Printed in the Republic of Korea ANALYTICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Vol. 27, No. 6, 339-346, 2014 http://dx.doi.org/10.5806/ast.2014.27.6.339 Note ( 단신 ) Validation of urinary N-methylacetamide reference material for proficiency test Mi-Young Lee Korea Occupational and Health Agency, Industrial Safety and Health Research Institute, Ulsan 681-230, Korea (Received November 18, 2014; Revised December 8, 2014; Accepted December 8, 2014) 숙련도시험을위한소변중 N- 메틸아세트아미드표준시료검증 이미영 한국산업안전보건공단산업안전보건연구원 (2014. 11. 18. 접수, 2014. 12. 8. 수정, 2014. 12. 8. 승인 ) Abstract: The author assessed the availability of urine reference material for proficiency test provided for laboratories in occupational health. N-methylacetamide is the biomarker of exposure to N,N-dimethyl acetamide, which was used as the substitute for hepatotoxic N,N-dimethylformamide (DMF). N-methylacetamide (NMAC) urine samples of 3 different levels covering the 0.2~2 times of the exposure limit were tested. Stability test up to 180 days (0, 7, 30, 60, 180 days) at 4 different temperatures (-60, -20, 5, 25 o C) and homogeneity test were performed for these samples. New analytical condition by GC/MSD using SIM mode (m/z 58, 59) and DB-624 column was investigated for better selectivity, sensitivity and resolution. Urinary NMAC samples showed good homogeneity for 3 levels. These samples also showed good stability up to 180 days. The data of stability and homogeneity of urinary DMAC confirmed the basis of including this item into Korean proficiency test for occupational health laboratories since 2008. 요약 : 근로자건강진단실무지침상의필수검사항목항목중, N-메틸아세트아미드의소변표준시료를제조하여그신뢰도를확인하고자하였다. DB-624 컬럼을사용한 GC/MSD 분석방법에의해기존분석컬럼보다우수한분리능과선택성으로 N-메틸아세트아미드를분석하였다. -60, -20, 5, 25 o C에서 5-50 mg/l의농도범위의소변중 N-메틸아세트아미드의안정성을 6개월보관시점까지검토한결과모든보관조건에서안정하였으며, 각시료에대한균질성검사결과도양호하였다. 이상의결과로부터유리형 NMAC를첨가하는방법으로제조한소변중 NMAC 표준시료가분석정도관리용으로실용화하기에적합한균질성과장기간보관시의안정성을모두만족시킴을확인하였고, 2008년부터분석정도관리표준시료로활용하였다. Key words: reference material, urinary N-methylacetamide, proficiency test, biological monitoring Corresponding author Phone : +82-(0)52-703-0873 Fax : +82-(0)52-703-0335 E-mail : cookmom@kosha.or.kr 339
