(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12Q 1/68 (2006.01) (52) CPC 특허분류 C12Q 1/689 (2013.01) C12Q 1/686 (2013.01) (21) 출원번호 10-2015-0164791 (22) 출원일자 2015 년 11 월 24 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 KR1020110105663 A 2015 년 11 월 24 일 Journal of taibah University for Science, Vol. 3, pp. 8-13 (2010.) J. Microbiol. Biotechnol., Vol. 19, No. 10, pp. 1176-1183 (2009.05.29.) US20100075306 A1 (45) 공고일자 2017년05월25일 (11) 등록번호 10-1739749 (24) 등록일자 2017년05월19일 (73) 특허권자 윤현규 경기도남양주시진접읍해밀예당 1 로 49,1102 동 102 호 ( 남양휴튼아파트 ) (72) 발명자 윤현규 경기도남양주시진접읍해밀예당 1 로 49,1102 동 102 호 ( 남양휴튼아파트 ) (74) 대리인 이동기 전체청구항수 : 총 12 항심사관 : 노은주 (54) 발명의명칭리얼타임 PCR 을이용한질염검사키트및방법 (57) 요약 본발명은리얼타임 PCR 을이용하여질염유발미생물인가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스를특이도및민감도높게검출하고질내상재균인락토바실러스크리스파투스를질내의다른미생물종과의교차반응없이정량적으로분석하는질염검사키트및방법을제공한다. 본발명에따르면, 임상검체로부터리얼타임 PCR 을이용하여질염유발미생물인가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스를신속하면서도정확하게그리고정량화된데이터에기초하여특이도및민감도높게검출할수있고, 질내상재균인락토바실러스크리스파투스를질내의다른미생물종과의교차반응없이정량적으로분석할수있다. 대표도 - 도 1-1 -
(52) CPC 특허분류 C12Q 1/6895 (2013.01) C12Q 2561/113 (2013.01) C12Q 2563/107 (2013.01) C12Q 2600/112 (2013.01) C12Q 2600/158 (2013.01) C12Q 2600/16 (2013.01) - 2 -
명세서청구범위청구항 1 리얼타임 PCR을이용한질염검사키트로서, 질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 의검출용표적유전자인 cpn60(60 kda chaperonin) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 1 및 2의프라이머쌍, 및서열번호 4 및 5의프라이머쌍중적어도하나의프라이머쌍과, 질염유발미생물인칸디다알비칸스 (Candida albicans) 의검출용표적유전자인 ITS(Internal transcribed Spacer) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 7 및 8의프라이머쌍과, 질내상재균 ( 常在菌 ) 인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 의검출용표적유전자인 slpa(surface layer protein A) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 10 및 11의프라이머쌍, 서열번호 13 및 14의프라이머쌍, 서열번호 16 및 17의프라이머쌍, 서열번호 19 및 20의프라이머쌍, 서열번호 22 및 23 의프라이머쌍, 서열번호 25 및 26의프라이머쌍, 및서열번호 28 및 29의프라이머쌍중적어도하나의프라이머쌍과, 질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 의검출용표적유전자인 cpn60(60 kda chaperonin) 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브로서서열번호 3 및서열번호 6의올리고뉴클레오티드들과이러한올리고뉴클레오티드들에상보적인올리고뉴클레오티드들로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브와, 질염유발미생물인칸디다알비칸스 (Candida albicans) 의검출용표적유전자인 ITS(Internal transcribed Spacer) 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브로서서열번호 9의올리고뉴클레오티드와이러한올리고뉴클레오티드에상보적인올리고뉴클레오티드로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브와, 질내상재균인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 의검출용표적유전자인 slpa(surface layer protein A) 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브로서서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27 및서열번호 30의올리고뉴클레오티드들과이러한올리고뉴클레오티드들에상보적인올리고뉴클레오티드들로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브를포함하는, 리얼타임 PCR을이용한질염검사키트. 청구항 2 제1항에있어서, DNA 중합효소, dntps, PCR 완충용액및 PCR 증폭산물의표지물질을더포함하는리얼타임 PCR을이용한질염검사키트. 청구항 3 제2항에있어서, 상기표지물질은, 상기 cpn60 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단과, 상기 ITS 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단과, 상기 slpa 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단에표지되는것을특징으로하는리얼타임 PCR을이용한질염검사키트. 청구항 4 제3항에있어서, - 3 -
상기 cpn60 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브와, 상기 ITS 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브와, 상기 slpa 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브중 2종이상의프로브들은각기서로다른파장에서검출할수있는표지물질로표지되는것을특징으로하는리얼타임 PCR을이용한질염검사키트. 청구항 5 제4항에있어서, 2종이상의프로브들이각기서로다른파장에서검출할수있는표지물질로표지된경우, 1개의검사튜브에서질염과관련된가드네넬라바지날리스, 칸디다알비칸스및락토바실러스크리스파투스중 2종이상의미생물을한번에검출할수있는것을특징으로하는리얼타임 PCR을이용한질염검사키트. 청구항 6 리얼타임 PCR을이용하여질염여부를결정하는정보를제공하기위한시험관내검사방법에있어서, 검체로부터유전자샘플을준비하는단계와, 상기준비한유전자샘플을주형으로사용하고, 청구항제1항내지제5항중어느한항에정의된리얼타임 PCR 을이용한질염검사키트를이용하여, 상기가드네넬라바지날리스의검출용표적유전자인 cpn60 유전자, 상기칸디다알비칸스의검출용표적유전자인 ITS 유전자, 및상기락토바실러스크리스파투스의검출용표적유전자인 slpa 유전자를리얼타임 (real-time) PCR로증폭하는단계와, 상기표적유전자의증폭후, 리얼타임 PCR 결과를확인하여상기검체내의가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스의존재여부및존재량과, 상기검체내의락토바실러스크리스파투스의존재여부및존재량을정량적으로측정하는단계와, 상기정량적으로측정된가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스의존재여부및존재량과, 락토바실러스크리스파투스의존재여부및존재량에기초하여질염여부를결정하는정보를제공하는단계를포함하는, 리얼타임 PCR을이용하여질염여부를결정하는정보를제공하기위한시험관내검사방법. 