체액식별을위한 DNA 메틸화 분석법과체액특이미생물 확인법의융합및유용성평가 연세대학교대학원 의과학과 최아진
체액식별을위한 DNA 메틸화 분석법과체액특이미생물 확인법의융합및유용성평가 지도교수신경진 이논문을석사학위논문으로제출함 2012 년 12 월 연세대학교대학원 의과학과 최아진
최아진의석사학위논문을인준함 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 연세대학교대학원 2012 년 12 월
감사의글 우선막연하게관심만있던법의학을공부할수있는기회를주시고, 많은지도와조언을아끼지않으신신경진교수님께깊은감사드립니다. 그리고항상격려를아끼지않으시고바쁘신와중에세심하게지도해주신양우익교수님, 좋은논문이될수있도록많은조언해주시고심사해주신김형표교수님께도감사의말씀을전합니다. 또한깊이있는연구를할수있도록, 여러기회를통하여발전할수있도록항상격려해주시고세심하게지도해주신이환영교수님께진심으로감사드립니다. 뒤에서함께고민해주시고조언해주셨던양인석박사님, 처음왔을때부터하나하나가르쳐주시고도와주셨던박명진선생님, 같은 methylation 팀으로어려울때마다도움주신안자현선생님, 미생물에대해아무것도모르던저에게도움주시고격려해주신이은영, 박성규선생님, 함께공부하고도움이필요할때마다언제나군말없이도와줬던은혜씨와유나씨, 비록다른실험실이지만대학원에서다시만나서로의지할수있었고힘이되어준지혜에게감사의말을전합니다. 그리고멀리서도움주시고격려해주신윤정아, 김나영선생님, 정은언니에게도고마움을전합니다. 마지막으로멀리떨어져있지만항상기도해주시고아낌없는사랑과믿음을보내주셨던부모님, 늘힘이되어준동생에게깊은감사의말을전합니다. 가족들의든든한지원이있었기에무사히마칠수있었습니다. 그리고여기에모두언급하지못하였지만저를아껴주시고도움주시고기도해주셨던모든분들께이결실을바칩니다. 2012 년 12 월저자씀
< 차례 > 국문요약 1 Ⅰ. 서론 4 II. 재료및방법 9 1. 연구대상 9 2. DNA 추출및정량 10 3. 체액식별을위한표지자선정 10 4. Primer 설계 13 5. Methylation sensitive restriction enzyme 처리 16 6. 중합효소연쇄반응증폭 17 7. 중합효소연쇄반응증폭산물의유전자형결정 18 8. 대립유전자사다리와표지자사다리와체액식별을위한패널생성 18 9. 다중중합효소연쇄반응검사의식별력검사 19 10. 75일간실내환경에노출시킨시료에서의체액감별효율확인 20 11. 새로구축된다중중합효소연쇄반응의민감도확인 20 12. 혼합된체액의다중중합효소연쇄반응검사 21 III. 결과 22 1. Methylation-sensitive restriction enzyme-polymerase chain reaction (MSRE-PCR) 구축 22 2. 박테리아존재확인을위한중합효소연쇄반응시스템구축 22 3. 다중중합효소연쇄반응구축및체액별프로파일링 23 4. 정액 DNA의다양한메틸화패턴 28 5. 75일간실내환경에노출시킨시료에서의체액감별효율확인 30 6. 새로구축된다중중합효소연쇄반응의민감도확인 32 7. 혼합된체액의다중중합효소연쇄반응검사 40 IV. 고찰 43
V. 결론 57 참고문헌 59 영문요약 64 게재리스트 67
그림차례 그림 1. Conversion of cytosine to 5-methylcytosine by methyltransferase 5 그림 2. Principle of methylation-sensitive restric -tion enzyme-polymerase chain reaction (MSRE-PCR) 16 그림 3. Scheme of multiplex PCR system for body fluid identification 24 그림 4. Result of MSRE-PCR (left) and a body fluid -specific bacteria presence test (right) in each body fluid 25 그림 5. Various DNA methylation patterns of semen 29 그림 6. Body fluid identification of samples exposed to indoor environment for 75 days 31 그림 7. Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system in saliva 34 그림 8. Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system in semen 35
그림 9. Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system in vaginal fluid 36 그림 10. Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system using various concentrations of saliva DNA with different PCR cycles 37 그림 11. Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system using various concentrations of semen DNA with different PCR cycles 38 그림 12. Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system using various concentrations of vaginal fluid DNA with different PCR cycles 39 그림 13. Results of mixture sample multiplex PCR test 41
표차례 표 1. Multiplex PCR primers for DNA methylation profiling using MSRE-PCR 14 표 2. Multiplex PCR primers for amplification of bacterial 16S ribosomal RNA gene 15 표 3. The profile of bacteria in each body fluid 28
국문요약 체액식별을위한 DNA 메틸화분석법과체액특이미생물 확인법의융합및유용성평가 범죄현장에서발견된체액의종류를확인하는것은체액의제공자와실제범죄행동을연관짓는데중요한정보를제공한다. DNA를기반으로체액을식별하는방법들중 DNA 메틸화프로파일링은 tdmrs (tissue-specific differentially methylated regions) 에서의 DNA 메틸화정도의차이를이용하는방법으로, 현재까지발굴된 tdmr 표지자는정자가존재하는정액을성공적으로식별할수있으며혈액과타액으로부터질분비액과생리혈을구별할수있다. 다른방법은체액의종류에특이적으로존재하는박테리아 DNA를검출하는방법으로타액과질분비액을식별할수있다. 따라서, 이 2가지방법을융합하는것은한번의반응으로좀더다양한체액을효과적으로식별하도록할것이다. 이러한목적을달성하기위하여, 이전에보고된 tdmrs 표지자들을이용하여 DNA 메틸화정도를분석하는 MSRE-PCR (methylation-sensitive restriction enzyme-polymerase chain reaction) 에타액과질분비액에존재할것이라예상되는박테리아의 16S rrna gene에대한표지자를추가하여체액유형감별의 - 1 -
변별력을개선한다중중합효소연쇄반응방법을구축하였다. 새로운방법을이용하여정액은 USP49, DACT1, PFN3 tdmrs의 unmethylation과, L81528의 methylation으로쉽게식별할수있었다. 타액은타액특이적박테리아인 Streptococcus salivarius나 Veillonella atypica를검출함으로써구별할수있었으며, 질분비액과생리혈은 PFN3 tdmr이 hypomethylation되고, 질분비액특이적박테리아인 Lactobacillus crispatus나 Lactobacillus gasseri의존재를확인함으로써다른유형의체액으로부터구분할수있었다. 75일간실내환경에노출된체액또한성공적으로분석할수있어본연구를통해구축된다중중합효소연쇄반응은오래되고분해된체액에서도유용하게사용할수있을것이라예상된다. 또한, 구축된다중중합효소연쇄반응시스템은표준조건일경우, 타액과정액은 DNA 500 pg 이상에서, 질분비액은 DNA 250 pg 이상에서분석가능함을보였다. 중합반응횟수를늘림으로써 31 pg의 DNA으로도체액을구분할수있었다. 이러한높은민감도를나타내는것은 DNA 메틸화분석법과체액특이박테리아확인법이서로의단점을상호보완하여가능하였다. 본연구에의해구축된다중중합효소연쇄반응은개인식별프로파일링을위해사용하는동일한생물학적시료인 DNA를사용한다는점과한번의반응으로다양한유형의체액을동시에식별할수있다는점을고려하였을때법의실제영역에서좀더 - 2 -
효과적인체액식별방법으로사용할수있을것이다. -------------------------------------------------- 핵심되는말 : 체액식별, DNA 메틸화, methylation-sensitive restriction enzyme 중합효소연쇄반응, 타액특이박테리아, 질분비액특이박테리아 - 3 -
체액식별을위한 DNA 메틸화분석법과체액특이미생물 확인법의융합및유용성평가 < 지도교수신경진 > 연세대학교대학원의과학과 최아진 Ⅰ. 서론 범죄현장에서발견되는체액은범죄과학수사의가장중요한증거물중하나로용의자나피해자의신원을확인할수있는가치있는정보를포함한다. 또한특정체액의종류를확인하는것만으로도그체액의제공자와실제범죄행동을연관지어범죄현장을재구성하는데도움이될수있다. 1 현장에서주로발견되는체액은혈액, 타액, 정액이며질분비액이나소변, 땀과같은체액들또한가치있는 DNA 증거물을포함하여중요한역할을할수있다. 예를들어, 현장에서발견된혈흔이혈액인지생리혈인지구분함으로써폭행여부등사건의본질을판별할수있고, 정액이나질분비액이발견된다면성범죄또는성적접촉이있었음을입증할수있을것이다. 또한피해자의피부에서범인의타액을증명할수있으면범인과피해자가접촉했다는증거 - 4 -
