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생약학회지 Kor. J. Pharmacogn. 45(2) : 93 100 (2014) 산겨릅나무로부터페놀화합물의분리및항염증활성의측정 송나영 이광진 마진열 * 한국한의학연구원한의신약개발그룹 Isolation and Identification of Phenol Compounds from Acer tegmentosum and their Anti-inflammatory Activity Na-Young Song, Kwang Jin Lee and Jin Yeul Ma* KM-Based Herbal Drug Development Group, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 305-811, Korea Abstract The Acer tegmentosum (3 kg) were extracted with boiled water and the freeze dried extract powder was partitioned with CH 2 Cl 2, EtOAc, n-buoh and H 2 O, successively. From the EtOAc and n-buoh fraction, six phenolic compounds were isolated through the silica gel, octadecyl silica gel and sephadex LH-20 column chromatography. On the basis of spectroscopic methods, such as 1 H-NMR and 13 C-NMR, and LC/MS, the chemical structures of the compounds as feniculin (1), avicularin (2), (+)-catechin (3), (-)-epicatechin (4), salidroside (5) and 6 -O-galloylsalidroside (6). In this study, compounds 1 and 2 have been first isolated from the A. tegmentosum. To provide insight into the effects of six compounds isolated from A. tegmentosum on inflammation, we investigated its effect on nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cells using lipopolysaccharide (LPS) stimulation. Compounds 1 and 6 slightly repressed NO production. Also, compounds 3 and 4 inhibited NO secretion with statistical significance. However, compounds 2 and 5 did not show any inhibitory effect on NO production. Key words Acer tegmentosum, Anti-inflammation, Avicularin, Feniculin, Isolation, NMR 산겨릅나무 (Acer tegmentosum) 는단풍나무과 (Aceraceae) 에속하며낙엽활엽소교목으로원산지는한국이다. 높이는 10 m안팎이며, 수피는회록색으로검은줄무늬가있다. 잎은대생하며 3~5개로얕게갈라지고, 꽃은 5월경에황색의총상화서로나며, 열매는 9월에황갈색으로익는다. 1,2) 민간에서는벌나무또는산청목이라불리며, 간암, 간경화, 간위, 백혈병등간에관련된질병에탁월한효과가있다고보고되었다. 3) 또한본초에서는청해척이라하여종기와외상출혈치료에사용되고있다. 4) 산겨릅나무에서분리된성분으로는 β-sitosterol, β- sitosterol-3-o-β-d-glucoside, epifriedelinol과같은 steroid 와 terpenoid, 5) salidroside, tyrosol, 6'-O-galloylsalidroside, quercetin, isoquercetin, morin-3-o-α-l-lyxoside, fraxin, cleomiscosin A, scopoletin과 (+)-catechin, (-)-epicatechin 등과같은 phenol 화합물이있다. 6-8) 또한산겨릅나무추출물은항산화활성, 항지질과산화활성, 항미생물활성이우수하고, 9) 주성분인 salidroside는위의손상과통증을억제 * 교신저자 (E-mail) : jyma@kiom.re.kr (Tel): +82-42-868-9466 하는활성이보고되었다. 