최종연구보고서 젖소원유의실시간휴대용품질판정시스템개발 Development of Real-Time Portable Quality Evaluation System of Cow's Milk 연구기관 성균관대학교 농림수산식품부
제출문 농림수산식품부장관귀하 본보고서를 젖소원유의실시간휴대용품질판정시스템개발에관한연구 과제의최종보고서로제출합니다. 2008 년 4 월 24 일 주관연구기관명: 성균관대학교 총괄연구책임자: 최창현 연구원: 김용주 연구원: 김종혁 연구원: 남은혜 연구원: 이병열 연구원: 김종덕 연구원: 김태형 참여기업명: 옵토켐( 주) 연구원: 김재민 연구원: 김희주 연구원: 강현정 협동연구기관명: 한국식품연구원 협동연구책임자: 김기성 연구원: 임상동 연구원: 신미순 연구원: 노해원 - 1 -
요약문 Ⅰ. 제 목 젖소원유의실시간휴대용품질판정시스템개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 국내의낙농산업은타식품산업에비해비교적짧은역사속에서급속한성장을 이룩하였다. 국내경산우의산유량은 1995년에는 6,427 kg/ 두, 1999년에는 7,247 kg/ 두, 2000년에는 7,355 kg/ 두로지속적인생산량의증가를보이고있으며, 연평균소비 량도 2~3 % 정도로계속적인증가를보이고있다( 한국낙농육우협회, 2002). 그러나우 유생산량과소비량이계속적인증가를보이는반면, 값싸고품질이우수한수입유 제품의지속적인증가로인해우유의자급률은오히려하락하여국내산우유의수급 불균형현상을초래하고있다( 국립수의과학검역원, 2004). 그러므로국내우유의수급 률을조절하고우유의국제경쟁력을높이기위해서는고품질우유의생산이필요한 실정이다. 현재시행되고있는원유의품질측정은여러젖소로부터수집하여혼합된원유의 샘플을이용하여전수조사가아닌표본조사에의존하고있으므로품질이낮은젖소의 원유를선택적으로제거하기가어렵고다른원유시료와혼합되어전체적인품질저 하를초래하게된다. 그러므로고품질우유생산을위해서는착유현장에서실시간 원유의품질요인을측정할수있는젖소원유의실시간휴대용품질판정시스템이필 요한실정이다. 따라서본연구는자동으로우유시료의공급, 반응시약투여, 시료온도제어및혼 합등의시료전처리와우유시료의광학적특성을이용한체세포수, 지방, 단백질, 유당, 총고형분의비파괴품질측정이가능한원유의실시간휴대용품질판정시스템 을개발하고자수행되었다. - 2 -
Ⅲ. 연구개발내용및범위 휴대용품질판정시스템시작품제작및체세포수측정알고리즘개발 원유체세포수측정기술개발 1 차년도 - 원유시료공급, 시약투여의유량제어및시료온도제어알고리즘개발 - 분광모듈의재현성및정확도분석 - 전처리장치, 분광부, 시스템제어부를포함한원유의휴대용품질판정시스템의시작품제작 - 반응시약의종류와체세포수에따른원유의광학적특성구명 - 원유의품질판정시작품을이용한체세포수측정알고리즘개발및평가 - 국내원유체세포수분포도조사 - 원유체세포수측정을위한원유시료전처리조건설정 - 원유체세포수측정을위한첨가시약의환경조건설정 휴대용품질판정시스템시작품제작및체세포수측정기술개발 원유성분조성측정알고리즘및제어프로그램개발 원유성분조성분석기술개발 2 차년도 - 근적외선분광광도계를이용하여반응시약의종류및원유성분조성에따른원유의광학적특성구명 - 원유의성분조성알고리즘개발및평가 - 원유시료공급, 시약투여의유량제어및시료온도제어알고리즘개발 - 임베디드시스템을이용한시스템제어장치개발 - 시스템제어알고리즘및품질판정프로그램개발 - 전체시스템의현장적응성검토 - 국내원유성분조성분포도조사 - 원유성분조성( 지방, 단백질, 유당, 총고형분) 측정을위한원유시료전처리조건설정 - 원유성분조성분석을위함첨가시약의환경조건설정 젖소원유의휴대용실시간품질판정시스템개발 - 3 -
Ⅳ. 연구개발결과및활용에대한건의 스펙트럼전처리및품질판정프로그램 본연구에서는광원의산란현상을보정하기위해스펙트럼을안정화시키는분산 보정(MSC), 표준정규화(SNV & Dtr.) 와 1차미분및 2차미분이가능하도록전처리 프로그램을개발하였다. 또한자체적으로부분최소자승법(PLS) 을이용한품질판정프 로그램을개발하여원유시료의스펙트럼측정과동시에전처리와품질판정이가능하 도록스펙트럼전처리및품질판정프로그램을개발하였다. 품질판정프로그램은사 용자가원하는크기의정하여전체영역을대상으로원하는성분값과가장상관관계 가높은파장영역을선정하도록개발하여품질분석및전문지식이없는사용자고편 하게사용이가능하도록개발하였다. 또한전처리및품질판정프로그램은상호연관 되어작동이가능하도록개발하여원시스펙트럼및사용자가원하는전처리상태를 선택하면자동으로품질판정모델을개발할수있도록설계하였다. 그러므로본연구 에서개발된스펙트럼전처리및품질판정프로그램은현재사용되는가시광선/ 근적 외선의예측모델개발을위하여다양한분야에서사용이가능하며, 또한다양한통계 의모델개발분야에서도편리하게응용이가능할것으로판단된다. 휴대용분광분석기 본연구에서개발된원유의품질측정을위한휴대용분광분석기는광원, 시료측정 용셀, 광프로브, 광검출기를포함하여시스템의인터페이스장치및제어장치와시 료의전처리장치들로구성하였다. 휴대용원유의품질측정을위한휴대용분광분석 기의개발기술은현재근적외선분광분석법이사용되는농업과식품등의다양한분 야에적용이가능하며, 특히 FTA에따른수입품의안정성및원산지판별에유용하 게사용될것으로판단된다. 또한휴대용분광분석기는현장에서실시간품질평가및 기초분석에사용이가능하고장비의가격이비교적저렴한장점까지있어해외에서 수입되는고가의장비를대체할수있는방안이될것으로판단된다. - 4 -
비례미분적분(PID) 제어를이용한온도제어 본연구에서우유시료의온도유지를위해개발된 PID 제어는사용자가원하는 온도를설정하면열전소자와 On/off 제어를이용하여열전소자의전압을공급하고끊 어주는방법으로자동으로적정온도를유지하도록개발하였다. 이러한온도제어방법 은크게인공지능빌딩및자동차의적정온도유지를위하여적용이가능하며, 특히 현재활발한연구가진행되고있는태양열에너지를이용한난방분야에응용이가능 할것으로판단된다. 시료의자동혼합장치 현재이화학적인분야에서사용하는시료의혼합방법은주로기계식교반장치나 마그네틱바를혼합시료에담고회전하는방법을사용하고있는이는사용자가수동 으로작동해야하며, 관련장비가있어야사용이가능한단점이있다. 그러므로어떤 경우에는사용자가교반을위하여손으로흔드는방법, 유리막대로젓는방법등을 사용하는데이러한혼합방법은현장에서실시간품질측정을위해사용이불가능한 단점이있으며, 시료처리에관한전문지식이필요하다. 그러므로본연구에서는실 시간우유와반응시약의혼합을위해자동화된혼합장치를개발하였으며, 이는현 장에서휴대하여혼합할수있는장점이있어휴대용품질측정분야외에현장에서 시료와시약을혼합하는데적용이가능할것으로판단된다. 착유기장치에의응용 현재해외의낙농선진국에서는고품질우유의생산을위해젖소의개체별관리및 영양관리에주력을다하고있는실정이다. 그러므로본연구에서개발된휴대용원 유의품질판정시스템으로착유와동시에젖소개체별로실시간품질을측정하여젖 소의건강및우유의등급을관리하는것이가능하며, 저능력우를판별하여생산된 원유의고품질화를달성할수있을것으로판단된다. 젖소의개별맞춤형영양관리시스템개발 본연구에서는우유의체세포수, 지방, 단백질, 유당및총고형분의측정이가능한 - 5 -
품질판정시스템을개발하였으며, 이는주로고품질우유의생산기반을조성하기위 하여수행되었다. 그러나국외낙농선진국에서는기존의우유품질관리를위해우유 의다양한인자를추가적으로측정하고있으며, 젖소영양상태의기준이되는요소태질소이다. 현재가장관심을갖고있는인자는 요소태질소는젖소사료속의에너지 균형을판단하는지표로젖소의사료를조절하고, 질병을예방하며, 분뇨로배출되는 질소의수준을조절하여환경오염을감소시키는데큰역할을하고있다. 또한요소태 질소는근적외선분광법에의하여이미적정파장영역이선정된상태이므로현재개발 된시스템에추가적으로적용하여고품질우유관리및젖소의영양관리를통합적으 로할수있는시스템개발이가능할것으로판단된다. 반응시약을이용한미생물측정분야에활용 가시광선/ 근적외선은높은에너지전위를가지므로주로시료를전처리하지않고 측정하거나시료의특성상전처리가필요한경우에만사용하였다. 그러므로현재개 발된대부분의예측모델은시료의광학적특성만을이용한것이대부분이며, 체가가시광선/ 근적외선과의상관관계가낮은경우에는사용이불가능하였다. 시료자 그러나 현재개발된우유의품질판정기술은기존에연구된체세포수예측모델의상관관계가 낮은것에반해체세포수와반응하는반응시약을선정하고첨가하여좋은상관관계 를나타내고있어이러한방법을응용하면, 기존에예측모델개발이어려웠던미생물 분야등의다양한분야에적용이가능할것으로판단된다. 액상시료를이용한제품제조공정의자동화 현재개발된원유의품질판정시스템은시료의자동공급, 온도제어, 혼합등의전처 리가가능하며, 동시에품질판정이가능한장점이있다. 이와같은성능은석유의정 제공정, 발효공정등의제품제조공정에서시료의공급, 온도유지, 혼합등을통한 전처리와동시에품질을측정하여부족한성분을추가적으로자동공급하고필요에 따라정제공정을계속적으로반복하는등의제조공정분야에자동화를구축하는데 적용이가능할것으로판단된다. - 6 -
수질및토양오염등의환경모니터링장비로의활용 현재국내수질및토양오염의측정절차는관련기관의전문가가일정한시간에직접방문하고대표시료를수집한후, 연구실에서분석하는방법으로수행되고있다. 그러나이러한품질분석방법은시간이오래걸리고전수조사가아니므로수질및토 양오염에대해효과적으로대체할수없는단점이있다. 그러므로본연구에서개발 된휴대용품질판정기술을응용하여수질의실시간자동공급을통한오염도측정 및토양시료의오염도측정에적용이가능할것으로판단된다. 또한현재활발히진 행중인전자지도(GIS) 와융합한다면수질및토양오염의오염원을실시간판단을통하여환경오염의원인에대해효과적으로대처할수있을것이다. 고품질원유의등급유지를위한유통관리방법개선 국내의유가제도는주로대기업및유제품생산기업이낙농가에서우유의수집한 후, 우유성분분석기의분석결과를토대로하여각각의낙농가별로유대지급기준 을마련하고있다. 그러나이러한유대지급기준은객관성및투명성이결여되므로 본연구에서개발된휴대용원유품질판정시스템을낙농가에보급하여낙농가가스 스로자신이생산한원유의품질을확인하여고품질의원유생산을위한기틀을마련 하는데활용할수있다. 또한계절별차등가격제와용도별차등가격제등의도입을 통한우유생산비계산상의문제점을해결하는데응용할수있을것으로판단된다. - 7 -
SUMMARY ( 영문요약문) Because the quality of milk has influence on the cost of milk products, measurement of milk properties such as SCC, fat, protein, SNF and lactose is the most important for dairy industry. Especially, the SCC is a recognized indicator of cow`s health and milk quality. Milk from infected cows, associated with mastitis, has the high level SCC. Fast detection of SCC can help to exclude infected milk from dairy production and early treatment can minimize losses of dairy farmers. To improve the quality of milk, frequent measurement of milk composition of every individual cow was needed. The industries use several types of sophisticated instruments to determine milk constituents in the laboratory. SCC is determined by and integrated flow cytometer. Fat, protein, SNF and lactose are determined by infrared spectroscopy in the range of 3,500 9,600 nm. But reference method was expensive and time-consuming and there are currently no practical on-farm methods to determine milk properties. The NIR spectroscopic technique, which has very high signal to noise ratio, has a very short detector response time, requires minimum to no sample preparation, can simultaneously determine multiple milk properties in the farm. The final goal of this research is to develop a real-time portable quality evaluation system which can determine milk properties simultaneously in the dairy farm. The real-time portable quality evaluation system consisted of a flow pump to supply milk sample and reaction reagent at given volume, a fan to mix milk with reaction reagent, a thermoelectric device to maintain sample temperatures of 40, tungsten-halogen lamp, spectrometer, optical fiber probe to measure milk spectrum, - 8 -
and embedded module to control signals. The performance of the real-time portable quality evaluation system was analyzed by comparing the prediction accuracy of the laboratory spectrophotometer. Total of 200 milk samples were collected from dairy farms in the central areas of Korea. The milk samples were preserved to minimize propagation of bacteria cells during transportation. Milk properties such as SCC, fat, protein, SNF and lactose, were measured by the Combifoss (Foss-Electric, Model 5000, Denmark) and used as reference values. Reagents such as Methyl red, Methylene blue and Resazurin for reduction test, Eosin-Y for dying cell and Amido black for dying protein were added to milk samples. They activated for 5 minutes as optimal reaction time (KFRI, 2006) before spectra measurements. The transmittance spectra were measured in wavelength ranges of 350 1,700 nm. five repetitive scans were averaged, transformed to log(1/reflectance), and then were stored in the embedded module, forming one spectrum. Spectra of milk samples were divided into a calibration set and a validation set. Samples were ranked by values of SCC, and each set was selected by increasing rank evenly. Half of the total samples were selected for calibration set, and 50% were reserved for validation set. The calibration set was used during model development, and the validation set was used to predict milk properties from unknown spectra. The method of PLS analysis was used to determine the milk properties. A unique set of PLS loading vectors (factors) was developed. The multiplicative scatter correction(msc) and the first derivative pretreatments based on Savitzki-Golay polynomial filter were applied to spectra to minimize sample-to-sample light scatter differences. A developed spectrum analysis was used to perform the PLS analyses. For each constituent, up to 20 factors was examined. Cross validation was performed during model development, where one of the calibration samples at a time was removed from the calibration set. The - 9 -
standard error of calibration (SEC) was considered to determine the optimal number of factors and the range of wavelength during calibration. On completion of the calibration, the model was used to predict milk properties from the validation set. Model performance was reported as the correlation coefficient (r), the standard error of prediction (SEP), and the average difference between measured and predicted values (bias). The PLS models showed good correlations between predicted and measured SCC with reagents in visible ranges. The PLS analyses for fat, protein, SNF and lactose showed good relationship with reagents in the NIR ranges. The PLS models showed excellent correlation to predict SCC by adding Resazurin, fat, protein and SNF. These PLS models might be good enough to predict SCC, fat, protein and SNF by applying spectroscopic techniques in the diary farm. The correlation coefficient of lactose was lower than the other constituent models, but the PLS models showed the possibility to determine the variance of lactose. The prediction performance can be enhanced when the noises of reflectance signals are reduced and method for signal processing is improved. - 10 -
CONTENTS ( 영문목차) Chapter 1 Introduction 15 Section 1 Necessity of this research 15 Section 2 Objective of this research 21 Chapter 2 Present Status of Technologies 23 Section 1 Domestic status of technologies 23 Section 2 Foreign status of technologies 25 Section 3 Domestic and foreign status of patent 27 Chapter 3 Method and Result 29 Section 1 Background of near infrared spectroscopy 34 Section 2 Development of preprocessing technique for somatic cell count 96 Section 3 Development of preprocessing technique for milk properties 78 Section 4 Development of measuring algorithm for somatic cell count 121 Section 5 Development of measuring algorithm for milk properties 134 Section 6 Development of portable quality evaluation system of milk 154 Section 7 Performance analysis of portable quality evaluation system of milk 178 Chapter 4 Achievement of Goal and Contribution 188 Section 1 Objective of this research 188 Section 2 Achievement of goal 189 Section 3 Contribution 190 Chapter 5 Plan of Practical Usage 194-11 -
Section 1 Necessity of additional research 194 Section 2 Adaption of other research 197 Section 3 Plan of commercialization 201 Chapter 6 Technical Information Related This Study 207 Section 1 Paper 207 Section 2 Patent 213 Section 3 Web site 215 Chapter 7 References 217-12 -
목 차 제 1 장연구개발과제의개요 15 제 제 1 절연구개발필요성 15 2 절연구개발목표및범위 21 제 2 장국내외기술개발현황 23 제 제 제 1 절국내기술개발현황 23 2 절국외기술개발현황 25 3 절국내외특허현황 27 제 3 장연구개발수행내용및결과 29 제 제 제 제 제 제 제 1 절근적외선분광기술 34 2 절원유의체세포수측정을위한전처리기술개발 69 3 절원유의성분조성측정을위한전처리기술개발 87 4 절원유의체세포수측정알고리즘개발 121 5 절원유의성분조성측정알고리즘개발 134 6 절원유의휴대용품질판정시스템개발 154 7 절전체시스템의현장적응성검토 178 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 188 제 제 제 1 절연도별연구목표및평가의착안점 188 2 절목표달성도 189 3 절관련분야기여도 190 제 5 장연구개발결과의활용계획 194 제 1 절추가연구의필요성 194-13 -
제 제 2 절타연구에의응용 197 3 절기업화추진방안 201 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 207 제 제 제 1 절학술논문 207 2 절관련특허 213 3 절웹사이트 215 제 7 장참고문헌 217-14 -
제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발필요성 1. 경제적 산업적중요성 우유는인간에게가장이상적인건강영양식품으로우유가완전에가까운식품이라 는말은사람의건강을유지하는데에필요한거의모든영양소를소화하기쉬운형 태로갖고있기때문이다. 국내의우유관련산업은타식품산업에비해비교적짧은 역사속에서급속한성장을이룩하였으며, 현재경산우의산유량은 1990년에는 6,148 kg/ 두, 1995년에는 6,427 kg/ 두, 1999년에는 7,247 kg/ 두, 2000년에는 7,355 kg/ 두로지 속적인생산량의증가를보이고있다. 이러한원유생산량증가의주요원인으로는낙농진흥회출범(1999 년) 에따라호당 젖소사육규모확대, 개량기술의개선, 사양방식의개선, 축사환경의개선, 특히비유 촉진제사용의확대등으로볼수있다. 그러나이러한원유생산량과소비량은표 1-1과같이각각연평균 0.5 ~ 0.8 %, 2 ~ 3 % 정도로계속적인증가를보이는반면수입유제품의지속적인증가로인하여원유의자급률은오히려지속적으로하락하여 2011년에는 59.8 % 에머무를것으로전망되어원유수입이축산산업에큰문제로대두되고있다. Table 1-1 우유수급율단위 : 천톤 2000 2001 2002 2004 2011 원유생산량 2,400 2,403 2,421 2,451 2,568 원유소비량 2,840 2,934 3,043 3,291 4,296 수입량 540 502 611 855 1,742 자급률 (%) 84.5 81.9 79.6 74.5 59.8 1 인당총소비량(kg/1 인) 60.1 61.6 63.3 67.5 84.5 재고량 133 88 65 69 81 2002, 한국농촌경제연구원농업전망 - 15 -
원유의수입량은 1991년부터지속적으로증가하여 1996년과 1997에는국내원유생 산량의 1/4 정도에달하는양이수입된바있으며, 매년지속적으로증가하여국내산 원유의구조적인수급불균형현상을초래하고있다. 이러한현상은유가공업체에서이 윤추구를위하여값싸고품질이좋은수입산원유를수입하여피자치즈, 기능성요구 르트, 조제분유등의유제품을생산하기때문이다. 그러므로현재국내에서는원유의 생산량을조절하기위하여비유촉진제의사용을금지하고국제경쟁력을높이기위하 여고품질우유생산에박차를가하고있다. 고품질우유란풍미가좋고단백질, 지방과같은우유성분함량이풍부하며세균수 와체세포수가적은신선한우유를말한다. 특히원유체세포수의증가는표 1-2와 같이유성분중지방, 유당, 단백질, 카제인의감소와나트륨, 염소의증가를가져오는 등의전체적인원유품질에영향을미쳐축산농가의경제적손실이매우크고, 우유 의경제적가치가떨어진다. Table 1-2 체세포수와유질과의관계 구성성분 정상우유 (%) 체세포수가 높은우유 (%) 체세포수가높은 우유 / 정상우유(%) 무지고형분 (Solid Not Fat) 8.9 8.8 99 지방 (Fat) 3.5 3.2 91 유당 (Lactose) 4.9 4.4 90 단백질 (Total Protein) 3.61 3.56 99 카제인 (Total Casein) 2.8 2.3 82 나트륨 (Sodium) 0.057 0.105 184 염소 (Chloride) 0.091 0.147 161 칼륨 (Potassium) 0.173 0.157 91 칼슘 (Calcium) 0.12 0.04 33 2002, 국립수의과학검역원, 원유가산정체계기준변화에따른체세포수관리대책 - 16 -
원유의체세포수증가는표 1-3과같이유량감소이외에유방염진단의지표로도 사용되는데일반적으로건강한유선으로부터분비되는원유에는체세포수가ml당 20 만개이하이나, 미생물에감염되면면역세포중에서호중구의증가로인하여원유ml 당 50 만개이상의체세포수를나타낸다. 그러므로목장별로체세포수를측정하여젖 소의유방염감염우가있다는사실을확인할수있다. Table 1-3 냉각기체세포수와유방염감염율과의관계 냉각기체세포수감염분방율 (%) 유량감소 (%) 200,000 6 0 500,000 16 6 1,000,000 32 18 1,500,000 48 29 2002, 국립수의과학검역원, 원유가산정체계기준변화에따른체세포수관리대책 덴마크는 2001년원유ml내에체세포수 30만개이하가약 85% 이며, 유질협회에서 우유를관리하고있는일본도체세포수 30만개이하가 74%, 50개만이하가 92% 를기 록하고있으며, 미국에서는낙농가의원유의체세포수를 10만개이하로감소시키는 것을장래의목표로삼고있다. 국내에서도위생등급제실시이후일시적으로체세포수가개선되었지만 1997년이후 에는체세포수개선정도가미진하여체세포수 50만개이상의 3등급농가분포율이전 체의 30% 전후로나타났다. 이러한체세포수증가의원인은국내낙농업이전업화, 규모화되면서농가별평균사육두수의증가로개체별관리의한계를보이고, 제한된 공간에서농후사료위주의열악한사육환경과예방적인차원에서체세포수관리프로 그램의적극적인도입이되고있지않기때문이다. 현재덴마크, 미국, 일본등에서는소득증대와웰빙시대에발맞추어기존의유대지 급기준인체세포수, 지방, 단백질이외에유당, 총고형분, 수분등을추가로하였고 세균수와체세포수가일정한계를넘을때에는집유정지를가하고벌과금을부과하는 - 17 -
등고품질우유생산에심혈을기울이고있다. 국내의경우 1972 년이전에는물량위주로유대지급을하였고, 1992년까지는유지 방율을기준으로유대를지불하였다. 1993년 6월부터는유지방율과유대차등지불제 를시작하였으며, 1995년 10월부터는세균수와체세포수의등급기준을위생등급에따 른우유값의차등지급제로시행하여위생적인우유생산에큰효과를거두었으나체 세포수 25만개이하가 2001년에약 21% 로다른선진국에비하여매우낮은실정이다. 그러므로, 국내축산산업의국제경쟁력강화와축산농가의소득증대를위해서는 착유시축산농가및원유유통현장에서원유의체세포수등을포함한유지방, 단백 질, 유당등을측정할수있는원유의품질판정시스템을도입하여등급별체계적인 원유의관리가필요하다. 공산물의품질관리및안전성에대한연구는많은국공립연구기관과기업체연구소 등에서다양하게수행되고있으나, 농산품의품질관리를위한전문연구소설치및전 문인력양성은미비한실정이며국내농산품의이공학적특성에대한기초자료의축 적이미진하고, 적도미흡하다. 품질판정에대한연구역사가그리오래되지않아관련기술개발실 그러므로원유의품질판정에관련된각종단위계측장치및설비의 국내개발이어려운실정이므로대부분의설비를수입에의존하고있는실정이다. 2. 연구개발의필요성 한국낙농육우협회의 2002 우유의수급안정대책방안 에서는국내우유의수급 안정화를위하여계획생산제도입, 비유촉진제사용금지, 저능력우의도태추진, 탄력 있는유가제도도입, 원유생산비조사의기본지침설정을권장하고있다. 계획생산제도입은가급적합리적인소비촉진을통해수요량을늘리고, 늘어난수 요량만큼생산하는증산지향적계획생산을의미하며, 비유촉진제사용은우유의생 산성을높이지만품질이저하되므로사용을제한하고있다. 또한, 체세포수가높거나 산유량이일정수준미만인저능력우에대하여도태를권장하고있는데, 이는저능력 우의우유가다른고품질의우유에혼합되어전체적인품질저하를일으키는것을방 지하기위함이다. 그러나무계획적인도태는낙농생산기반을위축시킬우려가있기 때문에저능력우의도태보다는착유시원유의품질관리를통하여젖소의질병을예 - 18 -
방하고저능력우의발생을방지하는것이최선이다. 또한, 탄력있는유가제도도입, 원유생산비조사의기본지침을설정하여계절별차 등가격제와용도별차등가격제를도입하고우유생산비계산상의문제점을고려하여 낙농가와유업체가공동으로납득가능한유대지급기준의도입을권장하고있는데이 를위해서는낙농가가계절과용도에따라원유의품질을관리하여고품질우유를유 업체에공급하는것이필요하다. 국내에서는 2002년부터원유가격산정체계를표 1-4와같이기존의체세포수등급 을 3등급에서 5 등급으로세분화여유대를지급하고있으며, 유지방에감소에따른부 과금을높이는등고품질우유생산에박차를가하고있다. Table 1-4 체세포수에따른원유가격산정체계변화 현행가격체계 개선가격체계 등급구간가격등차등급구간가격등차 1등급 20 만미만 +30 1등급 20 만미만 +50 2등급 20~50만미만 0 2등급 20~ 35만미만 +23 3등급 50만초과 -30 3등급 35~ 50만미만 +3 4등급 50~75만미만 -25 5등급 75만미만 -40 2002, 국립수의과학검역원, 원유가산정체계기준변화에따른체세포수관리대책 최근국내에서는 MUN(Milk Urea Nitrogen) 에대한관심이집중되고있는데, 이것 은원유에포함되어있는요소태질소을의미하는것으로젖소사료속의단백질과 당, 전분등의에너지균형을판단하는지표로활용되고있다. 그러므로원유품질에 대한실시간측정은급여사료의적절한조절로사료비를절감할수있으며요소와 암모니아과잉등의젖소의질병을예방하며분뇨로배출되는질소의수준을조절하 여환경오염을감소시킬수있다. 원유의품질검사법은주로임상진단과화학적진단등이있으나오랜시간이소요 되며위험한시약을사용하는등의복잡한전처리과정을거쳐야하며, 전문가를필 - 19 -
요로하여일반낙농농가에서는사용하기어려운단점이있다. 현재국내 외에서사용되고있는자동화된원유의품질측정장치는크게체세포수 측정장치(Fossomatic) 와단백질, 유당, 지방, 총고형분등을측정할수있는장치 (Milkoscan) 가있다. 또한, 체세포수와원유의품질을동시에측정가능한장치 (Combifoss) 는개발되어있으나가격이비싸일부유가공업체에서만사용이가능하 고장비의규모가크므로이동중에사용하거나휴대할수없어응급시원유생산현 장에서실시간품질측정이불가능하고수입품이므로국내축산농가환경과는다소차 이가있어축산농가및유통현장에서실시간측정이가능한휴대용원유품질판정 시스템의개발이필요한실정이다. 또한, 현재시행되고있는원유의품질측정은여러젖소로부터수집하여혼합된원 유의샘플을이용하여전수조사가아닌표본조사에의존하고있으므로품질이낮은 젖소의원유를선택적으로제거하기가어렵고다른원유시료와혼합되어전체적인 품질저하를초래하게된다. 그러므로고품질우유생산을위해서는착유현장에서 실시간원유의품질요인을측정하는등의등급별원유관리가필요하다. 최근농산물의품질검사를위하여사용되고있는비파괴검사법에는농산물의물리 적, 전자기적, 광학적특성등을주로사용하고있다. 근적외선분광분석법은시료의 광학적특성을이용하는것으로시료에빛을조사( 照射 ) 하여시료내부의화학적성 질을시료에영향을주지않고비파괴적으로분석하는방법으로전량분석이가능하고 하나의스펙트럼을가지고동시에여러개의이화학적성분검사가가능하여농업, 화학, 제약산업등의현장에서신속한선별및등급판정을위한온라인시스템에 적용하기에적합하다. 국내유제품의품질에대한소비자의신뢰도를높임으로서소비자의불신을해소하고소비자기호의다양화와고품질의소비경향에맞추기위해서는착유시실시간원유의품질을측정할수있는기술을개발하여고품질우유생산의기반을조성해야한다. - 20 -