를제시하거나교흔 (bite marks) 의존재사실을뒷받침할수있다. 현재까지법과학영역에서조직및체액을효과적으로식별할수있는방법은지속적으로개발되고있다. 주로특정조직이나체액에서특이적으로발현되는단백질또는효소를검출하는방법을사용해왔으며, 최근에는조직특이적으로발현되는 messanger RNA 또 는 micro RNA 를대상으로하는연구가많이수행되었다. 2-4 하지만 개인식별프로파일링등법과학영역에서생물학적시료로서 DNA 를주로사용한다는점등을고려하여 DNA 를기반으로한체액식 별방법도최근발표되고있다. 현재까지보고된 DNA 를기반으로하는체액식별방법에는 DNA 메틸화정도의차이를이용하는방법과체액의종류에특이적 인박테리아를확인하는방법이있다. Cytosine 5-Methyl Cytosine 그림 1. Conversion of cytosine to 5-methylcytosine by methyltransferase DNA 메틸화는기본적인 DNA 서열의변화없이유전자발현조 - 5 -
절에영향을미치며, 조직이나세포에따라서로다른패턴을가지 고있다. 특히 tdmrs (tissue-specific differentially methylated regions) 로알려진유전자상의영역은조직마다차이를보이는메틸 화패턴을나타내는것으로알려져있다. 5-7 이영역의 DNA 메틸화 정도의차이를분석하여조직혹은체액을식별하는방법들이법과 학영역에서보고가되었으며, 8-9 대표적인분석방법으로는 methylation sensitive restriction enzyme-polymerase chain reaction (MSRE-PCR) 방법과 bisulfite SNaPshot 이있다. 10-11 최근 개발된 Nucleix DSI-Semen kit (Nucleix, Tel Aviv, Israel) 는 MSRE-PCR 방법을이용하여정액을특이적으로식별할수있는상용화된키트로, 적은양의 DNA로정액식별이가능하며짧은크기의중합효소연쇄반응증폭산물로구성되어분해된 DNA에서도분석이가능하다. 게다가상용화된개인식별테스트키트와기기 장비를동일하게사용할수있다는장점이있다. 12-13 또한연세대 연구진에의해위 2 가지방법을이용하여 tdmrs 에서의메틸화정 도의차이를분석하는체액식별방법이제시되었으며, 이들은정 자를포함하고있는정액의식별이가능하고, 질분비액과생리혈을 혈액과타액으로부터구별할수있었다. 10 하지만 DNA 메틸화분석 법은아직개발초기단계이며, 좀더세부적으로체액을식별하기위해서는다양한체액에특이적인 tdmr을보다많이발굴할필요가있다. 반면에 DNA를기반으로하는최근의연구방법중하나는특정 - 6 -
체액내에존재하는미생물을확인하는방법으로, 14-19 박테리아의 종특이적영역을가지고있는 16S ribosomal RNA (rrna) gene이나 16S-23S rrna intergenic spacer region을중합효소연쇄반응으로증폭함으로써이루어진다. 특히박테리아의 16S rrna gene은여러박테리아사이에서매우잘보존되는영역이있는반면여러가지박테리아사이에염기서열의다양성을가지는초가변영역을가지므로이를이용하여박테리아를효과적으로구별할수있 다. 20-21 법과학영역의체액식별에서는주로타액과질분비액에초 점이맞춰져있으며, 타액의경우 Streptococcus salivarius 와 Streptococcus mutans 종이대표적으로이용되고 14-16 질분비액의 경우 Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners, Lactobacillus jensenii 등을이용하여다른체액으로부터질 분비액을식별할수있다. 17-19 또한가임여성에게서가장빈번하게 나타나는질감염질환인세균성질염과관련된 Gardnerella vaginalis 와 Atopobium vaginae 도질분비액을식별하는데유용한 표지자로사용될수있음이보고되었다. 17 하지만박테리아의존재 유무를통한체액식별방법은타액과질분비액등박테리아가존재하는체액에그사용이국한되어있으므로정확한체액식별방법을위해서는혈액이나정액등도확인할수있는다른체액식별방법과함께사용해야할것이다. 또한인접한, 혹은접촉가능한곳에박테리아가옮겨가서체액식별의정확도가떨어질수있는가능성도있으므로분석시이를염두에두어야한다. 18-7 -
따라서본연구에서는 DNA 메틸화분석방법과체액특이박테리아의존재확인법을융합하여이들의한계점을보완하고기존의체액식별방법을개선하고자한다. 현재 DNA를기반으로하는체액식별방법에는한번의반응으로동시에여러체액을정확하고효과적으로식별할수있는방법은없다. 따라서, 두가지체액식별방법을융합한다면 DNA 메틸화를기반으로한체액식별의한계점을타액과질분비액에존재하는박테리아를확인하여보완함으로써한번의분석으로 5가지체액을효과적으로구별할수있을것이다. 이에, MSRE-PCR 방법을이용한 DNA 메틸화분석법과체액내특정미생물존재여부를동시에분석할수있는다중중합효소연쇄반응을구축함으로써모든체액을한번의반응으로동시에식별할수있는방법을제시하고자한다. 또한개발된다중중합효소연쇄반응분석법의식별력, 민감도확인및혼합된체액검사등을통하여법의실제영역에서의유용성을평가하고자한다. - 8 -
Ⅱ. 재료및방법 1. 연구대상 본연구에서는기원을알고있는체액을테스트하기위해총 5 가지체액 ( 혈액, 타액, 정액, 질분비액, 생리혈 ) 을모집하여구축된다중중합효소연쇄반응의정확도를평가하고자하였다. 이를위해피험자모집공고문을통하여 20대에서 50대까지다양한연령대의건강한한국인을모집하였으며, 남성으로부터혈액, 타액, 정액을, 여성으로부터혈액, 타액, 질분비액과생리혈을기증받았다. 혈액은주사기를이용하여 2 ml씩얻고, 타액과정액은각각미세원심분리튜브에 1 ml, 전용용기에 1회분비량을얻었다. 질분비액과생리혈은각각 4개의멸균된면봉을통해얻었다. 기증받은혈액, 타액, 정액은 200 μl씩미세원심분리튜브에분주한채로, 질분비액과생리혈의경우각각채취된면봉채로 DNA를추출할때까지 -20 냉동고에보관하였다. 본연구는연세대학교의과대학연구심의위원회와유전자연구생명윤리심의위원회의승인을받아수행되었다 ( 승인번호 4-2012-0247). - 9 -
2. DNA 추출및정량 보관된시료들은체액의타입에따라혈액, 타액, 정액은 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) 에서 Protocol: DNA Purification from Blood or Body Fluids (Spin protocol) 에따 라추출하였고, 질분비액과생리혈은 QIAamp DNA Investigator Kit (QIAGEN) 에서 Protocol: Isolation of Total DNA from Surface and Buccal Swabs 에따라 DNA 를추출하였다. 추출된 DNA 시료는 Quantifiler Duo DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를이용하여정량한후, -20 에서보관하였 다. 3. 체액식별을위한표지자선정 DNA 메틸화정도를통해체액을식별하기위해 4개의 tdmrs (tissue-specific differentially methylated regions) 를선정하였다. USP49와 DACT1은 Kitamura 등 8 에의해보고된 tdmrs 중하나로고환에만특이적으로 unmethylation 됨으로써발현되는유전자이다. 따라서연세대연구팀에서정액또한이와관련이있을것이라여겨실제혈액, 타액, 정액, 질분비액그리고생리혈에서의메틸화패턴을분석하였고, 9 연령에관계없이정액에서만 unmethylation 패턴을보임을확인한바있다. 10 따라서, USP49 와 - 10 -
DACT1을정액식별을위한 tdmr 표지자로선정하였다. Frumkin 등 11 에의해제시된 L81528 표지자는 USP49, DACT1 과반대로정액에서 methylation 되어있음으로써다른체액들과구별된다. L81528 표지자를 USP49, DACT1과함께정액식별을위한 tdmrs 표지자로선정함으로써서로반대되는패턴으로좀더확실하게정액을식별할수있도록하였다. 마지막으로 PFN3는 Illingworth 등 7 에의해혈액에특이적인메틸화패턴을보인다고보고되었으나, 연세대연구진의실험결과에따르면정액특이적으로 unmethylation 경향을보이고, 질분비액과생리혈에서도 hypomethylation 경향을보이는것으로나타났다. 9 따라서정액을식별하고, 질분비액과생리혈을혈액과타액으로부터식별할수있는표지자로써선정하였다. 체액특이박테리아의존재확인을위하여타액과질분비액에대하여각각 2개의박테리아표지자를선정하였다. 박테리아선정에있어서되도록표적체액내에만존재하고다른체액에서존재하지않는박테리아를표지자를선정하였다. 타액특이박테리아의경우법의영역에서타액을식별하기위해 주로이용하는 Streptococcus salivarius 를우선선정하였다. 14-16 또 한법의영역에서는보고된바없으나다양한연령대의한국인에서 빈번하게나타난다고보고된 Veillonella atypica 를선정하였다. 22 질분비액특이박테리아로질정상세균종인 Lactobacillus - 11 -