청구항 7 제6항에있어서, 증폭전, 상기 cpn60 유전자, 상기 ITS 유전자및상기 slpa 유전자의카피수를알고있는유전자샘플인양성표준자를, 상기 cpn60 유전자, 상기 ITS 유전자및상기 slpa 유전자를각각증폭하는프라이머쌍과, 증폭되는상기 cpn60 유전자, 상기 ITS 유전자및상기 slpa 유전자와관련하여유전자증폭량을나타내는표지물질을이용하여리얼타임 (real-time) PCR로증폭하는단계와, 상기양성표준자의전체 PCR 증폭기간에대한상기표지물질의형광세기의변화를측정하고, Cp값또는 Ct값을통한 PCR 반응회수를분석하는단계와, 상기표지물질의형광세기의변화를측정하여얻어진표준곡선으로부터상기양성표준자의카피수와, Cp값또는 Ct값을대응시키는단계와, 상기검체의유전자샘플내에존재하는상기 cpn60 유전자, 상기 ITS 유전자및상기 slpa 유전자각각의전체 PCR 증폭기간에대한상기표지물질의형광세기의변화를측정하고, Cp값또는 Ct값을통한 PCR 반응회수를분석하는단계와, 상기검체의유전자샘플내에존재하는상기 cpn60 유전자, 상기 ITS 유전자및상기 slpa 유전자각각을 PCR 증폭하여얻은 Cp값또는 Ct값을상기양성표준자의카피수에대응시켜, 상기검체내의가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스의존재여부및존재량과, 상기검체내의락토바실러스크리스파투스의존재여부및존재량을정량적으로측정하는단계를더포함하는, 리얼타임 PCR을이용하여질염여부를결정하는정보를제공하기위한시험관내검사방법. 청구항 8 제7항에있어서, - 4 -
상기표지물질은, 상기 cpn60 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단과, 상기 ITS 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단과, 상기 slpa 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단에표지되는것을특징으로하는, 리얼타임 PCR을이용하여질염여부를결정하는정보를제공하기위한시험관내검사방법. 청구항 9 제8항에있어서, 상기 cpn60 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브와, 상기 ITS 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브와, 상기 slpa 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브중 2종이상의프로브들은각기서로다른파장에서검출할수있는표지물질로표지되는것을특징으로하는, 리얼타임 PCR을이용하여질염여부를결정하는정보를제공하기위한시험관내검사방법. 청구항 10 제9항에있어서, 2종이상의프로브들이각기서로다른파장에서검출할수있는표지물질로표지된경우, 1개의검사튜브에서질염과관련된가드네넬라바지날리스, 칸디다알비칸스및락토바실러스크리스파투스중 2종이상의미생물을한번에검출할수있는것을특징으로하는, 리얼타임 PCR을이용하여질염여부를결정하는정보를제공하기위한시험관내검사방법. 청구항 11 리얼타임 PCR을이용한질염검사방법에서사용되는리얼타임 PCR 증폭용프라이머쌍으로서, 질염유발미생물인가드네넬라바지날리스의검출용표적유전자인 cpn60(60 kda chaperonin) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 1 및 2의프라이머쌍, 및서열번호 4 및 5의프라이머쌍중적어도하나의프라이머쌍과, 질염유발미생물인칸디다알비칸스의검출용표적유전자인 ITS(Internal transcribed Spacer) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 7 및 8의프라이머쌍과, 질내상재균인락토바실러스크리스파투스의검출용표적유전자인 slpa(surface layer protein A) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 10 및 11의프라이머쌍, 서열번호 13 및 14의프라이머쌍, 서열번호 16 및 17의프라이머쌍, 서열번호 19 및 20의프라이머쌍, 서열번호 22 및 23 의프라이머쌍, 서열번호 25 및 26의프라이머쌍, 및서열번호 28 및 29의프라이머쌍중적어도하나의프라이머쌍을포함하는, 질염유발미생물및질내상재균표적유전자증폭용프라이머세트. 청구항 12 질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 의검출용표적유전자인 cpn60(60 kda chaperonin) 유전자에특이적인프로브로서서열번호 3 및서열번호 6의올리고뉴클레오티드들과이러한올리고뉴클레오티드들에상보적인올리고뉴클레오티드들로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브와, 질염유발미생물인칸디다알비칸스 (Candida albicans) 의검출용표적유전자인 ITS(Internal transcribed Spacer) 유전자에특이적인프로브로서서열번호 9의올리고뉴클레오티드와이러한올리고뉴클레오티드에상보적인올리고뉴클레오티드로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브와, 질내상재균인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 의검출용표적유전자인 slpa(surface layer protein A) 유전자에특이적인프로브로서서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27 및서열번호 30의올리고뉴클레오티드들과이러한올리고뉴클레오티드들에상보적인올리고뉴클레오티드들로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브를포함하는질염검사용프로브조성물. 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은리얼타임 PCR ( 실시간중합효소연쇄반응 ) 을이용한질염검사키트및방법에관한것으로서, 보다 - 5 -
상세하게는검출대상이되는질염유발미생물과질내상재균외의다른미생물종과의교차반응이없고질내의 정확한미생물종의정량값을제공하여간단하면서도저비용으로신속하고정확하게질염을검사하는키트및 방법에관한것이다. [0002] [0003] 구체적으로, 본발명은임상검체로부터리얼타임 PCR을이용하여질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 및칸디다알비칸스 (Candida albicans) 를신속하면서도정확하게그리고정량화된데이터에기초하여특이도및민감도높게검출할수있고, 질내상재균 ( 常在菌 ) 인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 를질내의다른미생물종과의교차반응없이정량적으로분석할수있는질염검사키트및방법에관한것이다. 또한, 본발명은임상검체로부터리얼타임 PCR을이용하여전술한바와같은질염유발미생물과질내상재균의정확한질내존재량을특이도및민감도높게검출하여질염의진행의정도가증가할수록전술한바와같은질염유발미생물이증가하고, 반대로전술한바와같은질내상재균이감소하는것을정량적으로정확하게판단함으로써질염을간단하면서도저비용으로신속하고정확하게검사할수있는기술에관한것이다. [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] 배경기술유산균속 ( 屬 ) 미생물은여성의질내에상주하는상재균 ( 常在菌 ) 으로여성생식기의정상적인환경을유지하는중요한역할을수행한다. 건강한여성의질의경우유산을지속적으로생성하여질내를산성 (ph4.5 내지 5.5 정도 ) 의환경으로유지함으로써다른기회감염균의과증식과이로인한감염을억제한다. 하지만, 다양한원인으로인하여질내유산균이감소하여질내 ph가증가하고, 다양한기회감염균이번식하게되어질염을일으키게된다. 