상태로자라는세포 ( 예 ; lymphocytes) 나조혈모세포 (hematopoietic stem cells) 에효과적임 ) 1,2). RetroNectin Reagent는 0.5 mg, 2.5 mg 형태와 RetroNectin Precoated Dishes (35 mm) 형태로되어있다. RetroNectin 이란? Fibronectins (FN) 은 plasma lasma 나 extracellular ma trix (ECM) 에존재하는여러가지기능을수행하는점착성당단백질그룹으로구성된다. 이와같이널리존재하는단백질은세포표면의 integrin 단백질과다양하게결합하여세포가 ECM에부착될수있도록한다. 뿐만아니라세포의이동, 증식, 분화에중요한역할을담당한다. RetroNectin (CH-296) 은각각바이러스또는세포표면단백질에결합하는몇몇 FN 단편에서유래한재조합펩타이드이다. RetroNectin은세포표면의 integrin receptor VLA-5와결합하는세포점착성영역을가진 RGDS motif, 다양한바이러스입자와결합하는헤파린결합영역, VLA-4 integrin receptor와결합하는 CS-1 서열등세가지기능적영역을가진다 ( 그림 1). RetroNectin의작용메커니즘 RetroNectin의다원적특성은세포와바이러스가동시에결합하여물리적으로가깝게만든다 ( 그림 1). 바이러스와세포의 colocalization을촉진하여결과적으로안정적인유전자도입의기회를높인다. 표 1. RetroNectin Supports High-Efficiency Gene Transfer 1 Cell Type Efficiency of Gene Transfer (%) Human CD34 + CD38 BMC Human PBMC TF SupT Jurkat 80.1 K HL Monkey CD34 + BMC 72.0 Monkey CD4 + T-cell Transductions were performed using the RetroNectin-Bound Virus (RBV) Method of transduction. 2 Bone marrow cells. 3 Peripheral blood mononuclear cells. NH 2 Binding Domains Fibronectin Fibrin Heparin Cell Binding Domain RGDS Collagen VLA-5 (α 5 β 1 ) Retroviral transduction 을향상시키기위한방법 RetroNectin-coated plate 에바이러스를먼 저넣은후타겟세포를첨가하는 RetroNec tin-bound Virus (RBV) 유전자도입방법에 RetroNectin 을효과적으로사용할수있다. 세 포는 RetroNectin 과바이러스가코팅된바닥에 부착하면서바이러스에감염된다. RBV 방법은 모든타입의타겟세포에적용될수있고, 특히 유전자도입이어려운세포나다량의바이러스 stock 을이용해감염시켜야하는세포에효과적 이다. 유전자도입시저해물질을제거하고세포의생존력을높임 Packaging 세포상층액에포함되어있는저해물 질들은유전자도입효율을현저하게저하시킬 수있고, 뿐만아니라다른불순물이존재하거나 과량의바이러스처리로인해민감한세포의생 존능력에영향을미칠수있다 3). RBV 방법을이 용한유전자도입에서 RetroNectin 이코팅된플 레이트에바이러스를결합시킨후, 세포를첨가 하여감염시키기전에결합되지않은바이러스 입자나기타수용성저해물질을씻어낸다. 그결 Target cell Retrovirus vector Heparin Binding Domain RetroNectin (CH-296) DNA SH Viral receptor 그림 1. RetroNectin greatly enhances virus-mediated gene transduction. RetroNectin is a chimeric recombinant peptide consisting of 3 functional domains derived from human fibronectin, that bind either cell surface proteins or virus. The enhancement is likely due to the colocalization of virus and cells on RetroNectin molecules. RetroNectin is most effective when viruses are first allowed to bind to RetroNectin-coated plates (or other cell growth substrates), followed by the addition of target cells. RGDS CS-1 Cell Heparin Cell (IIICS) VLA-4 (α 4 β 1 ) CS-1 Fibrin SS 18 Life Science & Biotechnology

19 Technical Tip 2 과타겟세포에적은바이러스로효율적으로유 전자를도입하고세포생존능력도높일수있다. 유전자도입효율을높이는 RetroNectin 다카라의연구결과, RetroNectin 을이용한방법 이다양한세포타입에서유전자도입효율을매 우높이는것을확인하였다. RetroNectin 을이 용한유전자도입효율은다음과같았다 ; human CD34 + bone marrow cell 90% ; human, nonhu man primate CD4 + T lymphocytes 70% 이상 ; K562, Jurkat 을포함한 human T lymphocyte cell line 80% 이상 ; HT1080 cell 90%. 다른세포 주에대한유전자도입효율은표 1 과같다. Polybrene 없이줄기세포와 Jurkat 세포의유전자도입효율을높임 RetroNectin 을이용한방법은 polybrene 또는 protamine 에의존하던기존의방법보다훨씬 더효율적으로인간줄기세포에유전자를도입 할수있다. 3 가지다른타입의인간줄기세포 에각각 Pit-1 (GaLV Env protein 의 receptor; 표 2) 를발현시켰을때, RBV 방법을이용하면 약 50~75% 의유전자도입효율을보였다. 반면 protamine 또는 polybrene 을이용한일반적인 유전자도입방법을사용하였을때는도입효율 이매우낮았다. 유전자도입이어려운 Jurkat T-cell line 에 RBV 방법을사용할경우역시높은효율을나타냈다. 그림 3 에서나타나듯 Jurkat 세포에서 retroviral vector 와 lentiviral vector 모두효과적으로도입 됨을알수있었다. Infection 후유전자가도입 되어 ZsGreen1 을발현하는세포가전체세포의 75~95% 를차지하였다. RetroNectin Reagent 와 precoated culture dish 의사용 RetroNectin Reagent 는 4~20 μg/cm 2 의비율 로플레이트를덮을수있도록 20~100 μg/ml 의 농도로플레이트에코팅한다. 1 vial 에 2.5 mg 이포함되어있으며, 이는 10~60 dish 를코팅하 기충분한양이다 ( 지름 3.5 cm, 표면적 10 cm 2 ). RetroNectin Precoated Dishes 는지름 3.5 cm dish 에 40 μg/ml 이코팅되어있다. 표 2: Surface Protein Phenotypes of Some Human Stem Cells Gene hcd34 + hmsc hadsc VLA VLA Pit VLA-4 and VLA-5 are integrins that bind RetroNectin. 2 Pit-1 is the cellular receptor for the GaLV Env protein. These values represent Pit-1 expression relative to that of hmsc. Percent transduction hcd34 + hmsc hadsc Stem cells RetroNectin Polybrene Protamine 그림 2. RetroNectin-mediated transduction outperforms standard methods of trans duction. A GaLVpseudotyped retrovirus carrying a fluorescent protein marker was used to transduce human hematopoietic (hcd34 + ), mesenchymal (hmsc), and adipose (had- SC) stem cells, all of which express different levels of Pit-1 (the GaLV receptor) (see Table II). In each case, the RBV method transduced the stem cells more efficiently than either the polybrene- or the protamine-based method. 관련제품 참고문헌 1. Hanenberg, H. et al. (1996) Nature Med. 2(8): Hanenberg, H. et al. (1997) Hum. Gene Ther. 8(1): Chono, H. et al. (2001) J. Biochem. 130(3): Counts Counts Retro-X retrovirus FL1-H Lenti-X lentivirus 제품명용량 TaKaRa Code RetroNectin Reagent FL1-H 그림 3. Effective retroviral and lentiviral transduction of Jurkat cells on RetroNectin-coated plates. Jurkat cells were transduced with either retrovirus (Panel A) or lentivirus(panel B) by using serial RBVbased trans ductions. Each VSV-G pseudotyped viruswas engineered to express ZsGreen1. Viruses were bound to RetroNectin-coated plates for 4 hr followed by incubation with the cells for 24 hr. Following the first infection, the cells were collected and added to a sec ond RetroNectin plate containing freshly bound virus. At 96 or 72 hr after the second round of retroviral or lentiviral infection, respectively, the cells were analyzed for fluorescent protein expression using flow cytometry. The transduced cells shownin Panel A were 75.5% positive with an MFI of 138; those shown in Panel B were 94.8% positive with an MFI of mg T100A 2.5 mg T100B RetroNectin Precoated Dishes 10 dishes T110A * License Notice: [16] March

20 Technical Tip 3 ToxiLight 와 ViaLight Plus 를이용한 AK 및 ATP 모니터링 HUVEC 에서 DNA Topisomerase I 억제제인 Camptothecin 의영향측정 Lonza Nottingham, Ltd 소개 Camptothecin은 Camptotheca acuminate에서추출한것으로, in vitro에서농도의존적으로 apoptosis을유도하여세포사멸을유발하는데일반적으로사용되고있다. Camptothecin은 DNA 합성의필수효소인 DNA topoisomerase I 을저해하는작용기전이있다. 이화합물의유도체들은현재여러암에대한잠재적인화학치료요법으로개발되고있는중이다. 밍한 luminometer 를이용하여측정하였다. 챔버슬라이드로부터배양액을제거하고, 새로 만든 live/dead staining solution (2 μm calcein AM; 4 μm EthD-1 in PBS) 300 μl 로교환하였 다. 샘플을고정하기전에상온에서 30 분동안 배양하였다. 방법 HUVEC 세포 (Clonetics, Lonza) 는 endothelial EBM-2 배양액에 human endothelial growth factor (hegf), hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin B), fetal bovine serum (FBS), vascular endothelial growth fac tor (VEGF), human fibroblast growth factor (hfgf-b with heparin), R3-IGF-1 및 ascorbic acid를첨가하여배양하였다. 세포는 5% (v/v) CO 2, 37 그리고습한상태에서키웠다. HUVEC (10 5 cells/ml -1 ) 세포를 96웰플레이트 (white walled tissue culture plate) 나챔버슬라이드에접종하여, 일반적인배양조건에서밤새키웠다. Camptothecin (Calbiochem) 을 0 nm nm 농도범위로희석하여세포에넣어주었다. 플레이트와슬라이드를 5%(v/v) CO 2, 37 그리고습한상태에서 24시간배양하였다. 배양후, ToxiLight BioAssay Kit (Lonza) 로분석하기위해각 well로부터 20 μl 샘플 (100% ly sis control 포함 ) 을새로운 luminometer 플레이트로옮겼다. 100 μl의 AKDR (Adenylate kinase detection reagent) 을각 well에첨가하고, 상온에서 5분간배양시켰다. 이를일괄적으로 1초동안읽도록프로그래밍한 Berthold Orion luminometer를이용하여측정하였다. 나머지샘플은 ViaLight Plus BioAssay Kit (Lonza) 를이용하여분석하였다. Cell Lysis Reagent 50 μl를각웰에첨가하고 10분동안상온에서배양하였다. 100 μl의 AMR Plus (ATP Monitoring Reagent Plus) 를각웰에첨가한후에시그널의안정화를위해서 2분동안배양한다. 이를일괄적으로 1초동안읽도록프로그래 그림 1. HUVEC cells treated with camptothecin for 24h. Cells were assayed using the ToxiLight assay kit according to the manufacturer s instructions. The data produced was compared to a 100% lysed control sample and is expressed as a % lysis. The data is representative of the mean of 3 separate experiments (containing six replicates per dose) + SEM 그림 2. ATP levels in HUVEC cells treated with camptothecin for 24h. Cells were assayed using the ViaLight Plus bioassay kit according to the manufacturer s instructions. The data is representative of the mean of 3 separate experiments (containing six replicates per dose) ±SEM 20 Life Science & Biotechnology