340 Mi-Young Lee 1. 서론 표준물질 (RM, reference material) 은 측정기기의교정, 측정방법의평가또는물질의특성치를결정하는데기준으로사용하는것으로, 하나이상의특성치가충분히확정되어있는균질한소재또는물질 로정의된다. 1,2 표준물질의정규적인사용은유효하고신뢰할수있는측정의기초가되며, 부정확한측정에뒤따르는비용과위험을절감하게해준다. 실험실적으로는 ISO/ IEC 17025 [General requirements for the competence of testing and calibration laboratories, 시험및교정기관의자격에대해일반요구사항 ] 에서표준물질의사용에대해여러번언급되고있다. 3 현대세계에서는다른국가, 다른실험실에서나온측정결과를서로비교할수있어야하고그기초로표준물질의중요성이점차강조되어왔다. 산업과과학분야에서표준물질의중요성은점점높아지고있으며, 국내에서도환경, 재료분야에서숙련도시험을위한표준시료개발및적용에대한연구가이루어진바있다. 4,5 불확도가작은표준물질일수록제조하여검증하는데에많은시간과비용이소요되며, 따라서가격도상승한다. 불확도가작은 1차표준물질은측정불확도평가, 장비교정등에사용되며일상적인내부정도관리와측정법확인에는자체또는일상용표준물질을사용하는것이경제적이다. 6 지금까지우리나라의산업보건분야생물학적모니터링용표준물질개발은 1995년에산업안전보건연구원에서특수건강진단분석정도관리를주관하게되면서소변중마뇨산과혈중납표준시료가시작으로, 7 이후특수건강진단분석정도관리를계속하면서추가항목들이개발되었다 (Table 1). 그러나노동부고시근로자건강진단실무지침에제시된필수노출지표물질은유기화합물 8종 9항목, 금속류 3종 3항목, 가스상물질류 1종 2항목으로모두 12 종 14 항목이규정되어있고선택지표물질이금속류 8종 11 항목, 유 기화합물 17 종 18 항목, 산및알칼리류 2종 2항목, 가스류 1종 1항목등 28 종 32 항목이규정되어있는것과비교하면 8 아직많은분석항목에대한표준물질이부족한실정이다. 따라서본연구에서는우리나라근로자건강진단실무지침에제시된생물학적노출지표검사항목이면서아직표준물질이개발되지않은항목에대한표준물질을개발하고자하였다. 특히, 필수노출지표물질이면서아직표준물질이개발되어있지않은 N,N-디메틸아세트아미드 (N,N-dimethyl acetamide, 이하 DMAC) 의노출지표인소변중 N-메틸아세트아미드 (N-methyl acetamide, 이하 NMAC) 를선정하여개발을진행하였다. 개발한표준물질은실험실간비교를통한외부정도관리및실험실의일상적인분석시내부정도관리를위해사용되는것을목적으로하였다. 이시료는자체또는일상용표준물질 (In-house or working reference material) 에해당하며, 정확한불확도계산과기준값설정보다는균질성과안정성입증에중점이주어진다. 본연구에서는근로자건강진단실무지침상의필수검사항목항목중, 아직국내표준시료가개발되어있지않아시료분석의정확도를확인하지못하고있는항목인 N-메틸아세트아미드의소변표준시료를자체개발하고자하였다. N-메틸아세트아미드를포함한표준시료를제조하고, 이시료가정도관리에사용하기에적합한안정성과균질성을가지고있음을증명하는것이본연구의목적이다. 개발한 N-메틸아세트아미드의소변표준시료를향후국내특수검진기관분석정도관리에응용함으로써이항목에대한국내산업보건관련분석실험실의분석숙련도를향상시키는데기여하고자하였다. 2. 연구방법 2.1. 표준시료제조직업적으로 N,N-디메틸아세트아미드를비롯한유해 Table 1. History of reference material development for biological monitoring by OSHRI Year Organic item Inorganic item 1995 Hippuric acid in urine Lead in blood 1996 Mandelic acid in urine Methylhippuric acid in urine Cadmium in blood 1997 Phenylglyoxylic acid in urine Manganese in blood 1999 N-methylformamide in urine Mercury in urine 2000 Trichloroacetic acid and trichloroethanol in urine - 2003 Muconic acid in urine - 2004 2,5-hexanedione in urine Cadmium in urine Analytical Science & Technology
