대한임상병리사회지 : 제 26 권제 1 호 1994. B 형간염바이러스표면항원양성혈청에서 B 형간염 바이러스의 e 항원및 DNA 측정에관한분석 서울의과학연구소 서울임상병리검사센터 고려병원임상병리과 * 최철석 김은아 홍창식 이경옥 박창봉 * Kèy words : HBsAg, HBeAg, Hybridization with DNA probe, Polymerase chain reaction. 1 서폰 counter 로측정한다. 이방법에의한측정감 B 형간염바이러스 (hepatits B virus;hbv) 는아직도전세계적으로중요한보건학적문제 의하나로남아있다. 특히남부아프리카나동 남아시아지역에서는주민의 50 % 정도가혈 청학적항체양성을나타내고있다 1) 우리나 라도다른선진국의감염양성률 1--2 % 에비 하면약 6% 로서높은감염률을나타내고있 는실정이다 1). B 형간염을진단하기위하여대 체로혈청학적측정법을이용하여질병의진행 과정을예측하고있는데, 이과정에서확진을 하기에는다소문제점이있었던것도사실이 다. 비록 B 형간염바이러스를측정하는데있 어혈청학적 marker 가예민하고편리한방법 도는 HBV DNA 의약 3 X 10 4 에서 3 X 10 5 copy 수에해당하는 1 --10-1 pg 정도까지측정할수 있으나, 그특이성이다소떨어지고있다 6) 그 러나최근유전자 1 개 copy 에해당하는량 (1 fg) 까지도측정할수있는고도의감도와특 이성을지닌, 일명중합효소연쇄반웅 (PCR; polymerase chain reaction) 법이개발되어 HBV 를확진하고, 또치료경과를관찰하는데 보다유용하게되었다. 본저자들은 HBV 표면항원 (HBsAg) 의혈청학적양성을나타낸혈청검체를대상으로하 여혈청학적방법의 HBeAg 측정과, DNA probe 법에의한 DNA 측정및 DNA poymerase 측정을하고이에대한결과를확인하기 이라할지라도이것이항상바이러스의활동성위한수단으로 PCR을이용한 DNA 증폭을시 을의미하는훌륭한지표가되지는못한다 2) 이런관점에서볼때바이러스의 DNA라든가 도하여그결과를분석하였다. DNA 를중합하는 DNA 중합효소 (DNA poly- II. 재료및방법 merase) 를측정하는것이혈중의바이러스존 재를나타내는데보다정확한신뢰성과증거 1. 재료 를줄수있다 2-6) DNA 를측정하기위하여현재이용되고있 1) 대상검체 는방법으로혈청중에존재하는 HBV DNA 를의뢰된임상혈청검체중면역혈청학적방 추출하여 filter paper 나 nylon membrane 에옮법 (radioimmunoassay; RIA) 에서 HBsAg 양성 겨고정한후특이한 :J:-JA probe 로 hybridi- 으로판명된 17 예를선별하여시험대상으로 zation 해서 autora diography 혹은 scintilla tion 하였으며, 이과정에서단지 HBsAb, HBcAb 만 m ω
혈청학적양성을나타낸검체는대상에서제외 하였다. 2) DNA probe hybridization법 DNA probe hybridization 법에의한 HBV DNA 측정은시판 kit(abbott Laboratories, UA) 를이용하였으며 125 1 표지 probe 를 DNA hy bridiza tion 에이용하였다. 3) DN A polymerase 측정 DNA 합성을위한이 igomer deoxynucleotides 는 poly(da). poly(dt) 12-18(Pharmacia, UA) 를 사용하였으며양성대조에사용한 DNA 중합효 소는 T 4 DNA polymerase(pharmacia, UA) 를 사용하였다. 본시험에대상으로한검체 17 예중 9 예만 DNA probe 법에의한 HBV DNA 측정올하였 으며측정방법은 kit 내에동봉된안내서의 지시에따라수행하였다. 즉간단하게서술하 면다음과같다. 우선주실험에들어가기전 에 sepharose column 을수직 rack 에걸고 24 시간정도방치하여 column 내에충전되어있 는 sepharose gel 이완전히충전되도록하였다. 이어, 음성, 양성및검체시험올위해멸균 된 1.5 ml microfuge tube 를준비하고각용기 에 NaCl 완충액 100μl 넣은후음성, 양성대 조액및검체혈청을각각 100μl 씩넣었다. 희석된각반웅용기에바이러스단백올분 해하기위하여 10 μl 단백분해효소 ( proteinase K) 를첨가하여혼합하고간단하게 micro-fuge 한후실온에 1 시간동안방치하였다. 방치후 4) 중합효소연쇄반응의 oligonucleotides 20μ1 NaOH 완충액으로실온에서 30 분간처리 primer 하여바이러스외부단백질올완전히소화시켰 사용된 primer 는 HBV genome 의 core 부분을다. 용기내의용액중에방출된 HBV DNA 에 암호화한유전자 8) 로각각 1763 번과 2032 번위이바이러스 DNA 에특이한 l 젠표지 probe 치에서시작되는유전자, 5' - GCTTTGGGGC 70μl 를각반웅용기에첨가한후 65 0 C 에서 ATGGACATTGACCCGACTATAA-3 과 5- 약 18 시간동안방치하여 hybri-dization 시켰 CTGACTACTAATTCCCTGGATGCTGGGTCT 다. 