제 2 절연구개발목표및범위 1. 연구개발목표 본연구는자동으로우유시료의공급, 반응시약투여, 시료온도제어및혼합등의 시료전처리와우유시료의광학적특성을이용한체세포수, 지방, 단백질, 유당, 총고 형분의비파괴품질측정이가능한원유의실시간휴대용품질판정시스템을개발하고 자수행되었으며, 주요연구개발목표는다음과같다. - 원유품질요인( 체세포수, 지방, 단백질, 유당, 총고형분) 의실시간측정기술개발 - - 근적외선분광법을이용한원유의품질판정알고리즘및프로그램개발 젖소원유의실시간휴대용품질판정시스템개발및성능평가 2. 연구개발범위 가. 원유의휴대용품질판정시스템시작품제작 - 원유시료공급장치, 시약투여장치, 온도제어장치등을포함한전처리장치설 계및제작 - - 분광모듈의재현성및정확도분석 인터페이스모듈을포함한시스템제어부설계및제작 - 전처리장치, 광원부, 검출부, 광섬유, 샘플홀더, 시스템제어부를포함한원유의 휴대용품질판정시스템의시작품제작 나. - 원유의체세포수측정알고리즘개발 근적외선분광광도계를이용하여반응시약의종류및체세포수에따른원유의광 학적특성구명 - 분광광도계와원유의품질판정시작품을이용한체세포수측정알고리즘개발및 평가 다. 원유체세포수측정기술개발 - 21 -
- - - 국내원유체세포수분포도조사 원유체세포수측정을위한원유시료전처리조건설정 원유체세포수측정을위한첨가시약의환경조건설정 라. 원유의성분조성( 수분, 지방, 단백질, 유당, 총고형분) 측정알고리즘개발 - 근적외선분광광도계를이용하여반응시약의종류및원유성분조성에따른원유 의광학적특성구명 - 분광광도계와원유의품질판정시스템을이용한원유의품질판정알고리즘개발 및평가 마. 실시간휴대용품질판정시스템의제어알고리즘및품질판정프로그램개발 - 원유시료공급, 시약투여의유량제어및시료온도제어알고리즘개발 - - 임베디드시스템을이용한시스템제어장치개발 시스템제어알고리즘및품질판정프로그램개발 바. - 전체시스템의현장적응성검토 현장적응및측정환경에따른문제점분석 - 현장운영평가를통한시스템의정확도검토및사업화방안정립 - 22 -
제 2 장국내외기술개발현황 국내외기술개발현황은주로고품질우유생산을위한체세포수감소방안에관한 연구와우유의실시간품질측정에관한연구등이있으며, 아직까지휴대용우유품 질판정시스템에관한연구는미비한실정이다. 본연구에서는과제의성공적인수행 을위해현재까지연구된국내외기술개발현황을조사및분석하였으며, 수집한주 요자료는다음과같다. 제 1 절국내기술개발현황 국내축산농가에서는원유의품질과는상관없이착유된원유를하나의냉각기에 저장하여원유유통업체에보내품질에따른유대를지급받고있다. 원유의품질 이저하되거나체세포수가늘어나면현장에서이화학적방법을이용하여품질저하 원인을찾고있으나, 이미품질이저하된상태이므로원인을찾아해결하기에는 많은시간과노력이소요된다. 또한축산농가자체에서생산되는원유에대하여 품질측정이불가능하므로원유유통업체의등급판정에의존하는실정이다. 국내의원유에대한연구는착유현장에서착유기의관리, 젖소의위생관리, 착유 시간등의착유방법에대한연구가주로수행되고있으며, 체세포수증가방지를 위한이화학적방법에대한연구는활발히진행되고있으나원유의품질측정방법 에대한연구는부족한실정이다. 성균관대학교에서는원유의품질요인중지방, 단백질, 유당, 총고형분에대한예 측모델을개발하였으나실용화를위해서는측정방법및알고리즘의수정이필요하 다고보고하였으며, 체세포수의경우개발된모델이체세포수의함량을정확히예 측하기어렵다고보고하였다. - 23 -
한국식품연구원에서는근적외선분광법을이용한체세포수측정의문제점을보완 하기위하여체세포수에직 간접적으로반응하는시약을원유에첨가한후, 체세 포수예측모델을개발하여체세포수측정에반응시약사용의가능성을제시하였으 나상용화하기위해서는시약반응조건의최적화및다양한알고리즘을통한모델 개발이필요하다고하였다. 국내에서근적외선분광법을이용하여원유의품질요인측정에관하여연구한논 문은 10 편미만에불과하며, 아직까지상용화되기에적합한예측모델은개발되지 않았다. 또한, 국내의원유품질에대한관리는기존의체세포수측정에서수분, 지방, 단백질, 유당, 총고형분등의범위까지확대되고있으나해외의비싼측정장 비를그대로사용하는등아직까지국내에서개발된체세포수측정장비및자동 화된원유의품질판정시스템은개발되지않았다. 국립수의과학검역원에서는착유기및착유환경에따른체세포수의증가원인에대 한연구하여체세포수가증가하는것을방지하기위한올바른착유기사용및착 유환경조성에관하여활발히연구하고있다. 축산기술연구원에서는고품질원유생산을위한관리기술개발에대한연구로체 세포수를높게만드는원인을착유시유량으로분석하여적절한유량으로착유를 하면체세포수를감소할수있다는가능성을제시하였다. 서울우유에서는원유중요소태질소(MUN) 의활용방안에대한연구로원유의 요소태질소를측정하여젖소의영양상태파악및적절한사료투입에활용가능 성제시하였다. - 24 -
제 2 절국외기술개발현황 미국유방염관리위원회에서는효과적인유방염진단을위해목장의냉각기체세 포수측정을권장하고있는데, 아직까지현장에서실시간체세포수를측정할수 있는자동화된장비가없어이화학적방법을사용하고있으며정확한개수측정이 불가능하고복잡한전처리를필요로하는등의단점이있어, 신속하고정확한체 세포수측정기술개발이활발히진행되고있다. 독일, 덴마크, 노르웨이, 미국등에서원유중요소태질소와젖소번식능력및원 유품질의상관관계에대하여오랫동안연구해왔으며, 젖소의영양상태및사료량 조절을위하여유대값결정및원유의품질검사와동시에요소태질소의측정을 권장하고있다. 근적외선분광법의단점은분석방법이경험적이고, 측정값이임의의수치이므로 시료의알고있는성분이나조건을이용하여교정(Calibraion) 작업이필요하다. 일 반적으로교정은많은시간이걸리며, 필요에따라자료의전처리가요구되나, 일 단모델이개발되면하나의스펙트럼으로여러가지성분의실시간측정이가능하 다. 해외에서는다중선형회귀(Multiple linear regression, MLR), 부분최소자승 (Partial least squares, PLS), 주성분분석(Principle component analysis, PCA), 신 경회로망등을이용하여농산물및식품의품질평가를위한예측모델을개발하고 있다. 해외에서는 1980년대부터근적외선분광법을이용하여원유의품질예측모델을개 발해왔으며원유의단백질, 지방, 유당, 카제인등을측정할수있는품질판정기 술을개발하고시작기를제작하여상품화하였으나체세포수예측모델의상용화는 한계가있어이화학적전처리를이용하여측정하거나새로운알고리즘통한예측 모델을개발하고있다. - 25 -
Tsenkova(2001) 등은근적외선분광법을이용하여우유의체세포수에따른지방, 단백질, 유당의예측모델을개발하여체세포수가증가함에따라모델의검증력이 낮아지고오차가증가한다고보고하였다. Pravdova(2001) 등은기존의체세포수 측정알고리즘을수정하여근적외선분광법으로체세포수예측모델개발의가능성 을제시하는등원유의품질측정을위한연구가활발히수행되고있으나현장에 적용가능한장치는개발되지않았다. 이스라엘우유개량협회에서는우유내생체중과우유내요소농도간의관계를분 석하기위해생체중(Live body weight, BW) 과우유내요소농도(MUN) 의관계를 평가하였으며, 생체중의 2차적성분이요소농도와높은상관도를보여생체중의 지수가젖소내의요소농도를예측가능함을제시하였다. 핀란드국립우유연구소에서는젖소에서유방염과체세포수의유전적관계를분 석하기위해선천적으로낮은체세포수를가진젖소가체세포수가많은젖소보다임상형유방염(Clinical Mastitis: CM) 에더민감한지의여부를조사하여유방염과체세포수와의상관관계를연구하여유방염진단에체세포수의측정이중요하다고보고하였다. - 26 -
제 3 절국내외특허현황 본연구에서는과제수행중제품화방안및기술이전을추진하기위하여국내외 관련특허를조사하였다. 본연구에서조사한관련특허는주로우유의신선도, 요소 태질소, 체세포등의측정기술에관한특허가있었으며, 휴대용시스템으로는실시 간과일의품질측정을위한과일당도계에관한특허가조사되었다. 그러므로본연구 는과제의창의성및독창적인연구의기반을마련하기위하여아래와같은특허를 기본으로하여개발되는결과물의상품화를추진할것이다. 우유의신선도판별용근적외선분광분석시스템 - 특허번호및일자 : 10-2006-0040487, 2006.05.04 - 특허내용 : 근적외선분광분석법을이용하여원유의산도(pH) 예측모델을개발 하여 신선도판별을위한시스템개발 근적외선분광분석시스템을이용한우유중요소태질소의분석방법 - 특허번호및일자 : 10-2007-0107947, 2006.05.04 - 특허내용 : 근적외선분광분석법을이용하여젖소의영양상태판별의기준이 되는요소태질소의분석방법을개발 근적외선분광분석시스템을이용한우유중체세포수측정방법 - 특허번호및일자 : 10-2006-0040511, 2006.05.04 - 특허내용 : 근적외선분광분석법을이용하여젖소의유방염판별의기준이되는 우유의체세포수측정방법을개발 휴대형과일품질정보측정장치 - 특허번호및일자 : 20-2005-0027708, 2005.09.27 - 특허내용 : 근적외선분광분석법을이용하여과일의산도및당도측정이가능 한휴대용품질정보장치를개발 - 27 -
Raman instrumentation - 특허번호및일자 : WO2007143590, 2007.12.13 - 특허내용 : 라만분광법으로다양한시료의스펙트럼을전처리없이측정하여 정성및정량분석이가능한시스템 Method and apparatus for detecting mastitis by using visible light and near infrared light - 특허번호및일자 : JP2001002017, 2001.03.14 - 특허내용 : 근적외선분광분석법을이용하여젖소의체세포수등급을정성적으 로측정하여젖소의유방염판별 Method and apparatus for determining the constituents of dairy products - 특허번호및일자 : 19910773921, 1991.10.30 - 특허내용 : 근적외선분광분석법을이용하여젖소의체세포수등급을정성적으 로측정하여젖소의유방염판별 Method and apparatus for determining the constituents of dairy products - 특허번호및일자 : 19910773921, 1991.10.30 - 특허내용 : 근적외선분광분석법을이용하여유제품의정성및정량분석을통 한품질분석 - 28 -
제 3 장연구개발수행내용및결과 연구개발목표 본연구는자동으로우유시료의공급, 반응시약투여, 시료온도제어및혼합등의 시료전처리와우유시료의광학적특성을이용한체세포수, 지방, 단백질, 유당, 총고 형분의비파괴품질측정이가능한원유의실시간휴대용품질판정시스템을개발하고 자수행되었으며, 주요연구개발목표는다음과같다. - 원유품질요인( 체세포수, 지방, 단백질, 유당, 총고형분) 의실시간측정기술개발 - - 근적외선분광법을이용한원유의품질판정알고리즘및프로그램개발 젖소원유의실시간휴대용품질판정시스템개발및성능평가 1. 연구개발범위 원유의휴대용품질판정시스템시작품제작및체세포수측정알고리즘개발 원유의휴대용품질판정시스템시작품제작 - 품질판정시스템은일정한양의시료를자동으로공급하여반응시약을투여하고 혼합된시료와시약을적절한온도로조절이가능하도록시료공급장치, 시약투 여장치, 온도제어장치를설계및제작. - 휴대용품질판정시스템개발에사용할분광모듈의재현성을측정하여스펙트럼 의정확도를분석. - 품질판정시스템은원유시료공급, 시약투여, 온도제어, 스펙트럼처리및분석이 가능하도록인터페이스를구성. - 스펙트럼의특성을고려한광원부, 검출부, 신호처리부, 제어부및샘플홀더등을 설계하고전처리장치가포함된휴대용원유품질판정시스템의시작품을제작. 원유의체세포수측정알고리즘개발 - 체세포수등급을기준으로 1등급에서 5등급까지각등급별로동일한수의원유 - 29 -
시료를선택하여분해능이우수한분광광도계(NIRS 6500) 와원유품질판정시스템의시작품을이용하여투과스펙트럼을측정. - 투과스펙트럼은시료에광선을여러번주사(Scan) 하여측정한스펙트럼을평균내어하나의흡광도로파일로저장. - 반응시약의종류에따라스펙트럼과원유체세포수의상관관계를분석하고적정 파장대를선정한후, 스펙트럼의수처리기법및전처리방법을구명. - 다중회귀분석(MLR), 부분최소자승법(PLS), 인공지능기법(Neural network) 등의 모델개발방법으로원유체세포수의측정알고리즘을개발하고미지의시료를 이용하여정확도를분석. - 현재통상법으로사용되고있는체세포수측정기기와유사한정확도범위를갖도 록알고리즘을보완및수정. 2. 원유의체세포수측정기술개발 우유생산농가에서우유시료를수집하여원유의체세포수분포도를조사 원유체세포수측정방법개발 - 원유체세포수측정에영향을미치는시료온도, 첨가시약의반응시간, 농도, 측정 온도등의최적측정조건을실험적으로구명. 3. 원유의실시간휴대용품질판정시스템의원유성분조성측정알고리즘및제어 프로그램개발 원유의성분조성( 지방, 단백질, 유당, 총고형분) 측정알고리즘개발 - 분해능이우수한분광광도계(NIRS 6500) 와원유품질판정시스템의시작품으로원유시료에광선을여러번주사하여측정한스펙트럼과반응시약의종류에따 른상관관계를분석하고적정파장대를선정한후, 스펙트럼의수처리기법및 전처리방법을구명. - 다중회귀분석, 부분최소자승법, 인공지능기법등의모델개발방법으로원유품질 의예측모델을개발하고미지의시료를이용하여정확도를분석. - 30 -
- 현재통상법으로사용되고있는원유품질측정기기와유사한정확도범위를갖 도록알고리즘을보완및수정. 실시간휴대용품질판정시스템의제어알고리즘및측정프로그램개발 - 원유시료의공급, 시약의투여를위한유량제어및시료의온도제어알고리즘 개발. - 고속마이크로프로세서, 메모리, TCP/IP 통신이가능한임베디드시스템 (Embedded System) 을이용하여시스템제어장치를설계및제작. - 시료및시약의유량제어, 온도제어는물론품질판정이가능하도록인터페이스 모듈및임베디드장치의제어알고리즘개발. - 휴대용품질판정시스템의시료공급, 시약투여및온도제어를통한실시간품질 판정프로그램개발. 품질판정시스템의프로그램은참여기업인옵토켐( 주) 과협 력하여최종사용자로예상되는단위농협의원유수집담장자및축산농민이 편리하게사용할수있도록 User interface 프로그램을개발할계획임. 전체시스템의현장적응성검토 - 축산농가등의현장환경에따른문제점보완및분석. - 현장적응을통한사용자의편리성과정확도를점검하여문제점을보완하고, 단위 장치및프로그램을개선. - 원유의휴대용실시간품질판정시스템의현장적응성, 효율성검토를통한산업 화방안정립. 4. 원유성분조성분석기술개발 우유생산농가에서우유시료를수집하여원유의원유성분조성분포도를조사 원유성분조성분석기법개발 - 원유성분조성( 수분, 지방, 단백질, 유당, 총고형분) 에영향을미치는시료온도첨 가시약의반응시간, 농도, 측정온도등의최적측정조건을실험적으로구명. - 31 -
주요연구개발결과 1 차년도 : 우유시료에 Methyl red, Methylene blue, Bromcresol purple, Phenol red, Resazurin, Eosin-Y, Amido black 의반응시약을첨가한후, 고성능분광광도 계(NIRS 6500) 를이용하여원유의실시간휴대용품질판정시스템개발을위한전처리조건및적정파장영역을분석한결과는다음과같다. - 우유시료의온도는유성분의온도에따른영향을최소화하기위해 40 로유지 하였다. - 체세포수측정을위한환경조건은 Resazurin 시약을사용하여반응시간을 5분으 로사용한경우가 400 ~ 600 nm 영역에서가장좋은상관관계를보였다. - 지방, 단백질, 유당, 총고형분측정을위한환경조건은반응시약의첨가유 무 및반응시간과상관없이 보였다. 1,400 ~ 1,600 nm 영역대에서가장좋은상관관계를 - 그러므로원유의실시간휴대용품질판정시스템개발을위한전처리조건은체 세포수와지방, 단백질, 유당, 총고형분의동시측정을위해 Resazurin 시약과 5 분간반응하는것을전처리조건으로설정하였고적정파장영역은체세포수의 경우가시광선영역으로, 지방, 단백질, 유당, 총고형분의유성분은근적외선영역 으로선정하였다. 2 차년도 : 고성능분광광도계(NIRS 6500) 를이용하여전처리조건및적정파장 영역을분석한결과를기본으로전처리장치( 시료공급장치, 시약투여장치, 온도 제어장치, 시료혼합장치), 분광장치( 광원부, 검출부, 광섬유, 샘플홀더), 우유의스 펙트럼데이터수집을위한인터페이스모듈과전체시스템제어를위한고성능 임베디드장치를포함한원유의휴대용실시간품질판정시스템을개발하였다. 또 한실시간품질판정을위해시스템구동프로그램과품질판정알고리즘및분석 프로그램을개발하여원유의휴대용실시간품질판정시스템의예측성능을평가 한결과는다음과같다. - 32 -
- 체세포수는 400 ~ 700 nm 에서상관관계를보였으며, 검증한결과상관계수는 0.85, 오차는 13,111 개로나타났다. - 지방은 1,200 ~ 1,500 nm 에서상관관계를보였으며, 검증한결과상관계수는 0.95, 오차는 0.45 % 로나타났다. - 단백질은 1,400 ~ 1,600 nm 에서상관관계를보였으며, 검증한결과상관계수는 0.92, 오차는 0.23 % 로나타났다. - 유당은 1,300 ~ 1,600 nm 에서상관관계를보였으며, 검증한결과상관계수는 0.86, 오차는 0.33 % 로나타났다. - 총고형분은 1,300 ~ 1,500 nm 에서상관관계를보였으며, 검증한결과상관계수 는 0.92, 오차는 0.38 % 로나타났다. 원유의휴대용실시간품질판정시스템의원유품질요인측정에대한정확도는상 용화된우유품질분석장치에비해다소낮은예측력을보여주고있으나, 현장에서실 시간품질판정을위한휴대성과고가의우유품질분석장치보다경제성이우수하여 축산농가및낙농현장에서유용하게사용될것으로판단된다. - 33 -
제 1 절근적외선분광기술 1. 전자기파의개요 빛이란 파동성과입자성을가진전자기복사선(Electromagnetic radiation) 의넓은 영역중의가시( 可視 ) 부이다. 전자기복사선은대단히빠르게공간에전파하는에너지 의일종으로전자기복사선이공간을전파하는성질을나타내는데는파동(Wave) 으 로써설명하면그파동을속도, 진동수, 파장및진폭(Amplitude) 과같은파라미터로 써표시할수있다. 그러나복사에너지의흡수(Absorption) 나방출(Emission) 에관한 현상은이러한파동모형으로잘설명하기가어려워이러한경우에는전자기복사선 을광자(Photon) 라고부르는일정한에너지를가진입자로볼수있다. 전자기복사선 은공간에번갈아나타나는전기장(Electric field) 이며, 이전기장에직각으로자기장 (Magnetic field) 이나타나게된다. 복사선이물질에부딪치면물질속에있는전자 (Electron) 와전기장이서로작용하므로보통의경우에복사선은전기장의벡터만을 생각해도충분하다. 그림 1-1 은전파되는빛의전기적성분만을보여주는것이다. 이 파의 x, y, p 및 q는전기장에서의최대진동을나타낸것이고 x와 y 사이의거리( 또 는 p와 q 사이의거리) 는파장(Wavelength, λ) 으로나타낼수있으며, 이파장의길이 에따라그림 1-2 와같이전자기파를구분할수있다. 또한각각의파장에따라물질 이대응되는형태가다르며이중분광학적으로이용되어지는영역은표 1-1 과같다. - 34 -
Fig. 1-1 Electric properties of propagating light. Frequency V is ib le H z 1 0 6 1 0 8 1 0 1 0 1 0 1 2 1 0 1 4 1 0 1 6 1 0 1 8 1 0 2 0 1 0 2 2 R a d io T V /F M R a d a r H e a t In fra re d U ltra vio le t X -ra y γ -ra y 1 0 2 1 0 0 1 0-2 1 0-4 1 0-6 1 0-8 1 0-1 0 1 0-1 2 1 0-1 4 1 m 1 m m 1µ m 1 n m 1 p m Wavelength Fig. 1-2 Classification of electromagnetic wave. Table 1-1 Electromagnetic spectrum Electromagnetic wave Wavelength Molecular level Spectroscopy Radio wave 10 3 ~ 10-1 m Spin NMR Micro wave 10-1 ~ 10-3 m Rotation Microwave Infrared rays 10-3 ~ 10-6 m Vibration IR Visible rays 10-6 ~ 10-7 m Outer electron VIS Ultraviolet rays 10-7 ~ 10-9 m Outer electron UV X-ray 10-9 ~ 10-10 m Inner electron X-RAY - 35 -
적외선은파장영역에따라근적외선(Near InfraRed, NIR), 중적외선(Mid InfraRed, MIR) 및원적외선(Far InfraRed, FIR) 으로분류되며근적외선은가시광선과중적외선 사이에존재하는빛으로 700 nm에서 2,500 nm(14,000 ~ 4,000 cm -1 ) 사이에존재하 고있다. 광원으로부터근적외선이시료에조사되면시료는분자내결합의진동에 관련된파장의빛을흡수하여해당파장의빛의세기(Intensity) 가감소하게된다. 이 러한세기의변화는시료내의특정물질의농도와관련이있으며그변이는검출기에 의해검출되고측정된연속된신호(Spectrum) 는정량, 정성분석에사용된다. 2. 근적외선(NIR) 의응용분야 근적외선분석법은 1960년대초미국농무성의 Karl Norris에의해농산물에처음 적용된이래그응용범위가확대되어농업, 식품및사료분야뿐만아니라현재에는 화학, 생화학, 화장품, 의학, 석유화학, 제약, 고분자, 제지및섬유분야까지널리보급 되어있다. 가. 과실및과채류의당도 사과배등과실류와수박, 토마토, 오이등과채류의경우수분이 80 % ~ 90 % 정도이고, 그외는당분, 섬유질등가용성고형분이포함되어있다. 이들과채류의 경우당분의함량은맛을결정하는중요한인자이기때문에당함량을선별라인에서 비파괴적으로실시간으로측정하는기술을개발하기위한연구가활발히진행되고있 다. 또한일본의경우는 5 대과일( 사과, 배, 복숭아, 단감, 감귤) 의당 산도를판정하 는장치를개발하여보급하고있다. 나. 곡류의함수율및주요성분 곡류원료또는분쇄된곡물의함수율, 지방, 단백질, 아미노산등주요성분의비 파괴측정기술은원료의품질판정과건조또는가공공정제어를위해대단히중요하 다. Norris 등이근적외선분광분석법을이용하여밀과콩의함수율측정하기위한연 구를처음으로수행한이후함수율뿐만아니라곡류의주요성분측정에관한연구가다수수행되었다. 그결과산물상태의시료를대상으로주요성분의흡수파장을근거 - 36 -
로선정된다수의광학필터를이용한성분측정장치가개발되어보급되고있다. 에는곡류단립을대상으로근적외선스펙트럼분석법을이용하여단립의수분, 최근 단백 질등을측정하는방법에관한연구가수행되고있으며, 일부상용화되고있다. 또한 함수율이외에단백질, 지방, 아미노산등주요성분을측정할수있는필터방식의 비파괴분석장치가상용화되고있다. 다. 쌀의식미판정 근적외선분광분석법을이용한성분분석결과와식미와의상관관계를이용하여식 미판정기가개발보급되고있다. 일본에서는사타께식미계, 니레꼬식미계, 시즈오까 세기식미분석계, 야마모도식미분석계등이있다. 라. 우유및유제품의주요성분 치즈에함유된지방, 단백질및전체고형분함량을근적외선분광분석법에의해 예측한연구가수행되었으며염소젖을치즈로변환시키는데중요한 Casein의함량을 측정하는데도사용되었다. 근적외선을이용하여우유의이물질이나첨가제의검출도 가능하다. 실제낙농산업에서근적외선을이용한대표적인온라인측정장치는미국 에서상용화된것으로우유, 분유, 버터및치즈에함유된지방, 단백질, 수분및염분 의함량측정이가능하다. 마. 원산지판별 화학적조성의패턴에기초하여재료의산지를알아내는방법과외관과방향성분에 근거해시료의산지를추적하는연구가시도되고있는데근적외선과계량분석화학에 의해나타난패턴에맞추어봄으로써어떤시료의기원을밝히는방법이연구되고있 다. 외국의경우오렌지주스의화학적조성을근적외선을이용하여측정하고이를 분석하여생산지역을밝히는연구사례가있으며, 국내에서는생약( 황기, 인삼, 복령) 에 근적외선분광분석법을적용하여그성분을구분하고생약의원산지를구별하는연구 가수행되었다. - 37 -
3. 흡수분광법에의한성분측정원리 가. 근적외선의흡수원리 시료에적외선을조사하면전자기복사선의양자(Photon) 들은분자를여기시켜즉 각적으로진동하도록만든다. 분자에진동을유발시킨복사선은물체에흡수되며, 이 러한흡수에의해스펙트럼에흡수파장대역(Absorption band) 이발생하게된다. 대 부분의유기화합물의분자들은매우복잡하게구성되어있으므로빛의흡수에따라 생기는진동스펙트럼또한매우복잡하다. 유기화합물의스펙트럼에대한이해를 위해서는구조가간단한이원자분자의진동에대한이해가필요하다. 이원자분자 의진동을고전역학을적용하여그림 1-3 과같이가정할수있다. a) 두원자의질량은각각의원자중심에집중되어있다(Point mass). b) 두원자는탄성계수가 k 이고, 질량이 0 인용수철로연결되어있다. Fig. 1-3 Vibration model of atom. 질량이각각 m 1 및 m 2 이고, 탄성계수가 k 인이원자분자의거리(x) 에따른포텐셜 에너지는식 (1-1) 과나타낼수있으며, 진동주파수( ν) 는 Hook의법칙에따라식 (1-2) 과같이나타낼수있다. E x = 1 2 k x 2 식 (1-1) - 38 -
ν = 1 2π k m 1 + m 2 식 (1-2) m 1 m 2 식 (1-1) 에서진동주파수는탄성계수 k 의제곱근에비례하며, 원자의질량이적으 면적을수록진동수는높아진다. 이러한관계는스펙트럼의해석에응용될수있는데, 예를들어탄소원자의결합에서결합강도는 3중결합이 2 중결합보다크고, 2중결합 이단일결합보다크다. 이와같이적외선스펙트럼의흡수진동수를관찰함으로써대상시료의성분에대 한정성적인추론이가능하다. 두개의질량이용수철로연결되어있는조화진동자 (Harmonic oscillator) 에서는질량사이의거리에대한위치에너지의모양은그림 1-4 와같다. Fig. 1-4 Anharmonic and harmonic oscillation of molecule. 이러한고전적인이원자분자의진동모델( 조화진동모델) 은실제분자와잘일 치하지않는면이있다. 왜냐하면, 분자계는에너지가연속적이지않고불연속적이고 양자화된상태를나타내기때문이다. 분자운동을단순조화진동자의운동이라고가 - 39 -
정할때, 양자역학적인취급방법을써서허용되는에너지를계산하면식 (1-3) 과같 이나타낼수있다. E v = h ν ( v + 1 2 ) 식 (1-3) v : 진동양자수(Vibrational quantum number) E v : v번째진동양자수에대한상태에너지 h : 플랑크상수(Plank's constant, 6.626 10-27 erg/s) 실제분자의위치에너지곡선은쌍곡선이아니며진동에너지준위가식 (1-3) 에서 와같이균일한거리로배열되어있지않다. 따라서위치에너지곡선은수렴하게되 는데, 수렴의정도는조화진동(Harmonic vibration) 에서비조화진동(Anharmonic vibration) 으로옮겨갈수록증가한다. 이와같은비조화진동을설명하기위한두원 자의거리에따른포텐셜에너지에대한 Morse 의실험식은식 (1-4) 과같다. E E D e x 식 (1-4) α : 분자의종류에따른상수 E D : 해리에너지(Dissociation energy) 또한식 (1-4) 와같은포텐셜에너지곡선을가지는비조화진동자에대한양자화 된포텐셜에너지는식 (1-5) 로표현할수있다(Osborne, 1993). E v v h v h x v h x 식 (1-5) x1, x2,... : 비조화상수(Anharmonicity constants) 근적외선은 700 nm ~ 2,500 nm(14,300 ~ 4,000 cm -1 ) 의파장영역을가지며, 이파 장대역에서유기물의경우분자의진동에의해광흡수가일어난다. 즉, 어떤분자결 합에근적외선이조사되면그분자결합이가지고있는고유진동에너지에해당하는 - 40 -
복사선이흡수된다. 분자가적외선을흡수하기위해서는그분자는진동하면서이중 극자능률(Dipole moment) 의변화가일어나야만한다. 이런결과때문에균일한핵을 가진이원자분자(Homonuclear diatomic molecule) 는적외선을흡수하지않는다. 이 원리에의하면진동하는동안에이중극자모멘트(Dipole moment) 의방향이나크기가 조금이라도변하면복사선의전기적성분과적외선이작용하여흡수를일으키게된 다. 이러한흡수는다원자분자보다는이원자분자에서더잘일어난다. 근적외선은 2,500 nm 이상의중적외선영역에서일어나는 O-H, C-H, N-H 및 C=O 등과같은 작용기의기본흡수(Fundamental absorptions) 에의한진동(Fundamental vibration) 을 일으키며, 이것에의해배진동(Overtone vibration) 과결합진동(Combinational vibration) 이나타나는파장대역이다. 기본진동은그림 1-4 및식 (1-5) 에서진동양자 수 v가 0에서 1 로증가할때, 포텐셜에너지가증가하면서, 진동수가 ν 인특정파장 의빛을흡수함으로써발생된다. 진동양자수 v가 0에서 2, 3, 4 로증가할때, 발생되 는진동을 1 차배진동(First overtone), 2 차배진동(Second overtone) 및 3차배진동 (Third overtone) 이라한다. 나. NIR의특성 근적외선영역은중적외선영역의기본흡수에의한결합음및배진동에의한흡수 가일어나는영역이다. 일반적으로배진동에의한흡수의세기는표 1-2와같이중적 외선영역의기본흡수보다 10 ~ 10,000 배작다. 따라서중적외선을이용할경우높 은흡수도로인해시료를희석해야하지만근적외선을이용하면이와같은시료의전 처리가필요없기때문에신속하게분광스펙트럼을측정할수있다. - 41 -
Table 1-2 Absorption strength for overtone vibration level Transition (ν 0 to ν n) Overtone vibration level Relative absorbance n = 0 Default 100 n = 1 1 9 n = 2 2 0.3 n = 3 3 0.01 일반적으로근적외선의특징은물질을투과할때파장이커질수록흡광도는증가하 고대역폭(Bandwidth) 과경로길이(Path length) 는감소한다. 파장이짧아질수록경로 길이및대역폭은증가하고흡광도가감소하므로시료의전처리를필요로하지않는 장점이있다. 또한산란율이작아물리적인영향을적게받고흡광도가작기때문에 다량의주성분만의분석이가능해진다. 그러나근적외선에서중적외선으로갈수록 흡광도및산란율이증가하고시료의경로길이와대역폭은감소하므로미량의성분을 포함한시료도분석이가능하지만물리적인영향을크게받는다. 스펙트럼에나타나 는흡수대역(Absorption band) 은그물질에포함된특정성분의작용기가그파장에 서진동한다는것을의미하며, 이는물질의화학적성분의조성에따라다르다. 따라 서적절한파장의근적외선을이용할경우여러가지화학성분을선택적으로측정할 수있으며, 중적외선영역과비교할때표 1-3 과같은장단점이있다. - 42 -
Table 1-3 Characteristic of NIR spectrum 장점 중적외선에비해침투깊이가크다. 대역폭이크므로해당주파수의이동 으로인한측정오차가적다. 추출, 템퍼링, 박편등의시료전처리 가필요없다. 광학장비의가격이비 교적싸다. On-line 이가능. 비파괴품질판정기술로이용 단점 흡광스펙트럼의해석이어렵다. 같은분자결합을갖는유사한화합물의스펙트럼대역이중첩된다. 검량모델작성을위해서많은시료를대상으로한측정이요구된다. 다. Beer-Lambert 법칙 Beer-Lambert 법칙에의하면시료의흡광도는일반적으로농도에비례하므로흡광 도를측정함으로써액상시료의농도를측정할수있다. 그러나액상시료의흡광도 를직접적으로측정하기는실질적으로어려우므로, 투과도를측정하여흡광도로변환 하는방법이일반적으로이용되고있다. 투명한액상시료의경우정반사는무시할정도작으므로그림 1-5에서와같이농 도가 c 이고, 두께(dx) 가얇은시료에대해입사된광에너지를 I, 투과된광에너지를 I x 라할때식 (1-6) 이성립하게된다. Fig. 1-5 Reduction of intensity by material concentration. - 43 -
di I x I c I dx di I c dx 식 (1-6) 식 (1-6) 에서비례상수 ε 는일반적으로흡광계수(Absorptivity) 라부르고, 특히농 도(c) 의단위가몰(Mol) 인경우몰흡광계수(Molar absorptivity) 라고한다(Osborne, 1993), 이것은분자의종류및파장등에따라다른값을갖게되다. 또한두께가 d 인시료에입사한광에너지및투과된광에너지를각각 I i 및 I o 라할때식 (1-6) 을 적분하면, 식 (1-7) 이성립하게된다. Ii I odi I c ddx log I o log I i c d log I o I i c d 식 (1-7) 식 (1-7) 에서I o I i 는투과도(Transmittance, T) 이므로, 식 (1-7) 은식 (1-8) 로 나타낼수있다. log (1/ T ) = ε c d 식 (1-8) 흡광도(Absorbance) 는 log(1/t) 와같이나타낼수있으며이때광투과길이 (Pass-length) 는빛이시료를통과한두께(d) 를의미하게된다. 농산물과같이여러가지성분으로구성된시료에입사되는빛은일반적으로그림 1-6 에서와같이시료로부터반사(Reflection) 되거나흡수(Absorption) 혹은투과 (Transmission) 하게되며, 이때측정하는빛의종류에따라반사스펙트럼, 흡수스펙 트럼혹은투과스펙트럼을사용할수있다. - 44 -
Fig. 1-6 Various type of incident light. 시료로부터입사각과등각으로반사되는빛을정반사(Regular reflection, RR) 라하 고시료의내부로침투하여다시시료외부로반사되는빛을체반사 (Body reflection, RB) 라한다. 또한, 농산물의경우시료표면이균일하지않으므로반사되는상당부분 의광이일정하지않은방향으로반사되는경우가많다. 이것을확산반사(Diffused reflection, DR) 라한다. 입사된전체에너지(I i ) 에대한반사된에너지의비율을반사 도(Reflectance) 라한다. 직반사의경우내부품질과직접적으로관련이없으므로반사도를측정할때직반사 는제외하는것이바람직하다. 일반적으로성분측정과관련하여반사도라함은식 (1-9) 와같이조사된총에너지에대한체반사에너지의비를의미한다. 빛이시료의 반대쪽으로통과하여나오는것을투과(Transmission) 라하며, 식 (1-10) 과같이입사 된전체에너지에대한투과된에너지의비율을투과도(Transmittance) 라한다. 또한, 물체내부에서흡수되는것을흡수(Absorption) 라하며, 입사된전체에너지에대한 흡수된에너지의비율을흡수율(Absorptance) 이라한다. 반사도(R) 를이용하여흡광도 (A) 를계산하는방법은식 (1-11) 과같다. 체반사율 R B I B I I 식 (1-9) 투과율 T I T I I 식 (1-10) 흡광도 A log R 식 (1-11) - 45 -
