최종보고서 [ 기관고유연구사업 ] 과제고유번호 1310381 연구분 야 ( 코 드 ) G-3 지원 프로그램 창의과제 공개가능여부 ( 공개, 비공개 ) 공개 연구사업명 연구과제명 국립암센터기관고유연구사업 PD-1 등의면역억제유전자제어를통한유전자세포치료제개발 비뇨생식기암과제책임자성명이상진소속직위과장연구과 구분 (1세부) 세부과제 (2세부) (3세부) 2013년 01월 ~ 총연구기간 2015년 12월 ( 총 3년 ) 과제명삼중면역조절유전자탑재항종양아데노바이러스치료제개발면역억제인자 PD-L1 및 CD200 표적두경부암유전자면역치료제개발혈액종양에서동종골수이식후 CTLA4 변이유전자이입동종T세포요법의개발 해당단계참여연구원수총연구기간참여연구원수 총 : 21명 내부 : 21명 외부 : 명 총 : 21명 내부 : 21명 과제책임자 성명 소속 ( 직위 ) 전공 이상진 비뇨생식기암연구 약리학 정유석 특수암연구과 의학 엄현석 혈액종양클리닉 의학 해당단계 연구비 :200,000천원 연구개발 민간 : 천원 비 계 : 200,000 천원 연구비 : 천원 총연구개발비 민간 : 천원 외부 : 명계 : 천원 구분연구기간계국립암센기업부담금터소계현금현물연구기간및계 13.01~ 15.12.31 650,000 연구비제1차 13.01~ 13.12.31 200,000 ( 단위 : 천원 ) 제2차 14.01~ 14.12.31 200,000 제3차 15.01~ 15.12.31 250,000 참여기업참여기업명 : 국제공동연구 위탁연구 상대국명 : 상대국연구기관명 : 연구기관명 : 연구책임자 : 요약 ( 연구개발성과를중심으로개조식으로작성하되, 500 자이내로작성합니다 ) 2015 년 10 월 28 일 과제책임자 : 이상진 ( 인 ) 국립암센터원장 귀하
< 국문요약문 > 연구의 목적및내용 연구개발성과 연구개발성과의활용계획 ( 기대효과 ) 현재, 국립암센터가자체개발한아데노바이러스면역유전자치료제 (Ad5mTR.sPD1) 및유전자이입 T 세포치료제 (CTLA4 변이유전자를탑재한 T 세포 ) 를기반으로 항암면역효능이더욱강화된차세대아데노바이러스유전자치료제및 CTLA4 변이유전자가동종항암 T 세포 (allogenic T cell) 에이입된유전자이입 동종 T 세포치료제를개발함 제1세부 : n 방광암, 대장암모델에서 Ad5mTR.sPD1과항암제, 방사선의표준치료와병합치료 n 제 2 세부 : n n 의항종양효과검증및항종양효과에관여하는면역세포분석 Ad5CRT 의임상시험 1 상 Ad5mTR 과 Cisplatin 에 AdmTR 의항암효능강화검증완료및그기작연구 암세포에서발현하는 CD200 의암전이조절연구 제 3 세부 : n allogenic donor T cell 에 CTLA4 변이유전자를이입하는유전자이입 T 세포요 법을통해개선된 delayed DLI(donor lymphocyte infusion) 법을개발 < 정량적성과 1) > 구분 달성치 / 목표치 1) 달성도 (%) SCI 논문편수 4/6 70 IF 합 21.516/42 50 국내출원1건, 등록3건 기타성과 ( 특허 ) 국외출원 10 건, 국외등록 1 건 1) 총연구기간내목표연구성과로기제출한값 < 정성적성과 > DLI 에서최적의항종양효과를위해고려해야할제반조건확립 400% 새로운 T 세포활성화유전자인 CTLA4-CD28 유전자가이입된동종 T 세포요법 (allogenic T cell therapy) 을개발 Ad5mTR.sPD1 바이러스와항암제 (cisplatin) 병합치료 POC 로임상으로적용가능성 증명 암세포에서발현하는 CD200 의새로운기능규명으로항암제개발의중요성증명 아데노바이러스 Ad5CRT 의임상 1 상시험진행 유전자치료제는융합기술로써타분야의새로운기술발전과궤도를같이하 므로타분야의연구를활발히촉진할수있는동력을제공할것임. 또한, 본과제에서개발한유전자치료제와유전자조작세포치료제는향후 바이오항암치료제로개발될것으로기대함. 중심어 (5 개이내 ) 유전자치료제 유전자세포치료 제 아데노바이러스 공여자림프구주 입술 면역관문
< 영문요약문 > SUMMARY Purpose& Contents On the basis of current biotherapeutic modalities (Ad5mTR.sPD1 and geneticaly-engineered T cell therapy), these studies aim to developing more advanced adenvoirus-based genetherapy and genetically engineered DLI(delayed T lymphocyte infusion). n Using bladder and colon animal models, this study evaluates the anti-cancer efficacy and the mechanism. Additionally, this study tests the potential possibility of combination of Ad5mTR.sPD1 with other standard therapies like chemotherapy and radiation therapy. n clinical trial phase of Ad5CRT n Evaluation of the combination therapy of Ad5mTR with Cisplatin in terms of anti-tumor efficacy and anti-tumor mechanis. Results Expected Contribution n n Functional role of CD200 to control metastasis when expresed on cancer cell. Development of delayed DLI(donor lymphocyte infusion) by inserting CTLA4 mutation gene into allogenic T cell. <Quantative Achievement 1) > achievement/goal achieved (%) SCI papaers published 4/6 70 IF in total 21.516/42 50 others (patent) <Qualative Achievement> Ad5mTR.sPD1 바이러스와항암제 (cisplatin) 병합치료 POC 로임상으로적용가능성증 명 암세포에서발현하는 CD200 의새로운기능규명으로항암제개발의중요성증명 During DLI, establishment of the most optimal conditions for the maximum anti0cancer effect. Development of allogenic T cell therapy by inserting CTLA4-CD288 susion gene. Proof of concept for the combination therapy bwtween cisplatin and Ad5mTR.sPDa Proof of novel biological functions of CD200 expressed on cancer cell membrane during cell metastasis. Clinical trial phase 1 of adenovirus Ad5CRT Gene therapy is a fusion technology, so that it needs to co-develop related-new technologies for its success and vice versa. Gene therapy and genetically-engineered cell therapy (DLI) would be further developed for clinical translation. Keywords gene therapy cell therapy adenovirus DLI immune checkpoint
목차 1. 연구개발과제의개요 6 2. 국내외기술개발현황 7 3. 연구수행내용및결과 10 4. 목표달성도및관련분야에의기여도 14 5. 연구결과의활용계획등 14 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 15 7. 연구개발과제의대표적연구실적 15 8. 참여연구원현황 16 9. 기타사항 16 10. 참고문헌 17 < 별첨 > 자체평가의견서
I. 제 1 세부과제 세부과제명 : 삼중면역조절유전자탑재항종양아데노바이러스치료제개발 세부과제책임자 ( 성명 / 소속 ) : 이상진 ( 비뇨생식기암연구과 )
1. 연구개발과제의개요 1-1. 연구개발목적 국립암센터가자체개발한아데노바이러스면역유전자치료제 (Ad5mTR.sPD1) 를기반으로항암면역효능이더욱강화된차세대아데노바이러스유전자치료제를개발하고자함 아데노바이러스 Ad5CRT의임상시험 1상진행 1-2. 연구개발의필요성 현재암치료의현황및치료의지향방향 -우리나라에서 2013년에암으로사망한사람은총 75,334명이고전체사망자의 28.3% 가암으로사망하였음. < 그림 1> 2013 년도암으로인한사망자수 -대표적인새로운접근이종양의발암과정을고려한표적치료제로써만성골수성백혈병의발암과정을이해하고원인을교정함으로써치료의 paradigm이바뀌었으며 ( 그림2) EGFR 유전자변이 (mutation) 가있는환자에서 EGFR을억제함으로써환자의치료에도움을줌. 그이후많은표적치료의붐이일고표적치료라는이름하에많은아류를내고있지만치료의효과가미비하였으나종양의발암과정에관련되는 B-raf 돌연변이를유전자를억제하는약제가나오면서종전에는치료의방법이없던흑색종을치료할수있는길을열었음. 이세예에서보여주는것과같이종양의발암과정의특성을완전히이해하고그표적물질을개발하게되면그질환의예후를완전히바꾸어놓을수있다는것을보여준대표적인경우라고할수있음. < 그림 2> 만성백혈병환자의표적치료제인 imatinib 이기존의표준치료와의비교치료반응률 항암신약개발의중요성 - 항암신약개발의필요성 : 최근인구의노령화에따른암환자의꾸준한증가로사회적비용이급격한상승
하고있음 - 암발생률 : 12.4만명 ( 03) 에서 14.3만명 ( 05) 으로 14.8% 증가 - 암사망률 : 07년현재 6.8만명 (27.6%) 으로사망원인 1위 - 경제적부담 : 9.4조원 ( 02) 에서 14.3조원 ( 05) 으로급증 < 그림 3> 질병별사망원인분석및암발생에따른사회경제적비용 항암제개발의산업, 경제적필요성 - 전세계의항암제는 63조원 (481억불) 으로전체제약시장의 6.2% (IMS헬스, 세계처방약시장보고서 ) 를차지하고있음 - 국내의약품시장규모는 13.8조원이며, 이중항암제가 5천억원으로국내시장의 3.6% ( 메디팜스투데이 ) 를차지하고있음 - 항암신약개발은고비용, 고위험성이따르는연구개발분야로후보물질 5,000~10,000건당하나가성공할정도로실패가능성이높으나 1개의글로벌신약으로도세계초일류기업으로성장가능함 (1개의신약개발시 4.8억불의소요비용과예상수익은 22억불이상임 ) 면역관문을조절하는치료제의성공적인임상진입 - 면역관문유전자 PD-1, CTLA4를억제하는항체치료제가훌륭한임상시험결과를보여줌. 특히, PD-1를억제하는 nivolumab은 BRAF 돌연변이가없는흑색종과 Metastatic Squamous 비소세포폐암에서환자를대상으로시판허가를획득함. - 면역관문을표적하는치료제의성공적인결과로다국적제약회사를비롯한많은연구자가기존의혹은새로운면역관문을표적하는다양한치료제를개발하기위하여각축하고있음. 유전자치료제개발의필요성 - 유전자치료제개발을위한벡터제작기술은선진국과대등함 - 유전자치료제를생산하고, 임상시험을진행하는기술력은선진국의 70% 수준으로기존의저분자항암제와비교하여기술격차가작으므로국내의기술경쟁력을갖추고있음 -현재, 임상3상에진입한유전자치료제를비롯한국내에유전자치료제를개발할수있는인프라를갖추고있음 1-3. 연구개발범위 Ad5EF1α.FLT3L 아데노바이러스항종양효과검증및면역세포활성화분석 2. 국내외기술개발현황 가. 국내기술수준및시장현황 기술현황
-국내의바이러스를이용한항암유전자치료제는아데노바이러스 (adenovirus), HSB (herpes simplex virus), vaccinia virus, retrovirus를이용하여치료유전자를암세포로전달하여암세포의사멸을유도함. -바이러스에의한암세포를사멸하는기작은세포독성유전자 (HSVtk, cytosine deaminase 등 ) 를탑재하거나, 바이러스의증식을암세포특이적으로유도하는기작을갖춤. 또한, 면역조절유전자를탑재하여부가적으로항암효과를증강시킴. -또한, 바이러스의종양표적을향상시키기위하여바이러스를리포좀으로싸서체내로전달하는방법으로치료제를개발하는연구도진행하고있음. -항암유전자치료제시장은성숙기로다수의품목이임상 2상혹은임상 3상에진입하였으며, 국립암센터 Ad5CRT를비롯한몇개의제품은임상1상을진행하고있음. 1년내로시판허가를획득한유전자치료제가시장에출시될것으로추측함. 세계시장현황 - 2014년 6월기준으로유전자치료제임상은전체의 64% 가암관련치료제개발과관련돼있음. 정부에서는최근 바이오헬스미래신산업육성전략 에따라유전자치료제의임상, 생산및수출등사업전반에걸쳐총 3400억원을투자한다는계획을발표하였음. < 그림 4> 유전자치료제의세계시장현황 경쟁기관현황 -항암바이러스벡터를개발하는기업체는바이로메드 (VM206RY), 신라젠 (JX594), 제넥신 (GX-188E) 으로활발하게바이러스기반의항암유전자치료제를개발하고있음. -다수의대학과연구소에서바이러스기반의유전자치료제를백신의형태로혹은적극적치료제로개발하여임상시험연구를수행하고있음 < 표 1> 암질환의국내유전자치료제임상시험 코드명 개발회사 임상단계 대상질환치료유전자전달벡터 VMDA3601 동아제약 Ⅱ 허혈성족부질환 VEGF naked DNA JX-594 녹십자 / 동아대학교 Ⅱ 간암 TK -,GM-CSF Vaccinia virus Theragene 뉴젠팜 Ⅱ 전립선암 TK, CD Adenovirus VM106 바이로메드 Ⅰ/Ⅱa 만성육아종 gp91 Retrovirus
GX-12 동아제약 / 포항공대 Ⅰ HIV 감염 HIV 항원, IL-12 naked DNA VM202RY 바이로메드 Ⅰ 허혈성심혈관질환 HGF naked DNA TissueGene-C 코오롱생명과학 Ⅰ 퇴행성관절염 TGFb Retrovirus HB-110 동아제약 / 포항공대 Ⅰ B 형간염 HBV 항원, IL-12 naked DNA DW-418 대웅제약 Ⅰ 두경부암 TERT, relaxin Adenovirus Ad5CRT 지식재산권현황 보령제약 / 국립암센터 I 간암 / 간전이암 HSVtk Adenovirus - 특허는종양을특이적으로표적하는기작, 유전자를탑재한바이러스벡터, 바이러스벡터에탑재되는치료 유전자로크게분류할수있으며, 본과제를진행하는연구자는 htert-ribozyme 기반의종양표적기작을탑 재한아데노바이러스에대한국내외특허를보유하고있음 - 또한, HSVtk 와 PD-L1 를억제하는유전자를탑재한바이러스에대한국내외특허를보유하고있음 나. 국외기술수준및시장현황 기술현황 - 현재상용화된유전자치료제는 2가지제품으로, 중국에서최초로승인받은유전자치료제인 Gendicine은 H&N Cancer 치료용 Adenoviral vector를사용한 P53 유전자이며, 필리핀에서승인받은고형암치료제인 Rexin G는 Retroviral vector를이용한 Cyclin-G1 gene 으로서, 현재미국내유방암및췌장암환자를위한임상을진행중임. - 선진국에서는바이러스성전달체의안전성을향상시키고나노와같은신소재비바이러스성전달체를개발하고있으며뿐만아니라임상에서안전장치를마련하는등꾸준한기술개발을진행하고있음. 시장현황 - 암유전자치료제시장은아직본격적으로형성되지않아그규모를예측하기는어려우나세계최초로 2004 년 1월에중국에서발매된 Ad/p53 (p53 유전자를함유한아데노바이러스 ) 유전자치료제의성장을지켜보면시장규모에대한윤곽을파악할수있을것임 - 암유전자치료제의본격상용화시점은다양한제품이출시될것으로예상되는 2010년이후로예측되고있음. 제품화성공후년차별치료환자수의증가율은 Frost & Sullivan에서는총환자의 5%(1차년도 ), 7%(2차년도 ), 11%(3차년도 ), 15%(4차년도 ), 20%(5차년도 ) 를기준으로예측하고산정함 경쟁기관현황 - 유전자치료에대한연구가초기에는미국을중심으로진행되었고유럽은상대적으로연구가미미했지만정 부의적극적인지원으로유전자치료에대한연구와상업화가활성화되고있음. < 표 2> 암질환의해외유전자치료제임상시험 회사명 유전자전달체 대상질병 Targeted Genetics Co. 베타인터페론-신경종 ( 임상1상 ) 아데노바이러스,, 낭포성섬유증, 비바이러스 ( 지질 ) 류마티스관절염 ( 임상2상 ) Cell Genesys, Inc 아데노바이러스, 렌티바이러스 암백신 ( 임상3상 ) Valentis 비바이러스성 ( 폴리머, 지질 ) 암 ( 임상2상 ) Transgene S.A. 아데노바이러스 면역증강치료, 항원-특이치료 Genetronics Biomedical Co. Elctroporation 고형암 ( 임상1,2상 )