21 Technical Tip 3 결과세포막으로부터억제되었던 adenylate kinase 의방출은 cytolysis 검출의확실한방법이다. ToxiLight BioAssay Kit를사용하여분석한샘플은 ToxiLight 100% Lysis Reagent로준비한 lysate와비교하였고, 세포용해된정도를백분율로나타내었다 ( 그림 1). 그림 1에서보여진대로이 primary human cell line의 cytolysis 백그라운드레벨은약 27% 이다 (cultured cell line에서는보통 5~8%). 고농도의 camptothecin을처리한샘플에서는세포사멸의현저한증가와함께농도의존적으로 cytolysis 레벨이증가한다. 세포사멸이유도되면, 웰에서보이는 ATP 레벨이급격히감소한다. Camptothecin을처리한세포는 ViaLight Plus를사용하여분석하였고, 각웰의 ATP 레벨은세포생존률지표로평가된다 ( 그림 2). 그림 2와같이, camptothecin 농도가증가하면 ATP의레벨은농도에의존하여떨어지게된다. 는세포는 EthD-1 dye가침투하여붉은형광을띈다 ( 그림 4). 결론발표된결과들로부터 camptothecin은 HUVEC 세포에서농도의존적으로세포사멸을유도한다. ViaLight Plus와 ToxiLight BioAssay Kit의 bioluminescent 방법의조합으로부터, 하나의샘플에서 ATP 레벨과 AK 레벨을측정할수있고그결과를조합하면세포에대한 camptothecin 의효과를전체적으로파악할수있다. 이경우낮은농도의 camptothecin 으로 ATP 레벨에대한현저한효과를낼수있지만그에부합하는 AK 레벨의증가는없다. 이는세포가세포사멸을진행하는동안세포막이손상되는지점까지는아직이르지않았다는것을나타낸다. Live dead cytotoxicity 염색을사용하면형광현미경을통해시각적인결과를얻을수있다. RLUs ViaLight Plus ToxiLight [Camptothecin] nm 그림 3. Comparison of ViaLight Plus and ToxiLight Assays using HUVECS dosed with camptothecin. The ATP levels indicated by the ViaLight Plus RLUs reduce steadily in a dose dependent manner. At the lower drug doses the AK released from the cells is relatively low compared with that of the control only increasing dramatically at the highest drug doses % lysis 두실험의결과를직접적으로비교해보면 ( 그림 3), 이미 cytolysis가유도되었기는하지만어느정도의농도에서세포생존에영향을끼치는지평가가가능하다. Campatothecin이세포사멸을유도한다고알려진것처럼, 적은양의 camptothecin 투여에서 ATP가감소된것으로사실상 apoptosis에이른것이라는가정을할수있지만, 여전히세포내부의 AK를유지하는손상되지않은세포막은존재한다. 세포생존을측정하기위해두가지 dye를사용하는 live/dead cytotoxicity assay를이용하여 camptothecin을처리한세포들을분석하였다. 살아있는세포는 non-fluorescent Calcein AM을높은 green fluorescent Calcein으로전환할수있는 estereases를포함한다. 손상된막이존재하 그림 4. Live dead staining of HUVEC cells dosed with Camptothecin. A, 0 nm camptothecin; B, 500 nm camptothecin; C, 1000 nm camptothecin; D, 5000 nm camptothecin. The top level of photographs shows the calcein staining. The number of cells fluorescing green decreases as the level of drug increases. Conversely in the lower photographs the red stain of cells with compromised membranes increases with increasing drug. 관련제품 제품명용량 TaKaRa Code 500 회 LT ViaLigh Plus Assay Kit 1,000 회 LT ,000 회 LT 회 (TC plate 5 개포함 ) LT ,000 회 LT ToxiLight Non-Destructive Cytotoxicity BioAssay Kit 500 회 LT 회 (TC plate 5 개포함 ) LT ToxiLight 100% Lysis Control Set 100 ml (200 tests) LT March

22 주목의신상품 1 단 10 분만에배양세포로부터 Real Time RT-PCR 용주형조제 CellAmp TM Direct RNA Prep Kit for RT-PCR (Real Time) One step 과 Two step Real Time RT-PCR 모두에적용가능 SYBR Green 검출법과 TaqMan probe 검출법에사용가능 경제적인반응비용 본제품은플레이트로배양한동물세포로부터 별도의 RNA 추출과정없이간편하게 Real Time RT-PCR 용의주형을조제하기위한키트로, 배양세포로부터 10 분이면주형샘플을조제할 수있다 ( 그림 1). One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II(Perfect Real Time) (TaKaRa Code RR086A/B) 등의시약과병행하면약 2 시간이내에유전자발현해석까지실시할수 있고 PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa Code: RR037A/B) 와함께 사용하면약 30 분내에 Real Time RT-PCR 용 주형 cdna 를합성할수있어, 효율적이고 대규모해석에유용하다. 본제품으로조제한 시료는 Real Time PCR 중 SYBR Green 검출법이나 TaqMan probe 검출법모두에 적용할수있어다양한실험에사용될수있다. 제품구성 CellAmp Direct RNA Prep Kit for RT-PCR (Real Time) (200 회 ) *1 CellAmp Washing Buffer (12.5 ml 2) CellAmp Processing Buffer (10 ml) DNase I for Direct RNA Prep (200 μl) * 1 : 96 well 플레이트로세포배양시, 200 well 분의처리가가능하다. : 버퍼와프로토콜의개선으로기존 CellAmp Direct RNA Prep Kit for One Step RT-PCR (Real Time) (TaKaRa Code 3731) 보다신속하고편리하게되었다. 실험예 1 : SYBR Green 검출법 방법 96 well 플레이트에 HeLa 세포를 cells/ well 씩분주하여 48 시간배양한뒤, 본키트의 프로토콜에따라세포용해물 (lysate) 50 μl 를 조제했다. 용해물을 10 배씩단계적인희석을통 함께사용하면좋은제품 해원액용해물부터 10,000 배희석액까지만 든후각각 2 μl 씩을주형으로 One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II 를이용한 1 Step Real Time RT-PCR 과, PrimeScript RT reagent Kit 와 SYBR Premix DimerEraser 를이용한 2 Step Real Time RT-PCR 로 RPLP1 유전자의발 현해석을실시하였다. 제품명용량 TaKaRa Code 1-Step Real Time RT-PCR Kit One Step SYBR PrimeScript RT- PCR Kit (Perfect Real time) One Step SYBR PrimeScript RT- PCR Kit I (Perfect Real Time) 100 회 RR066A 500 회 RR066B (A 5) 100 회 RR086A 500 회 RR086B (Ax5) (Perfect Real Time) *1 500 회 RR064B (Ax5) One Step PrimeScript RT-PCR Kit 100 회 RR064A 2 Step Real Time RT-PCR Kit 200 회 RR037A PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) *2 SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time) 800 회 RR037B (Ax4) 200 회 RR041A 400 회 RR041B (Ax2) 200 회 RR081A 400 회 RR081B (Ax2) SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time) *3 200 회 RR091A 400 회 RR091B (Ax2) Premix Ex Taq (Perfect Real Time) *1 200 회 RR039A 400 회 RR039B (Ax2) 1:TaqMan Probe 검출용 2:Real Time RT-PCR 전용의역전사 Kit 3:Real Time PCR 시약의최신판 22 Life Science & Biotechnology

23 주목의신상품 1 CellAmp Washing Buffer 로세포를세정 Processing 용액 * 을첨가 실온 5 분 세포용해물을회수 * CellAmp Processing Buffer 에 DNase I 를첨가한것 열처리 75, 5 분 유전자발현해석까지불과 2 시간 ~ 2 시간 30 분! Real Time RT PCR 용의주형으로세포용해물완성! Real Time RT PCR 로유전자발현해석 결과 Ct 값을연결해본결과, 1-Step 과 2-Step Real Time RT-PCR 의검량선모두높은직선성을 나타냈다. 또 10,000 배희석액 ( 약 4 세포에상 당 *) 에서도유전자발현을검출할수있었다 ( 그 림 2). * 본실험에서는 48 시간배양하여약 cells/well 까지증식시켰다. 세포의종류나타겟이되는유전자에 따라검출에한계가되는최소세포수는다르다. 그림 1. 실험과정 실험예 2: TaqMan Probe 검출법 1 Step RT-PCR 2 Step RT-PCR 시약 : 1 Step 용 : One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II (Perfect Real Time) 2 Step 용 : PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) 과 SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time) 측정기기 : Thermal Cycler Dice Real Time System 측정유전자 : Human RPLP1 프라이머 : Perfect Real Time Support System으로제작한프라이머 방법 96 well 플레이트에 MEF-3T3 세포를 cells/well씩분주하여 48 시간배양후에, 본키트의프로토콜에따라서용해물 50 μl 를조제했다. 용해물은 10배씩단계적인희석을통해용해물원액부터 10,000배희석액까지만들고각각 2 μ l 를주형으로 One Step PrimeScript RT-PCR Kit 를이용하여 1 Step Real Time RT-PCR을하거나 PrimeScript RT reagent Kit 와 Premix Ex Taq을이용해 2 Step Real Time RT-PCR을통해 Actb 유전자의발현해석을실시했다. 검출에는 TaqMan Probe를사용했다. 그림 2. SYBR Green 검출법에의한해석결과 1 Step RT-PCR 2 Step RT-PCR 시약 : 1 Step용 :One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time) 2 Step용 :PrimeScript RT reagent (Kit Perfect Real Time) 또는 Premix Ex Taq (Perfect Real Time) 측정장치 :Thermal Cycler Dice Real Time System 측정유전자 :Mouse Actb 프라이머와 Probe: TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems사 ) 의프라이머와 TaqMan Probe 시약 : One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II (Perfect Real Time) 장치 : Thermal Cycler Dice Real Time System 타겟 : RPLP1 TFRC 프라이머 : Perfect Real Time Support System으로제작한프라이머 그림 3. TaqMan Probe Assay 의해석결과 그림 4. Ct 값으로확인한용해물조제의재현성 March

24 주목의신상품 1 단 10 분만에배양세포로부터 Real Time RT-PCR 용주형조제 CellAmp Direct RNA Prep Kit for RT-PCR (Real Time) 결과 Ct 값을산출한결과, TaqMan Probe 검출에서도 1 step 과 2 Step Real Time RT-PCR 의검량선은 모두높은직선성을나타냈다. 또 10,000 배희석 액 ( 약 4 세포에상당 *) 에서도유전자발현을검 출할수있었다 ( 그림 3). * 본실험에서는 48 시간배양하여약 cells/ well 까지증식시켰다. 세포의종류나타겟이되는유전자에따라검출에한계가되는최소의세포수는달라질수있다. 실험예 3: 용해물 (lysate) 조제의재현성 정제 total RNA 1 Step Real Time RT-PCR 분주세포수 10 4 cells 분주세포수 10 3 cells 2 Step Real Time RT-PCR 분주세포수 10 2 cells 방법 96 well 플레이트에 HeLa 세포를 cells/ well씩분주하여 72 시간배양한후, 본 kit을이용해 well당용해물 50 μl를만들었다. 각각 2 μl를주형으로 1 Step Real Time RT-PCR을실시하여 RPLP1과 TFRC 유전자의발현해석을실시했다. 결과 RPLP1과 TFRC, 두유전자에대해일정한 Ct 값을얻을수있었고, N=24의실험으로재현성높은유전자발현해석결과를얻을수있었다 ( 그림 4). 실험예 4: 유전자발현프로파일의해석 방법 96 well 플레이트에 HeLa 세포를 , , cells/well씩분주후, 48 시간배양한후, 프로토콜에따라서각각용해물 50 μl 를조제했다. 각용해물 2 μl를 Real Time RT-PCR의주형으로이용하여 SYBR Green 검출법에의해 1 Step과 2 Step Real Time RT- PCR로 6 종류유전자를타겟으로유전자발현해석을실시했다. 대조군으로 FastPure RNA Kit으로정제한 100 ng 의 total RNA를이용해동일한유전자발현해석을실시하였다. 결과 세포양에상관없이모든세포에서조제된용해물은 1 Step과 2 Step Real Time RT-PCR 모두에서, FastPure RNA Kit으로정제한고순도 RNA 이용했을경우와동등한안정적인유전자발현프로파일결과를얻을수있었다 ( 그림 5). 관련제품 타겟 : 제품명용량 TaKaRa Code [Real Time PCR 장치 ] 정제 total RNA 시약 : 1 Step 용 :One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II (Perfect Real Time) 2 Step 용 :PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) 과 SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time) 분석장치 : Thermal Cycler Dice Real Time System 프라이머 :Perfect Real Time Support System 으로제작한프라이머 그림 5. 6 종류의유전자를타겟으로한발현해석결과 Thermal Cycler Dice Real Time System 1 system TP800 Thermal Cycler Dice Real Time System MRQ 1 system TP860 Thermal Cycler Dice Real Time System Single 1 system TP850 Thermal Cycler Dice Real Time System Single MRQ 1 system TP870 [Real Time PCR 용 Housekeeping Gene Primer Set] Human Housekeeping Gene Primer Set 1 set 3790 Mouse Housekeeping Gene Primer Set 1 set 3791 Rat Housekeeping Gene Primer Set 1 set 3792 [Real Time RT-PCR 용 primer 온라인검색 & 주문시스템 ] Perfect Real Time Support System 분주세포수 10 4 cells * License Notice: [19], [20], [21], [22], [23] 분주세포수 10 3 cells 분주세포수 10 2 cells shopping/perfect_real_time.asp 24 Life Science & Biotechnology

25 유기용매를 기반으로 AGPC법에 의한 total RNA 추출시약 TaKaRa Code Size 100 ml 200 ml RNAiso Plus AGPC (Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform) 법에 의한 total RNA 추출시약 배양세포, 동물조직, 식물조직 으로부터 total RNA 추출 샘플량이 많은 경우나 total RNA를 대량으로 회수하고 싶은 경우에 강력 추천! 유기용매층이 적색으로 경계면 구분이 쉽고, 상층 회수가 간단! 약 50분에 추출 정제가 완료 RNAiso Plus 프로토콜 고순도 total RNA 추출 가능 <HeLa 세포 1.5 X 106 으로부터 회수> 회수량 : 37.3 ug, OD260/280=1.96 샘플에 RNAiso Plus 첨가 Homogenize Chloroform 첨가, vortex 원심분리, 상층(수층) 회수 Isopropanol 침전 고순도 total RNA Agilent 2100 Bioanalyzer에 의한 분석 결과 TIP! RNAiso Plus 와 FastPure RNA Kit(9190)를 조합하여 사용하면, 매우 높은 순도의 total RNA 회수가 가능합니다.