Validation of urinary N-methylacetamide reference material for proficiency test 341 Table 2. Planning of new reference sample Chemical Biological marker Biological exposure index Target concentration N-methylacetamide in urine N-methylacetamide in urine 30 mg/g creatinine 5 mg/l 20 mg/l 50 mg/l *The unit of practical guide for workers' health examination is described as mg/g creatinine. Target concentration is based on the assumption that creatinine concentration is 1 g/l. 화학물질에노출되지않는일반사무직종의근로자의소변으로부터균질한소변풀 (pool) 을기존에확립되어있는방법에따라 7,9 준비하고, 여기에유리형지표물질 N-메틸아세트아미드 (NMAC) 를첨가하여표준시료를제조하였다. 정량분석에대한방해물질영향을검토하기위하여 N,N-디메틸포름아미드의대사산물인 N-메틸포름아미드 (NMF) 도함께첨가하였다. 균질성시험을위해시료를소분할시료용기의부피는이후에실제로표준물질로사용하기위한시료용기의부피보다커서는안된다. 10,11 국내특수건강진단분석정도관리에적용시사용하는시료용기의부피가 1.8 ml임을고려하여, 여기서는부피 1.2 ml의용기를사용하였다. 고용노동부고시근로자건강진단실무지침을참조하여, 생물학적노출지표노출기준값의 0.2-2 배범위에서첨가량을결정하였다 (Table 2). 2.1.1. 표준시료제조를위한소변전처리직업적으로 N,N-디메틸아세트아미드에노출되지않은근로자의소변 1 L에 sodium azide를 1 g 가하여 sodium azide의농도가 0.1% 가되도록하였다. 소변에초산을가하여 ph를 5.5로조정한후초저온냉동고에보관하였다. 얼린소변을해동하여 8 µm 여과지 (Whatman grade 2V, 미국 ) 를통과시켜침전물을제거한후다시초저온냉동고에보관하였다. 이를다시해동하여여과하는과정을 2번더반복한후, 이소변을 0.45 µm membrane filter로여과한여액을이용하여표준시료를제조하였다. 2.1.2. 소변중 NMAC 및 NMF NMAC 약 260 µl와 NMF 약 140 µl를취하여 10 ml 용량플라스크에옮기고정확한질량을측정한후탈이온수로표선을채워 NMAC 및 NMF 표준용액원액을만들었다. 이용액을소변풀 (blank urine) 120 ml에 0.24 ml 가하여 NMAC와 NMF가각각약 50 mg/l, 25 mg/l 수준으로첨가된소변풀을제조하 였다 (Table 2). Blank urine과 spiked urine을혼합하여 NMAC와 NMF가첨가된소변시료를각각 80 ml씩제조하였다. 2.2. 표준시료검증 2.2.1. 균질성시험소분단위간변이 (between-unit variation) 와분석법변이 (analytical method variation) 사이에통계적으로유의한차이가없다면각소분단위간에균질하다고판단할수있다. 10,11 본연구에서는 10 개바이알을취하여 2회씩반복분석하고 95% 신뢰수준에서균질성을평가하였다 2.2.2. 안정성시험보관온도와기간에따른안정성을평가하기위하여제조한표준시료를 25 o C, 5 o C, -20 o C, -60 o C에서각각총 180 일간보관하면서제조직후의시료의분석값과 7, 30, 90, 180일경과후시료의분석값을비교하였다. 본연구에서는조건당 3개시료를취하여분석하고 95% 신뢰수준에서안정성을평가하였다. 2.3. 분석방법 2.3.1. 시약및장비지표물질을첨가할균질한바탕 (blank) 소변풀 (pool) 은기존에확립되어있는방법에따라준비하였다 ( 양정선, 1995). 제조된시료는 Simport사 ( 캐나다 ) 의 sterile cryovial에소분하여보관하였다. N-메틸아세트아미드표준시약 (99+%, mp 27 o C, d 0.957), N-메틸포름아미드표준시약 (99%, mp -40 o C, d 1.011) 은 Aldrich사 ( 미국 ) 의특급시약을사용하였고, 시료전처리용메탄올은 Merck사 ( 미국 ) 의크로마토그라피급용매를사용하였다. 탈이온수는 Millipore사 ( 미국 ) 의 Milli-RO와 Milli-Q water system으로실험실에서제조하여사용하였다. 시료희석및여과를위해 cluster tube(corning사, 미국 ), 96-well 여과장치 (Varian사, 미국 ) 를사용하였으 Vol. 27, No. 6, 2014