라. 흡수분광법및회귀분석에사용되는용어 흡수분광법및회귀분석에사용되는용어는표 1-4 와같다. Table 1-4 Technical terms about near infrared spectroscopy Symbols A c C.V. CCD FIR MIR MLR MSC NIPALS NIR NMR PCR PDA PLS(=PLSR) PRESS R R 2 SDR SEC SEP SNV SSC T VIS Meanings Absorbance( 흡광도), log(1/t), log(1/r) Concentration( 농도, %) Coefficient of Variation( 변이계수) Charge Coupled Device Far Infrared( 원적외선) Mid Infrared( 중적외선) Multi-Linear Regression( 다중선형회귀법) Multiplicative Scatter Correction( 다중산란보정) Nonlinear Iterative Partial Least Squares Near Infrared( 근적외선) Nuclear Magnetic Resonance( 핵자기공명) Principal Component Regression Photo Diode Array Partial Least Squared Regression( 부분최소자승회귀법) Prediction Residual Error Sum of Squares( 예측오차제곱합) Reflectance, Correlation Coefficient( 상관계수) Determination Coefficient( 결정계수) Standard Deviation Ratio Standard Error of Calibration( 검량표준오차) Standard Error of Prediction( 검증표준오차) Standard Normal Variate Transform Soluble Solid Content( 고형분함량) Transmittance( 투과도) Visual Light( 가시광선) - 46 -
4. 분광광도계개요및특성 가. 분광광도계의구성및종류 분광광도계는일반적으로빛을내는광원부와그백색광을필요한파장으로분리시 키는단색화장치, 단색화된빛을측정시료에조사시키도록시료를담은용기와시료 에서나오는광량을측정하기위한검출기로구성되어있으며, 빛을시료에조사시키 는방법에따라크게투과법과반사법으로나눈다. 1) 투과측정장치 투과법은그림 1-7(a) 과같이광원으로부터오는빛이시료에투과하여검출기에 도달한빛을측정하는것이다. 주로투명한액상시료나빛이충분히투과할수있는 형태의시료를측정할때사용한다. 2) 반사측정장치 반사법은그림 1-7(b) 과같이빛을시료면에수직으로입사시키고시료에서반사된 빛을 45 각도에서검출하는방식이다. 보통고체상태의시료나미세하게분쇄한시료 를측정할때많이사용된다. (a) Transmission measurement (b) Reflection measurement Fig. 1-7 Schematic diagram of transmission and reflection measurements. - 47 -
3) Single beam 가장간단한형태의분광광도계로서그림 1-8(a) 에나타낸것과같이하나의빛을사 용하여기준광원측정과시료측정을순차적으로수행하는것이다. 먼저기준용매를 용기에넣은후투과광량을측정하고다시시료용액을넣고투과광량을측정하는 형태이다. 구조가간단하나측정하는동안광원의세기에변화에따라오차가발생할 수있다. 4) Double beam 그림 1-8(b) 과같이필터나단색화장치로부터나오는빛모두를교대로기준용기와 시료용기에번갈아가며조사시키고통과된빚을다시그리드거울에의해검출기로 보내는형태이다. 이경우는광원의변화를계속해서반영하기때문에보다안정된 신호를얻을수있다. (a) Single beam (b) Double beam Fig. 1-8 Schematic diagram of single and double beam spectrophotometers. 5) 실시간(Real time) 분광광도계 실시간분광광도계의구조는그림 1-9와같이광원과단색화장치사이에시료가 - 48 -
위치하게되며시료를통과한빛이단색화장치에의해분해되고동시에검출되는형 태이다. 실시간분광광도계는움직이는구동부분이없기때문에실시간으로신호를 얻을수있으며주사를반복할때얻는파장의재현성은극히높다. 실시간분광광도 계는신호평균화를통해신호-대- 잡음비(Signal-to-noise ratio) 를높일수있어현장 에서실시간품질측정을위한휴대용품질측정장치에주로사용되며, 그림 1-10에 도시하였다. Fig. 1-9 Schematic diagram of real time spectrometer. - 49 -
Fig. 1-10 Real time spectrometer(ocean Optics, USA). 나. 광원의종류 분자흡수측정의목적을위한연속광원은상당히넓은파장범위에걸쳐그세기가 크게변하지않는것을필요하며, 필요에따라원하는파장에해당하는광원을선택 해야한다. 1) 중수소와수소램프(Deuterium lamp) 자외선영역에서연속적인스펙트럼을얻고자할때사용되며 160 nm 정도까지의연속광을얻을수있다. ~ 410 nm - 50 -
2) 텅스텐할로겐램프 가장일반적인가시광및근적외복사선의광원으로 350 nm ~ 2,500 nm 정도까지 의연속광을얻을수있으나, 가시/ 근적외선영역의분광기에가장많이사용되고있다. 3) 크세논아아크램프 이등은크세논기체에전류를통하여강한복사선을발생시키고대략 피크를나타내며 250 nm ~ 600 nm 사이의연속스펙트럼을얻을수있다. 500 nm에서 다. 단색화장치의종류 자외선, 가시선및적외선단색화장치는빛이들어오는입구슬릿, 렌즈, 거울, 복사 선을각각의성분파장으로분산시키는프리즘이나회절발(Grating), 출구슬릿등으로 구성되어있다. 회절발단색화장치는그림 1-11과같이반사표면에서회절이일어나 각파장으로분산이일어나게되며, 프리즘의경우는두표면에서굴절이일어나각 파장으로분산이이루어지는형태이다. 같은회절발을이용한단색화장치는크기의분 산장치일경우파장분리가용의하고복사선을선형으로분산시킬수있는장점때문 에가장많이사용되고있다. - 51 -
Fig. 1-11 Grating(a) and prism(b) monochromator. 반사회절발은매끈하게연마된금속표면위에적당한모양의다이아몬드기구를 가지고많은수의평행하고조밀한간격의홈(Groove) 을파서만든것이다. 자외선 과가시선영역에서사용되는회절발은 300 ~ 2,000 홈/mm을가지고있고적외선 영역에사용하는것은 10 ~ 200 홈/mm 의홈을가지고있다. 이때회절발에그어지 는홈들은모두크기가같고, 평행하며등간격이어야하므로매우정교한제작과정 이요구된다. 라. 시료용기 시료를담는용기(Cell) 또는큐벳(Cuvette) 은이용하는스펙트럼영역의복사선을 흡수하지않는재질로만들어야한다. 석영이나용융실리카는자외선영역(350 nm 이 하) 의복사선뿐아니라 3 μm 까지도통과시키므로자외선, 가시선및적외선에연구에 모두이용할수있으며, 규산염유리는 350 ~ 2,000 nm 의영역에이용할수있다. 마. 검출기 1) 광전자증배관(Photomultiplier tube) - 52 -
자외선과가시광선영역에서는주로사용되며열에의해암전류발생이커지기때 문에암전류를최소화하기위해서검출기를냉각시키는장치가부착되어있다. -30 정도까지냉각시키면암전류를거의제거할수있다. 2) 광전도검출기(Photoconductive detecter) 근적외선영역(750 ~ 3,000 nm) 에서는사용되며근적외선영역의복사선이흡수되 면전기저항이감소하는반도체를이용한다. 가장널리사용되는광전도물질은황화 납(PbS) 으로서실온에서도사용할수있는장점을가지고있다. 황화납검출기는 800 ~ 2,000 nm 사이의영역에서감도가좋다. 3) 실리콘다이오드(Silicon diode) 검출기 복사선이다이오드에들어오면복사선의세기에비례하는전류가흐르게되고이를 검출하는방식이다. 약 190 ~ 1,100 nm 까지의스펙트럼을측정할수있는감응범 위를가지고있다. 4) 다중채널광자검출기 회절발에의해분산된복사빛을동시에측정할수있도록배열로이루어져있고, 규소다이오드(Silicon diode) 검출기를 1024개또는 2048개를배열로만들어사용하며 실시간분광광도계는다중채널광자검출기를채택하고있다. 가 ) Linear CCD array type CCD array type 의검출기는감도(Sensitivity) 가좋은반면신호대잡음비( 보통 250:1) 가낮아측정하는신호자체가매우미약할경우에는고감도의 CCD array type 을사용해야한다. 신호-대-잡음비를높이려면신호의세기를높여주어야하는데 CCD type 의경우신호가포화(Saturated) 되어측정이불가능하기때문에신호대잡음비를 높이는데한계가있다. 나 ) Linear PDA type - 53 -
PDA type의감도는 CCD type에비해약하지만신호의세기를높여줄수있기 때문에높은신호-대- 잡음비( 보통 2500:1 ~ 8000:1) 를얻을수있다. 보통 CCD type 에비해가시선영역에서는 30 배정도, 적외선영역에서는 70 배정도덜민감하여신 호의세기가충분하다면 PDA type 을사용하는것이유리하다고할수있다. 바. 광섬유장치 광섬유(Optical fiber) 는상당한거리( 수백미터정도그이상) 까지복사선을통과시 킬수있는유리, 용융실리카또는플라스틱의선다발로되어있다. 광섬유의지름은 0.05 μm부터 0.6 cm까지의것들이쓰이고있으며신축성을이용하여광경로가구부러 진경우에도측정이가능하고일정한거리에떨어져있는시료를측정할수있다. 따 라서공정내에분광광도계를설치하여온라인시스템구성이가능하게된다. 광섬유 의재질에따라유리또는플라스틱의경우는가시/ 근적외선영역의복사선측정에 사용되며, 용융실리카의경우는자외선영역부터사용할수있다. 용도에따라여러가 지종류의광섬유가쓰이며원하는형태로주문제작도가능하다. 반사를측정하기 위한광섬유프로브는하나의프로브내에광원에서부터오는복사선을통과시키는광 섬유와반사되어나오는복사선신호을받아들이는광섬유를동시에넣어 제작한것 으로반사측정시매우편리하게사용할수있다. 액체시료의투과도를용기를사용 하지않고직접측정할수있는 작되고있다. Dip 프로브형태도있으며투과거리도다양하게제 5. 스펙트럼의측정및분석법 스펙트럼의측정은측정방식에의해반사및투과스펙트럼측정으로나눌수있다. 반사스펙트럼은주로시료표면및일부표면이하의성분측정에주로이용되며, 고체시료의성분분석에유리하다. 투과스펙트럼은시료내부를통과한투과광을측정한것으로, 내부성분과관련된 정보를많이포함하고있어원유와같은액체시료분석에유리한점이있으나, 측정 장치가반사에비해좀더복잡해지게되고, 투과광의강도가반사에비해미약하기 때문에감도가높은센서를요구한다. 또한 1100 nm이상의파장에서는대부분의스펙 - 54 -
트럼이시료에흡수되기때문에이를측정하는것이쉽지않다. 따라서분석하고자하는시료의형태나분석성분의정보가들어있는파장영역, 분 석목적에부합하는측정방식을선택하여야한다. 반사혹은투과스펙트럼측정장치 를이용하여측정된스펙트럼의분석순서는그림 1-12 와같다. 분석대상파장영역선택 전체파장영역, 부분영역 데이터전처리 노이즈제거, 외란에의한스펙트럼변이제거, 성분과상관이높은영역강조 회귀모델적용 MLR, PCR, PLS 회귀모델적용 No 최적회귀모델? 회귀모델성능평가기준적합여부 Yes 최종모델선정 회귀모델선정기준에부합하는모델선정 Fig. 1-12 Process of spectrum analysis. 가. 스펙트럼의특성및외란 가시광선/ 근적외선은외란의영향을많이받게되며, 실시간측정장치의경우, 분 석용분광광도계로측정하는것보다더많은외란요인이작용한다. 스펙트럼전처리 는다중모델의개발에있어서가장기초적인단계이며, 스펙트럼에포함된외란을 제거하여보다안정적인예측모델을만들기위해이용된다. 스펙트럼측정시구조적인외란으로는특히과일과같은고형물체의경우, 표면에 서의광산란이나측정방식에기인한광경로의차이, 측정센서에서의노이즈, 주변측 정환경의변화( 온도등) 가있으며, 이러한외란은측정된스펙트럼의변이에주요한 - 55 -
영향을미치게된다. 따라서예측하고자하는내부품질의농도정보가포함된스펙 트럼영역에이러한변이가나타나게되면, 성분의농도와상관이없는스펙트럼의 변이는회귀모델을만들때방해가되며, 모델의예측성능을저하시키는주요한원 인이된다. 나. 스펙트럼전처리 전처리의목적은다중회귀모델개발의기초단계로서, 외란요인에의한스펙트럼의 변이를제거하고, 성분과관련된스펙트럼정보를강조하는데있다. 스펙트럼의주요전처리방법은평활화(Smoothing), 1 2 차미분, MC, SNV, MSC 등이있으며, 스펙트럼측정장치자체의노이즈를제거하는데평활화를, 1 2차미분 은광경로의차이나측정환경의변화등에기인한 baseline의이동을제거하거나변이 가큰파장영역의강조에이용되고있으며, MSC나 SNV는스펙트럼의측정시광산 란의영향을제거하는데이용되고있다. 1) 평활화(Smoothing) Smoothing 은주로외란요인중, 측정센서자체의노이즈를제거하는데이용한다. Smoothing의종류는 Savitzky-Golay smoothing, Hanning window, Moving average, Foulier transform, Wavelet transform 등이있으며, Smoothiong의종류에따라평활 화성능에차이가있다. 그림 1-13은 7 개의농도별(8.4 ~ 14.9 brix) 로원시스펙트럼( 파장범위 550 ~ 1,050 nm) 을보여주고있다. 그림에서보는바와같이각농도별스펙트럼은각파장 에서의스펙트럼에너지가선형적인관계에있지않아기준선의이동이발생했으며, 센서자체의노이즈성분도포함되어있음을알수있다. - 56 -
Fig. 1-13 Raw spectrum for concentration. 그림 1-14는 Savitzky-Golay smoothing을이용하여그림 1-13의원스펙트럼데이 터를평활화한경우의예이다. 그림에서보는바와같이스무딩포인트를증가시킬수 록평활화된원래데이터에포함된노이즈는잘제거가되나, 피크의이동(773 nm 770 nm) 이발생하므로, 스펙트럼이가지고있던성분에대한피크정보의변형이생 긴다. 따라서원스펙트럼정보를변형시키지않고측정센서자체의노이즈만을제 거할수있는평활화방법및각방법의평활화조건을찾아야한다. - 57 -
Fig. 1-14 Example of smoothing. (Savitzky-Golay Smoothing, Smoothing points = 5, polyminial order = 1) 2) 미분(Differential) 스펙트럼미분의목적은측정시의환경변화나, 측정장치의변화등에의해야기된 기준선의이동을제거하고, 분석대상성분의스펙트럼정보가다른주성분의스펙트 럼정보에파묻혀잘보이지않을경우, 이를강조하기위해사용된다. 스펙트럼미분 은 1 차, 2 차, 3 차,... 등여러가지차수에서행할수있으나, 대개의경우 2차미분정 도만으로도충분한경우가많다. 과도한미분을행할경우, 스펙트럼의모든변이에 대해미분효과가나타나, 스펙트럼을이해하기가어렵다. 미분방법은여러가지가있 으나그림 1-15와같은예에서는 Savitzky-Golay derivative 를이용하였으며, 사과의 투과에너지스펙트럼에대해 2 차미분을행한결과이다. 그림에서원스펙트럼에서는 보이지않던특정파장에서의피크가보이며, 다른성분의피크에묻혀있던작은스펙 트럼정보를강조하는효과가있음을알수있다. - 58 -
Fig. 1-15 2nd derivated spectrum. 3) 다분산보정(Multiplicative scattering correction, MSC) MSC 는시료표면혹은시료내부의불균일성때문에, 에대해서도얻어진스펙트럼은차이를보일수있으며, 동일시료에대한반복측정 이는스펙트럼데이터변이 의가장큰원인이된다. 또한산란정도는사용된광원의종류나시료표면의상태, 그 리고시료의반사지수등에영향을받으며, 이것은주로베이스라인의이동이나기울 기및곡률의변화로나타난다. 이러한광산란의영향은특히측정된스펙트럼의장 파장영역에서주로나타난다. MSC의기본개념은모든스펙트럼을이상적인스펙트 럼에의해보정하는것이다. 실제로는이상적인스펙트럼을얻을수없으므로, 전체 스펙트럼의평균을이상스펙트럼으로하며, 이상적인스펙트럼은식 (1-12) 를이용하 여계산되어진다. - 59 -
x j = m x i, j i = 1 m 식 (1-12) x : 스펙트럼 (m n), x j : j 번째파장의평균스펙트럼(1 n) 식 (1-12) 와같은평균스펙트럼을이용하여각파장에서의흡광도데이터에대해 선형회귀를취하면, 식 (1-13) 과같이선형모델을계산할수있다. x i = a i x + b i 식 (1-13) x i a i : 평균에대한회귀스펙트럼(1 n), : 기울기, b i : 절편 그러므로선형모델에대한 a i 및 b i 값을이용하여식 (1-14) 와같이다분산보정을 수행하게된다. x i MSC = ( x i - b i ) 식 (1-14) a i x i MSC : MSC 보정된스펙트럼(1 n) 그림 1-16은그림 1-13의 7개농도별원데이터에대해다분산보정을수행한결과이 며, 산란에의한변이가상당히감소했음을알수있다. - 60 -
Fig. 1-16 Corrected spectrum by MSC. 4) SNV(Standard normal variate) SNV 는다분산보정과마찬가지로광산란보정을위한방법으로전처리의목적은 동일하지만 SNV 는이상적인스펙트럼이필요하지않으며, 대신에각스펙트럼을전 체스펙트럼의표준편차로정규화하여광산란의영향을제거하는방법이다. 광경로나 광원의변동에따른스펙트럼의변이등이 SNV 에의해보정될수있으며, SNV보정된 스펙트럼은식 (1-15) 를이용하여식 (1-16) 과같은무차원이된다. a i = n x i, j j = 1 n 식 (1-15) x i SNV = ( x i - a i ) n ( x i, j - a i ) 2 j = 1 ( n - 1) 식 (1-16) - 61 -
a i x i SNV : i 번째스펙트럼의모든파장에대한평균 (n 1) : SNV 보정된스펙트럼 (1 n) 그림 1-17은원시스펙트럼에대해 SNV 전처리를적용한것으로, MSC와거의유 사한효과를보임을알수있다. Fig. 1-17 Corrected spectrum by SNV. 다. 상관계수곡선(Corelation curve) 상관계수곡선을그리는것은분석대상파장영역각파장에서의스펙트럼측정값 과성분과의상관계수를구하여이를전체파장에대해도시한것으로, 회귀모델개 발전에모델의정확성을어느정도예측할수있다. 상관계수곡선에서상관관계가 높은영역이많을수록분석대상성분의스펙트럼정보가많이포함되어있음을알수 있다. 그림 1-18은전술한각전처리별상관계수곡선을제시한것으로전처리에따 라상관계수가변하는것을알수있다. - 62 -
Fig. 1-18 Change of corelation curve for preprocesses. 라. 회귀분석모델(Regression model) 스펙트럼을이용하여정성분석혹은정량분석을하는데사용되는통계적인분석방 법에는주성분분석(PCA), 다중회귀법(MLR), 주성분회귀분석(PCR), 부분회소자승법 (PLS) 등이있는데, 미지의성분의분석에있어서는주로주성분분석을이용한정성분 석을하여특정파장영역을선정한후, 표 1-5와같은회귀분석을통하여정량분석을 하는방법이주로이용된다. - 63 -
Table 1-5 Various type of regression model 회귀모델사용변수장점단점 MLR 파장정밀도높음 파장선택이어려움변수수는샘플수에제한받음모델안정성이낮음변수간다중공선성문제가있음 PCR PLS 주성분 정밀도높음 모델안정성이높음 모델해석이어려움 1) 주성분분석(Principal component analysis, PCA) 주성분분석이란자료가가지고있는정보를발견하기위해서자료에포함된사례들 의펼쳐져있는방향또는경향을발견하기위한고전적통계기법이라고할수있 다. 자료가펼쳐진방향또는경향을발견함으로써자료가내포하고있는정보를발 견할수있다. 발견된정보에근거해서자료를압축하여저장할수있고또차후에 자료를재구성하더라도손실을최소화할수있다. 주성분분석(PCA) 의구체적목적에는변수들의선형결합을결정하는것, 가장유용 한변수들을선택하는것, 변수의수를줄이는것, 의미있는새로운잠재적변수를발 견하는것, 자료세트를행렬의차원으로축소하는것, 또는대상들의집단을파악하는 것등이포함될수있다. 인자분석을실시할것인가주성분분석을실시할것인가는연구목적에따라다르 다. 인자분석은관찰되지않은잠재적변수들을발견하는데유용하다. 자료를요약하 고선형관계를파악하기위해서는인자분석보다는주성분분석을시행하는것이좋 다. 또회귀분석, 군집분석에있어서변수들의수를줄이기위해서주성분분석에서 도출된주성분을사용할수있다. 또한, 주성분분석은다수의양적변수들의관계를 파악하기위한다변량기법으로, 다수의상관변수들을비상관변수들인주성분으로 전환한다. 주성분분석은평방대칭행렬의고유값(Eigenvalues) 과고유벡터(Eigenvectors) 에기 반을둔고유분석(Eigen analysis) 기법이다. 고유벡터들은직각이기때문에주성분은 - 64 -
최소변수들의공간을통해서수직방향을표시한다. 상관행렬, 공분산행렬, 또는제 곱및교차곱합계행렬등이사용될수있다. 상관행렬은표준화된자료로부터제곱 과교차곱의합계행렬이다. 공분산행렬은제곱과교차곱의개산( 槪算 ) 된합계이다. 제 곱및교차곱합계행렬은순수제곱및교차곱합계의행렬이다. 그러므로주성분(Principal component) 을찾기위한일반적기법은자료상관행렬의 고유벡터를계산하는것이다. 이교유벡터는자료가펼쳐진방향을제공하며, 고유벡 터상의자료의투영(Projections) 이주성분이다. 각주성분은처음변수들의선형결합 이며상관관계행렬또는공분산행렬의고유벡터의계수를갖고있다. 제 1 주성분은 자료에서관찰된변수들의선형결합의최대변량즉최대분산을가지고있다. 제 2 주성분은그다음변량을설명한다. 2) 다중회귀분석모델(Multi-linear regression, MLR) 다중회귀분석모델을일반화하며식 (1-17) 과같이나타낼수있으며, 계수벡터 β의추정치인추정회귀계수 b 는식 (1-18) 과같이구할수있다. 식 (1-17) X : Y : 시료의농도 시료의흡광도 ε : 오차 식 (1-18) 그러므로 X와 Y사이의선형관계를이용하여미지시료의성분값 Y를예측해야하 며, 이를위해서는변수선택법을이용하여모델과가장부합되는변수의조합을찾아 내야한다. 이때변수를많이고려할수록만들어진모델의정확도는향상되나, 기기장 치의변동이나측정된스펙트럼에변이가생기게되면, 예측성능이저하되어모델이 안정적이지못한단점이있다. 또한 NIR 데이터에이모델을적용할때는변수사이의 다중공산성문제를고려하여적용해야하므로선택된변수들간의상관관계분석이필 - 65 -
요하다. 3) 주성분회귀분석모델(Principal component regression, PCR) 스펙트럼데이터와같이여러개의반응변수(Response variable) 에대하여얻어진 다변량데이터(Multivariate data) 를분석의대상으로하는주성분회귀모델은식 (1-19) 와같이다차원적인변수들을축소및요약하여차원을단순화시키며서로상 관되어있는반응변수들상호간의복잡한구조를서로독립적인주성분 (Principal component) 이라고불리는새로운변수를유도한다. 주성분분석모델은높은상관관계 를갖는많은스펙트럼데이터를고유벡터집합과스코어로분해하여주성분이라는소수의상호독립적인새로운변량으로변환함으로써다중선형회귀모델(MLR) 의다중 공산성을제거하며, 소수의주성분으로스펙트럼데이터의변이를최대한수용하려는 통계기법이다. 다중선형회귀모델에서처럼스펙트럼데이터에서소수의특정파장의 데이터만을이용하는것이아니라모든파장의스펙트럼데이터를종합적으로파악하 려는방법으로많은수의스펙트럼데이터를소수의주성분으로축소하며, 이주성분 의분석을통해스펙트럼데이터의변이를해석한다. 그러나주성분분석모델은변수 X를새로운변수세트 T 로바꾸어차원축소를행한후, 이의선형관계를이용하여 Y 값을예측하는반면에, X 차원에서의분산만이고려된다는단점이있다. 식 (1-19) T : Score P : Loading 혹은 Factor X : 시료의흡광도 4) 부분최소자승회귀모델(Partial least square, PLS) 부분최소자승모델은주성분분석모델에서와같이스펙트럼데이터행렬을고유벡 터집합(Eigen vector) 과스코어(Score) 로분해하는데, 이때주성분분석모델과는달 리농도정보를이용함으로써고농도의스펙트럼은저농도의스펙트럼보다큰가중 치를가지게하는기법이다. 즉, 스펙트럼데이터행렬을고유벡터집합과스코어로 - 66 -
분해하고회귀시키기전의분해과정에서농도정보를사용함으로써높은농도를가지 는성분의스펙트럼은낮은농도의것보다큰가중치를가진다. 부분최소자승회귀법 은기존에존재하는스펙트럼데이터를주성분분석으로분해하여각각의주성분과농 도사이의상호관계를이용하는것으로식 (1-20) 과같은모델식을이용하게된다. 식 (1-20) X : Y : 스펙트럼데이터행렬 농도데이터 T : 독립변수 X를설명하는 Score 행렬 W : X와 U(Y) 사이의상관관계를나타내는 Weight 행렬 U : 종속변수 Y를설명하는 Score 행렬 Q : Y와 T(X) 사이의상관관계를나타내는 Weight 행렬 E, F, H : 잔차행렬 주성분분석모델은스펙트럼을분해하는과정에서농도데이터가포함되지않으나, 부분최소자승모델의경우스펙트럼분해과정에농도데이터가포함되므로일반적으 로더욱우수한성능을발휘하는것으로보고되고있다. 5) 모델성능평가 회귀모델의성능평가를위해식 (1-21) 과같은값을계산하며, 이는모델의예측표 준오차인 SEC(Standard error of calibration) 와미지시료의예측표준오차 SEP(Standard error of validation) 이다. 이는모델의예측성능을파악하기위한지표 로사용된다. - 67 -
식 (1-21) y i : 시료성분의실제값 ˆy i : 모델에의한성분예측값 f : 자유도, 여기서는부분최소자승 Factor의수 m : 시료의수 본연구에서는휴대용원유품질판정시스템개발을위해텅스텐할로겐램프를 광원으로선정하였으며, 가시광선과근적외선영역의측정을위해각각 CCD array type과 PDA type 의실시간분광광도계를사용하였다. 원유시료가액체시 료임을고려하여투과스펙트럼방식으로측정하였다. 또한기기장치의변동이나 측정된스펙트럼에변이가생기게되면, 예측성능이저하되어모델이안정적이지 못하며, 모델적용시변수사이의다중공산성문제를고려해야하는다중회귀분석 모델과다중회귀분석모델의단점은보완했으나모델이 X차원에서의분산만고려 되는단점이있는주성분분석모델을제외하였다. 모델해석이어렵지만다중회귀 분석모델의단점을보완하고 X와 Y사이의상관관계를고려한모델개발이가능 한부분최소자승회귀모델을이용하여유성분의모델을개발하였다. - 68 -
제 2 절원유의체세포수측정을위한전처리기술개발 1. 국내원유체세포수분포도조사 가. 체세포 체세포는몸을구성하고있는각기관, 조직의가장작은단위세포를말하는것으 로사람이나가축의체세포는여러가지종류로나누어지며일반적으로상피세포, 중 성구, 임파구및단핵구등의세포들로혈액에서유래한백혈구가 75 %, 유방분비세 포인상피세포가 25 % 정도로구성되어있다(Aroshi 등, 1989). 체세포의소장세포는 1.5 일, 창자의벽에붙어있는섬모세포는 3 ~ 5일의수명을가지고있으며원유를 생성하는유방의유선세포도일정한수명을가지고있어오래된세포는표면에서탈 락되어떨어져나가고새로운세포가생성되어원유의합성과분비가계속적으로가 능하다. 또한외부의병원균의침입으로유선이탈락되어원유와함께섞여나오는데 이러한상피세포는원유중에일정한양이혼입되며이것은유방내에염증상태를측 정할수있는중요한역할을한다. 유방염에걸린젖소의원유중 70 % 는판매가불 가능하고산유량이 30 % 감소하며유성분중유지방, 총단백질, 카제인, 무지고형분 등이감소하여막대한경제적손실을초래하고있어체세포수의정확한측정을통한 유방염진단이필요한실정이다. 선진낙농국가에서는오래전부터체세포수에의한 유방염진단및등급제를실시하여원유의위생적인측면에높은관심을기울이고있 으며국가별평균체세포수는표 2-1 과같이오스트리아, 스위스, 핀란드, 노르웨이가 평균 20 만개정도를보이고있다. 국내에서는위생등급제실시이후체세포수개선정 도는미진하였으나 2001년도에체세포수등급간의기준범위격차를현행 3등급에서 5등급으로세분화하여 1등급원유의비율은표 2-2와같이 2002년 25.6 % 에서 2005 년 42.9 % 로높은증가율을보이고있다. - 69 -
Table 2-1 A ratio of somatic cell count in other countries Country Somatic cell count ( 1,000/mL) Health ratio by somatic cell count < 300,000 < 400,000 < 500,000 500,000 Austria 160 84.9 % 7.1 % 4.3 % 3.7 % Swiss 273 93.1 % 3.6 % 1.5 % 1.8 % Finland 280 88.5 % 7.6 % 2.5 % 1.5 % Norway 231 93.1 % 4.8 % 1.4 % 0.7 % 2001, 낙농진흥회 Table 2-2 A change of somatic cell count ratio for each year Grade 1 Grade ( < 200,000) 2 Grade ( < 350,000) 3 Grade ( < 500,000) 4 Grade ( < 750,000) 5 Grade ( 750,000) 2002 25.6 41.9 21.8 6.5 4.2 2003 31.7 32.2 17.4 11.5 7.2 2004 37.2 34.5 15.6 8.5 4.2 2005 42.9 36.1 13.6 6.0 1.4 2007, 낙농진흥회 나. 현행체세포수검사법 1) 표준법( 직접현미경법) 직접현미경검사법은슬라이드글라스의 1 cm 2 내에샘플우유 0.01 ml 를도말, 건조 시켜염색후현미경하에서체세포수를직접검사하고현미경계수를곱하여원유 1 ml 중체세포수를산정하는것으로이검사법이현재체세포수검사법의표준법으로 널리이용되고있다. 하지만이방법은많은시간과노력이들어서다수의샘플을처 리하기에는부적합하다. 가) 원유채취및보존 - 70 -
원유채취시에는충분히혼합한후채취하고저장온도가 6 를초과해서는안 되며 6 시간이내에검사를수행하여야한다. Orthoboric acid(0.6% 이내) 를보존제로 첨가시에는 6 에서 24 시간보존할수있다. 체세포수는최초 2 3일정도는증가 한뒤시간이길어질수록감소하므로정확한검사를얻기위해서는신속한검사가필 요하다. 나) 염색액(Newman-Lampert stain solution) Methylene blue Ethyl alcohol 95% Tetrachlorethane Glacial acetic acid 0.6 g 54 ml 40 ml 6 ml Ethyl alcohol과 Tetrachlorethane을혼합하여 60 70 항온수조에서처리한후 Methylene blue 를주의깊게가한다. 4 로식힌후 Glacial acetic acid를가하여 10 12 micron 이하의구멍사이즈(Pore size) 의필터(Filter) 를이용하여여과후사용 한다. 다) 염색방법 슬라이드글라스는사전에깨끗이닦고, 알코올로재처리후건조시켜사용하며, 슬 라이드글라스위의 1 cm 2 격자는매니큐어등으로정확히표시한다. 원유를 30 40 로열처리한수슬라이드위 (1 cm 2 ) 에고르게도말하여고정시키고, 10분간염색을 실시하고증류수로 3 회수세후건조시켜현미경으로관찰한다. 라) 체세포수산정 체세포수측정시핵을가진모든세포를계산하고핵이없는원형질 (Cytoplasmic) 덩어리및작은핵을가진작은세포의분해물(Small cell fragment) 은계산하지않는 다. 체세포수의산정은식 (2-1) 과같이 Working factor 를곱하여산정한다. - 71 -
우유희석배수 을 로환산 반지름 식 (2-1) MF : 현미경계수(Microscopic factor) 예를들면표 2-3과같이 50시야를임의로측정했을때체세포수가 30이었다면우 유 1mL 중의체세포수는 Working factor(10,000) 측정수(30) = 300,000이된 다. Table 2-3 Relation of visual number and working factor visual number 1 10 25 50 100 200 Working factor 500,000 50,000 20,000 10,000 5,000 2,500 2) Rolling ball viscometer(rbv) 법 계면활성제의작용으로체세포중길게얽힌 DNA 분자가풀려나와우유중의단 백질과결합함으로써섬유성기질을형성시켜점도를나타내며, 점도정도를세포수 로환산하여측정하는방법이다. Glycerol 28 %(W/W) 로서점도를고정시킨후시험 코자하는우유시료와계면활성제(Viscol 610) 를섞어이로인한점도를구슬(Ball) 이 움직이면서체세포수를가리키는점도측정장치이다. 라. 자동화검사장비 우유중의체세포를형광물질인 Ethidium bromide로코팅시켜일정량을디스크에 도포시켜순간적으로통과되는체세포를할로겐램프또는레이저빔으로측정하는검 사법으로포소매틱(Fossomatic), 소마카운터(Somacount), 소마스코프(Somascope) 등이 - 72 -
있다. 가장신속하게우유중의체세포수를측정할수있는방법으로서시간당 200개 이상의시료를측정할수있다. 세계각국의유방염진단연구소나유업체에서는이미 오래전부터이장치를설치운용하고있어목장의집합유(Bulk milk) 와젖소개체별우유에대한검사를실시하고있으나경제적인면에서매우제한적이다. 가) 포소매틱(Fossomatic) (1) 원리 우유중체세포에형광물질인 Ethidium bromide 로염색시켜일정량을디스크(Disk) 에도포시켜순간적으로통과되는체세포를할로겐램프로측정하는자동형광현미경법 이다. 최근에는일정한속도로흐르는관에빛을비추어염색된세포의수를측정하 는 Flow cytometry method 를이용한다. (2) 시약및재료 ( 가) 우유약 10 ml ( 나) 시약준비 1 Dye buffer basic solution (14,500 샘플측정용) 가 40 50 로가열된증류수 1 L에 Ethidium bromide 2.5g를완전히녹인 다. 나 Triton X-100 50 ml과 Fossomatic buffer powder 415 g를 4 L 증류수로 완전히녹인후총 유효기간은 5 L 이되게한다( 햇빛과공기가통하지않게보존하면 90 일정도이다). 2 1% Triton X-100 Solution 가 Triton X-100 10 ml를 1 L 증류수에넣은후 60 에가온하여녹인다 ( 햇빛과공기가통하지않게보관하면유효기간은 60 일정도이다). 3 Working solution( 유효기간 2-3 주) 가 Dye buffer Basic solution을증류수로 10 배희석하여사용한다. 나 Cleaning solution : 1 % Triton X-100 10 ml과암모니아수 5 ml를 10 L 증류수에넣어사용한다. - 73 -