10) 본연구는산겨릅나무로부터보고되지않은화합물을분리하기위하여 dichloromethane(ch 2 Cl 2 ) 과 ethyl acetate (EtOAc), n-butanol(n-buoh), H 2 O의용매로계통분획을실시하였다. 그결과 EtOAc 분획물에서 feniculin, avicularin, (+)-catechin, (-)-epicatechin, 6'-O-galloylsalidroside과 n- BuOH 분획물에서 salidroside를분리하였다. 이때 feniculin 과 avicularin은산겨릅나무에서처음분리된화합물로확인되었다. 또한고순도의 6종의화합물에대하여항염증활성인 RAW 264.7 대식세포에대하여세포독성을확인하였고, 산화질소생성에대한억제효과를측정하여탐색하였다. 재료및방법 실험재료 본실험에사용한산겨릅나무시료는 2012 년 7 월대창약업사로부터구입하였으며, 표본시료는한국한의학연구원한의신약개발그룹에서보관되어사용되었다 ( 구입한시료는충남대학교약학대학배기환명예교수의감별에의하여관리되었다 ). 93

94 Kor. J. Pharmacogn. 시약및기기 Column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(Merck, Germany) 을사용하였고, Octadecylsilane(ODS) 은 LiChroprep RP-18(Merck) 을사용하였으며 Sephadex LH-20(Fluka, USA) 을사용하였다. Thin layer chromatography(tlc) 는 Kiesel gel 60 F 254 (Merck) 와 RP- 18 F 254S (Merck) 를사용하였다. NMR spectrum은 Varian Inova 400NB(Varian, USA) 와 Varian Inova 600(Varian) 으로측정하였고, LC-MS는 Agilent LC-ESI-MSD 1100+ G1958(Agilent, USA) 을사용하였다. 시료의추출과분획에사용한 CH 2 Cl 2 와 EtOAc, n-buoh 용매는대정화학주식회사에서생산한 1급시약을사용하였으며, LC-MS 분석에사용된 acetonitrile(j.t. Baker, USA) 은 HPLC급용매 (99.9%) 로사용하였고, trifluoroacetic acid(tfa, Sigma-Aldrich, USA) 은분석급시약을사용하였다. 물은초순수제조장치 (Milipore, USA) 를이용하여제조한 3차증류수를사용하였다. 세포주배양에필요한 RPMI 1640 배지, fetal bovine serum(fbs), penicillin-streptomycin(p/s), phosphate buffered saline(pbs) 는 Lonza(Basel, Switzerland) 에서구입하였다. Lipopolysaccharide(LPS), bovine serum albumin(bsa), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylthiazolium bromide (MTT) 는 Sigma(St. Louis, MO, USA) 에서구입하였다추출및분획 산겨릅나무 3kg을증류수 30 L에담가 105 o C에서 3시간열수추출하여 standard testing sieves (150 µm, Retsch, Germany) 로여과하여추출물 101.6 g을얻었다. 그중 20 g을 H 2 O(600 ml) 와 dichloromethane (CH 2 Cl 2, 600 ml 3) 으로분배추출하였고, H 2 O 분획은다시 ethyl acetate(etoac, 600 ml 4) 로분배추출한뒤 n- butanol(n-buoh, 600 ml 4) 로분배추출하였다. 각분획물을감압농축하여 CH 2 Cl 2 분획 (420.8 mg), EtOAc 분획 (1.24 g), n-buoh 분획 (4.18 g), H 2 O 분획 (13.51 g) 을얻었다. 화합물의분리 산겨릅나무 EtOAc 분획 (1.24 g) 중 1.22 g 으로부터 silica gel column chromatography(c.c.)[φ 4 10 cm, chloroform(chcl 3 )-MeOH-H 2 O = 15:3:1(1.2 L) 13:3:1(1.3 L) 10:3:1(1.2 L) 7:3:1(1 L) 4:3:1(1 L) MeOH] 를실시하여 12개의분획물 (OS1E-1~OS1E-12) 을얻었다. 이중 OS1E- 6(55.5 mg) 분획을 Sephadex LH-20 c.c.[φ 1.5 45 cm, 50% MeOH(180 ml) 70% MeOH(300 ml) 100% MeOH] 를진행하여 7개의분획 (OS1E-6-1~OS1E-6-7) 을얻었으며화합물 1(OS1E-6-2, 6.0 mg) 과화합물 2(OS1E-6-4, 5.9 mg) 를분리하였다. OS1E-7(260.3 mg) 분획에대하여 Sephadex LH-20 c.c.