보안과제 ( ), 일반과제 ( o ) 과제번호 2010-0019867 의학 - 첨단과학기술융합원천기술개발사업 (Development of Integrated Technology in Medical & Advanced science ) 신장상피세포의 cilia disassembly 에의한내피세포손상기전규명 (Study on Injury Mechanism of Endothelial Cell in Kidney Disease caused by Epithelial Cilia Disassembly) 숙명여자대학교 미래창조과학부
2. 제출문 제출문 미래창조과학부장관귀하 이보고서를 " 신장상피세포의 cilia disassembly 에의한내피세포손상기전규명에관한연구 " 과제의보고서로제출합니다. 2013년 07 월 24 일 주관연구기관명 : 숙명여자대학교주관연구책임자 : 박종훈연구원 " : 박은영 " : 공현경 " : 우유미 " : 고제영 " : 김보혜 " : 이은지 " : 장은선 " : 이선영 " : 김예솔 " : 박세정 " : 김도연 " : 신유빈 " : 이정연 협동연구기관명 : 협동연구책임자 :
3. 보고서요약서 과제고유번호 2010-0019867 보고서요약서 해당단계연구기간 2012.06.30~ 2013.05.31 단계구분 3/5 연구사업명 중사업명 세부사업명 바이오 의료기술개발사업 의학 - 첨단과학기술융합원천기술개발사업 연구과제명 대과제명대과제가있을경우기재합니다 ( 단위과제일경우에는아래에기재합니다 ) 세부과제명 연구책임자박종훈 연구기관명및소속부서명 요약 국제공동연구 신장상피세포의 cilia disassembly 에의한내피세포손상기전규명 해당단계 참여 연구원수 총연구기간 참여 연구원수 숙명여자대학교생명과학과 총 : 14 명 내부 : 13 명 외부 : 1 명 총 : 43 명 내부 : 40 명 외부 : 3 명 해당단계 연구비 총연구비 참여기업명 상대국명 : 상대국연구기관명 : 위탁연구연구기관명 : 연구책임자 : 1. 다낭신동물모델인 Mxi1 KO 마우스를활용하여 Mxi1 유전자의결 함으로인해발현이감소된 Ift20 이 cilia 결함을유발하여신장낭포형 성에관여한다는새로운메커니즘을규명하였음. 2. Mxi1 유전자가 EMT (epithelial-mesenchymal transition) 에관여하 는것으로알려진 MMP9 을조절하여 renal tubulogenesis 에영향을미 친다는결과를증명하였음. 3. 신장상피세포의 cilia 유지에관여하는 Ift46 유전자를기능연구를 위해 Ift46 KO 마우스모델을구축하였고 embryonic lethality 가있음을 관찰하였음. 또한 in vitro 접근법을통해 Ift46 유전자가신장상피세포 의세포증식조절에관여한다는것을규명하였음. 4. 다낭신동물모델인 Pkd1,Pkd2 조건마우스라인을구축하고 renal collecting duct 세포에서특이적으로 Cre 를발현하는 HoxB7-Cre 마우 스와교배하여 Pkd1f/f:HoxB7-Cre 와 Pkd2f/f:HoxB7-Cre 를구축하고 각각의표현형을분석하였음. 보고서면수 : 37 정부 : 183,000 천원 기업 : 천원 계 :183,000 천원 정부 : 583,000 천원 기업 : 천원 계 :583,000 천원 색인어 ( 각 5 개이상 ) 한글 영어 다낭신, 섬모, 낭포형성, 세포증식, 신장상피세포 Polycystic kidney disease, cilia, cystogenesis, cell proliferation, renal epithelial cells
4. 요약문 요약문 Ⅰ. 제목 신장상피세포의 cilia disassembly 에의한내피세포손상기전규명 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성신장에낭포가형성되는질병인다낭신 (polycystic kidney disease) 은인구약 1000명당 1명정도로발병하는유전질환임. 지금까지알려진다낭신발병메커니즘으로는 renal tubule을구성하는신장상피세포의빚정상적인증식증가가대표적이며최근들어신장상피세포의 cilia 결함도낭포형성에관여한다는사실이밝혀졌음. 하지만아직까지다낭신을치료할수있는효과적인약물이개발되어있지않기때문에투석이나신장이식만이유일한치료법으로간주되고있음. 따라서본연구진은다낭신동물모델을이용하여신장상피 / 내피세포의네트워크를바탕으로한새로운낭포형성메커니즘을규명하여근본적인치료를위한약물개발에초석을마련하고자함. Ⅲ. 연구개발의내용및범위본연구진은다낭신동물모델인 Mxi1 KO 마우스를이용하여 Mxi1 유전자의결함으로인한낭포형성메커니즘을규명하고신장기능유지에중요한 renal tubulogenesis에 Mxi1 유전자가미치는영향을검증하고자함. 또한 cilia 형성및유지에중요한역할을하는것으로알려진 IFT gene family중 Ift46 유전자를선별하여 Ift46 유전자가신장에미치는영향및기능을규명하고자함. 이뿐만아니라대표적인다낭신동물모델로알려진 Pkd1f/f:HoxB7-Cre 마우스와 Pkd2f/f:HoxB7-Cre 마우스를구축하고각각의표현형을관찰하고자함. Ⅳ. 연구개발결과본연구진은 Mxi1 유전자의결함이 Ift20 유전자의발현을저하시켜 cilia 결함을유도하여신장낭포형성에관여한다는메커니즘을규명하였고 Mxi1 유전자가 MMP9 발현을조절하여 renal tubulogenesis를조절한다는사실을확인하였음. 또한 Ift46 유전자기능을검증하기위해 Ift46 KO 마우스를구축하였고 embryonic lethality가있음을확인하였으며, Ift46 유전자가신장상피세포의세포증식기작에영향을미칠수있음을 in vitro system에서검증하였음. 새롭게구축한 Pkd1f/f:HoxB7-Cre 마우스와 Pkd2f/f:HoxB7-Cre 마우스의표현형을관찰한결과두마우스모두굉장히심각한다낭신표현형을가지고있음을관찰하였고낭포형성메커니즘연구에활용될수있는가능성을검증하였음. Ⅴ. 연구개발결과의활용계획 Mxi1 유전자의결함으로유도되는다낭신발병메커니즘은지금까지밝혀져있지않았던 Mxi1 유전자의새로운기능을밝혔다는데의미가있으며이는다낭신치료제발굴혹은바이오마커개발에후보유전자로써가능성을제시할수있음. 또한신장세포에서기능이밝혀져있지않았던 Ift46 유전자가신장상피세포의세포증식에관여한다는것을규명함으로써 Ift46 유전자가다낭신유발원인유전자로간주될수있다는증거를새롭게규명하였음. 추가로구축한 Pkd1f/f:HoxB7-Cre 마우스와 Pkd2f/f:HoxB7-Cre 마우스의각각의표현형을분석해봤을때 Pkd1과 Pkd2 유전자가 renal - 2 -
collecting duct 에서결함이일어났을때다낭신을유발할수있는충분한원동력이될수있음을 in vivo 모델을통해검증하였고이동물모델을이용하여다낭신치료에적용될수있는새로운후보 유전자 screening 에기여할것으로기대함. 5. 영문요약서 SUMMARY PKD(polycystic kidney disease), one of the chronic kidney disease, is characterized by fluid-filled cysts in kidney. However, effective drugs for PKD is still not clear, so development of new candidates for PKD treatment are needed. To overcome this limitation, our research group elucidated renal cystogenesis mechanism using Mxi1 KO mouse model. Also, we suggested that Ift46 gene is new candidate gene related to PKD causing mechanism using in vitro system. Taken together, our results shows the novel therapeutic targets or biomarkers against PKD. 6. 영문목차 CONTENTS Chapter 1. Preview of R&D project Chapter 2. Technological status in domestic and foreign country Chapter 3. Results of this project Chapter 4. Application of this project Chapter 5. Scientific of technological information from foreign coutries Chapter 6. Research facilities and list of equipment Chapter 7. References 7. 목차 목차 제1장연구개발과제의개요제2장국내외기술개발현황제3장연구개발수행내용및결과제4장연구개발결과의활용계획제5장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보제6장연구시설ㆍ장비현황제7장참고문헌 - 3 -