이러한현상은여성의나이, 스트레스, 호르몬의불균형, 월경, 성교에의한기회감염균의정착등이원인일수있다. 질염은여성의상당수가경험할정도로흔한질병이지만, 오랜시간방치하게되면질염으로인해골반염의위험도증가, 수술후감염증가등의위험이있으며, 특히임부의경우에서는조기양막파수, 조기진통, 자궁내막염등의다양한합병증을일으킬수있다. 주요한질염유발미생물로는가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 및칸디다알비칸스 (Candida albicans) 가있으며, 그밖에도프레보텔라 (Prevotella spp.), 혐기성그람양성구균 (anaerobic grampositive cocci), 모빌런쿠스 (Mobiluncus spp.), 유레아플라즈마유레아라이티컴 (Ureaplasma urealyticum), 마이코플라즈마호미니스 (Mycoplasma hominis) 등이있다. 즉, 질염을일으키는미생물은다양하고한종류또는여러종류의미생물이존재하여염증을일으킬수있다. 질염을진단하는방법은일반적으로그람염색법이이용되어왔지만, 최근배양을기반으로하지않은유전자검사법들이도입됨에따라손쉽고빠르게질염을진단할수있다. 예를들어, PCR(polymerase chain reaction) 기법을이용하여질염유발미생물을검출하는방법이있는데, 종래의 PCR 검사법은전술한바와같은다양한성병관련미생물들을멀티플렉스방식으로검사하는방법을채택하고있어, 질염만을특정하여검사하는것이아니고비용이고가이며검사결과를받기까지 3일내지 5일정도소요되어신속하면서도간단하게그리고정확하게질염만을검사하는방법이라고는할수없었다. 이러한종래의 PCR 검사법의대안으로서반정량다중 PCR을이용하여질염유발미생물과질내상재균의존재여부를검출함으로써질염을진단하는방법이제안되었으나, 반정량다중 PCR 검사법은정확한미생물의존재량을분석하기에는결과의오류발생의가능성이높은문제점이있었다. 즉, 단순히질염유발미생물의존재만으로질염이라고진단할경우진단오류의가능성이있으며질염인경우에도질내상재균이존재할수있기때문에, 단순히질염유발미생물과질내상재균의존재여부만로는질염진단이용이하지않고진단오류의문제점이있었다. 또한, 리얼타임 PCR을이용하여락토바실러스이네르스 (Lactobacillus iners) 와락토바실러스가세리 (Lactobacillus gasseri) 그리고아토포비움바지나에 (Atopobium vaginae) 의음성적연관성을제시한연구가있었으나, 여기서적용된락토바실러스종특이적인프라이머는다른미생물종과의교차반응이빈번하게발생할수있으며, 검체의상태에따라프라이머다이머 (dimer) 등이발생할수있어정확한정량측정에는한계가있었다. 따라서, 본발명이속한기술분야에서는간단하면서도저비용으로신속하고정확하게질염을검사하는방법의제공이필요한실정이다. - 6 -
선행기술문헌 [0011] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 대한민국등록특허공보제 10-0819634 호 (2008.04.04) ( 특허문헌 0002) 대한민국공개특허공보제 10-2013-0142675 호 (2013.12.30) ( 특허문헌 0003) 대한민국등록특허공보제 10-1528433 호 (2015.06.11) 발명의내용 [0012] [0013] [0014] 해결하려는과제본발명은리얼타임 PCR ( 실시간중합효소연쇄반응 ) 을이용하여검출대상이되는질염유발미생물과질내상재균외의다른미생물종과의교차반응이없고질내의정확한미생물종의정량값을제공하여간단하면서도저비용으로신속하고정확하게질염을검사하는키트및방법을제공하는데그목적이있다. 구체적으로, 본발명은임상검체로부터리얼타임 PCR을이용하여질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 및칸디다알비칸스 (Candida albicans) 를신속하면서도정확하게그리고정량화된데이터에기초하여특이도및민감도높게검출할수있고, 질내상재균 ( 常在菌 ) 인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 를질내의다른미생물종과의교차반응없이정량적으로분석할수있는질염검사키트및방법을제공하는데그목적이있다. 또한, 본발명은임상검체로부터리얼타임 PCR을이용하여전술한바와같은질염유발미생물과질내상재균의정확한질내존재량을특이도및민감도높게검출하여질염의진행의정도가증가할수록전술한바와같은질염유발미생물이증가하고, 반대로전술한바와같은질내상재균이감소하는것을정량적으로정확하게판단함으로써질염을간단하면서도저비용으로신속하고정확하게검사할수있는기술을제공하는데그목적이있다. [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] 과제의해결수단상기한발명의기술적과제를해결하고상기한발명의목적에부합되도록예의연구를거듭한결과, 본발명자는리얼타임 PCR을이용하여대표적인질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 및칸디다알비칸스 (Candida albicans) 를특이도및민감도높게검출하고질내상재균인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 를질내의다른미생물종과의교차반응없이정량적으로분석하는질염검사법을제공하기에이르렀다. 즉, 본발명은리얼타임 PCR을이용하여질내의정확한미생물종의정량값을제공하는기술로서, 전술한바와같은질염유발미생물과질내상재균의정확한질내존재량을특이도및민감도높게검출하여질염이있는경우전술한바와같은질염유발미생물은증가하고, 반대로전술한바와같은질내상재균은감소하는것을정량적으로정확하게판단함으로써질염을간단하면서도저비용으로신속하고정확하게검사할수있는기술을제공한다. 본명세서에서사용되는용어인 " 질염유발미생물 " 이란세균만을의미하는것이아니라곰팡이류를포함하는진균류, 바이러스등을포함하는광의적의미로사용된다. 또한, 본명세서에서사용되는용어인 " 검체 " 란검출대상질염유발미생물및 / 또는질내상재균또는이들의유전자를함유하는시료를포괄하는것으로서, 인체에위해를가하지않고안전하며의심환자의건강을전혀해치지않는도구로채취된질분비물, 질벽채취물, 예를들어면봉등의검체도구를이용하여채취된질분비물, 질상피등일수있다. 본명세서에서사용되는용어인 " 유전자샘플 " 이란 RNA, DNA, 역전사효소에의해 RNA로부터생성된 cdna, pre- PCR ( 예비 PCR) 을통해증폭된 DNA 또는 cdna 등을포함하는광의의개념으로사용된다. 본명세서에서사용되는 " 리얼타임 (real-time) PCR" 이란형광물질 (fluorescent material) 을 PCR 기법에응용한것으로반응중검체내에존재하는표적유전자의증폭과함께형광물질의발광 (emission) 정도를실시간으로검출하고정량분석하여표적유전자의증폭유무및그양상을신속하고정확하게분석할수있는방법이다. - 7 -
이러한리얼타임 (real-time) PCR 은 SYBR 그린 (SYBR Green) 을사용하는방법과이중표지된프로브를이용하는 방법으로나누어진다. [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] SYBR 그린 (SYBR green) 기법은리얼타임 PCR 증폭과정에서증폭된 DNA에 SYBR 그린염색약이끼어들어가 PCR 반응으로합성된이중가닥 DNA에결합하여형광신호를발생하게되고이러한형광신호를검출하여표적유전자의존재여부와이로부터의증폭산물의생성량을측정할수있는방법이다. 또한, 이중표지된프로브 (dual labeled probe) 를이용한리얼타임 PCR 기법은 5' 말단에형광물질이표지되어있고 3' 말단에소광물질 (Quencher) 이표지된이중표지된프로브를이용하는방법으로서, 이중표지된프로브에의한형광신호를통해이중표지된프로브가표적유전자의 PCR 증폭산물과어닐링되었는지여부를확인할수있고, 표적유전자의존재여부와이로부터의증폭산물의생성량을측정할수있는방법이다. 본발명에서는상기방법이외에 TaqMan 프로브법등당업계에알려진리얼타임 PCR이적용가능함은물론이다. 