다 Zero solution : NaCl 4 g를증류수 1 L에녹인후 Triton X-100 1 ml을 가하여사용한다( 밀봉하여건조한곳에서보관). (3) 방법 ( 가) Fossomatic을 15분간 Stand by 한다음 Zero solution으로영점을잡아준 다. ( 나) Prog 및 Enter key를사용하여 Batch 및 Sample number 값을정해준다. ( 다) Sample의체세포수측정은 Auto measure 를사용하여자동으로측정한다. ( 라) 원유가혼합된다음 2.6 ml이주입되고 Ethidium bromide dye solution에 의해체세포가염색되어디스크(Disk) 에도포되어서할로겐램프를이용측 정하게된다. (4) 특징 포소매틱검사법은표 2-4 와같은특징들을가지고있다. Table 2-4 Specifications of Fossomatic system 항목 성능 분석속도 측정범위 300 sample/1 시간 (Fossomatic 300) > 10,000,000 cell/ml 정확도 < 10 % 직접현미경법과상관성 0.96 0.99 오차( 반복성) 4 7 % 우유소비량 2.6 ml 샘플온도 30 40 염색액소비량 세척액소비량 2,700 sample/10l 500 sample/10l 나) 소마카운터(Somacount) - 74 -
(1) 원리 우유중의세포를형광물질인 Ethidium bromide로염색시켜일정량을레이저빔으 로체세포를측정하는 Flow cytometric method 를이요한장치이며, Foss Electric의 FM 500/SAYS 6000 등이이방법을이용한다. (2) 시약및재료 ( 가) 우유 ( 나) Dye stock solution 50 로데운증류수 100 ml에 Ethidium bromide 2.5 g를완전히녹여사용한다 ( 햇빛과공기가통하지않게냉장고에보관하면유효기간은 60 일이다). ( 다) Buffer stock solution 50 로데운증류수 950 ml에완충분말 1책을완전히용해시킨후 Triton X-100 10 ml를첨가하여햇빛이차단된진공용기에냉장고에서 60 일정도보관하다. ( 라) Working solution 증류수 8,900 ml에 Dye stock solution 100 ml를첨가하고여기에 Buffer stock solution 1 L 을섞어서완전히용해시킨다. ( 마) Carrier fluid (RBS 2 % solution) * 상기시약은상온에서제조일로부터약 3 주를넘지않도록해야한다. (3) 방법 가검우유약 4 ml이형광염색액 4 ml과자동으로기계에의하여혼합염색 된다. 염색된체세포는레이저빔에의해자동으로판독된다. (4) 특징 소마카운터검사법의표 2-5 와같은특징들을가지고있다. - 75 -
Table 2-5 Specifications of Somacount system 항목 분석속도 성능 300 sample / 1 시간 (Somacount 300) 측정범위 0 20,000,000 cell / ml 정확도 < 10 % 직접현미경법과상관성 > 0.96 오차( 반복성) < 5 % 우유소비량샘플온도염색액소비량세척액소비량 4 ml 실온 3 ml / 1 sample 200 ml / 1 sample 다. 국내원유체세포수분포도조사 원유시료는한국식품연구원과협조하여대부분 2006년 6월 ~ 12월경에낙농농가 에서수집한시료를중심으로체세포수의범위가 1등급 ~ 5등급까지각등급별의시 료를포함하도록수집하였다. 본연구에서는서울우유지도소에의뢰하여표준화된체세포수검사장비인체세포 수시험기(Somacount, Bently Instrument, USA) 를이용하여체세포수를측정하였다. 측정된원유는표 2-6과같이전체시료 550점중 272 점(49.5 %) 이 1 등급, 115 점(20.9 %) 이 2 등급, 66 점(12 %) 이 3 등급, 44 점(8 %) 이 4 등급, 53 점(9.6 %) 으로나타나고품 질의원유가생산되고있음을알수있다. - 76 -
Table 2-6 Grade of somatic cell count tested Grade Somatic cell count Number of samples Rate (%) 1 grade < 200,000 272 49.5 2 grade < 350,000 115 20.9 3 grade < 500,000 66 12 4 grade < 750,000 44 8 5 grade 750,000 53 9.6 Total 550 100 2. 원유체세포수측정을위한원유시료전처리조건설정 수집된원유시료는서울우유지도소에서체세포수시험기로체세포수를측정한후 성균관대학교에서 1 일이내스펙트럼을측정하였다. 저장환경의변화는미생물, 효소 등의번식을유발하여체세포수예측성능에영향을미친다. 그러므로본연구에서는 미생물의번식을억제하는보존제의광학적특성을구명하기위하여표 보존제처리한원유와처리하지않은원유시료를임의로수집하였다. 2-7과같이 - 77 -
Table 2-7 Somatic cell count for milk condition tested Somatic cell count Number Ave. Max. Min. Std. Raw Methyl red Methylene blue Bromcresol purple Phenol red Resazurin Eosin-Y Amido black Fresh 73 228,705 1,305,000 15,000 247,132 Preserved 50 228,705 2,789,000 21,000 554,868 Fresh 49 292,522 298,000 35,000 466,598 Preserved 50 292,522 2,789,000 21,000 554,868 Fresh 49 292,522 298,000 35,000 466,598 Preserved 50 292,522 2,789,000 21,000 554,868 Fresh 49 292,522 298,000 35,000 466,598 Preserved 50 292,522 2,789,000 21,000 554,868 Fresh 49 253,475 954,000 12,000 266,066 Preserved 45 253,475 1,105,000 9,000 224,085 Fresh 49 253,475 954,000 12,000 266,066 Preserved 45 253,475 1,105,000 9,000 224,085 Fresh 49 292,522 298,000 35,000 466,598 Preserved 50 292,522 2,789,000 21,000 554,868 Fresh 49 253,475 954,000 12,000 266,066 Preserved 45 253,475 1,105,000 9,000 224,085 미생물, 효소등의번식을억제하기위한보존제(Broad spectrum micro tabs Ⅱ) 는 1정제당 8 mg 의 Myacide pharma BP 및 0.3 mg Natamycin 이함유되어있으며원 유 40 ml당 1 정제를넣어처리하였다. 보존제처리한원유와처리하지않은원유에 대한첨가시약의사용가능성을알아보기위하여그림 사용되는 2-1과같이염료환원시험법에 Methyl red, Methylene blue, Bromcresol purple, Phenol red, Resazurin의 시약, 조직표본염색에사용되는 Eosin-Y 시약, 전기영동시단백질염색에주로이용 되는 Amido black 시약을원유에첨가하여가시광선/ 근적외선영역의고성능분광광 - 78 -
도계(NIRS 6500, FOSS, Denmark) 로 400 ~ 2500 nm 영역에서 2 nm 간격으로반사 스펙트럼을측정하였다. 스펙트럼측정은원유시료의온도에의한영향을최소화하 기위하여시료의온도를 40 로유지하였고( 김재민, 2004) 원유와반응시약이충분 히반응하도록반응시간을 5 분으로하였다. 측정된스펙트럼의 50 % 를교정부로분류 하여체세포수와의상관관계(R) 를구하였으며나머지 50 % 의데이터를이용하여예 측성능을검증하였다. 상관관계는상용프로그램인 Unscrambler(CAMO, Norway) 의 PLS(Partial least square) 를이용하여분석하였다. Fig. 2-1 Flow chart of experiment method for milk condition. 그림 2-2는보존제처리한원유시료에시약을첨가하여측정된반사스펙트럼으로 첨가시약에따라 400 ~ 800 nm 의가시광선영역에서차이를보이고있으며, 이는첨 가시약의원래색이시약의첨가에의해원유시료의색을변하게했음을알수있 다. 시약첨가가원유시료의체세포수예측성능에미치는광학적특성을구명시 가시광선영역의특성변화를확인하는것이다른파장영역에비해비교적중요할 것으로판단된다. - 79 -
Fig. 2-2 Reflectance spectra of visible/near-infrared spectrum for milk with reductive reagents. 원유의처리조건을선정하기위하여표 2-8과같이보존제처리한원유와처리하 지않은원유에대하여예측모델을개발하였다. PLS 모델을개발한결과전체적으로 보존제처리한원유시료의상관계수가높게나타났는데, 이것은체세포수측정시 환경조건과스펙트럼측정시의환경이다소차이가있기때문이며보존제를첨가한 경우체세포수측정환경이유지되어환경변화에대한오차를최소화하였기때문으로 판단된다. 또한시약을첨가하지않은원유시료보다시약을첨가한시료의상관관계 가상대적으로높게나와스펙트럼을이용한예측모델개발시첨가시약의사용가 능성을제시하였다. 보존제처리한원유시료에 Methyl red를첨가하여 400 ~ 600 nm영역에서모델을개발한결과교정부상관계수는 0.90, 교정부오차는 35,088 개, Methylene blue의경우 500 ~ 800 nm영역에서교정부상관계수 0.89, 38,382 개, Resazurin의경우 400 ~ 700 nm영역에서교정부상관계수 0.98, 교정부오차 25,314 개, Amido black의경우 400 ~ 700 nm에서교정부상관계수 0.94, 교정부오차 26,322 개로높은교정결과를보이고있다. - 80 -
Table 2-8 PLS results of calibration for each milk condition Somatic cell count Calibration Wavelength N Factor R SEC Raw Methyl red Methylene blue Bromcresol purple Phenol red Resazurin Eosin-Y Amido black Fresh 400~700 45 5 0.51 123,037 Preserved 400~700 30 3 0.79 334,994 Fresh 400~800 29 11 0.56 110,636 Preserved 400~600 30 16 0.90 35,088 Fresh 700~900 29 2 0.50 84,847 Preserved 500~800 30 13 0.89 38,382 Fresh 600~800 29 3 0.52 87,771 Preserved 400~800 30 12 0.82 301,449 Fresh 800~1200 29 4 0.55 78,993 Preserved 400~900 25 13 0.84 29,399 Fresh 900~1200 29 3 0.58 79,311 Preserved 400~700 25 15 0.98 25,314 Fresh 500~700 29 7 0.53 92,368 Preserved 400~600 30 14 0.76 56,502 Fresh 900~1100 29 5 0.59 103,861 Preserved 400~700 25 11 0.94 26,322 전체적인체세포수의예측모델은첨가시약에따른색상변화를고려하여 400 ~ 800 nm 의가시광선영역에서개발하였으며미지의시료를이용하여검증한결과표 2-9와같이보존제처리한원유시료에 Methyl red를첨가하여검증한결과검증부 상관계수는 0.79, 검증부오차는 122,978 개, Methylene blue의경우검증부상관계수는 0.80, 검증부오차는 99,732 개, Bromcresol purple의경우검증부상관계수는 0.60, 검 증부오차는 221,438 개, Phenol red의경우검증부상관계수는 0.62, 검증부오차는 213,140 개, Resazurin의경우검증부상관계수는 0.80, 검증부오차는 100,111 개, - 81 -
Eosin-Y의경우검증부상관계수는 0.68, 검증부오차는 157,617 개, Amido black을첨 가하였을경우검증부상관계수는 0.81, 검증부오차는 98,786개로예측되어전체적으 로낮은검증결과를보이고있는데, 이것은모델개발시사용된시료의수가적어예 측모델이미지의시료를검증하기에는어려운것으로판단된다. 본연구에서는상대 적으로상관관계가낮은 Bromcresol purple, Phenol red, Eosin-Y 시약은향후실험 에서제외하였으며, 스펙트럼을이용한체세포수예측모델의성능을높이기위하여 수집된원유시료에보존제를첨가하였다. Table 2-9 PLS results of prediction for each milk condition Somatic cell count Prediction N R SEP Raw Methyl red Methylene blue Bromcresol purple Phenol red Resazurin Eosin-Y Amido black Fresh 28 0.30 150,010 Preserved 20 0.36 422,623 Fresh 20 0.59 91,602 Preserved 20 0.79 122,978 Fresh 20 0.34 115,837 Preserved 20 0.80 99,732 Fresh 20 0.38 135,761 Preserved 20 0.60 221,438 Fresh 20 0.37 213,451 Preserved 20 0.62 213,140 Fresh 20 0.41 100,317 Preserved 20 0.80 100,111 Fresh 20 0.35 152,753 Preserved 20 0.68 157,617 Fresh 20 0.43 105,165 Preserved 20 0.81 98,786-82 -
3. 원유체세포수측정을위한첨가시약의환경조건설정 원유시료에혼합되는첨가시약은체세포염색을목적으로하는시약으로염색시 반응시간은중요한요인이다. 염색이시간이길면효과가뚜렷하지만너무길게되 면지나치게염색되어분석결과에안좋은영향을미치게된다. 그러므로본연구에 서는첨가시약과보존제처리한원유의반응시간에따른광학적특성을구명하기위 하여그림 2-3과같이 0 분, 5 분, 10분의반응시간을두어 Methyl red, Methylene blue, Resazurin, Amido black의시약과반응한후 400 ~ 2500 nm의반사스펙트럼 을측정하여체세포수예측성능을평가하였다. Fig. 2-3 Flow chart of experiment condition for reaction time with reductive reagents. 첨가시약의반응시간을구명하기위하여표 2-10과같이방부제처리한원유시료 를수집하였고평균체세포수는 0 분, 5 분, 10분의반응시간에대하여각각 75,658 개, 743,725 개, 185,216개로나타났으며반응시간이 0분인경우는시약을원유와첨가하 는동시에스펙트럼을측정하였다. Table 2-10 Somatic cell count for each reaction time Reaction reagent Reaction time Number Ave. Max. Min. Std. Methyl red, Methylene blue, Resazurin Amido black 0 Min. 60 75,658 487,000 10,000 92,765 5 Min. 140 743,725 1,749,000 8,000 554,868 10 Min. 140 185,216 861,000 18,000 209,629 반응시간에따른가시광선/ 근적외선영역의스펙트럼은그림 2-4와같이 0, 5, 10분 - 83 -
으로시간이지남에따라특히 400 ~ 800 nm 가시광선영역에서흡광도가증가하는 것을알수있다. 시간이지남에따라원유시료와첨가시약의혼합시료의색이점 점옅어지는것으로, 체세포와시약의반응이진행되고있음을알수있다. Fig. 2-4 Reflectance spectra of visible/near-infrared spectrum for milk with resazurin. 첨가시약의반응시간에따른체세포수예측성능을구명하기위하여표 2-11과같 이 PLS 방법을이용하여체세포수와의상관관계를구하였으며미지의시료를이용하 여검증결과반응시간이 5 분인경우가가장좋은검증력을보여주고있다. 반응시 간을 5분으로하여예측모델을개발한결과 Methyl red의경우 500 ~ 800 nm영역 에서교정부상관계수 0.88, 교정부오차 138,887 개, Methylene blue의경우 400 ~ 800 nm영역에서교정부상관계수 0.90, 교정부오차 129,978 개, Resazurin의경우 500 ~ 800 nm영역에서교정부상관계수 0.93, 교정부오차 90,304 개, Amido black의경 우 400 ~ 700 nm영역에서교정부상관계수 0.92, 교정부오차 89,611개로좋은상관 관계를보여주고있다. - 84 -
Table 2-11 PLS results of calibration for each reaction time Somatic cell count Calibration Wavelength N Factor R SEC Methyl red. 400~800 35 8 0.51 225,685 0 Min. Methylene blue 500~800 35 9 0.55 122,535 Resazurin 700~1100 35 8 0.68 122,588 Amido black 500~800 35 7 0.76 118,758 Methyl red. 500~800 80 11 0.88 138,887 5 Min. Methylene blue 400~800 80 14 0.90 129,978 Resazurin 500~800 80 10 0.93 90,304 Amido black 400~700 80 11 0.92 89,611 Methyl red. 400~700 90 13 0.61 252,557 10 Min. Methylene blue 500~900 90 15 0.64 276,352 Resazurin 400~800 90 11 0.67 233,453 Amido black 400~900 90 14 0.70 244,658 전체적인검증결과는표 2-12와같이 Methyl red의경우검증부상관계수 0.72, 검증부오차 170,112 개, Methylene blue의경우검증부상관계수 0.72, 검증부오차 167,040 개, Resazurin의경우검증부상관계수 0.82, 검증부오차 147,191 개, Amido black의경우검증부상관계수 0.80, 검증부오차 135,603개로개발된모델의성능에 비하여다소낮은검증결과를보여주고있다. 본연구에서는보존제를첨가한원유 시료와첨가시약의반응시간을 5분으로설정하였으며모델의체세포수예측성능을 높이기위해서는반응시약의선정및수학적전처리를통한예측모델이필요할것 으로판단된다. - 85 -
Table 2-12 PLS results of prediction for each reaction time Somatic cell count Prediction N R SEP Methyl red. 35 0.50 285,255 0 Min. Methylene blue 35 0.52 144,255 Resazurin 35 0.65 135,254 Amido black 35 0.59 157,341 Methyl red. 80 0.72 170,112 5 Min. Methylene blue 80 0.72 167,040 Resazurin 80 0.82 147,191 Amido black 80 0.80 135,603 Methyl red. 90 0.55 378,422 10 Min. Methylene blue 90 0.59 344,312 Resazurin 90 0.64 203,334 Amido black 90 0.54 390,181-86 -
제 3 절원유성분조성측정을위한전처리기술개발 1. 국내원유성분조성분포도조사 가. 원유의성분조성 고품질우유란풍미가좋고단백질, 지방과같은우유성분함량이풍부하고세균수 와체세포수가적은신선한우유를말하며우유의품질에영향을미치는유성분으로 는체세포수와더불어성분조성이수분, 지방(Fat), 단백질(Protein), 총고형분(Total solids, TS), 유당(Lactose) 등이있으며, 정상원유에표 3-1과같이지방은 3.5 %, 단백질은 3.6 %, 유당은 4.9 %, 총고형분은 12.4 % 정도가포함되어있다. Table 3-1 Properties ratio of milk Property Ratio(%) Fat 3.5 Protein 3.6 Lactose 4.9 Total solids 12.4 원유에함유된수분은정확하게말하면수분활성도라하여원유의식품기술적인측 면에서중요한요소이다. 원유에서수분은가장중요한희석제이며, 원유의물리적, 화학적및미생물학적변화에큰영향을미친다. 원유의지방은리놀레산(Linoleic acid) 과같이인체에서합성되지않는필수지방산과지용성비타민(A, D, E, K) 의공 급원이며원유의풍미와물성학적특성에있어큰영향을미친다. 소의개체능력을나타내는지표로유가를산출하는데기준이되며, 산유량과함께젖 규격상적부의확 인에이용되어부정우유(Adulteration milk) 등의판정한다. 또한젖소의건강상태와 질병의진단에이용되고있다. 원유의단백질은칼슘공급원일뿐만아니라식품단백 질중에서가장우수한것중에하나이다. 비타민을운반하며차원높은생리작용으 - 87 -
로골다공증예방을한다. 또한숙면에도움이되고혈압을낮춰주는요소도포함하 고있다. 현재에는원유의유대지급기준으로지방과함께원유성분조성의대표적인 성분이다. 유당은사료의종류, 유방감염그리고특히비유기에따라변화한다. 발효 유제품의제조에필수적인구성분이며, 영양을제공한다. 그러나성인기에있는비유 럽인은유당을일부, 또는전혀소화시키지못하여유당불내증이되기도한다. 총고형 분은원유에서수분을제외한나머지성분으로수분을측정하여총고형분의함유량을 측정하게된다. 나. 1) 현행성분조성검사법 지방측정방법 가) Babcock법 미국의 Babcock에의해고안된유지방측정법으로시료에진한황산을가한후원 심력에의하여지방을분리하는것으로진한황산은지방이외의원유중의성분을 용해하고그때발생하는고열로지방을액상화하여다른액체와비중차이를크게 한다. 분리된지방층을일정온도에서유지시키면지방층의부피가바로무게백분율 (%) 로표시하게된다고한다. (1) 시약및재료 ( 가) 원유시료용 17.6 ml 피펫 ( 나) 황산용기자동뷰렛또는시료채취용 17.5 ml의 Dipper나 17.5 ml의피펫 ( 다) 항온수조(Water bath) ( 라) 디바이더(Divider) ( 마) 원심분리기(Centrifuge) ( 바) 시약 : 황산(20 에서비중 1.82 1.83 이고, 황산함량 90.05 92.10 %) ( 사) 기타 : 연수를사용한증류수, 기구세척용알칼리세제 (2) 방법 ( 가) 원유용피펫으로잘혼합된원유시료 17.6 ml 를취하여시험관에넣는다. - 88 -
이때피펫에남아있는것도불어서떨어뜨린다. ( 나) 시료가들어있는시험관을약간기울이고황산 17.5 ml를조용히벽을따 라흘러들어가도록혼입한다. ( 다) 회전운동(Rotary motion) 이되도록시험관을흔들어원유와황산을잘혼 합하고일시적으로생긴 Curd 를완전히용해시킨다.( 이때황산의농도가 적당하면처음에는갈색으로되었다가서서히흑갈색으로변화된다. 처음부 터흑색으로변화되는것은황산이너무강하거나시료등의온도가너무 높았기때문이다.) ( 라) 시료와황산이잘혼합된시험관을약 55 이상으로보온된원심분리기 (Centrifuge) 에대칭으로놓는다. ( 마) 원심분리(Centrifuging) 는 5 분, 2 분, 1분의 3 차례실시하되, 첫 5분회전후 60 의온수를시험관의목(Neck) 눈금아래까지첨가하고다시 2분회전 한후지방층이눈금범위까지떠오르도록온수를첨가하고다시 심분리를한다. 1분간원 ( 바) 시험관을꺼내서 55 60 의온수조에 2 3분간두었다가 Divider로 지방층의최하단에서 Meniscus 의최상단까지읽으면지방율을알수있다. 나) Gerber법 우유의지방은타유성분보다비중이낮아 (15, 0.93) 황산으로단백질, 유당을 분해시킨후이소아밀알콜로지방의분리를촉진시켜원심분리하여그용량으로지방 량을표시하는방법이다. Gerber 법은시료를 11 ml 취하는데이때 0.1 ml 는피펫의내벽에묻고, 10.9 ml 가유지계에담긴다. 이를우유의평균비중 1.032로환산하면 11.25 g (10.9 ml 1.032 g / ml) 이되고, 60 부근에서의지방의비중은 0.9 g이되므로 1 ml는 0.9 g 에해당된다. 0.9 g 100 / 11.25 g = 8 % 즉, 지방 0.125 ml는우유의유지방 1 % 에상당한다. - 89 -
(1) 방법 ( 가) Gerber 유지계에황산( 비중 1.82 ~ 1.825, 순도 90 ~ 91 %) 을분주한다. ( 나) 11 ml 를피펫으로시료를취한후, 유지계내벽을따라황산과직접섞이 지않도록넣는다. ( 다) 이소아밀알콜 ( 비중 0.815, 비점 128 ~ 130 ) 1 ml를가한후소량의증 류수로유지계입구를세척한다. 이때증류수를가함은원심분리시유지계 의눈금부위에지방층이오도록하기위함이니적당량을가한다. ( 라) 보안경및장갑을착용하고유지계마개를막고, 손으로쥐어시료가황산 에완전히분해되도록흔들어준다. ( 마) 50 ~ 60 수욕조에 15분간담근후 1100 rpm 에서원심분리한다. ( 바) 유지계눈금의지방량(%) 을읽어준다. (2) 주의사항 ( 가) 황산및시료의온도는 15 ~ 20 로하며, 시료는시험직전잘혼합시 킨다. ( 나) 유지계를흔들때마개가빠지지않게유의한다. ( 다) 유지계마개의고무속에는유리구슬 1개가있으므로유지계손잡이를너 무세게누르지않는다. ( 라) 유지계및마개는세척과건조를잘하여사용한다. 다) Rose-Gottlieb 법 ( 마조니아법) 물을가하면액상또는유상을나타내는식품에적용하여지질함량을측정하는방 법인데생우유, 가공우유, 연유류, 탈지유, 분유류, 크림류등의유제품이외에도두 유같은유상식품이있다. 지방구를보호하고있는지방구막을암모니아로분산시켜 유리하는지방을암모니아성알코올용액으로부터에틸에테르또는석유에테르로추 출하는방법이다. - 90 -
(1) 시약및재료 ( 가) 피펫 : 10 ml, 2 ml ( 나) 항온건조기 : 99±1 로조절할것 ( 다) 화학천칭 : 감도 0.1 mg의것 ( 라) ( 마) 항온수조 데시케이터 ( 바) Rohrig 관 : Reiter 관또는 Mojonnier 관 ( 사) 28 % 암모니아수 ( 아) ( 자) 석유에테르 에틸에테르 ( 차) 95 % 에틸알코올 ( 카) 세척건조한 250 ml 코니칼비커 (2) 방법 ( 가) 시료검체 2 ~ 5 g 을정밀하게단다. ( 소수네자리까지) ( 나) 증류수를가하여시료와증류수의양이 11 ml 내외가되게하고 40 ~ 50 로가온시켜시료를증류수와혼화시킨다. ( 다) 암모니아수 1.5 ml( 시료가산성인경우 2 ml) 를가한후혼화시킨다. ( 라) 에틸알코올 10 ml 를가한후섞는다. ( 마) 에틸에테르 25 ml 를가한후, 주입구를막고가볍게흔든후, 조심하여에 테르증기를날려보낸다. ( 바) 다시입구를막고약 1 ~ 2 분정도강하게흔들어준다. ( 사) 석유에테르 25 ml를가하고 1 ~ 2 분세게흔들어준다. ( 아) 코니칼비커위에여과기, 여과지를넣고무수황산나트륨( 수분탈취용) 약 2 ~ 3 g 을넣고마조니아관상등액을 ( 에테르추출물) 붓는다. ( 자) 다시에틸에테르, 석유에테르각 15 L 씩을가하여강하게진탕후위의 조작을 3 ~ 5 회반복한다. ( 차) 다음에틸에테르및석유에테르동량혼합액체로주입관의주입구, 여과 - 91 -
지등의지방잔량을깨끗이씻어코니칼비커에합친다. ( 카) 수욕중에서용매{( 에틸에테르) + ( 석유에테르)} 를날려보낸다. ( 이때여 액을받는용기의주입구가작으면시간및, 화재의염려에주의하면서, 용 기바닥에끓는방울이생기기시작하면즉시불꽃을작게조절하면서날 려보낸다. ( 타) 코니칼비커를건조기에넣고항량이될때까지건조한후식 (3-1) 과같이 조지방을산출한다. 조지방 식 (3-1) S : 검체의채취량(g) W1 : W2 : 빈코니칼비커무게(g) 조지방추출후건조시킨코니칼비커무게(g) 2) 단백질분석법 총질소를정량할때에는 Kjeldahl 법을이용하는것이보통이며, Kjeldahl법에는 Macro 법, Semi-micro 법, Micro법등이있으나이중에서정량방법이간편한 semi-micro 법이널리이용되고있다. 가) Semi-micro Kjeldahl법 (1) 시약및재료 ( 가) Kjeldahl ( 나) Kjeldahl 분해관 분해장치 ( 다) ( 라) 버너 피펫 ( 마) 뷰렛 : 25 50 ml용 ( 바) 농황산 ( 사) N/10 HCl 또는 N/20 H 2 SO 4-92 -
( 아) 40 50 % NaOH액 ( 자) 4% 붕산액(boric acid) ( 차) 분해촉매 : CuSO 4, 5H 2 O 1 g에 K 2S O 4 9 g을섞은것 ( 카) 혼합지시약(Brunswick's reagents) methyl red 0.1 g 및 methylene blue 0.1 g을 200 ml 의에탄올에녹여서갈색병에보관한다. (2) 시험방법 시료 0.5 2 g( 단백질로서 0.05 0.2 g 상당량), 농황산 5 7 ml, 분해촉매약 2 3 g 및작은유리알을 Kjeldahl 분해관에취하고처음 5 10분간약한불로 서서히가열한다. 다음수시간동안격렬히가열하여청색또는무색투명하게되면 실온에서냉각시킨다. 4 % 붕산액 10 ml를 15 ml 삼각플라스크에취하고혼합지시 약 3 4 방울떨어뜨린다음냉각관의끝이붕산액속에잠기게고정한다. 분해시료 를증류장치내에주입하고소량의증류수로 3 4회분해관을씻어서넣어 50 % NaOH액 10 15 ml 를가하고신속히입구를막고증류한다. 증류액이 80 100 ml 정도되면냉각관끝을소량의증류수로씻어놓고잠시동안증류액수 ml를 더받은다음 N/10 HCl액또는 N/20 H 2SO 4 액으로적정하여본래의색깔인적자색이 될때까지의소요량을구하여식 (3-2) 에의해단백질량을산출한다. 단백질 또는 식 (3-2) a : N/10 HCl 또는 N/20 H2SO4 의소비(mL) F : N/10 HCl 또는 N/20 H2SO4의역가 W : 시료채취량(mg) 3) 유당분석법 가) Lane-Eynone법 (1) 시약및재료 ( 가) Buret : 50 ml용 ( 나) 전기히터 - 93 -
( 다) Fehling 용액 A : CuSO 4, 5H 2 O 34.639을용해시켜총량이 500 ml이되게 한다. ( 라) Fehling 용액 B : Sodium potassium tartrate(rochelle 염색) 173 g 및 NaOH 50 g를증류수에용해시켜 500 ml이되게한 다. ( 마) Methylene blue 용액 (2) Fehling 용액 A의역가검정 삼각플라스크에 Fehling 용액 A 10 ml를정확히취하고증류수 40 ml를가한후 30 % 초산(Acetic acid) 4 ml 및 50 % KI 용액 6 ml를가하여유리되는옥도를 1 % 전분시액을지시약으로하여 N/10 Sodium thiosulfate 액으로적정한다. N/10 sodium thiosulfate 1 ml은 6.354 mg 의동에해당되며, 이에의하여 A 액 100 ml 중에함유된동의양을산출한다. 이동의양을 174.8 mg로나눈값은 Fehling 용액 A 의역가로한다. 역가 소비 (3) 시험방법 시료일정량( 유당약 0.5 g 상당량) 을 200 ml 용메스플라스크에취하고, 증류수로 200 ml 되게희석한다. 별도로 200 ml용삼각플라스크에 Fehling용액 A 및 B 각 5 ml, Fehling 용액이담긴플라스크를놓고가열하여끓기시작하면뷰렛의시료를적 하하여적정예정량의대부분을가하고, 이용액의청색이거의손실될때까지가열 한후 Methylene blue 지시약 4방울을가하고청색이완전히손실될때까지계속적 정한다. 이때의적정은 3 분이내에끝나도록한다. 적정예정량을정하기위해예비실험을실시하여, 이예비실험에의해시료의희석 정도를결정한다. 즉, 소요적정액이 25 35 ml 되도록희석정도를조절한다. 유당 량은 Lane-Eynone 유당정량표에의하여희석시료 100 ml 중의유당량을구해 Fehling용액 A 의역가를곱해보정하고식 (3-3) 과같이시료 100 g 당의유당량을 구하여유당 % 로한다. - 94 -
유당 식 (3-3) a : 시료 100mL 중의유당량 F : Fehling용액의 A의역가 n : W : 희석배수 시료채취량(g) 나) Bertrand법 (1) 시약및재료 ( 가) Wit 여과장치및 Glass filter(15g 3 ) : Glass filter의여과판상에 Gooch 여과 ( 나) 뷰렛 : 25 50 ml용 기용석면을흡입시킨다. ( 다) CuSO 4 5H2O 용액(A 액) : CuSO 4 5H2O 40 g을증류수에녹여전량을 1 L 로한다. ( 라) 알칼리성 Rochelle 염액(B 액) : Potassium sodium tartrate(rochelle 염, C 4H 6O 6KNa 4H2O) 200 g과 NaOH 150 g 을증류수에녹여 를먼저녹인다 ). 1 L 가되게한다(NaOH ( 마) Fe2(SO 4) 3 용액(C 액) : Fe(SO 4) 3 NH2O(n<1) 50 g과농황산 200 g을물에 녹여전량이 1 L 되게한다. ( 바) KMnO 4 용액(D 액) : KMnO 4 5 g을증류수에녹여전량을 1 L 로하며, 2일 간실온에서방치하고 Glass filter(3g 3 ) 로여과하여착 색병에보존한다. (2) KMnO 4 액의역가 C 2O 4(NH 4) 2 H 2 O 0.25 g을증류수 100 ml에용해시키고농황산 2 ml를가한후 60 70 로가온하고뷰렛으로부터 MnO4액을적정하여미홍색이되게한다. 여기에 - 95 -