8. 본문 제 1 장연구개발과제의개요 만성신장병은신장고유의기능인체내의노폐물배설및삼투압조절에실패하여발생하는질병으로자가증상이없어조기발견이어렵고치료시기를놓치는경우가많음. 그중다낭신 (polycystic kidney disease, PKD) 은신장에체액으로가득찬낭포가 renal tubule에형성되어신기능을저해하는대표적인유전적질환으로알려져있으며낭포형성이진행됨으로써결석, 요로감염, 출혈등과같은합병증을동반함. 대표적인다낭신발병원인유전자로는 PKD1과 PKD2 유전자가있는데실제다낭신환자에서이두유전자의돌연변이가많이관찰되고있음. PKD1 유전자돌연변이발생빈도는다낭신환자의 80-90% 정도를차지하며 PKD2 유전자의돌연변이는전체환자의 10-20% 에서관찰되고있음. PKD1, PKD2 유전자는각각 PC1(polycystin-1), PC2(polycystin-2) 단백질을 coding 하고있으며이두단백질은서로 interaction 하여 calcium channel 로써역할을수행함. Renal tubule을구성하고있는신장상피세포는 tubule의 lumen 안쪽으로 cilia를뻗어세포내신호전달에관여하는데 PC1과 PC2 단백질이 cilia에위치하여 calcium channel로써의역할을수행하고있음. Cilia는 lumen 안쪽으로생기는 urine flow에의해 bending현상이일어나고이러한자극을 PC1과 PC2로구성된 calcium channel 이인식하여세포내 calcium level 을증가시켜신호전달에관여한다고알려져있음. 최근연구에따르면 PC1과 PC2 돌연변이가없어도 cilia에결함이생기면낭포가형성될수있다는결과가발표되었음. 특히 cilia 와연관성이깊은유전자로 IFT(intraflagellar transport) gene family를들수있는데이유전자는 cilia assembly와 disassembly 를조절하여 cilia 모양유지에관여하며 cilia membrane 에존재하는다양한 protein 의 recruit 에도영향을미치는것으로밝혀졌음. 실제로 IFT gene 을 targeting 한동물모델의표현형을분석해보면대부분신장에낭포가형성된다낭신을관찰할수있음. 이러한연구결과들은 IFT 유전자들이 cilia 형성및기능유지에관여하고있을뿐만아니라다낭신을유발할수있는원인유전자임을보여주고있음. 이처럼다낭신발병원인메커니즘규명을위해다양한연구가진행되고있지만아직까지효과적인치료제개발이나바이오마커발굴에는뚜렷한진전을보이고있지않음. 따라서본연구진은다양한다낭신동물모델을구축및이용하여 in vivo 모델에서의낭포형성메커니즘을구체화시키고새로운타겟유전자를발굴하여치료제및진단마커로사용될수있는새로운후보타겟을발굴하고자함. - 4 -
제 2 장국내외기술개발현황 ADPKD 발병기작의연구 상염색체우성다낭신 (ADPKD) 은말기신부전증을야기하는요인으로서당뇨, 고혈압에이어 3번째를차지한다. ADPKD는유전질환이며, PKD1과 PKD2 유전자의 loss of function mutation 에의해일어난다. PKD1 유전자에의해만들어지는 PC1 단백질은 GPCR-like receptor 로서 C 말단의 cleavage 에의해생성되는 P100 단백질이중요한기능을한다 [1]. 한편 PKD2 유전자에의해생성되는 PC2 단백질은 TRP (transient receptor potential) calcium channel 로알려져있으며, 주로 PC1과 complex 를이루어신장상피세포의 primary cilium 상에존재한다. PC1/PC2 complex 는 mechanosensor 로서외부의 flow 를인식하여세포내로칼슘이유입되도록한다 [2]. 이러한역할을하는 PKD 유전자의 mutation 은신장상피세포의비정상적인증식을일으켜낭포을발생시킨다. PKD 유전자의돌연변이에의해 dysregulation 되는중요 intracellular signaling을소개하면다음과같다. 1. 세포내칼슘농도저하에의한 cyclic AMP 관련 signaling의과도한활성화정상적인조건하에서칼슘은 Adenylyl cyclase 5/6 (AC5/6) 의활성을저해시키는역할을한다. 따라서세포내칼슘유입이감소되면 AC5/6의활성을적절히조절하지못하게된다. AC5/6의기능은 ATP를이용하여 cyclic AMP를생성시켜 Protein kinase A (PKA) 가활성을가지게하는것이며, 활성화된 PKA는 B-raf 를인산화시킴으로써 MEK/ERK로이어지는 MAPK pathway를 up-regulation 시킨다. 이는결과적으로신장상피세포의과도한증식을일으킨다 [3]. 2. mtor pathway TSC1/2 complex 는 GTP-binding protein 인 Rheb의기능을억제시키는역할을하는데, Rheb 는 mtorc1과 mtorc2의활성을촉진시킴으로서세포분열을유발한다. 최근연구결과에따르면, PC1의기능상실로인해서 hepatocyte growth factor (HGF) 의수용체인 c-met 의 ubiquitinational degradation 이제대로일어나지않음으로서 mtor pathway 가지나치게활성화된다는사실이알려지게되었다 [4]. 3. Wnt/β-catenin signaling Wnt signaling 은 β-catenin 이연관되어있는 canonical pathway 와그렇지않은 noncanonical pathway 로나뉜다. PKD에서는 canonical pathway 가상당히활성화되어있어, 전사인자인 active β-catenin 의 target gene (e.g. c-myc, cyclind1) 들의발현이증가되어있다. 한편 noncanonical pathway 는 planar cell polarity (PCP) 와 intracellular calcium 조절에관련되어있으며, 이 pathway의 dysregulation 은비정상적인세포증식과 epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) 의원인이되기도한다. - 5 -
제 3 장연구개발수행내용및결과 다낭신동물모델을이용하여신장상피세포결함및낭포형성 메커니즘규명 1. Mxi1 KO 마우스의신장에서 primary cilia 와연관성이깊은유전자및단백질의발현 screening 및후보유전자선별 가. Cilia assembly에관여하는유전자발현검증및후보유전자선별본연구진은이미선행연구를통해다낭신동물모델인 Mxi1 KO 마우스의신장에서상피세포의 cilia 결함이있는것을확인한바있음. 이를바탕으로하여본연구에서는전사인자인 Mxi1이 cilia의결함을통해낭포형성이관여할것이라는가설을세우고 Mxi1 유전자의결함으로부터유도되는 cilia 결함메커니즘을밝히고자하였음. 우선 Mxi1 KO 마우스의신장에서분리한 mrna와 Mxi1 KO MEFs에서 cilia assembly 에관여하는대표적인유전자인 Ift20, Ift88, Kif3a의발현레벨을 qpcr로검증하였음 ( 그림 1). 그림 1. Cilia assembly 에관여하는유전자들의발현패턴비교 (A) Mxi1 KO 마우스의신장조직에서 Ift20, Ift88, Kif3a 유전자들의발현비교 (B) Mxi1 KO MEFs 에서 Ift20, Ift88, Kif3a 유전자들의발현비교 그결과, Mxi1 KO 마우스의신장조직과 Mxi1 KO MEFs 에서 Ift20, Ift88, Kif3a 의발현이 - 6 -