[φ 1.5 44 cm, 80% MeOH(400 ml) 100% MeOH] 를실시하여 10개의분획물 (OS1E-7-1~OS1E-7-1-10) 로나누었고, 이중 OS1E-7-6(53.1 mg) 을 ODS c.c.[φ 1.5 8 cm, MeOH-H 2 O = 1:6(900 ml) MeOH] 를진행하여총 6개의분획 (OS1E-7-6-1~OS1E-7-6-6) 을얻었으며화합물 3(OS1E-7-6-2, 30.7 mg) 과화합물 4(OS1E-7-6-4, 14.2 mg) 을분리하였 다. OS1E-9(237.5 mg) 을 ODS c.c.[φ 2.5 8 cm, MeOH- H 2 O = 1:3(450 ml) 1:2(300 ml) 1:1(300 ml) MeOH] 를수행하여 13개의분획물 (OS1E-9-1~OS1E-9-13) 로나누었으며 OS1E-9-3(77.8 mg) 에대하여 silica gel c.c.[φ 1.5 10 cm, CHCl 3 -MeOH-H 2 O=7:3:1(350 ml) MeOH] 를진행하여 4개의분획물 (OS1E-9-3-1~OS1E-9-3-4) 로나누었으며, 화합물 6(OS1E-9-3-2, 60.3 mg) 을분리하였다. 산겨릅나무 n-buoh분획 (4.18 g) 에대하여 silica gel c.c.[φ 4 11 cm, CHCl 3 -MeOH-H 2 O = 10:3:1(2.2 L) 7:3:1(1.6 L) 4:3:1 (1.4 L) MeOH] 를진행하여 10개의분획물 (OS1B-1~OS1B- 10) 을얻었고화합물 5(OS1B-3, 1.34 g) 을분리하였다. 화합물 1(feniculin) yellow amorphous powder (MeOH); ESI-MS m/z 435.1 [M+H] + ; 1 H-NMR (400 MHz,, δ H ) 7.73 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2'), 7.55 (1H, dd, J=8.4, 1.6 Hz, H-6'), 6.88 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5'), 6.39 (1H, d, J=1.6 Hz, H-8), 6.19 (1H, d, J=1.6 Hz, H-6), 5.16 (1H, d, J=6.0 Hz, H-1''), 3.89 (1H, dd, J=8.0, 6.0 Hz, H-2''), 3.82 (1H, H-5''a), 3.80 (1H, m, H-4''), 3.64 (1H, dd, J=8.0, 2.8 Hz, H-3''), 3.44 (1H, dd, J=13.2, 3.2 Hz, H-5''b); 13 C- NMR (100 MHz,, δ C ): Table 1. 화합물 2(avicularin) yellow amorphous powder (MeOH); ESI-MS m/z 435.1 [M+H] + ; 1 H-NMR (600 MHz,, δ H ) 7.52 (1H, d, J=1.8 Hz, H-2'), 7.49 (1H, dd, J=8.4, 1.8 Hz, H-6'), 6.90 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5'), 6.38 (1H, d, J=1.8 Hz, H-8), 6.20 (1H, d, J=1.8 Hz, H-6), 5.46 (1H, s, H-1''), 4.32 (1H, d, J=2.4 Hz, H-2''), 3.89 (1H, dd, J=4.8, 2.4 Hz, H-3''), 3.86 (1H, m, H-4''), 3.49 (2H, t, J=4.2, H- 5''); 13 C-NMR (150 MHz,, δ C ): Table 1. 화합물 3[(+)-catechin] brown powder (MeOH); ESI- MS m/z 291.0 [M+H] + ; 1 H-NMR (600 MHz,, δ H ) 6.83 (1H, d, J=2.4 Hz, H-2'), 6.76 (1H, d, J=8.4 Hz, H- 5'), 6.71 (1H, dd, J=8.4, 2.4 Hz, H-6'), 5.92 (1H, d, J=2.4 Hz, H-6), 5.85 (1H, d, J=2.4 Hz, H-8), 4.56 (1H, d, J=7.2 Hz, H-2), 3.97 (1H, m, H-3), 2.50 (1H, dd, J=16.2, 8.4 Hz, H-4a), 2.84 (1H, dd, J=16.2, 6.0 Hz, H-4b); 13 C- NMR (150 MHz,, δ C ): Table 1. 