이어 hybridization 된반웅물을 sepharose -3 의한쌍을외측 primer(primer 1) 로사용 column 으로분리용출하여용출액을감마 하고 270 base pair 를증폭하도록합성하여사 counter 로 10 분동안측정하였다. 용하였다. 또, 이에대한내측 primer (primer 2) 로서 1778 번위치에서시작되는유전자, 5 - GACGAATTCCATTGACCCGTATAAAGA ATT-3 와 2017 번위치에서시작되는유천자, 5 - A TGGG A TCCCTGG A TGCTGGGTCTTC CAAA-3 의한쌍을선정하고 258 base pair 증폭을목표로하였다. 2. 방법 1) HBeAg 측정 시험대상으로한검체 17 예중 9 예만 HBeAg 을통위원소면역분석법 (radioimmunoassay ; RIA) 으로측정하고그측정값에따라 음성, weakly 양성, 양성으로표시하였다. 2) DNA probe 법 3) HBV 의 DN A polymerse 측정 시험검체 100μl 를동량의세포용해완충 액 (25 mm Tris-HCl, ph '7.5, 5 mm dithiothreitol, 50 mm KCI 50 % glycerol, 2.5 % Triton X -100) 으로처리하여세포단백올 파괴하였다. 0.5 ml micro tube 에양성, 음성 대조및검체를표시한후각 tube 에 template -pnmer 용액 [0.5% Triton X-100, 50mM KC 1, 0.5 % BA, 1 μ1 poly(da) -oligo(dt) 12-18J 를 50μl 씩넣었다. 양성대조에 2μl T4 DNA polymerase(new England Biolab, England) 를음성대조에는증류수, 그리고검체 용기에는혈청검체를각각 5μl 씩넣고잘혼 합한후얼음에 15 분간방치하였다. 다음에반 응혼합액 [1M Tris-HCl, ph 7.5, 10 mm DTT, 1.0M MgCb, 50 mm dntp(atp, CTP, - 71-
s εt μ1l ogtp), 5 μ1 3H-TTP(1mci/ml), D.W. 58.5 μij 를 85μe 씩넣고혼합한후 37 0 C 에서 1 시간 동안반웅시킨다음얼음에 10 분간정치하였 다. 반웅검체 100 띠를 glass fiber filter(gff) 에 spot 하고 200 띠의 cold 10 % trichloroacetic acid/ O.lM sod. pyrophosphate(tca -5PP) 를가하 여 polynucleotide 를침전시켰다. 이어 cold 5 % TCA-5PP 용액으로세척하고다시냉알 콜로세척하였다. GFF 를건조한다음 liquid scintillation vial 에넣고 cocktail (PPO 5g, bis - M5P 0.5g, toluene 11 ml) 을넣고 scintillation counter 로방사능을측정하였다. 4) 중합효소연쇄반응 (PCR) 에의한 HBV DNA 측정 HBV DNA 추출은일반적으로실시되고있 는단백분해효소 ( proteinase K) 처리및유기 용매에의한방법으로추출하였다 9) (1) 1 차 PCR 사전에제조하여분주된 PCR 반웅완충액 (10 mm Tris-HCI ph 8.8, 1.5 mm MgCb, O. 1 % Triton X -100, 10 pmole primer 1, O. 2 mm dntp, 50 mm KCI) 에음성대조에증류 수, 양성대조에 HBV DNA, 검체용기에는각 시험검체 DNA 를 2μl 씩, 그리고 2.5 unit 의 Taq DNA polymerase 를각반응용기에가하 고최종반웅액의량은 20μl 가되도록하였다. 반웅용기를 thermal cycler 로옮기고 94 0 C 1 분간 denaturation, 55 Oc 광 1. 5 분간 annealing, 72 0 C 3 분간 extension 을한주기로하여전체 40 회실시하였다. (2) 2 차 PCR 반응종료된 1 차 PCR 산물중음성을 나타낸검체는반응산물 2μl 를 1 차 PCR 에 사용된 pnmer 에대한내측 primer(primer 2) 를사용하여 2 차 PCR 을하였다. 이때 pnmer 를제외한모든반응액성분과증폭조건은 1 차증폭과같게하였고전체증폭회수는 30 회실시하였다. (3) PCR 산물확인 최종반웅이종료된반응액의일부를 gel loading 완충액에혼합하고 l μg/ml ethidium bromide 가함유된 2 % agarose gel 상에서전기 영동을하였다. 전기영동이완료되면자외선 투사기 (ultra violet transilluminator) 상에서원 하는크기의 band 를확인하였다. III. 결과 이번조사에서는측정된 HBeAg 의결과는 9 예중 3 예 (52, 53, 55) 가양성을, HBV DNA probe 는 51, 52, 54, 59 의 4 예가양성을보였 다. 반면이들 9 예중에 DNA polymerase 는 1 예 (52), PCR 은 3 예 (51, 52, 55) 가양성을나 타냈다 ( 표 1). PCR 측정은양성대조는원하 는크기의 DNA 단편이증폭되었고음성대조 Table 1. Detection of HBeAg, HBV DNA probe, DNA polymerase and PCR in 17 HBsAg posltive sera. No. tested HBeAg HBV DNA probe DNA polymerase PCR 3 4 5 7 μμμl-2 6 s s E E 8 9 U 나ιq니Anu 낸--- 다니CU?l w w w ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND w : weakly positive. ND : assay not done. -72 -
