한얼국제특허사무소 서울특별시강남구삼성동 도심공항타워 6 층 ( 우 ) TEL: FAX: 수 신 : 한국과학기술원 참

한얼국제특허사무소 서울특별시강남구삼성동 159-9 도심공항타워 6 층 ( 우 ) 135-973 TEL: 82-2-2016-7900 FAX: 82-2-2016-7905 E-mail : hanol@hanollawip.com 2012.05.07 수 신 : 한국과학기술원 참 조 : 김학성교수님 / 김권변리사님 / 최봉근선생님 / 김대성선생님 / 정주환님 / 이윤기님 발 신 : 한얼국제특허사무소 제 목 : PCT 국제출원완료보고 당소관리번호 : 고객관리번호 : OPA12025/PCT P-07761 권리출원번호출원인 특허 PCT/KR2012/002091 출원일 2012.03.22 한국생명공학연구원 / 한국과학기술원 명칭패혈증단백질치료제의효능분석및스크리닝방법 {Method for Screening Protein Therapeutics for Sepsis Treatment} 발명자 이승구 / 김학성 / 김유정 / 이상철 / 한지은 / 김수진 / 손정훈 / 하재석 우선권주장번호 10-2011-0025446 우선권주장일 2011.03.22 국제예비심사청구마감 국내단계진입마감 2013.01.22 ( 우선일로부터 22개월 ) 2013.09.22 (30개월) 1. 귀원의일익번창하심을기원합니다. 2. 2012.03.22자출원약식보고에이어, 상기 PCT국제출원에대한출원서류및출원번호통지서를송부드리오니업무에참고하시기바랍니다. 3. 추후진행사항은접수하는대로보고드리도록하겠습니다. hsl/rjk/ms 한얼국제특허사무소 대표변리사손민 첨부서류 : 1. 출원번호통지서 2. PCT 출원서류 1 부 1 부끝. Note. 출원인의주소또는명칭 ( 성명 ) 이변경되는경우, 당소로연락을주셔야향후분쟁등의경우에서류송달불능으로인한불이익을방지할수있습니다.

OPA12025PCT PCT 출원서 1/7 출력 ( 전자적형태가원본 ) 0 수리관청전용 0-1 국제출원번호 0-2 국제출원일자 0-3 수리관청명칭및 "PCT 국제출원 " 0-4 서식 PCT/RO/101 - PCT 출원서 0-4-1 우측에기재된바와같이작성되었다. PCT-SAFE 버전 3.51.052.228 MT/FOP 20120101/0.20.5.19 0-5 신청 아래서명인은본국제출원서가특허협력조약에의해처리될것을청구합니다. 0-6 출원인이지정한수리관청 대한민국특허청 (RO/KR) 0-7 출원인또는대리인의서류참조기호 OPA12025PCT I 발명의명칭 패혈증단백질치료제의효능분석및스크리닝방법 II 출원인 II-1 이사람은 오직출원인 II-2 우측지정국에관한출원인 미국을제외한모든지정국 II-4ko 성명 한국생명공학연구원 II-4en Name: KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY II-5ko 주소대한민국 305-806 대전광역시유성구과학로 125 ( 어은동 ) II-5en Address: 125, Gwahak-ro, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-806 Republic of Korea II-6 국적 II-7 거주국 II-11 출원인코드 3-1999-034166-5