crispatus 와 Lactobacillus gasseri 를선정하였다. 이두종은질분 비액내에항상둘중하나의종이존재한다고보고된바있다. 19 양성대조군으로 methylation sensitive restriction enzyme인 HhaⅠ의인지부위를포함하지않아항상증폭하는 Amelogenin과 D3S1358 표지자를선정하였다. 이들은양성대조군의역할외에성별을확인하고, 개인식별표지자인짧은연쇄반복표지자를확인함으로써샘플이바뀌는것을막을수있다. 제한효소인 HhaⅠ의완전한절단을확인하기위하여인위적으로만들어진 DNA의증폭산물인 Digestion control 표지자가음성대조군으로써사용하였다. 중합효소연쇄반응증폭산물은모든 CpG 부위에메틸기가붙지않으므로, 23 pcr 2.1-TOPO vector (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 의중합효소연쇄반응증폭산물인인위적으로만들어진 DNA는 HhaⅠ 처리시항상절단되어이후중합효소연쇄반응에서증폭되지않는음성대조군이된다. 또한인위적으로만들어진 DNA의투입을확인하기위하여 Hha Ⅰ인지부위를포함하지않는영역을증폭시키는 Amplification control 표지자또한선정하였다. - 12 -
4. Primer 설계 DNA의메틸화패턴을확인하는 methylation-sensitive restriction enzyme-polymerase chain reaction (MSRE-PCR) 영역의 4가지 tdmrs 표지자에대한 primer는증폭되는영역안에 Hha Ⅰ 인지부위인 GCGC 염기서열을포함하도록설계한반면양성대조군인 Amelogenin과 D3S1358은 HhaⅠ의인지영역을포함하지않는영역을증폭하도록설계하였다. 이들의 primer를설계하기위한각유전자에대한 DNA 염기서열은 UCSC genome browser (http://genome. ucsc.edu/) 에서얻을수있었다. 인위적으로만들어진 DNA에서도음성대조군인 Digestion control은 HhaⅠ 인지영역이포함된부분을증폭하도록하였고, 또하나의양성대조군인 Amplification control의경우인간 DNA에대한양성대조군과마찬가지로 HhaⅠ의인지영역을포함하지않는부분을증폭하도록 primer를설계하였다. 모든 primer는획득된염기서열정보를 Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm) 에적용하여설계하였다. Melting temperature (Tm) 는 57 에서 63 사이이면서적정값은 60, primer의최소크기는 18 nucleotide bases, primer의 GC% 범위는 20에서 80이되도록하는 Primer3 상에내정된조건을따랐으며, 중합효소연쇄반응증폭산물의크기가 80-150 bp가되도록지정하여채택하였다. MSRE-PCR에사용한 primer는표 1에나타내었다. - 13 -
표 1. Multiplex PCR primers for DNA methylation profiling using MSRE-PCR Gene Primer sequences (5 >3 ) USP49 Conc. (mm) F: GTAGCAGGTGTTGCCCAGGTT 1.0 R: (FAM)CCCTCCCTACCTCACGCAGA 1.0 Size (bp) 107 DACT1 L81528 PFN3 Amelogenin D3S1358 Amplification control Digestion control F: (FAM)CACTCCTCCCCTGCTGTCTA 0.7 R: GATAAACTGGGCCTTGACCA 0.7 F: (FAM)CTTCTGGGGCGACTACCTG 0.4 R: AGTCAGCCTCATCCACACTGA 0.4 F: CCTGGCAGCCTCTAGACTCA 0.15 R: (FAM)GGGCCAAATAAACTGTGACC 0.15 F: CCCCTTTGAAGTGGTACCAGAG 0.25 R: (FAM)GCATGCCTAATATTTTCAGGGAATAA 0.25 F: GAGCAAGACCCTGTCTCATAGA 0.27 R: (HEX)TCAACAGAGGCTTGCATGTAT 0.27 F: CTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTT 0.15 R: (HEX)CAACCCGGTAAGACACGACT 0.15 F: GGTGAAGATCCTTTTTGATAATCT 1.0 R: (HEX)TTTGTTTGCAAGCAGCAGAT 1.0 118 128 137 81,84 83-111 131 144 박테리아의 16S ribosomal RNA (rrna) gene은여러가지박테리아사이에염기서열의상당한다양성을가지는초가변영역을가지며, 또한같은박테리아임에도불구하고서로다른염기서열을가지는영역도있다. 따라서선정된후보박테리아의 gene 중에서종특이적영역을가지고있는 bacterial 16S ribosomal RNA gene 내에서분석할영역을결정하였다. 우선 Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu/) 에서여러계통의동일박테리아종의염 - 14 -
기서열을얻은후 ClustalW2 프로그램 (http://www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalw2/) 을사용하여동일박테리아종사이의서로다른염기서열을있는부분을구분하여이부분을피해서 primer를디자인하였다. Primer3 프로그램을이용하여디자인된 primer들은 Ribosomal Database Project 웹사이트에서 probe match를시킴으로써디자인된 primer가어떤박테리아와 match되는지여부를확인하여선정된 primer쌍을사용했을때가장적은종을특이적으로증폭시키는 primer를선정하였다. Primer 조건은 MSRE-PCR과동일한조건이되도록지정하여채택하였다. 박테리아다중중합효소연쇄반응에사용된 primer는형광 dye로 TAMRA를사용하여 DNA 메틸화분석영역과구별되도록하였고, 이들의염기서열및표적박테리아는표 2에나타내었다. 표 2. Multiplex PCR primers for amplification of bacterial 16S ribosomal RNA gene Marker Target bacteria V. aty V. atypica S. sal S. salivarius L. cri L. gas L. gallinarum L. helveticus L. crispatus L. acidophilus L. johnsonii L. gasseri Primer sequences (5 >3 ) - 15 - Conc. (mm) F: TTAATAGACGGAAGCGAAACC 0.12 R: (TAMRA)CCGCAGTATGCTGACCTGC 0.12 F: (TAMRA)TACCGCATAACAATGGATGAC 0.2 R: TTACCTCACCTACTAGCTAATACAACG 0.2 F: (TAMRA)TGCCCCATAGTCTGGGATAC 0.2 R: CATCCCATAGCGACAGCTTA 0.2 F:(TAMRA)GACGGTAATTACTTAGAAAGT CACGG 0.4 R: CTTATTGAACCGCCTGCACT 0.4 Size (bp) 127 98 107 117
5. Methylation sensitive restriction enzyme 처리 DNA 메틸화분석을위하여메틸화되어있지않은 CpG 인지부위를인식하여절단하는 methylation sensitive restriction enzyme 을사용하였다. 그중메틸화되어있지않은 GCGC 인지부위를절단하는 HhaⅠ을사용하였다. 그림 2. Principle of methylation-sensitive restriction enzyme -polymerase chain reaction (MSRE-PCR) 1 ng의주형 DNA가 10 U의 HhaⅠ (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 및 1.0 μl의 Gold ST*R 10X Buffer (Promega, Madison, WI, USA) 에인위적으로만들어진 DNA 1 μl를포함하여총 10 μl의혼합물에서절단되었다. 인위적으로만들어진 DNA는항상메틸화되어있지않도록만든 DNA로 pcr 2.1-TOPO vector (Invitrogen) 의 HhaⅠ 인지부위를포함하는 481 bp 부분을중합효소연쇄반응으로인한증폭에의해얻은후 genomic DNA 1 ng에상응하도록희석하여사용하였다. 이들은 37 에서 30분동안 - 16 -
효소처리한후 65 에서 20 분동안배양함으로써열에의해비활 성화시켰다. 6. 중합효소연쇄반응증폭 중합효소연쇄반응증폭을위한혼합물에는표 1, 2의최종농도에해당하는 primer와 1.0 μl의 Gold ST*R 10X Buffer (Promega) 및 2.0 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems) 가포함되도록하였고, DMSO를 5 % 추가하여 GC 함량이높은곳에서도주형 DNA가잘증폭될수있도록하였다. 이혼합물에효소가처리된 DNA 10 μl를첨가한후, 최종부피는멸균된 3차증류수로 20 μl가되도록맞추어잘섞어주었다. 중합효소연쇄반응혼합물은 PTC-200 DNA engine (MJ Research, Waltham, MA, USA) 에장착하여, 95 에서 11분간변성시키고 94 에서 20초, 59 에서 1분, 72 에서 30초의조건으로 28회중합반응후최종적으로 60 에서 60분간반응시킨후 4 에잠시보관하였다. - 17 -