각각의 controls 에비해모두감소한것을확인하였음. 이를통해본연구진은 Mxi1 유전자 의결함이 cilia assembly 와관련된유전자들의발현의감소를유도하여 cilia 결함을유도할 것이라는가능성을제시할수있었음. 본연구진은 cilia assembly 에관여하는유전자들의발현뿐만아니라 cilia 의 membrane 에 존재한다고알려진 ciliary protein 인 PC2 의발현을 Mxi1 KO 마우스의신장조직에서관찰 하였음 ( 그림 2). 그림 2. Mxi1 KO 마우스의신장조직에서 PC2 발현레벨검증 (A) qpcr을이용한 PC2의 mrna 발현검증 (B) PC2 단백질발현검증 (C) PC2 단백질발현위치및레벨검증 그결과, Mxi1 KO mouse 의 kidney 조직에서 PC2의 mrna의발현과 protein 발현이 wild-type 마우스의신장조직에비해유의미한수치로증가한것을확인하였음. 또한만성신장병동물모델인 Mxi1 KO 마우스의신장조직에서생긴낭포의 cyst lining cells 주변으로 PC2 단백질의발현이증가한것을관찰하였음. 본연구진은 Mxi1에의해조절되는 PC2 단백질의 localization 에변화가있는지를확인하고자 Mxi1 KO MEFs에서 PC2의 localization 을검증하였음 ( 그림 3). Mxi1 WT MEFs의경우, 정상적인 cilia 에 PC2가위치하는것을확인하였고 merge 시켰을때 cilia 와 PC2가 co-localization 함을확인하였지만 Mxi1 KO MEFs의경우, PC2가 cilia 에위치하지않고있음을확인하였음. - 7 -
그림 3. Mxi1 KO MEFs 에서 PC2 localization 관찰 Mxi1 KO mouse 의 kidney 조직과 Mxi1 KO MEFs에서감소한 IFT family 유전자들중에서본연구진은 mrna 발현레벨이가장낮은 IFT20 을후보유전자로선정하고전사인자인 Mxi1에의해 IFT20 의발현레벨이조절되는지를확인하기위해 mimcd-3(mouse inner medullary collecting duct cells) 을이용하였음. mimcd-3 에 Mxi1 유전자가 stably overexpressed 되어있는 mimcd-3/mxi1 cell lines 과 Mxi1 유전자를 transiently overexpressed 시킨 mimcd-3/tf cell lines, mimcd-3 에 Mxi1 유전자의레벨이 transiently knockdown 되어있는 mimcd-3/sirna cell lines 을구축한후, 각 cell lines 에서 IFT20 유전자의발현패턴을 real-time PCR을통해검증하였음 ( 그림 4, A). 그림 4. Mxi1 유전자발현에따른 Ift20 유전자발현조절검증 (A) mimcd-3 세포를이용한 Ift20 mrna 발현검증 (B) Luciferase assay 를이용한 Ift20 promoter activity 측정 qpcr 결과, Mxi1 유전자가과발현되어있는 mimcd-3 cell lines(mimcd-3/mxi1, mimcd-3/tf) 에서 Ift20 유전자의발현이증가한것을확인하였고, 반대로 Mxi1 유전자를 - 8 -
knockdown 시킨 cell lines(mimcd/si) 에서는 Ift20 유전자의발현이감소한것을확인함. 이를통해본연구진은 Ift20 유전자가 Mxi1 발현레벨에따라조절되고있다는것을증명하였음. Mxi1은전사인자이기때문에, 본연구진은 Mxi1에의해 Ift20의 promoter activity 가조절되는지를 luciferase system 을통하여확인하였음 ( 그림 4, B). Ift20 promoter 0.5kb 와 1.0kb region 에서 promoter activity 가 Mxi1 유전자의발현정도에따라조절됨을확인하였고이를통해본연구자는전사인자인 Mxi1이 Ift20의 transcriptional regulation 에 critical factor 로작용할수있다는것을증명하였음. Mxi1 에의해조절되는 Ift20 promoter activity 가 0.5kb 에서 activity 가가장높게나온것을바탕 으로하여 0.5kb region 이 Mxi1 이관여하는 critical region 임을밝히기위해 deletion construct 를 제작하여 luciferase assay 를수행하였음 ( 그림 5). 그림 5. Mxi1이관여하는 IFT20 prmoter region 검증 (A) Mxi1 과발현시킨 mimcd-3(mxi1-tf) 와 empty vector transfection 한 mimcd-3(mock) 에서 Mxi1 mrna 발현비교 (B) Deletion construct 를이용한 IFT20 promoter region 의 luciferase assay 1.0kb region 중에서 +1~-0.5kb region 을 deletion 시킨 construct 를추가로제작하여 luciferase assay 수행한결과, deletion construct 에서는 Mxi1에의해서 luciferase activity 가변하지않은것을확인함. 이를통해, 본연구진은 IFT20 promoter 상에서 Mxi1이관여하는 region 이 0.5kb 임을검증하였음. 본연구진은 Mxi1 단백질이 Ift20 promoter activity 를조절한다는사실을 luciferase assay 를통해검증한후, 실제로 Mxi1 이 Ift20 단백질레벨조절에도관여할수있는지를밝히기 위해 western blot 을통해이를검증하였음 ( 그림 6). - 9 -
그림 6. Mxi1 발현에따른 IFT20 단백질발현차이검증 mimcd-3에 Mxi1-siRNA 를처리한후 Ift20 발현을비교해본결과, Mxi1 감소로인해 Ift20 발현또한감소함을관찰했음. 또한 mimcd-3에 Mxi1을과발현시켰을때에도 Ift20 발현이 control 에비해증가함을확인했음. 이를통해 Ift20 promoter activity 조절에관여하는전사인자인 Mxi1이 Ift20 단백질조절에도영향을미칠수있음을증명하였음. 이를통해본연구진은 Mxi1 유전자를통한신장상피세포의 cilia결함메커니즘을밝히는데 Ift20 유전자를후보유전자로선택하고실험을진행하였음. 나. Mxi1 유전자감소로인한신장상피세포의 cilia 표현형변화관찰 본연구진은 Mxi1에의해 Ift20 발현레벨이조절되는것을확인하였기때문에 Mxi1 유전자에의해신장상피세포의 cilia 표현형을관찰하고자하였음. 첫시도에서는기존세포유지용조건으로배지에 10% FBS를첨가하여세포배양을한후, Control sirna가 transfection 된 mimcd-3와 Mxi1 sirna가 transfection 된 mimcd-3에서 cilia marker 인 acetylated-a-tubulin 으로염색된부분을관찰하였음 ( 그림 7). Fig 7. mimcd-3 cell lines 에서 Mxi1 유전자발현이 cilia formation 에미치는영향 그결과, Mxi1 sirna 가 transfection 된 mimcd-3 에서 acetylated a-tubulin 으로염색된부 - 10 -
분이 control과는다르게조금짧아진것을확인하였고 acetylated a-tubulin으로염색된부분이감소한것을확인하였음. 본연구진은 in vitro 상에서정상적인 ciliogenesis 를유도하기위해기존에사용하던 10% FBS가추가된배지를사용하지않고 serum deprivation-induced growth arrest 혹은 confluency-induced cilioary formation 조건을이용하여 MEFs와 mimcd-3에서 Mxi1에의한 ciliogenesis 변화를재검증하였음 ( 그림 8). 그림 8. Mxi1 유전자가 MEFs의 ciliogenesis 에미치는영향검증 (A) Mxi1+/+, Mxi1-/-, Mxi1-/- - Mxi1 TF 시킨 MEFs에서 cilia 표현형관찰 (B) Mxi1+/+, Mxi1-/-, Mxi1-/- - Mxi1 TF 시킨 MEFs에서 ciliogenesis 변화를 cilia per cell nuclei' 로정량화한그래프 (C) Mxi1+/+, Mxi1-/-, Mxi1-/- - Mxi1 TF 시킨 MEFs에서 p-erk 발현레벨검증 Mxi1+/+ MEFs의경우 Mxi1-/- MEFs에비해 cilia를가지고있는세포의수가더많았고 cilia per cell nuclei 로수치화해본결과유의미한수치로변화가있음을확인하였음. Mxi1 유전자의 deletion 으로인해 ciliogenesis 가감소한 Mxi1-/- MEFs에 Mxi1 유전자를과발현시킨후, ciliogenesis 의변화를관찰한결과, Mxi1의과발현에의해 cilia를가지고있는세포의수가증가한것을관찰하였음. 또한 Mxi1-/- MEFs에서 p-erk 발현이 control 보다증가되어있는것을확인하였고 Mxi1의과발현에의해증가되어있든 p-erk 가다시감소하는것을검증하였음. mimcd-3 에 Mxi1 의발현을감소시킨후 confluency-induced ciliary formation 조건을이 용하여 ciliogenesis 를유도하고변화를재검증한결과 Mxi1 유전자의발현감소가 - 11 -