Introgen Therapeutics Inc. 아데노바이러스, 비바이러스성 p53 유전자치료 ( 임상 1,2,3 상 ) GenVec, Inc. 아데노바이러스 췌장암 ( 임상2상 ) Vical Inc. 비바이러스성 ( 지질 ) 암 ( 임상3상 ) Avigen Inc. 아데노바이러스 선청성, 후천성질환 Copernicus Therapeutics, Inc. 비바이러스성 ( 다가양이온펩티드 ) 암 ( 임상3상 ) Onyx Pharmaceuticals, Inc. 아데노바이러스 암 ( 임상2,3상 ) Medigene 헤르페스바이러스, 뇌종양 ( 임상2상 ), 아데노바이러스간암전이 ( 임상2상 ) 지식재산권현황 - 특허는종양을특이적으로표적하는기작, 유전자를탑재한바이러스벡터, 바이러스벡터에탑재되는치료유 전자로크게분류할수있으며, 유전자치료제는각기다양한형태로개발되므로, 초우월적인특허는없음. 3. 연구수행내용및결과 Ad5EF1α.FLT3L 아데노바이러스항종양효과검증및면역세포활성화분석 n Ad5EF1α.FLT3L 아데노바이러스제작 FLT3L를과발현하는아데노바이러스를제작하기위하여 FLT3L의 cdna를아데노바이러스의 E3에클로닝하였으며, FLT3L의발현은 EF1α 전사조절체에의해서발현이조절됨. 아래의바이러스 Ad5EF1α.FLT3L 는 E1 region이결손된아데노바이러스로복제능력이없으며 FLT3L 유전자를세포로전달하는역할을가지고있음. Ad5EF1α.FLT3L 를 10MOI로 293 세포로감염시키고 24시간후에배양액을수거하여 western blot으로 FLT3L의발현을확인하였음. [ 그림5] Ad5EF1α.FLT3L 아데노바이러스의구조와세포를감염하여 FLT3L의발현 n 바이러스 Ad5EF1α.FLT3L에의해서발현하는 FLT3L의기능분석 -C57/BL6 마우스에 OVA 항원을발현하는 EL4 lymphoma 세포 (EG.7) 를마우스에이식하고종양이 40mm 3 이상으로커졌을때에 Ad5EF1α.FLT3L 를종양으로주사하여 FLT3L의발현을다량으로유도함. 3일후에종양주변에형성된 draining lymph node (DLN) 을수거하여 MACS로 DC(dendrite cell) 를분리하고, OT-1 마우스에서준비된 OVA를인지하는 TCR를가진 T 세포와함께배양하였음. 배양액에존재하는 INF-gamma를 ELISA로측정하였음. [ 그림 6] Ad5EF1α.FLT3L 를주사하고 FLT3L 에의한 DC 의기능이향상되어 T 세포의기능을강화하는지분석
-T 세포의활성화는 T 세포를항원 (ovalbumin) 으로자극하고, T 세포에서만드는 INF-gamma 를측정하면아래의 그림에서보듯이 Ad5EF1α.FLT3L 를종양으로주사하면 T 세포의기능을강화할수있음을관찰하였음. [ 그림 7] Ad5EF1α.FLT3L 를주사하고 FLT3L 에의한 T 세포의활성화를 INF-gamma 로측정 n 바이러스 Ad5EF1α.FLT3L에의해서 Ad5mTR의항종양효과강화검증 - 아데노바이러스 Ad5EF1α.FLT3L 에의해서 Ad5mTR의바이러스항종양효과를강화하는지를종양성장억제능력으로평가하였음. CT26이라는세포를이용하여 C57/BL6 마우스에종양을만들고다양한바이러스를주사하여종양의성장을측정하였음. Ad5EF1α.FLT3L는단일치료제로써는항종양효과를가지고있지않았으나, AdmTR과동시에주사하였을때는 Ad5mTR의치료효과를향상시켰음. - [ 그림 8] Ad5EF1α.FLT3L 와 Ad5mTR 의구조를보여줌. 바이러스에의한치료효과를 CT26 세포의종양의성장억제로관찰 n 바이러스 Ad5EF1α.FLT3L 에의해서 Ad5mTR.sPD1 의항종양효과강화검증 - 아데노바이러스 Ad5EF1α.FLT3L 에의해서 Ad5mTR.sPD1 의바이러스항종양효과를강화하는지를종양성장억제능력
으로평가하였음. [ 그림 9] Ad5EF1α.FLT3L 에의한 Ad5mTR.sPD1 항종양효과향상 n 바이러스 Ad5EF1α.FLT3L에의한항종양효과는 CD8세포의존성검증 - 아데노바이러스 Ad5EF1α.FLT3L 에의해서 Ad5mTR.sPD1의바이러스항종양효과를강화는여전히 CD8 T lymphocyte를필요로하는지를검증하기위하여 C57/BL6마우스에 CT26의종양을이식하고바이러스와 CD8 T 세포를무력화시키는항체를주사하여종양성장억제능력으로평가하였음. 항체는 5일간격으로주사하였으며, 바이러스를주사하기 5일전부터항체를주사하였음. 아래의그림에서보듯이 CD8를무력화시키는항체는 Ad5EF1α.FLT3L + Ad5mTR.sPD1 치료제의효능을크게감소시킴을알수있었음. [ 그림 10] CD8-depleting 항체의존재하에서 0Ad5EF1α.FLT3L 에의한 Ad5mTR.sPD1 항종양효과향상 n 바이러스 Ad5EF1α.FLT3L에는종양으로침투하는 T 세포의숫자도크게향상시켰음 - 마우스에종양을만들고종양을 14일째수거하여종양에존재하는 CD8 T 세포를 Alexa 546으로 conjugated 항체를이용하여염색하였음. 아래의그림에서보듯이 FLT3L로종양을처리하면종양으로침투하는 T 세포의수를크개증가시킴. [ 그림 11] Ad5EF1α.FLT3L 로종양을주사하고종양으로침투하는 CD8+ T 세포의염색
아데노바이러스 Ad5CRT의임상시험연구전임상연구 시료생산 ( 대웅제약 ): GMP 시설에서생산된시료를 HPLC를이용하여정제하고 banking 하였음 독성시험완료 (MPI research, USA): 1) 동물종 : ICR 마우스 2) 투여경로및횟수 : 정맥내투여, 4주와 13주반복투여 4) 투여경로 : 뇌내단독투여 5) 바이러스의 bio-distribution 6) 안전성및독성시험 특성분석완료 (Wuxi-Apptech, USA): GMP 시설에서뱅킹된시료의임상시험적합여부를검사하는특성분석 완제품 Certification of Analysis 완료 (Bio Outsource, UK): GMP 시설에서생산된시료의임상시험에적합한지여부의특성분석 두번째완제품 Certification of Analysis 완료 (Wuxi-Apptech, USA): 두번째생산된임상시료의임상시험에적합한지여부를검사하는특성분석 임상시험허가서획득 [ 그림 12] 아데노바이러스임상시험허가서
기술이전 -2013 년도 12 월에아데노바이러스 Ad5CRT 는보령제약으로 25 억에기술이전되었음. 기술이전은국립암센터와보 령제약이협력하여임상시험 1 상을완료한다고명시하고있음 임상시험1상연구 -본임상시험은 Ad5CRT의최대내약용량 (MTD) 을평가하기위해용량단계에따라 Ad5CRT 단회투여 (Day 0) 후 14 일까지 5 mg/kg를매 12시간마다간시클로버를투여하고, 시험약투여후 28일동안용량단계에서용량제한독성 (DLT) 을평가하고자함. 각용량단계에서시험자에의해판단된시험약과관련성이있는이상반응을 CTCAE version 4.03에근거하여판정하고자함 < 표 3> Ad5CRT 각용량단계 용량군시험약대상자수 제 1 용량군 1 X 10 11 VP 3-6 제 2 용량군 1 X 10 12 VP 3-6 제 3 용량군 2 X 10 12 VP 3-6 ** 용량제한독성 (DLT): Ad5CRT 와연관된 Grade 3 이상의비혈액학적독성 ( 구역제외 ) 또는 Grade 4 이상 의혈액학적독성으로정의됨 ** 최대내약용량 (MTD): 3 명중 1 명이상또는 6 명중 2 명이상에서용량제한독성 (DLT) 이발생하지않은 최대용량군으로결정함 연구결과 현재까지 1 cohort 의 3 명환자에바이러스주입하고, DLT 를결정하는임상시험을수행하고있음. 3 명중 1 명은 SD (stable disease) 로결정됨. 4. 목표달성도및관련분야기여도 4-1. 목표달성도 Ad5mTR.sPD1과 FLT3L의종양억제시너지효과를증명함 (100%) 임상시험 1상수행 (100%) 4-2. 관련분야기여도 종양미세환경에서항암면역을활성화시킬수있는방법을제시함으로써, 향후치료제개발의방향을제시함. 5. 연구결과의활용계획 국립암센터의현 pipeline치료제인유전자치료제 Ad5mTR.sPD1를발판으로보다효능이향상된다중면역조절인자를탑재한아데노바이러스기반의유전자세포치료제를개발함으로써향후항암유전자치료제를선도할수있는원천기술을확보하고, 치료제로활용.
6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 7. 연구개발과제의대표적연구실적 번호 구분 ( 논문 / 특허 / 기타 논문명 / 특허명 / 기타 소속기관명 역할논문게재지 / 특허등록국가 Impact Factor 논문게재일 / 특허등록일 사사여부 ( 단독사사또는중복사사 ) 특기사항 (SCI 여부 / 인용횟수등 ) Intravesical instillation of 1 논문 2 논문 3 논문 4 논문 c-myc inhibitor KSI-3716 suppresses orthotopic bladder tumor growth Antitumor activity of the c-myc inhibitor KSI-3716 in gemcitabine-resistan t bladder cancer Development of Replication-competen t Adenovirus for Bladder Cancer by Controlling Adenovirus E1a and E4 Gene Expression with the Survivin Promoter Low-dose cisplatin converts the tumor microenvironment into a permissive state for HSVtk-induced antitumor immunity in HPV16-related tonsillar carcinoma 국립암센터국립암센터국립암센터국립암센터 책임저 자 책임저 자 책임저 자 책임저 자 J of Urology Oncotarget Oncotarget Cancer Letters 3.753 2014.02.01 중복사사 SCI 6.627 2014.01.30 중복사사 SCI-E 6.627 2014.06.30 중복사사 SCI-E 5.621 2015.01.28 중복사사 SCI-E 5 특허 트랜스-스플라이싱라이보자임및암치료유전자를포함하는재조합 국립암센터 주발명 자 대한민국 등록 ( 국외출원 ) 2013.07.31
아데노바이러스및 이의용도 6 특허 안전성및항암활성이증가된재조합아데노바이러스및이의용도 국립암센 터 주발명 자 대한민국 등록 ( 국외출원 ) 2014.08.06 8. 참여연구원현황 소속기관명직위생년월일전공및학위 연구담당분야 신규채용여부 * 국가연구개발사업참여율 (%)[B] 번호 성명 과학기술인등록번호 성별 취득년도 학위 ( 전공 ) 과제참여기간 본과제참여율 (%) [A] 전체참여율 [A+B,%] 국립암센터 이상진 9. 기타사항
10. 참고문헌
< 별첨작성양식 > [ 별첨 ] 1. 과제현황 자체평가의견서 과제번호 1310381 사업구분 기관고유연구사업 연구분야유전자치료제개발단위과제구분사업명국립암센터기관고유사업주관 총괄과제 PD-1 등의면역억제유전자제어를통한유전자세포치료제개발 총괄책임자 이상진 과제명 삼중면역조절유전자탑재항종양아데노바이러스치료제개발 과제유형 ( 기초, 응용, 개발 ) 연구기관 국립암센터 연구책임자 이상진 연차 기간 연구비 민간 계 연구기간 1차년도 13.01~ 15.12.31 100,000 연구비 2차년도 14.01~ 14.12.31 100,000 ( 천원 ) 3차년도 15.01~ 15.12.31 100,000 계 13.01~ 15.12.31 300,000 참여기업 상대국 상대국연구기관 총연구기간이 5 차년도이상인경우셀을추가하여작성요망 2. 평가일 : 2015년 10월 28일 3. 평가자 ( 과제책임자 ) : 소속직위성명국립암센터비뇨생식기암과장이상진연구과 4. 평가자 ( 과제책임자 ) 확인 : 본인은평가대상과제에대한연구결과에대하여객관적으로기술하였으며, 공정하게평가하였음을확약하며, 본자료가전문가및전문기관평가시에기초자료로활용되기를바랍니다. 확약
Ⅰ. 연구개발실적 다음각평가항목에따라자체평가한등급및실적을간략하게기술 (200자이내 ) 1. 연구개발결과의우수성 / 창의성 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 최근의암연구가 oncoimmunology 에크게대두되는경향에비추어, 암세포가발현하는면역관문유전 자의억제를활용한치료제를개발한다는아이디어는매우창의적이고우수한결과를생산함 2. 연구개발결과의파급효과 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 본과제에서개발한삼중면역조절유전자를탑재한유전자치료제는향후유전자면역치료제의개발방향을제시하고있음. 또한, 유전자치료제가다중면역관문조절에의해서효과를극대화할수있다는측면에서다중면역관문을표적하는다른항암제의개발에자극제가될수있음 3. 연구개발결과에대한활용가능성 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 삼중면역조절유전자를탑재한아데노바이러스는전임상을마치고, 임상으로진입할수있은 POC (proof-of-concept) 수행함. 따라서, 임상치료제의형태로바이러스의유전자를 human 형태로바꾸고 바이러스를최적화하여임상치료제로개발할가능성을입증함 4. 연구개발수행노력의성실도 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 사사논문 4 편, 국내특허등록 2 건, 해외특허출원 2 건으로유전자치료제를개발하고자하는과제책임자 의성실성은아주우수하다고판단됨 5. 공개발표된연구개발성과 ( 논문, 지적소유권, 발표회개최등 ) 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 사사논문 4 편, 국내특허등록 2 건, 해외특허출원 2 건으로본과제의결과는 우수 하다고평가함
Ⅱ. 연구목표달성도 세부연구목표 ( 연구계획서상의목표 ) FLT3L 를발현하는바이러스제작 FLT3L 를발현하는바이러스와 HSVtk 와 spd1 를발현하는바이러스의시너지항암효과검증 두가지의다른동물모델에서삼중면역조절유전자를활용한치료제의항암효능검증 복제가능아데노바이러스제작 아데노바이러스임상시험 1 상진입 비중 (%) 달성도 (%) 15 100 35 100 30 80 10 100 10 100 자체평가 FLT3L 발현아데노바이러스제작하였음. 삼중면역조절유전자탑재바이러스는 90% 완성 (12월까지 100% 달성할예정임 ) HSVtk와 spd1를발현하는바이러스의항암효과는 FLT3L를발현하는바이러스에의해서항암효과가향상됨을검증하였음방광암모델과, 두경부암모델에서효능을검증하고자하였으나 (100%), 방광암모델은완료하지못함 survivin 전사조절체에의해서조절되는복제가능아데노바이러스제작완료 합계 100 점 95 Ⅲ. 종합의견 1. 연구개발결과에대한종합의견 대체로우수한연구결과물산출했으며, 향후에본과제에서개발한치료제를발전시킬수있는후속연구의필요성을증명함. 특히, PD-1를억제하는유전자와새로운면역관문유전자의억제는항암면역을증강시킬수있음을보임으로써, 향후면역관문유전자의연구의필요성과중요성을증명한중요한연구라고여겨짐. 2. 평가시고려할사항또는요구사항 3. 연구결과의활용방안및향후조치에대한의견
Ⅳ. 보안성검토 o 연구책임자의보안성검토의견, 연구기관자체의보안성검토결과를기재함 보안성이필요하다고판단되는경우작성함. 1. 연구책임자의의견 2. 연구기관자체의검토결과
목차 1. 연구개발과제의개요 24 2. 국내외기술개발현황 26 3. 연구수행내용및결과 27 4. 목표달성도및관련분야에의기여도 34 5. 연구결과의활용계획등 34 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 34 7. 연구개발과제의대표적연구실적 35 8. 참여연구원현황 35 9. 기타사항 36 10. 참고문헌 36 < 별첨 > 자체평가의견서
II. 제 2 세부과제 세부과제명 : 면역억제인자 PD-L1 및 CD200 표적두경부암유전자면역치료제개발 세부과제책임자 ( 성명 / 소속 ) : 정유석 ( 특수암연구과 )
1. 연구개발과제의개요 1-1. 연구개발목적 최근국내외적으로증가하고있는두경부암을대상으로, 국립암센터연구진에의해자체개발된 trans-splicing-ribozyme 기반암세포살상유전자 HSV-tk를탑재한 Ad5mTR1와 cisplatin의치료효과를규명하고, 새로운면역억제분자 CD200의암세포의전이과정에서의역할을규명하고자함 1-2. 연구개발의필요성 두경부암의현황 -두경부편평세포암 (head and neck squamous cell carcinoma, 이하두경부암 ) 은전세계적으로여덟번째사망원인인암임. 전통적으로두경부편평세포암 (HNSCC) 발생의기본개념은흡연과심한음주등의환경적요인의장기간노출및이로인한다발성유전자손상으로부터발암과정이시작된다는것이었지만, 최근인유두종바이러스 (HPV) 감염및이와관련된발암과정과있음이규명되었음. -특히 HPV 관련두경부암은감소하는흡연율에도불구하고대부분국가에서증가추세를보이고있어서, 전세계적인유행병 (global pandemic disease) 으로규정되기도할정도로공중위생적인주목을받고있음. 그러나, 치료기법의발전에도불구하고 HPV관련두경부암의 20-40%, HPV비관련두경부암의 40-60% 는기존치료에반응이불량하여결국사망에이르게되는현실을감안하면, 보다효과적인치료전략의개발이요구됨. [ 그림 13] HPV 관련두경부암의전세계적증가양상 - 두경부부위는언어, 삼킴, 미용, 호흡등생존및사회생활에서중요한기능이수행되는부위임. 이부 위에대한수술이나항암방사선병합요법등기존의치료는장기의정상적기능에손상을초래하여환자의 삶의질을저하시키고, 정상적사회생활을심각하게어렵게할수있음. - 따라서새로운치료방법의개발은질환에대한생존률증가및치료에따른이환의감소를통한삶의 질향상등두가지목적을위해요구되고있음.