7. 중합효소연쇄반응증폭산물의유전자형결정 중합효소연쇄반응증폭산물 1.0 μl를 0.2 μl의 GeneScan TM 500 LIZ Size Standard (Applied Biosystems) 와 20.0 μl의 Hi-Di TM Formamide (Applied Biosystems) 와혼합하여 95 에서 5분간반응시켜변성시키고얼음에넣어 2분 30초간방치하였다. 1.0 μl의대립유전자사다리도중합효소연쇄반응증폭산물과동일한방법으로준비한후, 준비된시료들을 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) 에장착하여 Performance Optimized Polymer 4 (POP4; Applied Biosystems) 와 47 cm ⅹ 50 μm의 310 capillary (Applied Biosystems) 를사용하여전기영동하였다. 중합효소연쇄반응증폭산물과대립유전자표지자사다리및내부크기표식자의 DNA 단편크기는전기영동중실시간 ABI Prism 310 Data Collection Software 1.2 (Applied Biosystems) 에입력시킨후 GeneMapper ID 3.2 (Applied Biosystems) 를이용하여형광상측정법으로내부크기표식자에대한상대적인크기로각각의체액식별용표지자의크기를측정하였다. 8. 대립유전자사다리와체액식별을위한패널생성 대립유전자사다리는체액식별을위한모든 12 개의체액식별용 표지자를포함하도록각각의표지자에해당하는시료를따로따로 - 18 -
중합효소연쇄반응을수행한후그증폭산물을취합하여만들었다. 취합된중합효소연쇄반응증폭산물은 QIAquick PCR purification Kit (Qiagen) 을이용하여정제한후, GeneMapper ID 3.2 (Applied Biosystems) 를이용하여체액식별을위한패널을정함으로써분석 을정확하고용이하도록하였다. 9. 다중중합효소연쇄반응검사의식별력검사 본연구를통하여구축된다중중합효소연쇄반응이어느정도체액식별이가능한지확인하기위하여, 기원을알고있는체액들을이용하여증폭하였다. 혈액 20명, 타액과정액 21명, 질분비액과생리혈 14명의체액을사용하여측정하였으며, 정액에는정관수술을한 2 명의남자가포함되어있다. 중합효소연쇄반응의증폭조건은앞서설명한중합효소연쇄반응조건과동일하며, 좀더정확한측정을위하여제한효소 HhaI을처리하지않은체액도동시에진행하였다. HhaI을처리하지않을경우, 중합효소연쇄반응증폭을위한혼합물에는 1 ng의주형 DNA와 1 ul의인위적으로만들어진 DNA에표 1, 2의최종농도에해당하는 primer와 2.0 μl의 Gold ST*R 10X Buffer 및 2.0 U AmpliTaq Gold DNA polymerase (Applied Biosystems) 가포함되도록하였고, DMSO를 5 % 추가하여 GC 함량이높은곳에서도주형 DNA도잘증폭될수있도록하였다. 제한효소처리전후를동시에중합효소연쇄반응하여어느정도차이를 - 19 -
보이는지확인하였다. 10. 75 일간실내환경에노출시킨시료에서의체액감별효율확인 본연구를통해구축된다중중합효소연쇄반응이오래되고분해된시료에서도체액식별이가능한지확인하기위하여각각의체액을 75일간실내환경에노출시켰다. 혈액과타액은 10 μl를거즈에묻혀노출시켰고, 정액과질분비액, 생리혈은면봉에묻힌채로 노출시켰다. 75 일이지난후 QIAamp DNA Investigator kit (QIAGEN) 를이용하여제조사의지시에따라 DNA 를추출하였다. 각체액의 DNA 를주형으로동일한방법으로중합효소연쇄반응을 위한혼합물을만들고, 29 회의중합효소연쇄반응을수행하였다. 11. 새로구축된다중중합효소연쇄반응의민감도확인 본연구를통해구축된다중중합효소연쇄반응이어느정도의민감도를나타내는지확인하기위하여, 각각 2명의타액, 정액, 질분비액의 DNA를 1 ng부터 500 pg, 250 pg, 125 pg, 62 pg, 31 pg, 15 pg으로차례로희석하여증폭하였다. 다중중합효소연쇄반응의증폭조건은앞서설명한중합효소연쇄반응조건과동일하며, 온도순환반복횟수또한 28회로동일하게수행하였다. 그리고각주형 DNA의농도에따라온도순환반복횟수를달리함으로써더 - 20 -
낮은농도에서도분석가능한지확인하기위하여 500 pg과 250 pg은 30회, 125 pg과 62 pg은 32회그리고, 31 pg은 34회로차등을두어수행하였다. 각각의농도별주형 DNA를이용한다중중합효소연쇄반응은 3회반복하여수행하였다. 12. 혼합된체액의다중중합효소연쇄반응검사 본연구를통해구축된다중중합효소연쇄반응이두가지의체액이혼합된경우에도식별가능한지확인하기위하여, 타액과정액, 질분비액과타액, 질분비액과정액혼합물을인위적으로만들어확인하고자하였다. 타액과정액의경우거즈위에타액 10 μl와정액 10 μl로 1:1의비율로섞은시료와타액 10 μl, 정액 20 μl로 1:2의비율로섞은시료를만들었다. 또한질분비액이묻혀진 4개의면봉위에타액과정액을각각 5 μl와 10 μl씩분주하여혼합물 시료를만들었다. 이들을하루동안건조한후에 QIAamp DNA Investigator kit (QIAGEN) 를이용하여제조사의지시에따라 DNA 를추출하였다. 각혼합체액의 DNA 를주형으로앞서설명한 동일한방법으로중합효소연쇄반응을수행하였다. - 21 -
Ⅲ. 결과 1. Methylation-sensitive restriction enzyme-polymerase chain reaction (MSRE-PCR) 구축 선정된 4개의 tdmrs 표지자에대하여각각설계된 primer가 HhaⅠ 처리된체액에서예상된메틸화패턴을보이는지확인하였다. 몇 tdmrs에서 GC 함량이높아증폭효율이떨어지는것은 DMSO를추가함으로써보완하였다. 그후 4개의표지자들의증폭산물크기를고려하여 FAM lane에배치하였다. 양성대조군인 Amelogenin과 D3S1358을각각 FAM과 HEX lane에배치하고, 완전한제한효소처리를확인하기위한음성대조군인 Digestion control과인위적으로만들어진 DNA의투입을확인하기위한 Amplification control을 HEX lane에배치하여다중중합효소연쇄반응을구축하였고, 이들사이에간섭현상이없는지확인하였다. 2. 박테리아존재확인을위한중합효소연쇄반응시스템구축 기존논문에보고된 primer 들 14,15,17,19 을사용하여몇몇시료을 대상으로스크리닝을진행하여, 체액내의박테리아존재여부를 확인한후자체적으로설계된 primer 를이용하여동일한결과가 - 22 -
나오는지확인하였다. 표적이되는체액에서잘증폭하는지, 반대로표적이아닌체액에서증폭되지않는지여부를확인하였다. 그와동시에 MSRE-PCR의경우 GC 함량이높은 tdmr 표지자들의증폭을위하여 DMSO를추가하므로각박테리아표지자들이 DMSO의영향을받는지여부도동시에평가하였고문제없이진행되는것을확인하였다. 그후후보 primer set의특이성과증폭산물의크기를고려하여다중중합효소연쇄반응을구축하였고, 이들사이에간섭현상이없는지확인하였다. 3. 다중중합효소연쇄반응구축및체액별프로파일링 한번의반응으로좀더식별력이높고효율적인체액식별을하기위하여독립적인두가지다중중합효소연쇄반응을융합하였고, 이때간섭현상없이독립적으로정확하게분석됨을확인할수있었다. 구축된다중중합효소연쇄반응의대립유전자사다리와 HhaⅠ 처리후의대표적인결과는그림 3에나타내었으며, 각체액에대한 MSRE-PCR과체액특이박테리아존재에대한결과는그림 4에나타내었다. - 23 -
A. B. 그림 3. Scheme of multiplex PCR system for body fluid identifycation (A) The allelic ladder of multiplex PCR system (B) The analysis result of saliva after HhaⅠ treatment - 24 -
A. Blood B. Saliva C. Semen D. Vaginal fluid E. Menstrual blood 그림 4. Result of MSRE-PCR (left) and a body fluid-specific bacteria presence test (right) in each body fluid Methylation state is indicated as peak height in MSRE-PCR. The tdmrs markers for USP49, DACT1, and PFN3 genes can identify semen by indicating unmethylated patterns. And L81528 marker shows methylated pattern in only semen. Vaginal fluid and menstrual blood is distinguished from blood and saliva by PFN3 markers. And Amelogenin is positive control. In saliva, - 25 -
Streptococcus salivarius or Veillonella atypica can be detected as saliva-specific bacteria. And vaginal fluid and menstrual blood can be identified by detecting Lactobacillus crispatus or Lactobacillus gasseri. 혈액은 3개의 tdmr인 USP49, DACT1, PFN3에서메틸화된결과를보이며 DNA가증폭되는반면, L81528은 HhaⅠ에의해절단된 unmethylation 결과를보였다. 박테리아존재확인결과에서는어떠한표지자도증폭하지않는결과를보였다. 타액의경우혈액과동일한 MSRE-PCR 결과를보였으나, 박테리아중합효소연쇄반응에서 Streptococcus salivarius와 Veillonella atypica가둘중하나혹은둘다증폭함으로써타액임을식별할수있었다. 특히 S. salivarius의경우박테리아가발견된모든타액시료에서관찰됨을확인할수있었다. PFN3의경우 HhaⅠ 처리전과비교했을때 70% 이하로낮아진 sample이 21명중 2명있었으나, 이들을모두타액특이박테리아를확인함으로써타액임을확인할수있었다. 박테리아가증폭되지않는결과를보여준 2명의시료를제외하고모두타액특이박테리아의증폭으로인해더명확하게타액임을예측할수있었다. 하지만타액중한시료에서 S. salivarius와 V. atypica가관찰되고동시에 Lactobacillus crispatus가약간증폭되는결과를보였다. - 26 -