소비된 KMnO 4 액의양을 a ml 라하면, 그 1 ml는동 0.2238 g/a 에해당한다. (3) 시험방법 150 200 ml 삼각플라스크에시료 20 ml( 예비실험에의하여 20 80 mg의환 원당에상당하게시료를희석한다.) 를취하고, 여기에 CuSO 4 액과 Rochelle염액을각각 20 ml씩흔들면서가하고가열하여 3 분간끓이고방냉한다. 이때상등액이청색을 나타내지않으면환원당의양이많으니더욱희석하여야한다. 삼각플라스크중의상 등액을경사하여서서히여과하고, 더운물 50 ml를플라스크내벽을따라붓고플라 스크를흔들어침전을현탁시키고, 잠시방치한후침전이완전히되면상등액을전 과같이여과한다. 이조작을수회반복하여영액에알칼리반응이일어나지않을때 까지계속한다. 이때침전물 (Cu 2 O) 이공기와접촉되지않게주의하면서경사여과하여야한다. 다 음 Fe 2(SO 4) 2 용액약 20 ml 를삼각플라스크에가하고, 침전물을녹여새로운수기에 그여과액을받고증류수로삼각플라스크및여과기를수회반복하여세척하여그세 액을여과액과합친다음에 KMnO 2 액으로적정하여미적색이 30 초간지속하게한다. 이적정량으로부터시료일정량중의 Cu 2 O 의양(mg) 을구하여 Bertrand 당류정량표 에의하여식 (3-4) 와같이당량(mg) 을산출한다. 식 (3-4) V : KMnO4 적정량 F : KMnO4 액의역가[KMnO4 1 ml에해당되는 Cu 량(mg)] 다) Chloramin T법 (1) 시약 ( 가) Na 2WO 4 용액 : Na 2WO 4 2H2O 7 g을증류수 870 ml에녹이고 H 2PO 4(88 ( 나) Chloramin T 용액 : 0.04N(5.7 g/l) ( 다) 0.04N Na 2S 2O 3 용액 %) 0.1 ml, 1N-H 2SO 4 70 ml 를가한다. - 96 -
( 라) 10 % KI용액 ( 마) 1 % 전분지시액 (2) 시험방법 시료 10 ml를 100 ml 메스플라스크에취하고증류수 25 ml 및 Na 2WO 42H 2 O용액 40 ml를가하고혼합한다음증류수를가하여전량을 100 ml 로한다. 잘혼합하여 여과하고여액 10 ml 를삼각플라스크에취하고, 10 % KI 용액 5 ml 및 chloramin T 용액 20 ml를혼합한다음마개를막아냉암소에서 90 분간방치한다. 다시 2N 염 산액 5 ml를가하고전분시액을지시약으로 0.04N Na 2 S 2 O 2 액으로적정한다. 별도로시료를넣지않고동일한방법으로바탕시험을행하고유당은식 이용하여구할수있다. (3-5) 를 유당 식 (3-5) Vo : 바탕시험소비량(mL) V : W : 본시험소비량(mL) 시료채취량(g) 라) HPLC법 (1) 표준용액의조제 과당, 포도당, 설탕, 유당등의표준품을각각 100 ml 메스플라스크에정밀하게칭 량하여물 50 ml로용해한다음 Acetonitrile로 100 ml 로조절한다. (2) 시험용액의조제 시료약 5 g을 50 ml 메스플라스크에정밀히칭량하여물 2 5mL를가하여용해한 다음 Acetonitrile로 50 ml 로조절한다. 이시험용액을 45 μm의 Membrane filter로 여과한것을시험용액으로한다. (3) 시험방법 ( 가) HPLC의운전조건 1 Column : 길이 30 mm, 내경 4 mm, μ-bondpak/carbohydrate 혹은그와상 - 97 -
당하는 column 2 3 4 검출기 : RI detector 이동상 : 물 - Acetonitrile(17 : 83, V/V) 유속 : 1.0 ml/min 5 ( 나) Column 온도 : 정량시험 실온 시험용액및표준용액각각 10 μl씩주입하여얻은피크의넓이혹은높이를구하 여검양선작성한후시험용액의당농도( μg/ml) 를구하고식 (3-6) 에의해시료중 당의함량(mg/100 g) 을산출한다. 당함량 시료의양 식 (3-6) S : a : b : 시험용액중당의농도( μg/ml) 시험용액의전량(mL) 희석배수 4) 수분측정법 가) 상압건열법 (1) 실험재료 ( 가) 칭량병 : 직경 5 cm 내외의공전칭량병으로서유리제품또는알루미늄제 품 ( 나) 항온건조기 : 정밀전기정온식으로 102±2 로조절가능한것과 135±2 로조절가능한것 ( 다) 데시케이터(Desiccator) : 새로이작열하여냉각시킨무수 CaCl 2 또는황산 ( 라) 화학천칭 : 감도 0.1 mg의것 을건조제로사용한것 (2) 시험방법 정제해사 15~20 g 및작은유리봉을칭량병에넣고건조기에서항량이될때까지 - 98 -
건조시키고이칭량병에시료 2~ 5 g을취하고 102±2 또는 135±2 의항온건조기에 서 3~5시간또는 1시간건조시킨후데시케이터에서방냉시킨다음신속히칭량하여 항량이될때까지반복건조한다. 액체시료의경우에는수옥상에서때때로유리봉으 로교반하면서예비건조한다음항온건조기에옮기고, 식 (3-7) 에의해수분을산출 한다. 수분 시료채취량 식 (3-7) a : b : 시료와칭량병의무게 건조후시료와칭량병무게 나) 간이법 (1) 실험재료 ( 가) 건조기 : Ultra-X 를사용한다. ( 나) 알루미늄은박지 (2) 시험방법 시료 5 g 을취하고( 눈금 0 에맞춘다) 건조판을일정한높이로고정시킨후규정 된온도와시간( 자체시험에의해보정함) 에서건조시키고가온된상태에서눈금의수 치를수분 % 로한다. 다) 속성법 (1) 실험재료 ( 가) 알루미늄은박지 ( 나) 항온건조기(102±2 로조절가능한것) (2) 시험방법 은박지여지를 102±2 의건조기에서 10분간건조시킨후공기중의수분혼입이 - 99 -
없도록신속히은박지를접은후여지와은박지의무게 (F 1 ) 을재고시료약 3 g을여 지에도포하여신속히무게 (F 2 ) 를재고 102±2 의항온건조기에서 30분간건조시킨 후잠시방냉시킨후다시무게 (F 3 ) 를잰다. 수분은식 (3-8) 에의해산출한다. 수분 식 (3-8) 5) 유성분자동측정기(Milkoscan) 적외선파장범위내에서지방, 단백질, 유당및총고형분이각각고유의특정한파 장에서진동하면서적외선방사에너지를흡수하는현상을이용한자동화된측정기이 다. 가) 성능 유성분자동측정기의성능은표 3-2 와같다. - 100 -
Table 3-2 Specifications of Milkoscan system 항목측정속도측정범위재현성 성능 200, 300, 400 or 500 sample/hr 지방 : 0-15 % 단백질 : 0-10 % 총고형분 : 0-20 % 요소태 : 10-100 mg/dl 구연산 : 0.1-0.5 % 지방, 단백질, 유당 : 0.5 % 총고형분, 무지고형분 : 1.0 % 요소 : 1.5 mg/dl 구연산 : 0.005 % 정확도 지방 : 1.0 % (Bulk milk) 단백질, 유당: 1.0 % (Bulk milk) 총고형분, 무지고형분 : 1.0 % (Bulk milk) 요소 : 3.5 mg/dl (Single cow's milk) 구연산 : 0.015 %(Single cow's milk) 세척률 > 99 % 샘플온도 37-42 다. 국내원유성분조성( 수분, 지방, 단백질, 유당, 총고형분) 분포도조사 원유의성분조성분포조사를위한원유시료는한국식품연구원과협조하여대부분 2007년 6월~12 월경에낙농농가에서수집한시료를사용하였다. 본연구에서는서울우유지도소에의뢰하여표준화된성분조성검사장비인원유성 분시험기(Milkoscan, FOSS FT6000, Denmark) 를이용하여성분조성을측정하였다. 측정된원유의성분조성은표 3-3과같이수분 84.01 ~ 89.71 %, 지방 2.44 ~ 6.42 %, 단백질 2.44 ~ 4.28 %, 유당 3.93 5.24 %, 총고형분 10.29 15.99 % 를포함 한것으로나타났다. - 101 -
Table 3-3 Chemical properties of milk tested (N = 200) Avg. Max. Min. Std. Moisture(%) 87.19 89.71 84.01 0.36 Fat(%) 4.05 6.42 2.44 0.82 Protein(%) 3.35 4.28 2.44 0.41 Lactose(%) 4.74 5.24 3.93 0.24 TS(%) 12.81 15.99 10.29 0.79 라. 원유성분조성측정을위한원유시료전처리조건설정 수집된원유시료는서울우유지도소에서원유성분시험기 (Milkoscan, FOSS FT6000, Denmark) 로성분조성을측정한후성균관대학교에서 1일이내스펙트럼을 측정하였다. 저장환경의변화에의한체세포수의증가는지방, 단백질, 유당, 총고형분 에영향미치게되므로본연구에서는보존제에의한미생물의번식억제가성분조성 예측에미치는광학적특성을구명하기위해원유시료를보존제처리한경우와처리 하지않은경우로나누어실험하였으며, 수집된원유시료의각성분조성은표 3-4와 같이지방 2.57 ~ 6.22 %, 단백질 2.56 ~ 4.32 %, 유당 3.81 ~ 5.08 %, 총고형분 10.56 ~ 15.84 % 의범위를보이고있다. Table 3-4 Chemical properties of milk tested (N = 100) Avg. Max. Min. Std. Fat(%) 4.12 6.22 2.57 0.80 Protein(%) 3.46 4.32 2.56 0.45 Lactose(%) 4.83 5.08 3.81 0.27 TS(%) 12.71 15.84 10.56 0.74-102 -
원유시료보존제처리는체세포수측정실험과동일한방법으로수행하였다. 보존 제처리한원유와처리하지않은원유에대한첨가시약의사용가능성을알아보기위 하여그림 3-1과같이체세포수예측성능이높았던 Methyl red, Methylene blue, Resazurin, Amido black 의시약을사용하였으며, 체세포수측정을위한환경설정실 험과동일한방법으로가시광선/ 근적외선영역의고성능분광광도계를이용하여 400 ~ 2,500 nm 영역에서 2 nm 간격으로반사스펙트럼을측정하였다. 이때원유시료의 온도는 40 로유지하였고, 상관관계는상용프로그램인 Unscrambler의 PLS를이용 하여각각의성분조성의예측성능을분석하였다. Fig. 3-1 Flow chart of experiment method for milk condition. 원유의처리조건을선정하기위해보존제처리한원유와처리하지않은원유에대 하여각성분조성의예측모델을개발하였다. 지방의경우표 3-5와같이보존제처 리를하지않은시료와보존제처리한시료에 Methyl red를첨가한경우모두 1,700 ~ 1,800 nm에서상관관계가있는것으로나타났으며교정부상관계수는각각 0.95와 0.94 로나타났다. Methylene blue의경우 1,700 ~ 1,800 nm에서상관관계가있는것 으로나타났으며교정부상관계수는각각 0.95와 0.96 로나타났다. Resazurin의경우 각각 1,700 ~ 1,800 nm와 1,600 ~ 1,800 nm에서상관관계가있는것으로나타났으 며교정부상관계수는각각 0.96과 0.97 로나타났다. Amido black을첨가했을경우각 각 1,700 ~ 1,900 nm와 1,700 ~ 1,800 nm에서상관관계가있는것으로나타났으며 교정부상관계수는각각 0.97과 0.96으로나타나지방의예측성능은보존제처리의 영향을받지않음을알수있다. 또한시약을첨가하지않은원유시료의상관계수와 유사하여지방의예측성능은첨가시약의영향을받지않음을알수있다. - 103 -
Table 3-5 PLS results of calibration for each milk condition Fat Calibration Wavelength N Factor R SEC Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Fresh 1600~1900 50 5 0.96 0.18 Preserved 1600~1800 50 5 0.96 0.19 Fresh 1700~1800 50 3 0.95 0.14 Preserved 1700~1800 50 3 0.94 0.20 Fresh 1700~1800 50 3 0.95 0.18 Preserved 1700~1800 50 3 0.96 0.17 Fresh 1700~1800 50 3 0.96 0.16 Preserved 1600~1800 50 4 0.97 0.14 Fresh 1700~1900 50 4 0.97 0.16 Preserved 1700~1800 50 3 0.96 0.15 단백질의경우표 3-6과같이보존제처리를하지않은시료와보존제처리한시료 에 Methyl red를첨가한경우각각 1,500~1,800 nm와 1,600~1,800 nm에서상관관계 가있는것으로나타났으며교정부상관계수는각각 0.96과 0.97 로나타났다. Methylene blue의경우각각 1,700~1,800 nm와 1,600~1,800 nm에서상관관계가있 는것으로나타났으며교정부상관계수는모두 0.98 로나타났다. Resazurin의경우모 두 1,600~1,800 nm에서상관관계가있는것으로나타났으며교정부상관계수는각각 0.97과 0.98 로나타났다. Amido black의경우모두 1,600~1,800 nm에서상관관계가 있는것으로나타났으며교정부상관계수는각각 0.97과 0.96으로나타나단백질의예 측성능은보존제처리의영향을받지않음을알수있다. 또한시약을첨가하지않 은시료의상관계수와유사하여단백질의예측성능은첨가시약의영향을받지않음 을알수있다. - 104 -
Table 3-6 PLS results of calibration for each milk condition Protein Calibration Wavelength N Factor R SEC Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Fresh 1600~1700 50 8 0.98 0.07 Preserved 1600~1800 50 7 0.97 0.09 Fresh 1500~1800 50 6 0.96 0.04 Preserved 1600~1800 50 6 0.97 0.04 Fresh 1700~1800 50 7 0.98 0.05 Preserved 1600~1800 50 9 0.98 0.04 Fresh 1600~1800 50 10 0.97 0.06 Preserved 1600~1800 50 9 0.98 0.05 Fresh 1600~1800 50 6 0.97 0.07 Preserved 1600~1800 50 8 0.96 0.08 유당의경우표 3-7과같이보존제처리를하지않은시료와보존제처리한시료에 Methyl red를첨가한경우각각 1,600 ~ 1,900 nm와 1,600 ~ 1,800 nm에서상관관 계가있는것으로나타났으며교정부상관계수는각각 0.84와 0.85 로나타났다. Methylene blue의경우각각 1,600 ~ 1,700 nm와 1,600 ~ 1,800 nm에서상관관계가 있는것으로나타났으며교정부상관계수는모두 0.86 으로나타났다. Resazurin의경 우모두 1,600 ~ 1,800 nm에서상관관계가있는것으로나타났으며교정부상관계수 는각각 0.85와 0.86 로나타났다. Amido black의경우모두 1,600 ~ 1,800 nm에서상 관관계가있는것으로나타났으며교정부상관계수는각각 0.87과 0.86으로나타나유 당의예측성능은보존제처리의영향을받지않음을알수있다. 또한시약을첨가 하지않은시료의상관계수와유사하여유당의예측성능은첨가시약의영향을받지 않음을알수있다. - 105 -
Table 3-7 PLS results of calibration for each milk condition Lactose Calibration Wavelength N Factor R SEC Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Fresh 1700~1800 50 11 0.86 0.08 Preserved 1600~1800 50 13 0.85 0.10 Fresh 1600~1900 50 14 0.84 0.10 Preserved 1600~1800 50 10 0.85 0.09 Fresh 1600~1700 50 9 0.86 0.09 Preserved 1600~1800 50 10 0.86 0.09 Fresh 1600~1800 50 11 0.85 0.09 Preserved 1600~1800 50 12 0.86 0.08 Fresh 1600~1800 50 8 0.87 0.08 Preserved 1600~1800 50 9 0.86 0.08 총고형분의경우표 3-8과같이보존제처리를하지않은시료와보존제처리한시 료에 Methyl red를첨가한경우모두 900 ~ 1,300 nm에서상관관계가있는것으로 나타났으며교정부상관계수는각각 0.96과 0.94 로나타났다. Methylene blue의경우 각각 800 ~ 1,400 nm와 800 ~ 1,500 nm에서상관관계가있는것으로나타났으며 교정부상관계수는모두 0.95 로나타났다. Resazurin의경우각각 800 ~ 1,300 nm와 900 ~ 1,500 nm에서상관관계가있는것으로나타났으며교정부상관계수는각각 0.94와 0.93 으로나타났다. Amido black의경우각각 900 ~ 1,300 nm와 800 ~ 1,400 nm에서상관관계가있는것으로나타났으며교정부상관계수는각각 0.95와 0.96으로 나타나총고형분의예측성능은보존제처리의영향을받지않음을알수있다. 또한 시약을처가하지않은시료의상관계수와유사하여총고형분의예측성능은첨가시약 의영향을받지않음을알수있다. - 106 -
Table 3-8 PLS results of calibration for each milk condition Total solids Calibration Wavelength N Factor R SEC Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Fresh 800~1300 50 18 0.95 0.09 Preserved 800~1400 50 11 0.93 0.08 Fresh 900~1300 50 10 0.96 0.09 Preserved 900~1300 50 11 0.94 0.09 Fresh 800~1400 50 12 0.95 0.09 Preserved 800~1500 50 13 0.95 0.09 Fresh 800~1300 50 13 0.94 0.10 Preserved 900~1500 50 15 0.93 0.09 Fresh 900~1300 50 14 0.95 0.09 Preserved 800~1400 50 12 0.96 0.09 개발된모델의검증을한결과, 지방의경우표 3-9와같이보존제처리를하지않 은시료와보존제처리한시료의검증부상관계수는 Methyl red의경우 0.90과 0.91, Methylene blue의경우 0.93과 0.92, Resazurin의경우모두 0.94, Amido black의경우 0.95와 0.94 로나타나교정결과와유사한수준을보이고있다. - 107 -
Table 3-9 PLS results of prediction for each milk condition Fat Prediction N R SEP Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Fresh 50 0.95 0.20 Preserved 50 0.94 0.21 Fresh 50 0.90 0.29 Preserved 50 0.91 0.31 Fresh 50 0.93 0.23 Preserved 50 0.92 0.23 Fresh 50 0.94 0.21 Preserved 50 0.94 0.20 Fresh 50 0.95 0.19 Preserved 50 0.94 0.20 단백질의경우표 3-10과같이보존제처리를하지않은시료와보존제처리한시 료의검증부상관계수는 Methyl red의경우 0.91과 0.90, Methylene blue의경우모두 0.96, Resazurin의경우 0.97과 0.96, Amido black의경우모두 0.95로나타나교정결 과와유사한수준을보이고있다. - 108 -
Table 3-10 PLS results of prediction for each milk condition Protein Prediction N R SEP Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Fresh 50 0.96 0.11 Preserved 50 0.97 0.09 Fresh 50 0.91 0.10 Preserved 50 0.90 0.12 Fresh 50 0.96 0.06 Preserved 50 0.96 0.05 Fresh 50 0.97 0.08 Preserved 50 0.96 0.09 Fresh 50 0.95 0.09 Preserved 50 0.95 0.09 유당의경우표 3-11과같이보존제처리를하지않은시료와보존제처리한시료 의검증부상관계수는 Methyl red의경우 0.76과 0.77, Methylene blue의경우 0.71과 0.69, Resazurin의경우 0.80과 0.81, Amido black의경우모두 0.81로나타나교정결 과보다낮은수준을보이고있어예측모델의보완이필요함을알수있다. - 109 -
Table 3-11 PLS results of prediction for each milk condition Lactose Prediction N R SEP Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Fresh 50 0.73 0.10 Preserved 50 0.71 0.12 Fresh 50 0.76 0.13 Preserved 50 0.77 0.11 Fresh 50 0.71 0.10 Preserved 50 0.69 0.13 Fresh 50 0.80 0.10 Preserved 50 0.81 0.10 Fresh 50 0.81 0.09 Preserved 50 0.81 0.08 총고형분의경우표 3-12와같이보존제처리를하지않은시료와보존제처리한 시료의검증부상관계수는 Methyl red의경우 0.86과 0.87, Methylene blue의경우모 두 0.89, Resazurin의경우 0.91과 0.92, Amido black의경우 0.92와 0.90으로나타나 교정결과보다낮은수준을보이고있어예측모델의보완이필요함을알수있다. - 110 -
Table 3-12 PLS results of prediction for each milk condition Total solids Prediction N R SEP Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Fresh 50 0.93 0.12 Preserved 50 0.91 0.14 Fresh 50 0.86 0.17 Preserved 50 0.87 0.16 Fresh 50 0.89 0.15 Preserved 50 0.89 0.15 Fresh 50 0.91 0.14 Preserved 50 0.92 0.13 Fresh 50 0.92 0.13 Preserved 50 0.90 0.14 보존제처리가성분조성에미치는광학적특성을구명하기위해 PLS 모델을개발 한결과보존제처리와관계없이상관계수가유사하게나타나성분조성의예측모델의 예측성능은보존제처리의영향을받지않는것으로나타났다. 또한첨가시약의첨 가여부와관계없이유사한수준을보여성분조성의예측성능은첨가시약의영향을 받지않는것으로나타났으며, 이것은성분조성에대한예측모델이근적외선영역에 서상관계수가높게나왔기때문으로판단된다. 그러나유당과총고형분의검증결과 는교정결과보다비교적낮게나타나향후예측모델개발시다양한수처리방법및 예측알고리즘의개발로보완이필요함을알수있다. 마) 원유성분조성측정을위한첨가시약의환경조건설정 원유시료에혼합되는첨가시약이반응시간 5분에서성분조성의예측모델의성능에 큰영향을미치지는않는것으로나타났으나반응시간이변화함에따라영향을줄가 능성이있다. 그러므로본연구에서는첨가시약과보존제처리한원유의반응시간에 - 111 -
따른광학적특성을구명하기위해그림 3-2와같이반응시간을 0 분, 5 분, 10분의 3수 준으로두어반응시간에따른예측성능을평가하였으며, 이때반응시약으로는 Methyl red, Methylene blue, Resazurin, Amido black 의시약을사용하였다. Fig. 3-2 Flow chart of experiment condition for reaction time with reductive reagents. 첨가시약의반응시간을구명하기위하여표 3-13과같이방부제처리한원유시료 를수집하였으며, 상용화된유성분분석기로분석한결과, 지방은 2.72 ~ 6.37 %, 단백 질은 2.62 ~ 4.33 %, 유당은 3.88 ~ 5.27 %, 총고형분은 10.13 ~ 15.81 % 의범위를 보이고있다. 수집된원유시료에시약을첨가하는동시의측정하는스펙트럼을 0분 인경우로하여 5 분, 10분에각각스펙트럼을측정하여각각의유성분과의상관관계 를분석하였다. Table 3-13 Chemical properties of milk tested (N = 100) Avg. Max. Min. Std. Fat(%) 4.17 6.37 2.72 0.71 Protein(%) 3.58 4.33 2.62 0.52 Lactose(%) 4.94 5.27 3.88 0.31 TS(%) 12.90 15.81 10.13 0.83 첨가시약의반응시간에따른각성분조성의예측성능을구명하기위하여 PLS 방 법을이용하여각성분조성의예측모델을개발한결과, 지방의교정부상관계수는표 3-14와같이대부분근적외선영역의 1,600 ~ 1,800 nm에서상관관계가높게나타났 - 112 -
으며, 원유시료에첨가한시약에관계없이반응시간이 0분인경우 0.93 ~ 0.95, 5분인 경우 0.93 ~ 0.97, 10분인경우 0.91 ~ 0.94로유사하게나타나시약첨가시지방의 예측성능은반응시간의영향을받지않는것을알수있다. Table 3-14 PLS results of calibration for each reaction time Fat Calibration Wavelength N Factor R SEC Methyl red 1700~1800 50 8 0.93 0.17 0 Min. Methylene blue 1700~1800 50 8 0.94 0.16 Resazurin 1600~1800 50 7 0.95 0.15 Amido black 1700~1800 50 8 0.94 0.19 Methyl red 1700~1800 50 7 0.94 0.18 5 Min. Methylene blue 1700~1800 50 11 0.93 0.17 Resazurin 1600~1800 50 10 0.97 0.16 Amido black 1700~1800 50 8 0.95 0.19 Methyl red 1700~1800 50 8 0.93 0.12 10 Min. Methylene blue 1700~1800 50 9 0.91 0.17 Resazurin 1600~1800 50 10 0.96 0.16 Amido black 1700~1800 50 8 0.94 0.19 단백질의교정부상관계수는표 3-15와같이대부분근적외선영역의 1,600 ~ 1,900 nm 에서상관관계가높게나타났으며, 원유시료에첨가한시약에관계없이반응 시간이 0분인경우 0.95 ~ 0.97, 5분인경우 0.95 ~ 0.98, 10분인경우 0.95 ~ 0.96으 로유사하게나타나시약첨가시단백질의예측성능은반응시간의영향을받지않는 것을알수있다. - 113 -
Table 3-15 PLS results of calibration for each reaction time Protein Calibration Wavelength N Factor R SEC Methyl red 1600~1800 50 11 0.97 0.09 0 Min. Methylene blue 1600~1800 50 7 0.95 0.09 Resazurin 1600~1800 50 8 0.96 0.07 Amido black 1600~1800 50 9 0.95 0.07 Methyl red 1700~1900 50 10 0.95 0.06 5 Min. Methylene blue 1600~1800 50 8 0.96 0.06 Resazurin 1700~1900 50 8 0.98 0.04 Amido black 1600~1800 50 8 0.97 0.06 Methyl red 1600~1800 50 9 0.96 0.07 10 Min. Methylene blue 1700~1900 50 11 0.96 0.09 Resazurin 1700~1900 50 12 0.95 0.08 Amido black 1600~1800 50 10 0.95 0.06 유당의교정부상관계수는표 3-16과같이대부분근적외선영역의 1,600 ~ 1,900 nm 에서상관관계가높게나타났으며, 원유시료에첨가한시약에관계없이반응시간이 0분인경우 0.85 ~ 0.88, 5분인경우 0.85 ~ 0.89, 10분인경우 0.86 ~ 0.88로유사하 게나타나시약첨가시유당의예측성능은반응시간의영향을받지않는것을알수 있다. - 114 -
Table 3-16 PLS results of calibration for each reaction time Lactose Calibration Wavelength N Factor R SEC Methyl red 1700~1800 50 10 0.86 0.08 0 Min. Methylene blue 1700~1800 50 8 0.85 0.10 Resazurin 1700~1800 50 9 0.88 0.10 Amido black 1700~1900 50 11 0.86 0.09 Methyl red 1700~1900 50 12 0.88 0.09 5 Min. Methylene blue 1600~1900 50 10 0.85 0.08 Resazurin 1600~1900 50 8 0.89 0.08 Amido black 1600~1800 50 9 0.85 0.07 Methyl red 1700~1800 50 10 0.86 0.07 10 Min. Methylene blue 1700~1800 50 12 0.86 0.09 Resazurin 1700~1900 50 7 0.87 0.08 Amido black 1600~1900 50 7 0.88 0.09 총고형분의교정부상관계수는표 3-17과같이대부분근적외선영역의 800 ~ 1,500 nm 에서상관관계가높게나타났으며, 원유시료에첨가한시약에관계없이반응 시간이 0분인경우 0.93 ~ 0.96, 5분인경우 0.93 ~ 0.95, 10분인경우 0.92 ~ 0.94로 유사하게나타나시약첨가시총고형분의예측성능은반응시간의영향을받지않는 것을알수있다. - 115 -
Table 3-17 PLS results of calibration for each reaction time Total Solid Calibration Wavelength N Factor R SEC Methyl red 900~1400 50 11 0.94 0.09 0 Min. Methylene blue 800~1500 50 15 0.93 0.08 Resazurin 800~1400 50 18 0.96 0.09 Amido black 900~1300 50 17 0.95 0.09 Methyl red 900~1300 50 10 0.95 0.08 5 Min. Methylene blue 800~1400 50 10 0.95 0.08 Resazurin 800~1300 50 18 0.94 0.08 Amido black 900~1300 50 17 0.93 0.09 Methyl red 800~1300 50 16 0.93 0.09 10 Min. Methylene blue 900~1400 50 15 0.94 0.09 Resazurin 900~1300 50 15 0.92 0.10 Amido black 1000~1300 50 17 0.92 0.09 시약첨가시반응시간이성분조성에미치는광학적특성을구명하기위해 PLS 모 델을개발한결과반응시간에관계없이예측성능이유사하게나타나, 시약첨가시 반응시간은성분조성예측에영향을미치지않는것을알수있다. 또한첨가시약에 관계없이유사한예측성능을보였으나, 유당의경우다른성분조성에비해예측성능 이낮게나타났다. 반응시간에따른개발된각성분조성의예측모델을검증한결과, 지방의검증부상 관계수는표 3-18과같이원유시료에첨가한시약에관계없이반응시간이 0분인경우 0.91 ~ 0.95, 5분인경우 0.92 ~ 0.96, 10분인경우 0.91 ~ 0.96으로나타나교정결과 와유사한수준을보이고있음을알수있다. - 116 -
Table 3-18 PLS results of prediction for each reaction time Fat Prediction N R SEP Methyl red 50 0.95 0.21 0 Min. Methylene blue 50 0.91 0.33 Resazurin 50 0.95 0.20 Amido black 50 0.94 0.19 Methyl red 50 0.94 0.21 5 Min. Methylene blue 50 0.92 0.31 Resazurin 50 0.96 0.19 Amido black 50 0.93 0.18 Methyl red 50 0.95 0.22 10 Min. Methylene blue 50 0.94 0.32 Resazurin 50 0.96 0.22 Amido black 50 0.91 0.19 단백질의검증부상관계수는표 3-19와같이원유시료에첨가한시약에관계없이 반응시간이 0분인경우 0.94 ~ 0.96, 5분인경우 0.94 ~ 0.98, 10분인경우 0.92 ~ 0.93 으로나타나교정결과와유사한수준을보이고있음을알수있다. - 117 -
Table 3-19 PLS results of prediction for each reaction time Protein Prediction N R SEP Methyl red 50 0.94 0.11 0 Min. Methylene blue 50 0.95 0.10 Resazurin 50 0.96 0.08 Amido black 50 0.95 0.11 Methyl red 50 0.96 0.13 5 Min. Methylene blue 50 0.95 0.12 Resazurin 50 0.98 0.06 Amido black 50 0.94 0.10 Methyl red 50 0.93 0.19 10 Min. Methylene blue 50 0.92 0.12 Resazurin 50 0.93 0.10 Amido black 50 0.92 0.18 유당의검증부상관계수는표 3-20과같이원유시료에첨가한시약에관계없이반 응시간이 0분인경우 0.74 ~ 0.76, 5분인경우 0.75 ~ 0.78, 10분인경우 0.74 ~ 0.76 으로나타나교정결과보다예측성능이낮음을알수있다. - 118 -
Table 3-20 PLS results of prediction for each reaction time Lactose Prediction N R SEP Methyl red 50 0.74 0.11 0 Min. Methylene blue 50 0.74 0.12 Resazurin 50 0.76 0.06 Amido black 50 0.76 0.09 Methyl red 50 0.75 0.15 5 Min. Methylene blue 50 0.77 0.17 Resazurin 50 0.78 0.09 Amido black 50 0.76 0.10 Methyl red 50 0.74 0.12 10 Min. Methylene blue 50 0.75 0.14 Resazurin 50 0.75 0.07 Amido black 50 0.76 0.10 총고형분의검증부상관계수는표 3-21과같이원유시료에첨가한시약에관계없이 반응시간이 0분인경우 0.91 ~ 0.96, 5분인경우 0.95 ~ 0.98, 10분인경우 0.93 ~ 0.95 로나타나교정결과와유사한수준을보이고있음을알수있다. - 119 -