mimcd-3 의 ciliogenesis 의감소를유도함을증명하였음 ( 그림 9). 그림 9. Mxi1 유전자의발현에의한 mimcd3의 ciliogenesis 조절 (A) mimcd3에 Con-siRNA 와 Mxi1-siRNA 처리한후 cilia 표현형관찰 (B) mimcd3에 Con-siRNA 와 Mxi1-siRNA 처리한후 ciliogenesis 변화를 cilia per cell nuclei' 로정량화한그래프 (C) mimcd3에 Con-siRNA 와 Mxi1-siRNA 처리한후 p-erk 발현변화관찰 또한 Mxi1 으로유도된 cilia defect 에의해서 MAPK pathway 가유의미한수치로증가함을 protein level 에서확인하였음 ( 그림 9). 다. Mxi1 유전자에의한 Ift20 발현조절기작규명 Mxi1 에의해 Ift20 의발현이조절되고 cilia 표현형에영향을미칠수있다는결과들을뒷받침으 로하여, 본연구진은 Mxi1 이 Ift20 유전자의 promoter region 에직접적으로 binding 할수있는가 능성에대해검증하고자하였음. - 12 -
그림 10. 일반 program 을통한 Ift20 promoter 에 binding 하는전사인자의 1 차적 screening 연구에앞서 Ift20 promoter region 에 binding 할수있는 transcription factor 들을 1 차적으로일반 program 을통해 screening 해본결과다양한전사인자들이 Ift20 promoter region 1kb 안에서 binding 할수있다는가능성을확인하였음 ( 그림 10). 하지만그림 10 에서사용한 program 은신뢰성이부족한 tool 이었기때문에본연구진은 TRANSFAC 이라는전문적인 program 을이용하여 Ift20 promoter 에 binding 할수있는전사인자 에대해재검증하였음 ( 그림 11). 그림 11. TRANSFAC program 을이용한 Ift20 0.5kb promoter 분석 분석결과, Mxi1은 Ift20 promoter 에직접적으로 binding할가능성이낮음을확인하였고 Mxi1의 Ift20 promoter 조절은간접적으로이루어질수있음을예상하였음. 이를검증하기위해 core match와 matrix match가 0.98이상인전사인자만선별하여 Ift20 promoter 에직접결합하는전사인자와 Mxi1의관련성을밝히고자하였음. 우선, 선별된전사인자가 Ift20 promoter region 에 binding할수있는가능성을검증하기위해 EMSA를수행하였음 ( 그림 12). Probe 1은 kid3와 pax4, probe 3은 Sp1, probe 5는 Ets-1, probe 7과 probe 10은 kid3의 binding site를포함한 probe 를이용하여실험한결과임. - 13 -
그림 12. Ift20 promoter 에 binding 할가능성이있는전사인사를 EMSA 를통해선별 EMSA 수행결과, Sp1 과 Ets-1 의 binding site 를포함한 probe 에서 protein 과 DNA interaction 가능성을확인하였고 protein-dna complex 에존재하는 protein 이 Sp1 과 Ets-1 임 을증명하기위해 supershift assay 를수행했음 ( 그림 13). 그림 13. Sp1 과 Ets-1 의 IFT20 promoter 에 binding 할수있는가능성검증 그결과, Sp1 binding site 를포함하는 probe 의경우 Sp1 의 binding sequence 가 protein-dna complex 를이루는데중요함을 mutant(mt) probe 로확인하였음. 또한 Sp1-14 -
antibody 를 nuclear extract 과 incubation 한후, prope 와반응시킨결과 main band의 density 가 control(igg) 에비해약간감소함을확인하였음. Ets-1 binding site를포함하는 probe 의경우또한 mutant(mt) probe 를이용하여실험한결과 protein-dna complex 를이루는데 Ets-1 binding sequence 가중요함을확인하였음. 또한 Ets-1 antibody 로 supershift 혹은 band density 변화를유도한결과 control(igg) 에비해 band density 가감소함을확인하였음. 이를통해본연구진은 Ift20 promoter 0.5kb 에서 Ets-1이 binding할가능성이높아졌음을본실험을통해검증할수있었음. Ets-1 이 IFT20 promoter 에직접 binding 한다면 Ift20 유전자의발현에영향을미칠가능성 이크기때문에본연구진은 mimcd-3 에 Ets-1 의발현을감소시킨후, Ift20 발현에변화가 있는지 mrna 와 protein level 에서확인했음 ( 그림 14). 그림 14. Ets-1 유전자에의한 Ift20 유전자의발현조절확인 (A) mimcd-3에 Con-siRNA 와 Ets-1-siRNA 처리한후 Ets-1과 Ift20의 mrna level 비교 (B) mimcd3에 Con-siRNA 와 Ets-1-siRNA 처리한후 Ets-1 단백질발현비교 그결과, Ets-1 발현이감소한 mimcd-3 에서 Ift20 유전자의발현과단백질발현이줄어든 것을검증했음. 이를통해 Ift20 promoter 에영향을미치는 Ets-1 이 Ift20 발현조절에도관여 할수있음을확인하였음. Ets-1 이 Ift20 promoter 에 binding 하여 Ift20 발현을조절한다면 Ets-1 의발현에의해 Ift20 promoter activity 가영향을받을것으로예상하고본연구진은 luciferase assay 를진행하였 음 ( 그림 15). - 15 -
그림 15. Ets-1 유전자의발현레벨에따른 Ift20 prmoter activity 변화관찰 (A) empty vector 를 transfection 시킨 mimcd-3와 Ets-1 expression vector 를 transfection 시킨 mimcd3에서 Ets-1 mrna 발현확인 (B) mimcd-3와 mimcd-3-ets1 TF 세포에서 Ift20 promoter activity 측정 그결과, Ets-1을 transfection 시킨 mimcd-3에서 empty vector 를 transfection 시킨 control mimcd-3에비해 promoter activity 가증가한것을확인함. 이를통해 Ift20 promoter 에 binding하는 Ets-1이 Ift20 promoter activity 및발현조절에영향을미친다는것을검증하였음. 본연구진은 Ift20 유전자의 promoter 조절이 Ets-1 단백질에의해특이적으로조절될수 있는지를검증하기위해 site-directed mutagenesis 를이용하여 Ift20 promoter 에존재하는 Ets-1 binding site 를 mutation 시킨후 luciferase assay 실험을수행하였음 ( 그림 16). 그림 16. Ets-1 binding site 의 mutation 유무에따른 Ift20 promoter activity 변화 그결과, 정상적인 Ift20 promoter(wt0.5kb) 를 transfection 시킨 mimcd-3 에서는 Ets-1 을 - 16 -