정액은 MSRE-PCR에서혈액, 타액과정반대의결과를보여주었다. USP49, DACT1, PFN3에서 peak가확인되지않음으로써 unmethylation 되어있음을알수있으며, L81528에서는메틸화되어 HhaⅠ에의한절단없이증폭됨을확인할수있었다. 혈액과마찬가지로박테리아존재확인결과에서는어떠한표지자도증폭하지않는결과를보였다. 질분비액과생리혈은거의동일한결과를보였다. USP49와 DACT1에대하여 hypermethylation 경향을보였으며, L81528은 unmethylation 결과를보였다. PFN3의경우생리혈에서한명을제외하고, HhaⅠ 처리전후를비교했을때 30-70% unmethylation을보였다. 질분비액특이박테리아의경우 Lactobacillus crispatus와 Lactobacillus gasseri 둘중하나혹은둘다증폭되었다. 두가지박테리아가모두강하게증폭되는시료는거의없었으며, 동일인의질분비액과생리혈이항상동일한박테리아를가지고있는것은아니지만강한증폭을보이는질분비액특이박테리아는거의동일하였다. - 27 -
표 3. The profile of bacteria in each body fluid Body fluid N Number of positive samples L.crispatus L.gasseri S.salivarius V.atypica Number of negative samples Blood 20 0 0 0 0 0 Saliva 21 1 0 19 13 2 Semen 21 0 0 0 0 0 Vaginal fluid Menstrual blood 14 8 9 0 0 1 14 8 8 0 0 3 4. 정액 DNA 의다양한메틸화패턴 다른체액과달리정액에서는다양한메틸화패턴을보였으며대표적인결과는그림 5에나타냈다. 21명중 10명이일반적으로예상했던메틸화패턴대로 4개의 tdmrs 중 L81528만증폭되는결과를보였다. 9명은그림 5의 B와같이 L81528을제외한 3개의 tdmrs도약간의메틸화패턴을보이면서증폭되었으나 L81528이증폭된결과를통해정액임을예측할수있었다. 마지막으로 2명의정관수술한남성의정액은다른체액과유사한패턴을보이며 L81528이그림 5의 C와같이완전히 unmethylation 상태이거나약간메틸화된결과를보였다. - 28 -
A. Semen B. Methylated semen C. Semen of vasectomized male 그림 5. Various DNA methylation patterns of semen Semen that has sperm cells can be distinguished from other body fluids by amplifying L81528 marker. But, semen from vasectomized male shows a very weak L81528 peak. - 29 -
5. 75 일간실내환경에노출시킨시료에서의체액감별효율확인 실내환경에 75일간노출시킨 DNA를이용하여오래되고분해된시료에서도 DNA 메틸화의안정성과박테리아의존재여부를확인하고자하였다. 타액을제외한체액에서는 DNA 메틸화를확인할수있었으며타액에서는인간 DNA가완전히분해된것처럼거의어떠한 amplicon도생성되지않는결과를보여주었다. 하지만 S. salivarius의증폭으로이체액이타액임을확인할수있었다. 나머지체액에대해서는그림 6에서나타냈듯이노출시키지않은 DNA 결과와거의동일한결과를보였으며, 생리혈에서질분비액특이박테리아는확인할수없었다. - 30 -
A. Blood B. Saliva C. Semen D. Vaginal fluid E. Menstrual blood 그림 6. Body fluid identification of samples exposed to indoor environment samples for 75 days DNA from body fluids exposed in indoor environment for 75 days shows almost similar methylation pattern and body fluid-specific bacteria comparing with DNA from fresh body fluid. - 31 -
6. 새로구축된다중중합효소연쇄반응의민감도확인 타액, 정액, 질분비액에대하여각각 2명의시료를이용하여 1 ng부터 15 pg까지연속적으로희석하여 3회반복확인하였다. 100 relative fluorescent units (RFUs) 값을넘는 peak에한하여유효한 peak로보았다. 타액의경우두시료모두 500 pg 이상에서 4개의표지자중 L81528을제외한 3개의표지자가증폭되는것을확인할수있었다. 정액의경우 1 ng의 DNA에서는 DACT1이약하게증폭되지만, 정액특이메틸화표지자인 L81528의증폭을기준으로하였을때 500 pg 이상에서는분석가능함을확인하였다. 질분비액의경우 250 pg 이상까지분석가능하였으며 125 pg 이하에서는 PFN3가인지되지않았다. 박테리아의경우타액과질분비액에서만증폭하며개인에따라다른양상을보이지만, 대부분의타액과질분비액시료에서 62 pg 이상의 DNA로증폭할경우체액특이박테리아가하나이상증폭함으로써체액을식별할수있었다. 박테리아양이적은시료의경우 250 pg 이하에서증폭되지않는경우도존재하였다. 타액, 정액, 질분비액의각민감도확인결과는그림 7, 8, 9에나타내었다. 동일한시료에대하여 500 pg부터 31 pg까지연속적으로희석한후중합반응횟수를달리하여민감도를확인하였다. 메틸화정도를보는 MSRE 영역에서타액은 31 pg으로희석된시료에서 L81528의증폭이확인되었고, 정액은 125 pg으로희석된 - 32 -
시료에서부터 DACT1 등 L81528이아닌다른 peak들이관찰되었으며질분비액에서는모든시료에서예상되는동일한메틸화패턴을보였다. 체액특이박테리아영역에서는타액에서 62 pg의 DNA에서 V. atypica가증폭되지않는경향을보였다. 정액에서는 31 pg에서타액특이박테리아인 S. salivarius가증폭되었으며, 질분비액에서도 125 pg 이하의 DNA에서 S. salivarius가증폭됨을확인할수있었다. 양성대조군인 D3S1358은시료와상관없이 125 pg 이하의 DNA에서는 19 allele이증폭되는결과를보였으며, 음성대조군인 Digestion control 또한 125 pg 이하의 DNA에서는중합반응횟수가늘어남에따라약간증폭되는결과를보였다. 중합반응횟수를달리한민감도확인결과는그림 10, 11, 12에나타내었다. - 33 -
A. 1 ng B. 500 pg C. 250 pg D. 125 pg E. 62 pg F. 31 pg G. 15 pg 그림 7. Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system in saliva When the cut-off value was settled as 100 RFUs, more than 500 pg of DNA from saliva can be analyzed by amplifying USP49, DACT1, and PFN3 without drop-in and drop-out. - 34 -
A. 1 ng B. 500 pg C. 250 pg D. 125 pg E. 62 pg F. 31 pg G. 15 pg 그림 8. Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system in semen When the cut-off value was settled as 100 RFUs, more than 500 pg of DNA from saliva can be analyzed by amplifying L81528 without drop-in and drop-out. - 35 -
A. 1 ng B. 500 pg C. 250 pg D. 125 pg E. 62 pg F. 31 pg G. 15 pg 그림 9. Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system in vaginal fluid When the cut-off value was settled as 100 RFUs, more than 250 pg of DNA from saliva can be analyzed by amplifying USP49, DACT1, and PFN3 without drop-in and drop-out. - 36 -
A. 500 pg B. 250 pg C. 125 pg D. 62 pg E. 31 pg 그림 10. Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system using various concentrations of saliva DNA with different PCR cycles 30 cycles for 500, 250 pg of template DNA; 32 cycles for 125, 62 pg; 34 cycles for 31 pg. - 37 -
A. 500 pg B. 250 pg C. 125 pg D. 62 pg E. 31 pg 그림 11 Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system using various concentrations of semen DNA with different PCR cycles 30 cycles for 500, 250 pg of template DNA; 32 cycles for 125, 62 pg; 34 cycles for 31 pg. - 38 -