Table 3-21 PLS results of prediction for each reaction time Total Soild Prediction N R SEP Methyl red 50 0.91 0.13 0 Min. Methylene blue 50 0.94 0.17 Resazurin 50 0.94 0.15 Amido black 50 0.96 0.13 Methyl red 50 0.95 0.14 5 Min. Methylene blue 50 0.96 0.17 Resazurin 50 0.98 0.13 Amido black 50 0.96 0.20 Methyl red 50 0.94 0.13 10 Min. Methylene blue 50 0.93 0.18 Resazurin 50 0.94 0.13 Amido black 50 0.95 0.15 시약첨가시반응시간에관계없이각성분조성은유사한예측성능을보여성분조 성의예측성능은반응시간의영향을받지않음을알수있으나, 유당의경우교정부 의예측성능이다른성분조성에비해낮으며, 검증부예측성능도교정부의예측성능 보다낮게나타나향후예측모델개발시다양한수처리방법및예측알고리즘의보 완이필요함을알수있다. 원유의성분조성은보존제처리, 첨가시약, 반응시간의영 향을받지않기때문에체세포수예측성능이비교적좋았던조건. 즉, 보존제처리, 시약첨가, 반응시간 5분의조건에서체세포수와성분조성의동시측정기술개발이 가능함을알수있다. - 120 -
제 4 절원유의체세포수측정알고리즘개발 1. 반응시약의종류및체세포수에따른원유의광학적특성구명 반응시약선정을위한첨가시약의종류및체세포수에따른원유의광학적특성 구명하기위하여한국식품연구원과협조하여대부분 2006년 12월 ~ 2007년 1월경에 낙농농가에서수집한시료를중심으로체세포수의범위가 1등급 ~ 5등급까지각등 급별의시료가균일하게포함하여총 200 개의원유를수집하였다. 체세포수는서울우 유지도소에의뢰하여표준화된체세포수검사장비인원유성분시험기 (Combifoss, FOSS FT6000, Denmark) 를이용하여측정하였으며검사시료는보존제처리한후즉 시아이스팩이등냉매로채워진아이스박스에넣어냉장상태(5 이하) 로보관하 여성균관대학교로이동한후 1일이내에스펙트럼측정을완료하여우유의성분변 화를최소화하였다. 보존제처리된원유시료는그림 4-1과같이온도를 40 로유 지한후시약을첨가하지않은원유시료와미생물측정을위한염료환원시험법에 사용되는 Methyl red, Methylene blue, Resazurin과전기영동시단백질염색에주로 이용되는 Amido black의 4가지시약을첨가한시료로구분하였으며첨가한시약의 농도는원유 5 ml에대하여 0.01 % 의농도를갖도록하였다. Fig. 4-1 Flow chart of experiment condition for reductive reagents. 성분분석이완료된원유시료는고성능분광광도계와 Horizontal 모듈을이용하여 가시광선/ 근적외선영역에서반사스펙트럼을측정하였다. 고성능분광광도계는표 4-1과같이회절격자형으로 400 ~ 2500 nm 파장범위에서 2 nm 간격으로시료의 반사및투과스펙트럼을측정할수있으며파장의정밀도는 ±0.3 nm 이다. 원유시 - 121 -
료의반사스펙트럼의측정을위하여분광분석기의 Horizontal 모듈에적합하게샘플 셀을제작하였다. 샘플셀은지름 50 mm, 높이 30 mm의크기로바닥은두께 3 mm 의수정으로제작되었으며, 반사판은지름 35 mm 의알루미늄으로제작되었다. 반사 판의바닥은평면을고르게정밀가공한후반사율을높이기위하여금으로도금하였 다. 반사판의높이에따른원유시료의흡광도가변화되므로시료의투과거리를고 려하여반사판의높이를 1 mm 로제작하였다. Table 4-1 Specifications of VIS/NIR spectrometer Items Specifications Wavelength range 400 ~ 2500 nm Wavelength accuracy Wavelength repeatibility Data interval ± 0.3 nm ± 0.015 nm standard deviation ± 2 nm 원유시료의스펙트럼은분광분석기의구동을위하여전용프로그램인 WinISI(NIRSystems, USA) 를이용하여 400 ~ 2500 nm에서 2 nm 간격으로반사스 펙트럼을측정하였다. 분광분석기를 30 ~ 40 분이상예열시킨후기준(Reference) 스펙트럼을측정하고각각의샘플용기에담겨진원유시료를샘플셀에부은후높 이 1 mm의반사판을넣고약 5분간대기하여시료가완전히정지한후시료의반사 스펙트럼을측정하고다시기준스펙트럼을측정하는방법으로반복하여총 200점의 반사스펙트럼을측정하였다. 기준스펙트럼은항상일정한흡광도를나타내는세라 믹판(Ceramic plate) 을이용하였으며, 시료에광선을 32 회주사(Scan) 하여측정한스 펙트럼을평균하여흡광도(log(1/R)) 로변환한스펙트럼을컴퓨터의파일로저장하였 다. 스펙트럼을측정시실내온도를 27 로유지했으며이때습도는 54 % 로측정되 었다. 가시광선/ 근적외선영역의스펙트럼은그림 4-2와같이 400 ~ 600 nm의가시광선 영역과 1400 ~ 1600 nm, 1900 ~ 2100 nm의근적외선영역에서차이를보이고있으 - 122 -
며검출부의특성에따른노이즈에의한영향을 2100 ~ 2500 nm 영역의볼수있다. 특히가시광선영역에서는첨가시약의색상과체세포수에따른첨가시약의색상이 변화하여스펙트럼간의큰차이를보이고있으며근적외선영역에서도미세한차이를 보여주고있다. Fig. 4-2 Reflectance spectra of visible/near-infrared spectrum for milk with reductive reagents. 2. 체세포수측정알고리즘개발및평가 스펙트럼을이용한예측모델을개발하기위하여그림 4-3과같이전처리된원유 시료의 50% 를교정부로, 50% 를검증부로분류하였다. 원유시료를체세포수의크기 로정열한후순차적으로교정부와검증부로분류하였으며, 교정부와검증부의유사 한체세포수의분포를갖도록조정하였다. 교정부의스펙트럼은모델의개발단계에서 반복하여사용되었으며, 검증부는예측모델의최종평가에 1 회사용되었다. - 123 -
Fig. 4-3 Flow chart of experiment condition for development of SCC model. 체세포수예측모델은반응시약의종류에따라차이를보이는 400 ~ 600 nm의 가시광선영역과 1400 ~ 1600 nm, 1900 ~ 2100 nm 영역의기준으로하여부분최소 자승(PLS) 으로원유의체세포수와반사스펙트럼의상관관계를분석하였다. PLS 분 석은상용프로그램인 Unscramber를사용하였으며각성분의예측모델을개발하기 위하여측정된스펙트럼을사용하였다. PLS 모델은교차검증(Cross validation) 을이 용하여개발하였으며, 팩터의수와 PRESS(Prediction residual error sum of squares) 값을참조하고상관계수(R) 와교정부오차(Standard error of calibration, SEC) 를비 교하여선정하였다. 팩터의수가증가하면 PRESS값은감소하나팩터의수가너무많 으면검증시예측능력이떨어지므로, F-검증을수행하고 F-검증의확률이 0.75미만 이되는팩터의수를모델의최적팩터의수로결정하였다. 최적의 PLS 모델은상관 계수, 교정부오차, 팩터의수를고려하여선정하였다. 각모델의예측성능은검증부 오차(Standard error of prediction, SEP) 를이용하여분석하였다. 전체 200개의원유시료에대하여체세포수를측정한결과 15,000 ~ 3,328,000개의 범위에서평균 376,886개로체세포수가다소높게나타났는데이것은시료수집과정 에서가능한전체등급별로균일한시료를수집하기하였기때문이다. 또한체세포수 는넓은범위를가지고있어 200개의시료를이용하여 3,000,000개이상의체세포수를 대표할수있는모델을개발하는것은쉽지않기때문에본연구에서는시료의예측 값을줄이기위하여표 4-2 와같이체세포수에상용로그(Log) 를취한것을예측값으 로하여모델을개발하였다. 로그계산이된체세포수의범위는 4.17 ~ 5.62의범위 에서평균 5.58을보이고있으며모델개발시오차의계산을위해서는로그값에대 - 124 -
한환산이필요하다. 오차의환산은체세포수로그값의평균(5.58) 에대한오차의백 분율로계산하였다. 예를들어모델개발시 0.1의평균오차는 5.58에대한 0.1의비 율인 1.8 % 로계산할수있어평균 376,886개에대한 1.8 %, 즉 6,754개의오차를의 미한다. Table 4-2 Somatic cell count for development of SCC model Somatic cell count Number Avg. Max. Min. Std. Raw, Methyl red Methylene blue Resazurin, Amido black Original 200 376,886 3,328,000 15,000 362,919 Log scale 200 5.58 6.52 4.17 0.43 400 ~ 600 nm의가시광선영역과 1400 ~ 1600 nm, 1900 ~ 2100 nm 영역에서 각각의첨가시약에대하여예측모델을개발한결과표 4-3과같이시약처리를하 지않은원유(Raw) 는 400 ~ 600 nm에서상관계수가 0.78, 교정부오차가 0.27로나 타났다. Methyl red를첨가한원유는 400 ~ 2100 nm의영역에서상관계수가 0.63, 오차가 0.31로나타났으며 Methylene blue를첨가한경우 400 ~ 2100 nm의영역에 서상관계수가 0.65, 오차가 0.30으로두가지시약에대해모두낮은상관도를보여 주고있다. Resazurin을첨가하면 400 ~ 2100 nm에서상관계수가 0.98, 오차가 0.08 로가장우수한상관관계를보여주며가시광선영역인 400 ~ 600 nm와근적외선영 역인 1900 ~ 2100 nm 에서도높은상관관계를보여주고있다. Amido black 시약을 첨가한경우전체영역인 400 ~ 2100 nm에서상관계수가 0.99, 오차가 0.04로우수한 상관관계를보이며 400 ~ 600 nm의가시광선영역보다는 1400 ~ 1600 nm, 1900 ~ 2100 nm 의근적외선영역에서더욱우수한상관관계를보이고있다. - 125 -
Table 4-3 PLS results of calibration for development of SCC model Somatic cell count Calibration Wavelength N Factor R SEC(Log) SEC(Original) 400~2100 4 0.55 0.36 24,315 Raw 400~600 8 0.78 0.27 18,236 100 1400~1600 1 0.10 0.43 29,043 1900~2100 1 0.11 0.43 29,043 400~2100 2 0.63 0.31 20,938 Methyl red 400~600 1 0.44 0.36 24,315 100 1400~1600 2 0.51 0.34 22,964 1900~2100 1 0.54 0.33 22,289 400~2100 2 0.65 0.30 20,263 Methylene blue 400~600 1 0.45 0.35 23,640 100 1400~1600 2 0.47 0.35 23,640 1900~2100 1 0.52 0.31 20,938 400~2100 7 0.98 0.08 5,403 Resazurin 400~600 8 0.92 0.17 11,482 100 1400~1600 4 0.85 0.21 14,184 1900~2100 7 0.95 0.13 8,780 400~2100 9 0.99 0.04 2,701 Amido black 400~600 4 0.87 0.19 12,833 100 1400~1600 9 0.91 0.16 10,807 1900~2100 7 0.94 0.13 8,780 미지의시료를이용하여개발된모델을검증한결과표 4-4와같이 Resazurin과 Amido black 시약을첨가한경우가좋은예측결과를보여주고있으며, 시약을첨가 - 126 -
하지않은원유의검증부상관계수는 0.23, 검증부오차는 0.45로나타나체세포수의 예측을위해서는적절한반응시약의첨가가필요함을보여주고있다. 시약을첨가하 지않은원유의모델검증결과 400 ~ 600 nm에서상관계수는 0.23, 검증부오차는 0.45 로낮은검증결과를보여주고있다. Methyl red와 Methylene blue를각각첨가 한결과전체영역에서상관계수는 0.36, 0.47로나타났으며검증부오차는 0.39, 0.37 로모델이체세포수예측이어려움을보여주고있다. Resazurin을첨가한경우그림 4-4와같이전체영역에서상관계수가 0.95, 검증부오차는 0.13으로우수한검증력을 보이고있으며, 그림 4-5, 4-6, 4-7과같이 400 ~ 600 nm와 1400 ~ 1600 nm, 1900 ~ 2100 nm의근적외선영역에서검증결과상관계수는각각 0.86, 0.83, 0.91, 검증부 오차는 0.21, 0.23, 0.17 로근적외선영역에서더좋은검증결과를보여주고있다. Amido black을첨가하여모델검증결과그림 4-8과같이전체영역에서상관계수는 0.98, 검증부오차는 0.09로우수한상관관계를보이며가시광선과근적외선영역에서 그림 4-9, 4-10, 4-11과같이상관계수는각각 0.86, 0.89, 0.86, 검증부오차는 0.21, 0.18, 0.21 로유사한검증력을보여주고있다. - 127 -
Table 4-4 PLS results of prediction for milk condition tested Somatic cell count Prediction N R SEP(Log) SEP(Original) 0.23 0.45 30,394 Raw 98 0.49 0.42 28,368 0.10 0.44 29,719 0.15 0.43 29,043 0.36 0.39 26,341 Methyl red 98 0.24 0.40 27,017 0.27 0.40 27,017 0.21 0.42 28,368 0.47 0.37 24,991 Methylene blue 98 0.36 0.39 26,341 0.34 0.40 27,017 0.34 0.40 27,017 0.95 0.13 8,780 Resazurin 98 0.86 0.21 14,184 0.83 0.23 15,535 0.91 0.17 11,482 0.98 0.09 6,079 Amido black 98 0.85 0.21 14,184 0.89 0.18 12,158 0.86 0.21 14,184-128 -
Fig. 4-4 Prediction of SCC by milk with Resazurin using 400 ~ 2100 nm. Fig. 4-5 Prediction of SCC by milk with Resazurin using 400 ~ 600 nm. - 129 -
Fig. 4-6 Prediction of SCC by milk with Resazurin using 1400 ~ 1600 nm. Fig. 4-7 Prediction of SCC by milk with Resazurin using 1900 ~ 2100 nm. - 130 -
Fig. 4-8 Prediction of SCC by milk with Amido black using 400 ~ 2100 nm. Fig. 4-9 Prediction of SCC by milk with Amido black using 400 ~ 600 nm. - 131 -
Fig. 4-10 Prediction of SCC by milk with Amido black using 1400 ~ 1600 nm. Fig. 4-11 Prediction of SCC by milk with Amido black using 1900 ~ 2100 nm. - 132 -
가시광선/ 근적외선스펙트럼을이용하여첨가시약에대한원유의체세포측정알고 리즘을개발한결과, Resazurin, Amido black 시약을반응시약으로사용한경우가가 장좋은상관관계를보였으며, 특히전체스펙트럼영역을사용한결과가가장좋은 상관관계를보이고있으나휴대용시스템에적용하기위해서는고가인광검출장치가 필요하므로경제적측면을고려하여가시광선영역을체세포수예측을위한적정파 장으로선정하였다. 또한가시광선영역을이용한체세포수예측모델검증력은다소 낮아품질판정시스템의신뢰성을높이기위해서는다양한신호처리방법및알고리 즘의적용이필요할것으로판단된다. - 133 -
제 5 절원유의성분조성측정알고리즘개발 1. 반응시약의종류및성분조성에따른원유의광학적특성구명 반응시약선정을위한첨가시약의종류및성분조성에따른원유의광학적특성 구명하기위하여한국식품연구원과협조하여대부분 2007년 6월 ~ 2007년 12월경에 낙농농가에서총 200 개의원유를수집하였다. 성분조성은서울우유지도소에의뢰하 여낙농농가에서총 200개의원유시료를수집하였으며체세포수예측모델시와동일 한방법으로실험을수행하여지방, 단백질, 유당, 총고형분의예측모델을개발하였다. 전체 200 개의원유시료에대해상용화된원유성분시험기(Combifoss) 를이용하여 성분조성을측정한결과표 5-1과같이지방은 2.08 ~ 6.38 %, 단백질은 2.35 4.37 %, 유당은 3.38 ~ 5.21 %, 총고형분은 9.83 ~ 14.29 % 의범위를보였다. ~ Table 5-1 Properties ratio for development of fat, protein, lactose and TS model Number Avg. Max. Min. Std. Raw, Methyl red Methylene blue Resazurin, Amido black Fat(%) 200 4.04 6.38 2.08 0.82 Protein(%) 200 3.33 4.37 2.35 0.41 Lactose(%) 200 4.68 5.21 3.38 0.24 TS(%) 200 12.76 14.29 9.83 0.75 400 ~ 600 nm의가시광선영역과 1400 ~ 1600 nm, 1900 ~ 2100 nm 영역에서 각각의첨가시약에대하여예측모델을개발한결과지방의경우표 5-2와같이시 약처리를하지않은원유(Raw) 는 1400 ~ 1600 nm에서교정부상관계수가 0.97, 교 정부오차가 0.12 로비교적가장우수한상관관계를보여주고있다. 원유에 Methyl red를첨가하면 400 ~ 2100 nm에서교정부상관계수가 0.95, 교정부오차가 0.14로 나타났다. Methylene blue의경우 400 ~ 2100 nm에서교정부상관계수와교정부오 차가각각 0.95, 0.15 로나타났다. Resazurin 첨가시에는 1400 ~ 1600 nm에서교정 부상관계수가 0.96, 교정부오차가 0.13 으로나타났다. Amido black을원유에첨가했 - 134 -
을경우에는 400 ~ 2100 nm와 1400 ~ 1600 nm에서교정부상관계수가모두 0.80, 교정부오차가모두 0.23 으로나타났다. 가시광선영역보다는전체영역인 400 ~ 2100 nm과근적외선영역의 1400 ~ 1600 nm에서비교적높은상관관계를보여주고 있다. Table 5-2 PLS results of calibration for development of fat model Fat Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Calibration Wavelength N Factor R SEC 400~2100 8 0.94 0.14 400~600 1 0.41 0.39 100 1400~1600 7 0.97 0.12 1900~2100 2 0.65 0.31 400~2100 9 0.95 0.14 400~600 2 0.74 0.26 100 1400~1600 8 0.93 0.15 1900~2100 3 0.81 0.22 400~2100 8 0.95 0.15 400~600 2 0.65 0.31 100 1400~1600 8 0.94 0.14 1900~2100 3 0.72 0.27 400~2100 7 0.92 0.16 400~600 2 0.68 0.29 100 1400~1600 9 0.96 0.13 1900~2100 1 0.83 0.21 400~2100 7 0.80 0.23 400~600 1 0.25 0.42 100 1400~1600 6 0.80 0.23 1900~2100 2 0.54 0.35-135 -
단백질의경우표 5-3과같이시약처리를하지않은원유는 1400 ~ 1600 nm에서 교정부상관계수가 0.99, 교정부오차가 0.11로비교적가장우수한상관관계를보여 주고있다. Methyl red를원유에첨가한경우 400 ~ 2100 nm에서교정부상관계수 가 0.95, 교정부오차가 0.14 로나타났다. 원유에 Methylene blue를첨가한경우 400 ~ 2100 nm에서교정부상관계수가 0.95, 교정부오차가 0.13 으로나타났다. Resazurin의경우 1400 ~ 1600 nm에서교정부상관계수와교정부오차가각각 0.98, 0.11 로나타났다. Amido black을첨가했을경우에는 400 ~ 2100 nm에서교정부상 관계수가 0.95, 교정부오차가 0.14 로나타났다. 전체영역인 400 ~ 2100 nm과근적 외선영역의 있다. 1400 ~ 1600 nm에서다른영역에비해비교적좋은상관관계를보이고 - 136 -
Table 5-3 PLS results of calibration for development of protein model Protein Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Calibration Wavelength N Factor R SEC 400~2100 8 0.95 0.14 400~600 1 0.65 0.31 100 1400~1600 6 0.99 0.11 1900~2100 2 0.79 0.24 400~2100 9 0.95 0.14 400~600 1 0.66 0.30 100 1400~1600 7 0.94 0.14 1900~2100 3 0.73 0.27 400~2100 8 0.95 0.13 400~600 2 0.80 0.23 100 1400~1600 7 0.93 0.15 1900~2100 1 0.81 0.22 400~2100 9 0.96 0.13 400~600 2 0.80 0.23 100 1400~1600 8 0.98 0.11 1900~2100 2 0.84 0.21 400~2100 7 0.95 0.14 400~600 1 0.66 0.30 100 1400~1600 8 0.93 0.15 1900~2100 2 0.78 0.24 유당의경우표 5-4와같이시약을첨가하지않은원유의경우 1400 ~ 1600 nm에 서교정부상관계수와교정부오차가각각 0.88, 0.18 로나타났으며, Resazurin을원유 에첨가한경우 1400 ~ 1600 nm에서교정부상관계수가 0.88, 교정부오차가 0.17로 나타나두가지경우가다른시약을첨가했을경우보다비교적높은상관관계를보임 을알수있다. 원유에 Methyl red를첨가한경우 400 ~ 2100 nm에서교정부상관 - 137 -
계수가 0.86, 교정부오차가 0.19 로나타났다. Methylene blue의경우 400 ~ 2100nm 에서교정부상관계수가 400 ~ 2100 nm에서교정부상관계수와교정부오차가각각 0.86, 0.20 로나타났다. Amido black을첨가했을경우 400 ~ 2100 nm와 1400 1600 nm에서교정부상관계수가모두 0.85, 교정부오차가 0.20, 0.21 로나타났다. 가 시광선영역의 400 ~ 600 nm과 1900 ~ 2100 nm영역보다전체영역인 400 ~ 2100 nm과근적외선영역의 1400 ~ 1600 nm 에서비교적높은상관관계를보이고있으며, 다른성분조성에비해전체적으로상관도가낮게나와신호처리방법및품질판정알 고리즘등의보완이필요한것으로판단된다. ~ - 138 -
Table 5-4 PLS results of calibration for development of lactose model Lactose Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Calibration Wavelength N Factor R SEC 400~2100 8 0.81 0.22 400~600 1 0.26 0.42 100 1400~1600 10 0.88 0.18 1900~2100 1 0.45 0.38 400~2100 9 0.86 0.19 400~600 1 0.23 0.42 100 1400~1600 7 0.83 0.21 1900~2100 2 0.52 0.36 400~2100 10 0.86 0.20 400~600 1 0.38 0.39 100 1400~1600 9 0.85 0.20 1900~2100 1 0.57 0.34 400~2100 8 0.86 0.19 400~600 1 0.44 0.38 100 1400~1600 8 0.88 0.17 1900~2100 2 0.55 0.35 400~2100 7 0.85 0.20 400~600 1 0.31 0.41 100 1400~1600 9 0.85 0.21 1900~2100 1 0.49 0.37 총고형분의예측모델을개발하여분석한결과표 5-5와같이시약을첨가하지않 은원유는 1400 ~ 1600 nm에서교정부상관계수가 0.98, 교정부오차가 0.11로나타 났으며, Resazurin의경우 1400 ~ 1600 nm에서교정부상관계수가 0.98, 교정부오차 가 0.12로나타나두가지경우가다른경우보다비교적높은상관관계를보임을알 수있다. Methyl red를원유에첨가한경우 400 ~ 2100 nm와 1400 ~ 1600 nm에서 - 139 -
교정부상관계수가모두 0.97, 교정부오차가각각 0.12, 0.13 으로나타났다. 원유에 Methylene blue를첨가한경우 400 ~ 2100 nm에서교정부상관계수가 0.94, 교정부 오차가 0.15 로나타났다. Amido black을첨가했을경우에는 400 ~ 2100 nm에서교 정부상관계수가 0.94, 교정부오차가 0.14 로나타났다. 다른성분조성과마찬가지로 전체영역인 400 ~ 2100 nm과근적외선영역의 1400 ~ 1600 nm에서비교적좋은 상관관계를보이고있다. Table 5-5 PLS results of calibration for development of TS model Total solids Raw Methyl red Methylene blue Resazurin Amido black Calibration Wavelength N Factor R SEC 400~2100 13 0.92 0.16 400~600 2 0.68 0.29 100 1400~1600 11 0.98 0.11 1900~2100 2 0.74 0.26 400~2100 10 0.97 0.12 400~600 1 0.69 0.29 100 1400~1600 12 0.97 0.13 1900~2100 2 0.76 0.25 400~2100 12 0.94 0.15 400~600 1 0.81 0.22 100 1400~1600 11 0.91 0.16 1900~2100 1 0.82 0.22 400~2100 13 0.96 0.13 400~600 2 0.71 0.28 100 1400~1600 12 0.98 0.12 1900~2100 2 0.78 0.24 400~2100 13 0.94 0.14 400~600 1 0.65 0.31 100 1400~1600 10 0.92 0.16 1900~2100 2 0.76 0.25-140 -
미지의시료를이용하여개발된모델을검증한결과지방의경우표 5-6과같이 Methyl red와 Methylene blue를각각첨가한결과전체영역에서검증부상관계수는 0.90, 0.91, 검증부오차는 0.17, 0.16 으로나타났으며, 원유에 Amido black을첨가한 경우전체영역과 1400 ~ 1600 nm에서검증부상관계수가모두 0.76, 검증부오차가 각각 0.25, 0.26 로나타났다. 시약처리를하지않은경우그림 5-1과같이 1400 ~ 1600 nm에서검증부상관계수가 0.93, 검증부오차가 0.15 로나타났으며, Resazurin을 첨가했을경우그림 5-2와같이 1400 ~ 1600 nm에서검증부상관계수와검증부오 차가각각 0.94, 0.14 로나타나비교적우수한검증력을보이고있다. - 141 -
Table 5-6 PLS results of prediction for fat model Fat Prediction N R SEP 0.91 0.16 Raw 100 0.28 0.41 0.93 0.15 0.53 0.35 0.90 0.17 Methyl red 100 0.68 0.29 0.89 0.18 0.72 0.27 0.91 0.16 Methylene blue 100 0.43 0.38 0.89 0.18 0.66 0.30 0.88 0.18 Resazurin 100 0.49 0.37 0.94 0.14 0.79 0.24 0.76 0.25 Amido black 100 0.22 0.42 0.76 0.26 0.21 0.42-142 -
Fig. 5-1 Prediction of fat by raw milk using 1400 ~ 1600 nm. Fig. 5-2 Prediction of fat by milk with Resazurin using 1400 ~ 1600 nm. - 143 -
개발된모델을검증한결과단백질의경우표 5-7과같이 Methyl red를첨가한경 우 400 ~ 2100 nm에서검증부상관계수가 0.90, 검증부오차가 0.17 로나타났다. Methylene blue의경우전체영역에서검증부상관계수와검증부오차가각각 0.89, 0.18 로나타났다. Amido black을원유에첨가한경우 1400 ~ 1600 nm에서검증부 상관계수가 0.88, 검증부오차가 0.18 로나타났다. 시약처리를하지않은경우그림 5-3과같이 1400 ~ 1600 nm에서검증부상관계수가 0.93, 검증부오차가 0.15로나 타났으며, Resazurin을첨가했을경우그림 5-4와같이 1400 ~ 1600 nm에서검증부 상관계수와검증부오차가각각 있다. 0.94, 0.14로나타나비교적좋은검증결과를보이고 - 144 -
Table 5-7 PLS results of prediction for protein model Protein Prediction N R SEP 0.91 0.16 Raw 100 0.60 0.33 0.93 0.15 0.73 0.27 0.90 0.17 Methyl red 100 0.50 0.36 0.88 0.18 0.67 0.30 0.89 0.18 Methylene blue 100 0.69 0.29 0.84 0.21 0.75 0.26 0.92 0.16 Resazurin 100 0.75 0.26 0.94 0.14 0.79 0.24 0.87 0.19 Amido black 100 0.54 0.35 0.88 0.18 0.61 0.32-145 -
Fig. 5-3 Prediction of protein by raw milk using 1400 ~ 1600 nm. Fig. 5-4 Prediction of protein by milk with Resazurin using 1400 ~ 1600 nm. - 146 -
개발된유당모델의검증결과는표 5-8과같이원유에 Methyl red와 Methylene blue를각각첨가한경우 400 ~ 2100 nm에서검증부상관계수가각각 0.79, 0.81, 검 증부오차가각각 0.24, 0.22 로나타났다. Amido black의경우전체영역과 1400 ~ 1600 nm에서검증부상관계수가모두 0.67, 검증부오차가각각 0.30, 0.32로나타나 개발된모델의성능에비하여다소낮은검증결과를보였다. 원유에시약을첨가하지 않은경우그림 5-5와같이 1400 ~ 1600 nm에서검증부상관계수가 0.85, 검증부오 차가 0.20 으로나타났으며, Resazurin의경우그림 5-6과같이 1400 ~ 1600 nm에서 검증부상관계수와검증부오차가각각 0.86, 0.19로나타나비교적우수한검증력을 보이고있으나다른성분조성에비해낮은검증결과를보이고있다. - 147 -
Table 5-8 PLS results of prediction for lactose model Lactose Prediction N R SEP 0.78 0.24 Raw 100 0.11 0.42 0.85 0.20 0.31 0.41 0.79 0.24 Methyl red 100 0.12 0.42 0.77 0.25 0.36 0.40 0.81 0.22 Methylene blue 100 0.29 0.41 0.68 0.29 0.34 0.40 0.57 0.34 Resazurin 100 0.21 0.42 0.86 0.19 0.23 0.42 0.67 0.30 Amido black 100 0.12 0.42 0.67 0.32 0.32 0.41-148 -
Fig. 5-5 Prediction of lactose by raw milk using 1400 ~ 1600 nm. Fig. 5-6 Prediction of lactose by milk with Resazurin using 1400 ~ 1600 nm. - 149 -
총고형분의경우검증결과는표 5-9와같이 Methyl red를원유에첨가한경우 400 ~ 2100 nm와 1400 ~ 1600 nm에서검증부상관계수가모두 0.92, 검증부오차 가각각 0.16, 0.18 로나타났다. Methylene blue와 Amido black을각각첨가한경우 전체영역에서검증부상관계수가각각 0.91, 0.90, 검증부오차가 0.16, 0.17로나타났 다. 원유에시약처리를하지않은경우그림 5-7과같이 1400 ~ 1600 nm에서검증 부상관계수와검증부오차가각각 0.95, 0.14 로나타났으며, Resazurin의경우그림 5-8과같이 1400 ~ 1600 nm에서검증부상관계수가 0.95, 검증부오차가 0.13으로 나타나비교적좋은검증력을보이고있다. - 150 -
Table 5-9 PLS results of prediction for TS model Total solids Prediction N R SEP 0.89 0.18 Raw 100 0.62 0.32 0.95 0.14 0.67 0.30 0.92 0.16 Methyl red 100 0.53 0.35 0.92 0.18 0.57 0.34 0.91 0.16 Methylene blue 100 0.72 0.27 0.86 0.19 0.69 0.29 0.94 0.14 Resazurin 100 0.62 0.32 0.95 0.13 0.75 0.26 0.90 0.17 Amido black 100 0.55 0.35 0.84 0.21 0.68 0.29-151 -