에는 DNA 증폭은발견되지않아본시험에서 HBeAg 를사용하는데이는체내 감염된바이 는외부 DNA 혼입은인정되지않았다 ( 그림 1.2). 또, 17 예의 PCR 대상검체중 1 차 PCR 에서 5 예가, 2 차 PCR 에서 3 예가각각증폭되어전체적으로 8 예 (47.9 %) 가양성을보였다. 러스활성기전을이해함에서비롯된것으로생각된다 2). HBeAg 이과거에는바이러스의증식및감염력과밀접한관계가있는것으로생각되어왔었다. 그러나일률적으로생각하여 3는 HBeAg, 4와 9 는 HBV DNA probe 임상적소견을판단하는것은곤란하다 12, 13) 에서만각각양성을나타내서로상반된결과 HBeAg는바이러스의증식이없어도간세포를보였다. 반면, 5 는 PCR에서도양성을나유전자에삽입된 HBV DNA 에의해서생성이타내어혈청내 DNA 가존재함이증병되었다. 가능할수있으므로체내바이러스증식을정 한편, 모든방법에서양성을보인겸제는 2 확하게의미한다고는할수없으며 14, 15) 실제 뿐이였다. DNA polymerase와 PCR만측정한 HBeAg 양성인검체에서 HBV DNA가검출되나머지 10--17 까지의 8 검체는두방볍의지않았던연구보고도있다 16) 이는측정방결과가 100 % 일치하였다. 이검체는간기능법의감도상에서비롯된것이아니라 HBeAg 효소활성치가급격히상승 ( 자료별도로제시 에서 anti-hbeab 까지의혈청전환기동안은 되지않음 ) 된것으로서이는체내바이러스의바이러스간기 (intermitant) 로서 17) 이기간동 증식이활발하게이루어지고있음을입증하여안에혈청내에 HBV DNA 는측정되지않지만 주었다. 여전히 HBeAg 는양성을타나내는것으로알 려졌다. 따라서 HBeAg 의 역가나임상경과와 N. 고찰 는밀접한상관관계가없는것으로보고되었 다. 한편, HBV 의활성지표로서 DNA poly- 간염의진행과정을관찰하기위한수단으로 merase를측정하여판단하려는시도도 15) 있어 HBsAg, anti - HBc 를측정하여사용하여왔는왔지만방법상의예민도가문제가제기되었다. 데이는실제임상과상당한차이가있는것으본연구에서대상으로한 17 예의 HBsAg 양로알려졌다. 이런이유에서또다른지표로성검체에대해서 HBeAg 양성인겸체는 3 예 M l 2 3 M 1 2 3 270 bp 258 bp A B Fig. 1 PCR amplification of hepatitis B virus DNA. PCR product was electrophoresed through 2 % agarose gel and detedted by UV -transilluminator after staining with ethidium bromide. A is result of first PCR products, 270 bp DNA fragment was amplified for positive of HBV DNA. B is 2nd PCR products which shown 258 bp for positive of HBV DNA. M; molecular marker, Lane 1 through 3; negative control, positive control, sample, respectively. 껴녀
~ ~ r11 o] ~ 1 ojl(2) ~ J.. ~ 1:3J- t{] ojl Ai 0 J:;.d % 1..-t E} 4l ol ~ i!} ~ 2_ ~ rrj1. ~ ~~ ~]4l ojj Ai t1} o 1 c~ ~ ~ * ~l ~ ti~ ~ ~% ~ o] ~ q.jl w -T- ~139. q..=r c~ 4 3 ~ q~ : - 1:3J- t{] ojl Ai g ).d g_ 4 E} 'tr ~.g..=i ~ ~% ~ ~ <5} ~l ~-f ~ -T-~ ~7-]'i}- ~Ai <:8-B- cs-}~7-]'i}- t~}o]c~~~ ~ ;.d cycle o l serovonversion Tt! 7-ll ojl ~ 7-]?l- g_ 77} "'] 4.!fl q. 5 ~ HBeAg7} oj:;.d oj1 ] ol PCR OJ:).d.2.. DNA e~~ ~ ~~ cs-tetl ~ ~ li! oj1, probe t{] ~ % ;.d g_ 4 E} 4l ol probe t{] o l {J- 7} ~qjl ~ -T- ~q..=rc~4 9~ Jtl-7-1 DNA probe~ ojl 'i! ~ :Aj ~<Xi q~ ~ ~ o] ~ 7} 1} ~ 7-]?l- 7-] 'i} o l.c probe 1:3J- ~ ~ :; ;.d g_.jl ~ ~ ~ rrj1 tlj:; oj ~ ~ ~%oj1 9-j ~ Ai ~ OJ:J.d o] o} \:! 7} "] z.