본발명은리얼타임 PCR을이용한질염검사방법에서사용되는리얼타임 PCR 증폭용프라이머쌍으로서, 질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 의검출용표적유전자인 cpn60(60 kda chaperonin) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 1 및 2의프라이머쌍, 및서열번호 4 및 5의프라이머쌍중적어도하나의프라이머쌍과, 질염유발미생물인칸디다알비칸스 (Candida albicans) 의검출용표적유전자인 ITS(Internal transcribed Spacer) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 7 및 8의프라이머쌍과, 질내상재균 ( 常在菌 ) 인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 의검출용표적유전자인 slpa(surface layer protein A) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 10 및 11의프라이머쌍, 서열번호 13 및 14의프라이머쌍, 서열번호 16 및 17의프라이머쌍, 서열번호 19 및 20의프라이머쌍, 서열번호 22 및 23 의프라이머쌍, 서열번호 25 및 26의프라이머쌍, 및서열번호 28 및 29의프라이머쌍중적어도하나의프라이머쌍을포함하는, 질염유발미생물및질내상재균표적유전자증폭용프라이머세트를제공한다. 또한, 본발명은질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 의검출용표적유전자인 cpn60(60 kda chaperonin) 유전자에특이적인프로브로서서열번호 3 및서열번호 6의올리고뉴클레오티드들과이러한올리고뉴클레오티드들에상보적인올리고뉴클레오티드들로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브와, 질염유발미생물인칸디다알비칸스 (Candida albicans) 의검출용표적유전자인 ITS(Internal transcribed Spacer) 유전자에특이적인프로브로서서열번호 9의올리고뉴클레오티드와이러한올리고뉴클레오티드에상보적인올리고뉴클레오티드로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브와, 질내상재균인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 의검출용표적유전자인 slpa(surface layer protein A) 유전자에특이적인프로브로서서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27 및서열번호 30의올리고뉴클레오티드들과이러한올리고뉴클레오티드들에상보적인올리고뉴클레오티드들로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브를포함하는질염검사용프로브조성물을제공한다. 또한, 본발명의일실시예의리얼타임 PCR을이용한질염검사키트는, 질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 의검출용표적유전자인 cpn60(60 kda chaperonin) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 1 및 2의프라이머쌍, 및서열번호 4 및 5의프라이머쌍중적어도하나의프라이머쌍과, 질염유발미생물인칸디다알비칸스 (Candida albicans) 의검출용표적유전자인 ITS(Internal transcribed Spacer) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 7 및 8의프라이머쌍과, 질내상재균인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 의검출용표적유전자인 slpa(surface layer protein A) 유전자를특이적으로증폭하는서열번호 10 및 11의프라이머쌍, 서열번호 13 및 14의프라이머쌍, 서열번호 16 및 17의프라이머쌍, 서열번호 19 및 20의프라이머쌍, 서열번호 22 및 23의프라이머쌍, 서열번호 25 및 26의프라이머쌍, 및서열번호 28 및 29의프라이머쌍중적어도하나의프라이머쌍과, 질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 의검출용표적유전자인 cpn60(60 kda chaperonin) 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브로서서열번호 3 및서열번호 6의올리고뉴클레오티드들과이러한올리고뉴클레오티드들에상보적인올리고뉴클레오티드들로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브와, 질염유발미생물인칸디다알비칸스 (Candida albicans) 의검출용표적유전자인 ITS(Internal transcribed Spacer) 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브로서서열번호 9의올리고뉴클레오티드와이러한올리고뉴클레오티드에상보적인올리고뉴클레오티드로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브와, - 8 -
[0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] 질내상재균인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 의검출용표적유전자인 slpa(surface layer protein A) 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브로서서열번호 12, 서열번호 15, 서열번호 18, 서열번호 21, 서열번호 24, 서열번호 27 및서열번호 30의올리고뉴클레오티드들과이러한올리고뉴클레오티드들에상보적인올리고뉴클레오티드들로이루어진군에서선택되는적어도하나의프로브를포함한다. 본발명의일실시예의리얼타임 PCR을이용한질염검사키트는, DNA 중합효소, dntps, PCR 완충용액및 PCR 증폭산물의표지물질을더포함한다. 본발명의일실시예의리얼타임 PCR을이용한질염검사키트에있어서, 상기표지물질은, 상기 cpn60 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단과, 상기 ITS 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단과, 상기 slpa 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단, 예를들어 5' 말단에표지될수있다. 이와관련하여, 상기 cpn60 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브와, 상기 ITS 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브와, 상기 slpa 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브중 2종이상의프로브들은각기서로다른파장에서검출할수있는표지물질로표지되는것이바람직하다. 이와같이전술한바와같은프로브들중 2종이상의프로브들이각기서로다른파장에서검출할수있는표지물질로표지된경우, 1개의검사튜브에서질염과관련된질염유발미생물및 / 또는질내상재균을한번에검출할수있는장점이있다. 본발명의일실시예의리얼타임 PCR을이용한질염검사키트에있어서, 상기표지물질은형광물질이고, 상기표지물질로부터의형광의세기를측정하여상기 cpn60 유전자의증폭량, 상기 ITS 유전자의증폭량및상기 slpa 유전자의증폭량을산출할수있다. 본발명의일실시예의리얼타임 PCR을이용한질염검사방법은, 검체로부터유전자샘플을준비하는단계와, 상기준비한유전자샘플을주형으로사용하고, 전술한바와같은리얼타임 PCR을이용한질염검사키트를이용하여, 상기가드네넬라바지날리스의검출용표적유전자인 cpn60 유전자, 상기칸디다알비칸스의검출용표적유전자인 ITS 유전자, 및상기락토바실러스크리스파투스의검출용표적유전자인 slpa 유전자를리얼타임 (real-time) PCR로증폭하는단계와, 상기표적유전자의증폭후, 리얼타임 PCR 결과를확인하여상기검체내의가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스의존재여부및존재량과, 상기검체내의락토바실러스크리스파투스의존재여부및존재량을정량적으로측정하는단계와, 상기정량적으로측정된가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스의존재여부및존재량과, 락토바실러스크리스파투스의존재여부및존재량에기초하여질염여부를결정하는단계를포함한다. 