화합물 4[(-)-epicatechin] brown powder (MeOH); ESI- MS m/z 291.0 [M+H] + ; 1 H-NMR (600 MHz,, δ H ) 6.96 (1H, d, J=1.8 Hz, H-2'), 6.79 (1H, dd, J=8.4, 1.8 Hz, H-6'), 6.75 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5'), 5.93 (1H, d, J=1.8 Hz, H-6), 5.91 (1H, d, J=1.8 Hz, H-8), 4.80 (1H, br s, H-2), 4.16 (1H, m, H-3), 2.86 (1H, dd, J=16.8, 4.8 Hz, H-4a), 2.73 (1H, dd, J=16.8, 3.0 Hz, H-4b); 13 C- NMR (150 MHz,, δ C ): Table 1. 화합물 5(salidroside) colorless powder (MeOH); ESI- MS m/z 301.1 [M+H] + ; 1 H-NMR (400 MHz,, δ H )

Vol. 45, No. 2, 2014 95 Table 1. 13 C-NMR chemical shifts of compounds 1-6 isolated from Acer tegmentosum No. of carbon 1 2 3 4 5 6 100 MHz 150 MHz 150 MHz 150 MHz 100 MHz 150 MHz 1 130.82 130.56 2 158.70 159.44 82.81 79.86 131.03 130.83 3 135.65 135.00 69.78 67.47 116.19 116.08 4 179.48 180.09 28.47 29.25 156.85 156.52 5 163.05 163.19 157.54 157.66 116.19 116.08 6 99.88 99.95 96.28 96.38 131.03 130.83 7 166.07 166.25 157.78 157.98 36.43 36.33 8 94.70 94.84 95.50 95.88 72.16 72.20 9 158.43 158.69 156.88 157.35 10 105.63 105.69 100.81 100.06 1' 122.89 123.09 132.19 132.28 2' 117.45 116.54 115.23 115.88 3' 145.95 146.47 146.19 145.76 4' 149.96 149.96 146.21 145.92 5' 116.17 116.54 116.08 115.31 6' 123.03 123.20 120.03 119.38 sugar-1'' 104.63 109.59 104.42 104.39 2'' 72.87 83.41 75.17 74.99 3'' 74.13 78.76 77.99 77.84 4'' 69.11 88.10 71.69 71.67 5'' 66.94 62.64 78.15 75.34 6'' 62.81 64.70 galloyl-1''' 121.37 2''' 110.16 3''' 146.44 4''' 139.78 5''' 146.44 6''' 110.16 -COO- 168.31 7.08 (2H, d, J=8.0 Hz, H-2, 6), 6.71 (2H, d, J=8.0 Hz, H-3, 5), 4.31 (1H, d, J=8.0 Hz, H-1''), 4.07 (1H, H-6''a), 3.88 (1H, dd, J=12.4, 2.0 Hz, H-6''b), 3.73 (H-3''), 3.67 (H-4''), 3.36 (H-2''), 3.28 (H-5''), 3.21 (2H, t, J=8.4 Hz, H-8), 2.86 (2H, t, J=8.4 Hz, H-7); 13 C-NMR (100 MHz,, δ C ): Table 1. 화합물 6(6'-O-galloylsalidroside) pale yellow oil (MeOH); ESI-MS m/z 453.1 [M+H] + ; 1 H-NMR (600 MHz,, δ H ) 7.10 (2H, br s, H-2''', 6'''), 6.96 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2, 6), 6.65 (2H, d, J=8.4 Hz, H-3, 5), 6.65 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5), 4.52 (1H, dd, J=11.4, 2.4 Hz, H-6''a), 4.45 (1H, dd, J=11.4, 6.0 Hz, H-6''b), 4.32 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1''), 3.95 (1H, m, H-8a), 3.70 (1H, m, H-8b), 3.55 (1H, m, H-5''), 3.42 (2H, t, J=7.8 Hz, H-3'', 4''), 3.22 (1H, t, J=8.4 Hz, H-2''), 2.77 (2H, m, H-7); 13 C-NMR (150 MHz,, δ C ): Table 1. LC-MS 분석조건 산겨릅나무로부터분리한 6종의화합물에대하여 LC-MS 분석을수행하였고, 각각의화합물은 MeOH에녹여 200 ppm의농도로사용되었으며, LC-MS 의분석조건은 Table 2와같다. 이조건에서화합물 1의머무름시간은 32.6분, 화합물 2는 34.0분, 화합물 3은 12.1분, 화합물 4는 17.7분, 화합물 5는 8.0분, 화합물 6은 21.3분으

