스생산은최적화된시스템구성성분들간의시너지효과에의한것이다 ( 그림 1). 첫째, 클론텍의새로운 Lenti-X HT Packaging Mix는 Gag-Pr, Tat, Rev, RT, IN과 VSV-G prteins을높은레벨로발현하는벡터에의해필수적인렌티바이러스패키징구성요소를완

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락만 사공
6 years ago
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1 Lentiviral delivery system 에관한모든것은클론텍에서 Lenti-X TM Expressin System [1] 클론텍의 Viral Gene Delivery Systems 클론텍은어떤세포에도적용할수있는모든바 이러스시스템을갖추고있다. Lentiviral 이나 retrviral 또는 adenviral systems 중에서선택가능 모든시스템이고발현구조를갖고있으며 inducible 시스템은옵션 바이러스생산이나형질전환유전자의발현 을형광이나선별마커로추적가능 바이러스 titratin kit it 나 adenvirus purifica uri ica tin kit [2] 고효율의 Lentiviral Packaging System Lenti-X HT Packaging System 은다른렌티바이 러스벡터와병행하여도높은바이러스 titer 를 생산할수있다. 다른어떤패키징시스템보다도 25~50 배이상 의높은 titer 48 시간내에 VSV-G pseudtype 의렌티바이러 스를형성 독특한패키징구조로설계되어자가복제를 억제하기때문에안전한바이러스를생산 바이러스상청액 10 ul 만으로도플레이트내 의타겟세포를충분히감염 재조합렌티바이러스는 primary cultures 나비분 열세포, 줄기세포등을포함한거의모든종류 의포유류세포에유전자를도입시킬수있는대 표적인바이러스벡터이다. 클론텍의 Lenti-X system vectr 와 Lenti-X HT Packaging System 을함께사용한다면다른어떤렌티바이러스시 스템보다도더높은 titer 의바이러스를생산할 수있으며, 특히 packaging system 은기존의다 른렌티바이러스시스템보다최고 50 배이상의 효율을나타낸다. 그예로, 비농축상층액 1 ml 당 5 x 10 8 IFU (infectius units) 까지생산할수 있다. 표 1. 클론텍의 Viral Gene Delivery Systems Lenti-X Retr-X Aden-X Target Cells Cell Lines (Dividing) Primary Cultures (Dividing) Primary Cultures (Nndividing) Neurns Stem Cells Transgene Expressin Stable 1 Transient Cnstitutive Inducible Bicistrnic/Dual Expressin Expressin Levels Flurescent Fusin Prteins Flurescent Marker Virus shrna/rnai System Features High Titers Safe, Replicatin-Incmpetent Bradly Trpic Titratin Kits Purificatin Kits Custm Services Lng-Term Stability/Strage 1 Stable in nndividing cells 시너지효과에의한최고의성능실현 Lenti-X HT Packaging System 의뛰어난바이러 그림 1. The Lenti-X HT Packaging System. A lentiviral vectr (e.g. plvx-pur) and the Lenti-X HT Packaging Mix are ctransfected int 293T cells using the highly efficient Lentiphs HT transfectin system. High titer supernatants are ready fr use 48 hr after transfectin. 2 Life Science & Bitechnlgy