과발현시켰을때 Ift20 promoter activity 가증가하는것을관찰하였지만, Ets-1 binding site 가 mutation 된 promoter(mt0.5kb) 를 transfection 시킨 mimcd-3 에서는 Ets-1 의과발현에도 불구하고 promoter activity 에변화가없는것을확인하였음. 본연구진은 Ift20 promoter 에 binding하여그발현을조절하는 Ets-1과 Mxi1의연관성을밝히기위해어떤전사인자가상위 regulator 인지밝히고자하였음. 우선 Ets-1이 Mxi1 단백질의 downstream target 이될수있는지를검증하기위해 western blot을수행하였음 ( 그림 17). 그림 17. Mxi1 과발현에의한 Ets-1 발현레벨검증및 Ets-1 과발현및감소를통한 Mxi1 발현레벨검증 그결과, Mxi1 단백질을과발현시킨 mimcd-3에서 Ets-1의발현이증가하는것을확인하였음. 이를통해, Mxi1 단백질이 Ets-1 단백질의발현을조절하여 Ift20 발현에영향을미칠수있는가능성을제시할수있음. 추가실험으로 Ets-1 단백질이 Mxi1 단백질의 upstream regulator 가될수있는지검증하기위해 western blot을수행하였음 ( 그림 17). 그결과, Mxi1 과발현에의해발현이증가되던 Ets-1과는다르게, Ets-1을과발현시켰을때에는 Mxi1 단백질발현에변화가없는것을관찰하였음. 또한 Ets-1 단백질레벨을 sirna를이용하여감소시켰을때에도 Mxi1 단백질발현에영향이없는것을확인하였음. 이를통해, Mxi1 단백질이 Ets-1 단백질의 upstream regulator 임을증명하였음. 이결과들을종합한결과 ( 그림 18), Mxi1 유전자의 inactivation 을통해이루어지는 cilia disassembly 는 Ift20 promoter 에 binding하는 Ets-1 단백질의발현을조절함으로써이루어지는것을확인하였음. 이렇게유도된 cilia disassembly 는신장상피세포에서 p-erk 의 activation 을유도하여세포증식을증가시켜신장낭포형성에관여한다는것을이번연구를통해규명하였음. - 17 -
그림 18. Mxi1 유전자의 inactivation 을통해이루어지는 cilia disassembly 기작및낭종 형성메커니즘에대한 diagram 2. Mxi1 유전자에의해조절되는 EMT(Epithelial-mesenchymal transition) 과정연구 본연구진은이미선행연구를통해 Mxi1 유전자의과발현이 renal tubulogenesis 에억제하고 EMT와관련된유전자들중하나인 MMP9(Matrix metalloproteinase 9) 의발현이감소되어있는것을확인하였음. Tubulogenesis 의조절은신장이정상기능을수행하는데중요한과정중하나이며, EMT와관련된유전자들의발현패턴이무엇보다중요함. 따라서본연구진은이번연구를통해 Mxi1 유전자발현레벨에의해 MMP9 발현레벨이조절되는지를확인하였음 ( 그림 19). 그림 19. Mxi1 유전자가 MMP9 발현에미치는영향 (A) RT-PCR 을이용해서 mimcd-3/mxi1 cell lines 에서 MMP9 발현검증 (B) qpcr 을이용해서 mimcd-3/mxi1 cell lines 에 Mxi1 sirna 를 transfection 한후 MMP9 발현검증 (C) western blotting 을이용해서 mimcd-3/mxi1 cell lines 에 Mxi1 sirna 를 treat 한후 MMP9-18 -
발현검증 mimcd-3 에 Mxi1 유전자가 stably overexpressed 되어있는 cell lines 인 mimcd/mxi1 에서 MMP9 의발현이감소되어있는것을확인하였고, 동일한 cell lines 에 Mxi1 sirna 를 transfection 하여 Mxi1 발현을감소시켰을때 MMP9 의발현이증가하는것을확인하였음. 본연구진은 MMP9 유전자에의해 mimcd-3 의 tubulogenesis 가조절되는지를 3D culture 를이 용하여관찰하였음 ( 그림 20). 그림 20. MMP9 유전자의발현이 mimcd-3 의 tubulogenesis 에미치는영향 그결과, mimcd-3 는 normal condition 에서정상적인 EMT 과정이진행되어 tubulogenesis 가일 어나는것을관찰하였지만, MMP9 이감소된 mimcd-3 에서는정상적인 tubulogenesis 과정이일 어나지않는것을확인하였음. Mxi1 유전자에의해조절된 MMP9 유전자가 renal tubulogensis 에영향을미친다는사실을검증한후, 본연구진은 tubulogenesis 와관련된 signaling molecule 들의발현패턴을확인하였음 ( 그림 21). 그결과, mimcd-3/mxi1 cell lines 에 MMP9을과발현시켰을때, tubulogenesis 에관여하는 pathway molecule 인 p-erk, p-jnk protein level 이증가한것을확인하였음. 또한 mimcd-3/mxi1 cell lines 에 Mxi1 유전자를감소시켰을때 MMP9 단백질이증가하고 tubulogenesis 에관여하는 pathway molecule 들의발현이증가하는것을확인하였음. 이결과들을바탕으로하여본연구진은 Mxi1 유전자에의해 EMT과정에관여하는 MMP9 발현레벨이조절됨으로서 renal tubulogenesis 에영향을미친다는사실을증명하였음. - 19 -
그림 21. tubulogenesis 와관련된 signaling molecules 의발현패턴분석 (A) mimcd-3/mxi1 에 MMP9을과발현시킨후 tubulogenesis 와관련된 molecule 들의발현레벨검증 (B) mimcd-3/mxi1 에 Mxi1을감소시킨후 tubulogenesis 와관련된 molecule 들의발현레벨검증 3. PKD2 Tg 를활용한내피세포관련 molecules 변화관찰 본연구진은 human PKD2 유전자를과발현시킨동물모델을이용하여, 낭포형성에있어서혈관내피세포의영향을파악하기위해 HIF-1α 유전자의발현레벨을확인하였음 ( 그림 22). HIF(hypoxia-inducible transcription factor) 유전자는산소부족상태 (hypoxia) 를인식하여그발현이증가하며, 이를통해 angiogenesis 가촉진됨. 그림 22. PKD2 Tg 신장조직에서분리한단백질로 western blotting 수행한결과 그결과, 대조군에비해 PKD2 Tg 에서 HIF-1a 의발현이증가되어있는것을관찰하였음 ( 그림 22). - 20 -
HIF-1α western blotting 결과를통하여본연구진은 PKD2 Tg 마우스의신장조직에서내 피세포항상성유지에관여하는 angiogenesis 와관련된유전자들의발현에변화가있을것으 로예측하고 qpcr 을통하여발현레벨을검증하였음 ( 그림 23). 그림 23. PKD2 Tg 신장조직에서 VEGFR1, VEGFR2 유전자발현레벨검증 그결과, 생후 18개월된대조군마우스와 PKD2 Tg 마우스에서 angiognesis 와관련된유전자은 VEGFR1과 VEGFR2의발현레벨을비교해본결과 PKD2 Tg 마우스의신장에서그발현이유의미한수치로증가되어있는것을확인하였음. 이를통하여다낭신마우스모델인 PKD2 Tg에서관찰되는낭포형성에내피세포의결함이관여할수도있는가능성을제시할수있었음. Ift46 KO 마우스구축및신장상피세포에서의 Ift46 기능연구 1. Ift46 KO 마우스확보및유지를위한 mouse Ift46 항체제작 현재판매되고있는항체중 mouse Ift46 특이적인항체가존재하지않아본연구를통해 mouse Ift46 특이적인항체를제작하였음. GST-tagging 된 pgex vector type 중 pgex 4T-3 vector 에 mouse Ift46 insert 를 cloning 하여항체제작을하였음 ( 그림 24). - 21 -