26 주목의 신상품 2 프라이머 dimer 고민을 해결한 Real Time PCR 시약 탄생! SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time) 한층 더 향상된 반응 특이성 (A) 사용이 편리한 premix 타입 증폭곡선 융해곡선 다카라의 Perfect Real Time Support System RR081 (PRTSS) 프라이머 사용 가능 프라이머 dimer SYBR Green I 검출에 의한 Real Time PCR 은 저비용의 간편한 실험방법이지만, 프라이머 dimer가 생성되어 정확한 정량을 방해하는 경 우가 있다. 다카라의 Perfect Real Time 시리즈 RR091 에는 증폭 효율이 뛰어난 SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (TaKaRa Code RR041) 및 반응 특이성을 향상시킨 SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time) (TaKaRa Code RR081) 가 있다. 여기에 추가로 다카라에서는 프라이머 타사 시약 dimer 생성을 철저히 억제하여 반응 특이성을 극대화시킨 SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time) (TaKaRa Code RR091)를 개발하였 다. SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time)는 hot start PCR용 효소 TaKaRa Ex Taq RR081 HS에 의해 cycle 전의 mis-priming을 방지할 뿐 프라이머 dimer 만 아니라, 독자적으로 개발한 보조 단백질을 첨가하고 버퍼 조성을 개선하여 PCR cycle 중 의 mis-priming도 효과적으로 억제한다. SYBR Premix Ex Taq II 에서는 프라이머 dimer의 생 성을 완전히 억제할 수 없었지만, SYBR Premix DimerEraser는 프라이머 dimer를 강력하게 Erase 한다. 그 결과, 높은 반응 특이성으로 미 량인 타겟까지 고감도로 검출되기 때문에, 폭넓 은 주형 농도 범위에서 신뢰성이 높은 정량이 가 능하다. 제품구성 SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time) (TaKaRa Code RR091A/B) (200회, 50 μl 반응기준) SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time) (2 conc.) 1 ml 5 ROX Reference Dye (50 conc.) 200 μl ROX Reference Dye II (50 conc.) 200 μl RR091 타사 시약 주형 cdna 단계 희석액 (HL60 세포, Rat 간 유래 total RNA 1 pg~100 ng 상당량, 각 1 반응) 및 멸균 증류수 (2 반응) 타겟 (A) Human YWHAZ (B) Rat Atp5f1 기기 Thermal Cycler Dice Real Time System 반응 조건 각사 제품의 추천 조건 RR081 95, 30초 (95, 5초/ 60, 30초) 40 cycle 융해곡선 분석 RR091 표준 프로토콜 (3-step PCR) 95, 30초 (95, 5초/ 55, 30초/ 72, 30초) 40 cycle 융해곡선 분석 타사 시약 95, 15분 (94, 15초/ 55, 30초/ 72, 30초) 40 cycle 융해곡선 분석 그림 1. 반응 특이성 비교예-1 26 Life Science & Biotechnology 비특이적 증폭

27 주목의 신상품 2 실험예 [방법] (C) 증폭곡선 융해곡선 RR081 프라이머 dimer를 일으키기 쉬운 프라이머(A) 비특이적 증폭 (B)와 고분자에 비특이적 증폭 산물을 일으키기 쉬운 프라이머(C)를 이용하여, 신제품인 SYBR Premix DimerEraser (TaKaRa Code RR091)와 SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Code RR081) 및 타사 제품의 반응 특이성을 비교했다. RR091 결과 (1) 프 라이머 dimer 생성의 억제 프라이머 (A), (B) 각 제품의 표준 프로토콜로 반응을 실시한 결과, 비특이적 증폭 타사시약 SYBR Premix Ex Taq II나 타사 제품에서는 프 라이머 dimer 등의 비특이적 증폭이 생겼지만, SYBR Premix DimerEraser 에서는 비특이적 증 폭없이 특이성이 높은 반응을 실시할 수 있었다 (그림 1). (2) 주 형 유래의 비특이적 증폭의 억제 프라 이머(C) PCR 증폭 서열이나 주형량에 따라서 고분자 쪽 에 비특이적 증폭 산물이 생기는 경우가 있다 (통상 타겟보다 높은 Tm 값에서 피크가 확인된 다). SYBR Premix DimerEraser 의 표준 프로토 주형 cdna 단계 희석액(HL60 세포 유래 total RNA 1 pg~100 ng 상당량, 각 1 반응) 및 멸균 증류수(2 반응) 타겟 (C) Human GAPDH 기기 Thermal Cycler Dice Real Time System 반응조건 각사 제품의 추천 조건 RR081 95, 30초 (95, 5초/ 60, 30초) 40 cycle 융해곡선 분석 RR091 옵션 프로토콜 (2 step PCR) 95, 30초 (95, 5초/ 60, 30초) 40 cycle 융해곡선 분석 타사 시약 95, 15분 (94, 15초/ 55, 30초/ 72, 30초) 40 cycle 융해곡선 분석 그림 2. 반응 특이성 비교예-2 콜은 3-step PCR이지만, 이와 같이 고분자 쪽 에 비특이적 증폭이 많은 경우에는 옵션 프로토 증폭곡선 융해곡선 콜인 2-step PCR이 유효하다. 이 실험예에서도 SYBR (RR041) SYBR Premix DimerEraser 에서는 옵션 프로토 콜을 적용하여 비특이적 증폭을 완전하게 억제 할 수 있었다(그림 2). 관련 제품 소개 SYBR Ⅱ (RR081) 최적의 시약 선택 패키지 SYBR Premix Reagent Trial Pack 본 고에서 소개한 SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time)를 포함하여, 반응 특이성이 나 증폭 효율이 각각 다른 3종류의 SYBR Green DimerEraser (RR091) I 검출용 Real Time PCR 시약을 패키지화하였 다. 본 Trial Pack은 3종류의 Real Time PCR 시 약을 소포장하여, 실험 목적에 최적인 시약을 선 택할 때 이용할 수 있다. 시약 주형 3 종류의 SYBR Premix λ DNA 1 fg, 10 fg, 100 fg, 1 pg, 10 pg, 100 pg (각 1 반응), No Template Control (2 반응) 증폭 사이즈 300 bp 기기 Thermal Cycler Dice Real Time System PCR 조건 각 시약의 추천 조건 그림 3. SYBR Premix Reagent Trial Pack을 이용한 비교 실험예 (증폭곡선과 융해곡선) March

28 주목의신상품 2 프라이머 dimer 고민을해결한 Real Time PCR 시약탄생! SYBR R Premix DimerEraser (Perfect Real Time) Ct 값 제품구성 SYBR Premix Reagent Trial Pack (TaKaRa Code RR489) ( 각 40 회, 50 μl 반응기준 ) SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (2 conc.) *1 1 ml SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time) (2 conc.) *2 SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time)(2 conc.)* 3 ROX Reference Dye (50 conc.) ROX Reference Dye II (50 conc.) *1 :RR041, *2 :RR081, *3 :RR091 에해당 실험예 방법 검량선 < 증폭효율 > SYBR Premix EX Taq (RR041) 95% SYBR Premix EX Taq Ⅱ (RR081) 94% SYBR Premix DimerEraser (RR041) 86% 그림 4. SYBR Premix Reagent Trial Pack 을이용한비교실험예 ( 검량선과증폭효율 ) 1 ml 1 ml 200 μl 200 μl 본제품을이용해 λdna 를주형으로한 Real Time PCR 을실시해, 3 종류의 SYBR Premix 의 반응성을비교하였다. 각시약의추천조건으로 반응하였고, 본실험예에서는 PCR 증폭사이즈 가추천범위 (80~150 bp) 보다긴 300 bp 이며, 이 는일반적인조건보다는약간증폭이곤란한실 험조건이다. 결과 고찰 - 반응특이성에대해서 SYBR Premix Ex Taq 에서는두반응의 No Template Control 가운데한반응에서프라이머 dimer 라고생각되는비특이적증폭산물이 생겼지만, SYBR Premix Ex Taq II 와 SYBR Premix DimerEraser 에서는 No Template Control 에서증폭은나타나지않고반응 특이성은양호했다 ( 그림 3). - 증폭효율에대해서 검량선으로부터나온 PCR 증폭효율을보면, SYBR Premix Ex Taq 및 SYBR Premix Ex Taq II 가 SYBR Premix DimerEraser 보다증폭효율 이좋은것을알수있었다 ( 그림 4). 이상의결과를종합적으로판단해보면, 이와 같은실험예에서는 SYBR Premix Ex Taq I I 가 가장적합하다고판단할수있다. 결론 (Real Time PCR 의고민해결 ) Real Time PCR 실험에대해서는실험계디자인 에관한문의가많이있다. 프라이머에따라서 는어느시약을이용해도양호한반응이나오는 경우도있으나, 반대로무엇인가문제가발생했 을경우에는그해결이꽤어려운경우도있다. 같은파라미터설정으로설계한프라이머에서 관련제품 SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time) SYBR Premix DimerEraser (Perfect Real Time) 도실제로실험해보면반응성이달라, 실험조 건의최적화에어려움을느끼는연구가가많을 것으로생각된다. Real Time PCR 시약의상당수는사용자의조작 성을중시하여 2 농도의 Premix type 이사용되 고있으나, 이것은사용이편리한반면마그네슘 농도를자유롭게변경할수없는등, 실험조건 의최적화에는불편한점도있다. 이러한관점에 서본고에소개한 SYBR Premix 시리즈는그러 한문제의해결을위해, 각각의실험계에적절한 시약을간단하게선택할수있도록개발되었다. SYBR Premix 시리즈를능숙하게사용하려면 기본이되는시약을선택하고, 개별적인실험계 에적용하여문제가발생할경우는그상황에따 라다른시약으로전환하는것을추천한다. 다 음장의내용을참고하여보다확실한 Real Time PCR 시약선택에도움이되었으면한다. 제품명용량 TaKaRa Code 200 rxns RR041A 400 rxns RR041B (A 2) 200 rxns RR081A 400 rxns RR081B (A 2) 200 rxns RR091A 400 rxns RR091B (A 2) SYBR Premix Reagent Trial Pack 각 40 rxns RR489 PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time) One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time) One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit I (I Perfect Real Time) Premix Ex Taq (Perfect Real Time) One Step PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time) 200 rxns RR037A 800 rxns RR037B (A 4) 100 rxns RR066A 500 rxns RR066B (A 5) 100 rxns RR086A 500 rxns RR086B (A 5) 200 rxns RR039A 400 rxns RR039B (A 2) 100 rxns RR064A 500 rxns RR064B (A 5) Thermal Cycler Dice Real Time System 1 system TP800 Thermal Cycler Dice Real Time System Single 1 system TP850 * License Notice: [19], [20], [21], [22], [23] 28 Life Science & Biotechnology

29 주목의신상품 2 1. 기본시약의선택 우선 2-step PCR 을표준프로토콜로하고신 속한반응이가능한 SYBR Premix Ex Taq (RR041) 또는 SYBR Premix Ex Taq II (RR081) 를시험한다. 두제품의사용구분의기준은그림 5 에나타내었다. RR081 을이용해도비특이적증폭이문제가되 는경우는, SYBR Premix DimerEraser (TaKaRa Code RR091) 를표준프로토콜 (3-step PCR) 로 테스트하고, 더불어고분자측에비특이적증폭 이나타난다면, RR091 를옵션프로토콜 (2-step PCR) 로테스트한다. * RR091 의옵션프로토콜은표준프로토콜에비해증폭효율이약간저하하는경우가있기때문에, 우선은표 준프로토콜로의검토를추천합니다. 2. 각제품의특징 SYBR Premix 시리즈의적절한실험적용으로 모든트러블을신속하게해결! 증폭효율및범용성 : RR041>RR081 이런경우는 RR041 을추천 Real Time PCR 에적절한프라이머설계가어렵다 ( 반응성이나쁘다, 증폭사이즈가길다, etc. ) Real Time PCR 기기는 Smart Cycler System 시리즈를사용 RR041, RR081 모두 OK! 1) Real Time PCR/RT-PCR 로 유전자발현해석 게놈 DNA 를주형으로유전자검출 High-throughput 해석 고속반응을실시하고싶다!! SYBR Premix Ex Taq 탁월한증폭효율로타사 Real Time PCR시약에서는증폭이곤란한서열도증폭가능한예가있다. 일례로, 논문 (Shaik, GM., et al. (2008) Nucleic Acids Res.,36 (15), e93.) 에서시판되는시약에서증폭할수없었다고보고된마우스 Thy-1(864 bp) 의증폭을시도하였다. PCR 조건은논문에기재된것에따랐고, SYBR Premix Ex Taq 를이용할경우증폭에성공하였다 ( 그림 6 상단 ). 또한그림 6의하단은동일조건으로반응한 SYBR Premix Ex Taq II의결과이다. SYBR Premix Ex Taq II 증폭효율과반응특이성모두우수하고사용하기쉬운시약이다. 다카라의 Perfect Real Time Support System의프라이머와같이사용하면높은성공율의 Real Time RT-PCR 결과를얻을수있다. SYBR Premix DimerEraser 증폭효율보다는반응특이성을추구한시약이다. 프라이머 dimer 등의비특이적증폭의고민을해결할수있다. 본제품은 3-step PCR이표준프로토콜이며, SYBR Premix Ex Taq 나 SYBR Premix Ex Taq II 보다약간더많은반응시간을필요로하지만, 최고의반응특이성을실현할수있다. 이런경우는 RR081 을추천 프라이머 dimer 등비특이적증폭을억제하고, 반응특이성을높이고싶다. 다카라의 Perfect Real Time Support System 의프라이머를사용하고있다. 그림 5. RR041 과 RR081 의사용구분의기준 RRO41 RRO81 그림 6. 어려운타겟의증폭예 반응특이성 : RR081>RR041 증폭곡선 융해곡선 March