Adenovirus 유전자치료와두경부암 - 두경부암에대한새로운치료전략의하나로주목받고있는제재는 Adenovirus 를이용한유전자치료제임. -Adenovirus유전자치료제는 adenoviral vector에종양특이적인치료유전자를탑재하여종양에서발현시키는경우종양을살상할수있는능력을가짐으로써특정종양표적분자를이용한일종의 표적치료제 로사용될수있다는장점이있으나, 정맥주사에의한 systemic delivery가용이하지않다는단점이지적되어왔음. 그러나, 두경부암의경우그해부학적위치상종양에대한직접적인 adenovirus의주사 (intratumoral injection) 이가능하므로, adenovirus유전자치료의좋은 indication이되는암종으로여겨짐. - 따라서, 현재두경부암을대상으로하는 adenovirus 유전자치료제의전임상및임상시험이활발히진행되고 있는상황임 (Rhinology. 2012 Jun;50(2):115-21, Head Neck Oncol. 2009 Jan 12;1:30. 면역조절인자탑재 Adenovirus의개발 -adenovirus유전자치료제가표적특이적인분자치료를대표하는주목받는치료제재이지만, 큰 mass의종양인경우, 모든종양세포에치료유전자를전달하여살상하기는어려운제한점이있음. 따라서, adenovirus유전자치료의최근경향은면역조절인자유전자를종양살상유전자와함께탑재하여이차적인항암면역활성화를유도하는제재로진화하고있음. -adenovirus에탑재가능한면역활성화면역조절분자의일례로서 T세포및큰포식세포등의면역세포억제분자에대한중화분자 (neutralizing molecule) 를들수있으며, 이중 T세포억제분자인 PD-L1 중화분화인 soluble PD1의경우, 제 1세부과제의선행연구를통해항암면역증진효과와항종양효과가확인된바있음. ( 제1세부과제참조 ) -T 세포외에큰포식세포를주로억제하는면역세포억제분자로는 CD200 가알려져있으므로, CD200 중화분자는 항암면역을증진시킴으로써 adenovirus 치료제의치료효능을항진시킬개연성이있는탑재후보유전자임. 그 러나, 현재까지 CD200 중화분자를탑재한 adenovirus 제재는보고된바가없음. -따라서, 본과제에서는 CD200의 ligand인 CD200R수용체를 soluble형태로제조한 scd200r를 adenovirus에탑재함으로써항암면역촉진제로서의가능성을타진하고자함. -또한, 제 1세부과제에서사용하는 spd1이탑재된유전자치료제의치료효과를두경부암 model을이용하여검증함으로써, 두경부암치료제로의개발가능성을타진하고자함. CD200와항암면역 -특히, CD200은주로혈액암에서숙주의면역보호기전을회피하는과정에관여하고, 종양내암줄기세포분획에서선택적으로발현, 줄기세포분획의증식기전에역할을할것으로생각되는세포막단백질임. 이는향후면역치료의유용한표적이될가능성이있음. -과거에 OX-2로알려졌던 CD200은제1형경세포막 (transmembrane) 글리코단백으로서두개의세포외면역글로불린 superfamily (IgSF) 부분과한개의경세포막부분, 그리고짧은세포내꼬리부분으로구성됨. 이단백질은정상적으로뉴런, 모낭상피세포, 신사구체, 융합영양막세포, 점막상피세포, T세포, B세포, 가슴샘세포등에서발현됨. CD200은큰포식세포 / 단핵구세포군, T 세포, 수지상세포의세포막에존재하는수용체 (CD200R1) 와결합하여표적세포인골수계면역세포내의작용변화를촉발하는리간드임. CD200과 CD200R1의반응은면역억제를초래하는신호전달기전을통하여큰포식세포를억제하고, regulatory T cell을유도하고, Th1에서 Th2로사이토카인프로필을전환시키고, 그리고종양특이적 T 세포반응을억제함. [ 그림 14] CD200-CD200R1 의발현및유사단백
-CD200 은몇몇종양조직이나세포주에서도발현되는데, 예로서만성림프구성백혈병, 난소암, 악성흑색종, 신경모세포종, 전립선암, 유방암, 그리고대장암등이있음. -CD200 CD200R1 결합기전이종양세포의면역회피기전과궁극적으로종양의진행에관여한다는몇몇증거가 만성림프구성백혈병, 급성골수구성백혈병, 다발골수종, 그리고몇몇고형암등에서보고되었음. -아울러, CD200은암줄기세포 (cancer stem cells) 를나타내는세포표면표지와동시에발현되는경향이있다는사실이전립선암 (CD44+), 유방암 (CD44+CD24 ), 대장암 (CD133+), 그리고교모세포종 (CD133) 등에서발견되어, 암줄기세포를의미하는표지로추정할수있다는보고도있음. 그러나 CD200이암줄기세포표지와어떤기전으로같이발현하는지, 그종양생물학적의미는무엇인지는잘알려져있지않음. -이러한연구들에근거하여, 만성림프구성백혈병, 급성골수구성백혈병등의혈액암에서 CD200 단클론항체가면역치료의효과적전략이될수있는지에대해서연구및임상시험이시작되고있음. -두경부암의경우, 정상조직에비해 CD200발현이증가되어있다는보고가있으며 (Biochem Biophys Res Commun. 2008;366(1):117-22), 본연구진의선행연구에의하면, 몇몇두경부암세포주에서도 CD200가발현됨이관찰된바, CD200억제가두경부암에대한항암면역을증가시킬수있는가능성이제시되고있음. 1-3. 연구개발범위 Ad5mTR과 Cisplatin에 AdmTR의항암효능강화검증완료및그기작연구 암세포에서발현하는 CD200의전이조절기작연구 CD200을억제하는 soluble extracellular domain of CD200R1을탑재한아데노바이러스제작 2. 국내외기술개발현황 가. 국내외기술수준및시장현황 기술현황 -대표적인면역관문유전자 PD-1, CTLA4 외에도여전히밝혀지지않은 600여개의면역관문유전자가추측되고있음. nivolumab이라는면역관문억제항체의성공적인임상시험결과로다국적제약회사와많은연구자
가새로운면역관문유전자를유전체 / 단백질체학등의빅데이타를활용하여발굴하고있음. 시장현황 -CTLA4 를억제항체 Ipilimumab 과 PD1 를억제제 nivolumab 가성공적으로임상에서항암제로쓰이고있음. 경쟁기관현황 - 국내의암을대상으로항체면역치료제는많은제약회사가국내의학교혹은연구소의연구진과협력하여개 발을진행하고있음. < 표 4> 항체면역치료제개발현황 회사구분프로젝트주요적응중개발단계 HM95573 고형암임상 1 상 KX2-391 고형암임상 1 상 한미식품 협성신약 Oratecan 고형암임상 1 상 Poziotinib 폐암임상 2 상 셀트리온 녹십자 동아에스티 종근당 바이오시밀러바이오신약바이오의약품합성신약 Oraxol 위암 임상2상 HM61713 폐암 임상2상 CT-P06 유방암 국내승인 CT-P10 비호지킨림프종 글로벌3상 MGAH22 유방암 임상2상 GC1118A 대장암 임상1상 DMB-3111 유방암 일본임상 1상 CKD-516 고형암 임상1상 CKD-581 림프종 임상1상 CKD-12201 자궁경부암백신 임상1상 JW 중외신 약 합성의약품 바이오 신약 CKD-12201 자궁경부암백신 임상1상 트루패스 ODT 전립선비대증 임상1상 Crevax RCC 신장암 임상3상완료 Crevax HCC 간암 임상3상 지식재산권현황 - 새로운면역관문유전자, 면역관문유전자를억제하는항체, 면역관문억제유전자를탑재한유전자혹은 세포치료제등에서원천기술이만들어졌으며특허로등록되었음. 3. 연구수행내용및결과
1) MEER세포주의 PD-L1 발현 PD-L1의발현을조사하기위하여 PD-L1을인지하는항체에 PE가레이블되어있는 anti-pd-l1/pe 항체를이용하여 flow cytometer를이용하여알아봄. 아래의그림에서보듯이 MEER은 PD-L1의항원이거의발현되지못하므로마우스의편도에서유래한마우스 MEER 세포주를사용할수없음. [ 그림 15] MEER 세포주의 PD-L1 발현 2) 두경부암의치료제로써아데노바이러스 Ad5mTR과방사선의병합치료 Cisplatin에의해서 Ad5mTR 항암기능강화및그기작연구 - 본연구에서는아데노바이러스유전자치료제로써 Ad5mTR을사용하였음. Ad5mTR은 mouse TERT를코딩하는 pre-mrna 와 pairing을이루어 pre-mrna를절단하고 pre-mrna의 3 유전자인 HSVtk(herpes simplex virus thymidine kinase) 를발현시키는 trans-splicing-ribozyme (TSR) 에의해서유전자발현이 TERT를과발현하는암세포에서주로발현되도록하는유전자를탑재하였음. [ 그림 16] 아데노바이러스 Ad5mTR - TSR은 TERT를과발현하는암세포에서활성화되므로정상세포와암세포를구분함으로써바이러스의안전성을향상시켰음. 본과제에서사용하는 TERT-positive 세포주인 MEER/CD200hi 세포로바이러스를감염시키고 TSR에의해서만들어지는 TSM (trans-splicing molecule, TERT pre-mrna와 HSVtk의접합 RNA) 의생성이 TERT의발현과상관관계가있음을확인하였음. 본과제에서사용하는세포주인 MEER/CD200hi 에서만 TSM이확인되었음. 대조세포로 TERT-negative인 IMR90를포함시켰음. [ 그림 17] Ad5mTR 에의해서 TERT-positive 세포에서발현하는 TSM
-아데노바이러스AdmTR 가두경부암세포주 MEER를 killing하는지를확인하기위하여여러개의바이러스를세포주에감염시키고 pro-drug인 GCV를 100microM로넣고 48시간후에 MTT에세이를수행하였음 ( 아래그림, 위 ). 아래의그림에서보듯이대조군바이러스인 AdMOCK과비교하여통계적으로유의하게 (P=0.0143), 아데노바이러스 AdmTR은 MEER세포주를효과적으로 killing함을알수있었음. 또한, C57/B6 마우스에 MEER 세포주를이용하여피하에종양을만들고바이러스를 5 x 10 8 PFU를주사하고종양의성장을관찰하였음. 아래의그림 ( 아래 ) 에서보듯이 AdmTR은종양의성장을억제하였음. 그러나, 항종양효과는시간이지남에따라서점차감소하였음. [ 그림 18] AdmTR 를이용한 in vitro( 왼쪽 ) 와 in vivo( 오른쪽 ) 의항종양효과 - 아데노바이러스와두경부암의병합치료를개발하기위하여, 우선, 두경부암에쓰이는 Cisplatin를사용하여마우스 MEER/CD200 hi 세포의증식을억제하는항종양효과를얻을수있는지를확인하였음. 여러농도로세포주를 Cisplatin으로처리하고 MTT에세이로세포의증식을관찰하였으며 ( 왼쪽 ), C57/B6마우스에 MEER세포주를피하로주사하여종양을만들고 Cisplatin를 1, 2, 4mg/kg로처리하고종양의성장을측정함. In vivo에서 2, 4mg/kg에서항종양효과가뚜렷하게관찰되었음. [ 그림 19] Cisplatin 를이용한 in vitro( 왼쪽 ) 와 in vivo( 오른쪽 ) 의항종양효과
- AdmTR에의한병합치료를확인하기전에 Cisplatin의독성을최소화하기위하여 Cisplatin을처리하고몸무게, CKMB, GOT/AST, Total bilirubin, 총 lymphocytes, GPT/ALT를측정하여독성이없는최소농도를결정하였음. 몸무게는 2mg/kg부터감소하였으며, CKMB, GPT, 총 lymphocytes는 4mg/kg에서만통계적으로유의한독성이나타났음. 따라서, 독성이없는농도로동물실험에서는 1mg/kg로정하였음. [ 그림 20] 마우스에 Cisplatin 에의한다양한독성측정 - 아데노바이러스 Ad5mTR 과 Cisplatin 는두경부암세포주인 MEER/CD200hi 세포주의 proliferation 을효과적으로억제 하였으며, Cisplatin 은 Ad5mTR 의항종양효과를크게강화였음.