본발명의일실시예의리얼타임 PCR을이용한질염검사방법에있어서, 질염이있는경우질염유발미생물인가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스의존재량이증가하고, 질내상재균인락토바실러스크리스파투스의존재량이감소하는것을특징으로한다. 본발명의일실시예의리얼타임 PCR을이용한질염검사방법은, 증폭전, 상기 cpn60 유전자, 상기 ITS 유전자및상기 slpa 유전자의카피수를알고있는유전자샘플인양성표준자를, 상기 cpn60 유전자, 상기 ITS 유전자및상기 slpa 유전자를각각증폭하는프라이머쌍과, 증폭되는상기 cpn60 유전자, 상기 ITS 유전자및상기 slpa 유전자와관련하여유전자증폭량을나타내는표지물질을이용하여리얼타임 (real-time) PCR로증폭하는단계와, 상기양성표준자의전체 PCR 증폭기간에대한상기표지물질의형광세기의변화를측정하고, 일정한형광세기에도달하는 PCR 반응회수 (Cp값또는 Ct값 ) 를분석하는단계와, 상기표지물질의형광세기의변화를측정하여얻어진표준곡선으로부터상기양성표준자의카피수와, Cp값또는 Ct값을대응시키는단계와, 상기검체의유전자샘플내에존재하는상기 cpn60 유전자, 상기 ITS 유전자및상기 slpa 유전자각각의전체 PCR 증폭기간에대한상기표지물질의형광세기의변화를측정하고, 일정한형광세기에도달하는 PCR 반응회수 - 9 -
(Cp 값또는 Ct 값 ) 를분석하는단계와, [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] 상기검체의유전자샘플내에존재하는상기 cpn60 유전자, 상기 ITS 유전자및상기 slpa 유전자각각을 PCR 증폭하여얻은 Cp값또는 Ct값을상기양성표준자의카피수에대응시켜, 상기검체내의가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스의존재여부및존재량과, 상기검체내의락토바실러스크리스파투스의존재여부및존재량을정량적으로측정하는단계를더포함한다. 본발명의일실시예의리얼타임 PCR을이용한질염검사방법에있어서, 상기표지물질은, 상기 cpn60 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단과, 상기 ITS 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단과, 상기 slpa 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브의한쪽말단, 예를들어 5' 말단에표지될수있다. 이와관련하여, 상기 cpn60 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브와, 상기 ITS 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브와, 상기 slpa 유전자의증폭산물에특이적으로결합하는프로브중 2종이상의프로브들은각기서로다른파장에서검출할수있는표지물질로표지되는것이바람직하다. 이와같이전술한바와같은프로브들중 2종이상의프로브들이각기서로다른파장에서검출할수있는표지물질로표지된경우, 1개의검사튜브에서질염과관련된질염유발미생물및 / 또는질내상재균을한번에검출할수있는장점이있다. 본발명의일실시예의리얼타임 PCR을이용한질염검사방법에있어서, 상기표지물질은형광물질이고, 상기표지물질로부터의형광의세기를측정하여상기 cpn60 유전자의증폭량, 상기 ITS 유전자의증폭량및상기 slpa 유전자의증폭량을산출할수있다. 한편, 본발명에있어서프로브의한쪽말단, 예를들어 5' 말단은 Cy5, Cy3, x-로다민, 텍사스레드, SYBR 그린 (SYBR green), FAM, VIC, JOE, NED, HEX, TET 및 TAMRA 등과같은형광물질로표지될수있고, 프로브의다른쪽말단, 예를들어 3' 말단은 IABkFQ, DABCYL, BHQ (BHQ-1, BHQ-2 등 ), EBQ, ZEN-IBFQ 등과같은소광물질로표지될수있다. 그러나, 본발명은이에제한되는것이아니고당업계에알려진다양한형광물질및소광물질이사용될수있음은물론이다. [0050] [0051] [0052] 발명의효과본발명에따르면, 리얼타임 PCR ( 실시간중합효소연쇄반응 ) 을이용하여검출대상이되는질염유발미생물과질내상재균외의다른미생물종과의교차반응이없고질내의정확한미생물종의정량값을제공할수있고, 이로써간단하면서도저비용으로신속하고정확하게질염을검사할수있다. 구체적으로, 본발명은임상검체로부터리얼타임 PCR을이용하여질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 및칸디다알비칸스 (Candida albicans) 를신속하면서도정확하게그리고정량화된데이터에기초하여특이도및민감도높게검출할수있고, 질내상재균 ( 常在菌 ) 인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 를질내의다른미생물종과의교차반응없이정량적으로분석할수있는장점이있다. 또한, 본발명은임상검체로부터리얼타임 PCR을이용하여전술한바와같은질염유발미생물과질내상재균의정확한질내존재량을특이도및민감도높게검출하여질염의진행의정도가증가할수록전술한바와같은질염유발미생물이증가하고, 반대로전술한바와같은질내상재균이감소하는것을정량적으로정확하게판단함으로써질염을간단하면서도저비용으로신속하고정확하게검사할수있다. [0053] 도면의간단한설명도 1은질내상재균인락토바실러스크리스파투스를특이도및민감도높게검출하는본발명의일실시예의프라이머쌍및프로브를이용하여표준미생물균주의게놈 DNA에대한리얼타임 PCR을수행하여얻어진결과그래프로서, 특이도실험에사용된다른균주의게놈 DNA에대해서는교차반응이없고검출대상인락토바실러스크리스파투스만을특이적으로검출하는결과를나타내고있다. 도 2는질염유발미생물인가드네넬라바지날리스를특이도및민감도높게검출하는본발명의일실시예의프라이머쌍및프로브를이용하여임상검체에대한리얼타임 PCR을수행하여얻어진결과그래프로서, 임상검체는가드네넬라바지날리스양성인것을나타내고있다. 도 3은질염유발미생물인칸디다알비칸스를특이도및민감도높게검출하는본발명의일실시예의프라이머 - 10 -
쌍및프로브를이용하여임상검체에대한리얼타임 PCR 을수행하여얻어진결과그래프로서, 임상검체는칸 디다알비칸스양성인것을나타내고있다. [0054] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 본발명의실시예에기초하여보다상세하게기술한다. 본발명의하기실시예는본발명을구체화하기위한것일뿐본발명의권리범위를제한하거나한정하는것이아님은물론이다. 본발명의상세한설명및실시예로부터본발명이속하는기술분야의전문가가용이하게유추할수있는것은본발명의권리범위에속하는것으로해석된다. 본발명에인용된참고문헌은본발명에참고로서통합된다. [0055] [0056] [0057] [0058] 실시예 1: 질염유발미생물검출을위한리얼타임 PCR용프라이머및프로브설계질염유발미생물인가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 및칸디다알비칸스 (Candida albicans) 를특이도및민감도높게검출할수있는표적유전자를선행문헌및 GenBank 유전자서열을토대로선정하였다. 이들질염유발미생물을특이적으로검출할수있는표적유전자로서, 가드네넬라바지날리스는 cpn60(60 kda chaperonin) 유전자를표적유전자로선정하였고, 칸디다알비칸스는 ITS(Internal transcribed Spacer) 유전자를표적유전자로선정하였다. GenBank AY123673.1의서열을참조한서열상동성분석으로통하여가드네넬라바지날리스 (Gardnerella vaginalis) 의표적유전자를특이적으로증폭하는프라이머와, 증폭반응결과물을특이적으로확인할수있는형광표지가된프로브를디자인하였다. 또한, GenBank KT876577.1의서열을참조한서열상동성분석으로통하여칸디다알비칸스 (Candida albicans) 의표적유전자를특이적으로증폭하는프라이머와, 증폭반응결과물을특이적으로확인할수있는형광표지가된프로브를디자인하였다. 