96 Kor. J. Pharmacogn. Table 2. LC-MS operating condition LC-MS system Agilent LC-ESI-MSD 1100 + G1958 Column HECTOR-M-C 18 (100 4.6 mm I.D., 3 µm, RS tech) Column Temp. 40 o C Mobile phase 0.1% TFA water (A), acetonitrile (B) B Con. : 10-25%(0-35 min), 25-10%(35-37 min), 10%(37-45 min) Flow rate 0.5 ml/min Injection vol. 10 µl Ionization source API-ES (positive mode) Fragmentor voltage 70 V Quadrupole Temp. 99 o C Capillary voltage 3000 V Nebulizer pressure 35 psig Drying gas Temp. 350 o C Mass range (m/z) Scan mode, 200~500 로확인되었다. 세포배양과실험약물의처리 마우스유래의대식세포주 (murine macrophage, RAW 264.7) 를사용하였다. RAW 264.7 세포는한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, Seoul, Korea) 에서구매하여 1% 의 P/S와 10% 의 FBS가첨가된 RPMI 1640 배지를이용하여배양하였다. 세포는 5% CO 2, 37 o C, full humidify의조건으로배양하였다. 세포에실험약물을처리하거나자극원을처리하기위하여배양배지를 FBS가첨가되지않은신선한배지로교체하였고 1시간배양후실험약물 (10, 30, 50, 100 µm) 을처리하였으며다시 1시간배양후자극원인 LPS(200 ng/ml) 를처리하였다. MTT assay를이용한세포생존율측정 RAW 264.7 세포를 5 104 cells/well의농도로 96-well plate에접종한후 18시간동안 37 o C 인큐베이터에서배양하였다. 6종의분리된화합물을 10, 30, 50, 100 µm의농도로각각처리하였다. 37 o C 인큐베이터에서 24시간배양한후에 MTT 시약을이용해세포에대한실험약물의독성을확인하기위해 5mg/ ml 농도의 MTT 시약을처리하였다. 4시간을더배양한후배지를제거하고각 well 마다 dimethylsulfoxide (DMSO) 를 100 µl 첨가하여형성된 formazane을녹인후 ELISA reader(infinite M200, TECAN, Männedorf, Switzerland) 를이용하여 570 nm에서흡광도를측정하였다. 산화질소생성의측정 산화질소의생성은배양중인대식세포의배지에포함된아질산염을측정함으로써분석하였다. 세포에실험약물을농도별로처리하고 1시간배양후자극원인 LPS를처리하였다. 24시간을배양한후상청액을취하여동일한부피의 griess 시약 (1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride and 2.5% phosphoric acid) 과혼합하여상온에서 5분간배양하였다. 18) 분석은 ELISA reader를이용해 570 nm의흡광도를측정하였다. 결과및고찰 산겨릅나무 3kg을증류수 30 L에담가열수추출하여추출물 101.6 g을얻었으며, 그중 20 g에대하여용매의극성에따라 CH 2 Cl 2, EtOAc, n-buoh 및 H 2 O로분배추출하였다. EtOAc 분획과 n-buoh 분획으로부터 silica gel, ODS 및 Sephadex LH-20 column chromatography를반복진행하여화합물 1-6을분리하였다. 각화합물에대하여 1 H, 13 C- NMR을측정하였고문헌과비교분석하여 feniculin(1), avicularin(2), (+)-catechin(3), (-)-epicatechin(4), salidroside (5), 6 -O-galloylsalidroside(6) 로구조동정하였으며 (Fig. 1), 각화합물에대하여분자량을확인하기위하여 LC-MS를측정하였다 (Fig. 2). 화합물 1과 2는 ODS TLC 전개후 10% H 2 SO 4 로발색하면노란색을나타내어 flavonoid 화합물로예상하였다. 