30 주목의신상품 3 이제부터클로닝은고품질의 Competent Cell 로!! E. coli HST08 Premium Competent Cells 일반적인클로닝에도, 긴단편 (10 kb 이상 ) 클로닝에도최적! 메틸화된 DNA의클로닝도가능 cdna library나 genome library의제작에도추천! SOC 배지, control 플라스미드를첨부 E. coli HST08 Premium Competent Cells은클로닝에필요한거의모든요소를겸비한새로운대장균주의 Competent Cell이다. HST08 Premium 균주는외래의메틸화된 DNA를절단하는유전자 (mcra, mrr-hsdrmsmcrbc) 를완전하게결손시켜한층더높은형질전환능력을가지고있기때문에, 메틸화된 DNA의클로닝에서 cdna library나 genome DNA library의제작, 서브클로닝까지폭넓은실험에사용할수있다. 긴단편의플라스미드 DNA 형질전환능력도뛰어나 TaKaRa DNA Ligation Kit LONG (TaKaRa Code 6024) 과함께사용할경우, 10 kb 이상의긴단편 DNA 클로닝이나 library 제작도쉽게수행할수있다. 본균주는 F 이고, BAC, Fosmid vector의사용이가능하다. 또한, puc계의플라스미드형질전환시에는 β-galactosidas의 α-상보성을이용해 X-Gal에의한재조합체의 blue/white 선별이가능하다. HST08 Premium의유전자형 F -, enda1, supe44, thi-1, reca1, rela1, gyra96, phoa, φ80dlacz ΔM15, Δ(lacZYA -argf) U169, Δ(mrr-hsdRMS -mcrbc),δmcra, λ - 방법 2 kb (100 pg), 10 kb (1 ng), 20 kb (1 ng) 의플라 스미드 DNA 를이용해각 competent cell 을형 질전환하고, ampicillin 을포함한 LB agar 배지 에도말한후얻은콜로니수로부터형질전환효 율을계산했다. 그리고 2 kb 플라스미드 DNA 의 형질전환효율을각각 100 % 로해서 10 kb, 20 kb 플라스미드의형질전환효율의비율을산출 했다 ( 형질전환비율 ). 형질전환효율 ( 형질전환체 / μg플라스미드 DNA) 결과 E. coli HST08 Premium Competent Cells 에서는 2 kb, 10 kb, 20 kb 의플라스미드 DNA 에서도, A 사제품 DH10B Competent Cell 과동등한 이상의형질전환효율을얻을수있었다 ( 그림 1). 또한, 10 kb, 20 kb 의플라스미드 DNA 형질 전환에서는긴단편의플라스미드형질전환에 이용되는 DH5α, DH10B 와비교해약 2 배높은 형질전환효율을확인할수있었다 ( 그림 2). 카탈로그표시 형질전환효율 (/ μg puc19) ( 당사비교데이타 ) 그림 1. 정제플라스미드를이용한형질전환효율의비교 실험예본제품과 E. coli DH5α Competent Cells (TaKaRa Code 9057) 및 A사제품의 DH10B Competent Cell을이용해형질전환효율을비교했다. 카탈로그에표시된각제품의형질전환효율은> 형질전환체 / μg puc19 DNA이다. 형질전환비율 (%) (1) 실험예 -1 : 정제플라스미드를이용한형질 전환효율의비교 그림 2. 긴단편의플라스미드형질전환비율의비교 (2 kb 플라스미드 DNA 의각형질전환효율을 100% 로해서산출 ) ( 당사비교데이타 ) 30 Life Science & Biotechnology

31 주목의신상품 3 (2) 실험예-2 : Ligation 반응액을이용한형질전환효율의비교 방법 2 kb, 20 kb의 DNA 단편과 puc118 Hind III/BAP (TaKaRa Code 3324) 의 ligation 반응에각각 DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(TaKaRa Code 6023) 및 TaKaRa DNA Ligation Kit LONG (TaKaRa Code 6024) 을이용하였다. 반응액의일부를각 Competent Cell로형질전환시켜, ampicillin을포함한 LB (+X-Gal) agar배지에 plating 후, 얻어진 white colony의수로부터형질전환효율을계산하였다. 그리고 2 kb DNA 단편의 ligation 반응액에의한형질전환효율을각각 100 % 로해서 20 kb DNA 단편의 ligation 반응액에의한형질전환비율을산출하였다. 2 kb DNA 단편의 ligation 반응조건 2 kb DNA/Hind III (100 ng) 와 puc118 Hind III/BAP (50 ng) 의 ligation 반응은 DNA Ligation Kit <Mighty Mix> 를이용 (3) 실험예 -3 : Agar 배지상에서형질전환체의 방법 생육속도비교 2 kb, 10 kb 의플라스미드 DNA 를이용하고, 실 형질전환효율 ( 형질전환체수 ) 카탈로그표시형질전환효율 ( μg puc19) 그림 3. Ligation 반응액을이용한형질전환효율의비교 험예 1의방법에따라, E. coli HST08 Premium Competent Cells 및메틸화서열제한결손등유사한유전형질을가지는 A사제품의 DH10B Competent Cell을각각형질전환해서, 15시간배양후 agar 배지상의 colony를촬영했다. 2 kb ligation 반응액 20 kb ligation 반응액 ( 당사비교데이타 ) 20 kb DNA 단편의 ligation 반응조건 20 kb DNA/Hind III (75 ng) 와 puc118 Hind III/BAP (25 ng) 는 TaKaRa DNA Ligation Kit LONG을이용해 16 에서 6시간 ligation 반응 결과 Ligation 반응액을이용한형질전환에대해서도 insert size가 2 kb, 20 kb 모두에서 E. coli HST08 Premium Competent Cells을이용했을경우에가장높은형질전환효율을얻을수있었다 ( 그림 3). 특히 20 kb 단편의클로닝에서는현저한차이를볼수있어 DH5α, DH10B와비교해긴단편의클로닝에서의형질전환율이높은것을알수있었다 ( 그림 4). 따라서통상의클로닝작업을효율적으로하는것은물론, 특히 cdna library나 genome library 제작시 library 중의긴 DNA 단편의함유율을높인다고예상할수있다. 형질전환비율 (%) 그림 kb DNA 단편클로닝시의형질전환비율 (2 kb DNA 클로닝시의각형질전환효율을 100 % 로해서산출 ) ( 당사비교데이타 ) March

32 주목의신상품 3 이제부터클로닝은고품질의 Competent Cell 로!! E. coli HST08 Premium Competent Cells 결과 2 kb 플라스미드 DNA를도입했을경우, 양쪽대장균주에서형질전환 colony의생육속도에분명한차이는확인되지않았다 ( 그림 5 상단 ). 한편, 10 kb 플라스미드 DNA를도입했을경우에는 HST08 Premium 균주는 DH10B 균주에비해분명하게생육속도가빠르고, 15시간후에형질전환 colony를쉽게확인할수있었다 ( 그림 5 하단 ). 대장균주에따라긴단편의플라스미드도입에의해생육이늦어지는현상을자주볼수있지만, HST08 Premium 균주에서는생육속도를유지할수있어통상의배양시간으로도충분한크기의 colony를확인할수있었다. 유전자재조합실험용숙주로사용되고있는대장균주의상당수는 dam methylase, dcm methylase를보유하고있어, 도입된외래플라스미드의 GATC, CCWGG염기서열부분이메틸화된다. 이러한서열이인식부위에포함된일부의메틸화감수성제한효소에서는플라스미드상에인식서열이존재해도절단할수없다. 새롭게발매된 E. coli HST04 dam - /dcm - Competent Cells은본래대장균이가지고있는 2 kb 플라스미드를도입 A사 DH108 메틸화유전자 dam, dcm 이결손되어있어, 본균주를이용해조제한플라스미드 DNA 는 dam 메틸화 (G m ATC), dcm 메틸화 (C m CWGG) 영향을받지않습니다. 본제품은이러한 메틸화감수성의제한효소에서도절단가능한 플라스미드 DNA 를조제하기위한숙주로서 이용할수있다. [ 주의 ] 본제품은클로닝용의숙주에는적합하지않습니다. 형질전환시에는미리구축한플라스미드 를사용하시기바랍니다. HST08 Premium 끝으로 Competent Cell의성능을나타내는척도로써카탈로그등에기재되어있는형질전환효율은일반적으로 Competent Cell 제작직후에정제플라스미드를이용해얻어지는값이사용되고있다. 실제로실험에이용할때의형질전환효율이표기값이하로나타나는일이있다. 또한, 일반적으로 ligation 반응액을그대로형질전환에이용하는경우, 반응액의버퍼조성등에의해형질전환이저해되어충분한효율을얻을수없는경우도있다. 따라서, 카탈로그에기재된형질전환효율만을기준으로 Competent Cell의성능을판단하는것은곤란하다. 신제품의 E. coli HST08 Premium Competent Cells은실험예에서보여준것처럼, 정제플라스미드, ligation 반응액의어느조건에있어서도높은형질전환효율을얻을수있다는것을확인할수있다. 일반적인클로닝작업에서부터 library 제작까지매일사용하는 Competent Cell로연구에큰도움이될것으로생각된다. 10 kb 플라스미드를도입 A사 DH108 그림 5 형질전환후 15시간배양한 colony 관련제품 HST08 Premium ( 당사비교데이타 ) - 자매품 - E. coli HST04 dam - /dcm - Competent Cells (TaKaRa Code 9129) 제품명 용량 TaKaRa Code TaKaRa DNA Ligation Kit LONG 50 rxns 6024 DNA Ligation Kit <Mighty Mix> 50 rxns 6023 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 250 U R010A 1,000U R010B 32 Life Science & Biotechnology

33 Insert Size? 이제더이상 Cloning 에걸림돌이아닙니다. TaKaRa DNA Ligation Kit LONG Product Size TaKaRa Code TaKaRa DNA Ligation Kit LONG 1 kit kb 이상의 DNA 단편 cloning 에최적 BAC library 등긴단편의 DNA library 제작에최적 제품구성 DNA Ligase <LONG> 50 μl 10 X LONG Ligation Buffer 300 μl Control Insert DNA/Hind III (18 kb) 30 μl Control Vector (puc118/hind III/BAP) 10 μl dh2o 1 ml X 2 Sticky end 의경우 50μ l 반응계 x 50 rxns, blunt end 의경우는 50μl 반응계 x 10 rxns 에해당. Transformants x 10 6 cfu / μ g 그림 1. Insert size 별 ligation 효율비교 TaKaRa DNA Ligation Kit LONG (TaKaRa Code 6024), DNA Ligation Kit<Mighty Mix> (TaKaRa Code 6023), T4 DNA Ligase (TaKaRa Code 2011A) 및타사의 ligation kit 를이용하여 4 kb, 10 kb, 18 kb DNA 단편의 ligation 효율을비교하였다. TaKaRa DNA Ligation Kit LONG 은 4 kb, 10 kb, 18 kb DNA 단편의 ligation 에서모두높은형질전환효율을나타냈다. 특히, 18 kb DNA 단편의 cloning 에서는다른제품과비교하여최대 50 배이상의높은형질전환효율을나타냈다. White colony 수 반응액중각 DNA 농도 TaKaRa DNA Ligation kit LONG Vector DNA (ng /μl) Insert DNA (ng /μl) 저농도 고농도 그림 2. 반응액 DNA 농도차이에따른반응성의변화 TaKaRa DNA Ligation Kit LONG 및타사의 ligation kit 를이용하여 18 kb DNA 단편을 ligation 하였다. DNA 농도별비교에서 TaKaRa DNA Ligation Kit LONG 을이용했을경우에가장높은형질전환효율을얻을수있었다. 또한타사의 ligation kit 에비해형질전환효율이 DNA 농도의영향을적게받았으며, 넒은범위의 DNA 농도조건에서형질전환효율이높게유지되는것을확인하였다. March