}~ q. DNA probet{] o]4 PCRoJl ~ ~ HBV DNA ~ 78 ~ ~ ~ojl DNAe~~ etllf- 'i! ~ 78 <5}~ ~ o] E- ~ojl Ai ~ ift>}~ ~ o] ~ ~ ~ AJ~ ~ ftt!t>}~ ~ ~ q~.!f-~7} ~ g_ ~ ~q. o] Jtl ~ -T-oJl Ai ~ 78 1 87R (10----17) ~ ~ ~1 ~ ff% {}~ g_ Oll?:!~ ~ ~~ ~~ Z!-71 'o.:s:.~ 7.]7} ~o] AJ1).!fl ~~l Ai ~lt.h tl}o]c-1~~ tt;.d g_ ~ 78 <5} 7] ~ ~ -&~ ~ t>-}4 DNA polymerase9l- PCRoJl ~~DNA ~~'i}g_ A]. ~ ~ o] q. o] 7d ~ojl.:g- JiL. - ~l f- 1:3J-t{j ~ ~i!}7} ~7-]~g_.!ii_~q. o] :Jd~ DNA polymerase e~~ ~ DNA~ ~~1 t>}etl Pi.g. t~}o] e-1.~ DNA~ 'i} ~ Jl ~ 7] ujl ~oj1 o1 ~ ~ -2- DNA~ e~~ ~ 4E}4l7l ~q. rr}c.}ai PCRoJl ~~ DNA~ ~~ t>] ~ 78~ ~o]q. ~ ~~ _Q_ oj Jtl ~ -T-oJJ Ai 3:A}.!f]_ ~i!}, ~ HBeAg ~ 0 J:;.d o]4 ~ 78 DNA ~:i!l- ~ g J.d, :E.C HBeAg.C g ;.d g_.!ii_o]:a]~ HBV DNA~ ~ ~!@ oj1 ~ ~ rrj1 Bi8 {}~ g_ ~ Jtl-t>}JL Oll ~ :t!-~~71 ~ t>~ Ai ~ HBeAg~ 78 ~ ti~ <5} etl ~ol %1:~ DNA ~ 78 7}?;~ PCRoJl ~ ~ DNA ~~o].!ii_q %%~ l:ij"t{]blo]c.} A}li~ q. Detection of Hepatitis B e Antigen and Hepatitis B Viral DNA in era of Hepatitis urface Antigen Positive Choi, C.., Kim, U. A;, Hong, C.., Lee, K. 0., Park, C. P.* eoul Medical cience Institute, eoul Clinical Laboratory Dept. of Clinical Pathology, Korea Hospital, eoul Korea.* ABTRACT were HBeAg positive but DNA probe-results was negative. And the other was HBeAg era from 17 patients with hepatitis B sur- negative, however DNA was positive in probe face antigen(hbsag) positive were tested for or PCR. And all 5 was DNA polymerase hepatitis B e antigen(hbeag) by radioimmu- negative. Four(44.4) of 9 were hepatitis B e noassay, hepatitis B virus(hbv) DNA by antigen negative. Of these, one was DNA hibridization with DNA probe. and polymerase positive both DNA probe, polymerase and chian reaction(pcr) method, and hepatitis B PCR method. However three were shown the virus DNA polymerase. In this study there negative results in all method. Eight of 17 were considerable discordance among their samples were tested for DNA polymerase and results in 5(55.6 %) of 9 samples which were PCR without the test for HBeAg and HBV hepatitis surface antigen positive. Of 5, two DNA probe. These results showed 100 % cor- -74-
relation each other. Conclusively as above our by PCR should be useful method for the dirusults, serological test with amplified DNA agnosis of hepatitis B virus infection. REFERENCE 1. Murray RP, Kobayashi G, Pfaller MA, Resenthal K : Hepatitis B viruses. p 702-718. Medical microbiology 2nd ed., Mosby- Year Book, Inc., London, 1994. 