화합물 1의 1 H-NMR (400 MHz,, δ H ) 에서 δ H 6.39 (1H, d, J=1.6 Hz, H-8) 와 δ H 6.19 (1H, d, J=1.6 Hz, H-6) 의 olefine methine proton signal로부터 1,2,3,5-4 치환벤젠고리를확인하였고, δ H 7.73 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2') 과 δ H 1.55 (1H, dd, J=8.4, 1.6 Hz, H-6'), δ H 6.88 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5') 에서관측된 olefine methine proton signal로부터 1,2,4-3 치환벤젠고리가존재함을예상하였다. 산소가치환된영역의 δ H 5.16 (1H, d, J=6.0 Hz, H-1'') 에서한개의 hemiacetal proton signal과다수의 oxygenated methine이관측되어한개의당이결합되어있음을예상하였다. 13 C-NMR (100 MHz,, δ C ) 에서총 20개의 signal이관측되었으며, δ C 179.48에서 ketone carbon signal (C-4) 이하나관측되었다. 저자장에서총 14개의 [δ C 166.07 (C-7), δ C 163.05 (C-5), δ C 158.70 (C-2), δ C 158.43 (C-9), δ C 149.96 (C-4'), δ C 145.98 (C-3'), δ C 135.65 (C-3), δ C 123.03 (C-6'), δ C 122.89 (C-1'), δ C 117.45 (C-2'), δ C 116.17 (C-5'), δ C

Vol. 45, No. 2, 2014 97 Fig. 1. Chemical structure of first isolated compounds (a) and reported compounds (b) from Acer tegmentosum. Fig. 2. MS spectra of feniculin (1), avicularin (2), (+)-catechin (3), (-)-epicatechin (4), salidroside (5) and 6 -O-galloylsalidroside (6) isolated from Acer tegmentosum using LC-MSD. 105.43 (C-10), δ C 99.88 (C-6), δ C 94.70 (C-8)] signal 이관측됨에따라벤젠고리두개와이중결합한개가존재함을확인하였고, 이중 δ C 166.07, δ C 163.05, δ C 158.70, δ C 158.43, δ C 149.96, δ C 145.98, δ C 135.65 의 signal 이저자장으로 shift 된것으로부터수산기가치환되어있음을예상하여 flavonol 골격의 quercetin 으로확인하였다. δ C 104.63 (H-1'') 의 anomer carbon signal 이하나관측됨에따라당이한분자결합하고있음을확인하였으며, 60~80 ppm 에서관측된 signal 의 chemical shift 값으로부터 pyrane 형태의 arabinose 가결합하고있음을확인하였다. 위의데이터를종합하고문헌과비교하여화합물 1 을 quercetin 에 arabinopyranoside 가결합된 feniculin 으로구조동정하였으며, 11) positive mode 의 ESI-MS 를측정하여 m/z 435.1 [M+H] + 을얻었다. 화합물 2 는 1 H 와 13 C-NMR 의스펙트럼에서화합물 1 과비슷한양상을나타내었으며, quercetin 에 arbinose 가 furane 형태로결합된 avicularin 으로구조동정하였고, 12) positive mode 의 ESI-MS 를측정하여 m/z 435.1 [M+H] + 을얻었다. 화합물 3 과 4 는문헌과비교하여각각 (+)-catechin 과 (-)- epicatechin 으로구조동정하였고, 13) 두화합물모두 positive mode 의 ESI-MS 를측정하여 m/z 291.0 [M+H] + 을확인하였다. 화합물 5 는 ODS TLC 로분석하고 10% H 2 SO 4 를분무하여가열하면갈색으로발색되어페놀화합물로예상하였다. 1 H-NMR (400 MHz,, δ H ) 에서 δ H 7.08 (2H, d, J=8.0 Hz, H-2, 6) 과 δ H 6.71 (2H, d, J=8.0 Hz, H-3, 5) 에