34 주목의신상품 4 이미지분석실험에최적인 tdtomato- 가장밝은적색형광단백질 최고의밝기 높은응용성 in vivo 실험에서추천본고에소개하는 tdtomato Vectors는 Dr. Roger Tsien의연구실에서개발된 tandem dimmer (td) Tomato를코딩하는 vector로적색형광단백질을발현한다. 이것은 DsRed의단당체변이로써 1) DsRed 항체로검출할수있다 ( 그림 1). 밝기와안정성을염두에둔설계 tdtomato는특히응집현상을줄이도록디자인된 tdtomato 유전자 2개의유전적융합체 2) 로이루어졌다 1). tdtomato의 tandem dimer 구조는형광단백질의밝기에중요한영향을미친다 ( 표 I). tdtomato의 excitation과 emission은각각 554nm과 581nm에서최고값을보인다 1). tdtomato는 intramolecular dimer이기때문에 monomer와유사하게작용하며 N-말단과 C-말단의융합에성공적으로이용된다. 이것은뛰어난광안정성을보이며 maturation( 성숙 ) 반감기 (t 0.5 ) 는 37 에서 1시간이다 1). 뛰어난 in vivo 적용 tdtomato의 emission 파장과밝기는살아있는동물의 imaging study에이상적이다. 첫째로이종이식된전이성유방암마우스모델에서 tdtomato는피부아래 1cm정도의깊이에서도쉽게검출가능하고, 아주작은외상도오랜기간추적및검출된다 3). 두번째모델에선타겟유전자의활성에따른유방암종양의증가를정량하기위해 tdtomato를사용하였다 4). 트랜스제닉마우스모델들이개발되고있는데 그중에는 Cre 재조합반응에대한리포터로써 tdtomato 가이용되는것도있다. 이모델은세 포계통추척이나조직이식연구, 그리고살아있 는세포의형태학연구등에유용한툴로이용될 수있었다 5). tdtomato 는융합단백질을이용한 실험 6) 이나프로모터리포터 7) 로써매우효과적으 로이용되고있다. tdtomato 는형광단백질의밝기, 광안정성, 그리고사용의편리성등으로이미지연구분야에 이상적인최적의형광단백질을만들수있도록 한다. 관련제품 참고문헌 1. Shaner, N. C. et al. (2004) Nature Biotechnol. 22 (12): Campbell, R. E. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (12): Winnard Jr., P. T. et al. (2006) Neoplasia 8 (10): Johnstone, C. N. et al. (2008) Mol. Cell Biol. 28 (2): Muzumdar, M. D. et al. (2007) Genesis 45 (9): Bjørkøy, G. et al. (2005) J. Cell Biol. 171(4): Alandete-Saez, M. et al. (2008) Mol. Plant 1(4): * License Notice: [2], [10] 제품명용량 TaKaRa Code ptdtomato Vector 20 μg ptdtomato-n1 Vector 20 μg ptdtomato-c1 Vector 20 μg pcmv-tdtomato Vector 20 μg pmcherry Vector 20 μg pmcherry-n1 Vector 20 μg pmcherry-c1 Vector 20 μg pmcherry-1 Vector 20 μg Living Colors DsRed Monoclonal Antibody 20 μl Living Colors DsRed Monoclonal Antibody 200 μl Living Colors DsRed Polyclonal Antibody 100 μl 표 1: Fluorescent Protein Properties 1 Fluorescent Protein Excitation Maximum (nm) Emission Maximum (nm) Extinction Coefficient Per Chain (M -1 cm -1 ) Fluorescence Quantum Yield Brightness of Fully Mature Protein Brightness (% of EGFP) t 0.5 for Maturation at 37 t 0.5 for Bleach (sec) tdtomato , , % 1 hr 70 mcherry , ,840 46% 15 min 68 EGFP , , % Shancer, N. C. et al. (2004) Nature Biotechnol. 22(12): Life Science & Biotechnology

35 형광단백질및융합단백질을검출하고싶을때는 Living Colors R Antibody Western Blot Immuno precipitation Immuno cytochemistry 형광단백질항체시리즈 Living Colors R 시리즈에는형광단백질을검출하는다양한 monoclonal antibody 와 polyclonal antibody 가있다. 각항체는 lot 간에일정한성능을보증하며형광단백질은물론, N말단, C말단융합단백질의검출도가능하다. Western blot detection of DsRed and its variants. A HeLa cells were transiently transfected with the following vectors, and then analyzed by Western blot with the DsRed Monoclonal Antibody. Lane 1: pdsred2-n1, Lane 2: pdsred2-c1, Lane 3: pdsred1-c1, Lane 4: pdsred2-mito (N-terminal fusion), Lane 5: pdsred2-nuc (C-terminal fusion), Lane 6: control (untransfected cells). A 20 kda, non-specific band appears with extended exposure. B Western blot with the DsRed Polyclonal Antibody. Lane 1: 25 ng of recombinant AcGFP1 protein. Lanes 2-5: HEK-293 cells were stably transfected with the following vectors. Lane 2: pacgfp1. Lane 3: Control (untransfected cells). Lane 4: pdsred-monomer-n1. Lane 5: pdsred-express-n1. AcGFP1 형광단백질추천하는 antibody TaKaRa Code 적용가능한실험 GFP Monoclonal Antibody WB, IP, IC A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) , WB, IP, IC Full-Length A.v. Polyclonal Antibody , WB, IP A.v. Peptide Antibody , WB, IP, IC AmCyan1 Anti-RCFP Polyclonal Pan Antibody WB AsRed2 Anti-RCFP Polyclonal Pan Antibody WB mbanana mcherry DsRed2 DsRed-Express DsRed-Express2 DsRed Monoclonal Antibody , WB, IP DsRed Polyclonal Antibody WB, IP, IC DsRed Monoclonal Antibody , WB, IP DsRed Polyclonal Antibody WB, IP, IC Anti-RCFP Polyclonal Pan Antibody WB DsRed Monoclonal Antibody , WB, IP DsRed Polyclonal Antibody WB, IP, IC DsRed Monoclonal Antibody , WB, IP DsRed Polyclonal Antibody WB, IP, IC DsRed Monoclonal Antibody , WB, IP DsRed Polyclonal Antibody WB, IP, IC DsRed-Monomer DsRed Polyclonal Antibody WB, IP, IC HcRed1 morange mplum mraspberry mstrawberry tdtomato ZsGreen1 Anti-RCFP Polyclonal Pan Antibody WB HcRed Polyclonal Antibody WB DsRed Monoclonal Antibody , WB, IP DsRed Polyclonal Antibody WB, IP, IC DsRed Monoclonal Antibody , WB, IP DsRed Polyclonal Antibody WB, IP, IC DsRed Monoclonal Antibody , WB, IP DsRed Polyclonal Antibody WB, IP, IC DsRed Monoclonal Antibody , WB, IP DsRed Polyclonal Antibody WB, IP, IC DsRed Monoclonal Antibody , WB, IP DsRed Polyclonal Antibody WB, IP, IC Full-Length ZsGreen Polyclonal Antibody WB Anti-RCFP Polyclonal Pan Antibody WB ZsYellow1 Anti-RCFP Polyclonal Pan Antibody WB EGFP* ECFP* EYFP* GFP Monoclonal Antibody WB, IP, IC A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) , WB, IP, IC Full-Length A.v. Polyclonal Antibody , WB, IP WB= Western Blot. IP= Immunoprecipitation IC= Immunocytochemistry * 종매품 : vector 만종매

36 주목의신상품 5 혁신적인 directional 클로닝방법 In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kits 빠르고쉽게 PCR 산물을 directional 클로닝 어떤형태든어떠한벡터라도정확히클로닝 제한효소, ligase, phosphatase 가필요없음 Amplify your gene of interest Design gene-specific primers with 15 bp extensions homologous to vector ends In-Fusion PCR Cloning Kits는 PCR로증폭한인서트 (insert) 를제한효소로처리하여선형화 (linearized) 된어떠한벡터에라도 30분정도면클로닝할수있다 1, 2) ( 그림 1). 새롭게출시된 In-Fusion Advantage PCR Cloning Kits는 NucleoSpin Columns 또는 Cloning Enhancer 가포함되거나또는포함되지않은형태로되어있어서, 클로닝전에 PCR 산물을가장적합하게처리할수있는방법을선택할수있다. 또한다양한용량과형태로제품이구성되어있어, 자신의실험목적에따라 PCR 클로닝반응을최적화할수있다. 사용할벡터가준비되지않은경우라면, 형광단백질을융합하거나재조합단백질정제용 6xHN tags이있는다양한 In-Fusion Ready Prelinearized Vectors를선택할수있다 3, 4) (pacgfp1-c In-Fusion Ready Vector, In-Fusion Ready BacPAK vector set 등 ). 또한 PCR 클로닝에최적화된 Fusion-Blue Competent Cells을사용하면클로닝효율을극대화할수있다. PCR product Add proprietary Cloning Enhancer to the PCR product OR spin-column purify The In-Fusion Enzyme creates single-stranded regions at the ends of the vector and PCR product, which are then fused due to the 15 bp homology Any linearized vector Recombinant vector 30 min single-tube reaction 그림 1. The In-Fusion Advantage Cloning Protocol. A thermostable, high-fidelity DNA polymerase and genespecific primers are used to generate a PCR product containing a gene of interest with 15 bp extensions homologous to the ends of vector. The PCR product is either treated with Cloning Enhancer or spin columnpurified, and combined with the vector in a 30 min In-Fusion Advantage cloning reaction. The cloning reaction is then used to transform E. coli. 표 1. In-Fusion PCR Cloning vs. 기존클로닝시스템 기존클로닝시스템의한계를뛰어넘다! In-Fusion PCR Cloning 시스템은다른클로닝시스템에서는보기어려운몇가지독특한장점을갖고있다 ( 표 1). In-Fusion을사용하면, 하나또는그이상의인서트를선형화된벡터의어떠한위치에라도클로닝할수있고, 단일스텝으로원하는컨스트럭트를만들수있다. In-Fusion 방법은 A-overhangs의유무에영향을받지않기때문에, PCR 산물을증폭할때 fidelity가높은 thermostable DNA polymerase 를사용할수있다. 하지만최상의결과를얻기위해서는 fildelity 매우높은 Advantage HD Polymerase Mix 또는 PrimeSTAR HD DNA polymerase를사용하는것을권장한다. 기존클로닝시스템의제한점 벡터선택이제한적 킷트에따라다른벡터사용 킷트에포함된벡터만사용 제한효소처리및 ligation 이필요 벡터와인서트의제한효소서열을맞춰야함 사용할수있는제한효소사이트가한정적 복잡한컨스트럭트는서브클로닝이필요 시간이많이소요되고, 각각의조정을통한복수의클로닝 긴인서트의경우클로닝효율이낮음 가능한인서트사이즈가제한적 Nondirectional 클로닝의경우에는 insert 방향검증을위해컨스트럭트스크리닝필요 원하지않는 base pairs 가최종컨스트럭트에삽입되는경우가생김 중형, 대형스케일의클로닝에적합하지않음 In-Fusion Advantage 클로닝시스템 PCR 산물을선형화된어떠한벡터에라도클로닝가능 (PCR 산물은벡터의양말단서열과 15bp homology) 제한효소처리나 ligation 이불필요 PCR 산물내의제한효소사이트에의해클로닝이영향받지않음 서브클로닝이불필요 단지 30 분의반응으로복수의 PCR 산물을원하는벡터에클로닝가능 In-Fusion 시스템은 12 kb 까지의인서트 DNA 를효율적으로클로닝 ( 표 2, 표 3 참조 ) In-Fusion 시스템은 directional 클로닝이고, 인서트는원하는방향으로위치 원하지않는 base pairs 의삽입없이정확한클로닝 In-Fusion 클로닝기술은자동화하기적합함 36 Life Science & Biotechnology

37 주목의신상품 5 클로닝효율을높이기위한 PCR 산물의정제방법으로는클로닝에앞서 Cloning Enhancer 를사용하거나 NucleoSpin Extract II로스핀- 컬럼정제하는방법을선택할수있다. Cloning Enhancer를사용하면백그라운드주형 DNA를제거하여, 별도의 PCR insert 정제단계가필요없다. In-Fusion Enzyme의독특한 end-joining 능력으로 ligase나제한효소없이클로닝이가능하고, 불필요한 base가추가되지않고정확한클로닝결과를얻을수있다. 어떤 insert, 어떤벡터도가능 In-Fusion 클로닝은어떠한 PCR 단편이라도선형화된모든벡터에클로닝이가능하며, 이때인서트양말단은선형화된벡터의말단서열과 15 bp homology를가져야한다. 이 homology 영역은타겟 DNA를증폭하기위해프라이머를디자인할때프라이머의 5 말단에목적하는벡터서열을삽입하면된다. Clontech의홈페이지에서는 In-Fusion용프라이머디자인프로그램을제공하고있기때문에이를사용하면편리하게프라이머를디자인할수있다 ( tech.com/infusion/). 벡터의선형화는 PCR 또는제한효소로처리하거나, Clontech의 pre-linearized In-Fusion Ready Vectors를직접사용할수있다. 제한효소가필요없는자동화된클로닝을원한다면, PCR 증폭으로선형화된벡터를준비하는것을추천한다 5). 벡터의선형화이외에벡터에어떠한처리도필요하지않다. 다양한사이즈에대한탁월한클로닝효율 In-Fusion 클로닝시스템의장점을증명하기위해서, In-Fusion PCR Cloning Kits와타사의 PCR cloning kits를이용하여다양한사이즈의클로닝을비교하였다. 각각의 insert 사이즈에대한클로닝효율을비교할결과, In-Fusion Cloning Kits가 PCR 산물 (insert) 의길이에상관없이많은수의클론을생성하여그우수한성능을확인할수있었다 6), 7) ( 표 2). 또한, 이를상세분석한결과, 높은클로닝효율은물론정확한클론에대한비율도높음이확인되었다 6), 7) ( 표 3). 소형및 high-throughput 적용 In-Fusion 클로닝시스템은 PCR 클로닝을위한가장탄력적인방법으로, 자동화클로닝시스템적용에도적합하다. In-Fusion 시스템은 표 2. Transformation 효율 (Number of Colonies) 1 Insert Size (kb) In-Fusion 2 A 사 S kit 2 B 사 T kit None (control) ~ ~1, ~1, ~ ~1, ~1, Cloning was performed according to the instructions for each kit, with transformation into the required E. coli cell lines. The numbers of colonies generated for the indicated inserts are shown. Prior to setting up the cloning reactions, PCR fragments between 0.5 kb and 6 kb in size were spin column-purified, and the 8 kb and 12 kb fragments were gel-purified. Because the Cloning Enhancer was used to treat the 0.5 kb 6 kb PCR inserts for use with the In-Fusion PCR Cloning Kit, there was no need to purify these inserts. All of the transformants were plated on LB/Amp plates 6), 7). 2 For the In-Fusion and S kit products, only 1/10 of the total transformation mixes were plated for the 0.5 kb, 1 kb, 2, kb, 4 kb, and 6 kb insert sizes. For all other fragment sizes and the Directional T kit, the entire transformation was plated. 표 3. 정확한인서트를포함하는플라스미드비율 1 Insert Size (kb) In-Fusion A 사 S kit 2 B 사 T kit Ratio % Ratio % Ratio % 0.5 8/ /8 50 6/ / /8 0 4/ / /8 50 0/ / /8 0 6/ /8 50 3/ / / /0 NA 1/ / /0 NA 0/8 0 1 The ratio and percentage of positive inserts relative to the number of clones sampled for each of the three products are shown. Screening was performed via PCR on randomly chosen colonies for the 0.5 kb and 1 kb inserts, and by plasmid isolation and restriction digestion for the 2 kb, 4 kb, 6 kb, 8 kb, and 12 kb inserts 6), 7). 2 The orientation of the clones for the nondirectional S kit method was not determined. The S Kit was incapable of cloning the 8 kb and 12 kb inserts in our experiments. Harvard Medical School 8), Stanford University School of Medicine 9) 및 University of Oxford 10) 등을포함한다양한 high-throughput 클로닝프 로젝트에사용된실적이있다. 액상타입과 drydown 타입에대한테스트결과, 소형스케일이 나 high-throughput 에서동일한클로닝효율을 보였다. 또한 2 가지형태모두 12 kb 까지클로닝 이가능하였다. In-Fusion 을사용하면누구나클로닝전문가! In-Fusion 기술은 2 개의 DNA 단편뿐만아니라, 4 개의단편까지한번의반응으로정확하게클 로닝이가능하다 11, 12). 복수의 PCR 산물을제한 효소처리가필요없이, 단일스텝으로선형화 된벡터에동시에클로닝할수있다 13) ( 그림 2). In-Fusion 반응은새로운클로닝가능성을열 어두었다. 또한본시스템을사용하면, 호환 ( 교 환 ) 가능한영역을갖는기본발현벡터를제작 할수있고, 정확한융합단백질제작, DNA 단 편제거또는치환, point mutation 삽입, 내부 형광융합단백질제작, 유전자의 tags 를교환하 는것등이가능하다 11, 13). In-Fusion 은다양한 사이즈의복수의인서트라도빠르고편리하게 클로닝할수있기때문에, 기존클로닝시스템 에서제한되었던클로닝을현실화할수있다. March