A. 500 pg B. 250 pg C. 125 pg D. 62 pg E. 31 pg 그림 12. Sensitivity test results of the developed multiplex PCR system using various concentrations of vaginal fluid DNA with different PCR cycles 30 cycles for 500, 250 pg of template DNA; 32 cycles for 125, 62 pg; 34 cycles for 31 pg. - 39 -
7. 혼합된체액의다중중합효소연쇄반응검사 5가지체액의여러가지조합중실제현장에서발견될수있을법한조합을선택하여진행하였다. 타액과정액을 1:1과 1:2의비율로혼합한시료의경우둘사이에큰차이는보이지않았으며, 정액의표지자인 L81528 표지자가증폭되고타액특이미생물인 S. salivarius가증폭됨을두체액이혼합된시료임을알수있었다. 질분비액과타액을혼합한시료에서는질분비액특이박테리아인 L. gasseri와타액특이박테리아인 S. salivarius가증폭됨으로써질분비액과타액의혼합시료임을확인할수있었다. 5 μl와 10 μl의타액을혼합한시료에서모두극소량의 S. salivarius가증폭되었으나 100 RFUs 값보다높으므로실제타액이혼합되어있다고결론내릴수있었다. 하지만질분비액과정액을혼합한시료의경우, 질분비액특이박테리아인 L. gasseri가증폭되고 DNA 메틸화정도또한질분비액의대표적인패턴을보였으나정액에특이적인표지자의증폭은확인할수없었다. - 40 -
A. B. C. D. E. F. 그림 13. Results of mixture sample multiplex PCR tests Mixture of saliva and semen is detected S. salivarius, saliva-specific bacteria, and L81528 that shows semen-specific methylated pattern. (A) Mixture of saliva 10 μl and semen 10 μl (B) Mixture of saliva 10 μl and semen 20 μl ; Mixture of vaginal fluid and saliva can be confirmed by each body fluid-specific bacteria, L. gasseri and S. salivarius (C) Mixture of vaginal fluid - 41 -
swab and saliva 5 μl (D) Mixture of vaginal fluid swab and Saliva 10 μl ; Mixture of vaginal fluid and semen can be confirmed by each body fluid-specific bacteria, L. gasseri and S. salivarius (E) Mixture of vaginal fluid swab and semen 5 μl (F) Mixture of vaginal fluid swab and semen 10 μl - 42 -
Ⅳ. 고찰 범죄현장에서체액을증명하고그유형을식별하는것은용의자의추적을위한 DNA 정보를제공할뿐만아니라체액시료제공자와실제범죄행동을연결짓는중요한정보를제공한다. 체액식별자체만으로도범죄를해결하는데많은도움을주므로현재체액식별에대한많은연구들이진행되고있으며, DNA를기반으로법의영역에서체액을식별할수있는방법은조직특이적으로다른메틸화패턴을보이는 tdmrs를분석하는방법과체액특이박테리아의존재여부를확인함으로써체액을식별하는방법이있다. 본연구는 2가지체액식별방법을융합하여각각의단점을보완하고, 한번의반응으로보다높은식별력을가지는체액식별용다중중합효소연쇄반응을구축하였다. 새롭게구축된체액식별용다중중합효소연쇄반응의 methylation-sensitive restriction enzyme-polymerase chain reaction (MSRE-PCR) 영역은기존의보고된 MSRE-PCR 들 10,12,13 과비교했을때몇가지개선된점들이있다. 첫째로, 이전에연세대연구진이구축한 MSRE-PCR은정액을확인하기위하여모두 unmethylation 경향을띠는 4개의표지자가선정하였다. 대부분의정액시료는 4가지표지자에대하여모두 unmethylation 경향을보이며 peak가뜨지않는패턴을보이지만, - 43 -
드물게메틸화되어있는경우정액인지다른체액인지구분하기힘들었다. 본연구에서는체액식별하는데큰영향력이없는 PRMT2를제외하고, 정액에서만메틸화패턴을보이는 L81528 표지자를추가하였다. 정액을제외한다른체액에서는 L81528이 unmethylation 되어있어 HhaI 처리에의해서모두절단되어결과적으로 peak가관찰되지않지만, 정액은메틸화되어있어 HhaⅠ에영향을받지않아정액인경우에만 L81528 peak를관찰할수있었다. 하나의다중중합효소연쇄반응에정액에대하여서로반대되는 2가지메틸화패턴을보이는표지자들을선정함에따라, 다른 3가지표지자들이약한메틸화경향을보이더라도 L81528의증폭을통해정액임을확실하게예상할수있게되었다. 하지만정관수술을한남성의정액은 L81528에대하여정자를지닌정액과비교하여매우약한메틸화반응을보였다. 따라서본연구를통해구축된다중중합효소연쇄반응은정자를가지고있는정액에대하여식별이가능하고정관수술을받았거나무정자증정액을확인하기위해서는새로운시스템의개발이필요하다. 두번째로 Amplification control 표지자가추가되었다. 이전연세대연구진이구축한 MSRE-PCR에는중합효소연쇄반응의증폭산물은주형 DNA와달리메틸기가붙지않는다는이론을근거로제한효소의완전한반응을확인하기위해벡터 DNA의증폭산물을이용하여인위적으로만들어진 DNA를사용한 Digestion control 표지자가포함되어있다. 하지만이는주형 DNA - 44 -
외에추가적으로들어가는 DNA이므로제한효소처리가끝났을때실제로제한효소가완전히작용하여절단되어서 peak가관찰되지않는것인지 DNA 자체가투입되지않은것인지확인할수있는방법이없었다. 그래서인위적으로만들어진 DNA 영역내에 HhaI 인지부위를포함하지않는 Amplification control을추가함으로써 DNA의투입여부를확인할수있도록하였다. 마지막으로, 정액식별을위한상용화된 MSRE-PCR kit인 DSI-Semen TM kit (Nucleix) 는정액을구분하는 3 가지표지자와 정액이아님을구분하는 2가지표지자로구성된다중중합효소연쇄반응이다. 이다중중합효소연쇄반응시스템은본연구진이구축한시스템에서정액을좀더명확하게식별하기위해서로반대되는메틸화패턴을이용하는것과동일한원리로정액특이표지자는 L81528 표지자와같이정액에서만 methylation 되어있는표지자를, 비정액특이표지자는 USP49 등의표지자와같이정액에서만 unmethylation 되어있는표지자를사용하였다. 이들은 5개의표지자를이용하여좀더명확하게정액을식별할수있다는장점이있지만, 또한정액만을식별할수있기에정액이아닌다른체액의경우추가적인검사가필요하다. 하지만본연구를통해구축된다중중합효소연쇄반응시스템은정액특이표지자이면서질분비액과생리혈에서도다른비율의메틸화정도를보이는 PFN3를포함함으로써정액외에도질분비액과생리혈이혈액과타액으로부터구별될수있도록하였다. - 45 -
현장에서발견되어분석되는체액시료의경우, 그양이적고상태가좋지않아한번이상의 DNA 추출이어려울것으로여겨진다. 본연구의경우인간 DNA와박테리아 DNA가동시에분석되어야하므로, 일반적으로사용되는개인식별을위한인간 DNA 추출방법으로도동시에추출가능한미생물을선택해야한다. 현재까지법의영역에서가장빈번하게사용되는체액특이박테리아는타액특이박테리아인 Streptococcus salivarius와 Streptococcus mutans이고, 질분비액특이박테리아는 Lactobacillus crispatus와 Lactobacillus gasseri이다. 하지만 S. mutans의경우박테리아 DNA 추출방법으로진행해보았을때많은양의 DNA를얻을수있었으나, 인간 DNA 추출방법으로진행하면 DNA 추출이불가능했다. 현장에서들어온시료는가장기본적으로개인식별을위한작업이진행되므로박테리아 DNA보다인간 DNA가우선적으로필요하다. 게다가인간 DNA의메틸화패턴을함께확인해야하는시스템이므로이러한특성을고려했을때최소한의조건에서도증폭이가능한박테리아를선별하여야했고, 따라서 S. mutans를대신하여타액에서흔히나타나는 Veillonella atypica를타액특이박테리아후보로선정하게되었다. 체액특이박테리아의표지자에대한 primer를설계할때각박테리아에만특이적으로증폭되는 primer를설계하기쉽지않았다. 그리하여타액특이박테리아인 S. salivarius와 V. atypical의경우 - 46 -
표적박테리아만증폭되도록설계할수있었으나, 질분비액의경우 L. crispatus는 4개의 Lactobacillus 종이증폭되고, L. gasseri는 2개의 Lactobacillus 종이함께증폭되는 primer가설계되었다. 하지만이들모두질분비액에존재하는박테리아이므로비록표적박테리아이외의것이증폭되더라도질분비액과생리혈에서만증폭되므로체액을식별하는데문제없었다. 박테리아존재여부로확인할수있는체액은타액과질분비액, 생리혈이다. 21명의타액을조사해본결과 2명은 S. salivarius와 V. atypica 모두증폭되지않았다. 나머지 19명중 S. salivarius는모든시료에서발견되었고, V. atypica는 13명의시료에서발견되었다. 특히, V. atypica는연령별로차이를보였고, 연령대가높아질수록검출빈도가낮아졌다. 현재연구에사용된체액은 20대에서 50대까지의남성과 20대에서 40대까지의여성의체액이사용되었다. 각표지자들은연령대에상관없이체액식별하는데큰무리가없었으나 V. atypica의경우연령대가높아질수록나타나는빈도수가줄어듦을확인할수있었다. 20대와 30대에서는각각 6명과 4명모두에서확인되었으며, 40대는 3명중 2명에게서, 50대는 6명중 1명에게서만나타났다. 본연구의결과는한국인을대상으로다양한연령대의타액에서발견되는박테리아를조사한결과와동일하였다. 22 또한한명의타액에서질분비액특이표지자인 L. crispatus가발견되었다. S. salivarius와 V. atypica에비해 peak 높이가현저히 - 47 -