2 스생산은최적화된시스템구성성분들간의시너지효과에의한것이다 ( 그림 1). 첫째, 클론텍의새로운 Lenti-X HT Packaging Mix는 Gag-Pr, Tat, Rev, RT, IN과 VSV-G prteins을높은레벨로발현하는벡터에의해필수적인렌티바이러스패키징구성요소를완벽하게제공한다 1). 이처럼여러단백질들이분리된유전자로부터발현됨으로써바이러스의안전성을강화시키고, 또한플라스미드가이상적인비율로배합되어있어바이러스생산성을극대화시킨다. A B Cnstitutive cdna Expressin Inducible cdna Expressin RRE cppt /CTS 5' LTR Ψ WPRE 3' LTR P Pur r PGK plvx-pur * rtta-adv IRES Ne r Lenti-X vectr elements plvx-tet-on Advanced * 둘째, titer를더높이기위해 Tet-Off transactivatr (tta) 를발현하는벡터를포함시켰다. 이벡터는테트라사이클린에반응하는프로모터가있어중요한바이러스단백질이고발현되도록유도한다. 셋째, 클론텍의 Lentiphs HT transfectin sys tem은목적렌티바이러스벡터와함께혼합된 Lenti-X HT Packaging Mix의플라스미드가고효율로 293T cells에도입되도록한다. 이와같이, Lenti-X HT Packaging System의진보된구성요소의탁월한조합으로클론텍의 Lenti-X System 벡터와병행사용시 293T cells 에서고효율의안전한렌티바이러스를생산할뿐만아니라, 다른어떤렌티바이러스벡터와사용시에도고효율의렌티바이러스를생산하도록설계되었다. Lenti-X vectrs 뛰어난발현능과도입효율을지닌바이러스를최상의 titer로생산하기위해선클론텍의 Lenti-X System 벡터를사용해야한다 (plvx- Pur; 그림 1). 이벡터는바이러스게놈프로세싱서열 (viral genme prcessing sequences) 을모두포함할뿐만아니라벡터의기능과발현을향상시킬수있는구성요소를가지고있다. RNA prcessing과핵외로내보내도록활성화시키는 WPRE (wdchuck hepatitis virus psttranscriptinal regulatry element) 는 titer를높이도록바이러스게놈전사체의패키징을향상시킬뿐만아니라도입된유전자 (transgene) shrna Expressin fr RNAi tta-adv IRES Ne r P Tight plvx-tet-off Advanced * plvx-tight-pur * F P Ne/Hyg plvx-ires-pur/ne/hyg * CMV IE IRES Pur r Pur r C Pur r plvx-shrna1 * PrteTuner Prtein Cntrl P U6 P U6 ZsGreen1 plvx-shrna2 ** D P plvx-ptuner ** CMV IE DD IRES Pur r Flurescent Tag Expressin DD IRES ZsGreen1 plvx-ptuner Green ** E AcGFP1 Pur r plvx-acgfp1-n1 & -C1** Bicistrnic Expressin DsRed-M IRES ZsGreen1 * Vectrs available as part f an expressin system. ** Vectrs available separately. Pur r plvx-dsred-mnmer-c1 & -N1 ** plvx-ires-zsgreen1 ** 그림 2. Lenti-X vectrs fr many applicatins. Lenti-X vectrs cntain sequence elements that facilitate lentiviral packaging, bst transgene expressin, r bth. Amng them are the HIV-1 LTRs and packaging signal (Y), a Rev respnse element (RRE), the central ply purine tract/central terminatin sequence (cppt/cts), and the wdchuck hepatitis virus psttranscriptinal regulatry element (WPRE). All vectrs are designed t be used with the Lenti-X HT Packaging System and the Lenti-X 293T Cell Line, which will prduce high titers f VSV- G-pseudtyped lentivirus fr transducing virtually any cell type. See article text fr vectr descriptins and applicatins. March

바이러스 게놈의 핵 장 중요한 특징은 패키징 배양액내의 거의 모든 lipid 기반의 트렌스펙션법보다 독성이 적어 패 내 도입을 증가시켜, 결과적으로 벡터의 융합 세포에 원하는 Lenti-X expressin vectr와 함 키징 과정 동안 293T cells의 생존력을 높여 더 (integratin)과 도입효율을 높인다3).