각각의프라이머및프로브의위치정보는표준염기서열 (AY123673.1의서열및 KT876577.1의서열 ) 을참조하여확인하였고, %GC, Tm 값은 IDT(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES) 사 ( 미국, 아이오아주 ) 의올리고애널라이저 3.1(oligoanalyzer 3.1) 웹기반 (web-based) 프로그램을이용하여분석하였다. 가드네넬라바지날리스의검출을위한 cpn60(60 kda chaperonin) 유전자에특이적인리얼타임 PCR용프라이머및프로브와, 칸디다알비칸스의검출을위한 ITS(Internal transcribed Spacer) 유전자에특이적인리얼타임 PCR용프라이머및프로브는아래의표 1과같고이들프라이머및프로브는 ( 주 ) 바이오니아 ( 대한민국대전광역시소재 ) 에의뢰하여합성하였다. 한편, 하기표 1의명칭란에서 F는정방향프라이머, R은역방향프라이머, P는프로브를나타내고, 마지막에표시된번호는프라이머쌍과프로브의각조합을나타낸다. [0059] 표 1 질염유발미생물인가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스에각각특이적인프라이머쌍과프로브의조합 서열번호 명칭 염기서열 (5' 3') Tm( ) 위치 증폭산물 서열번호 1 GV-Cpn60-F1 ATCGCTCTTCGTCGCGGA 59.2 67-84 120 서열번호 2 GV-Cpn60-R1 TGCTGCAGAAATAGTTGCAGTAGCT 58.8 162-186 서열번호 3 GV-Cpn60-P1 AGCAATTGTTAAGGAACTTCTCGCATCTGCTA 61.2 102-133 서열번호 4 GV-Cpn60-F2 CGCATCTGCTAAGGATGTTG 53.8 123-142 91 서열번호 5 GV-Cpn60-R2 CAGCAATCTTTTCGCCAACT 54 214-195 서열번호 6 GV-Cpn60-P2 TGCAACTATTTCTGCAGCAGATCC 57.6 168-191 서열번호 7 CA-ITS-F TCGCTTTGACAATGGCTTAGGTCTAAC 58.9 360-386 89 서열번호 8 CA-ITS-R GATTTGAGGTCAAAGTTTGAAGATATACG 54.4 448-420 서열번호 9 CA-ITS-P ACATTGYTTGCGGCGGTAACGTCCA 64.3 392-416 [0060] [0061] [0062] 실시예 2: 질내상재균검출을위한리얼타임 PCR용프라이머및프로브설계질내상재균인락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 를특이도및민감도높게검출할수있는표적유전자를선행문헌및 GenBank 유전자서열을토대로선정하였다. 이러한질내상재균인락토바실러스크리스파투스를특이적으로검출할수있는표적유전자서열로서, slpa(surface layer protein A) 유전자를선정하였다. 실시예 1에기재된방법과동일하게 GenBank HQ716719의서열을참조한서열상동성분석으로통하여락토바실 - 11 -
러스크리스파투스의표적유전자를특이적으로증폭하는프라이머와, 증폭반응결과물을특이적으로확인할수있는형광표지가된프로브를디자인하였다. 락토바실러스크리스파투스의검출을위한 slpa(surface layer protein A) 유전자에특이적인리얼타임 PCR용프라이머및프로브는아래의표 2와같고이들프라이머및프로브는 ( 주 ) 바이오니아 ( 대한민국대전광역시소재 ) 에의뢰하여합성하였다. 한편, 하기표 2의명칭란에서 F는정방향프라이머, R은역방향프라이머, P는프로브를나타내고, 마지막에표시된번호는프라이머쌍과프로브의각조합을나타낸다. [0063] 표 2 질내상재균인락토바실러스크리스파투스에특이적인프라이머쌍과프로브의조합 서열번호 명칭 염기서열 (5' 3') Tm( ) 위치 증폭산물 서열번호 10 LC-F1 ATGAAGAAAAATTTAAGAATTGT 45.2 1-23 64 서열번호 11 LC-R1 CRACAGGAGCAACAGCT 53.9 64-48 서열번호 12 LC-P1 AGCGCTGCTGCTGCTGCT 638 25-42 서열번호 13 LC-F2 CTTACACATTCAAGAACG 45.5 1241-1258 73 서열번호 14 LC-R2 GAAGCCTTTACGTAAGTCT 49.1 1313-1295 서열번호 15 LC-P2 AGCAATACTACAAGATCGGTAACAACAC 56.9 1262-1289 서열번호 16 LC-F3 TCGTTGCACCTAAGTCATTCA 54.2 821-842 102 서열번호 17 LC-R3 CCTTGCCGTTTGGTACATTAAC 54.4 923-901 서열번호 18 LC-P3 CTGCTAACAACAACGATGCTTCACGC 60.6 860-886 서열번호 19 LC-F4 AAAGGCTGCTGGTGTTGA 54.8 786-804 99 서열번호 20 LC-R4 CGTGAAGCATCGTTGTTGTTAG 54.5 885-863 서열번호 21 LC-P4 TGGTTCGTTGCACCTAAGTCATTCACT 60.2 817-844 서열번호 22 LC-F5 TCACGCACTTTAGCTGTAACT 54.1 880-901 112 서열번호 23 LC-R5 GCTTAGCGTTCTTGTCGTAGTA 54.4 992-970 서열번호 24 LC-P5 ACGGCAAGGACATGACTGTACCAA 60.5 914-938 서열번호 25 LC-F6 GTTAATGTACCAAACGGCAAGG 54.4 901-923 106 서열번호 26 LC-R6 TGTCAGTACCAACACGCTTAG 54.6 1007-986 서열번호 27 LC-P6 TGACTGTACCAAGCCAAAGCAAGACT 60.4 926-952 서열번호 28 LC-F7 GAGTTGTTTGCAGGTTCAGATG 54.4 637-659 86 서열번호 29 LC-R7 TAGTTGCTTGCGTGGTACTT 54.3 723-703 서열번호 30 LC-P7 ACGTTGCTCAAGTTGTTTCAGCTGC 60.5 671-696 [0064] [0065] 실시예 3: 표준미생물균주의게놈 DNA를이용한리얼타임 PCR 수행전술한실시예에서설계된리얼타임 PCR용프라이머및프로브의특이도평가를위하여미생물자원센터 ( 대한민국, 대전광역시소재 ) 에서분양받은표준미생물균주로부터게놈 DNA를추출하였고, 이를리얼타임 PCR 증폭대상이되는주형으로사용하였다. 본실시예의특이도실험에사용된표준미생물균주정보는아래의표 3과같다. [0066] 표 3 특이도실험에사용된표준미생물균주정보 균주번호 균주명 균주번호 균주명 15240 아토포비움바지나에 (Atopobium vaginae) 1508 바실러스투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) 3515 락토바실러스바지날리스 (Lactobacillus vaginalis) 5194 락토바실러스젠세니 (Lactobacillus jensenii) 5054 락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 3178 락토바실러스크리스파투스 (Lactobacillus crispatus) 2510 프로튜스미라빌리스 (Proteus mirabilis) 3173 락토바실러스가세리 (Lactobacillus gasseri) [0067] 상기표 3 의표준미생물균주의게놈 DNA 추출에는위즈바이오솔루션 ( 대한민국, 경기도성남시소재 ) 의위즈프 렙 gdna 미니키트 (WizPrep gdna Mini Kit) 를사용하였고, 표준미생물균주로부터게놈 DNA 를추출후 - 12 -