Fig. 5-7 Prediction of TS by raw milk using 1400 ~ 1600 nm. Fig. 5-8 Prediction of TS by milk with Resazurin using 1400 ~ 1600 nm. - 152 -
가시광선/ 근적외선스펙트럼을이용하여첨가시약에대한원유의성분조성측정알 고리즘을개발한결과, 시약을첨가하지않는경우와 Resazurin 시약을반응시약으로 사용한경우가가장좋은상관관계를보였으며, 특히근적외선영역의 1,400 ~ 1,600 nm 에서가장좋은상관관계를보이고있어근적외선영역을원유의성분조성예측을 위한적정파장으로선정하였다. 또한유당예측모델검증력이다소낮아품질판정 시스템의신뢰성을높이기위해다양한신호처리방법및알고리즘의적용이필요할 것으로판단된다. 원유의체세포수와성분조성측정을위한전처리기술과측정알고리즘을개발한 결과, 체세포수의경우 Resazurin과 Amido black 을첨가했을때, 성분조성의경우시 약을첨가하지않았을때와 Resazurin 을첨가했을때가장좋은상관관계를보였다. 체세포수의경우 Resazurin의검증력이 Amido black보다는다소낮게나타났으나성 분조성과의연계성과알고리즘의최적화를위해본연구에서는휴대용원유의품질판 정시스템개발시원유시료에첨가하는반응시약으로 Resazurin 을선정하였다. - 153 -
제 6 절원유의휴대용품질판정시스템개발 1. 원유의휴대용품질판정시스템시작품제작 원유의휴대용품질판정시스템은그림 6-1과같이현장에서실시간원유의품질측 정을위해가로 42 cm, 세로 25 cm, 높이 30 cm의케이스를이용하여운반및이동 이용이하도록제작하였다. 사용자가시스템의전원버튼을작동시키게되면원도우 시작과함께 LCD 화면에휴대용품질판정시스템의작동을위한프로그램이실행되 며, 사용자는 LCD 화면을직접터치하여현장에서실시간우유의품질을측정할수 있다. 또한현장에서실시간원유의품질측정을위해휴대가가능하도록리튬-이온방식 의배터리셀을사용하였으며, 90 ~ 250 V의교류를이용하여충전이가능하며연속 적으로현장에서약 6 시간정도의품질측정이가능하도록설계하였다. - 154 -
Fig. 6-1 Real time portable quality evaluation system of cow's milk. 휴대용품질판정시스템의전체적인개략도는그림 6-2와같이현장에서휴대용측 정을위한전원장치, 원유와반응시약의공급, 혼합, 온도제어를위한전처리장치, 품질측정을위한광원, 샘플홀더, 검출장치와전체시스템제어를위한임베디드장치 로구성하였다. - 155 -
Fig. 6-2 Schematic diagram of portable quality evaluation system of cow's milk. 가. 전처리장치 원유의휴대용품질판정시스템의전처리장치는일정한양의원유와반응시약을 자동으로공급하는시료공급장치, 원유와반응시약을균일하게혼합하는시료혼합 장치, 혼합된시료의온도를일정하게유지하는온도제어장치로구성하였다. 1) 시료공급장치 스펙트럼측정으로원유체세포수의효과적인분석을위해원유에시약을첨가해주 어일정비율을유지해야하며, 원유와시약의일정량을자동으로공급하기위해그림 6-3 과같이유량조절이가능한유량펌프(RP-M50, Furue, Japan) 를사용하였다. 유량 펌프의사양은표 6-1 과같이공급전원(6 ~ 12 V) 에따라공급속도(mL/min) 의조 절이가능하고디지털신호의입력에따라공급및정지가가능하며, 우유와시약은 내경 다. 2 mm의실리콘튜브를통과하여유량펌프에의해자동으로혼합용기에공급된 - 156 -
Fig. 6-3 Flow pump for sample supply. Table 6-1 Specifications of flow pump for sample supply Items Specification Supplied voltage DC 6 ~ 12 V Flow pump Decelerate ratio 1/100 Flow rate 0.7 ~ 7 ml/min Tube ID OD φ2.0 φ4.0 mm 2) 시료혼합장치 공급된원유와시약의반응을위해서는원유와시약을균일하게혼합해주어야하 며, 본연구에서는원유와시약의혼합시료의양이적은것을고려하여그림 6-4와 같이직경 50 mm 팬을혼합용기위에장착하고팬의회전력을이용하여원유와시 약을혼합하였다. 이때팬의회전속도는표 6-2 와같이공급전원(6 ~ 12 V) 을이용 하여조절하였다. - 157 -
Fig. 6-4 Fan motor for sample mixing. Table 6-2 Specifications of fan motor for sample mixing Items Fan motor Diameter Specification 50 mm Speed 1,200 ~ 6,500 rpm 3) 온도제어장치 원유의성분은온도에따라민감하게반응하므로스펙트럼측정시혼합된원유와 시약의온도에따른오차를줄이기위해서는일정한온도를유지하는것이필요하다. 본연구에서는시료의온도제어를위해혼합용기에그림 6-5와같은열전소자 (Thermoelectric) 와측온저항체(Resistance temperature detector, RTD) 를장착하였으 며, 온도제어장치는착유된원유의온도범위(30 ~ 40 ) 를고려하여혼합시료가 40 로유지되도록측온저항체온도를입력으로하는비례적분미분(PID) 제어를이 용하여열전소자의작동을제어하였다. 온도제어에사용된열전소자와측온저항체는 표 6-3 과같다. - 158 -
Fig. 6-5 Thermoelectric(left) and Pt-100 RTD(right). Table 6-3 Specifications of Thermoelectric and Pt-100 RTD for sample temperature control Items Thermoelectric RTD(Pt-100) Specification V max, I max, ΔT max 5.6 V, 5 A, 67 Resistance 0.83 ~ 0.91 Operating temperature 0 ~ 300 Resistance at 0 100±0.12 Ω Ω 4) PID 제어 제어변수와기준입력사이의오차에근거하여계통의출력이기준전압을유지하 도록하는피드백제어의일종으로, 비례(Proportional) 제어와비례적분 (Proportional-integral) 제어, 비례미분(Proportional-derivative) 제어를조합한것이 다. 비례제어(P) 는기준신호와현재신호사이의오차신호에적당한비례상수이 득을곱해서제어신호를만든다. 비례적분제어(I) 는오차신호를적분하여제어신 호를만드는적분제어를비례제어에병렬로연결해사용한다. 비례미분제어(D) 는 오차신호를미분하여제어신호를만드는미분제어를비례제어에병렬로연결하여 사용한다. 자동화시스템의반응을측정할뿐아니라반응을제어할때도사용되는 제어방법이며, 온도, 압력, 유량, 회전속도등을제어하기위해쓰이며, 과도상태의 특성등 PI나 PD 제어의문제점들을개선할수있다. - 159 -
가) PID 제어기의 Ziegler-Nichols 튜닝규칙 Ziegler와 Nichols는주어진플랜트의과도응답특성에근거하여비례이득, 적분 시간, 그리고미분시간 의값을결정하는규칙을제안하였다. 이러한 PID 제어 기의파라미터결정, 즉 PID 제어기의튜닝은현장엔니지어들에의해플랜트에대한 실험을통하여이루어진다.Ziegler-Nichols 튜닝규칙에는제1방법과제2방법의두가 지가있다. 1 제 1방법 제 1방법에서는그림 6-6에서와같이단위계단입력에대한플랜트의응답을실험 에의하여얻는다. 플랜트가적분기나주요폐루프극점을갖고있지않다면단위계 단응답곡선은그림 6-7과같은 S 형곡선이된다. 이방법은계단응답이 S형곡선이 될때만사용할수있다. 이러한계단응답곡선은실험이나플랜트에대한동적시뮬 레이션을통하여얻을수있다. Fig. 6-6 Step stair response of plant. Fig. 6-7 Response curve of S-type. - 160 -
S형곡선의특성은지연시간 L과시정수 T 로표현될수있다. 지연시간과시정수 는그림 6-7에표시한것처럼 S형곡선의변곡점에서그은접선과시간축및 인선과의교점을구함으로써결정된다. 그러면전달함수 를식 (6-1) 과같은운반지연을갖는 1 차시스템으로근사화할수있다. 식 (6-1) Ziegler와 Nichols는표 6-4의공식에따라,, 값을결정하는규칙을제 안하였다. Table 6-4 Ziegler-Nichols's tuning first rule 제어기의형태 P 0 PI 0 PID Ziegler-Nichols 제 1방법의규칙에의하여튜닝된 PID 제어기는식 (6-2) 와같다. 식 (6-2) - 161 -
따라서이 PID 제어기는원점에극점을, 에 2 중영점을갖는다. 2 제 2방법 제 2방법에서는먼저, 으로설정한다. 그림 6-8과같이비례제어동 작만을사용하여, 값을 0에서부터증가시키면서출력이최초로지속적인진동을 하게되는임계값 을찾는다. 이렇게임계이득 과이에해당하는주기 을 그림 6-9 와같이실험적으로구할수있다. Ziegler와 Nichols는표 6-5의공식에 따라,, 값을결정하는규칙을제안하였다. Fig. 6-8 Closed-loop system with proportional controller. Fig. 6-9 Continuous vibration with cycle. - 162 -
Table 6-5 Ziegler-Nichols's tuning second rule 제어기의형태 P 0 PI 0 PID Ziegler-Nichols 제 2방법의규칙에의하여튜닝된 PID 제어기는식 (6-3) 과같다. 식 (6-3) 따라서 PID 제어기는원점에극점을, 에 2 중영점을갖는다. 시스템의전달함수와같은수학적모델이주어져있다면, 근궤적법을이용하여임 계이득 과임계주파수 을찾을수도있다. 즉, 이값들은근궤적 가지와 측의교점으로부터얻을수도있다. 나. 분광모듈의재현성및정확도분석 원유휴대용품질판정시스템의분광모듈은고성능분광광도계를이용한실험결과 를기본으로체세포수예측을위한가시광선영역의분광모듈과성분조성예측을위 한근적외선영역의분광모듈을각각선정하였다. 또한그림 6-10과같이각각의분 광모듈의재현성및정확도를고성능분광광도계와비교 분석하였다. 광섬유프로브 - 163 -
를이용한가시광선분광모듈과고성능분광광도계를이용하여원유의반사스펙트럼을측정한결과그림 6-11과같이 350 ~ 1000 nm 영역과 850 ~ 1700 nm 영역에서고성능분광광도계와유사한패턴을보이고있으나전체적인흡광도가낮아지는현상을보이는데이것은광섬유프로브사용에따라광량이감소되었기때문으로판단된다. Fig. 6-10 Portable VIS spectrometer(left), NIR spectrometer(middle), and laboratory VIS/NIR spectrometer(right). Fig. 6-11 A typical reflectance spectra of milk sample using portable VIS spectrometer(left), portable NIR spectrometer(middle), and laboratory VIS/NIR spectrometer(right). 분광모듈의재현성분석은동일한원유시료에대하여가시광선분광모듈, 근적외 선분광모듈과고성능분광광도계를이용하여각각 30회씩반사스펙트럼을반복측 정하여표 6-6 과같이각파장영역에대한표준편차를분석하였다. 표준편차는가시 광선분광모듈, 근적외선모듈을고성능분광광도계와동일한검출영역인 350 ~ 1000 nm, 850 ~ 1700 nm 에대하여분석하였다. 각파장영역에대한표준편차의평 - 164 -
균은가시광선분광모듈이 0.0095, 고성능분광광도계는 0.0071 로나타났으며, 근적외 선분광모듈과고성능분광광도계는각각 0.0094와 0.0072로나타나가시광선분광모 듈과근적외선분광모듈의재현성이다소낮게측정되었으나큰차이는없어착유현 장에서사용하기에는무리가없음을알수있다. Table 6-6 Performance of portable and laboratory spectrometer Wavelength Items Std. (Number = 30) Max. Avg. Min. 350 ~ 1,000 nm 850 ~ 1,700 nm Portable 0.0151 0.0095 0.0054 Laboratory 0.0099 0.0071 0.0046 Portable 0.0151 0.0094 0.0054 Laboratory 0.0098 0.0072 0.0045 다. 인터페이스모듈을포함한시스템제어부설계및제작 원유휴대용품질판정시스템의제어부는그림 6-12 와같이시료공급장치, 온도제 어장치등의전처리부및분광모듈의제어를위한 I/O 인터페이스(USB-6009, National Instrument, USA) 와측정된시료의스펙트럼을이용하여실시간원유의품 질측정이가능한임베디드모듈(Nano-ITX, VIA, Taiwan) 로설계하였다. - 165 -
Fig. 6-12 I/O interface module(left) and embedded module(right). I/O 인터페이스는임베디드모듈과 USB로연결되어고속의통신이가능하며최대 8 채널의아날로그입력, 12 채널의디지털입/ 출력, 1 채널의카운터와아날로그출 력을가지고있으며, 14 bit의분해능으로 48 k 의샘플링이가능하다. 임베디드모듈 은윈도우기반의마이크로컨트롤러를사용하였으며, 자체적으로 USB, TCP/IP, Serial 포트를내장하고있어외부와의통신이용이한장점이있다. 원유와시약의일 정량을제어하는시료공급장치의유량펌프는 I/O 인터페이스의디지털출력 (ON/OFF) 에의하여혼합용기에원유와시약을공급하며, 혼합시료의온도를제어하 는온도제어장치의열전소자는측온저항체의온도를입력받은 I/O 인터페이스의디 지털출력에의해혼합시료의온도를일정하게유지한다. 또한측정된시료의스펙트 럼은흡광도(log(1/R)) 로변환되어 RS-232C 통신으로임베디드모듈에저장되며, 그 전체적인사양은표 6-7 과같다. - 166 -
Table 6-7 Specifications of I/O interface and embedded module Items I/O interface module Function Resolution Specifications Analog in/out, Digital in/out, Counter-timer 14 bit(48 ks/s) Input range -10 ~ +10 Embedded controller Microprocessor I/O Connectors OS VIA Luke CoreFusion TM processor USB, RS-232C, TCP/IP Microsoft windows xp 라. 분광장치의설계및제작 품질측정을위한분광장치는광원, 샘플셀, 검출장치및광프로브로구성하였 으며, 전체적인사양은표 6-8 과같이구성하였다. Table 6-8 Specifications of portable quality evaluation system Items Specifications Lamp Tungsten-halogen Light source Spectral range 360 ~ 2000 nm Power 12 VDC / 6.5 watts Fiber-optics Fiber type Singe fiber, 300 μm diameter Sample cell & holder Flow cell 1.5 mm pass length Wavelength 350 ~ 1000 nm VIS Detector Data interval Detector 0.18 nm Linear CCD array 3648 pixels Wavelength 850 ~ 1700 nm NIR Detector Data interval Detector 1.7 nm InGaAs linear array 512 pixels - 167 -
광원장치는그림 6-13 과같이가시광선/ 근적외선영역에서안정적인광특성을갖는 6.5 watts의텅스텐- 할로겐램프를사용하였으며, 자체적으로필터를교환하여광량의 조절이가능하도록설계하였다. 시료의스펙트럼측정을위한샘플셀은원유의투과 스펙트럼측정을위하여상 하로원유시료의이동이가능한 Flow 셀로구성하였으 며, 좌 우부분은시료의광투과성을높이기위해석영으로제작하였다. Fig. 6-13 Sample holder(left) and light source(right) for spectra measurements. 광원에서조사된빛과원유시료를투과한빛의이동경로인광프로브는직경이 300 μm 인것을사용하여빛의이동이용이하도록하였으며, 원유시료를투과된빛은 Y 형광프로브를이용하여가시광선영역과근적외선영역의검출기에각각전달하도 록설계하였다. 검출장치는원유의체세포수측정을위한가시광선영역의검출장치와성분조성측 정을위한근적외선의검출장치를각각사용하였다. 가시광선영역의검출장치는 CCD 어레이타입으로 350 ~ 1,000 nm 영역을 0.18 nm 간격으로측정이가능한스 펙트로미터(USB4000-VIS-NIR, Ocean Optics, USA) 를사용하였다. 근적외선영역의 검출장치는 InGaAs 어레이타입으로 850 ~ 1,700 nm 영역을 1.7 nm 간격으로측정 이가능한스펙트로미터(NIR512, Ocean Optics, USA) 를사용하였다. 광원부에서나 와시료와광섬유프로브를통과한빛( 투과또는반사) 은그림 6-14와같이각분광 기에내장된초소형오목회절발(Grating) 에의해파장대별로분리되어다중채널 CCD, InGaAs 검출기및증폭회로에의해전기적인신호로변환되며각각의스펙트 - 168 -
로미터는 USB 인터페이스를통하여가시광선영역과근적외선영역의원유스펙트럼 을시스템제어장치에전달하게된다. Fig. 6-14 VIS detector and NIR detector with light source and sample holder. 전원공급부는현장에서실시간원유의품질측정을위해휴대가가능하도록리듐-이 온방식의배터리셀을사용하였으며, 90 ~ 250 V의교류를이용하여충전이가능하 며연속적으로현장에서약 6 시간정도의품질측정이가능하도록설계하였다. 2. 원유의휴대용품질판정시스템의제어알고리즘및품질판정프로그램개발 가. 시료공급, 시료혼합, 온도제어알고리즘개발 1) 시료의공급량제어 제작된원유의휴대용품질판정시스템의시료공급성능을평가하기위해증류수를 사용하여공급속도를변화시키면서각각의펌프를통해토출된증류수의체적을 반복측정하였다. 이때, 각각의공급량은원유와시약의혼합비(20:1) 와샘플홀더의체 적을고려하여 5 ml과 0.25 ml 로선정하였다( 최등, 2006). 증류수의공급량은유량 펌프의공급전압을 6 V에서 12 V까지 1 V 단위로변화시켜유량 2.1 ~ 6.1 ml/min 의범위에서각각의토출된증류수의무게를측정하였고, 증류수의밀도(0.998 5회 g/ml) 를이용하여환산하는방법으로증류수의체적을계산하였다. 측정된증류수의 체적은선정된공급량과통계분석프로그램인 SAS(9.1, SAS Institute, USA) 를이용 - 169 -
하여유의수준 1 % 에서 t- 검정을수행하였다. 2) 시료의혼합상태제어 원유의휴대용품질판정시스템의시료혼합성능의평가를위해원유 5 ml과시 약 0.25 ml 를사용하여혼합용기에공급한후, 수동으로흔들어섞는방법, 팬을사 용하지않은방법, 전처리장치의팬을 2,150 rpm(6 V), 2,870 rpm(8 V), 3,580 rpm(10 V), 4,300 rpm(12 V), 5,020 rpm(14 V) 로회전시키는방법에대하여각각 5 분간시 료를혼합하였다. 이때, 원유와시약의온도는 40 로유지하였으며, 외기온도는 22 로측정되었다. 첨가된시약은원유의체세포수와성분조성예측모델개발에사용 된시약중 Reasazurin 시약을사용하였으며, 원유와시약을혼합한후에혼합된시 료의 5 개지점에대해동일한양을마이크로피펫으로수집하여액체색차계(JS555, Color techno system, Japan) 로 Lab값을 5 회반복측정하였다. 또한현재상용화되어 사용되고있는교반장치와의혼합성능을비교 평가하기위해전자식교반장치의 Lab 값을기준(Reference) 으로하여혼합방법에따른각각의 Lab값차이를비교하였 다. 혼합성능평가는식 (6-4) 와같이색차값(Color difference) 을이용하였으며, 통계 분석프로그램인 SAS로유의수준 1% 에서일원분산분석(One-way ANOVA) 과최소 유의차(Least Significant Difference, LSD) 검정을수행하였다. 식 (6-4) : 전자식교반장치로혼합한방법과의색차값,, : 혼합방법에따른 Lab값,, : 기준방법의 Lab값 3) 온도제어 제작된시스템의온도제어성능은외기온도와혼합된시료 5.25 ml의온도를변 화시키면서설정온도 40 에도달하는데필요한정착시간(Setting time) 과시료의 초기온도를측정하여분석하였다. 시료의초기온도와외기온도를변화하며시료의 온도가 0.5 의오차범위를유지하는상태를정착시간으로측정하였으며, 시료가설 - 170 -
정온도(40 ) 에도달한후 30 초간격으로 5 분간시료의온도를측정하여설정온 도 40 와의온도차이(RMSE) 를비교 분석하였다. 시료의초기온도는우유의저장 조건을고려하여냉장보관(4 ), 상온(25 ), 착유직후(35 ) 의 3수준으로설정하 였으며, 외기온도는 17 ( 외부온도), 22 ( 실내온도), 31 ( 난방상태의온도) 로 변화하며각각실험을수행하였다. 나. 임베디드시스템을이용한시스템제어장치 제작된원유의휴대용품질판정시스템의임베디드모듈을통해원유의시료공급, 시료혼합, 온도제어를하여그성능을평가하였다. 시료공급의경우표 6-9와같이 유량펌프속도를 2.1 ~ 6.1 ml/min로변화하며시료셀에우유용펌프로공급한결 과펌프의속도에관계없이 4.995 ~ 5.005 ml를공급하여유의수준 1 % 이내에서 5 ml 의공급량이정확하게제어되고있음을알수있다. 또한시약용펌프도공급속 도에관계없이 0.249 ~ 0.253 ml 가공급하였으며, 혼합비도 19.8 ~ 20.1 : 1로유지되어시료의공급이설정된수준으로제어되고있음을알수있다. Table 6-9 Results of volume control Flow rate (ml/min) 5 ml (milk) 0.25 ml (reaction reagent) Mixed ratio Avg.(mL) Std.(mL) Avg.(mL) Std.(mL) (20 : 1) 2.1 4.997 0.0062 0.250 0.0034 20.0 : 1 2.6 4.998 0.0079 0.250 0.0039 20.0 : 1 3.2 4.999 0.0066 0.250 0.0035 20.0 : 1 4.2 4.997 0.0078 0.249 0.0030 20.1 : 1 4.7 5.003 0.0063 0.253 0.0036 19.8 : 1 5.4 4.995 0.0071 0.250 0.0047 20.0 : 1 6.1 5.005 0.0059 0.249 0.0039 20.1 : 1 표 6-10은제작된시스템의시료혼합성능을평가하여기준방법과비교하기위해 시료셀에공급된우유 5 ml과시약 0.25 ml 를수동으로흔들어섞는방법, 팬을사 - 171 -
용하지않는경우, 시스템의팬속도를각각 2,150, 2,870, 3,580, 4,300, 5,020 rpm로 5 분간작동하는방법으로혼합한후 Lab값을측정하여기준방법인전자식교반장치 와의색차값을인자로최소유의차검정을수행한결과를보여주고있다. 일반적인수동으로흔들어섞는경우, 상용화된장치를이용한방법과의색차는평 균 0.20 로측정되어동일시료내에서도혼합상태가차이가있음을알수있다. 팬을 사용하지않은경우의색차는평균 8.77, 팬의속도를 2,150, 2,870, 3,580, 4,300, 5,020 rpm으로작동하여혼합한경우의색차는각각평균 14.11, 10.60, 7.93, 0.75, 0.41로나 타났다. 유의수준 1 % 에서수동으로흔들어섞는방법, 4300 rpm 으로혼합하는방법, 5,020 rpm 으로혼합하는방법의색차는차이가없으며, 기준방법과유사함을보여주 고있다. 팬속도를 4,300 rpm 이상으로작동하면시료가균일하게혼합됨을알수있 다. 2,150, 2,870, 3,580 rpm으로혼합한경우의색차는기준방법과분명한차이를보 이고있으며, 이것은팬의회전속도가충분하지못하여시료가균일하게혼합되고 있지못한것으로판단된다. Table 6-10 Results of color differences with different mixing methods Mixing method Color difference( ) Avg. Std. LSD F-value (Pr>F) With manual 0.20 0.13 a Without fan control 8.77 5.40 b With fan speed of 2,150 rpm 14.11 4.93 c With fan speed of 2,870 rpm 10.60 3.72 c With fan speed of 3,580 rpm 7.93 2.85 b 12.16 (<.0001) With fan speed of 4,300 rpm 0.75 0.15 a With fan speed of 5,020 rpm 0.74 0.14 a 시스템의온도제어성능을평가하기위해외기온도(17, 22, 31 ) 와시료의초기온도(4, 25, 35 ) 를변화하며설정온도에도달하는데필요한정착시간과설정온도 - 172 -
40 와온도차이(RMSE) 를비교한결과는표 6-11 과같다. 외기온도가 17 인경 우의시료의초기온도에따른정착시간은각각 11.5, 11.0, 9.56 분으로측정되었으며, RMSE는각각 0.24, 0.06, 0.08 로측정되어외기온도 17 에서설정온도에도달 하는시간은크게나타났으나, 설정온도를유지하고있음을알수있다. 외기온도가 22 인경우의시료의초기온도에따른정착시간은각각 10.5, 9.0, 7.5 분으로측정 되었으며, RMSE는각각 0.31, 0.10, 0.01 로측정되었으며, 외기온도가 31 인경 우의시료의초기온도에따른정착시간은각각 RMSE는각각 0.28, 0.15, 0.06 로측정되었다. 6.5, 5.5, 5.0 분으로측정되었으며, 시스템의온도제어성능은외기온도와시료의초기온도가낮을수록정착시간이 길어져시료의측정을위하여대기하는시간이증가하고있다. 그림 6-15와같이외 기온도 17 에서정착시간이 11.5 분으로가장많은시간이소요되었으나, 이는근 적외선광원이안정화되는데걸리는시간인 30 ~ 40 분(Choi 등, 2001) 보다짧은시 간이며, 실험시광원을켜지않았기때문에향후휴대용우유품질판정시스템의온 도제어는무리가없을것으로생각된다. Table 6-11 Results of temperature control tests of preprocessor Ambient temperature 17 22 31 Factor Mixture temperature 4 25 35 Setting time(min) 11.5 11.0 9.5 RMSE( ) 0.24 0.06 0.08 Setting time(min) 10.5 9.0 7.5 RMSE( ) 0.31 0.10 0.01 Setting time(min) 6.5 5.5 5.0 RMSE( ) 0.28 0.15 0.06-173 -
Fig. 6-15 Results of temperature control tests at ambient temperature of 17. 본연구에서는개발된원유의휴대용품질판정시스템의시료공급, 시료혼합, 온도 제어의성능을평가하였으며, 향후이결과는시스템의제어프로그램개발에이용하 였다. 시료공급은유량펌프의속도에관계없이일정량이제어되어측정시간과시스 템전원부의공급전압을고려하여 6.1 ml/min 으로선정하였다. 시료혼합의경우 4,300 rpm 이상에서기준방법과동일한혼합성능을보여전원부의전압을고려하여 5,020 rpm 으로선정하였으며, 온도제어는외기온도의영향을받지만시스템운영에 큰무리가없을것으로판단된다. 다. 1) 시스템제어알고리즘및품질판정프로그램 시스템제어알고리즘 시스템제어알고리즘은시료공급장치, 혼합장치, 온도제어장치, 스펙트럼측정 장치를포함한전체시스템을제어하도록개발하였으며, 그림 6-16과같은제어프로 그램을계측및제어프로그램의개발에용이한 Labview version 8.2(National Instrument, USA) 를이용하여개발하였다. - 174 -
Fig. 6-16 Control program of real time portable quality evaluation system of cow's milk. 원유의실시간휴대용품질판정시스템은사용자가시스템의전원을켜면전원장치 에의해시스템의각부위에전원이공급되며, 화면표시장치에 Initializing이라는메 시지와함께광원및온도제어장치의예열을위해 10 분이필요하다는메시지가출 력된다. 시스템의예열후, 제어프로그램의원유공급버튼과시약공급버튼을선택 하여각유량펌프에의해 6.1 ml/min 속도로원유와반응시약을혼합셀에공급하 게된다. 혼합셀에공급된원유와시약은팬에의해 5,020 rpm의속도로 5 분간혼 합되어진다. 이때온도제어장치는혼합셀에부착된측온저항체의온도를입력으로 하는 PID 제어알고리즘에의해열전소자를 On/off하여적정반응온도인 40 를유 지하도록개발하였다. 혼합시료는반응시간 5분동안반응한후사용자는시료공급 버튼을이용하여혼합된시료를 Flow 셀에공급할수있으며, 시료의공급후에는스 펙트럼측정을위해시료공급펌프가정지되고시료의스펙트럼을측정하게된다. 시료의스펙트럼측정은제어프로그램의데이터수집버튼을이용하여측정할수있 - 175 -
으며, 가시광선/ 근적외선스펙트로미터에의해검출된광학적특성신호는스펙트로미터의자체적인인터페이스모듈을통해전기적신호로변환되어시스템제어장치인 임베디드장치에서흡광도로변환되어저장된다. 스펙트럼측정이끝난시료는시료 공급버튼으로시료공급튜브의시료공급펌프를작동하여배출되며, 하나의시료가 측정되면원유공급라인에물을공급하여실리콘튜브, 혼합셀, 샘플홀더를세척한 후다음시료도동일한방법으로측정이가능하다. 또한측정된스펙트럼데이터는 임베디드장치의 TCP/IP, 시리얼및 USB 포트를통해프린터와연결하여인쇄가가 능하도록구성하였다. 2) 품질판정프로그램 스펙트럼측정시빛의산란으로발생하는오차를줄이고유성분의예측성능을높 이기위해그림 6-17 과같은전처리프로그램을개발하였으며, 그림 6-18과같은품 질판정프로그램을개발하여원유의품질을실시간평가하였다. Fig. 6-17 Preprocess program of spectrum. - 176 -
Fig. 6-18 Quality evaluation program of cow's milk. 예측모델개발을위해서는최적의스펙트럼이필요하며, 본연구에서는원유의원 시스펙트럼이빛의산란에따라발생하는측정오차를보정하기위해 1차및 2차미 분스펙트럼과다분산보정(MSC) 및표준정규화(SNV & Dtr.) 등이가능하도록스펙트 럼의전처리프로그램을개발하였다. 스펙트럼전치리프로그램은측정된스펙트럼 데이터를사용자가원하는형태로실시간변형이가능하며, 변형된스펙트럼은사용 자에게표시된후에유성분의모델개발에사용되어진다. 품질판정프로그램은측정된스펙트럼과유성분의기준값을이용하여 PLS 분석알 고리즘으로체세포수, 지방, 단백질, 유당, 총고형분의기준값과의상관관계를예측하 게된다. 모델개발은사용자가지정한일정크기단위로반복적으로모델을개발하 여가장상관관계가좋은파장영역대를자동으로선정하는 Moving windows 방법을 이용하여최적의파장영역을선정하였으며, 이때사용자는선정된파장영역을기본 으로하여각각의유성분예측을위한최적파장영역을선정할수있다. 또한개발 된각각의유성분예측모델을이용하여스펙트럼측정시실시간원유체세포수, 지 방, 단백질, 유당, 총고형분을평가하게된다. - 177 -
제 7 절전체시스템의현장적응성검토 1. 현장운영평가를통한시스템의정확도검토 휴대용원유품질판정시스템의현장운영평가를위해 2008년 2월 ~ 3 월경기, 강 원, 전남지역의원유시료 200여점을수집하여주변환경에따른원유성분의변화를 최소화하도록방부제처리한후, 안산의서울우유지도소에서표준화된원유성분분석 기(Combifoss) 를이용하여체세포수와성분조성을측정하였다. 선행된연구에서조사 된분포범위에서벗어나는시료를제외하였으며, 체세포수가 1 ~ 5등급까지균일하 게포함되도록 200 개의시료를선정하였다. 표 7-1과같이체세포수는 15,000 ~ 1,322,000 개, 지방은 2.47 ~ 6.40 %, 단백질은 2.50 ~ 4.25 %, 유당은 3.91 ~ 5.23 %, 총고형분은 10.59 ~ 15.81 % 의범위를보이고있다. 스펙트럼측정은지도소에서휴 대용품질판정시스템으로측정하였으며, 개발된휴대용시스템의성능평가를위해 성균관대학교로시료를운반하여 1 일이내에고성능분광광도계(NIRS 6500, Foss, Denmark) 를이용하여반사스펙트럼을측정하였다. Table 7-1 Chemical properties of milk tested (N = 200) Avg. Max. Min. Std. SCC Original 344,954 1,322,000 15,000 282,775 Log scale 5.54 6.12 4.18 4.54 Fat(%) 4.02 6.40 2.47 0.81 Protein(%) 3.31 4.25 2.50 0.44 Lactose(%) 4.71 5.23 3.91 0.42 TS(%) 12.71 15.81 10.59 0.71 실험은그림 7-1과같이성분분석이완료된원유시료를방부제처리하여사용하 였으며, 온도에따른유성분의영향을줄이기위해원유의온도를 40 로유지한후 에 Resazurin 시약을첨가하여 5분간반응후에개발된휴대용시스템과고성능분광 - 178 -
광도계를이용하여스펙트럼을측정하였다. Fig. 7-1 Schematic of experiment condition for spectra measurements. 원유성분의예측모델을개발하기위해서휴대용시스템과고성능분광광도계로 측정된각각의전체스펙트럼의 50 % 를교정부로, 50 % 를검증부로분류하였다. 각 성분을크기순서로정렬한후순차적으로교정부와검증부로분류하여교정부와검 증부가유사한크기와범위를갖도록조정하였다. 예측모델은다양한화학적성분조 성을갖는시료분석에적합한부분최소자승법(PLS) 을이용하여원유시료의스펙트 럼과각성분과의상관관계를분석하였다. PLS 분석은개발한품질판정프로그램을 사용하였으며, 예측모델을개발하기위해원시스펙트럼(Raw spectrum) 과빛의산 란을보정하기위한수처리방법(Mathematical treatment) 인다분산보정 (Multiplicative scatter correction, MSC) 을사용하였다. 또한 PLS 모델은개발된모 델의신뢰성을높이기위해교차검증(Cross validation) 을이용하였으며, 최대팩터수 (Factor) 를 20 으로설정하고각각의팩터에대한상관계수(R) 와교정부오차(Standard error of calibration, SEC) 를비교하여최적모델을개발하였다. 또한개발된모델의 예측성능은검증부상관계수(R) 와검증부오차(Standard error of prediction, SEP) 를 이용하여평가하였다. 휴대용원유품질판정시스템의성능평가를위해표 7-2와같이고성능분광광도 계로측정한스펙트럼과품질판정시스템으로측정한스펙트럼을이용하여원유의각 성분에대한예측모델을개발하였다. 표 7-2와같이고성능분광광도계로측정하여 예측모델을개발한경우, 체세포수는 400 ~ 600 nm에서상관관계가있는것으로나 타났으며, 검증결과상관계수는 0.90, 오차는 10,863 개로나타났다. 지방은 1,300 ~ 1,500 nm 에서상관관계가있는것으로나타났으며, 검증결과상관계수는 0.96, 오차 - 179 -