38 주목의신상품 5 혁신적인 directional 클로닝방법 In-Fusion TM Advantage PCR Cloning Kits Primers for PCR Amplification of the PD-L2 Extracellular Domain, IgG2a Fc, and IgA Tailpiece * PD - L2 Extracellular Domain with 15 bp Overlaps to NcoI-Digested Vector and IgG2a Fc, 693 bp PCR Product Sense (NcoI site is underlined) 5 - TTCAAATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3 Antisense 5 - CTTGATTGTGGGCCCTCTGGGGACTTTGGGTTCCATCCGA-3 * IgG2a Fc, 678 bp PCR Product Sense 5 - GGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTC-3 Antisense 5 - CCGGGAGAAGCTCTTAGTC-3 * IgA Tailpiece with 15 bp Overlaps to IgG2a Fc and SalI-Digested Vector, 100 bp PCR Product Sense 5 - AAGAGCTTCTCCCGGCTGTCGGGTAAACCCACCAATGTCAG-3 Antisense (SalI site is underlined) 5 - AGTAACGTTAGTCGACTCAGTAGCAGATGCCATCTC-3 그림 2. Seamless construction of a three-domain immunoglobulin fusion protein with a four-piece In- Fusion reaction. Segments were generated by PCR using primers that contained a 15 bp overlap with the adjacent segment, and bp of segmentspecific sequence. Colored regions indicate overlap regions with 15 bp of identity. Arrows indicate PCR primers. The segments were joined to a NcoI-SalI-digested expression vector in a ligase-free In-Fusion reaction. 참고문헌 1. In- Fusion PCR Universal Cloning Kits. (October 2005) Clontechniques XX (2): In-Fusion 2.0 CF Liquid PCR Cloning Kits. (April 2008) Clontechniques XXII I(2): Fluorescent Protein Vectors. (April 2008) Clontechniques XXIII (2): In-Fusion Ready BacPAK Vector Set. (July 2006) Clontechniques XXI (2): Benoit, R. M. et al. (July 2006) Clontechniques XX I (2): Superior One- Step Cloning of PCR Fragments into Any Vector with the In- Fusion 2.0 Cloning System. (April 2007) Clontechniques XXII (2): Efficient Cloning of Long PCR Inserts with the In-Fusion PCR Cloning System. (April 2007) Clontechniques XXII (2): Marsischky, G. & LaBaer, J. (2004) Genome Res. 14 (10B): Hartman, S. et al. (January 2005) Clontechniques XX (1): Berrow, N.S. et al. (2007) Nucleic Acids Res. 35 (6):e Zhu, B. et al. (2007) BioTechniques 43 (3): In-Fusion PCR Cloning Kits-FAQs (July 2007) Clontechniques XXII (3): Design Genes with Ease Using In-Fusion Cloning. (April 2008) Clontechniques XXIII (2): * License Notice: [11] In-Fusion 시스템제품 제품명형태용량 Cloning Enhancer Included Spin Columns Included TaKaRa Code Liquid 10 rxns In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit w/cloning Enhancer In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit w/nucleospin Liquid 50 rxns Liquid 100 rxns Liquid 10 rxns Yes Liquid 50 rxns Yes Liquid 100 rxns Yes Liquid 10 rxns Yes Liquid 50 rxns Yes Liquid 100 rxns Yes Life Science & Biotechnology

39 PrimeSTAR 는 Pfu 가아닙니다! Pfu 보다더정확한 Polymerase! PrimeSTAR R HS DNA Polymerase Top 클래스의높은 Fidelity - Pfu polymerase 보다정확한, High Fidelity PCR 효소중 No.1 High Fidelity PCR 효소중가장높은증폭효율 - 3' 5' exonuclease 활성이있는데도 Taq 보다높은증폭효율 Library 로부터복수 clone 을 PCR, cdna cloning - 하나의반응조건에서다양한길이의타겟증폭 높은 priming 효율, 항체를첨가한 Hot Start PCR - 특이성높은증폭가능 PrimeSTAR R HS 및각종 PCR 효소의정확성비교 High fidelity PCR 효소로알려진 Pfu DNA Polymerase 에비해정확성이더욱높아짐 PrimeSTAR R HS Pfu DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 에러율산출방법 : GC rich 로비교적변이가들어가기쉬운 Tth 게놈 DNA 를주형으로임의로선택한 10 종류의영역을 PCR 증폭후, 각각을벡터에클로닝하여각서열에대해복수클론을픽업하고 sequencing 을실시하여에러율을확인하였다. PrimeSTAR R HS 는 sequencing 한총염기수 484,429 base 에대해에러는불과 15 염기만나타났다. 이결과는 High Fidelity PCR 효소로잘알려진 Pfu DNA Polymerase 의정확성을크게상회하는것이다. TIP! 일반적인 Taq 의에러발생율이얼마인지아시나요? 그렇다고 3' 5' exonuclease 활성 (Proofreading) 이있다고완벽할수는없습니다! PCR 후 expression 용 cloning, site directed mutagenesis, mutation detection 등을계획한다면, 반드시사용하는 polymerase 의 fidelity 를따져보세요.

40 주목의 신상품 6 빠르고, 쉽게 His-Tagged Protein을 정제하는 HisTALONTM Cartridge 생물학적 활성을 보존한 단백질의 높은 회수율 syringe를 기본으로한 간편한 실험법 TALON Superflow Resin과 함께 사용하면 높 은 순도와 높은 정제수율 가능 T ALON resin을 사용한 2,400 편 이상의 publication 샘플의 전처리와 정제과정에서 목적 단백질의 생물학적 활성을 보존하고 단백질회수율을 높 이려면 실험의 전반적인 상황과 진행 시간을 잘 조절해야 한다. ph가 지나치게 높거나 낮은 조 건, 또는 정제과정에서 protease나 기타 다른 첨 가물들이 존재한다면 yield를 떨어뜨리는 원인 이 될 수 있다. 그러나 실험 진행을 간소화 한다 면 실험에 부정적 영향을 미치는 요인들을 충분 히 제거하거나 줄일 수 있다. 본 제품은 빠르고 효과적인 샘플의 전처리 단계와 양적으로 단백 질을 충분히 확보할 수 있는 실험과정(capture- 그림 1. T he HisTALON Cartridges (1 ml) provide highly efficient and specific method for purifying histagged proteins. and-release follow-up step)를 포함하면서, 동시 에 쉽게 사용 가능하다는 장점을 가지고 있어 목 적 단백질의 활성도를 최대화하는데 도움을 줄 것이다. 표 I. C omparison of HisTALON Cartridge (1 ml) Protein Yield & Activity to that of Competitor Cartridge1 Starting Sample Flowthrough Protein AcGFP1 (mg) (RFU) Protein AcGFP1 (mg) (RFU) Wash Eluate 클론텍에서 강력히 추천하는 TALON Superflow Resin (flow rate: 5~20 /min) 제품을 사용하 Vendor 면 단백질 정제를 보다 빨리 진행할 수 있다. 이 Protein (mg) AcGFP1 (RFU) Protein (mg) AcGFP1 (RFU) resin은 Superflow 6 (다공성의 견고한 agarose 유도체) 와 선택성이 높은 immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) ligand Clontech , , ,114 Vendor G , , ,111 Vendor Q , , , ,320 Vendor P , , ,214 인 TALON으로 구성되어 있다1-6). TALON은 cobalt의 tetradentate chlelator 성질을 갖고 있으 며, his-tagged protein과 특이적으로 결합한다. 여기에서 TALON Superflow Resin과 HisTALON Cartridges (그림 1)의 사용법에 대해서 알 아보기로 하자. 본 cartridge는 resin이 충진되어 있으며 박테리 아, mammalian 혹은 baculovirus-infected cell로 부터 추출한 total soluble protein으로부터 효율 1 적으로 his-tagged protein을 정제하기 위해 최 적화되어 있다. 40 Life Science & Biotechnology 2 3 Extraction and chromatography were performed according to the respective vendor s recommendations(see the Figure 2 caption for the Clontech sample extraction procedure). Extraction in presence of lysozyme. Extraction with the product-specific recommended extraction buffer.

41 주목의신상품 6 생물학적활성을보존한단백질정제의극대화 HisTALON Cartridge는생물학적으로활성을가진단백질의회수율을최대화시킬수있도록제작되었다. Co 2+ 이온의안정적인 chelation과 TALON의반응특이성이조화를이루어월등한고순도의단백질정제결과를확인할수있었고, 이는곧정제된단백질의양과도밀접한관련이있다 ( 경쟁사제품과비교, 표 1). 동시에 20 mg이넘는 his-tagged AcGFP1가하나의 HisTALON cartridge에흡착할수있음을확인하였다. UV absorbance (280 nm) Load Wash Elute 높은재현성과빠른결과그림 2는 HisTALON Bufer Set과 HisTALON cartridge를이용한단백질추출과정제과정을세가지 chromatography의결과로보여준다. Protein content와 fluorescence signal의차이가 5% 이하로재현성이높음을확인할수있었다 (data not shown). 실험의진행은추출에서정제까지 1시간이내에가능하다. 쉽게자동화하거나 syringe-based 정제가능 HisTALON Cartridge는부수적으로 buffer set 과함께사용하면효율이높아지고, 순도가높은결과물을얻을수있다. 게다가 AKTA FPLC 과같은자동화제품을함께사용한다면 선택적으로순도를높일수있다. Cartridge와 buffer는각각 HisTALON Cartridge (5 x 1 ml cartridge 형태로판매 ) 와 HisTALON Buffer Set로사용이가능하며이를조합한 HisTALON Cartridge Purification Kit 제품도있다. 또한 cartridge 는 Luer Lock Syringe Fitting (GE Healthcare, Cat. No ), M6 FPLC fitting (GE Healthcare, Cat. No & ) 과함께 syringe를이용한단백질정제에적용가능하다. HisTALON Cartridge는빠르고쉬우며 chromatographic separation에재사용이가능하고, 다방면에적용할수있다. 하지만이러한 cartridge의재사용은동일한 protein일경우에만사용해야하며, 이와관련된방법은제품매뉴얼에설명되어있다 Minutes 그림 2. HisTALON Cartridges provide highly reproducible and rapid his-tagged protein purification. Protein extraction and chromatography were performed according to the User Manual, with 0.4 g pellets of E. coli cells expressing his-tagged AcGFP1. These cells were extracted in the recommended volumes of extraction buffer and centrifuged at 10,000 x g for 20 min, at 4 C. For each run, extract from 250 mg of cells was consequently applied to the cartridge using the recommended loading buffer and flow rate, on an FPLC system from GE Healthcare (used for all the purifications described in this article). After the wash and elution steps were completed, all fractions, as well as the original samples, were analyzed for protein content 7) and relative fluorescence (from active AcGFP1) on a 96-well fluorescence spectrophotometer. A high level of reproducibility was observed between runs, with differences of less than 5% in both protein content and fluorescent signal (data not shown). The entire process, including extraction and purification, was completed in less than 1 hour. M M 그림 3. HisTALON Cartridges yield higher purity than a competitor. Fractions from the purification of histagged AcGFP1 on respective HisTALON and Vendor P cartridges were compared via electrophoresis on a 4 15% SDS polyacrylamide gel stained with Coomassie Blue. Lanes M: Bio-Rad Precision Plus Protein All Blue Standards. Lane 1: HisTALON extract. Lane 2: HisTALON flowthrough. Lane 3: HisTALON eluate. Lane 4: Vendor P extract. Lane 5: Vendor P flowthrough. Lane 6: Vendor P eluate. A contaminating high molecular weight band appeared in Lane 6 (Vendor P eluate), but not in Lane 3 (HisTALON eluate), indicating that the HisTALON eluate was of higher purity-consistent with the data in Table I. March