342 Mi-Young Lee 며, 여과용 filter plate는 0.45 µm 규격이었다. 시약이동및시료혼합에는 8-channel pipette(vistalab사, 미국 ) 을사용하였다. 시료분석용바이알에 conical insert (Agilent사, 미국 ) 을삽입하여소량의시료를 GC에주입하도록하였다. 분석에사용한장비는 Hewlett-Packard사 ( 미국 ) 의 6890 Series GC/HP-5973 가스크로마토그래프-질량분석검출기이며, 시료의분석을위해 HP-INNOWAX 컬럼 ( 길이 60 m, 내경 0.32 mm, 막두께 0.15 µm) 및 J&W Scientific Inc. 사 ( 미국 ) 의 DB-624 컬럼 ( 길이 60 m, 내경 0.25 mm, 막두께 1.40 µm) 을사용하였다. 이동상은 99.9999% 의초고순도헬륨을사용하였다. 2.3.2. 표준용액제조 NMAC 약 30 mg과 NMF 약 30 mg을정밀하게칭량하여 10 ml 용량플라스크에넣은후탈이온수로표선을채워 NMAC 약 3000 mg/l, NMF 약 3000 mg/l 표준용액을만들고이것을표준용액원액으로하였다. 표준용액원액 0.5 ml를취해 20 ml 용량플라스크에넣고탈이온수로표선을채워 NMAC 약 75 mg/l, NMF 약 75 mg/l 표준용액을만들었다. 이것을다시탈이온수로 1/10, 3/10, 5/10 희석하여 NMAC 및 NMF 약 7.5, 22.5, 37.5 용액을만들었다. 공시료는탈이온수로하였다. 2.3.3. 시료전처리표준용액및시료를 3분간잘섞어준후 8-channel pipette을사용하여 cluster tube에메탄올 450 µl를넣고, 시료 50 µl를가하였다. 8-channel pipette 혼합모드를이용하여시료를혼합한후, 그대로 96-well 필터카트리지로이동하였다. 96-Well 여과장치를이용하여시료를 0.45 µm 여과판을통과시킨후, GC 시료용 2 ml vial에 conical insert를넣고여기에시료를옮겨마개를하고 GC에주입하였다. 로 220 o C까지상승시킨후다시 3분유지하였다. 컬럼유속은 0.9 ml/ 분으로일정하게유지하였다. 검액을 1 µl 주입하였고, 주입모드는 split 모드에서 split ratio를 100:1로하였으며, 1 회분석에소요된시간은 17 분이었다. 질량분석검출기는 SIM(selective ion monitoring) 모드로설정하였고 NMAC와 NMF로부터생성된 m/z 58, 59의 fragment ion만을선택적으로검출하여두성분을분석하였다. 2.4. 숙련도시험본연구결과의표준시료균질성과안정성자료를근거로 NMAC 표준시료를국내노출기준인 30± 15 mg/l 범위내농도로제조하여 2008년부터산업안전보건연구원에서실시하는특수건강진단분석정도관리신청기관에배부하여소변중 NMAC 분석숙련도시험을실시하였다. 적합범위는분석기관의평균값을중심으로표준편차의 3배이내로설정하였다. 3. 연구결과 3.1. 분석조건설정소변중에공존하는방해물질에의한영향을배제하고, 성분검출을선택적으로수행하고자질량분석검출기를이용하여소변중 NMAC를검출하였다. 컬럼의온도구배는기존의유기용제분석용조건을적용하여 DB-624 60 m 컬럼을사용하여 100 o C 에서 220 o C까지온도를상승시키는조건을적용하였다. 주입구와검출기의온도는 250 o C로유지하여시료가충분히기화될수있도록하였다. GC/MSD 분석스펙트럼을 Fig. 1에나타내었다. m/z 30-300 범위에서 scan 방식으로각성분의스펙트럼을 2.3.4. 분석조건 GC-MSD에 DB-624 컬럼을설치하여 NMAC와 NMF를분석하였다. 주입부와질량분석기히터온도를 250도로설정하였고, 컬럼온도는 100 o C에서 2분유지하고분당 20 o C의온도로 200 o C까지상승시킨후 200 o C에서 3분유지하였다. 다시분당 20 o C의온도로 220 o C까지상승시킨후 220 o C에서 6분유지하였다. HP-INNOWAX 컬럼을사용한경우는컬럼온도를 40 o C에서 2분유지하고분당 20 o C의온도 Fig. 1. Mass spectrum of NMAC and NMF. Analytical Science & Technology
Validation of urinary N-methylacetamide reference material for proficiency test 343 얻은후 SIM (selective ion monitoring) 방식으로각성분에특이적인값을선택하여분석함으로써분석감도를최대한높였다. NMF의분자이온피크인 m/z 59와 NMAC의 fragment 피크인 m/z 58의두값을검출대상으로하였다. NMAC의분자이온피크는 m/z 73으로, 이 m/z 값에서더고감도로 NMAC가검출될것이기대되었으나, 이이온크로마토그램에서는방해물질로인해안정한베이스라인을얻을수없어, NMAC에해당하는피크만이선택적으로검출되는 m/z 58 fragment를검출대상으로하였다. Fig. 2. Mass chromatogram of standard solution. (A) m/z 58, 59, (B) m/z 58, (C) m/z 59 (NMAC 3.4 mg/l, NMF 3.5 mg/l, 1 µl injection) Fig. 2와 Fig. 3에 SIM 방식에의하여각성분의피크를나타낸표준용액과소변표준시료의크로마토그램을실었다. m/z 58, 59를모두표시한 SIM 크로마토그램에서는각 m/z 값에해당하는크로마토그램의 baseline이겹쳐피크의구분이명확하지않았기때문에각이온크로마토그램을따로표시하여적분한결과를정량에이용하였다. 