그림 24. mouse Ift46 항체제작을위한 GST protein cloning construct 이 construct 를 BL21에 transformation 하여 stock 으로만든후, transformation 된 BL21cell 을 IPTG를이용해 protein expression 을유도하였음. 이때, cell culture O.D값은 0.7~1.0 으로맞추었고, IPTG 농도는최소 1mM~ 많게는 2mM, 28 5시간처리하였음. IPTG induction 시킨 cell 을 collecting 하여 sonication 을통해 bacteria cell 을 lysis시켜 GST purification kit를이용해 protein purification 을하였음 ( 그림 25). 그결과, IPTG를처리하지않은 control 에비해 induction 이잘된것을확인하였음. 그림 25. GST pull down mift46 항체생성을위한 mouse IFT46 단백질확보를위해 GST tagging vector 외에 his-tagging vector 인 pet-28a vector 에 IFT46 CDS cloning 을하였음 ( 그림 26). 그림 26. His-tagging vector 에 mouse IFT46 CDS cloning - 22 -
이렇게본연구진으로부터제작된 mouse Ift46 항체를 western blot을통해검증한결과, Ift46 발현이감소되어있는 mimcd-3와마우스신장조직에서 Ift46 발현이감소된것을본연구진이제작한항체로 detection 하였음 ( 그림 27). 이를통해이번연구를통해제작된 mouse Ift46 항체가성공적으로 working 함을검증하였음. 그림 27. 제작된 mouse Ift46 monoclonal 항체검증 2. Ift46 KO 마우스구축및표현형검증 Ift46 KO mouse 의 targeting vector map 은다음과같이제작됨 ( 그림 28). Ift46 유전자가 targeting 된 mouse 를관찰해본결과, 산자로 Ift46 KO mouse 를얻을수없었기때문에 embryonic lethal 임을검증하였음. 그림 28. Ift46 targeting vector map - 23 -
태어난 Ift46 hetero mouse의 kidney 와 normal B6 mouse의 kidney 에서 Ift46 발현을비교해본결과 Ift46 hetero kidney 에서발현이감소한것을확인하였음 ( 그림 29, A). 또한 IFT46 knockout(ko) embryo 의 lethal 시기를규명하고 lethal 원인을찾기위해 embryonic stage에서 embryo 를분리하고 yolk sac을이용하여 genotyping 수행하였음 ( 그림 29, B). 본연구진은우선 E13.5 의 embryo 를분리하여 yolk sac에서 gdna를분리한후 genotyping 한결과모두 WT 혹은 HT임을검증하였음. 따라서본연구진은 IFT46 KO embryo 의 lethal 시기는 E13.5 전임을예상하고더이른시기의 embryo 를분리하였음 ( 그림 30).. 그림 29. Ift46 hetero kidney 의 Ift46 발현비교및 Ift46 konckout embryo lethal 시기검증 (A) normal B6 kidney와 Ift46 hetero kidney에서 Ift46 mrna 발현비교 (B) Ift46 hetero 끼리 mating 시킨후 E13.5 에 Ift46 KO genotyping 을가진 embryo 가있는지확인 그림 30. E11.5 의 wild type embryo 와 Ift46 hetero embryo, E9.5 의 wild type embryo 와 Ift46 hetero embryo 표현형관찰 E11.5 와 E9.5 의 embryo 를분리하여 genotyping 한결과 Ift46 KO embryo 는없었고 wild type 과 hetero embryo 만얻을수있었음. 또한그표현형을현미경을통해관찰한결과, wild - 24 -
type embryo 와 hetero embryo 의표현형에특별한차이점이없었음. Ift46 KO embryo 의 lethal 시기가초기에일어나는것을확인한뒤, Ift46 hetero 마우스의 신장표현형을관찰해보았음 ( 그림 31). 그림 31. Ift46 hetero 마우스의신장표현형관찰 (A) 9개월된 wild type 마우스의신장과 9개월된 Ift46 hetero 마우스의신장에서 Ift46 단백질발현비교 (B) 9개월된 wild type 마우스의신장과 9개월된 Ift46 hetero 마우스의신장표현형비교 그결과, 9 개월된 Ift46 hetero 마우스의신장에서 Ift46 단백질의발현이 wild type 신장에 비해감소했지만신장의표현형에는큰차이가없는것을확인하였음. 3. 신장상피세포에서의 Ift46 유전자기능연구 Ift46 KO embryo 의 lethal 시기가실험할수있는최소시기를넘기지못하고 Ift46 hetero kidney 에서도특별한표현형이없는것으로판단하여 Ift46 유전자가신장상피세포에서어떤기능을하고있는지검증하고자 in vitro 실험위주로진행하였음. Ift46은 cilia 형성에관여하는 IFT family중 cilia elongation 에관여하는 complex B에속하는단백질이기때문에 Ift46 유전자의발현을감소시켰을때 cilia defects 가일어날것으로예상하고실험을진행하였음. 신장상피세포에 Ift46 sirna를 transfection 하여 cilia의 marker 인 acetylated alpha tubulin으로염색한후 (FITC, green) 현미경으로관찰하였음 ( 그림 32). - 25 -
그림 32. Ift46 유전자의감소로인한 ciliogenesis 변화관찰 (A) Control sirna가 transfection 된 mimcd-3와 Ift46 sirna가 transfection 된 mimcd-3에서의 Ift46 mrna발현비교 (B) Control sirna가 transfection 된 mimcd-3와 Ift46 sirna가 transfection 된 mimcd-3에서의 ciliogenesis 표현형비교 (C) Control sirna가 transfection 된 mimcd-3와 Ift46 sirna가 transfection 된 mimcd-3에서의 ciliated cells 수치비교 그결과, Ift46 발현이감소되었을때, FITC 형광으로염색된 cilia가 control 과비교해봤을때큰변화가없음을확인하였고실제로 cilia를가지고있는세포 (ciliated cells) 를수치화하여관찰한결과큰차이가없는것을확인하였음. 이를통해 Ift46 유전자는신장상피세포의 ciliogenesis 과정에는큰영향을미치지않는것으로판단하였음. 본연구진은 Ift46 유전자의감소가신장상피세포의 cilia 형성에는영향을미치지않지만 cilia 길이를조절하는데역할을수행할수있을것이라예상하고 Scanning electron microscope (SEM) 을통해 cilia 길이를관찰하였음 ( 그림 33). - 26 -
그림 33. Ift46 유전자의감소로인한 ciliogenesis 변화관찰 (A) Control sirna가 transfection 된 mimcd-3와 Ift46 sirna가 transfection 된 mimcd-3에서의 Ift46 mrna발현비교 (B) Control sirna가 transfection 된 mimcd-3와 Ift46 sirna가 transfection 된 mimcd-3에서의 cilia 길이표현형비교 (C) Control sirna가 transfection 된 mimcd-3와 Ift46 sirna가 transfection 된 mimcd-3에서의 cilia 길이비교 그결과, Ift46 발현을감소시켰을때신장상피세포의 cilia 길이가줄어든것을확인하였 고이길이를직접측정하여통계처리한결과유의미한수치로 Ift46 발현이줄어든신장상 피세포에서 cilia 길이가줄어든것을확인하였음. 이미 publish된논문에의하면 Ift46은같은 IFT complex B에속하는 member 들과 interaction 하는것으로알려져있음. 이를바탕으로하여 Ift46 발현의감소가서로 interaction 하는다른 Ift member 들의 mrna 발현을조절할수있는지에대한여부를판단하기위해 real-time PCR을수행하였음 ( 그림 34). - 27 -