[ 그림 21] cisplatin 과아데노바이러스를이용한 in vitro, in vivo 의항종양효과 - Cisplatin에의해서 Ad5mTR의항암기능을강화시키는기작이마우스의항암 T 세포와관련이있는지를확인하기위하여 CD8 T 세포를 depletion시키는항체를주사하고 Cisplatin에의한항종양효과가사라지는지를관찰하였음. CD8-depleting 항체에의해서 Cisplatin의항암강화효과가사라졌으므로, 낮은농도의 Cisplatin은마우스의항암 T 세포를통해서 Ad5mTR의항암효과를증강시킴을확인함. [ 그림 22] CD8-depleting 항체의존재하에서 Cisplatin 과 Ad5mTR 의종양억제 - 기존두경부암치료의 standard therapy인일종인 Cisplatin 항암요법과 Ad5mTR.sPD1 를병합하여치료하는경우, Cisplatin에의한세포사멸의증가가종양항원의 release를촉진함으로써 Ad5mTR.s의항암면역력을증가시키는것을증명하였음. 또한, 종양내에침투하는 T 세포가종양의특이적인항원을인지하는 T 세포가존재하는지를알아보기위하여 E7을인지하는 T 세포가존재하는지를 tetramer 에세이로확인하였음. 아래의그림에서보듯이 Cisplatin과 Ad5mTR로종양을처리하면종양내에 E7를인지하는 T 세포가다량으로침투함을확인하였음. [ 그림 23] 종양내에존재하는 E7 항원을인지하는 T 세포분석
PDL-1을발현하는두경부암세포주확립 -MEER 혹은 CD200를발현하는 HPV(+) 두경부암세포주를확보하기위하여아래의그림과같은렌티바이러스를제작하고 MEER/CD200세포주인 clone 13에감염시켜 MEER/CD200/PDL1 세포주를제작하고자하였음. 아래의그림에서보듯이 MEER/PDL1세포주는 PD-L1를발현함. [ 그림 24] mouse PD-L1 의유전자를탑재한렌티바이러스 ( 위 ). 렌티바이러스를 MEER 세포 ( 아래, 왼쪽 ) 로 감염시키고 MEER/PDL1 세포주 ( 아래, 오른쪽 ) 를 flow cytometer 로분석 -MEER/PDL1 세포주가마우스에서종양을형성하는지를조사하기위하여 C57/BL6 에 2x10 6 세포를이식하고종양의성장 을측정함. 아래의그림에서보듯이 MEER/PDL1 세포는마우스에서종양형성능력이현저히떨어지므로모델로적합하 지않음 [ 그림 25] 마우스에 MEER/PDL1 세포주를만들고종양성장을측정
- 따라서, 마우스에 MEER 세포의 homograft 종양을만들고, 종양이폐로전이된종양으로부터유래한 MLM (MEER-Lung-Metastatsis) 를제작하였음. [ 그림 26] MEER 와 MLM 세포주에서 PD-L1 분석 암세포에서발현되는 CD200의전이조절기능연구 -CD200를 stable-transfection 하여제작된세포를 flow cytometer sorting하여 MEER/mCD200high 와 MEER/mCD200low 로분리하고각세포의침윤 (invasion) 를조사하였음. 아래의그림에서보듯이 MEER/CD200high 세포는 MEER/CD200low 와비교하여침윤의능력이더우수함을관찰하였음. [ 그림 27] CD200high 세포주는 CD200low 와비교하여 invasion 능력이향상됨
-CD200 의발현을억제하는 sirna 는 MEER/mCD200 세포주의침윤 (invasion) 능력을저하시킴. [ 그림 28] CD200 의발현을억제하는 sirna 에의한 invasion 의억제 4. 목표달성도및관련분야기여도 4-1. 목표달성도 Ad5mTR과기존의표준치료제와의항암시너지효과를검증함 (100%) 4-2. 관련분야기여도 유전자치료제와기존의치료제의시너지효과를검증함으로써향후임상시험에서유전자치료제의개발방향을제시함 5. 연구결과의활용계획 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보
7. 연구개발과제의대표적연구실적 구분 ( 논문번호논문명 / 특허명 / 기타소속 / 특허기관명역할 / 기타 Low-dose cisplatin converts the tumor microenvironment 1 논문 into a permissive 국립암센책임저 state for 터자 HSVtk-induced antitumor immunity in HPV16-related tonsillar carcinoma CD200: Association with cancer stem cell features and 2 논문 response to 국립암센책임저 chemoradiation in 터자 head and neck squamous cell carcinoma. 논문게재지 / 특허등록국가 Cancer Letters head and neck Impact 논문게재일 Factor / 특허등록일 사사여부 ( 단독사사또는중복사사 ) 특기사항 (SCI 여부 / 인용횟수등 ) 5.621 2015.01.28 중복사사 SCI-E 2.64 2015.03.01 중복사사 SCI-E 8. 참여연구원현황 소속기관명직위생년월일전공및학위 연구담당분야 신규채용여부 * 국가연구개발사업참여율 (%)[B] 번호 성명 과학기술인등록번호 성별 취득년도 학위 ( 전공 ) 과제참여기간 본과제참여율 (%) [A] 전체참여율 [A+B,%] 국립암센터 이상진
9. 기타사항 10. 참고문헌
< 별첨작성양식 > [ 별첨 ] 1. 과제현황 자체평가의견서 과제번호 1310381 사업구분 기관고유연구사업 연구분야유전자치료제개발단위과제구분사업명국립암센터기관고유사업주관 총괄과제 PD-1 등의면역억제유전자제어를통한유전자세포치료제개발 총괄책임자 이상진 과제명 면역억제인자 PD-L1 및 CD200 표적두경부암유전자면역치료제개발 과제유형 ( 기초, 응용, 개발 ) 연구기관 국립암센터 연구책임자 정유석 연차 기간 연구비 민간 계 1차년도 13.01~ 15. 12.31 50,000 연구기간 14.01~ 14. 2차년도연구비 12.31 50,000 ( 천원 ) 15.01~ 15. 3차년도 12.31 50,000 계 13.01~ 15. 12.31 150,000 참여기업 상대국 상대국연구기관 총연구기간이 5 차년도이상인경우셀을추가하여작성요망 2. 평가일 : 2015년 10월 28일 3. 평가자 ( 과제책임자 ) : 소속 직위 성명 국립암센터 선임연구원 정유석 4. 평가자 ( 과제책임자 ) 확인 : 본인은평가대상과제에대한연구결과에대하여객관적으로기술하였으며, 공정하게평가하였음을확약하며, 본자료가전문가및전문기관평가시에기초자료로활용되기를바랍니다. 확약
Ⅰ. 연구개발실적 다음각평가항목에따라자체평가한등급및실적을간략하게기술 (200자이내 ) 1. 연구개발결과의우수성 / 창의성 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 선행연구에서개발한아데노바이러스유전자치료제와기존의치료제를병합했다는아이디어보통의창의성을보임. 그러나 CD200의전이와관련된새로운기능은매우창의적이며, 향후종양미세환경내의면역세포의기능을이해하는데크게기여함. 2. 연구개발결과의파급효과 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 현재진행하고있는임상시험후에, 기존의표준치료와병합으로치료제를활용하면임상에더욱항암 효능이우수한치료제로개발될수있는 Proof-of-concept 를제시함. 3. 연구개발결과에대한활용가능성 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 아데노바이러스 Ad5CRT 는현재임상시험 1 상을진행하고있음. 따라서본세부과제에서증명한유전자 치료제와기존치료제와병합치료가능성을검증함으로써, 향후임상시험을거쳐임상의새로운 regimen 으로개발될것으로추측함. 4. 연구개발수행노력의성실도 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 논문 2 편을사사함. 또한, 세번째논문은투고하여심사중으로연구수행의우수한성실성을보여줌 5. 공개발표된연구개발성과 ( 논문, 지적소유권, 발표회개최등 ) 등급 : ( 아주우수, 우수, 보통, 미흡, 불량 ) 논문 2 편을사사함. 또한, 세번째논문은투고하여심사중으로 1 억 5 천만원의연구비로우수한성과 를만들었다고판단됨
Ⅱ. 연구목표달성도 세부연구목표 ( 연구계획서상의목표 ) Ad5mTR 과항암제 (cisplatin) 의시너지효과검증 암세포에서발현하는 CD200 의전이조절기작연구 Ad5mTR.sPD1 과방사선치료의시너지효과검증은, 두경부암세포주에서 PDL-1 를발현하는두경부암세포주확립에실패함 CD200 를무력화시키는유전자를탑재한아데노바이러스제작 비중 (%) 달성도 (%) 30 100 30 80 자체평가 low-dose cisplatin은아데노바이러스 Ad5mTR의항암효과를향상시킴을검증하였으면, 기작을증명함암세포에서발현하는 CD200은암세포의전이를촉진함을관찰하였으나, 그분자생물학적기작의규명은미흡함 10 0 향후에추진하고자함 20 100 CD200 를무력화시키는 sc200r1 를탑재한아데노바이러스 Ad5smCD200R1 를제작하고 soluble CD200R1 의발현을확인함 합계 100 점 80 Ⅲ. 종합의견 1. 연구개발결과에대한종합의견 대체로우수한연구결과물산출했으며, 향후에본과제에서개발한치료제를발전시킬수있는후속 연구의필요성을증명함 2. 평가시고려할사항또는요구사항 3. 연구결과의활용방안및향후조치에대한의견
Ⅳ. 보안성검토 o 연구책임자의보안성검토의견, 연구기관자체의보안성검토결과를기재함 보안성이필요하다고판단되는경우작성함. 1. 연구책임자의의견 2. 연구기관자체의검토결과
목차 1. 연구개발과제의개요 43 2. 국내외기술개발현황 48 3. 연구수행내용및결과 50 4. 목표달성도및관련분야에의기여도 76 5. 연구결과의활용계획등 78 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 78 7. 연구개발과제의대표적연구실적 79 8. 참여연구원현황 79 9. 기타사항 80 10. 참고문헌 80 < 별첨 > 자체평가의견서
III. 제 3 세부과제 세부과제명 : 혈액종양에서동종골수이식후 CTLA4 변이유전자이입동종 T 세포요법의개발 세부과제책임자 ( 성명 / 소속 ) : 엄현석 / 혈액암연구과
1. 연구개발과제의개요 1-1. 연구개발목적 혈액종양에서동종골수이식후공여자림프구주입술의치료효율을높이기위하여, 새로운 T세포활성화유전자인 CTLA4-CD28 유전자가이입된동종T세포요법 (allogenic T cell therapy) 을개발함. 1-2. 연구개발의필요성 혈액종양에서동종골수이식의 1차적인목적은종양제거를위한고용량의화학요법및방사선요법에따르는골수부전을 rescue하기위함이었음. 이를위해자가골수및동종골수가쓰여질수있으나, 자가골수이식시골수에남아있는종양의재주입이우려되므로, 동종골수이식이선호되었음. 그러나, 연구가진행됨에따라, 동종골수이식에수반되는동종항원에대한면역반응이종양의동 종항원을인식하여항종양효과를보임을알려지면서공여자의 T 세포를이용한 allogenic T cell therapy 가가능함이인지됨. 동종골수이식시에시행하는고용량의화학요법및방사선요법을통한수여자골수의완전소실유도 (myeloablative conditioning regimen) 가환자의감염위험증대, 심각한염증반응의유도등의높은 treatment-associated morbidiy and mortality를유도함에따라, 현재이분야의경향은, 저용량의화학 / 방사선요법을사용한 reduced intensity conditioning(ric) 혹은 nonmyeloablative conditioning을적용함으로서 toxicity를줄이는방향으로나아감. 후자의경우, 수여자골수의완전부전대신공여자와수여자의골수가공존하는 mixed chimerism 상태가유도되고, 이어서공여자의임파구에의한동종면역반응에의해서서히수여자의골수를소실시켜수여자의골수가완전히공여자의골수로전환되는 full donor chimerism을유도함. 그러나, 이러한 RIC법은상대적으로 tumor relapse의확률이높고, 일부환자에서는 full donor chimerism으로의전환이이루어지지않아잔여종양이남는등의단점을가짐. 따라서, 이러한동종골수이식후 relapse에대한치료법으로공여자의임파구를수여자에게투여함으로써종양동종항원에대한 T세포반응을유도하여종양을제거하는공여자임파구주입술 (Donor lymphocyte Infusion, DLI), 즉 allogenic T cell therapy법이도입되어임상에사용되고있음. [ 그림 29] DLI (donor lymphocyte infusion) 의대략적인방법및예측되는결과
그러나, 이러한 DLI법은 30% 이상의환자에서넣어준공여자 T세포가수여자의정상조직을공격함으로써심각한염증질환을유도하는 Graft-versus-Host Disease(GVHD) 를유발함으로써심각한부작용의위험이있음. 따라서, 현재이분야의숙제는 DLI의 Graft-versus Tumor effect(gvt) 는유지하면서도 GVHD를방지하는치료법의개발임. 이러한숙제해결의한가지방법으로본연구진은동종골수이식후 mixed chimerism상황에서충분한휴식기간후에 DLI를시행하는경우, GVHD의발생이거의없이 GVT효과만을거둘수있음을선행연구를통해확인하였음. 이결과는수년전본연구진에의해미국혈액학회지인 Blood에출간된바있음 (Blood. 2006;108:2106-2113, 선행연구결과참조 ). 이는시간경과에따라동종골수이식시수반되는정상상피조직의염증이최소화되는상황에서는공여자의 T세포, 즉 allogenic T cell의조직침윤이최소화되기때문으로이해됨. 상기와같이적절한 GVHD control하에서 DLI가효과적인 allogenic anti-tumor T cell therapy로여겨지고있으나, 실제임상에서의 DLI의효과는 Chromic myleid leukemia와같은일부암종에서주된효력을보이고있으며 (50-100% response rate), 많은혈액종양 ( 예를들면, Acute myleoid leukemia, Acute lymphoid leukemia) 에서는그효과가매우제한적임 (10-20% response rate). 또한, CML과같은 responsive tumor의경우도 advanced stage의경우는 DLI의치료효율이매우낮음. (Expert Opin. Biol. Ther. (2011) 11(4):473-487) < 표 5> 혈액종양의치료법인 DLI 의효과및독성 그러므로, 현재 DLI 의치료효율을향상시키기위한여러연구들이활발히진행되고있으나, 아직 괄목할만한성과는아직보이지않고있어, DLI 치료효율향상을위한새로운시도가매우필요한상 황임.
(Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011;2011:292-8.) 이러한시도의일환으로, 본연구진은최근각광을받기시작한유전자이입 T세포요법 (genetically engineered T cell therapy) 을통해 DLI의효율을증진시키는연구를제안하며, 이를위한 T세포활성화유전자로본연구진이공동연구를통해새로이개발한 CTLA4 변이유전자를사용하고자함. 유전자재조합자가 T세포요법 (Genetically engineered autologous T cell therapy) 의기본적인 idea는환자체내의암항원특이 T세포를꺼내어 in vitro 세포배양상태에대량증식시켜다시환자의혈액으로돌려보냄으로써암세포를공격하도록한다는논리임. 즉, 소수의암특이T세포의수를크게늘려항암공격력을크게증가시키겠다는것임. 이런개념의세포치료는미국국립보건원의 Steve Rosenberg박사를주축으로지난 20-30년간 LAK(lymphokine-activated killer), TIL(tumor-infiltrating lymphocyte) 등의이름으로시도되어왔으나, 그유효성은상당히제한적이었음. 그러나, 최근이들 group은 T세포주입전에환자의 lymphocyte을미리 depletion시키는시도를통하여 metastatic melanoma환자에서완전관해 (complete remission) 를포함하여 50% 의 response rate을보고함으로써 adoptive T cell transfer therapy에중요한돌파구를열었음 (Science. 2002 ;298(5594):850-4, J Clin Oncol. 2005;23(10):2346-57). 이러한반응률은현재까지시도된면역치료법사상가장높은반응률로써그발전가능성에대한매우고무적인예측을불러일으키고있음. 암항원특이 T세포의 source로는최근까지암조직으로부터분리한 Tumor infiltrating lymphocyte(til) 을사용하였으며최근시도된임상시험에서는 50% 에가까운 response rate을기록하였음. 그러나, TIL의분리및배양, 증폭과정은복잡하고긴기간 (3-6주) 이소요되므로최근에는이들 TIL을환자의말초혈액으로부터분리된 T세포로대체하려는노력이이루어지고있음.
특히암항원특이적 T 세포수용체유전자를 retrovirus 를이용하여말초혈액세포에 transduction 시 킴으로써암항원특이적인 T 세포의수를늘린후다시환자혈액으로돌려주는시도가일부성공을거 둠으로써유전자세포치료의첫임상성공사례로보고된바있음 (Science. 2006 ;314(5796):126-9). 또한, 항암 T세포요법의한계점인환자의 HLA-type적합성을극복하고보다다양한항원성을이용하려는시도로암표면항원특이적재조합항체에 T cell receptor의세포내부위를융합시킨키메라단백질 (Chimeric antigen receptor, CAR or T-body) 을 T세포에 retrovirus를이용하여 transduction한후다시환자혈액으로돌려주는시도가이미 20건이상임상실험에들어간상태임 ( 표 2). (Blood. 2010; 116(7):1035-1044) < 표 6> 2010 년현재 CAR 유전자재조합 T 세포요법의임상시험현황 상기 2가지 approach는다량의항원특이적 T세포를유전자재조합을통해얻으려는노력으로써현재유전자재조합 T세포요법을주도하고있으나, 이외에도 T세포의치료효율을증강시키기위한다양한형태의 T세포 engineering이시도되고있는등, 유전자재조합을통해 T세포의항암효능을증강시키려는노력이탄력을받고있음 ( 표 3). 따라서이런방식의유전자재조합 T 세포치료법 (Adoptive transfer therapy of genetically engineered T cell) 의전망이상당히밝아지고있는현실임.