는 0.38 로나타났다. 단백질은 1,400 ~ 1,700 nm에서상관관계가있는것으로나타났 으며, 검증결과상관계수는 0.96, 오차는 0.16 으로나타났다. 유당은 1,200 ~ 1,700 nm 에서상관관계가있는것으로나타났으며, 검증결과상관계수는 0.91, 오차는 0.19 로나타났다. 총고형분은 1,300 ~ 1,500 nm 에서상관관계가있는것으로나타났으며, 검증결과상관계수는 0.97, 오차는 0.27 로나타났다. 휴대용원유품질판정시스템으로측정하여예측모델을개발한결과체세포수는그 림 7-2와같이 400 ~ 700 nm 에서상관관계를보였으며, 검증한결과상관계수와오 차는각각 0.85와 13,111 개로나타났다. 지방은그림 7-3과같이 1,200 ~ 1,500 nm 에서상관관계를보였으며, 검증한결과상관계수는 0.95, 오차는 0.45 로나타났다. 단 백질은그림 7-4와같이 1,400 ~ 1,600 nm 에서상관관계를보였으며, 검증한결과 상관계수는 0.92, 오차는 0.23 으로나타났다. 유당은그림 7-5와같이 1,300 ~ 1,600 nm 에서상관관계를보였으며, 검증한결과상관계수는 0.86, 오차는 0.33으로나타났 다. 총고형분은그림 7-6과같이 1,300 ~ 1,500 nm 에서상관관계를보였으며, 검증한 결과상관계수는 0.92, 오차는 0.38 로나타났다. - 180 -
Table 7-2 PLS result of calibration for each spectrum measurement Wavelength Calibration Prediction Factor R SEC R SEP SCC Laboratory 400~600 8 0.93 Portable 400~700 8 0.91 0.13 (8,375) 0.18 (10,961) 0.90 0.85 0.17 (10,863) 0.21 (13,111) Laboratory 1,300~1,500 7 0.99 0.08 0.96 0.38 Fat(%) Portable 1,200~1,500 8 0.98 0.11 0.95 0.45 Laboratory 1,400~1,700 8 0.98 0.10 0.96 0.16 Protein(%) Portable 1,400~1,600 7 0.95 0.19 0.92 0.23 Laboratory 1,200~1,700 9 0.93 0.16 0.91 0.19 Lactose(%) Portable 1,300~1,600 10 0.90 0.18 0.86 0.33 Laboratory 1,300~1,500 11 0.99 0.09 0.97 0.27 TS(%) Portable 1,300~1,500 10 0.96 0.23 0.92 0.38-181 -
Fig. 7-2 Prediction of SCC by milk with Resazurin using 400 ~ 700 nm. Fig. 7-3 Prediction of fat by milk with Resazurin using 1200 ~ 1500 nm. - 182 -
Fig. 7-4 Prediction of protein by milk with Resazurin using 1400 ~ 1600 nm. Fig. 7-5 Prediction of lactose by milk with Resazurin using 1300 ~ 1600 nm. - 183 -
Fig. 7-6 Prediction of TS by milk with Resazurin using 1300 ~ 1500 nm. 휴대용원유의품질판정시스템의각원유성분에대한예측성능은고성능분광광 도계의성능보다다소낮은것으로나타났으나착유현장에서실시간우유의품질을 평가하여저능력우를판별하고고품질우유에대한관리를하는데무리가없을것으 로판단된다. 또한휴대용시스템과고성능분광광도계에서각원유성분의예측모델 이개발된파장영역이다소차이가나는것으로나타났으며, 이는품질판정시스템은 스펙트럼측정방식, 광원및검출기의차이때문으로판단된다. 2. 현장적응및측정환경에따른문제점분석 휴대용원유의품질판정시스템의현장평가결과는표 7-3 과같다. 예열시간은고 성능분광광도계는 30 ~ 40 분, 휴대용품질판정시스템은 10분으로예열을위한시 간이적게필요하여현장에서의측정이용이함을알수있다. 휴대성은고성능분광광도계의경우현장에서휴대하여사용이불가능하여주로연 구실에서안정된상태에서만사용할수있으며, 휴대용품질판정시스템은휴대성및 이동성이용의하여현장에서실시간유성분의품질평가가가능함을알수있다. 우유및반응시료를위한전처리는고성능분광광도계의경우사용자가항온수 - 184 -
조, 마이크로피펫등을이용하여직접우유의예열하고정량으로혼합및공급해야 하는불편함이있으며, 휴대용시스템의경우사용자가우유시료및반응시약만있 으면, 자동으로시료공급, 온도제어, 혼합이가능하도록개발하였다. Table 7-3 Comparison of portable quality evaluation system and laboratory system 휴대용원유품질판정시스템 고성능분광광도계 예열시간 10 분 30~40 분 휴대성휴대가능휴대불가능 전처리자동수동 부대장비우유시료, 반응시약용기 우유시료, 반응시약용기항온주소, 마이크로피펫, PC 측정방식투과스펙트럼반사스펙트럼 정확도 측정오차 체세포수 : 90 % 지방 : 95 % 단백질 : 92 % 유당 : 86 % 총고형분 : 92 % 체세포수 : 13,111 개지방 : 0.45 % 단백질 : 0.23 % 유당 : 0.33 % 총고형분 : 0.38 % 체세포수 : 90 % 지방 : 96 % 단백질 : 96 % 유당 : 91 % 총고형분 : 97 % 체세포수 : 10,863 개지방 : 0.38 % 단백질 : 0.16 % 유당 : 0.19 % 총고형분 : 0.27 % 측정시간 6 분/ 점 10 분/ 점 측정방식투과스펙트럼반사스펙트럼 장비가격약 4천만원약 1억 3천만원 유성분예측성능의경우고성능분광광도계의정확도는체세포 90 %, 지방 96 %, - 185 -
단백질, 96 %, 유당, 91 %, 총고형분 97 % 로측정되었으며, 휴대용품질판정시스템 의정확도는체세포 90 %, 지방 96 %, 단백질, 96 %, 유당, 91 %, 총고형분 97 % 로 다소낮은검증결과를보여주고있다. 또한측정오차는고성능분광광도계의경우 체세포수 10,863 개, 지방 0.38 %, 단백질 0.16 %, 유당 0.19 %, 총고형분 0.27 % 로 측정되었으며, 휴대용품질판정시스템의경우체세포수 13,111 개, 지방 0.45 %, 단백 질 0.23 %, 유당 0.33 %, 총고형분 0.38 % 로다소높은검증오차를보여주고있다. 측정시간은고성능분광광도계가시료 1점에대하여 10 분이소요되었으며, 휴대용 품질판정시스템의경우 6분이소요되어 1 일(8 시간) 에각각 48점과 80점의측정이가 능하여휴대용품질판정시스템을이용하면우유시료의신속한품질판정이가능함을 알수있다. 그러므로원유의휴대용실시간품질판정시스템의원유품질요인측정에대한정 확도는상용화된원유품질분석장치에비해다소낮은예측력을보여주고있으나, 현장에서실시간품질판정을위한휴대성과고가의우유품질분석장치보다경제성이 우수하여축산농가및낙농현장에서유용하게사용될것으로판단된다. 원유의품질판정시스템은착유시축산농가및원유유통현장에서원유의체세포 수등을포함한유지방, 단백질, 유당등을측정하여젖소의개체별관리를통한고품 질우유의생산을도모할수있으며, 고품질원유의생산및공급, 젖소의개체별관 리, 분석장비의국산화등을고려할때본연구에서개발된휴대용원유품질판정 시스템의적용은낙농가의고품질우유생산에기틀을마련할것으로판단된다. 본 연구에서개발한휴대용원유품질판정시스템은착유시축산농가및원유유통현장 에서원유의체세포수등을포함한유지방, 단백질, 유당등을측정할수있으며, 이 러한원유의실시간품질측정은젖소의발육과영양상태를파악하여적절한급여사 료의단백질수준을조절할수있으므로사료비절감과혈중요소및암모니아과잉 등의질병예방이가능하고나아가고품질우유생산및공급이가능하므로축산농가 의소득증대및국민건강향상에기여할수있다. 또한축산농가와유통업체간의우 유생산비계산상의문제를해결하여효율적인유대지급기준의기틀을확립할수있을 것으로판단된다. 이를위해서는기업, 낙농협회, 낙농가의적극적인협동시스템의구축이필요하다. - 186 -
기업은고품질, 편의성의저렴한원유품질평가시스템을개발및판매해야하고낙 농협회는유대지급기준개선과함께낙농가의교육관리등에힘써야하며, 무엇보다 낙농가의착유우관리개선및원유품질향상에대한의지가바탕이되어야할것이 다. 이에개발된휴대용원유의품질판정시스템은원유의실시간품질판정으로국내 원유의품질향상에지대한영향을미치며, 해외에서수입된원유분석장비를이동 성과가격의저렴함을경쟁력으로하여국내원유의품질향상에일조할것으로판단 된다. - 187 -
제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 1 절연도별연구목표및평가의착안점 구분세부연구개발목표평가의착안점및기준가중치 1 차년도 (2006) 원유의 휴대용 품질판정 시스템 시작품제작 원유의 체세포수 측정 알고리즘 개발 시스템의적합성평가 50 % 알고리즘의정확성평가 20 % 원유의체세포수측정기술개발측정기술의정확성평가 30 % 2 차년도 (2007) 원유의 성분조성 측정 알고리즘 개발 휴대용 품질판정 시스템의 제어 알고리즘 및 품질판정 프로그램 개발 시스템의성능분석및현장적응 성검토 알고리즘의정확성평가 30 % 시스템의동작성능평가 20 % 효율성및적합성평가 20 % 원유의성분조성분석기술개발분석기술의정확성평가 30 % 원유의성분( 품질요인) 정기술개발 실시간측 개발된기술의적합성 평가 25 % 최종평가 근적외선분광법을이용한원유의품질판정알고리즘개발 개발된모델의예측능력평가 25 % 젖소원유의실시간휴대용품질판정시스템개발 휴대용품질판정시스템의성능및현장적응능력평가 50 % 합계 100 % - 188 -
제 2 절목표달성도 구분세부연구개발목표평가의착안점및기준달성도 1 차년도 (2006) 원유의 휴대용 품질판정 시스템 시작품제작 원유의 체세포수 측정 알고리즘 개발 시스템의적합성평가 100 % 알고리즘의정확성평가 100 % 원유의체세포수측정기술개발측정기술의정확성평가 100 % 2 차년도 (2007) 원유의 성분조성 측정 알고리즘 개발 휴대용 품질판정 시스템의 제어 알고리즘 및 품질판정 프로그램 개발 시스템의성능분석및현장적응 성검토 알고리즘의정확성평가 100 % 시스템의동작성능평가 100 % 효율성및적합성평가 100 % 원유의성분조성분석기술개발분석기술의정확성평가 100 % 원유의성분( 품질요인) 정기술개발 실시간측 개발된기술의적합성 평가 100 % 최종 평가 근적외선분광법을이용한원유의품질판정알고리즘개발젖소원유의실시간휴대용품질판정시스템개발 개발된모델의예측능력평가휴대용품질판정시스템의성능및현장적응능력평가 100 % 100 % - 189 -
제 3 절관련분야기여도 1. 시료의자동혼합장치 현재이화학적인분야에서사용하는시료의혼합방법은주로기계식교반장치나 마그네틱바를혼합시료에담그고회전하는방법을사용하고있으나이는사용자가 수동으로작동해야하며, 관련장비가있어야사용이가능한단점이있다. 그러므로어 떤경우에는사용자가교반을위하여손으로흔드는방법, 유리막대로젓는방법등 을사용하는데이러한혼합방법은현장에서실시간품질측정에는사용이불가능한 단점이있으며, 시료처리에관한전문지식이필요하다. 그러므로본연구에서개발 된실시간우유와반응시약의혼합이자동으로되는혼합장치는현장에서휴대하여 혼합할수있는장점이있어휴대용품질측정분야뿐만아니라현장에서시료와시약 을혼합하는데적용이가능하다. 2. 반응시약을이용한미생물측정분야에활용 가시광선/ 근적외선은높은에너지전위를가지므로주로시료를전처리하지않고 측정하거나시료의특성상전처리가필요한경우에만사용하였다. 그러므로현재개 발된대부분의예측모델은시료의광학적특성만을이용한것이대부분이며, 체가가시광선/ 근적외선과의상관관계가낮은경우에는사용이불가능하였다. 시료자 그러나 현재개발된우유의품질판정기술은기존에연구된체세포수예측모델의상관관계가 낮은것에반해체세포수와반응하는반응시약을선정하고첨가하여좋은상관관계 를나타내고있어이러한방법을응용하면, 미생물분야등다양한분야에서가시광 선/ 근적외선분광분석법을활용하기위한연구가활발히진행될것으로판단된다. 3. 비례미분적분(PID) 제어를이용한온도제어 본연구에서우유시료의온도유지를위해개발된 PID 제어는사용자가원하는 온도를설정하면열전소자와 On/off 제어를이용하여열전소자의전압을공급하고끊 어주는방법으로자동으로적정온도를유지하도록개발하였다. 이러한온도제어방법 은크게인공지능빌딩및자동차의적정온도유지에적용이가능하며, 특히현재활 - 190 -
발한연구가진행되고있는태양열에너지를이용한난방분야에적용이가능하다. 4. 액상시료를이용한제품제조공정의자동화 현재개발된원유의품질판정시스템은시료의자동공급, 온도제어, 혼합등의전처 리가가능하며, 동시에품질판정이가능한장점이있다. 이와같은성능은석유의정 제공정, 발효공정등의제품제조공정에서시료의공급, 온도유지, 혼합등을통한 전처리와동시에품질을측정하여부족한성분을추가적으로자동공급하고필요에 따라정제공정을계속적으로반복하는등의공정을자동화하는데활용될수있다. 5. 휴대용분광분석기 본연구에서개발된원유의품질측정을위한휴대용분광분석기는광원, 시료측정 용셀, 광프로브, 광검출기를포함하여시스템의인터페이스장치및제어장치와시 료의전처리장치들로구성하였다. 휴대용원유의품질측정을위한휴대용분광분석 기의개발기술은현재근적외선분광분석법이사용되는농업과식품등의다양한분 야에적용이가능하며, 특히 FTA에따른수입품의안정성및원산지판별에활용될 것이다. 또한휴대용분광분석기는현장에서실시간품질평가및기초분석에사용이 가능하고장비의가격이비교적저렴한장점까지있어해외에서수입되는고가의장 비를대체하는효과가있다. 6. 스펙트럼전처리및품질판정프로그램 본연구에서는광원의산란현상을보정하기위해스펙트럼을안정화시키는분산 보정(MSC), 표준정규화(SNV & Dtr.) 와 1차미분및 2차미분이가능하도록전처리 프로그램을개발하였다. 또한자체적으로부분최소자승법(PLS) 을이용한품질판정프 로그램을개발하여원유시료의스펙트럼측정과동시에전처리후에품질판정이가 능하도록스펙트럼전처리및품질판정프로그램을개발하였다. 품질판정프로그램은 사용자가원하는크기의정하여전체영역을대상으로원하는성분값과가장상관관계가높은파장영역을선정하도록개발하여품질분석및전문지식이없는사용자도편하게사용이가능하도록개발하였다. 또한전처리및품질판정프로그램은상호연 - 191 -
관되어작동이가능하도록개발하여원시스펙트럼및사용자가원하는전처리상태 를선택하면자동으로품질판정모델을개발할수있도록설계하였다. 본연구에서 개발된스펙트럼전처리및품질판정프로그램은가시광선/ 근적외선분광법을이용하 여예측모델을개발하는다양한분야에서사용이가능하며, 또한다양한통계모델 개발분야에서도활용될수있다. 7. 착유기장치에의응용 현재해외의낙농선진국에서는고품질우유의생산을위해젖소의개철별관리및 영양관리에주력을다하고있는실정이다. 그러므로본연구에서개발된휴대용원 유의품질판정시스템으로착유와동시에젖소개체별로실시간품질을측정하여젖 소의건강및우유의등급관리를가능하게하며, 저능력우의판별을하여생산된원 유의고품질화에일조할것이다. 8. 젖소의개별맞춤형영양관리시스템개발 본연구에서는우유의체세포수, 지방, 단백질. 유당및총고형분의측정이가능한 품질판정시스템을개발하였으며, 이는주로고품질우유의생산기반을조성하기위 하여수행되었다. 그러나국외낙농선진국에서는기존의우유품질관리를위해우유 의다양한인자를추가적으로측정하고있으며, 젖소영양상태의기준이되는요소태질소이다. 현재가장관심을갖고있는인자는 요소태질소는젖소사료속의에너지 균형을판단하는지표로젖소의사료를조절하고, 질병을예방하며, 분뇨로배출되는 질소의수준을조절하여환경오염을감소시키는데큰역할을하고있다. 또한요소태 질소는근적외선분광법에의하여이미적정파장영역이선정된상태이므로현재개발 된시스템에추가적으로적용하여고품질우유관리및젖소의영양관리를통합적으 로할수있을것으로판단된다. 9. 고품질원유의등급유지를위한유통관리방법개선 국내의유가제도는주로대기업및유제품생산기업이낙농가에서우유의수집한후, 우유성분분석기의분석결과를토대로하여각각의낙농가별로유대지급기준 - 192 -
을마련하고있다. 그러나이러한유대지급기준은객관성및투명성이결여되므로 본연구에서개발된휴대용원유품질판정시스템을낙농가에보급하여낙농가가스 스로자신이생산한원유의품질을확인하여고품질의원유생산을위한기틀을마련 하여소비자의신뢰도를높일수있다. 또한계절별차등가격제와용도별차등가격제 등의도입을통한우유생산비계산상의문제점을해결하는데활용될것이다. 10. 수질및토양오염등의환경모니터링장비로의활용 현재국내수질및토양오염의측정절차는관련기관의전문가가일정한시간에직접방문하고대표시료를수집한후, 연구실에서분석하는방법으로수행되고있다. 그러나이러한품질분석방법은시간이오래걸리고전수조사가아니므로수질및토 양오염에대해효과적으로대체할수없는단점이있다. 본연구에서개발된휴대용 품질판정기술을응용하면수질의실시간자동공급을통한오염도측정및토양시 료의실시간오염도측정이가능할것으로판단된다. 또한현재활발히진행중인전 자지도(GIS) 와융합한다면수질및토양오염의오염원을실시간으로진단하는등환경분야에서중요한역할을할것이다. - 193 -
제 5 장연구개발결과의활용계획 제 1 절추가연구의필요성 1. 스펙트럼전처리기술 본연구에서는우유의스펙트럼전처리를위해자체적사용자기반의스펙트럼전 처리프로그램을개발하였다. 본연구에서개발된스펙트럼전처리프로그램은빛의 산란을보정하기위한 1차및 2 차미분과분산보정(Multiplicative scatter correction, MSC) 과표준정규화(Standard normal variate and detrending, SNV & Dtr.) 등의스 펙트럼보정이가능하며, 추가적으로다양한신호처리알고리즘을추가적으로적용이 가능하도록하였다. 또한사용자가동시에여러가지신호처리방법을사용할수있 도록개발하여사용자의편의성을증대하였다. 그러나가시광선/ 근적외선스펙트럼의신호는높은에너지전위에의하여주요성분이중첩되어나타나므로전체적인신호보정을위한신호처리알고리즘외에중첩된신호의해석또는분해가가능한다양한신호처리방법에관한연구가필요할것으로판단된다. 2. 우유의품질판정알고리즘 본연구에서는우유의실시간품질판정을위해자체적사용자기반의품질판정프 로그램을개발하였다. 본연구에서개발된품질판정프로그램은주로우유체세포수, 지방, 단백질, 유당, 총고형분의부분최소자승(Partial least square, PLS) 을기반으로 하는예측모델을개발하여예측성능을평가하였다. 현재국내외문헌및자료에서는 가시광선/ 근적외선분광법의예측모델개발은예측성능이우수한부분최소자승법을 사용하고있는실정이나여러가지분야의다양한알고리즘이적용된사례는많지않 다. 그러나부분최소자승법은스펙트럼과성분간의관계가주로선형적인관계에있 는경우에가장좋은예측력을보이고있으므로스펙트럼과성분이서로비선형적인 경우의예측성능은다소떨어지는경향이있어인공지능알고리즘을기반으로하는 퍼지(Fuzzy), 뉴럴네트워크(Neural network) 등의비선형예측이가능한다양한알고 - 194 -
리즘의적용이필요할것으로판단된다. 3. 반응시약및반응시간등의환경조건 본연구에서는우유의체세포수예측성능을높이기위해반응시약으로 Methyl red, Methylene blue, Bromcresol purple, Phenol red, Resazurin, Eosin-Y, Amido black 을사용하였다. 본연구에서사용한반응시약의선정기준은주로문헌및자료 조사를통하여이뤄졌으며, 본연구에서는 Resazurin 시약을사용한경우의예측성능 이가장우수하게나타났다. 그러나본연구에서사용한반응시약외에유사한종류 의많은시약이있어다양한시약의적용에따른체세포수예측모델의성능평가및 체세포수와반응시약간의반응에관한정확한구명이필요할것으로판단된다. 또한본연구에서사용한반응시간은주로현장에서실시간우유품질평가가가능 하도록반응시간을 0 분, 5 분, 10분으로 3수준으로만두어예측성능을분석하여가장 좋은예측성능을보이는 5 분을반응시간으로선정하였다. 그러나반응시간은모든 반응시약에대하여동일하게적용하였기때문에각각의반응시약에대한다양한반 응시간의적용및반응시간에따른우유체세포의반응조건구명이필요할것으로 판단된다. 4. 원유수집의지역적다양성 본연구에서는원유의체세포수와성분조성의측정기술개발과휴대용품질판정 시스템의성능평가를위해경기, 강원, 전남지역에서수집한원유를이용하였다. 그 러나원유는계절별, 지역별로성분조성이변할수있으므로향후사업화및상품화 를위해서는국내의다양한지역의우유시료수집및계절별시료수집을통한다양 한시료의분석이필요할것으로판단된다. 또한향후해외시장에진출하기위해서 는국외우유시료에대한수집및분석을통해국내우유의성분조성과의공통점 및차이점을분석하는것도필요할것으로판단된다. 5. 휴대용전원부 본연구에서개발한휴대용원유의품질판정시스템은주로착유현장에서실시간 - 195 -
원유의품질을분석하여개체별젖소관리를통한고품질우유의생산할수있는기 반을마련하기위해수행되었다. 착유시우유의실시간품질판정을위해서는밧데리 및전원부의개발이요구되며, 본연구에서사용된리튬-이온방식의배터리셀은외 부콘센트를이용하여계속적인충전이가능하지만, 한번충전에최대연속가능사 용시간이 요하다고판단된다. 6시간인단점이있어장시간안정된전원공급을위한배터리의개발이필 - 196 -
제 2 절타연구에의응용 1. 스펙트럼전처리및품질판정프로그램 본연구에서는광원의산란현상을보정하기위해스펙트럼을안정화시키는분산 보정(MSC), 표준정규화(SNV & Dtr.) 와 1차미분및 2차미분이가능하도록전처리 프로그램을개발하였다. 또한자체적으로부분최소자승법(PLS) 을이용한품질판정프 로그램을개발하여원유시료의스펙트럼측정과동시에전처리와품질판정이가능하 도록스펙트럼전처리및품질판정프로그램을개발하였다. 품질판정프로그램은사 용자가원하는크기의정하여전체영역을대상으로원하는성분값과가장상관관계 가높은파장영역을선정하도록개발하여품질분석및전문지식이없는사용자고편 하게사용이가능하도록개발하였다. 또한전처리및품질판정프로그램은상호연관 되어작동이가능하도록개발하여원시스펙트럼및사용자가원하는전처리상태를 선택하면자동으로품질판정모델을개발할수있도록설계하였다. 그러므로본연구 에서개발된스펙트럼전처리및품질판정프로그램은현재사용되는가시광선/ 근적 외선의예측모델개발을위하여다양한분야에서사용이가능하며, 또한다양한통계 의모델개발분야에서도편리하게응용이가능할것으로판단된다. 2. 휴대용분광분석기 본연구에서개발된원유의품질측정을위한휴대용분광분석기는광원, 시료측정 용셀, 광프로브, 광검출기를포함하여시스템의인터페이스장치및제어장치와시 료의전처리장치들로구성하였다. 휴대용원유의품질측정을위한휴대용분광분석 기의개발기술은현재근적외선분광분석법이사용되는농업과식품등의다양한분 야에적용이가능하며, 특히 FTA에따른수입품의안정성및원산지판별에유용하 게사용될것으로판단된다. 또한휴대용분광분석기는현장에서실시간품질평가및 기초분석에사용이가능하고장비의가격이비교적저렴한장점까지있어해외에서 수입되는고가의장비를대체할수있는방안이될것으로판단된다. - 197 -
3. 비례미분적분(PID) 제어를이용한온도제어 본연구에서우유시료의온도유지를위해개발된 PID 제어는사용자가원하는 온도를설정하면열전소자와 On/off 제어를이용하여열전소자의전압을공급하고끊 어주는방법으로자동으로적정온도를유지하도록개발하였다. 이러한온도제어방법 은크게인공지능빌딩및자동차의적정온도유지를위하여적용이가능하며, 특히 현재활발한연구가진행되고있는태양열에너지를이용한난방분야에응용이가능 할것으로판단된다. 4. 시료의자동혼합장치 현재이화학적인분야에서사용하는시료의혼합방법은주로기계식교반장치나 마그네틱바를혼합시료에담고회전하는방법을사용하고있는이는사용자가수동 으로작동해야하며, 관련장비가있어야사용이가능한단점이있다. 그러므로어떤 경우에는사용자가교반을위하여손으로흔드는방법, 유리막대로젓는방법등을 사용하는데이러한혼합방법은현장에서실시간품질측정을위해사용이불가능한 단점이있으며, 시료처리에관한전문지식이필요하다. 그러므로본연구에서는실 시간우유와반응시약의혼합을위해자동화된혼합장치를개발하였으며, 이는현 장에서휴대하여혼합할수있는장점이있어휴대용품질측정분야외에현장에서 시료와시약을혼합하는데적용이가능할것으로판단된다. 5. 착유기장치에의응용 현재해외의낙농선진국에서는고품질우유의생산을위해젖소의개체별관리및 영양관리에주력을다하고있는실정이다. 그러므로본연구에서개발된휴대용원 유의품질판정시스템으로착유와동시에젖소개체별로실시간품질을측정하여젖 소의건강및우유의등급을관리하는것이가능하며, 저능력우를판별하여생산된 원유의고품질화를달성할수있을것으로판단된다. 6. 젖소의개별맞춤형영양관리시스템개발 본연구에서는우유의체세포수, 지방, 단백질, 유당및총고형분의측정이가능한 - 198 -
품질판정시스템을개발하였으며, 이는주로고품질우유의생산기반을조성하기위 하여수행되었다. 그러나국외낙농선진국에서는기존의우유품질관리를위해우유 의다양한인자를추가적으로측정하고있으며, 젖소영양상태의기준이되는요소태질소이다. 현재가장관심을갖고있는인자는 요소태질소는젖소사료속의에너지 균형을판단하는지표로젖소의사료를조절하고, 질병을예방하며, 분뇨로배출되는 질소의수준을조절하여환경오염을감소시키는데큰역할을하고있다. 또한요소태 질소는근적외선분광법에의하여이미적정파장영역이선정된상태이므로현재개발 된시스템에추가적으로적용하여고품질우유관리및젖소의영양관리를통합적으 로할수있는시스템개발이가능할것으로판단된다. 7. 반응시약을이용한미생물측정분야에활용 가시광선/ 근적외선은높은에너지전위를가지므로주로시료를전처리하지않고 측정하거나시료의특성상전처리가필요한경우에만사용하였다. 그러므로현재개 발된대부분의예측모델은시료의광학적특성만을이용한것이대부분이며, 체가가시광선/ 근적외선과의상관관계가낮은경우에는사용이불가능하였다. 시료자 그러나 현재개발된우유의품질판정기술은기존에연구된체세포수예측모델의상관관계가 낮은것에반해체세포수와반응하는반응시약을선정하고첨가하여좋은상관관계 를나타내고있어이러한방법을응용하면, 기존에예측모델개발이어려웠던미생물 분야등의다양한분야에적용이가능할것으로판단된다. 8. 액상시료를이용한제품제조공정의자동화 현재개발된원유의품질판정시스템은시료의자동공급, 온도제어, 혼합등의전처 리가가능하며, 동시에품질판정이가능한장점이있다. 이와같은성능은석유의정 제공정, 발효공정등의제품제조공정에서시료의공급, 온도유지, 혼합등을통한 전처리와동시에품질을측정하여부족한성분을추가적으로자동공급하고필요에 따라정제공정을계속적으로반복하는등의제조공정분야에자동화를구축하는데 적용이가능할것으로판단된다. - 199 -
9. 수질및토양오염등의환경모니터링장비로의활용 현재국내수질및토양오염의측정절차는관련기관의전문가가일정한시간에직접방문하고대표시료를수집한후, 연구실에서분석하는방법으로수행되고있다. 그러나이러한품질분석방법은시간이오래걸리고전수조사가아니므로수질및토 양오염에대해효과적으로대체할수없는단점이있다. 그러므로본연구에서개발 된휴대용품질판정기술을응용하여수질의실시간자동공급을통한오염도측정 및토양시료의오염도측정에적용이가능할것으로판단된다. 또한현재활발히진 행중인전자지도(GIS) 와융합한다면수질및토양오염의오염원을실시간판단을통하여환경오염의원인에대해효과적으로대처할수있을것이다. 10. 고품질원유의등급유지를위한유통관리방법개선 국내의유가제도는주로대기업및유제품생산기업이낙농가에서우유의수집한 후, 우유성분분석기의분석결과를토대로하여각각의낙농가별로유대지급기준 을마련하고있다. 그러나이러한유대지급기준은객관성및투명성이결여되므로 본연구에서개발된휴대용원유품질판정시스템을낙농가에보급하여낙농가가스 스로자신이생산한원유의품질을확인하여고품질의원유생산을위한기틀을마련 하는데활용할수있다. 또한계절별차등가격제와용도별차등가격제등의도입을 통한우유생산비계산상의문제점을해결하는데응용할수있을것으로판단된다. - 200 -
제 3 절기업화추진방향 1. 유제품수출입현황 세계적으로자유무역협정(FTA) 체결이가속화되는추세속에서우리나라는공산품 의수출경쟁력강화를위해 FTA 를동시다발적으로추진하고있다. 우리나라는 2004 년 4월처음으로칠레와 FTA 를발효시킨바있으며, 2004년 11 월에는싱가포르와, 2005년 7 월에는유럽자유무역연합(EFTA) 4개국과각각 FTA 협상을타결하였다. 현 재는협상이중단된상태이지만 2003년 12월에시작된한일 FTA는 2004년 11월까지 6 차례의협상이진행되었고, 중국, 인도, 남미공동시장(MERCOSUR), 멕시코등과는 FTA 본협상이전단계인공동연구등을추진중에있다. 또한우리나라는미국과 FTA를추진하기위해 2005년에 3차례의사전실무점검협의를마치고 2006년본협 상에들어가가급적조기에 FTA 협상을마무리짓기위해노력하고있다. 그러나세 계 1위의농축산물수출대국인미국과의 FTA는여타 FTA보다도국내농업에심각 한피해를줄것으로예상된다. 선진각국의농산물및공산품은낮은관세로진출하 여자국상품과품질및가격에서치열한경쟁을할것으로보이고우리나라의경우 도많은농수축산물이점차로시장개방되고있으며우유를비롯한많은유제품이이 미개방되어품질및가격에서외국제품과경쟁하고있다. 이런산업현황속에서선진국에비해짧은역사를가지고있는국내낙농업및유 가공산업은물량에서는비약적인발전을이룩하여유제품수출액이그림 3-1과같이 조금씩증가하는추세에있으나국내유제품소비량의증가에따라유제품수입액이 크게증가하여국내유제품의수급불균형현상을초래하고있다. 우유및유제품의 국제경쟁력을향상시키기위해서는좋은품질의원유를저렴한가격으로생산해야 하나국내에서생산되는원유는품질과가격면에서선진국과많은차이를보이고있 어그림 실정이다. 3-2와같이유제품무역수지적자가해마다증가하여국제경쟁력에서불리한 - 201 -
700,000 600,000 500,000 수입 수출 금액 ( 원 ) 400,000 300,000 200,000 100,000 0 2001 년 2002 년 2003 년 2004 년 2005 년 2006 년 2007 년 연도 Fig. 3-1 연도별유제품수출입금액현황. 600,000 500,000 400,000 금액 ( 원 ) 300,000 200,000 100,000 0 2001 년 2002 년 2003 년 2004 년 2005 년 2006 년 2007 년 연도 Fig. 3-2 연도별유제품무역수지적자현황. - 202 -
2. 경쟁국의기술수준비교 우리나라의낙농업이국제경쟁에서불리한손꼽히는원인중하나로국내낙농기 술수준의낙후를들수있다. 국내낙농기술과주요경쟁대상국과의기술수준을비 교하면, 국내우유 kg당생산비는 446 원/kg(2001 년) 에서 483 원/kg(2005 년) 으로증가 하고있으며, 미국의우유생산비가 340 원/kg이며일본이 830 원/kg이고호주 190 원/kg(2004, 일본농림수산성) 으로일본에비해낮지만한국도주요낙농생산국에비 해높은수준을유지하고있다. 또한국별두당산유량은미국 9,086 kg, 일본 7,759 kg, 한국 7,506 kg, 중국 5,243 kg으로산유능력에는경쟁력이있으나표 3-1에서보 여주는바와같이개량기반이선진국에비해취약한실정이다. Table 3-1 젖소개량기반비교 구 분 기술수준비교 미국네덜란드일본한국 경산우사육두수( 천두) 9,227 1,486 1,124 305 우군검정두수( 천두) 4,287 1,248 523 132 검정참여비율 (%) 46.5 84 46.5 43.2 후대검정두수( 두/ 년) 1,258 390 185 15 선발강도 1/8 1/10 1/6 1/8 후보우당검정딸소수( 두) 83 60 36 20 경산우중후대검정딸소비율 (%) 6.9 15.0 3.5 2.0 한국종축개량협회 덴마크는 2001년원유ml내에체세포수 30만개이하가약 85 % 이며, 유질협회에서 우유를관리하고있는일본도체세포수 30만개이하가 74 %, 50개만이하가 92 % 를 기록하고있으며, 미국에서는낙농가의원유의체세포수를 10만개이하로감소시키는 것을장래의목표로삼고있다. 국내에서도위생등급제실시이후일시적으로체세포 수가개선되었지만 1997년이후에는체세포수개선정도가미진하여체세포수 50만개 - 203 -
이상의 3등급농가분포율이전체의 30 % 전후로나타났다. 이러한체세포수증가의 원인은국내낙농업이전업화, 규모화되면서농가별평균사육두수의증가로개체별 관리의한계를보이고, 제한된공간에서농후사료위주의열악한사육환경과예방적 인차원에서체세포수관리프로그램의적극적인도입이되고있지않기때문이다. 3. 경쟁력확보방안 2007년 12월국내의낙농가수는 7,657호로전분기대비 2.0 % 감소하였다. 국내의 낙농가수는그림 3-3과같이매분기 1 ~ 2 % 씩감소세를보이며 50두이상의사육 두수를가진낙농가는그림 3-4와같이 57 % 로 2007년 3월이후 50 % 대진입후 지속적인증가를보이고있어낙농가의규모가점차커지고있음을알수있다. 국내낙농가의규모가점차커짐에따라사육두수의규모도커지고있어효과적인 우유품질관리방법이필요한실정이다. 현재시행되고있는원유의품질관리는여 러젖소로부터수집하여혼합된원유의샘플을이용하여전수조사가아닌표본조사에 의존하고있으므로품질이낮은젖소의원유를선택적으로제거하기가어렵고다른 원유시료와혼합되어전체적인품질저하를초래하게된다. 그러므로고품질우유 생산을위해서는착유현장에서실시간원유의품질요인을측정하는등의등급별원 유관리가필요하다. 현재덴마크, 미국, 일본등에서는소득증대와웰빙시대에발맞추 어기존의유대지급기준인체세포수, 지방, 단백질이외에유당, 총고형분, 수분등을 추가로하였으며세균수와체세포수가일정한계를넘을때에는집유정지를가하고 벌과금을부과하는등고품질우유생산에심혈을기울이고있다. 국내의경우 1972 년이전에는물량위주로유대지급을하였으며, 1992년까지는유지방율을기준으로 유대를지불하였다. 1993년 6 월부터는유지방율과유대차등지불제를시작하였으며, 1995년 10월부터는세균수와체세포수의등급기준을위생등급에따른우유값의차등 지급제로시행하여위생적인우유생산에큰효과를거두었으나고품질원유의관리에 는미비한실정이다. 유대기준을높이는것은낙농가로하여금고품질우유생산을 위해노력하도록하는방편은되지만, 현재고품질우유생산을위한우유품질관리 가가능한시스템은없는실정이다. - 204 -
8400 8300 8200 8100 8000 7900 7800 7700 7600 7500 7400 7300 8260 8138 7949 7810 7657 06. 12 07. 3 07. 6 07. 9 07. 12 Fig. 3-3 국내낙농가수( 호). Fig. 3-4 사육규모별낙농가비율. - 205 -