그림 34. Ift46 발현이감소된신장상피세포에서 Ift46, Ift20, Ift52, Ift88 mrna 발현검증 그결과, Ift46 의발현감소는서로 interaction 하는 Ift20, Ift52, Ift88 의 mrna 발현을조절 하지않는것으로판단하였음. Ift46 발현감소로인해 cilia 의길이가줄어든신장상피세포에서 cell cycle 과관련된 regulator 들과 MAPK pathway 의발현에변화가있는지검증하기위해 western blot 을수행 하였음 ( 그림 35). - 28 -
그림 35. Ift46 발현감소가 cell cycle 과관련된단백질들발현조절에미치는영향검증 그결과, Ift46 발현을감소시킨신장상피세포에서 CDK6, cyclin D3, p27, p15 의발현은 control 신장상피세포와비교해봤을때큰차이가없었음. 하지만 cyclin D1은 Ift46을감소시킨신장상피세포에서증가한것을확인하였고이를통해 Ift46이특이적으로 cyclin D1의발현조절에관여한다는것을규명하였음. 또한 Ift46 발현이감소된신장상피세포에서 p-mek 와 p-erk 의레벨이모두증가한것을확인하였음. 이를통해 Ift46 유전자가 MAPK pathway 조절에관여한다는것을증명할수있었고세포증식에관여할수있는가능성을제시할수있었음. Ift46 발현이감소된신장상피세포에서세포증식기작에관여하는 pmek, perk 발현이 증가된결과를바탕으로, 본연구진은 Ift46 유전자의감소가세포증식과관련되어있는지를 판단하기위해 XTT assay 를통해 cell viability 를측정하였음 ( 그림 36). 그림 36. Ift46 발현감소가신장상피세포의세포증식에미치는영향검증 (A) Control sirna가 transfection 된 mimcd-3와 Ift46 sirna가 transfection 된 mimcd-3에서의 Ift46 mrna발현비교 (B) Control sirna가 transfection 된 mimcd-3와 Ift46 sirna가 transfection 된 mimcd-3에서 XTT assay를통해 cell viability 측정 그결과, Ift46 발현이감소된신장상피세포가 control 에비해세포증식의속도가빨라지 는것을관찰하였음. 이를통해, Ift46 발현의감소가 pmek, perk pathway 를통해세포증 식조절에관여한다는사실을검증하였음. - Ift46 발현감소로인해신장상피세포의 proliferation 이증가한다는결과를바탕으로, 본 연구진은 Ift46 발현감소가신장상피세포의낭포형성유도에도관여할수있는지를검증하 - 29 -
고자 3D culture 를수행하였음 ( 그림 37). 3D culture 실험을수행하기위해서는기존사용하 던신장상피세포인 mimcd-3 는부적합하기때문에이번실험에서는또다른신장상피세 포인 MDCK 세포를사용하였음. 그림 37. Ift46 발현의감소가낭포형성에미치는영향검증 (A) Control sirna가 transfection 된 MDCK와 Ift46 sirna가 transfection 된 MDCK에서낭포형성표현형비교 (B) Control sirna가 transfection 된 MDCK와 Ift46 sirna가 transfection 된 MDCK에서낭포면적비교 그결과, Ift46 sirna를 transfection 시킨신장상피에서 control sirna를 transfection 시킨세포보다큰 cyst를가진세포를많이관찰할수있었음. 또한낭포면적을직접계산한결과 Ift46 sirna가 transfection 된신장상피세포가낭포면적이더큰것을검증하였음. 이를통해 Ift46 발현감소가 pmer, perk를통해 proliferation 을증가시켜낭포형성이관여할수있다는가능성을증명할수있었음. Pkd1 conditional knockout 마우스와 Pkd2 conditional knockout 마우스구축및표현형분석 - 30 -
본연구진은다낭신발병에가장중요한유전자인 Pkd1 과 Pkd2 유전자가 targeting 된 conditional knockout 마우스를구축하고 renal collecting duct specific Cre 마우스인 HoxB7-Cre 마우스와교배하여표현형을분석하였음 ( 그림 38). 그림 38. Pkd1 conditional KO 마우스와 Pkd2 conditional KO 마우스표현형분석 (A) 생후 13 일된 Pkd1f/f:HoxB7-Cre 마우스의신장, 비장, 간표현형비교 - 31 -
(B) 생후 15 일된 Pkd2f/f:HoxB7-Cre 마우스의신장, 비장, 간표현형비교 생후 13일된 Pkd1f/f:HoxB7-Cre 에서 growth retardation 을관찰할수있었고신장에 fluid 로가득찬낭종이신장전반적으로형성되어있는것을확인하였음. 생후 15일된 Pkd2f/f:HoxB7-Cre 마우스역시 growth retardation 을보였고신장에서다낭신표현형이관찰되었음. 또한 Pkd1f/f:HoxB7-Cre 마우스와 Pkd2f/f:HoxB7-Cre 마우스에서발견되는비정상적인표현형은신장에서만관찰되었는데이를통해, 본연구진은 HoxB7-Cre 마우스가신장에서만특이적으로기능을수행한다는것을검증하였음. 또한 Pkd1과 Pkd2 유전자의 renal collecting duct specific deletion 이다낭신을유발할수있는강력한 driving force 가될수있다는것을증명하였음. 제 4 장연구개발결과의활용계획 본연구진은다양한다낭신동물모델을활용하여신장상피 / 내피세포의결함으로인한낭포형성메커니즘을규명하였음. Mxi1 KO 마우스의신장상피세포에서관찰되는 cilia 결함이 Ets-1을거친 Ift20 발현조절을통하여일어남을증명하였고이러한비정상적인조절이신장상피세포의과도한세포증식을유도하여낭포형성에관여한다는메커니즘을새롭게규명하였음. 이결과는지금까지규명되어있지않던 Mxi1 유전자의새로운기능을밝혔다는점에서큰의미가있음. 또한낭포형성과정을유전자의전사레벨수준에서부터 - 32 -
functional study까지확장시켜결과를도출한부분은앞으로새로운다낭신치료제개발에있어서후보타겟으로간주될수있을것으로기대됨. 다낭신의발병원인은신장상피세포의증식증가로인해발병하는것이일반적인데본연구를통해신장상피세포의결함으로생긴신장병이라고하더라도내피세포의항상성조절에문제가있는것을간접적으로증명하였음. 이는신장이라고하는장기의고유특징때문에나타나는현상으로생각되며, 신장상피세포와내피세포가긴밀한네트워킹을통해연결되어있음을밝히는결과임. 본연구에서새롭게구축한마우스모델들중 Ift46 KO 마우스의 embryonic lethality는아직까지어떤 research group에서도제시하지않은결과로써 Ift46 유전자가 embryonic development 에관여하는중요한유전자임을알수있음. 또한 Ift46 유전자의기능연구를위해검증된 in vitro system 결과들은 Ift46 유전자가신장상피세포의세포증식에관여한다는새로운기능을규명했다는점에서의미가있으며다낭신발병에원인유전자가될수있는가능성을제시하였고진단마커유전자로써활용될수있을것으로기대됨. 추가로구축한대표적인다낭신모델인 Pkd1f/f:HoxB7-Cre 와 Pkd2f/f:HoxB7-Cre 마우스구축은앞으로다낭신연구에있어서효과적인 material 로이용될수있을것으로간주됨. 이두마우스모델은심각한다낭신표현형을보이기때문에다낭신치료제타겟들을검증하는데사용될수있는효과적인 material 로제시될수있을것으로간주됨. 이번연구로부터검증된결과들을종합해보았을때, 본연구결과들은만성신장병발병메커니즘을밝힘으로써새로운치료제타겟을발굴하는데획기적인토대를마련할것으로기대되며, 바이오마커, 진단용 chip 개발등으로도활용될수있을것으로생각됨. 제 5 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 Primary cilia 와관련된유전자가 targeting 되어있는동물모델 1. Ift20f/f:HoxB7-Cre (Ift20 conditional KO) 마우스모델 Ift20 유전자를 IFT gene family 중 complex B에속하는유전자로써 cilia assembly 에관여하는것으로알려져있음. 실제로이유전자를 constitutive knockout 시킨결과 embryonic lethality가관찰되어 conditional KO 마우스를제작하였음 [5]. HoxB7-Cre 마우스를이용하여 renal collecting duct에서만특이적으로 Ift20 유전자의발현을 knockout 시킨결과신장에서매우심각한다낭신표현형이관찰되었음. Ift20 conditional KO 마우스는신장상피세포를전자현미경을통해관찰해본결과 control 에존재하던 cilia가없어진것을확인할수있었고낭포형성과함께 BUN(blood urea nitrotgen) 이증가하고 Wnt pathway 가증가되어 - 33 -