(Nat Rev Immunol. 2005 Dec;5(12):928-40) < 표 7> 진행중인유전자재조합 T 세포연구의전략예 상기유전자이입 T세포요법이자가 T세포를사용하는반면, allogenic T cell therapy의경우도유전자이입을통해동종면역부작용을감소시키려는노력이시도되고있음. 특히, 동종골수이식후 DLI에의해 GVHD가유발되었을때넣어준 donor allogenic T cell을제거함으로써 GVHD 부작용을감소시키기위해, donor lymphocyte에 Herpes virus thymidine kinase(hsv-tk) 와같은 suicide gene을유입시킨후 DLI를시행하는임상시험이유럽을중심으로진행되고있음 (Science 1997;276(5319):1719-24.). 이경우, DLI후 GVHD 발생시 HSV-TK의 substrate인 gancyclovir를환자에게주사하면, HSV-TK에의해 toxic metabolite로전환되어 allogenic T cell을제거함으로써 GVHD를감소시키게됨. 그러나, 현재까지 allogenic T cell 의치료효율을증가시키기위해유전자를이입하는시도는보 고된바가없으며, 본연구진의시도가최초가될것임.
1-3. 연구개발범위 동종골수이식후 CTLA4 변이유전자이입 allogenic DLI모델을정립하고, 이를이용하여유전자이입 DLI의치료기전을분석함. 또한, allogenic DLI가수반하는 GVHD 현상을제어하기위해, 유전자이입 DLI와 GVHD 억제요법의병합치료연구방법을평가함. 2. 국내외기술개발현황 1. 면역세포치료제연구및시장동향 항암면역세포치료법은대부분의암치료에이용되고있는항암제, 외과적수술, 방사선조사등과함께항암치료분야에새로운트렌드로자리잡고있으며, 환자자신의면역체계를이용한 ' 맞춤형치료법 이라는점에서개인별맞춤의학의실현을위한의미있는치료패러다임의변화로인정받고있음. 면역세포치료법은 1980 년대미국국립암센터 (NCI) 의 Rogenberg 박사에의해처음개발되어, 최근 미국, 유럽, 일본등선진국은물론우리나라에서도임상시험과치료제출시가본격화되고있음. 세포치료제중아직상용화되지않은줄기세포치료제와는달리피부연골세포치료제와면역세포치 료제는각국식약청의허가를받아실제적인치료에적용되어현존치료법의한계를극복또는보완 할것으로기대됨. 식약청보고서에따르면, 2010 년 2 월까지보고된세계적으로임상시험이진행중인세포치료제는 231 건이며, 이중치료제개발이임박한것은 27 건인데미국이 13 건으로가장많으며, 이어우리나라 와스페인, 독일이각 3 건으로뒤를잇고있음. [ 그림 30] 국내외항암면역세포치료제승인현황 2. 미국의기술동향 미국 FDA 는 2010 년 4 월, 바이오기업인 Dendreon 社의전립선암세포치료제 Provenge" 의시판을 허가함. Provenge 의 FDA 판매허가는정부에서세계최초로항암면역세포치료제가승인받은사례이므
로향후동기술분야에미치는영향력이클것으로예상됨. 현재까지세계적으로면역세포치료제의시판을승인한국가는우리나라와미국뿐으로, 이러한정 책적지원에힘입어미국에서는암치료용면역세포치료제가활발히개발되고다양한기업의임상시 험이진행되고있음. 대형글로벌제약사가장악하고있는타의약산업분야와는달리세포치료제의경우중소바이오 기업의연구개발이활발한분야이며, 면역세포치료제도이와마찬가지로미국의중소바이오벤처기 업의임상연구개발이활발히진행되고있음. 특히, 세포치료제를이용한항암치료제는암의재발을막는다는의미로치료용암백신 (Cancer Vaccine) 이라고불리며, 항암치료시장의새로운패러다임을제시하고있음. 미국에서의암백신시장은미래바이오의약품시장에서점차그규모가확대될것으로기대되며지속적인산업화를위한연구가진행되고있음. Company Product Focused Area (Disease) Development stage the Dana-Faber Cancer Institute Genzyme Molecular Oncology Xcyte Therapies Argos Therapeutics ImmunoCellular Therapeutics Bellicum Pharmaceuticals IDM Pharma T Cell Therapy (CTLs) DC Vaccine T Cell Therapy (CTLs) AGS-003 (second-generation dendritic cell-based therapy) ICT-107 (dendritic cell based cancer vaccine ) BP-GMAX-CD1 (DC Vaccine) UVIDEM / COLLIDEM Melanoma Melanoma Kidney cancer non-hodgkin's lymphoma Kidney Cancer glioblastoma multiforme (GBM) Prostate cancer Melanoma Phase I Phase II (Ceased) Phase I/II Phase II Phase I/II Phase II Phase I/II Phase II (Ceased) ( 자료 : 각기업및연구소홈페이지 2011.11.15.) < 표 8> 미국의면역세포치료제개발현황 최근미국 Harvard Dana-Faber Cancer Institute 의 Dr. Bulter 연구팀은인체의항원제시세포와의 공동배양을통해면역반응이주입된세포독성 T 세포를활용하는 'Adoptive T cell 치료법 ' 을개발하 여임상 1 상에진입함. in vitro 상에서항원제시세포와의공동배양을통해교육되고면역학적기억력을습득한세포독성
T 세포를이용한치료는체내에서의항암반응이강화되며작용시간이연장되는등우수한효과를나 타내는것으로보고됨. Xcyte Therapies 社에서도세포독성 T 세포 (CTLs) 를이용한 Non-Hodgkin's Lymphoma 치료법을개발 하여임상 2 상에진입한것으로보고됨. 항암면역세포치료제중가장활발한연구가진행중인분야는수지상세포를이용한항암백신분야로, 미국에서도 Genzyme Molecular Oncology 社, Argo Therapeutics 社, ImmunoCellular Therapeutics 社, Bellicum Pharmaceuticals 社등다양한기업에서 Melanoma 및 Kidney cancer를대상으로한임상 1상및 2상연구가진행되고있음. 3. 연구수행내용및결과 < 1 차년도 > 연구목표 : 동종골수이식후 CTLA4 변이유전자이입 allogenic DLI 모델정립 이론적, 실험적접근방법 - 항암T세포요법의전망이밝지만, 현재까지는악성흑색종, EBV양성림프종, 만성골수성백혈병등몇몇암종에서만가시적인효과를보이고있는것이사실임. 이는항암T세포에의한효과적인종양제거를방해하는요인이있음을의미함. 대표적으로, 암특이 T세포가암세포를효과적으로제거하기위해서반드시넘어야할장애요인으로암세포가가지는면역저항성혹은면역억제력이존재함. - 암세포의면역저항성은여러가지요소로설명되고있지만암세포가항암임파구에대한관용 (tolerance) 을유도한다는설이유력함. 즉, 인체내에는실제암세포를인지하고파괴시킬수있는 T 임파구가존재하지만암세포혹은암세포주위의 microenvironment가이들항암t세포를불활성화시킨다는것임. 이는역으로말하면, 암세포에의한 T세포관용을깨게되면암세포가 T세포에의해효과적으로제거될수있음을의미한다. 따라서암세포에대한면역학적관용을깨서항암임파구를활성화시키는시도는항암면역요법의중요한선결과제라고할수있음. - T세포면역관용을매개하는중요한단백질의대표적인예로서, 활성화된 T세포의표면에발현되는 CTLA4를들수있음. CTLA4는 T세포에게항원을제공하는항원제시세포표면의 B7 단백질과결합함으로써 B7이 T세포표면의활성화수용체인 CD28과결합하는것을방해함으로 T세포활성화를저해함. 또한 B7과결합한 CTLA4 단백질은 T세포내부로억제신호를전달함으로써 T세포를비활성화시킴 ( 그림 3). 이러한 CTLA4 단백질의 T세포비활성화를통한관용유도현상은 CTLA4 knockout mice에서심각한 lymphoproliferative disease 및자가면역질환이관찰됨으로써확인되었음. - 따라서, 이러한 CTLA4 단백질의관용유도는항암 T세포에서도관찰되어 anti-ctla4 중화항체를, 종양을가진생쥐에주사하는경우, 항암 T세포의관용회피및활성화가촉진되어종양의효과적인제거가관찰됨. 이어서 humanized anti-ctla4 항체가치료용항체로개발되었으며, 임상시험을통하여일부환자에서효과적인종양의 regression이관찰됨. 특히 2011년에완료된전이성흑색종에대한임상 3상시험에서, anti-ctla4 항체를화학요법과병행하는경우단독화학요법에비해 overall survival을증가시킴이보고됨으로써, anti-ctla4 항체 (Ipilimumab) 는현재미국 FDA의승인하에시판이개시된상태임.(PNAS 2003 Jul 8;100(14):8372-7; N Engl J Med. 2011 Jun 30;364(26):2517-26) - 그러나, 이러한 anti-ctla4항체요법의문제점은 CTLA4의전신적인억제가항암 T세포의관용뿐만아니라자가항원에대한 T세포관용도파괴함으로써전신적인자가면역질환을부작용으로수반하
게된다는점임. 특히, 일부환자에서는 severe autoimmune colitis에의한장천공 (intestinal perforation) 이발생하여대장절제술 (colectomy) 을받아야했던경우도보고됨 (J Clin Oncol. 24:2283-2289). - 따라서, CTLA4 억제를통한 T세포관용억제가, 최근부각되고있는 T세포요법의효율을증강시킬수있는좋은표적이되지만, 전신적인 T세포의활성화를동반하지않고암항원특이적 T세포에서만선택적으로 CTLA4를억제함으로써자가면역질환의부작용없이 T세포치료의효율을증강시킬수있는좋은대안이필요함. (J Clin Oncol. 2008 Nov 10;26(32):5275-83) [ 그림31] CTLA4 단백질의 T세포관용유도기전및항 CTLA4항체의작용기전 - 본연구진은 T세포에서의 CTLA4 signal의억제를위해, CTLA4 dominant negative mutant를제작하여 T세포에발현시키고자하였음. 그러나, CTLA4 dominant negative mutant는학계에보고된바가없으므로, 본연구진에서새롭게 design하기로하였음. 1차적으로 endogenous CTLA4와경쟁적으로 ligand (B7 molecule) 에결합하되 inhibitory signal을보내지못하도록 CTLA4의 intracellular signaling domain을 deletion한 truncated CTLA4 mutant를 design하여 CTLA4 decoy receptor로명명하였음. 그러나, CTLA4 decoy receptor는활성화수용체인 CD28과 B7 간의결합도저해함으로써전체적인 T세포의반응성을떨어뜨릴수있는문제점이발견됨 ( 그림 4). - 따라서개선된 design으로 decoy receptor의 intracelluar portion에 CD28의 intracellular signaling domain을연결시킨 chimeric receptor를제조하였음. 이경우, CTLA4-CD28 chimera는 B7과결합하여경쟁적으로 endogenous CTLA4를통한 inhibitory signal을억제하는동시에, CD28 intracellular domain을통해 stimulatory signal을보냄으로써 T세포의활성을강화시키는역할을하는 dual effect를가지게됨 ( 그림 2). 그러므로궁극적으로, CTLA4의억제신호를활성화신호로바꾸는효과를통해훨씬강력한 T세포활성화가가능해짐. - 따라서 CTLA4-CD28 chimera분자를 retrovirus를이용하여암항원특이적 T세포에발현시키는경우, 종양에의한면역관용을극복하는 T세포의제조가가능해지므로, 기능이훨씬향상된항암 T세포의투입이가능함과동시에전신적인 CTLA4억제를동반하지않게됨으로써, 자가면역의부작용을회피하는이상적인 T세포치료법이가능해짐.
[ 그림 32] CTLA4 mutant 의 design 모식도 - 상기의전략에의해선행연구에서는 mouse T cell therapy model을이용하여 CTLA4-CD28 chimera의치료효과를검증하였음. 구체적으로, 암항원특이적 T cell receptor(tcr) transgenic mice로부터암항원특이적 T세포를분리하여 CTLA4-CD28 chimera를 retrovirus로이입한후, syngenic mouse tumor 를가진 mouse에주입하여항종양효과를관찰한결과, 예상대로훨씬향상된항종양효과를관찰할수있었음. - 따라서, 예상전략대로, CTLA4-CD28 chimera gene-modified T cell therapy는기존 T cell therapy 의효능을훨씬향상시킨차세대 T세포치료법으로의개발가능성이높음이확인되었음. - 상기연구는최근미국혈액학회지인 Blood(Impact Factor: 10.558) 지에출간되었고 (Blood. 2012;119(24):5678-5687). 국내및 PCT 특허출원이완료된상태임. ( 출원인 : 국립암센터, 출원번호 10-2011-0109729; PCT/KR2012/008878) - 상기결과는환자에게서분리및증식된자가 T세포를유전자이입한후주입하는자가 T세포요법의모델임. 따라서, 실제임상에서는소수의암특이적 T세포를분리및증식시키거나, 종양특이성을부여하기위해종양특이적 T cell receptor 혹은 CAR유전자를추가적으로이입해야하는어려운점이있음. - 본연구과제에서제안하는동종골수이식후 allogenic T cell therapy(dli) 는다량의 T세포를공여자로부터제공받을수있으며, 이미종양의 alloantigen에대한 tumor-specificity를갖추었으므로 CTLA4-CD28 유전자이입에의한항암T세포기능향상이라는목표를달성할수있는가장임상적용에가까운 T세포요법임. - 본연구과제에서는, 동종골수이식 (allogenic bone marrow transplantation) 마우스모델확립위해방사선조사된 B6 마우스에게 B10.A strain의골수세포를주입하여동종골수이식을시행하고, 수개월후 B6 origin의 syngeneic lymphoma tumor cell line(el4) 를주입하고, 이어서 CTLA4변이유전자가이입된 donor T세포 (B10.A) 를주입하여항종양효과를관찰하는방법으로 allogenic DLI model을정립함.
연구내용및결과 1. 동종골수이식 (BMT) 후 syngenic lymphoma mouse model의확립 - 본연구진은마우스를이용한혼합키메리즘동종골수이식모델로서 B10.A mouse strain과 B6 mouse strain을각각공여자와수여자마우스로사용하고, B6 origin의 mouse lymphoma cell line(el4) 을혈액종양모델로사용하였음. - 수여자 (B6 mice) 및공여자 (B10.A mice) 의골수세포를분리및혼합한후 lethally irradiated B6 mice에정맥주사하고 8주간기다리면, 정상조직염증이최소화된상태에서혼합키메리즘이형성됨. 혼합키메리즘의형성을 monitor하기위하여 flow cytometry를이용하여혈액세포의 immunophenotyping을실시한결과, 수여자혈액 (H2Dd음성) 의 2/3정도가공여자형 (H2Dd양성) 으로전환되었음이확인됨 ( 그림 5). [ 그림 33] 동종골수이식방법및혼합키메리즘확립 - 이때이들혼합키메리즘마우스에 syngenic B6 origin의혈액종양세포 (EL4) 를정맥주사하는경우, 골수이식후혈액종양의재발모델로사용되며, 1개월내에종양의성장에의해마우스들이사망에이르게됨. 하지만, 이때공여자 (B10.A mice) 의 spleen lymphocyte를종양주사 1주일전에정맥주사하는경우 (donor lymphocyte infusion, DLI), 이들공여자 lymphocyte에의한항종양효과에의해대부분의마우스들이생존하게됨. 그러나, 이는예방적 DLI 모델로서실제임상에서종양의 relapse후 DLI를시행하는과정을 mimic하기위해본연구진이공여자 lymphocyte를종양주사후에정맥주사하는 therapeutic model을시행한결과, 그치료효과가소실됨을확인함. 따라서, 현 DLI의치료효율을개선시킬필요가제기됨 ( 그림 6).