98 Kor. J. Pharmacogn. 서총 4개의 olefine methine proton signal이겹쳐서나타나므로대칭형의 ρ-2치환벤젠고리가존재함을예상하였다. δ H 4.31에서 8.0 Hz의 J값을가지는 hemiacetal proton signal (H-1 ) 과 3.0~4.1 ppm 사이의다수의 oxygenated methine proton signal로부터당한분자가 β 형태로결합하고있음을확인하였다. δ H 3.21 (2H, t, J=8.4 Hz, H-8) 과 δ H 2.86 (2H, t, J=8.4 Hz, H-7) 에서 J값이같은두개의 methylene proton signal이관측되어두개의 methylene이 chain 형태로결합되어있음을예상하였다. 13 C-NMR (100 MHz,, δ C ) 에서총 14개의 signal이관측되었으며저자장의 6개 [δ C 156.85 (C-4), δ C 131.03 (C-2, 6), δ C 130.82 (C-1), δ C 116.19 (C-3, 5)] signal로부터벤젠고리가하나존재함을확인하였고, 이중 δ C 156.85 signal이저자장으로 shift 된것으로부터수산기가결합되어있음을예상하였다. δ C 104.42 (C-1') 의 anomer carbon signal과 60~ 80 ppm의 5개의 oxygenated methine signal의 chemical shift 값으로부터 glucose가한분자결합하고있음을확인하였다. δ C 72.16 (C-8) 과 δ C 36.43 (C-7) 에서 methylene carbon signal을관측하였고 δ C 72.16의 signal이저자장으로 shift 된것으로부터수산기가결합되어있음을예상하였다. 위의데이터를종합하고문헌과비교하여화합물 5를수산기가하나치환된벤젠고리와 chain 형태의 methylene, 당한분자가결합된 salidroside로구조동정하였다. 10) 화합물 5의 positive mode의 ESI-MS 측정값은 m/z 301.1 [M+H] + 로확인하였다. 화합물 6의 1 H-NMR (600 MHz,, δ H ) 은화합물 5와매우비슷하였으나 δ H 7.10 (2H, br s, H-2'', 6'') 에서 broad singlet으로 split된 oxygenated methine proton signal 이겹쳐서관측되어 1,2,3,5-4 치환벤젠고리를추가로확인하였다. 또한당의 6번 [δ H 4.52 (1H, dd, J=11.4, 2.4 Hz, H-6'b), δ H 4.45 (1H, dd, J=11.4, 6.0 Hz, H-6'a)] proton signal이매우저자장으로 shift 된것으로부터당의 6번에 작용기가결합되어있음을예상하였다. 13 C-NMR (150 MHz,, δ C ) 또한화합물 5 의데이터와흡사하였으나, 저자장에서 6 개의 [δ C 146.44 (C-3'', 5''), δ C 139.78 (C-4''), δ C 121.37 (C-1''), δ C 110.16 (C-2'', 6'')]carbon signal 과한개의 ester carbon signal (δ C 168.31) 이관측되어 galloyl 기한분자가존재함을예상하였다. 위의데이터를종합하여화합물 6 을 salidroside 의당 6 번에 galloyl 기가결합된 6'-Ogalloylsalidroside 로구조동정하였으며, 14) positive mode 의 ESI-MS 를측정하여 m/z 453.1 [M+H] + 을확인하였다. (+)- catechin 과 (-)-epicatechin 은항산화활성이보고되어있으며, 15) salidroside 는 anti-gastropathic activity 가보고되어있고, 10) 6'-O-galloylsalidroside 또한항산화활성이보고되어있다. 6) 분리한화합물중 feniculin 과 avicularin 은산겨릅나무에서는처음분리된화합물이며, feniculin 은 antiplaque 활성과 16) avicularin 은간보호활성이보고되어있다. 17) RAW 264.7 세포의생존율에대한분리된화합물의효과 MTT assay 를통하여 6 종의화합물의세포독성을확인한결과화합물 1-5 는 100 µm 의높은농도까지세포독성이나타나지않았다. 화합물 6 은 50 µm 의농도까지전혀세포독성이나타나지않았고, 100 µm 의농도에서약간의세포독성이관찰되었다 (Fig. 3). 이로써화합물 1-5 는세포에매우안전하고화합물 6 은 50 µm 의농도까지세포에매우안전한것을알수있었다. 산화질소생성에대한분리된화합물의억제효과 RAW 264.7 대식세포에서산화질소발현에대한화합물 1-6 의억제효과를측정하기위해 6 종의화합물을세포에전처리한후 LPS 를처리하고산화질소의발현량을측정하였다. 양성대조군으로는항염증약물로널리쓰이는덱사메타손 (10 µm) 을사용하였다. Fig. 4 를통하여보면화합물 1 과 6 은고농도 (100 µm) 에서산화질소생성을약하게억제하는효능이관찰되었다. 또한화합물 3 과 4 는 50 과 100 µm 의농도에서산화질소생성을억제하였으며각각통계적유의성을관찰 Fig. 3. The cytotoxicity of six compounds on RAW 264.7 macrophage cells at different doses (10, 30, 50 and 100 µm) was evaluated by an MTT assay.