3 특집 1 Lentiviral delivery system에 관한 모든 것은 클론텍에서 Lenti-XTM Expressin System 의 발현을 지원한다2). Lenti-X vectrs내 cppt/ 최고 효율의 패키징 시스템 덧붙여 클론텍의 독특한 트렌스펙션법은 293T CTS (central plypurine tract/central termina 클론텍의 Lenti-X HT Packaging System의 가 cell에 최적화된 변형 calcium-phsphate법으로, tin sequence)는 감염 후 바이러스 게놈의 핵 장 중요한 특징은 패키징 배양액내의 거의 모든 lipid 기반의 트렌스펙션법보다 독성이 적어 패 내 도입을 증가시켜, 결과적으로 벡터의 융합 세포에 원하는 Lenti-X expressin vectr와 함 키징 과정 동안 293T cells의 생존력을 높여 더 (integratin)과 도입효율을 높인다3). 또한, 클론 께 패키징 벡터를 도입할 수 있는 고도로 최적 많은 바이러스를 생산할 수 있도록 한다. 텍에서는 inducible 발현, shrna 발현, 형광단 화된 트랜스팩션 프로토콜이다. 결과적으로, 각 Lenti-X HT Packaging System은 어떤 렌티바이 백질 tag, Bicistrnic 발현 등 다양한 응용실험이 세포는 바이러스를 생산하는 공장이 된다. 매우 러스 발현 시스템에도 필수적인 구성요소이며, 가능한 Lenti-X 벡터들을 제공한다 (그림 2). 효율적인 Lentiphs HT transfectin system은 거의 모든 렌티바이러스 벡터와 함께 사용될 수 99%에 가까운 293T cells에 도입 효율을 보이는 있다. 실질적으로 감염 후 다음 단계의 실험에도 안전하고 풍부한 렌티바이러스 생산 데, 이는 10 cm 플레이트의 293T cell에 5 x 108 적합하도록 안전한 높은 titer의 렌터바이러스 렌티바이러스 발현시스템은 이전에는 실험이 IFU/ml 까지 감염시키는 것을 말한다. 상층액을 쉽게 생산한다. 어려웠던 세포나 조직에 유전자 도입을 가능하 게 하고, 분리된 유전자 패키징 시스템을 통해 B A replicating viral genmes)를 방지함으로써 안전 Clntech s Lenti-X HT 성도 확보하였다. Lenti-X HT Packaging Mix는 으로 패키징할 수 있는 필수 발현 구성요소의 독 75 Untransduced Cunts 모든 재조합 렌티바이러스 발현 벡터를 효과적 Cmpetitr s packaging system 75 특한 조합으로 되어 있다. 안전성을 강화하기 위 해, 다른 상용화된 시스템과 달리 Gag-Pl 활성 이 분리되어 있어 타겟 세포로부터 바이러스성 Transduced Cunts 재조합을 통한 바이러스 게놈의 자가복제(self- 10¹ 10² FL1-H 10³ 50 복제 기능이 전이되는 것을 철저히 방지하고 있 Transduced Untransduced 10¹ 10² FL1-H 10³ 104 다1). 그러므로 목적 재조합 바이러스로 감염된 타겟 세포는 새로운 바이러스를 만들기 위한 필 수적인 복제 구성요소가 충족되지 않을 것이다. 최상의 titer와 신경계의 형질도입 293T cells에서 이런 바이러스 구성성분들의 일시적인 고발현은 트렌스펙션 48~72시간 후 VSV-G pseudtype의 렌티바이러스가 높은 그림 3. High infectivity f supernatants prduced by the Lenti-X HT Packaging System. The Lenti-X HT Packaging System (Panel A) and a packaging system frm a cmpetitr (Panel B) were each used t generate viral supernatants frm their respective lentiviral system vectr that was engineered t express the ZsGreen1 flurescent prtein. As little as 10 μl f supernatant frm the Lenti-X HT Packaging System transduced the majrity f these HeLa cells, whereas 10 μl f supernatant frm the ther system transduced nly a small percentage f the cells. Transduced cells were quantified by flw cytmetry A B titer로 생산될 수 있게 한다. 상층액의 titer는 농축과정 없이도 목적세포 에 감염시켜 사용할 수 있을 정도로 충분히 높 다. 예로, 바이러스 상층액 10 ul 정도로 배양액 내 대부분의 HeLa cell에 형질도입시킬 수 있다 (그림 3). Lenti-X HT System으로 생산된 렌티 바이러스는 광범위한 바이러스 친화성(적용성, trpism)을 유지할 뿐만 아니라 신경계에서 유래 한 형질도입된 세포의 특성을 잘 보존하고 있다 (그림 4). 4 Life Science & Bitechnlgy 그림 4. Transductin f neural prgenitr cells by Lenti-X lentivirus. Recmbinant lentivirus fr expressing ZsGreen1 was prduced frm the Lenti-X HT Packaging System and used t transduce nrmal human neural prgenitr cells. A single transduced cell is shwn under phase cntrast micrscpy (Panel A) and flurescence micrscpy (Panel B).