낮아 L. crispatus의양이적은것으로보이나 100 RFUs를기준으로했을때유효한 peak으로나타났다. Lactobacillus는모든유산균이들어있는식품에서쉽게발견되는박테리아다. 실제 Giampaoli 등 19 의논문에서 2개의요거트를대상으로박테리아를검사했을때 L. gasseri는 2개에서모두나오고, L. crispatus가 1개의요거트에서발견되는결과를보였다. 실제로타액에서 L. crispatus 양성반응을보인기증자가이전에무엇을먹고타액을기증했는지는알수없었다. 유산균이들어간제품이요거트외에도김치등여러음식이있다는것을가정했을때약간의 Lactobacillus가존재하는것을배제할수는없을것으로보인다. 결과적으로타액에는적은양의 Lactobacillus가존재할가능성이있으므로 Lactobacillus가있다고해서타액임을배제하는것보다다른추가적인검사를통하여검증하는것이필요할것으로보인다. 질분비액에는 L. crispatus와 L. gasseri가둘중하나는항상존재한다고알려져왔다. 하지만본연구결과한명의질분비액에서둘중어떤박테리아도검출되지않았다. 하지만이시료의경우 DNA 메틸화결과만으로도질분비액-생리혈임을확인할수있었다. 생리혈의경우 14명중 3명에서박테리아가검출되지않았으나마찬가지로 MSRE-PCR을이용한 DNA 메틸화결과에서질분비액-생리혈의패턴을확인할수있었다. RNA 분석법와박테리아분석법을융합한 Fleming 등 24 의연구결과를봤을때에도질분비액은모든시료에서질분비액특이박테리아가 - 48 -
관찰되는반면생리혈의경우몇시료에서만관찰됨을보고한바있다. 이는질분비액에비해생리혈의양이많아희석되는경우와관계가있을것으로생각된다. 질분비액과생리혈은분비되는곳은다르나서로통해있기때문에유사한메틸화패턴과박테리아분포를보인다. L. crispatus와 L. gasseri가둘다분포하는경우는많지않다고알려져있고, 한체액내에둘다분포하더라도 L. crispatus와 L. gasseri 중하나가많은양을차지하고있다. 표 3에서보듯이질분비액과생리혈은약간의차이가있으나동일인이라면우세한박테리아종이동일한결과를보였다. 하지만생리주기에따라질 내박테리아의분포가달라지기때문에 25-27 동일인이라할지라도 질분비액과생리혈을기증받은시기가다른생리주기이므로박테리아종의차이는존재할수있다. 혈액과정액에서는예상했던것처럼 4개의표적박테리아가모두발견되지않았으며, 박테리아를통해서도체액을식별하는데도움이되는것을확인할수있었다. DNA 메틸화분석법과체액특이박테리아확인방법을융합하기위하여인간 DNA와박테리아 DNA의메틸화되는부위가다르기때문에고려해야할점이있었다. 인간 DNA의경우일반적으로 cytosine (C) 과 guanine (G) 이연속적으로나타나는염기서열인 CpG 부위라고불리는곳의 C에주로메틸화되어있다. 반면 - 49 -
박테리아의경우 GATC 염기서열에서 adenine (A) 에메틸기가붙는것으로알려져있다. GATC이외에도박테리아 DNA 내에메틸기가붙는부위는몇가지더있으나본연구에서인간 DNA 메틸화정도를알아보기위해사용한 HhaⅠ의인지부위인 GCGC에는메틸화가되지않는다. 따라서체액특이박테리아의표적증폭영역내에 GCGC 인지부위가존재한다면 HhaⅠ의영향을받아증폭되지않을수있으므로박테리아 DNA 증폭영역은 HhaⅠ 인지부위를피하여증폭하였다. DNA 메틸화패턴분석하는방법과박테리아존재여부를확인하는방법을융합한다중중합효소연쇄반응에서둘사이의간섭현상은발견되지않았으며, 이두가지분석법이함께진행되었을때보다여러가지체액을한번의분석으로구분할수있었다. 기존 MSRE-PCR을이용하였을때구분되지않았던혈액과타액이타액특이박테리아를통하여구분할수있었다. 또한개선된 MSRE-PCR에서 L81528을통하여메틸화패턴을보이는정액까지도완전히식별할수있었다. 또한혈액-타액으로부터구분하였던질분비액-생리혈을구별하는 PFN3는타액시료에서 hypomethylation 패턴을보임으로써명확하게구분되지않는시료들이있었다. 하지만타액특이박테리아와질분비액특이박테리아를함께분석함으로써보다명확하게체액을식별할수있게되었다. 따라서본연구의다중중합효소연쇄반응은혈액, - 50 -
타액, 정자가존재하는정액그리고질분비액 - 생리혈을식별할수 있다. 현장에서발견되는시료로부터얻어진 DNA는다소오래되고분해된시료일가능성이높다. 따라서본연구에서는각체액을실제실내환경에 75일간방치시킴으로써오래되고분해된시료에서도분석이가능한지확인하였다. 본연구에서의표적이되는체액은주로현장에서발견되는것이므로현장이발견되는시간은오래걸리지않을것이라여겨져 75일간방치하여실험을진행하였다. 기존에연세대연구진에의해구축된 MSRE-PCR에서는타액이모두분해되어인간 DNA가증폭되지않았으나, 본연구에서구축된다중중합효소연쇄반응에서는타액특이박테리아인 S. salivarius의증폭을통하여타액임을확인할수있었다. 다른체액에서는 MSRE-PCR 영역은모두증폭되었으나, 생리혈에서질분비액특이박테리아가증폭되지않는결과를보여주었다. 하지만실제생리혈시료들에서박테리아가존재하지않는경우가종종있었으므로생리혈이아니라고단정지을수는없었다. 결과적으로, MSRE-PCR 영역에서 75일노출전후를비교하였을때분해된타액을제외하고메틸화정도에큰차이가없는것을확인할수있었고, 체액특이박테리아의경우도동일하게증폭됨을확인할수있었다. 따라서 75일간실내환경에방치된시료에서도두가지방법을융합함으로써체액을 - 51 -
효과적으로식별할수있었다. 법의영역에서는획득되는 DNA 양이많지않기때문에구축된다중중합효소연쇄반응이얼마만큼의민감도를가지는지확인할필요가있다. 박테리아의경우사람에따라체액내에존재하는양이다르기때문에박테리아분석영역의민감도확인은큰의미가없을것으로여겨졌고, 따라서 DNA 메틸화분석영역의민감도를중점적으로확인하고자하였다. 5가지체액에대하여 DNA 메틸화분석법으로식별가능한 3가지패턴에대하여각각대표적인체액인타액, 정액, 질분비액을대상으로민감도확인을진행하였다. 3가지체액에대하여동일하게제한효소를처리한후 28회의동일한중합반응횟수로진행한결과타액과정액은 500 pg 이상에서, 질분비액은 250 pg 이상에서분석가능할것이라확인되었다. 250 pg 이하의 DNA에서별다른비특이적 peak가생성되거나사라지지는않았으나기준점인 100 RFUs 값을넘지못하여유효값으로보기어려웠다. 이처럼 250 pg 이하로 DNA 양이적을때에는중합반응횟수를늘림으로써분석가능할것으로보인다. 체액특이박테리아는사람에따라존재하는양이다르므로각시료에따라다른민감도를보였으며, 31 pg 이상의 DNA를식별가능한시료에서부터 250 pg 이상의 DNA에서식별가능한시료까지다양했다. 하지만대부분의시료의경우 62 pg 이상의 DNA에서하나이상의체액특이박테리아가증폭됨으로써사람 - 52 -
DNA로증폭하는 DNA 메틸화패턴을통해체액식별하는 MSRE-PCR 방법보다높은민감도를보였다. 비록구축된다중중합효소연쇄반응시스템이 MSRE-PCR 영역에서민감도가높진않지만, 체액특이박테리아가부분적으로높은민감도를가짐으로써새로운체액식별방법의민감도를개선할수있었다. 또한동일한시료를이용하여중합반응횟수를늘림으로써민감도를개선할수있는지확인하고자하였다. MSRE-PCR 영역에서는비특이적으로생성되거나사라지는 peak는많지않아비교적민감도가높아짐을확인할수있었다. 하지만 peak 높이의비율로메틸화정도를확인하는방법임을고려할때적은양의 DNA일수록상대적으로많은제한효소 HhaⅠ이처리됨으로써메틸화의안정화가완전히유지되지는않는결과를보여주었다. 그러나 MSRE-PCR의주표적인정액의경우낮은농도의 DNA로도 L81528의증폭을통하여식별가능하였다. 체액특이박테리아의경우모든농도에서하나이상의표적박테리아가증폭되었다. 정액에서비특이적으로 31 pg의 DNA에서타액특이박테리아인 S. salivarius가약간증폭되었으나, MSRE-PCR 결과를통해 31 pg의 DNA에서도정액임을입증할수있었다. 또한질분비액에서는 125 pg과 31 pg의 DNA에서 S. salivarius가증폭되었다. Rabe 등 28 은 S. salivarius가그양은적으나질내에군집하고있다고보고한바있으며, 본결과또한중합반응횟수를늘림으로써적은양의 S. salivarius가인지된것이아닌가여겨진다. - 53 -
음성대조군인 Digestion control은 125 pg 이하의 DNA의경우 100 RFUs 이상의 peak 높이를보임으로써 peak로인지되었고, Amplification control의경우 peak 높이가너무높아져 pull-up 현상을보였다. 이경우, Amplification control과 Digestion control은희석된인간 DNA가아닌인위적으로 1 ng 정도로만들어진벡터 DNA가주형 DNA로사용되므로 cycle이늘어남으로써너무많은양의 DNA가증폭되면서발생된문제로보여진다. 또한양성대조군인 D3S1358의경우 125 pg 이하의 DNA에서비특이적으로 19 allele이증폭되는결과를보였다. 이는양성대조군의역할만을봤을때다른 allele이증폭됨으로써인간 DNA가투임되었다는것은입증할수있으므로본역할을다했다고볼수있으나, 시료가바뀌는것을막는역할을보았을때는 DNA 농도가낮을경우주의깊게확인해볼필요가있을것으로보여진다. 결론적으로구축된다중중합효소연쇄반응시스템은적은양의 DNA를중합반응횟수를 32회까지늘렸을때 62 pg의 DNA까지각체액을식별할수있을것으로보인다. 이는 DNA 메틸화분석법과체액특이박테리아방법을융합함으로써서로의단점으로보완하여가능하게할수있었다. 또한법의실제영역에서발견되는체액은한가지체액만남아 있는경우도있겠지만, 혼합물로존재하는경우도많다. 예를들어 성범죄의경우정액만떨어져있는경우도있으나많은경우속옷 - 54 -