질량분석기에과량의시료가유입되어 ion source를오염시키는것을방지하고소변시료중의수용성성분을제거하기위한목적으로소변시료를메탄올로 20 배희석하였고, 메탄올희석과정에서생성되거나이미존재하는불용성성분및침전을제거하기위하여 0.45 µm 여과막을통과시킨여액을검액으로사용하였다. Split ratio는 100:1을적용하였으며, 분석감도는 100:1의 split ratio에서도 0.6 mg/l의 NMAC가검출될만큼양호하였다. 표준용액의크로마토그램으로부터 noise와성분피크의높이를측정하여검출한계를구한결과, S/N비를 3으로하였을때의검출한계는 0.6 mg/l (1 µl 중 0.6 ng) 이었고, 정량한계는 S/ N비를 10으로한경우 2.1 mg/l (1 µl 중 2.1 ng) 이었다. 현재농도보다더미량의시료를검출하고자하는경우, 희석용메탄올의양을줄여희석배율을줄이거나 split ratio를줄임으로서보다많은양의시료가유입되도록하면현재조건보다미량의성분을검출하는것이가능하다. NMF는이연구에서사용한분석조건에서 8.30분에검출되었고, NMAC는 8.96분에서검출되어두성분의용리시간차이가 0.6분으로, 두성분의피크가뚜렷이분리되어 HP-INNOWAX 컬럼을사용한경우 Fig. 3. Mass chromatogram of urine sample. (A) m/z 58, 59, (B) m/z 58, (C) m/z 59 Fig. 4. Mass chromatogram of NMAC and NMF separated in HP-INNOWAX column. Vol. 27, No. 6, 2014
344 Mi-Young Lee 일어날수있는피크의중복이전혀관찰되지않았다 (Fig. 2, Fig. 4). NMAC 표준용액 3.4-67.5 mg/l 범위에서표준용액검량선의상관계수는 0.9996으로양호한직선성을나타내었다. 독일국제정도관리시료중 NMF의회수율로부터구한소변중 NMF 분석의정확도는 3.9-40.9 mg/l의농도범위에서 99-112% 였다. 소변중 NMAC는소변풀에 NMAC를첨가한시료의회수율로부터분석의정확도를구하였으며, 5-30 mg/l의농도범위에서 102-103% 의정확도를나타내었다. 결과로부터구한 R T ±U RT 범위에 1.00 이포함되면 95% 신뢰수준에서 C Tm 이 C refm 과유의하게다르지않으며, 따라서주어진조건아래유의한변화가없이안정하다고볼수있다. Fig. 8부터 Fig. 10에각농도범위에서안정성시험결과의평균값과표준편차범위를도시하였다. 모든시료가안정하다고평가하였으며, Table 4 및 Fig. 8부터 Fig. 10에나타난바와같이제조한 3종의시료는모두 180일보관시점까지안정하였다. 실제로특수건강진단분석정도관리시료는우송에 4일미만이소요되며, 각기관에서는시료 3.2. 표준시료의균질성평가각항목에대해농도별로 10 개의시료에대한 2 회반복분석결과를이용하여구한 F값을기준 F값과비교하여균질성을평가하였다. 시료의분석값으로부터산출한 F값이기준 F값인 3.020보다작으면균질하다고말할수있는데, Table 3의결과로부터, 제조한 3종의시료는모두균질함을알수있었다. Fig. 5 -Fig. 7에세농도의표준시료안정성시험결과를나타내었다. 각분석결과와표준값의차이를도시하였으며, 참고로평균값 ±15% 의구분선을점선으로표시하였다. Fig. 6. Homogeneous test of NMAC reference sample 2 (No. of sample:20). 3.3. 표준시료의안정성평가각항목에대해농도별로 3개의시료에대한분석 Table 3. Homogeneity test of NMAC in urine Item_level Average (mg/l) F NMAC-1 4.99 1.906 NMAC-2 18.9 2.749 NMAC-3 48.8 1.553 *As F < F-crit 95%, the sample was homogeneous at 95% confidence level(f-crit 95% : 3.02) Fig. 7. Homogeneous test of NMAC reference sample 3 (No. of sample:20). Fig. 5. Homogeneous test of NMAC reference sample 1 (No. of sample:20). Fig. 8. Stability test of NMAC reference sample 1 (No. of sample:3) Analytical Science & Technology