42 주목의신상품 6 빠르고, 쉽게 His-Tagged Protein 을정제하는 HisTALON TM Cartridge SDS-PAGE를통해경쟁사제품과 chromatography 효율을비교하여 HisTALON Cartridge의수율이높게나타나는것은확인하였다 ( 그림 3). P 경쟁사의추출물에서는높은분자량의비특이적인추출이확인이되었지만, HisTALON을이용하여추출한경우엔이를확인할수없었다. 코발트를기본으로한클론텍의 TALON resin 은수많은연구자 (2,400 편이상의 publication) 들이사용하였으며, 높은특이성과선택성을가지는 TALON resin이목적단백질의순도를최대로이끌어낼수있도록도움을주고있다. M M 단백질이극소량만발현될때, 많은경우에매 우낮은회수율로인하여여러과정을거쳐단백 질을정제하게된다. 이때많은시간이소요되며 여러가지요인 ( roteolytic, (proteolytic, oxidation, or dena tured products) 에의해목적단백질이변형되거 나분해되는위험에노출된다. Mammalian 유래단백질의효과적인정제 HisTALON Cartridge 의다양한성능을검증 하기위해 mammalian sample 에적용하였 다. Sample 은 HEK293 cell pellet 에서추출하 고, 25 μg의 AcGFP1 을첨가하였으며 TALON xtractor Buffer (HisTALON Buffer Set 나 HisTALON Cartridge Purification Kit 에포함 ) 와 HisTALON cartridge 를이용하여추출및정제 하였다. 전체적인형광신호는 eluate 에서확인하 였고 flowthrough 에서는감지되지않았다. SDS-PAGE ( 그림 4) 를이용한 chromatography 분석결과를보면 HEK 293 cell 로부터추출된 10 mg이상의 mammalian protein 에 AcGFP1 을 25 μg의첨가하였음에도불구하고 sample 이고 순도정제됨을확인할수있었다. HisTALON Cartridge 는 TALON Superflow Resin 를만큼사용하기편리한포장으로되어 있다. HisTALON Buffer Set 과함께사용할 경우, 시간절약과함께효과적으로 sample 을 추출할수있고활성을유지한목적단백질의 최고의순도와회수효율을확인할수있다. 그림 4. HisTALON Cartridges effectively purify mammalian samples. A 200 mg HEK 293 cell pellet sample was extracted with our TALON xtractor Buffer. The extract, spiked with 25 μg of AcGFP1 and containing more than 10 mg of mammalian proteins from the HEK 293 cells, was loaded on a HisTALON cartridge. Fractions were analyzed via electrophoresis on a 4-15% SDS polyacrylamide gel and visualized with a silver staining kit (both from Bio-Rad Laboratories). Lanes M: Bio-Rad Precision Plus Protein All Blue Standards. Lane 1: HEK 293 extract spiked with 25 μg of AcGFP1. Lane 2: flowthrough. Lane 3: eluate. The single band in Lane 3 demonstrates the high purity of the eluate. 관련제품 제품명용량 TaKaRa Code HisTALON Cartridge 5 x 1ml HisTALON Buffer Set 20 purifications HisTALON Cartridge Purification Kit 1 5 x 1ml The HisTALON Cartridge Purification Kit combines the HisTALON Cartridge (containing 5 x 1 ml cartridge) and the HisTALON Buffer Set. 참고문헌 1. Porath, J. et al. (1975) Nature 258 (5536) : Hochuli, E. et al. (1987) J. Chrom. 411: Hochuli, E. et al. (1988) Bio/Technology 6(11): Chaga, G. et al. (1994) Protein Eng. 7(9): Froelich, C. J. et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 229(1): Stephens, L. R. et al. (1997) Cell 89 (1: Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72: * License Notice: [18] 42 Life Science & Biotechnology

43 주목의 신상품 7 ATTO Cooled CCD Camera System Light Capture (Chemiluminescent Detection) [1] 조작이 간편한 Hardware Light Capture 상부에 위치한 조작 패널에서 6 배 Zoom lens (8-48mm F1.0) AE-6981/6981C/6981FC 모든 촬영 조건을 설정 및 실행할 수 있어 Zoom lens는 화각 (viewing angel) 40x30mm 초보자도 간단하게 사용이 가능하다 (그림 1). ~220x170mm로 자유로운 화각 조정이 가능하여 촬영은 Single, Repeat, Sum, AutoSum, Live 의 agarose gel 의 형광 촬영 등에 좋다. 일반적인 5개 촬영모드가 있으며 Exposure Time은 1/30초 chemiluminescence 검출에는 zoom lens로도 ~ 90분까지 선택이 가능하다 (표 1). 촬영이 가능하지만 보다 높은 감도가 필요한 western blot이나 northern blot의 촬영에는 AE- 감 도 3배, high mode 를 이용한 촬영방법 (본체제어) 6982식의 고감도 렌즈의 사양을 권장한다. Light-capture로 발광검출 샘플을 측정할 때 - 자유로운 촬영사이즈 설정 exposure time이 중요하다. 감도 3배의 Highmode로 촬영을 하면 본 촬영의 exposure time을 추정할 수 있다. 단번에 본 촬영의 시간을 결정 (형광gel 촬영에 최적) - 발광(luminescence)촬영 및 형광(fluoresscence) 촬영 모두 가능 그림 1. Light Capture 본체. 할 수 있기에 ECL 등 발광시간이 짧은 발광기질 을 가진 실험에도 적용이 가능하다(그림 2). AUTO Exposure 기능 (PC 제어) 표 1. 촬영모드에 따른 시스템 사양 Image Mode Image Time Exposure Time Light-Capture의 분석 S/W인 CS Analyzer의 Image Sum Main Unit Control PC Control AutoExposure 기능을 이용하면 자동으로 Single 1 1/6sec ~90min Nothing O O exposure time을 결정하여 촬영 한다. Repeat 1 ~ STOP 1/6sec ~ 90min Nothing O O 1 ~ STOP 1/6sec ~ 90min Auto O O 1 ~ saturation, auto Stop 1/6sec ~ 90min Auto O O 1/30sec Nothing O O [2] 고감도 Zoom lens Sum AutoSum 고 감도 lens (18mm F0.95 Light Capture 전용개발) AE-6982/6982C/6982FC Live 고감도 lens는 화각 (viewing angel) 100x75 AutoExpose 1 1/6sec ~ 90min Nothing X O ~200x150mm로 촬영가능하며 zoom lens에 비해 SemiAuto 3 1/6sec ~ 90min Nothing X O 감도를 2배 이상 높일 수 있도록 개발된 Light DarkImage maintenance 1/6sec ~ 90min Nothing O X Live image Capture 전용 Lens 이다. - 고감도가 요구되는 western blot이나 northern blot 촬영 - 형광촬영 대응 그림 2. Exposure time에 따른 촬영 March

44 주목의신상품 7 ATTO Cooled CCD Camera System Light Capture (Chemiluminescent Detection) [3] 고감도냉각 CCD 카메라 고감도를위해안정된냉각기능 고감도냉각 CCD 카메라시스템 ( 강제공랭식 2 단 Peltier 냉각방식 ) Light-Capture 의카메라는장시간의 exposure 에 noise 를저감할수있는냉각 CCD 카메라 시스템을채용하고있다 ( 그림 3). 이론적으로는 냉각온도를낮게하는것으로 noise 레벨을 낮게할수있지만일정온도를유지하는것이 장시간 exposure 에는중요한 factor 가된다. Light Capture 는연구를거듭해안정된냉각을 할수있도록카메라가개발되었다. 그림 4. 파장대에따른 Light capture 의 luminescence 검출정도 Bottom lid 를열고 transmission type 을넣어사용가능 Lens 부분과 sample chamber 가분리 filter 교환이간단 소비전력도경제적인장비 (LightCapture : 80 VA, AE-6981FC system Max : 290VA) [6] 공간절약형 Cabinet Cabinet size : 32cmWx34.5cmDx62cmH, 21kg AE-6981FC : 56cmWx40cmDx74.5cmH, 38kg. 그림 5. Light capture 의내부구조 그림 3. Light-Capture 의냉각 CCD 카메라시스템 [4] 발광 (luminescencs) 에최적인 CCD 발광검출시약은 425 nm~550nm 의파장대에서 가장강하다. gel 촬영장치에채용되고있는 CCD 에서는이파장대에는대응할수없기 때문에 500 nm 이하의감도높은 CCD 가 요구된다. Light capture 는감도의좋은 CCD 를채용해 발광촬영에대응하고있다 ( 그림 4). [5] 화상보존, 14bit (16384 grayscale), CF 보존 Light-Capture 의화상보존미디어는 Compact Flash (CF) 이다 ( 표 2). 1 매의 CF 에최대 50 매까지보존하는것이가능하며, 화상은 14 bit (16384grayscale) 로보존화일용량은약 600 KB 이다. PC 에접속할경우 CS Analyzer 또는 chain 파일로보존이가능하다. 16bit TIFF 나 8bit TIFF/BMP/JPEG 파일등으로변환보존이 가능하다. 표 2. Light-Capture의화상보존미디어의종류및형식 Saving format Resolution File format Saved place CS file 14bit(16384 grayscale).ccd Main unit CS file 14bit(16384 grayscale).ccd PC Chain file 14bit(16384 grayscale).cha TIFF file 16bit(65536 grayscale).tif TIFF file 8bit(256 grayscale).tif PC transfer BMP file 8bit(256 grayscale).bmp JPEG file 8bit(256 grayscale).jpg 44 Life Science & Biotechnology

45 주목의신상품 7 [7] 사용용도 화학발광 (chemiluminescent) 샘플의촬영 Western blotting 의발광검출 Western blotting 은단백질의특이적검출법이 다. 전기영동으로분리한단백질을 membrane 에 transfer 한후, 특이검출을하는단백질의 항체 (1 차항체 ) 를반응시켜효소표지를한 2 차항체를반응시키고나서발광검출한다 ( 그 림 6, A). 발광검출의시약은 ECL (GE Healthcare Bio-science KK) 나 SuperSignal (Pierce Biotechnology, Inc. 등이주로사용되고있다. Light-Capture 는 Western blotting 을실험실 내에서간단하게진행할수있다. 런닝코스트 도낮고 ( 프린터용지 ) 현상에의한폐수등도 생기지않는장점이있다. Luciferase Assay 의발광검출 Luciferase Assay 는발광단백질을리포터로한유전자발현검출법이다. 측정하고싶은유전자의프로모터영역과발광단백질유전자를연결해세포에유전자를도입한후발광단백질의기질인 Luciferin을첨가하면발광한다. Light-Capture는식물체나동물미생물등의 Luciferase 유전자도입샘플의촬영이가능하다 ( 발현량에따라서검출이불가한경우도있다 )( 그림 7). 유전자발현량이적은경우는 Luminometer의사용을권장한다. A Southern Blotting 의발광검출 Southern Blotting 은 DNA의특이적검출법이다. Dot blotting 이나전기영동후 blotting 의해서 Membrane 상에고정한 DNA를그서열에특이적으로검출하는방법이다. Probe의표식효소는 ALP (Alkaline phosphatase) 를사용해, CSPD나 CDP-star라고하는발광시약을이용한다. Light-Capture는기존의방법에서얻은 X선필름보다뛰어난감도를실현하고있다 ( 그림 6, B). Northern Blotting의발광검출 Northern Blotting은 RNA의특이적검출법이다. 유전자발현의지표로서많이이용되며실험방법으로서는 Southern Blotting 과비슷하지만 RNA의추출이실험의성패를좌우한다. Light-Capture는기존의방법에서얻은 X선필름보다뛰어난감도를실현하고있다 ( 그림 6, C). B C 그림 6. Light capture 의발광검출. A: Western blotting 의발광검출, B: Southern Blotting 의발광검출, C: Northern Blotting 의발광검출 그림 7. Light capture 를이용한 luciferase assay March