100 Survival (%) 80 60 40 20 EL4 only naive DLI >> (7days) EL4 EL4 + naive DLI 0 0 20 40 60 80 100 120 140 Days after EL4 injection [ 그림34] 혈액종양치료모델에서 naive DLI의효과 2. 동종골수이식 (BMT) 후 syngenic lymphoma mouse model에서의 preactivated allogenic T cell의치료효과판정 - 상기 model에서사용되는 donor lymphocyte는주로항원자극을겪지않은 naive T cell로구성되어있으나, 항원자극을겪은 preactivated T cell은항원에대한반응성이훨씬증가하는것으로알려져있음. 한편, T세포에 retrovirus를이입하는과정에서 T세포는 preactivation과정을겪게되어있음. 따라서, 일단 retrovirus의이입없이 preactivation만으로 allogenic donor T cell의항종양효과가증가하는지일단 test해봄. - B10.A splenocyte로부터 MACS system을이용하여 CD4 및 CD8 T세포를분리한후 anti-cd3 및 anti-cd28으로 48시간동안자극한후 low dose IL-2 존재하에서 3일간배양하여 preactivated T cell 을제조함. - B6 syngenic lymphoma cell line인 EL4 cell을혈관주사하고이어서 preactivated T cell을혈관주사한후, 시간에따른생쥐의 survival을 monitor함 (treatment model). - 그결과, donor lymphocyte의 preactivation만으로는종양에의한마우스의사망률을줄일수없음을확인함으로써, 추가적인 T세포의활성화가필요함이확인됨 ( 그림 7). 100 EL4 only EL4 + pre-activated DLI Survival (%) 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 Days after EL4 injection [ 그림35] 혈액종양치료모델에서 pre-activated DLI의효과
3. Allogenic T cell로의 CTLA4-CD28 chimera virus transduction 및유전자발현확인 - donor lymphocyte의활성화를증가시키기위하여, 본연구진은 T세포억제수용체인 CTLA4에대한 dominant negative mutant(ctla4-cd28 chimera) 를개발한바있으며, CTLA4-CD28 chimera유전자를이입한 autologous T cell therapy model에서 T세포의항암치료효율이증진됨을보고한바있음. - 따라서, 본연구에서는 allogenic donor lymphocyte에 CTLA4-CD28 chimera유전자를이입하여 gene-modified donor lymphocyte가항종양효과를향상시키는지살펴보기로함. - 일단 donor lymphocyte의 gene-modification효율을 flow cytometry로측정함. B10.A splenocyte를 anti-cd3 및 anti-cd28으로 24시간동안자극한후 CTLA4-CD28 chimera발현용 retrovirus를가하고 90 분간 spin infection함. 이후 24시간후에 low dose의 IL-2 존재하에서 3일간배양함. 배양된 T세포에서 CTLA4-CD28 chimera의발현을 flow cytometry로확인함. 그결과, 전체 T세포중 2/3가량이 CD8 T세포이고, 1/3가량이 CD4 T세포임이확인되었고, CD4세포의경우 80-90%, CD8 T세포의 50% 정도에유전자가이입되었음이함께이입된 GFP양성률로확인됨. 이어서 CTLA4-CD28 chimera의효과적인발현역시확인됨 ( 그림 8). [ 그림 36] T 세포에의 CTLA4-CD28 chimera 발현 4. gene-modified DLI 의항종양효과 상기기술한 treatment model 에서 CTLA4-CD28-modified donor lymphocyte 의항종양효과를마우스생 존율로판정한결과, 아직도마우스생존율을증가시키기에는역부족임이증명됨 ( 그림 9). 100 EL4 only EL4 + unfractioned EV-DLI EL4 + unfractioned CTC28-DLI Survival (%) 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 Days after EL4 injection
[ 그림 37] 혈액종양치료모델에서 CTLA4-CD28-modified DLI 의효과 5. CD4 및 CD8 combined gene-modified T cell의항종양효과 기존 CTLA4-CD28 chimera를이용한 autologous T cell therapy model의결과에의하면, CTLA4-CD28 chimera의 T세포항진효과는 CD8 T세포보다 CD4 T세포에서더욱강하게나타냄을보고한바있음. 항기 mixed splenocyte culture에서는 CD8 T세포가 CD4 T세포에비해 dominant population을이루고있으므로, CTLA4-CD28 chimera의효능을극대화하기위해서는 CD4 T세포의분포율을증가시킬필요가제기됨. 따라서, B10.A (donor) splenocyte로부터각각 CD4 및 CD8 T세포를 MACS (magnet-assisted cell sorting) 기법을이용하여각각분리정제한후, 각 purified CD4 및 CD8 T세포를 CTLA4-CD28 chimera-retrovirus로 transduce시켰음. 그결과, 각각 70-80% 의 transduction efficiency를관찰할수있었으며, CTLA4-CD28의발현도효과적으로관찰됨 ( 그림 10). [ 그림 38] 분획한 T 세포에의 CTLA4-CD28 chimera 발현 - 이들 gene-modified CD4 및 CD8 T 세포를각각 1:1 로섞어서상기 treatment model 에적용한결과, 비로소 gene-modified DLI 에의한마우스생존율의향상을관찰할수있었음. 100 EL4 only EL4 + fractioned EV-DLI EL4 + fractioned CTC28-DLI Survival (%) 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 Days after EL4 injection [ 그림39] 혈액종양치료모델에서분획한 T세포를이용한 CTLA4-CD28-modified DLI의효과
- 따라서, CTLA4-CD28 chimera-modified DLI 는 CD4 및 CD8 이동량 combine 된경우, 그치료효율의극 대화를이룰수있으며, preventive model 이아닌 tumor treatment model 에서도 DLI 의치료효능을향 상시킬수있음이확인됨 ( 그림 12). [ 그림 40] 혼합키메리즘확립및 CTLA4-CD28-modified DLI 시행일정개요 연구개발추진전략및방법 1. 동종골수이식 (BMT) 후 syngenic lymphoma mouse model에서의 preactivated allogenic T cell의치료효과판정 - 기존 model에서사용되는 donor lymphocyte는주로항원자극을겪지않은 naive T cell로구성되어있으나, 항원자극을겪은 preactivated T cell은항원에대한반응성이훨씬증가하는것으로알려져있음. 한편, T세포에 retrovirus를이입하는과정에서 T세포는 preactivation과정을겪게되어있음. 따라서, 일단 retrovirus의이입없이 preactivation만으로 allogenic donor T cell의항종양효과가증가하는지일단 test해봄. - lethally irradiated B6 mice에 B10.A mouse 및 B6 mouse의골수세포를혼합하여이식한후 2개월이지난후, 혼합키메리즘이형성되었는지, 혈액세포의 immunotyping을통해확인함. - B10.A splenocyte로부터 MACS system을이용하여 CD4 및 CD8 T세포를분리한후 anti-cd3 및 anti-cd28으로 48시간동안자극한후 low dose IL-2 존재하에서 3일간배양하여 preactivated T cell 을제조함. - B6 syngenic lymphoma cell line인 EL4 cell을혈관주사하고이어서 preactivated T cell을혈관주사한후, 시간에따른생쥐의 survival을 monitor함 (treatment model).
2. Allogenic T cell로의 virus transduction 및유전자발현확인 - B10.A splenocyte로부터분리한 CD4 및 CD8 T cell을 anti-cd3 및 anti-cd28으로 24시간동안자극한후 CTLA4-CD28 chimera발현용 retrovirus를가하고 90분간 spin infection함. 이후 24시간후에 low dose의 IL-2 존재하에서 3일간배양함. - 배양된 T세포에서 CTLA4-CD28 chimera의발현을 flow cytometry 및 western blot으로확인함. 3. CTLA4-CD28 gene-modified Tcell의 in vitro 및 in vivo reactivity 확인 - Gene-modified T cell을, B6 mice로부터분리한후 irradiation한 splenocyte와 co-culture한후상층액으로분비된 IFN-r양을측정하여 gene-modification에의해 T세포활성도가증가함을확인함. - mixed chimeric mice에 EL4 tumor cell과 gene-modified T cell을정맥주사한후, 2-4주후 spleen 에서 T세포를분리한후, gene-modified T cell의 functional activity를 intracellular IFN-r staining으로확인함. 4. gene-modified T cell의 postbmt lymphoma model에서의치료효과 - 상기기술한 treatment model에서 gene-modified T cell을가한후생쥐의생존율을 monitoring하여치료효과를판정함. - 실제종양의제거를확인하기위하여, EL4 tumor cell에 luciferase를 transfection시킨 cell line 을구축함. 이를위해 luciferase-gfp발현 lentivirus를 EL4 cell에 transduction한후 GFP양성세포를 cell sorting을통해 stable transfectant를확보함. - lucifease-transfected EL4 cell과 gene-modified T cell을 mixed chimeric mice에주입한후, 시간경과에따라, in vivo luciferase imaging을통해종양 burden의감소를확인함. 연구개발추진일정 연구내용 1 ) 동종골수이식 ( B M T ) 후 syngenic lymphoma mouse model에서의 preactivated allogenic T cell의치료효과판정 2) Allogenic T cell로의 virus transduction 및유전자발현확인 3) CTLA4-CD28 gene-modified T cell의 in vitro 및 in vivo reactivity 확인 4) gene-modified T cell의 postbmt lymphoma model에서의치료효과 월단위계획 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 비고
< 2 차년도 > 연구목표 : 유전자이입 DLI 의치료기전분석 이론적, 실험적접근방법 - 유전자이입 DLI의치료기전연구로서 CD4 및 CD8 T세포의유전자이입효과비교분석, IL-2 및 IFN-r KO 마우스를이용한 cytokine의영향연구, 항원제시세포의역할연구수행. - CTLA4-CD28 유전자이입된면역세포로시행한공여자림프구주입술의항종양효과가관찰된상황에서 CD4 및 CD8 T세포의유전자이입의치료효과에서의기여도를확인하기위해, CD4 및 CD8 T세포에 CTLA4-CD28 유전자를이입시킨공여자림프구와대조군으로사용할 empty vector만을이입시킨공여자림프구를각각준비후, 이들을여러조합으로섞어림프종세포주인 EL4가주입된동종골수이식종양모델에공여자림프구주입술을시행함. 공여자림프구주입술의항종양효과는종양모델의생존연장여부로평가하고, 공여자림프구주입술시행후일정시간간격으로종양모델의혈액을채취분석하여수여자체내에서의공여자림프구의변화등을관찰하여항종양효과와의상관관계를평가함. - 또한, 수여자체내에서의 CTLA4-CD28 유전자이입 CD8 T세포의증가가항종양효과에결정적으로작용하는지확인하기위해, 체내에서 CD8 T세포만을선택적으로제거해주는단일클론항체를만드는 B세포주 (2.43, ATCC TIB-210) 를면역결핍마우스에주사하여단일클론항체를생산하고이를이용하여공여자림프구주입술에사용된 CD8 T세포를선택적으로제거한상황에서항종양효과가사라짐을생존연장여부로관찰해봄. - 주입된공여자림프구는수여자체내의동종항원제시세포를만나강력한동종항원반응을유발하게됨. 이경우 CTLA4-CD28 유전자이입된 T 세포의증식이활발함은확인되었지만, 유전자이입의항종양효과에이러한세포수적인효과이외에항종양효과를나타내는사이토카인의일종인인터페론감마 (IFN-g) 를생성하는세포로의기능이촉진되는현상이수반되는지를확인하려함. CTLA4-CD28 유전자이입된공여자림프구주입술을받은수여자마우스와대조군으로사용된 empty vector만을이입한공여자림프구주입술을받은수여자마우스의 spleen을 10일경과시점에적출하여, 총세포수와 CD4/CD8 T세포의비를확인하여공여자림프구의증식효과를확인해봄. 또한, 적출한 spleen 세포의 PMA+ionomycin restimulation을통해공여자림프구의수여자체내분화상황을세포내 cytokine 염색법으로확인하여유전자이입의 T세포기능상의효과를평가해봄. - 공여자림프구주입술이제공하는항종양효과에공여자림프구가생성하는 cytokine의역할을분석하기위해, T 세포증식인자이며항종양면역세포치료의효과를증진시키는것으로알려진 cytokine인 IL-2와, 또다른항종양효과가보고된 cytokine인 IFN-g가각각제거 (knockout) 된마우스들을이용해공여자림프구를준비함. 수여자 (B6) 유래의 knockout 마우스만을구할수있었으므로, 수여자에대한동종면역반응을유발하기위해서공여자로사용중인 B10.A 마우스에각각의 knockout 마우스들을교차로번식시켜 B10.A 유래 knockout 마우스를만든후, 이를이용해위의방법으로공여자림프구주입술을시행하여항종양효과를평가함. 연구내용및결과 1. 치료효과에서의 CD4 및 CD8 T 세포유전자이입의기여도분석.