PikoReal 96 리얼타임 PCR (real-time PCR) 장비 (Thermo Scientific, 미국메사추세츠주 ) 를이용하여리얼타임 PCR 을수행하였다. 다른미생물균주와의교차반응없이특이적으로질내상재균을검출하는리얼타임 PCR 조건 을확립하였고, 확립된리얼타임 PCR 증폭조건중가장양호한결과를얻은조건을본실시예에적용하였다. [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] 전술한 DNA 추출키트를사용하여추출된표준미생물균주의게놈 DNA( 주형 ) 1ng, 100pmol의프라이머 1μl ( 락토바실러스크리스파투스의표적유전자를특이적으로증폭하는본발명의일실시예의프라이머쌍, 예를들어서열번호 13 및 14의프라이머쌍 ), 그리고 100pmol의프로브 0.5μl ( 락토바실러스크리스파투스의표적유전자를특이적으로검출하는본발명의일실시예의프로브, 예를들어서열번호 15의프로브 ) 를 PCR 반응액에첨가하였다. 또한, PCR 반응액에는 2X 리얼타임 qpcr 마스터믹스 (real-time qpcr master mixture)( 애드바이오, 대한민국충청남도논산시소재 ) 10μl를첨가한후 PCR 반응액이 20μl가될때까지 3차증류수를첨가하였다. 그리고나서, PikoReal 96 리얼타임 PCR (real-time PCR) 장비를이용하여 95 에서 7분간변성하고, 40 사이클로 95 5초, 60 30초조건을반복하여실험을수행하였다. 한편, 리얼타임 PCR 증폭반응결과물을확인하고이를정량적으로분석하기위해프로브는형광물질및소광물질로이중표지되는데, 본실시예에서는 5' 말단에형광물질인 FAM ( 최대흡수파장 : 495nm, 최대방출파장 : 520nm) 으로표지하였고, 3' 말단에는소광물질인 BHQ-1을표지하였다. 한편, 프로브를표지하는형광물질및소광물질로는전술한예시에한정되는것이아니고, 당업계에알려진다양한형광물질및소광물질이사용될수있음은물론이다. 리얼타임 (real-time) PCR 방법은이러한형광물질과소광물질을 PCR 기법에응용한것으로반응중검체내에존재하는표적유전자의증폭과함께형광물질의발광 (emission) 정도를실시간으로검출하고정량분석하여표적유전자의증폭유무및그양상을신속하고정확하게분석할수있다. 리얼타임 PCR의기본원리는중합효소와형광공명에너지이동 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET) 의원리에의해 PCR의매주기마다실시간으로시행되는형광의검출과정량에있다. 리얼타임 PCR에서의정량은 PCR시매주기의진행상황을감시하여지수증가기 (exponential phase) 범위내에서실시간으로증폭산물을측정하는방법으로서, 이때중요한개념이 Ct(threshold cycle) 또는 Cp(crossing point) 라는수치이다. 이값은전술한이중표지된프로브에의해생기는형광의세기가기본값 (baseline level) 을넘어서감지될수있을정도로두드러지게증가하는시점의주기수이며, 이는표적유전자의초기주형량 ( 본실시예의경우락토바실러스크리스파투스의표적유전자인 slpa 유전자의카피수 ) 을정확하게반영한다. 따라서, 락토바실러스크리스파투스의 slpa 유전자를포함하는시료를 PCR 증폭하여전체 PCR 증폭기간에대한형광물질의형광세기의변화를측정하고일정한형광세기에도달하는 PCR 반응회수 (Cp값또는 Ct값 ) 를분석하고형광세기의표준곡선을얻은후, 락토바실러스크리스파투스의 slpa 유전자가존재하는지여부와시료내에포함된상기 slpa 유전자의초기주형량을정량적으로분석할수있다. 도 1에도시된바와같이, 표준미생물균주에대한리얼타임 PCR 실험을수행한결과균주번호 5054와 3178에서만양성값을확인할수있었으며, 다른미생물에대해서는반응하지않는것으로확인되었다. 즉, 본발명의일실시예의프라이머쌍및프로브를이용하여표준미생물균주의게놈 DNA에대한리얼타임 PCR을수행한결과, 특이도실험에사용된다른균주의게놈 DNA에대해서는교차반응이없고검출대상인락토바실러스크리스파투스만을특이적으로검출하는것을알수있었다. 따라서, 본발명의리얼타임 PCR을이용한질염검사방법은질내상재균인락토바실러스크리스파투스를질내의다른미생물종과의교차반응없이정량적으로분석할수있어, 정량화된데이터에기초하여특이도및민감도높게질염을검사하는데적합한것임을확인할수있었다. [0076] [0077] [0078] 실시예 4: 임상검체내에서의질염유발미생물인가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스검출실험주식회사유투바이오 ( 대한민국서울특별시송파구소재 ) 에서입수한임상검체를이용하여임상검체내에질염유발미생물인가드네넬라바지날리스및 / 또는칸디다알비칸스가존재하는지여부에대한리얼타임 PCR 실험을진행하였다 [IRB 접수번호-2015-S01-005, 승인번호제 IRB-2015-005호, 신속심의로진행 ( 위험도가매우낮은연구로분류 )]. 상기입수한검체는스왑샘플 (Swab sample)( 질내상피및 / 또는분비물 ) 로서, 주식회사유투바이오에서진행하는진단법으로양성임을확인된검체이다. 입수한검체로부터독일퀴아젠 (Qiagen) 사의 Qiaamp DNA mini kit를 - 13 -
이용하여 DNA를추출하였고, 추출된 DNA 2μl를리얼타임 PCR을위한주형으로사용하였다. PCR 장비, PCR 조성및 PCR 증폭조건등은실시예 3과동일하게하여리얼타임 PCR을수행하였고, 질염유발미생물인가드네넬라바지날리스및 / 또는칸디다알비칸스를특이도및민감도높게정량적으로검출하는리얼타임 PCR 조건을확립하였으며, 확립된리얼타임 PCR 증폭조건중가장양호한결과를얻은조건을본실시예에적용하였다. [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] 우선, 질염유발미생물인가드네넬라바지날리스를특이도및민감도높게검출하기위한본발명의일실시예의프라이머쌍 ( 예를들어, 서열번호 4 및 5의프라이머쌍 ) 및프로브 ( 예를들어, 서열번호 6의프로브 ) 를이용하여임상검체에대한리얼타임 PCR을수행하였다. 리얼타임 PCR 증폭반응결과물을확인하고이를정량적으로분석하기위해프로브는형광물질및소광물질로이중표지되는데, 본실시예에서는 5' 말단에형광물질인 FAM ( 최대흡수파장 : 495nm, 최대방출파장 : 520nm) 으로표지하였고, 3' 말단에는소광물질인 BHQ-1을표지하였다. 한편, 프로브를표지하는형광물질및소광물질로는전술한예시에한정되는것이아니고, 당업계에알려진다양한형광물질및소광물질이사용될수있음은물론이다. 도 2에는임상검체에대한리얼타임 PCR 결과가나타나있는데, FAM으로부터의형광신호의곡선이유효하게관찰되어임상검체를제공한주식회사유투바이오의사전검사결과, 즉임상검체가가드네넬라바지날리스양성인결과와일치하고있음을확인할수있었다. 또한, 질염유발미생물인칸디다알비칸스를특이도및민감도높게검출하기위한본발명의일실시예의프라이머쌍 ( 예를들어, 서열번호 7 및 8의프라이머쌍 ) 및프로브 ( 예를들어, 서열번호 9의프로브 ) 를이용하여임상검체에대한리얼타임 PCR을수행하였다. 리얼타임 PCR 증폭반응결과물을확인하고이를정량적으로분석하기위해프로브는형광물질및소광물질로이중표지되는데, 본실시예에서는 5' 말단에형광물질인 FAM ( 최대흡수파장 : 495nm, 최대방출파장 : 520nm) 으로표지하였고, 3' 말단에는소광물질인 BHQ-1을표지하였다. 한편, 프로브를표지하는형광물질및소광물질로는전술한예시에한정되는것이아니고, 당업계에알려진다양한형광물질및소광물질이사용될수있음은물론이다. 도 3에는임상검체에대한리얼타임 PCR 결과가나타나있는데, FAM으로부터의형광신호의곡선이유효하게관찰되어임상검체를제공한주식회사유투바이오의사전검사결과, 즉임상검체가칸디다알비칸스양성인결과와일치하고있음을확인할수있었다. 이러한결과들을종합하면, 본발명의리얼타임 PCR을이용한질염검사방법은질내분비물또는상피와같은임상검체로부터질염유발미생물인가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스를정량화된데이터에기초하여특이도및민감도높게검출할수있어, 간단하면서도저비용으로신속 정확하게질염을검사하는데적합한것임을확인할수있었다. 즉, 본발명은질염유발미생물을별도로배양하는과정이나의사에의한육안관찰과같은불편한진료과정없이도질내분비물이나상피와같이안전하게채취가능한검체로부터질염유발미생물의존재량을바로리얼타임 PCR에의해정량적으로검출할수있어, 여성환자들이꺼리는질염검사를간단하고신속하게수행할수있다. 