4 [3] Lenti-X Tet-On & Tet-Off Advanced Inducible Expressin Systems Tet-Advanced inducible system 을적용하여 어떤세포형태에서도고효율의렌티바이러스 형질도입이가능 높은 titer 를위해 Lenti-X HT Packaging System 포함 뛰어난유도발현조절과매우낮은백그라 운드 Lenti-X Tet On & Tet Off Advanced Inducible Expressin system 은다양한세포에적 용가능한강력한렌티바이러스유전자도입 기술과테트라사이클린에의해조절되는유전 자발현시스템의범용성이결합되었다 ( 그림 5). 렌티바이러스벡터는간, 뇌, 근육이나줄기 세포등과같은다양한조직에서유래한세포 의분열여부에상관없이모든세포에클론텍의 inducible 발현시스템을적용할수있다. 각시 스템은두개의렌티바이러스벡터로구성되어 있다. Tet-On Advanced (rtta-advancde) 또 는 Tet-Off Tet O Advanced (tta-advanced) (tta Advanced) tran scriptinal activatr 를안정적으로발현시키는 조절벡터와목적유전자의발현을조절하는반 응벡터 (plvx-tight-pur) 로구성되어있다. 또한 luciferase 를발현하는반응벡터의대조군 과클론텍의 Lenti-X HT Packaging System 을 포함하고있다. Lenti-X Tet-Advanced Lentivirus 의높은 titer 생산 클론텍의 Lenti-X HT Packaging System 의 Lenti-X Tet-Advanced System Vectrs 는자가 복제되지않는안전하고매우높은 titer 의렌티 바이러스를생산한다. 이렇게높은수준의바이 러스가생산될수있는것은클론텍의 Lenti-X HT Packaging Mix 와병용하여사용되는최적화 된 Lentiphs HT transfectin system 때문이다. Lenti-X HT Packaging Mix 는렌티바이러스패 키징단백질과복제단백질을고발현을위한최 적화된바이러스와비바이러스성발현구조의 독특한혼합물로되어있다. tta-advanced 3X (min VP16) Transcriptin Tet-Off Advanced Gene f interest rtta-advanced + Dx 3X (min VP16) Transcriptin TRE MOD CMV min TRE MOD CMV min P Tight Tet-On Advanced Gene f interest 그림 5. Induced expressin in the Tet-Off Advanced and Tet-On Advanced Systems. The Tet-cntrlled transactivatrs are fusin prteins that cntain a DNA-binding TetR dmain jined t three minimal transcriptin activatin dmains frm HSV VP16. Each transactivatr has been ptimized fr expressin in mammalian cells. In Tet-Off Advanced Systems, the basal state is maintained in the presence f dxycycline (Dx), and induced by its withdrawal. Tet-On Advanced Systems are activated in the presence f Dx. System inductin prduces high-level transcriptin f yur gene frm P Tight.. plvx- Tet-On Advanced Regulatr 1. Prduce regulatr and respnse lentiviruses using 293T cells and the Lenti-X HT Packaging System 2. Harvest high-titer Lenti-X supernatants 3. Cinfect any target cell type and culture and + Dx 4. Harvest cells fr analysis Ne r Dx Expressin OFF N expressin f transgene Lenti-X HT Packaging Mix + Dx 그림 6. Establishing an inducible gene expressin system with Lenti-X Tet-On Advanced. Use the Lenti-X HT Packaging System and 293T cells t generate high-titer lentiviral supernatants frm the plvx-tet-on Advanced Vectr, and frm the plvx-tight-pur Vectr cntaining yur gene f interest. Simultaneusly cinfect cultures f yur target cells with the tw lentiviruses (~8 hr). Then, after culturing fr an additinal hr (+ and-dx), harvest the cells fr analysis. These same prcedures als apply t the Lenti-X Tet-Off Advanced System, but the effects f Dx are reversed. P Tight Target cells Expressin ON High expressin f transgene Pur r plvx- Tight-Pur Respnse 293T packaging cells Gene f interest Target cells cntaining Tet-On Advanced March