46 TaKaRa 소식 TaKaRa 소식 다카라코리아 신규 판매점 (서울, 인천, 경기) 다카라바이오 후코이당 시리즈 TaKaRa 후코이당 캡슐 신발매 2009년부터 서울, 인천, 경기지역에 다카라코리아의 새로운 가족이 생겼습니다. 기존 판매점과 더불어 새롭게 선정된 판매점을 통해 보다 나은 서비스 제공과 신속한 제품 공급이 될 수 있도록 최선을 다하겠습니다. 다카라바이오는 성황리에 판매중인 후코이당 시리즈의 새로운 제품으로서 엄선한 홋카이도산의 가고메 다시마 후코이당 을 1알에 100 mg 함유한 TaKaRa 후코이당 캡슐 을 발매하였습니다. 에스엔씨포유 제품 개요 주 소 : 서울시 동작구 신대방동 719 동작쌍떼빌 전 화 : *서울/경기/인천지역 다카라코리아 판매점 - (주) 바이로메드 ( ) - (주) 비엠퍼시픽 ( ) - 에스엔씨포유 ( ) Clontech Yeast Two Hybrid system 신발매 Clontech에서 Matchmaker Gold system을 출시하였습니다. 본 시스템에서는 4개의 reporter와 3개의 promoter의 채용으로 false positive가 획기적으로 감소하였습니다. 또한 기존의 Matchmaker TM Two-Hybrid System 3에서 사용되던 4개의 리포터 유전자 중 하나가 Aureobasidin A 항생제 저항성 유전자로 바뀌어 protein interaction 시 강력한 Aureobasidin A 저항성을 나타냅니다. 영양소, blue/white screening과 함께 항생제를 통한 선별로 간단하면서도 효과적인 스크리닝이 가능한 장점을 가집니다. 그 외에서 손쉽게 Yeast Two Hybrid 실험을 진행할 수 있도록 Mate & Plate library 시리즈도 새롭게 출시되었습니다. 자세한 내용은 또는 고객지원센터 ( )를 통해 확인하실 수 있습니다. Abnova 제품 종매 안내 다카라코리아에서 공급하던 Abnova 제품이 2008년 12월부터 판매가 종료되었습니다. 그동안 Abnova 제품을 애용해 주신 여러분께 감사의 말씀을 드리며, 다카라코리아에서는 보다 좋은 제품을 공급할 수 있도록 최선의 노력을 다하겠습니다. 제품명 TaKaRa 후코이당 캡슐 종류 다시마 가공 식품 내용량 15.3 g (내용량 210 mg 60알) Retronectin 의 미국 세인트 주드 아동 병원에 공급 체결 다카라바이오는 미국 세인트 주드 아동 병원(St. Jude Children s Research Hospital)의 Dr. Dario Campana 그룹이 실시하는 급성 림프액성 백혈병을 대상으로 한 유전자 치료의 임상시험에, 당사에서 개발한 Retronectin 을 공급하는 계약을 체결했습니다. 급성 림프액성 백혈병은 임파구가 골수나 말초혈중에서 비정상으로 증식하여 발생하는 백혈병의 일종으로, 소아에 가장 많이 발병하며, 성인의 경우 연간 약 10만명 중 1명에게 발병하고 있습니다. 항암제를 이용한 화학치료요법을 주로 사용하지만, 소아의 약 20%, 성인의 약 65%가 치료 후에도 잔존하는 백혈병 세포에 의해 병이 재발하는 것으로 알려져 있어 새로운 치료법의 개발이 요구되고 있습니다. Dr. Campana 그룹이 실시하는 임상시험에서는 우선, 공여자(donor)로부터 제공된 말초혈액 중, NK 세포라고 하는 면역 세포만을 체외에서 선택적으로 배양합니다. 암으로 발전된 임파구(B세포)에서 발현하는 CD19를 선택적으로 인식할 수 있는 키메라 수용체유전자를 포함한 레트로바이러스를 당사가 개발한 Retronectin 을 이용해 배양된 NK세포에 고효율로 도입합니다. 이 유전자를 도입한 NK세포를 환자에게 투여하면 이 세포가 암화한 B세포 표면의 CD19를 인식하고, 암세포를 특이적으로 공격할 수 있습니다. 본 임상시험은 18세 이하의 난치성 혹은 재발성의 급성 림프액성 백혈병 환자를 대상으로 최대 3년에 걸쳐 진행될 예정입니다. 당사의 Retronectin법을 이용한 유전자 치료의 임상시험은 이번이 45번째로, 난치병 치료를 위해 필수적인 체외 유전자 치료방법에 Retronectin법이 표준기술로 적용될 것으로 기대하고 있습니다. 신규 판매점 안내 에스엔씨포유 전 화 : (02) 팩 스 : (02) 주 소 : 서울시 동작구 신대방동 719 동작상떼빌 저희 에스엔씨포유는 다른 업체들과는 달리 확실하고 체계적인 교육 관리를 함으로써 제품에 대한 전문적 지식과 현장에서 겪게 되는 어려움, 고객을 대하는 태도 등에 적극 대응 할 수 있도록 전문성을 더해 가고 있습니다. 또한, 모든 사원들에게 회사에 대한 주인의식을 가지게 하여 자부심과 적극성을 가지고 있습니다. 에스엔씨포유는 고객에게는 신뢰와 정직함을 바탕으로, 직원에게는 Win-Win 전략으로 회사와 직원이 함께 성장하도록 훌륭한 인재를 육성하고자 합니다. 저희 에스엔씨는 한국과학 발전을 위해 불철주야 매진하시는 고객 여러분의 연구에 최선의 도움이 될 수 있도록 최고의 실험기자재를 공급하여 고객 여러분의 연구에 조금이나마 보탬이 될 수 있도록 최선을 다하겠습니다. 다양한 제품과 성실한 납품, 소량까지도 귀사에 납품하는 서비스 정신으로 고객님들께 최고의 서비스를 드리겠습니다. 고객을 위해, 고객을 위한, 고객 중심으로 성실하고, 진실된 임직원이 되기 위해 최선을 다하겠습니다. 앞으로 고객여러분의 지속적인 관심과 격려를 부탁드립니다. 46 Life Science & Biotechnology

47 신제품안내 TaKaRa 신제품안내 제품명 Size TaKaRa Code PCR 산물의클로닝에 T-Vector pmd20 1μg 3270 T-Vector pmd19 (Simple) 1 μg 3271 고품질의 Competent Cell E. coli HST08 Premium Competent Cells 100 μl x E. coli HST08 dam - /dcm - Competent Cells 100 μl x 재조합 DNase I Recombinant DNase I (RNase-free) 1,000/5,000U 2270A/B Yeast Two-Hybrid 시스템의결정판 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System each Mate & Plate Library 시리즈 2 x 1 ml 외 Make Your Own Mate & Plate Library System 5 rxns 배양세포로부터 Real Time RT-PCR용주형조제에 CellAmp Direct RNA Prep Kit for RT-PCR (Real Time) 200 회 3732 식물의형질전환을위한유전자도입에 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells 40 μl x Cycling probe로신속한 Provirus 카피수측정 Provirus Copy Number Detection Primer Set, Human (for Real Time PCR) 100 rxns 6167 Wide-Range DNA Ladder Wide-Range DNA Ladder (50-10,000 bp) 100 회 3415A Wide-Range DNA Ladder (100-2,000 bp) 100 회 /200 회 3427A/B Wide-Range DNA Ladder (100-5,000 bp) 100 회 /200 회 3428A/B Dye가첨가되어있는전기영동용마커시리즈 DNA Ladder Markers Dye Plus 시리즈 100 회 /200 회 3422A/B 외 Human N-cadherin 검출을위한 Anti-Human N-cadherin, Monoclonal 0.1 mg M180 Human, mouse 등의 GAPDH 검출을위한 Anti-Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), Polyclonal 0.1 mg M181 Mouse, rat glucagon 검출을위한 Anti-Glucagon, Polyclonal 0.1 mg M182 Human TRACP 검출을위한 Anti-Tartrate-resistant Acid Phosphatase (TRACP), Polyclonal 0.1 mg M183 March

48 License Notice [1] bgh Poly A: Please see the bgh poly A licensing statement at [2] CMV Sequence: The CMV promoter is covered under U.S. Patent Nos.5,168,062 and 5,385,839 assigned to the University of Iowa Research Foundation. [3] cppt Element: Please see the cppt licensing statement at [4] IRES Sequence: Use of the IRES sequence is covered by U.S. Patent No. 4,937,190 and is limited to use solely for research purposes. Any other use of the IRES sequence requires a license from Wisconsin Alumni Research Foundation. [5] Lentiviral Expression Products: Portions of this product are covered by several patent applications owned by, or licensed to, Open Biosystems, Inc. The purchase of this product conveys to the buyer the limited, non-exclusive, non-transferable right (without the right to resell, repackage, or further sublicense) under these patent rights to perform the viral infection methods using the lentiviral vectors claimed in those patent applications for research purposes solely in conjunction with this product. No other license is granted to the buyer whether expressly, by implication, by estoppels or otherwise. In particular, the purchase of this product does not include nor carry any right or license to use, develop, or otherwise exploit this product commercially, and no other rights are conveyed to the buyer to use the product or components of the product of any other purposes, including without limitation, provision of services to a third party, generation of commercial databases, or clinical diagnostics or therapeutics. This product is sold pursuant to a license from Open Biosystems, Inc., and Open Biosystems, Inc. reserves all other rights under these patent rights. For information on purchasing a license to the patent rights for uses other than in conjunction with this product or to use this product for purposes other than research, please contact Open Biosystems licensing officer at [6] Living Colors Fluorescent Protein Products: Please see the Living Colors Fluorescent Protein Products licensing statement at [7] Tet-Based Expression Products: Please see the Tet- Based Expression Products licensing statement at [8] VSV-G Technology: Please see the VSV-G Technology licensing statement at [9] WPRE Technology: Please see the WPRE Technology licensing statement a t [10] Fruit Fluorescent Protein Products: Please see the Fruit Fluorescent Protein Products licensing statement at [11] In-Fusion Cloning Products: Clontech has the exclusive right to make, use and sell the In- Fusion PCR Cloning System. [12] Matchmaker Two-Hybrid System: Please see the Matchmaker Two-Hybrid System licensing statement at [13] Metridia Luciferase Markova, S.V., Golz, S., Frank, L.A., Kalthof, B. & Vysotski, E.S. (2004) Cloning and expression of cdna for a luciferase from the marine copepod Metridia longa. A novel secreted bioluminescent reporter enzyme. J.Biol.Chem. 279(5): [14] ProteoTuner Protein Stabilization/ Destabilization Products: Patent Pending. [15] Reverse Two-Hybrid Technology: Please see the Reverse Two-Hybrid Technology licensing statement at [16] RetroNectin Reagent: A method to increase the efficiency of retrovirus mediated gene transfer (covered by the claims of U.S. Patent No. 5,686,278, 6,033,907, 7,083,979, and 6,670,177 and their foreign counterpart patent claims) is licensed to TAKARA BIO INC. exclusively and worldwide. [17] SMART Amplification Products:Please see the SMART Amplification Products licensing statement at [18] TALON Purification Products: The use of TALON Purification products are covered under U.S. Patent No. 5,962,641. For-Profit and Not-For- Profit purchasers of TALON Purification products are entitled to use the reagents for internal research. For information on licensing TALON Chemistry for commercial purposes, please contact a licensing representative by phone at or by at licensing@clontech.com. [19] Purchase of this product includes an immunity from suit under patents specified in the product insert to use only the amount purchased for the purchaser,s own internal research. No other patent rights are conveyed expressly, by implication, or by estoppel. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. [20] Hot Start PCR: Licensed under U.S. Patent 5,338,671 and 5,587,287 and corresponding patents in other countries. [21] Molecular Probes, Inc.: Please see the Molecular Probes, Inc. licensing statement at [22] Purchase of this instrument conveys a limited non-transferable immunity from suit for the purchaser,s own internal research and development and applied fields other than human in vitro diagnostics under one or more of U.S. Patents No. 5,038,852, 5,656,493, 5,333,675, 5,475,610, and 6,703,236 (claims 1-6 only), or corresponding claims in their non-u.s. counterparts, owned by Applera Corporation. No right is conveyed expressly, by implication or by estoppel under any other patent claim. Further information on purchasing licenses may be obtained by contacting the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA., Applied Biosystems does not guarantee the performance of this instrument. [23] Practice of the patented 5 Nuclease Process requires a license from Applied Biosystems. The purchase of this product includes an immunity from suit under patents specified in the product insert to use only the amount purchased for the purchaser,s own internal research when used with the separate purchase of Licensed Probe. No other patent rights are conveyed expressly, by implication, or by estoppel. Further information on purchasing license may be obtained from the Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Drive, Foster City, California 94404, USA. 식품유전자검사의모든것! 한국유전자검사센터에서는다음과같은식품유전자검사를제공합니다. Animal identification 축산물유전자검사검사 Norovirus detection 노로바이러스검사 GMO test 유전자재조합식품검사 한우판별등축산물의품종검사, 우육. 돈육등의성별판별검사, 알려지지않은육류의종감별등축산물관련유전자검사를제공합니다. 식품의약품안전청은 식품의기준및규격 고시를통해식품제조용수등에대한노로바이러스기준을신설했습니다. 저희센터에서는식약청고시검사법을이용한노로바이러스검사서비스를제공합니다. 콩, 옥수수와이를이요한가공식품뿐아니라쌀, 유채 ( 채종, 카놀라 ), 면실, 사탕무등에대해서도폭넓은 GMO 검사를제공하고있습니다 서울특별시금천구가산동뉴티캐슬 606 호 Tel : ~4 Fax : URL : [Human section] human@takara.co.kr