- CTLA4-CD28 유전자이입된면역세포로시행한공여자림프구주입술의항종양효과가관찰된상황에서 CD4 및 CD8 T세포의유전자이입의치료효과에서의기여도를확인하기위해, CD4 및 CD8 T세포에 CTLA4-CD28 유전자를이입시킨공여자림프구와, 대조군으로사용할 empty vector유전자만을이입시킨공여자림프구를각각준비후, 이들을여러조합으로섞어림프종세포주인 EL4가주입된동종골수이식종양모델에공여자림프구주입술을시행함. [ 그림 41]> CD4 T 세포와 CD8 T 세포모두를 CTLA4-CD28-modification 한경우에만 혈액암치료모델에서치료효과가관찰됨. - Syngenic B6 origin의혈액종양세포 (EL4) 를혼합키메리즘이확립된수여자마우스에정맥주사하는경우, 종양의성장으로인해 20일경부터마우스들이사망하기시작하여 40일이전에 80% 정도의마우스가사망하는 kinetics를보임. 종양접종후수시간이내에 CD4 T세포와 CD8 T세포를동량혼합하여정맥주사한후마우스들의생존율을추적한결과, empty vector유전자가이입된 CD4 및 CD8 T세포를사용하였을경우, 마우스생존율의증가는관찰되지않았음. 반면, 1차년도결과와같이 CD4 및 CD8 T세포모두에 CTLA4-CD28 chimeric gene이이입된경우통계적으로유의미한항종양효과가관찰됨 ( 그림 13). 이어서, 각 CD4 및 CD8 T세포에의유전자이입이항종양효과에미친영향을평가하고자 CD4 혹은 CD8 T 세포에만 CTLA4-CD28 chimeric gene을유입하여실험한결과, CD4 혹은 CD8 T세포단독으로유전자가이입된경우에는항종양효과가소멸됨이관찰됨. 이는본연구팀의이전연구에서사용했던자가종양항원특이적 T세포를이용한고형암의치료결과 (Blood. 2012;119(24):5678-5687) 와는다소차이나는결과임. 자가종양항원특이적 T세포를이용한고형암치료의경우, CD4 T세포에만 CTLA4-CD28 chimeric gene이이입되더라도상당한항종양효과가관찰되었고, CD4 T세포및 CD8 T세포모두에 CTLA4-CD28 chimeric gene을이입한경우는항종양효과가극대화되는효과를보인반면, 본실험에서사용된혈액암모델에서의경우반드시동종 CD4 T세포와 CD8 T세포양쪽세포군의 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입을필요로함이관찰됨. 이에, 두종양모델에서의유전자이입 T세포의항종양효과에대한차이에대한추가적인연구가필요할것으로사료됨. - 이러한항종양효과에대한각 CD4 및 CD8 T세포의작용기전분석의일환으로, 상기와같이여러조합의 DLI 시행후 7일간격으로꼬리정맥으로부터혈액을채취하여 DLI 세포의수여자내증식여부등을확인하기로함. DLI 세포는 CTLA4-CD28 chimeric gene 혹은 empty vector 내에 GFP protein이동시에발현되도록설계되어있어, 혈액내다른 T세포들과는 GFP protein 발현에의해구별가능하므로
flowcytometry 방법으로확인해봄 ( 그림 14). [ 그림 42] CD4 T 세포와 CD8 T 세포모두를 CTLA4-CD28-modification 한경우에만 체내에서 CD8 T 세포의증식이관찰됨. - CD4 T세포의경우 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입효과는혈액내유전자이입세포의증식으로관찰됨. DLI 시행 14일째와 21일째모두 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입 CD4 T세포는 empty vector 이입 CD4 T세포보다월등히혈액내에서증식한것으로관찰되었고, 21일째경우는 CD8 T세포까지 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입한경우에서더높은증식율을보임. 반면, CD8 T세포의경우는이와는다소다른양상을보임. CD8 T세포만 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입한경우에는 empty vector 이입경우와동일하게수여자체내에서증식이일어나지않은반면, CD4 T세포와함께 CTLA4-CD28 chimeric gene으로이입하여 DLI한경우에만유의적인 CD8 T cell 증식이관찰됨 ( 그림 14). 일반적으로종양세포를직접살상하는역할을담당하는채내백혈구세포는 CD8 T세포로알려진상황에서, 종양을탑재한마우스에치료목적으로 DLI 시행한경우 CD8 T세포가상당히증식되는경우는 CD4 T세포와 CD8 T세포모두에 CTLA4-CD28 chimeric gene을이입하는경우뿐이고, 이경우에만혈액종양주입마우스의생존율이증가되었던사실에미루어보아, 이경우항종양효과에 CD8 T세포의증식이결정적으로필요함을보여주며이를위해서는 CD4 T세포와 CD8 T세포모두에 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입이요구됨을확인하게됨. 본실험에사용한혈액종양모델에서항종양효과에 CD8 T세포가결정적으로작용함을또다른방법으로확인하기위하여, 종양세포가주입된마우스에 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입 CD4 T세포와 CD8
T세포를 DLI 시행후체내에서 CD8 T세포를선택적으로제거하는경우 DLI의항종양효과가사라지는지를관찰해봄. 체내 CD8 T세포의선택적사멸을위해서는 CD8 T세포를살상하는단일클론항체를사용하였는데, 이미널리사용중인 2.43(ATCC TIB-210) hybridoma 세포주가분비하는항CD8 단일클론항체를고농도로함유한복수 (ascites) 를제조하여사용함. 체내 CD8 T세포사멸을위해서, 항CD8 항체가함유된복수를, 첫주에는 2일간격으로 3회복강주사하고, 다음주부터는 1주일에 1회씩복강주사하여 4주동안유지시켜줌. 대조군으로는 Rat IgG를같은스케줄로동일양 (500ug) 씩복강주사한후마우스생존여부를확인해봄 ( 그림 15). [ 그림 43] 혈액종양치료모델에서항종양효과의주요매개세포는 CD8 T 세포임. - 상기의스케줄로단일클론항체주사시전실험기간동안 CD8 T세포가사라짐을관찰할수있었음. 예상한대로 CD8 T세포를선택적으로살상한경우, CTLA4-CD28 chimeric gene 이입한 DLI 그룹에서확인되는항종양효과에따른생존연장결과가거의사라지는것이확인됨. 결과적으로이모델에서의항종양효과에는 CD8 T세포가중요한역할을하고있으며, CD8 T세포의체내증식을위해서는 CD4 T세포와 CD8 T세포에의 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입이필수적인것이라는결론에도달하였음. 2. 유전자이입 T세포의기능분석 - 항종양효과를위한공여자림프구주입술시행시, 공여자림프구는수여자체내의동종항원제시세포를만나강력한동종항원반응을유발하게됨. 이경우 CTLA4-CD28 유전자이입된 T 세포의증식이활발함은확인되었지만, 유전자이입의항종양효과에이러한세포수적인효과이외에항종양효과를나타내는사이토카인의일종인인터페론감마 (IFN-g) 의생성이촉진되는현상이수반되는지를확인하려함. 이를위해 CTLA4-CD28 유전자이입된공여자림프구주입술을받은수여자마우스와대조군으로사용된 empty vector만을이입한공여자림프구주입술을받은수여자마우스의 spleen을 10일경과시점에적출하여, 총세포수와 CD4/CD8 T세포의비를확인하여공여자림프구의증식효과를확인해봄. 또한, 적출한 spleen 세포의 PMA+ionomycin restimulation을통해공여자림프구의 IFN-g의생성을세포내 cytokine 염색법으로확인하여유전자이입이 T세포기능에미치는영향을평가해봄. - 일단, 수여자에게투여하기전, DLI에사용하기위해각각준비한 empty vector 탑재또는 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입 CD4 T세포및 CD8 T세포는 PMA+ionomycin restimulation을통해확인
한결과 effector cytokine 생성능이차이는 CD4 T 세포의경우는거의보이지않았고, CD8 T 세포의 경우는 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입 T 세포에서약간증가된양상을보임 ( 그림 16). [ 그림 44] in vitro 에서준비한 CTLA4-CD28 이입 T 세포의사이토카인생성능은증가되지않음 - 그러나, 혈액종양이탑재된동종수여자마우스에 DLI 시행후 10일경과시점에 spleen을적출하여분석해본결과는 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입효과가 T세포기능향상에도영향을주는것으로확인됨. 일단세포수적인효과는혈액분석으로확인했던결과와동일하게 CTLA4-CD28 chimeric gene이이입된 DLI 세포들이 empty vector 이입세포들보다 CD4 T세포의경우 8배정도증가하였고, CD8 T세포의경우도 5배이상증가됨이관찰됨. PMA+ionomycin restimulation 후세포내 cytokine 염색법으로확인한결과, CD4 T세포의경우는 IFN-g 생성 T세포의수가 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입 CD4 T 세포에서 2배정도증가함이확인되었고, CD8 T세포의경우는 DLI 시행당시의 effector cytokine 생성능을잘보존하고있는것으로관찰됨. 이는 in vitro에서 DLI용세포를준비하는과정에서는 CTLA4-CD28 chimeric gene의효과가나타날환경이제공되지않은반면, DLI 시행후동종수여자의체내에서강한동종면역반응이일어나고이에 CTLA4-CD28 chimeric gene이작동하게되어그결과가세포의증식뿐아니라기능에도영향을미치는것으로밝혀진것으로, 동종면역반응을보이는세포숫자의증식이라는정량적인효과에더불어항종양효과를보이는 cytokine인 IFN-g 생성을보이는기능적인효과도촉진되는정성적인효과까지도나타나게되어항종양효과가극대화된다는것을보여주는것임 ( 그림 17).
[ 그림 45] CTLA4-CD28 유전자이입의결과는세포수의증가와더불어항종양세포기능의 향상으로도나타남. 3. IL-2 및 IFN-g KO mice를이용한각 cytokine의역할분석 - 본연구팀의고형암모델에서종양특이적 T세포를이용한이전연구에서, CTLA4-CD28 chimeric gene 이입에따른증진된항종양효과는 IL-2 중화항체투여에따라사라짐을확인하였고결과적으로유전자이입의효과에 IL-2의중요성이강조되었음. 이에본실험에서는 IL-2 중화항체처리방법대신 IL-2 KO 마우스를공여자로사용하여 DLI 세포가생산하는 IL-2의항종양효과에서의역할을확인해봄. IL-2 KO 마우스는수여자 (B6) 의유전자형을갖는관계로, DLI 시동종면역반응유발을위해공여자 (B10.A) 와교차번식을통해유전자형을치환한후사용함. - 정상 (WT) 마우스와 IL-2 KO 마우스로부터각각준비한 CD4 T세포와 CD8 T세포를 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입후교차로섞어 DLI 시행한결과, IL-2 KO 마우스로부터 CD4 T세포와 CD8 T세포를준비하여 DLI 시행한경우 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입에따른항종양효과가완전히사라짐을확인함. 반면, 공여자 CD4 T세포혹은 CD8 T세포중한쪽이라도정상마우스에서유래된경우에는정도의차이는있지만항종양효과가유의하게나타남이확인됨 ( 그림 18).
[ 그림 46] CD4 T 세포와 CD8 T 세포모두에서 IL-2 가제공되지못할경우혈액종양치료모델의 항종양효과는사라짐. - 이경우, 혈액채취를통해 DLI 세포의채내증식여부를확인한결과공여자의 IL-2 생성여부와는상관없이모든경우의조합에서 DLI 세포의증식은비슷하게관찰되었음 (data not shown). 결과적으로, IL-2 KO 유래 CD4 T세포와 CD8 T세포로의 DLI 경우항종양효과가사라진것은 CD8 T세포의증식이일어나지않은결과에기인한현상은아닌것으로밝혀짐. IL-2는 T세포의증식외에도 terminal differentiation에중요하게작용한다고보고된까닭에, 현재 IL-2 KO 유래의 DLI 시수여자체내에서의 T세포분화양상을확인하는실험을계획중에있으며이를통해공여자 IL-2의역할이정성적인부분에작용하는지를확인할수있을것으로사료함. - 앞선실험결과에서항종양효과를보인 CTLA4-CD28 chimeric gene 이입마우스의경우체내에서 CD4 T세포의 IFN-g 생산세포로의분화가 2배증가함을확인하였고, 일반적으로 IFN-g의항종양효과는보고된것이므로, 이모델에서나타나는항종양효과에공여자유래 IFN-g의영향을알아보기위해 IFN-g KO 마우스를공여자로하여위의 IL-2 KO 마우스경우처럼실험을진행해봄.
[ 그림 47] 공여자유래 IFN-g 의혈액종양치료모델에서의역할 - 하지만, IFN-g KO 마우스유래의 CD4 T세포를 DLI에포함한경우의조합에서는마우스의심한체중감소및이상반응등이초기에관찰되어일부의경우종양의증식과는무관하게조기에사망하는경우가발생함. 문헌에의하면 IFN-g KO 마우스의경우에 inflammation이일어나는상황에서는 CD4 T세포가 IL-17을분비하는세포로분화되는것으로보고되었고, 이는다시심각한 inflammation을유발하는것으로알려져있음. 이러한교란변수로인하여, 2회의독립적인실험에서일정한패턴을관찰하기어려워 IFN-g KO T세포를이용한 IFN-g의항종양효과역할분석실험은적절한방법이아니라고판단됨 ( 그림 19). 향후보다적절한실험방법의도입이필요함. - 종합적으로, CTLA4-CD8 chimera유전자이입에의한 DLI의치료효과개선효과는 CD4 및 CD8T세포군양쪽의유전자이입이모두필요함이확인되었고, 이러한두 population의유전자이입의항종양효과기전은 CD8 T세포의증식증가와 CD4 및 CD8 T세포의사이토카인생성능의증가로판단됨. IL-2의경우는 CD4 및 CD8 population이분비하는 IL-2가모두항종양효과에기여함이확인됨. 연구개발추진전략및방법 1. 치료효과에서의 CD4 및 CD8 T세포유전자이입의기여도분석 - 기존 CTLA4 변이유전자이입 T세포요법선행연구에서, CD4 T cell의유전자이입효과가 CD8 T cell의유전자이입효과에비해더욱중요한것으로밝혀졌으므로, 이번동종T세포의유전자이입에서도 CD4 및 CD8 T세포의유전자이입이각각항종양효과에어떤영향을미치는지, CD4 T세포및 CD8 T세포의단독및병합 modification에대해각각치료효과를판정함. - 이때, 수여자생쥐의혈액내 CD4 및 CD8 gene-modified T cell의 percentage 및절대수를 flow cytometry로확인함. - 또한, gene-modified T세포에의한 bone marrow chimerism의변화추세를혈액세포의 flow cytometry로관찰함. 2. 유전자이입 T세포의기능분석 - 항종양효과를위한공여자림프구주입술시행시, 공여자림프구는수여자체내의동종항원제시세포를만나강력한동종항원반응을유발하게됨. 이경우 CTLA4-CD28 유전자이입된 T 세포의증식이활발함은확인되었지만, 유전자이입의항종양효과에이러한세포수적인효과이외에항종양효과를나타내는사이토카인의일종인인터페론감마 (IFN-g) 의생성이촉진되는현상이수반되는지를확인하려함. - 이를위해 CTLA4-CD28 유전자이입된공여자림프구주입술을받은수여자마우스와대조군으로사용된 empty vector만을이입한공여자림프구주입술을받은수여자마우스의 spleen을 10일경과시점에적출하여, spleen 세포의 PMA+ionomycin restimulation을통해공여자림프구의 IFN-g의생성을세포내 cytokine 염색법으로확인함. 3. IL-2 및 IFN-g KO mice를이용한각 cytokine의역할분석 - 선행연구에서 CTLA4-CD28 modified CD4 T cell의 IL-2 생성능이크게항진된점이관찰되고, IL-2 는 CD4 T cell이 CD8 T cell의활성을높이는데중요한역할을하는것으로알려져있으므로, IL-2 KO mice로부터분리한 CD4 T세포를 gene-modify하여수여자생쥐에주입하였을때치료효과가사라지는지확인함.
- 또한, IL-2 KO mice로부터분리한 CD8 T세포의 gene-modification이수여자생쥐의치료효과에미치는영향도같이 assess함. - 상기와동일한실험을 IFN-g KO mice로부터분리한 CD4 및 CD8 T세포를이용하여실시하여, 항종양효과의 major cytokine인 IFN-g의중요성을확인함. - 상기 IL-2 KO 및 IFN-g KO mice는보통 B6 background이므로, 공여자 background인 B10.A로 3-5회이상교차교배하여사용함. 연구개발추진일정 연구내용 1) 치료효과에서의 CD4 및 CD8 T 세포유전자이입의기여도분석 2) 유전자이입 T 세포의기능분석 3) IL-2 및 INF-r KO mice 를이용한각 cytokine 의역할분석 월단위계획 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 비고 < 3 차년도 > 연구목표 : 유전자이입 DLI 와 GVHD 억제요법의병합치료연구 이론적, 실험적접근방법 - Delayed DLI가 GVHD가최소화된 GVT효과를나타낸다고언급하였으나, 완전히 GVHD가소실되는것은아니며, 또한실제임상에서는일부환자에서 GVHD현상이일어남. - 또한, CTLA4 변이유전자를이입한 DLI의경우, 전반적인 T세포의기능이항진될것이므로, 잠재적으로 GVHD가심화될가능성이있음. 따라서, 유전자이입 DLI의개발과함께 GVHD억제요법을병행개발함이필요함. - CTLA4 변이유전자이입 DLI후 GVHD의심화여부를아래와같은 clincal scoring을통해확인함. < 표 9> 임상에서 GVHD 현상을객관화하기위한지표들 - T세포활성화유전자이입에의한 GVHD(graft-versus-host disease) 부작용심화에대비하여, T세포이동억제제병합요법, 면역억제유전자탑재간엽줄기세포병합요법, 자살유전자이입요법등 GVHD가최소화되면서 GVT효과가극대화된이상적인유전자세포치료법의개념을확립하고자함. - 기존보고에의하면, T세포가 lymphoid organ을빠져나가는데필요한 Sphingosine-1-receptor의
agonist인 FTY720을처리시, allogenic donor cell이 lymphoid organ에국한되고, 정상조직침윤이감소되어 GVHD가감소함. 더욱이, 이에따라항종양효과는증가함이보고됨. - 따라서, 본연구의유전자이입 DLI와 FTY720을병행처리시, GVHD의감소및유전자이입 T세포의항종양효과가증가하는지관찰함. - 최근줄기세포분야연구가발전하면서, mesenchymal stem cell(msc) 이면역억제력이있음이알려짐. 특히, MSC는염증조직으로 migration하는특징이있어, GVHD를일으키는 donor T cell이조직에침윤할때그작용이억제되는국소적면역억제효과를보일가능성이있음. - 따라서, 유전자이입 DLI와 mouse MSC를동시에주입할경우, GVT는증가되고, GVHD는억제되는효과가관찰되는지확인함. - MSC의조직이동을촉진하거나, 면역억제력을촉진하기위하여, CxCR4 및 IL-10등을 adenoviral vector를이용하여 MSC에과발현한후주입하는유전자이입 MSC의효능을함께추적관찰함. - Allogenic DLI로인한 GVHD를억제하기위한유전자이입으로 HSV-TK와같은 suicide gene을이입시킨 DLI가임상시험중임. 따라서, 안전성증가의목적으로 CTLA4 변이유전자와함께 HSV-TK 유전자를 donor lymphocyte에함께이입한후, GVHD발생시 prodrug인 gancyclovir를처리하여유전자이입t 세포를제거하는시도를함. - 이경우, 적절한 GVT효과를일으킨후 T세포를제거해야하므로, 최적의 gancyclovir 주사시기를최적화함. 연구내용및결과 1. 유전자이입 DLI후 GVHD 심화여부분석. - CTLA4 변이유전자를이입한 DLI의경우, 전반적인 T세포의기능이항진될것이므로잠재적으로 GVHD가심화될가능성이있음. 본실험에서도 BMT 후 8주이상경과되어 inflammation이충분히낮아진상황에서진행된 delayed DLI를시행하였지만 empty vector를이입한 DLI 경우보다심한 GVHD 증상이관찰됨. - 보다객관적인 GVHD발병상황을점검하기위해, 기존문헌에서사용한방법대로 GVHD clinical score를 70일간관찰해봄. - GVHD 현상을객관화하는지표로는체중감소 (10-25%), 곱사등 (hunched back), 활동성저하여부, 털의윤기소실및털빠짐등이사용됨 ( 표 5). - EL4 tumor를주입후 DLI 시행하는경우, EL4의증식에따른마우스의외형변화 ( 체중감소및활동성저하여부등 ) 와 GVHD 진행에따른외형변화가혼재되어 GVHD 현상을객관화하기어려운관계로, 본실험에서는 tumor의주입없이 DLI만시행하여진행함. - CTLA4-CD28 이입세포를 DLI받은그룹의마우스에서만 DLI 시행초기 30일안에체중의 20-30% 감소가확인되었고, 이후에는더이상의체중감소는진행되지는않음. 대개 20일경부터 GVHD 증상이관찰되어 40일경까지가파르게 GVHD clinical score가증가되는상황이관찰됨. 그러나, 70일간의관찰기간동안사망하는마우스는나타나지않음 ( 그림 20). - 외형상 GVHD 현상이활발하게일어나는시점으로보이는 DLI 시행 28일경과시점에각그룹의마우스를희생시켜, 일반적으로 GVHD 현상을유발하는 T세포의침윤기관인간 (liver), 피부 (skin), 대장 (colon), 폐 (lung) 로의 T세포침윤현상을확인하기위해 H&E 염색법을시행함. CTLA4-CD28 이입세포를 DLI한그룹의마우스에서각장기에높은 T세포침윤현상이관찰됨 ( 그림 21).