한편, 본발명의실시예 3 및실시예 4에서는락토바실러스크리스파투스의표적유전자에특이적인프로브, 가드네넬라바지날리스의표적유전자에특이적인프로브및칸디다알비칸스의표적유전자에특이적인프로브를동일한형광물질 ( 즉, FAM) 과동일한소광물질 ( 즉, BHQ-1) 로표지하였으나, 본발명은이에제한되는것이아니며이들프로브들중 2종이상의프로브들은각기서로다른파장에서검출할수있는표지물질로표지될수있음은물론이다. 이와같이락토바실러스크리스파투스, 가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스에특이적인프로브들중 2종이상의프로브들이각기서로다른파장에서검출할수있는표지물질로표지된경우, 1개의검사튜브에서질염과관련된가드네넬라바지날리스, 칸디다알비칸스및락토바실러스크리스파투스중 2종이상의미생물을한번에검출할수있는장점이있다. 예를들어, 1종의프로브는 5' 말단이 FAM으로, 다른 1종의프로브는 5' 말단이 JOE로, 그리고또다른 1종의프로브는 5' 말단이텍사스레드 (TEXAS RED) 로표지될수있다. 또한, 프로브를표지하는형광물질및소광물질로는당업계에알려진다양한형광물질및소광물질이사용될수있다. 이상과같은실시예 3 및실시예 4의결과를종합하면, 본발명의리얼타임 PCR을이용한질염검사방법은질내분비물또는상피와같은임상검체로부터질염유발미생물인가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스를정량화된데이터에기초하여특이도및민감도높게검출할수있고질내상재균인락토바실러스크리스파투스를질내의다른미생물종과의교차반응없이정량적으로분석할수있어, 간단하면서도저비용으로신속하고정확하게질염을검사할수있는장점이있다고할수있다. - 14 -
[0086] [0087] 따라서, 본발명은임상검체로부터리얼타임 PCR을이용하여질염유발미생물인가드네넬라바지날리스및칸디다알비칸스와질내상재균인락토바실러스크리스파투스를신속하면서도정확하게그리고정량화된데이터에기초하여특이도및민감도높게검출할수있고, 질내상재균인락토바실러스크리스파투스를질내의다른미생물종과의교차반응없이정량적으로분석할수있다. 특히, 본발명은임상검체로부터질염유발미생물과질내상재균의정확한질내존재량을특이도및민감도높게검출하여질염의진행의정도가증가할수록전술한바와같은질염유발미생물이증가하고, 반대로전술한바와같은질내상재균이감소하는것을정량적으로정확하게판단함으로써질염을간단하면서도저비용으로신속하고정확하게검사할수있다. 이상본발명을상기실시예를들어설명하였으나, 본발명은이에제한되는것이아니다. 당업자라면본발명의취지및범위를벗어나지않고수정, 변경을할수있으며이러한수정과변경또한본발명에속하는것임을알수있을것이다. 도면 도면 1 도면 2-15 -
도면 3 서열목록 <110> YOON, HYUN KYU <120> Method and kit for diagnosing vaginitis using real-time PCR <130> P15-0033KR <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <220><223> GV-Cpn60-F1 forward primer <400> 1 atcgctcttc gtcgcgga 18 <210> 2 <211> 25 <220><223> GV-Cpn60-R1 reverse primer <400> 2 tgctgcagaa atagttgcag tagct 25 <210> 3 <211> 32-16 -
<220><223> GV-Cpn60-P1 probe <400> 3 agcaattgtt aaggaacttc tcgcatctgc ta 32 <210> 4 <211> 20 <220><223> GV-Cpn60-F2 forward primer <400> 4 cgcatctgct aaggatgttg 20 <210> 5 <211> 20 <220><223> GV-Cpn60-R2 reverse primer <400> 5 cagcaatctt ttcgccaact 20 <210> 6 <211> 24 <220><223> GV-Cpn60-P2 probe <400> 6 tgcaactatt tctgcagcag atcc 24 <210> 7 <211> 27 <220><223> CA-ITS-F forward primer <400> 7 tcgctttgac aatggcttag gtctaac 27 <210> 8 <211 > 29-17 -
<220><223> CA-ITS-R reverse primer <400> 8 gatttgaggt caaagtttga agatatacg 29 <210> 9 <211> 25 <220><223> CA-ITS-P probe <400> 9 acattgyttg cggcggtaac gtcca 25 <210> 10 <211> 23 <220><223> LC-F1 forward primer <400> 10 atgaagaaaa atttaagaat tgt 23 <210> 11 <211> 17 <220><223> LC-R1 reverse primer <400> 11 cracaggagc aacagct 17 <210> 12 <211> 18 <220><223> LC-P1 probe <400> 12 agcgctgctg ctgctgct 18 <210> 13-18 -
<211> 18 <220><223> LC-F2 forward primer <400 > 13 cttacacatt caagaacg 18 <210> 14 <211> 19 <220><223> LC-R2 reverse primer <400> 14 gaagccttta cgtaagtct 19 <210> 15 <211> 28 <220><223> LC-P2 probe <400> 15 agcaatacta caagatcggt aacaacac 28 <210> 16 <211> 21 <220><223> LC-F3 forward primer <400> 16 tcgttgcacc taagtcattc a 21 <210> 17 <211> 22 <220><223> LC-R3 reverse primer <400> 17-19 -
ccttgccgtt tggtacatta ac 22 <210> 18 <211> 26 <220><223> LC-P3 probe <400> 18 ctgctaacaa caacgatgct tcacgc 26 <210> 19 <211> 18 <220><223> LC-F4 forward primer <400> 19 aaaggctgct ggtgttga 18 <210> 20 <211> 22 <220><223> LC-R4 reverse primer <400> 20 cgtgaagcat cgttgttgtt ag 22 <210> 21 <211> 27 <220><223> LC-P4 probe <400 > 21 tggttcgttg cacctaagtc attcact 27 <210> 22 <211> 21-20 -
<220><223> LC-F5 forward primer <400> 22 tcacgcactt tagctgtaac t 21 <210> 23 <211> 22 <220><223> LC-R5 reverse primer <400> 23 gcttagcgtt cttgtcgtag ta 22 <210> 24 <211 > 24 <220><223> LC-P5 probe <400> 24 acggcaagga catgactgta ccaa 24 <210> 25 <211> 22 <220><223> LC-F6 forward primer <400> 25 gttaatgtac caaacggcaa gg 22 <210> 26 <211> 21 <220><223> LC-R6 reverse primer <400> 26 tgtcagtacc aacacgctta g 21 <210> 27 <211> 26-21 -
<220><223> LC-P6 probe <400> 27 tgactgtacc aagccaaagc aagact 26 <210> 28 <211> 22 <220><223> LC-F7 forward primer <400> 28 gagttgtttg caggttcaga tg 22 <210> 29 <211> 20 <220><223> LC-R7 reverse primer <400 > 29 tagttgcttg cgtggtactt 20 <210> 30 <211> 25 <220><223> LC-P7 probe <400> 30 acgttgctca agttgtttca gctgc 25-22 -