Validation of urinary N-methylacetamide reference material for proficiency test 345 을유지한다는것을나타내었다. Fig. 9. Stability test of NMAC reference sample 2 (No. of sample:3). 3.4. 숙련도시험 2008년전반기와후반기특수건강진단분석정도관리에자율항목으로 NMAC를추가하여숙련도시험을실시하였다. NMAC 분석을신청한기관은전반기는 9개소, 후반기는 12 개소였으며, 전반기는 1개소, 후반기는 2개소에서부적합한결과를제출하여각각 89%, 83% 의적합률을나타내어이들기관의 NMAC 분석에대한신뢰도를확인할수있었다. 4. 결론 Fig. 10. Stability test of NMAC reference sample 3 (No. of sample:3). Table 4. Stability test for NMAC in urine Test condition Level 1 Range (R T ±U RT ) Level 2 Range (R T ±U RT ) Level 3 Range (R T ±U RT ) 25 o C, 7 days 0.84-1.28 0.89-1.04 0.88-1.08 25 o C, 30 days 0.91-1.33 0.92-1.04 0.90-1.11 25 o C, 90 days 0.91-1.46 0.96-1.01 0.89-1.10 25 o C, 180 days 0.85-1.20 0.94-1.05 0.84-1.08 5 o C, 7 days 0.82-1.22 0.94-1.01 0.88-1.09 5 o C, 30 days 0.78-1.15 0.97-1.02 0.88-1.10 5 o C, 90 days 0.82-1.16 0.97-1.04 0.90-1.10 5 o C, 180 days 0.82-1.14 0.93-1.04 0.89-1.12-20 o C, 7 days 0.82-1.20 0.99-1.09 0.92-1.13-20 o C, 30 days 0.68-1.12 1.00-1.04 0.89-1.10-20 o C, 90 days 0.78-1.10 0.87-1.05 0.92-1.12-20 o C, 180 days 0.88-1.24 0.95-1.00 0.89-1.09-60 o C, 7 days 0.81-1.30 0.98-1.05 0.88-1.08-60 o C, 30 days 0.85-1.19 0.96-1.07 0.88-1.09-60 o C, 90 days 0.93-1.30 0.91-1.06 0.90-1.10-60 o C, 180 days 0.81-1.14 0.92-1.04 0.92-1.13 를받으면즉시냉장혹은냉동보관하도록권고하고있으므로, 이상의결과는분석전까지시료가안정성 근로자건강진단실무지침에필수물질로등재되어있으나아직까지그생물학적노출평가를위한표준시료를국내에서구할수없었던 N,N-디메틸아세트아미드를생체시료표준물질개발의우선대상물질로선정하였다. N,N-디메틸아세트아미드의노출평가를위한생물학적노출지표로서그대사산물인 N-메틸아세트아미드가지정되어있어, N-메틸아세트아미드를첨가하여생물학적노출지표표준시료를제조하였다. 본연구에서는고감도, 고분리능의 N-메틸아세트아미드분석방법을확립하였으며, 시간과보관조건의변화에대한안정성과동일한시료간의균질성을확인하였다. 향후국내산업보건실험실의노출평가능력을확인하기위한생체시료분석정도관리항목에소변중 N-메틸아세트아미드를추가하여운영함으로써본연구결과를특수검진기관분석정도관리사업에활용하였다. 본연구에서표준시료로서의필수조건을만족함을증명한표준시료는 N,N-디메틸아세트아미드의생물학적노출평가능력을증명하고자하는실험실의숙련도시험을통해 N-메틸아세트아미드에대한분석능력의신뢰성확인및향상에기여하였다. References 1. ISO Reference materials - General and statistical principles for certification: ISO Guide 35: 2006 : International Organization for Standardization (2006). 2. Korea research institute of standards and science http:// crm.kriss.re.kr/(2007). 3. ISO General requirements for the competence of testing and calibration laboratories: ISO/IEC 17025: Inter- Vol. 27, No. 6, 2014
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