5 Lentiviral delivery system 에관한모든것은클론텍에서 Lenti-X TM Expressin System 상층액이만들었다. LVX-Tet-On Advanced 상층액과동량으로 LVX-Tight-Pur-Luc 상층액을섞은후, Dx가농도별로존재하는 HeLa Cell에감염시켰다. 낮은백그라운드와 inducible luciferase의고발현을통해 Lenti-X Tet 시스템의우수한성능을확인할수있다 ( 그림 7). 그림 7. The Lenti-X Tet-Advanced Systems are highly inducible. Using equal amunts f high-titer supernatants, HeLa cells cultured at the indicated cncentratins f Dx were ctransduced fr 8 hr with a LVX- Tight-Pur-Luc lentivirus and a LVX-Tet-On Advanced lentivirus. Cultures were harvested after 48 hr and assayed fr luciferase activity. Luciferase was expressed at very high levels, while the basal/uninduced expressin level was very lw. Lenti-X Packaging Mix 와함께사용되는 Lenti-X Tet-Advanced System Vectr 는 293T packaging cells 로거의 100% 코트랜스펙션된 다. 이결과매우높은 viral titer 를가진상층액 을만들수있어, 별도의농축과정없이상층액 을곧바로실험에사용할수있다. 이는높은도 입효율뿐만아니라 inducible 시스템셋업을위 한시간과노력을절약할수있게한다. 클론텍 에서는농축하지않은 Lenti-X HT 상청액 10 ul 만으로도 6- 웰플레이트의대부분의 HeLa cell 에형질도입할수있었다 ( 그림 3, 그림 6). Tet-Systems Overview 클론텍의 Tet-Advanced System 은 Gssen & Bujard 4) 의 inducible 발현법의상위버전으로 Urlinger, et al. 5-7) ( 그림 5) 에의해기술된여러가 지중요한개선점을포함하고있다. Inducible 시 스템을셋업하기위해선타겟세포의형질도입 에 plvx-tet Advanced Vectr (Tet-On 또는 Tet-Off) 와 plvx-tight-pur Vectr 로부터생 산된목적유전자를포함하고있는높은 titer 의 렌티바이러스상층액을이용한다 ( 그림 6). 높은 바이러스 titer 는동시감염 (cinfectin) 동안두 바이러스를모두가진목적세포에높은효율로 충분히트렌스팩션 ( 형질도입 ) 시킬수있을것이 다. 이런높은효율로인해안정적인형질도입주 를선별하지않고도곧바로유전자유도발현실 험을진행할수도있다. 또는 G418 과 purmycin 으로형질전환된세포를선별할수도있다. Tet- On Advanced System 으로형질전환된세포는 Dx 처리시목적유전자의전사를빠르게개시 할것이다. 반면, Tet-Off Advanced System 은 Dx 가없을때높은수준의유전자발현을가능 하게할것이다. 뛰어난시스템성능 강력한유도성능을확인하기위해 HeLa cell 에서 luciferase 를발현할수있도록 Lenti-X Tet-On Advanced System 을만들었다. 먼저조 절벡터와 luciferase 유전자 (cdna) 를발현하 는 plvx-tight-pur 반응벡터 (LVX-Tight- Pur-Luc) 를포함한높은 titer 의렌티바이러스 동시감염법클론텍은 Retr-X Tet-Advanced Inducible Expressin Systems에서의기술을기반으로 in ducible Lenti-X system을최적화시켰다. 반응벡터 (LVX-tight-Pur) 가조절벡터 (LVX- Tet-On 또는 Tet-Off Advanced) 보다많은비율의바이러스상층액으로타겟세포에감염시키면목적유전자를최대로발현시킬수있다. 반면조절벡터의비율이많은상층액의경우매우낮은백그라운드와최대의발현유도율을이룰수있다 8). Single- & Duble-Stable Cell Lines 안정적인세포주를생산하기위해 Lenti-X Tet- Advanced System 내의조절렌티바이러스와반응렌티바이러스는독립적으로또는순차적으로사용된다. Lenti-X Tet-On 또는 Tet-Off Advanced virus로형질도입된세포들은다목적 single-stable Tet-Advanced hst cell line을생성하기위해 G418로선별되어진다. 이세포주는다른 P Tight -cntrlled gene cnstructs의수용체로서작용한다. LVX-Tight-Pur lentivirus를가진 single-stable Tet-respnsive hst cell line 의형질도입과 purmycin으로의순차적인선별에의해각시스템으로부터의구성요소를모두포함한 duble-stable inducible cell line를생산한다. 렌티바이러스의장점다양한형질도입이가능한렌티바이러스가클론텍의강력한 Tet-Advanced Inducible Expressin Systems과결합되어, 연구자들은레트로바이러스감염이나일반적인유전자전달기술로이용하기힘들었던분화하는 primary cell과줄기세포와같은세포나조직에서의 inducible 발현시스템을적용할수있다. 렌티바이러스를이용한유전자도입은목적 6 Life Science & Bitechnlgy