Vol. 45, No. 2, 2014 99 Fig. 4. Suppressive effect of six compounds on NO production by LPS stimulation. RAW 264.7 cells were pretreated with six compounds for 30 min before incubation with LPS for 24 hours. The culture supernatant was analyzed for nitrite production. As a control, the cells were incubated with vehicle alone. Data shows mean±se values of triplicate determination from independent experiments. *p<0.01 and **p<0.001 were calculated from comparing with LPS-stimulation value. 할수있었다. 그러나화합물 2 와 5 는 LPS 로유도된산화질소의생성에대해조금의억제효과도나타내지않았다. 결 산겨릅나무 (Acer tegmentosum) 의 EtOAc 와 n-buoh 층추출물에포함된 feniculin(1), avicularin(2), (+)-catechin(3), (-)- epicatechin(4), salidroside(5), 6'-O-galloylsalidroside(6) 을컬럼크로마토그래피를이용하여순수물질을분리하여구조동정하였다. 이결과, 화합물 1 과 2 는산겨릅나무에서처음분리되었으며순수화합물 1-6 에대하여 RAW 264.7 대식세포에서산화질소생성억제활성을측정한결과, 1, 3, 4, 6 의화합물은높은농도에서미미한활성을보였고, 2 와 5 의화합물에서는산화질소생성억제활성이없는것으로나타났다. 사 본연구는한국한의학연구원의연구지원 (K14050) 에의하여수행되었으며이에감사드립니다. 론 사 인용문헌 1. 김태정 (2008) 한국의야생화와자원식물 3, 211. 서울대학교출판부, 서울. 2. 이정석, 이계한, 오찬진 (2010) 새로운한국수목대백과도감 ( 하 ), 166. 학술정보센터, 서울. 3. 김일훈 (1986) 신약, 79-288. 나무, 서울. 4. 안덕균 (1998) 한국본초도감, 523. 교학사, 서울. 5. Hur, J.-M., Jun, M., Yang, E.-J., Choi, S.-H., Park, J. C. and Song, K. S. (2007) Isolation of isoprenoidal compounds from the stems of Acer tegmentosum Max. Kor. J. Pharmacogn. 38: 67-70. 6. Kim, S., Hur, S. J., Kim, K. H., Gi, K. S. and Whang, W. K. (2012) Antioxidant and anti-inflammatory compounds isolated from Acer tegmentosum. J. Med. Plants Res. 6: 3971-3976. 7. Park, K. M., Yang, M. C., Lee, K. H., Kim, K. R., Choi, S. U. and Lee, K. R. (2006) Cytotoxic phenolic constituents of Acer tegmentosum Maxim. Arch. Pharm. Res. 29: 1086-1090. 8. Kwon, D.-J., Kim, J.-K. and Bae, Y.-S. (2011) DPPH radical scavenging activity of phenolic compounds isolated from the stem wood of Acer tegmentosum. Mokchae Konghak 39: 104-112. 9. Hong, B. K., Eom, S. H., Lee, C. O., Lee, J. W., Jeong, J. H., Kim, J. K., Cho, D. H., Yu, C. Y., Kwon, Y. S. and Kim, M. J. (2007) Biological activities and bioactive compounds in the extract of Acer tegmentosum Maxim. stem. Kor. J. Med. Crop. Sci. 15: 296-303. 10. Yoo, Y.-M., Nam, J. -H., Kim, M.-Y., Choi, J., Lee. K.-T. and Park, H.-J. (2009) Analgesic and anti-gastropathic effects of salidroside isolated from Acer tegmentosum heartwood. Open Bioact. Compd. J. 2: 1-7. 11. Fraisse, D., Heita. A., Carnat, A., Carnat, A.-P. and Lamaison, J.-L. (2000) Quercetin 3-arabinopyranoside, a major flavonoid compound from Alchemilla xanthochlora. Fitoterapia 71: 463-464. 12. Kim, H. J., Woo, E.-R. and Park, H. (1994) A novel lignin and flavonoids from Polygonum aniculare. J. Nat. Prod. 57:

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