[ 그림 48] GVHD 평가 (A) 체중감소, (B) clinical GVHD score, (C) 생존곡선 [ 그림 49] GVHD target 장기의 H&E 염색결과 (DLI 시행 28 일경과시점 ) 2. T세포이동억제제 FTY720의효과분석. - 문헌을참고로 FTY720은마우스체중 kg당 0.3mg씩, DLI 시행일로부터매일 11일간복강투여함. 일부실험에서는최장 35일간투여하기도함. - DLI 시행후 14일째시행한혈액내 T세포분석결과, FTY720을 11일간투여한그룹의마우스에서는혈액내 T세포가거의관찰되지않은것으로보아 (data not shown) T세포는 lymphoid organ에서혈액으로빠져나가지못한것으로사료되었으며, 이런현상은 21일째혈액검사에서는관찰되지않은것으로보아체내잔존 FTY720이사라진결과로추정됨. 또한, 21일째혈액검사에서 CTLA4-CD28-modified T세포의체내증식정도는 FTY720을투여하지않은경우와크게차이가나지는않는것으로관찰됨. 이러한현상이 GVHD 및 GVT효과에궁극적으로어떻게작용하게될지분석해봄. - FTY720을 DLI 시행시점에서 11일간투여시 GVHD진행은경미하게완화됨이관찰되지만, GVT효과역
시일부훼손되는것으로관찰됨 ( 그림 22). [ 그림 50] 11 일간 FTY720 투여시 clinical GVHD score 및 survival curve - FTY720을 11일간투여시 21일째혈액내에 CTLA4-CD28-modified T세포가관찰되고이시점부터보통 GVHD에의한외형변화가관찰되므로, FTY720을장기투여할경우 GVHD진행이완화될수있을것으로사료되어, 35일동안투여하는실험을진행함. 이경우 GVHD진행은 11일간투여한경우보다더완화되었고, GVT효과는크게영향받지않음. 결과적으로 FTY720을 GVT효과를감소시키지않는상황에서 GVHD발병을조절하기위해사용시장기간의투여가더효과적일수있음을확인하게됨 ( 그림 23). [ 그림 51] 35 일간 FTY720 투여시 clinical GVHD score 및 survival curve 3. Suicidal gene 의추가적유전자이입분석. - 현재임상시험중인 HSV-TK 를 P2A 시스템을사용하여 CTLA4-CD28 과함께 T 세포에발현시켰고, 이 경우에도 CTLA4 발현은저해되지않음을확인함. TK 유전자의작동여부를확인하기위해 in vitro 에
서 prodrug 인 gancyclovir 를처리하였더니 1-10uM 농도에서 TK 유전자가도입된 T 세포만선택적으로 제거됨이확인됨 ( 그림 24). [ 그림 52] CTC28-HSV-TK construct 및 gancyclovir 에의한선별적제거확인 - In vivo에서 TK 작동에따른 GVHD 제어여부를확인하기위해 DLI 실험을진행하였지만, T세포의증식여부를확인하기위해 14일째시행한혈액분석에서유전자이입 T세포가완전히사라진것을확인하게됨 ( 그림 25). 이시점에는아직 gancyclovir를처리하지않은시점이므로약물처리에따른유전자도입세포의사멸이아닌다른이유에서일것임. 실험에사용된 suicide gene인 TK는 herpes simplex virus 유래의것으로마우스의채내면역세포에의한 xenogenic graft rejection의결과로사라진것으로추정됨. 실제로임상실험에서도어느정도의거부반응이관찰되었고, 마우스를이용한 TK 유전자도입 T세포의사멸에관한전임상결과가보고된적은없었음. 결과적으로, TK 유전자삽입을통한 GVHD 제어여부는마우스전임상실험을통해서는확인할수없었지만, 현재진행중인임상에서의 TK 유전자삽입 T세포치료방법의효과가긍정적인면이보고되는것으로미루어임상에서의적용여부가능성은여전히있을것으로보임. [ 그림 52] DLI 시행후 14 일경과시점에 TK 유전자도입 T 세포가완전히사라짐
4. 유전자이입 Mesenchymal stem cell의 GVHD억제력분석. - 최근면역억제기능이보고되어임상에의적용도시험중에있는 MSC가조직으로침윤된 T세포에의한 GVHD현상을제어할수있는지확인해봄. MSC는마우스로부터세포주상태로확립된세포주를분양받아사용함. 수여자유래 (B6) 의 MSC 세포주와제3자유래 (BALB/c) 의세포주를 test한예비실험에서후자의경우가 survival 면에서더양호한결과를보였고 (data not shown), 임상에의적용시수여자로부터 MSC를분리하는것보다는건강한제3자성인으로부터얻는것이용이할것으로사료되어제3자유래의 MSC 세포주를사용하여 test 진행함. - MSC는문헌에의거하여 DLI 시행다음날과다시 2일경과후에마리당 5x10 5 개씩총 2회정맥주사로투여함. - 면역억제력을촉진하기위하여 IL-10을과발현하도록유전자를도입한 MSC가 BMT 후수반되는 GVHD 현상을조절할수있다는문헌에의거하여, IL-10 유전자이입 MSC의효능을함께추적관찰함. IL-10 유전자이입은 retrovirus를이용하여시행하였고, 유전자가이입된세포만을 flowcytometer로 sorting 후 IL-10 분비여부를확인하였음 ( 그림 26). 80000 BALB/c D3116-pMIG BALB/c D3116-pMIG-IL-10 IL-10 (pg/ml) 60000 40000 20000 0 1.25 2.5 5 10 20 40 MSC cells (x10 3 ) [ 그림 54] IL-10 유전자도입 MSC 의 IL-10 생성확인
[ 그림 55] IL-10 생성 MSC 투여시체중감소및 clinical GVHD score - 현재 IL-10 유전자도입 MSC 의 GVHD 및 GVT 효과에의영향을확인하는실험이진행중임. 일단 GVHD 조절은체중감소나 clinical GVHD score 상 IL-10 유전자도입 MSC 를처리한경우에서 GVHD 완화현상 은나타나지않고있음 ( 그림 27). - MSC의조직이동을촉진하기위해, 세포의체내이동에관여하는것으로보고된 CxCR4를 adenoviral vector를이용하여 MSC에과발현한후주입하는유전자이입 MSC의효능을함께추적관찰함. CxCR4 의안정적발현을위해 20MOI와 100MOI의 titer의 adenovirus로 transfection 후 flow cytometry 방법으로 CxCR4의발현여부를확인한결과, 100MOI titer로 transfection한경우 CxCR4가더높게발현됨이확인됨 ( 그림 28). 그러나, clinical GVHD score는 CxCR4 발현여부에관계없이 MSC 자체로도완화시키는결과를보였고, GVT 효과를볼수있는 survival 측면에서는 CxCR4를발현시킨 MSC 투여그룹에서더양호한결과를보임 ( 그림 29). [ 그림 56] adenovirus 를이용한 MSC 상의 CxCR4 발현정도확인 [ 그림 57] CxCR4 발현 MSC 투여시 clinical GVHD score 및 survival curve
연구개발추진전략및방법 1. 유전자이입 DLI 후 GVHD 심화여부분석 - 유전자이입 DLI 후 GVHD 의심화여부를다음의기준에따른 clincal scoring 을통해확인함. 2. T세포이동억제제 FTY720의효과분석 - 기존보고에의하면, T세포가 lymphoid organ을빠져나가는데필요한 Sphingosine-1-receptor의 agonist인 FTY720을처리시, allogenic donor cell이 lymphoid organ에국한되고, 정상조직침윤이감소되어 GVHD가감소함. 더욱이, 이에따라항종양효과는증가함이보고됨. - 따라서, 본연구의유전자이입 DLI와 FTY720을병행처리시, GVHD의감소및유전자이입 T세포의항종양효과가증가하는지관찰함. 3. 유전자이입 Mesenchymal stem cell의 GVHD억제력분석 - 최근줄기세포분야연구가발전하면서, mesenchymal stem cell(msc) 이면역억제력이있음이알려짐. 특히, MSC는염증조직으로 migration하는특징이있어, GVHD를일으키는 donor T cell이조직에침윤할때그작용이억제되는국소적면역억제효과를보일가능성이있음. - 따라서, 유전자이입 DLI와 mouse MSC를동시에주입할경우, GVT는증가되고, GVHD는억제되는효과가관찰되는지확인함. - MSC의조직이동을촉진하거나면역억제력을촉진하기위하여, CxCR4 및 IL-10등을 adenoviral vector를이용하여 MSC에과발현한후주입하는유전자이입 MSC의효능을함께추적관찰함. 4. Suicidal gene의추가적유전자이입분석 - Allogenic DLI로인한 GVHD를억제하기위한유전자이입으로 HSV-TK와같은 suicide gene을이입시킨 DLI가임상시험중임. 따라서, 안전성증가의목적으로 CTLA4 변이유전자와함께 HSV-TK 유전자를 donor lymphocyte에함께이입한후, GVHD발생시 prodrug인 gancyclovir를처리하여유전자이입t세포를제거하는시도를함. - 이경우, 적절한 GVT효과를일으킨후 T세포를제거해야하므로, 최적의 gancyclovir 주사시기를최적화함.
연구개발추진일정 연구내용 1) 유전자이입 DLI 후 GVHD 심화여부분석 2 ) T 세포이동억제제 FTY720 의효과분석 3)Suicidal gene 의추가적유전자이입분석 4 ) 유전자이입 Mesenchymal stem cell 의 GVHD 억제력분석 월단위계획 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 비고
4. 목표달성도및관련분야기여도 4-1. 목표달성도 연도별연구목표및평가착안점 구분세부연구목표가중치 (%) 평가의착안점및척도 1 차년도 (2013) 2 차년도 (2014) 3 차년도 (2015) 1) 동종골수이식 (BMT) 후 syngenic lymphoma mouse model에서의 preactivated allogenic T cell의치료효과판정 2) Allogenic T cell로의 virus transduction 및유전자발현확인 3) CTLA4-CD28 gene-modified T cell 의 in vitro 및 in vivo reactivity확인 4) gene-modified T cell의 postbmt lymphoma model에서의치료효과 1) 치료효과에서의 CD4 및 CD8 T 세포유전자이입의기여도분석 2) DLI 치료효과에서의항원제시세포의역할분석 3) IL-2 및 INF-r KO mice 를이용한각 cytokine 의역할분석 1) 유전자이입 DLI후 GVHD 심화여부분석 2) T세포이동억제제 FTY720의효과분석 3) 유전자이입 Mesenchymal stem cell 의 GVHD억제력분석 4) Suicidal gene의추가적유전자이입분석 10 model 확립의성공여부 30 유전자이입의확인 10 적절한 assay 의확립 50 유전자이입의치료효과확인여부 40 20 40 10 30 30 30 각유전자이입세포의치료효과기여도가명확히규명되었는가항원제시세포의역할규명을위한 system이확립되었는가각유전자조작생쥐의도입및교배, 유전자이입이성공적으로진행되었는가 GVHD scoring system이확립되었는가 FTY720의효과가명확히검증되었는가 MSC의배양및유전자이입이성공적으로이루어졌는가 suicide유전자이입및이를이용한세포사가성공적인가 1 차년도연구개발목표의달성도및자체평가 평가의착안점달성도 (%) 자체평가 model 확립의성공여부 100 해당 BMT mouse model 을성공적으로확립 유전자이입의확인 100 유전자이입및발현을성공적으로확인함 유전자이입의치료효과확인여부 100 유전자이입 T 세포요법의치료효능을성공적으로확인함 2 차년도연구개발목표의달성도및자체평가 평가의착안점달성도 (%) 자체평가 치료효과에서의 CD4 및 CD8 T세포유전자이입의기여도확인 CTLA4-CD28 gene-modified T cell의 in vitro 및 ex vivo reactivity확인 IL-2 및 IFN-r KO mice를이용한각 cytokine의역할분석 100 100 치료효과를위해서는 CD4 및 CD8 T 세포의유전자이입이 필수적임을확인함 유전자이입 T 세포는수여자체내에서의증식및기능의 향상을통해치료효과개선에참여하는것으로확인됨 100 공여자유래의 IL-2 는항종양효과에필수적임이확인됨
3 차년도연구개발목표의달성도및자체평가 평가의착안점달성도 (%) 자체평가 GVHD scoring system 이확립되었는가 FTY720 의효과가명확히검증되었는가 suicide 유전자이입및이를이용한세포사가성공적인가 MSC 의배양및유전자이입이성공적으로이루어졌는가 100 100 100 80 GVHD scoring system이확립되었고, CTLA4-CD28-modification에따른 GVHD 심화가확인됨장기적으로 FTY720을투여시 GVHD를완화시키는효과를 관찰함. 이때 GVT 효과의상승은관찰되지는않음 T세포에의 suicide 유전자이입과 in vitro에서의 ganciclovir 처리에따른세포사는확인했지만, 마우스 in vivo 에서 xenogenic graft rejection 현상으로 GVHD 및 GVT 상의효과는검정하지못함 MSC 자체로도 GVHD 완화효과가관찰되지만, IL-10 유전 자도입결과 GVHD 완화효과는개선되지않았고, GVT 효과는현재관찰중임. CxCR4 유전자를도입시에는 GVHD 완화효과와 GVT 효과에서도약간상승시켜줌. 4-2. 관련분야기여도 기술적측면 - 공여자부터분리된 T세포에 recombinant retrovirus를 transduction한후환자에게주입하는유전자조작 T세포의 adoptive cell therapy는국제적으로최근시도되기시작한신기술로국내에서는아직시도된바없으므로, 본연구팀이 pioneer적입장에서있음. - CTLA4-CD28 chimera를이용한 gene-modified T세포요법은항암T세포요법의큰장애요인을극복함으로써그치료효율을획기적으로개선시킬수있음. 이개념은기존학계에보고된바가없는독창적인것으로지적재산권확보및실용화에유리한위치를점유함. 현재국내특허및 PCT출원을완료한상태임. 경제, 산업적측면 - 세계적으로암치료용면역치료제의시장규모는 2003년에 146억달러에이르고있으며, 연평균성장률이 11.4% 로서 2010년에는약 300억달러시장을형성할것으로전망되었으므로, 고부가가치를창출할수있는산업임 ( 표 1). < 표 10 > 항암면역치료제시장현황및전망 - 특히, 면역세포치료제는최근관심의초점이되고있는 customized medicine 의대표적인예로, 선 진국형으로변화하는한국사회에서그요구가획기적으로증가할것으로예상됨.