내에질분비액과섞여있는정액을식별함으로써이를증명할수있다. 따라서본다중중합효소연쇄반응시스템으로혼합물또한식별가능한지여부를확인하고자타액과정액, 질분비액과타액, 질분비액과정액혼합물을만들어진행하였다. 주로박테리아의존재를통해서서로다른체액이혼합되어있음을확인할수있었다. 질분비액은면봉으로받은시료전체에타액이나정액을 추가하는것이므로 Quantifiler Duo DNA Quantification Kit (Applied Biosystems) 으로인간 DNA를정량해본결과질분비액이다른체액에비해 60~3000배정도더많은 DNA가추출되는결과를보였다. 따라서박테리아가아닌 DNA 메틸화정도를통해식별해야하는정액의경우질분비액과정액혼합물에서이들이혼합물임을증명하는데어려움이있었다. 따라서이러한시료의경우원심분리를이용하여정자와상층액을분리시켜서 DNA를추출하는방법을이용하여따로분석한다면두가지혼합물에대하여식별가능할것으로여겨진다. 현재까지개발된체액식별방법중 Fleming 등 24 은본연구와유사하게 mrna를방법과질분비액특이박테리아의 16S-23S rrna intergenic spacer region 분석법을융합하여다중중합효소연쇄반응을구축한바있다. 하지만이방법은질분비액특이박테리아만추가된다는점과법의영역에서아직까지 RNA가익숙하지않다는단점이있다. 본연구는법의 - 55 -
영역에서익숙하게사용하고 mrna에비해안정적인 DNA를사용한다는점과한번의반응으로여러가지체액을동시에분석가능하다는점을고려할때실제법의영역에서효과적인체액분석방법으로사용될수있을것으로보인다. - 56 -
Ⅴ. 결론 1. 기존의 DNA를기반으로하는체액식별방법보다효율적인방법을개발하기위해조직특이적인 DNA 메틸화패턴을보이는 tdmrs 분석법과체액특이박테리아의존재여부를확인하는방법을융합한다중중합효소연쇄반응을구축하였다. 2. 4 개의메틸화패턴을분석하는표지자와 4 개의체액특이 박테리아를이용하여혈액, 타액, 정액그리고질분비액 - 생리혈을 모든시료에서식별할수있었다. 3. 75일간실내환경에노출시킨체액을이용하여본연구에의해 구축된다중중합효소연쇄반응으로분석한결과, 75일이지난 후에도메틸화의안정성을보이고, 박테리아가관찰됨으로써 오래되고 분해된 시료에서도 체액 식별이 가능할 것으로 기대된다. 4. 구축된다중중합효소연쇄반응은동일조건일경우, 타액과정액은 DNA 500 pg 이상에서분석가능하며, 질분비액에서는 DNA 250 pg 이상에서분석가능함을보였으며, 중합반응횟수를늘릴경우 31 pg 이상의 DNA에서모두식별가능함을보임으로써적은양의 DNA에서도체액식별이가능할것으로 - 57 -
기대된다. 5. 본연구를통해구축된다중중합효소연쇄반응은법의영역에서익숙하게사용하는 DNA를사용한다는점과한번의반응으로여러가지체액을동시에분석가능하다는점을고려할때실제법의영역에서효과적인체액분석방법으로향후사용될수있을것으로보인다. - 58 -
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ABSTRACT Convergence of DNA methylation analysis and body fluid-specific microbial identification for body fluid discrimination and its forensic evaluation Ajin Choi Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University (Directed by Professor Kyoung-Jin Shin) Identification of the type of body fluids found at crime scenes provides important information that can support a link between sample donors and actual criminal act. Among several techniques based on nucleic acid analysis, DNA methylation profiling uses differences in DNA methylation status at tdmrs (tissue-specific differentially methylated regions) and can successfully discriminate semen including sperm cells. In addition, the method based on the detection of bacterial DNA specific for certain body fluid types can identify saliva and vaginal fluid. Therefore, integration of the two methods in a single reaction will allow more efficient discrimination of body fluids. To that end, previously reported multiplex MSRE PCR (methylation-sensitive restriction - 64 -
enzyme polymerase chain reaction) was improved by the addition of a new semen-specific marker and by including amplicons for 16S rrna gene of bacteria which are expected to be present in saliva and vaginal fluid. Since the bacterial DNA analysis regions don t have HhaI recognition sites, its amplification was not affected by MSRE treatment. Using the developed multiplex system, semen was distinguishable by unmethylation at the USP49, DACT1, PFN3 tdmrs and hypermethylation at L81528, saliva could be identified by detection of saliva-specific bacteria, V. atypica and/or S. salivarius, and vaginal fluid and menstrual blood were differentiated from other body fluids by hypomethylation at the PFN3 tdmr and the presence of vaginal fluid-specific bacteria, L. crispatus and/or L. gasseri. Moreover, 75-day-old samples can be successfully analyzed using this multiplex system, indicating the possible useful application of the multiplex for old and degraded samples. The multiplex PCR system has high sensitivity in 31 pg of DNA by increasing PCR cycles. This high sensitivity enables to overcome the weakness of both DNA methylation analysis and body fluid-specific bacteria identification and demonstrates complementary effects. Because developed multiplex system uses the same biological source of DNA for individual identification profiling and - 65 -
simultaneously analyzes various body fluids in one reaction, the method will facilitate more efficient body fluid identification in forensic casework. ------------------------------------------------ Key Words: Body fluid identification, DNA methylation, methylation-sensitive restriction enzyme polymerase chain reaction, saliva-specific bacteria, vaginal fluid-specific bacteria. - 66 -
게재 List 1. Lee HY, Park MJ, Choi A, An JH, Yang WI, Shin KJ. Potential forensic application of DNA methylation profiling to body fluid identification. Int J Legal Med 2012;126:55-62. 2. An JH, Choi A, Shin KJ, Yang WI, Lee HY. DNA methylation-specific multiplex assays for body fluid identification. Int J Legal Med In press. - 67 -