6 벡터가숙주세포의게놈에효과적으로삽입되 는기능성형질도입주를높은빈도로만들수있 다. 높은 titer 의감염된바이러스를사용하면형 질도입된세포는최대가될것이고항생제선별 을통해안정적인형질전환주를선별하는단계 가필요하지않을것이다. Primary cell cultures 나형질도입이쉽지않은 세포에 inducible 시스템을적용하려하거나효 과적인렌티바이러스유전자전달법을이용하 려고한다면, 클론텍의 Lenti-X Tet-Advanced Gene Expressin Systems 을추천한다. 제품구성 Lenti-X HT Packaging System Lenti-X HT Packaging Mix Lentiphs HT Lenti-X Tet-On r Tet-Off Advanced Inducible Expressin System LVX-Tet-On Advanced Vectr 또는 plvx-tet-off Advanced Vectr plvx-tight-pur Vectr plvx-tight-pur-luc Cntrl Vectr Lenti-X HT Packaging Mix Lentiphs HT Tet System Apprved FBS 참고문헌 1. Wu, X. et al. (2000) Ml. Ther. 2(1): Zufferey, R. et al. (1999) J. Virl. 73 (4): Zennu, V. et al. (2000) Cell 101(2): Gssen, M. & Bujard, H. (1992) Prc. Natl. Acad. Sci. USA 89(12): Urlinger, S., et al. (2000) Prc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14): Inducible Gene Expressin Systems (January 2007) Clntechniques XXII (1): Tet-On Advanced Inducible Gene Expressin System (July 2006) Clntechniques XXI(2): Inducible Retrviral Gene Expressin Systems (July 2007) Clntechniques XXII (3):2-3. 관련제품 제품명 용량 TaKaRa Cde 20 rxn Lenti-X HT Packaging System 40 rxn Lentiphs HT 20 rxn Lenti-X Expressin System each Lenti-X Bicistrnic Expressin System (Ne) each Lenti-X Bicistrnic Expressin System (Hyg) each Lenti-X Bicistrnic Expressin System (Pur) each Lenti-X Tet-On Advanced Inducible Expressin System each Lenti-X Tet-Off Advanced Inducible Expressin System each Lenti-X PrteTuner System each Lenti-X PrteTuner Green System each plvx-dsred-mnmer-n1 Vectr 10 μg plvx-dsred-mnmer-c1 Vectr 10 μg plvx-acgfp1-n1 Vectr 10 μg plvx-acgfp1-c1 Vectr 10 μg plvx-ires-zsgreen1 20 μl Lenti-X shrna Expressin System each plvx-shrna2 Vectr 10 μg Lenti-X 293T Cell Line 1 ml Lenti-X qrt-pcr Titratin Kit 100 rxns * License Ntice: [1], [2], [3], [4], [5], [7], [8], [9] March

Lentivirus Systems & Tools Lentivirus Transduction Tools 렌티바이러스농축시약 Lenti-X Concentrator 짧고간편한프로토콜 Ultracentrifugation 불필요 최대 1 배농축가능, ~9% 회수율 단순한프로토콜

Lentivirus Systems Lentivirus Systems & Tools Lentivirus Systems 최대 ~1 8 IFU/ ml의매우높은역가의렌티바이러스조제가능 48 시간이내에 VSV-G pseudotype의 lentivirus 획득 5 개의 vector로분리된 packaging mix를이용하여바이러스감염에대한안정성확보 Clontech의 Lenti-X