2. Bonino F, Hoyer B, Nelson J, Engle R, Verme G, Gerin J : Hepatitis B virus DNA in the sera of HBsAg carrier : A marker of active hepatitis B virus replication in the liver. Hepatology 1 : 386-391, 1981. 3. Brechot C, Pourcel C, Hadchoure M, Dejean A, Louise A, cotto J, Tiollais P : tate of hepatitis B virus DNA in liver disease. Hepatology 2 : 27s-34s, 1982. 4. Liberman HM, Labrecque DR, Kew MC, Hadziyannis J, hafritz DA : Detection of hepatitis B virus DNA directly in human serum a simplified molecular hybridization test : Comparison to HBeAg/ anti-hbe status m HBsAg earner. Hepatology 3: 285-291, 1983. 5. cotto J, Hadchouel M, Hery C, Yvart J, Tiollais P : Detection of hepatitis B virus DNA in serum by a simple spot hybridization technique : comparison with results for other viral marker. Hepatology 3 : 271-284, 1983. 6. hih LN, heu JC, Wang JT, Hung GT : Detection of hepatitis B viral DNA by polymerase chain reaction in patients with hepatitis B surface antigen. J Med Virol 30 : 159-162. 1990. 7. aiki RK, Gelfand DH, toffel, charf J, et a! : Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. cience 239 : 487-491, 1988. 8. Kaneko, Feinstone M, Miller RH : Rapid and sensitive method for the detection of serum hepatitis B virus DNA using the polymerase chain reaction technique. J clin Microbial : 1 930-193, 1989. 9. ~ ~ ~, ~ ~ C}, C 1 ~ ~ : ~ AJ 7}~ ~ oj1 -"l ~~~~~:}]l ~%g_ 0 1%~ ~~if ~B- 9.1 Jia 7}. ~ ~ n1 ).~ ~~~ A-1 28(5) : 381-389, 1993. 10. Hoofnagle J'H, Duseiko GM, et al : eroconversion from hepatitis B e antigen to antibody in chronic type B hepatitis. Ann Intern Med 94 : 744-748, 1981. 11. Fattovich V, Rugge M, et al : Clinical, virologic and histologic outcome fallowing seroconversion from HBeAg to anti-hbe in chronic hepatitis B. Hepatol 4 : 1052 (abstract), 1984. 12. hikada T, Karasawa T, Abe TK : Hepatitis B e antigen infectivity of hepatitis B virus. J infect Dis 136 : 571-576, 1977. 13. LaBrecque DR, Muhs TM, et a! :The risk of hepatitis B virus transmission from health care workers to patients in hospital-setting- A prospective study. Hepatolo 6 : 205-208, 1986. 14. Alter HJ, eeff LB, et a! : The infectivity of blood positive for e antigen and DNA polymerase after accidental needle stick exposure. N Engl J Med 295: 900-913, 1976. 15. Fagan EA, Williams R : erological response to HBV infection. GUT 27 : 858-867, 1986. 16. cott J, Pan PE, Pace RA, cott TP, Cooksley WG : The absence of hepatitis B virus DNA in hepatitis B e antigen posi- -75-
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