있는것이관찰되었음. 이를통해신장상피세포에서의 Ift20 유전자결함이낭포형성을유 도하여신기능을저하시킨다는내용의정보를얻을수있음 2. Ift140f/f:HoxB7-Cre (Ift140 conditional KO) 마우스모델 Ift140 유전자는 retrograde transport 에관여하는 IFT complex A에속하는유전자로알려져있음. IFT complex A에속하는대부분의유전자들을 targeting 하여마우스모델을만들었을때 skeletal, craniofacila, nervous system 에결함이있는것이보고되어져있음 [6-8]. Ift140 유전자를 HoxB7-Cre 마우스를이용하여 renal collecting duct에서만특이적으로발현을저하시킨결과심각한다낭신표현형을보였고신기능이저하되어있는것이관찰되었음 [9]. 대부분의 IFT gene targeted 마우스모델에서는 mitotic spindle misorientation 과함께낭포형성이관찰되는데이마우스의경우 mitotic spindle misorientation 은일어나지않는다고보고되었음. 하지만 Ift140 conditional KO 마우스의신장을 time course 별로분리하여다양한유전자들의발현을검증해본결과 proliferation 증가와관련된유전자들이나, Wnt pathway, inflammation, Hh signaling 에관여하는유전자들의발현이유의미한수치로증가되어있는것이관찰되었음. 3. Nek8 knockout 마우스모델 Nek8 유전자는 NIMA (Nek family of serine/threonine kinase) 단백질을 coding 하고있는유전자로 mitosis과정에서 cell cycle entry를조절하는것으로알려져있음 [10]. 최근연구들을보면 Nek8 단백질이 IFT family가아님에도불구하고 renal cilia에존재하고있다는결과가보고되었음. 이를바탕으로하여 Nek8 유전자의기능을규명하고자 Nek8 KO 마우스를제작하였음 [11]. 그결과, Nek8 KO embryo 에서 cardiac defects 가관찰되었고 laterality marker gene이 misexpression 하고있는것이보고되었음. Nek8의경우 cilia에존재하고있지만 Nek8 KO embryo 에 cilia가정상적으로존재하는것으로보아 Nek8이 ciliogenesis 에는큰영향을미치지않는것으로생각됨. 하지만 Nek8 단백질이 PC2의 activity를조절하여신장상피세포의신호전달에관여하는것을검증하였음. 다낭신과신장내피세포의항상성과의관련성 신장상피세포의비정상적인세포증식으로인해발병하는다낭신의경우, 과도한세포증식으로인해낭포주변으로 hypoxia 가일어남. Hypoxia 상태가되면낭포를형성하는세포들이혈액으로부터산소와영양소를공급받기어려워지기때문에주변내피세포의세포증식을유도하는 angiogenesis 과정을일으켜세포증식및유지에필요한영양소를공급받아질병을악화시킴. - 34 -
Han:SPRD rat은다낭신모델중하나로써신장에낭포가형성되어있는것이관찰되었고그 cyst lining cell 에 angiogenesis 와관련성이깊은 HIF1a 단백질발현이증가되어있는것이관찰되었음 [12]. 추가로 Han;SPRD rat의신장에서 VEGFR1과 VEGFR2의단백질발현을확인해본결과, cyst lining cell 에두단백질의발현이 control 에비해증가되어있는것이검증되었음. 이결과를바탕으로 VEGFR1과 VEFR2에대한 ribozyme 을각각동물모델에 injection 한결과신장낭포와 cell proliferation 이줄어드는것이확인되었음. 제 6 장연구시설ㆍ장비현황 해당사항없음. 제 7 장참고문헌 1. Aguiari, G., Catizone, L., and Del Senno, L. (2013). Multidrug therapy for polycystic kidney disease: a review and perspective. American journal of nephrology37,175-182. 2. Dalagiorgou, G., Basdra, E.K., and Papavassiliou, A.G. (2010). Polycystin-1: function as a mechanosensor. The international journal of biochemistry & cell biology42,1610-1613. 3. Qin, S., Taglienti, M., Nauli, S.M., Contrino, L., Takakura, A., Zhou, J., and Kreidberg, J.A. (2010). Failure to ubiquitinate c-met leads to hyperactivation of mtor signaling in a mouse model of autosomal dominant polycystic kidney disease. The Journal of clinical investigation120,3617-3628. 4. Torres, V.E., and Harris, P.C. (2006). Mechanisms of Disease: autosomal dominant and recessive polycystic kidney diseases. Nature clinical practice Nephrology2,40-55;quiz55. 5. Jonassen, J.A., San Agustin, J., Follit, J.A., and Pazour, G.J. (2008). Deletion of IFT20 in the mouse kidney causes misorientation of the mitotic spindle and cystic kidney disease. The Journal of cell biology183,377-384. 6. Tran, P.V., Haycraft, C.J., Besschetnova, T.Y., Turbe-Doan, A., Stottmann, R.W., Herron, B.J., Chesebro, A.L., Qiu, H., Scherz, P.J., Shah, J.V.,etal.(2008).THM1 negatively modulates mouse sonic hedgehog signal transduction and affects retrograde intraflagellar transport in cilia. Naturegenetics 40,403-410. 7. Cortellino, S., Wang, C., Wang, B., Bassi, M.R., Caretti, E., Champeval, D., Calmont, A., Jarnik, M., Burch, J., Zaret, K.S.,etal. (2009).Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the Sonic Hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complexa intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA - 35 -
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9. 뒷면지 주의 1. 이보고서는미래창조과학부에서시행한의학 첨단과학기술융합원천기술개발사업의연구보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표하는때에는반드시미래창조과학부에서시행한의학 첨단과학기술융합원천기술개발사업의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표하거나공개하여서는아니됩니다. - 37 -