OPA12025PCT PCT 출원서 2/7 출력 ( 전자적형태가원본 ) III-1 출원인및 / 또는발명자 III-1-1 이사람은 오직출원인 III-1-2 우측지정국에관한출원인 미국을제외한모든지정국 III-1-4ko 성명 한국과학기술원 III-1-4en Name: KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY III-1-5ko 주소대한민국 305-701 대전광역시유성구대학로 291 ( 구성동 ) III-1-5en Address: III-1-6 국적 III-1-7 거주국 III-1-11 출원인코드 3-1998-098866-1 III-2 출원인및 / 또는발명자 291, Daehak-ro, Guseong-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-701 Republic of Korea III-2-1 이사람은 출원인겸발명자 III-2-2 우측지정국에관한출원인 오직미국만 III-2-4ko 성명 이승구 III-2-4en Name (LAST, First): LEE, Seung Goo III-2-5ko 주소대한민국 305-806 대전광역시유성구어은동 52번지 III-2-5en Address: III-2-6 국적 III-2-7 거주국 III-3 출원인및 / 또는발명자 52, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-806 Republic of Korea III-3-1 이사람은 출원인겸발명자 III-3-2 우측지정국에관한출원인 오직미국만 III-3-4ko 성명 김학성 III-3-4en Name (LAST, First): KIM, Hak Sung III-3-5ko 주소대한민국 305-755 대전광역시유성구어은동한빛아파트 107동 1202호 III-3-5en Address: III-3-6 국적 III-3-7 거주국 107-1202, Hanbit Apt., Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-755 Republic of Korea

OPA12025PCT PCT 출원서 3/7 출력 ( 전자적형태가원본 ) III-4 출원인및 / 또는발명자 III-4-1 이사람은 출원인겸발명자 III-4-2 우측지정국에관한출원인 오직미국만 III-4-4ko 성명 김유정 III-4-4en Name (LAST, First): KIM, Yu Jung III-4-5ko 주소대한민국 305-806 대전광역시유성구어은동 52번지 III-4-5en Address: III-4-6 국적 III-4-7 거주국 III-5 출원인및 / 또는발명자 52, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-806 Republic of Korea III-5-1 이사람은 출원인겸발명자 III-5-2 우측지정국에관한출원인 오직미국만 III-5-4ko 성명 이상철 III-5-4en Name (LAST, First): LEE, Sang Chul III-5-5ko 주소대한민국 305-701 대전광역시유성구구성동한국과학기술원생명과학과 3220호 III-5-5en Address: III-5-6 국적 III-5-7 거주국 3220, Life Science and Bioengineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Guseong-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-701 Republic of Korea

OPA12025PCT PCT 출원서 4/7 출력 ( 전자적형태가원본 ) III-6 출원인및 / 또는발명자 III-6-1 이사람은 출원인겸발명자 III-6-2 우측지정국에관한출원인 오직미국만 III-6-4ko 성명 한지은 III-6-4en Name (LAST, First): HAN, Ji Eun III-6-5ko 주소대한민국 305-701 대전광역시유성구구성동한국과학기술원생명과학과 3220호 III-6-5en Address: III-6-6 국적 III-6-7 거주국 III-7 출원인및 / 또는발명자 3220, Life Science and Bioengineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, Guseong-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-701 Republic of Korea III-7-1 이사람은 출원인겸발명자 III-7-2 우측지정국에관한출원인 오직미국만 III-7-4ko 성명 김수진 III-7-4en Name (LAST, First): KIM, Su Jin III-7-5ko 주소대한민국 305-806 대전광역시유성구어은동 52번지 III-7-5en Address: III-7-6 국적 III-7-7 거주국 III-8 출원인및 / 또는발명자 52, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-806 Republic of Korea III-8-1 이사람은 출원인겸발명자 III-8-2 우측지정국에관한출원인 오직미국만 III-8-4ko 성명 손정훈 III-8-4en Name (LAST, First): SOHN, Jung Hoon III-8-5ko 주소대한민국 305-806 대전광역시유성구어은동 52번지 III-8-5en Address: III-8-6 국적 III-8-7 거주국 52, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-806 Republic of Korea

OPA12025PCT PCT 출원서 5/7 출력 ( 전자적형태가원본 ) III-9 출원인및 / 또는발명자 III-9-1 이사람은 출원인겸발명자 III-9-2 우측지정국에관한출원인 오직미국만 III-9-4ko 성명 하재석 III-9-4en Name (LAST, First): HA, Jae Seok III-9-5ko 주소대한민국 305-806 대전광역시유성구어은동 52번지 III-9-5en Address: III-9-6 국적 III-9-7 거주국 IV-1 대리인또는대표자아래에기재된자는관할국제기관에대하여우측에표시된자격으로출원인을대리하는것으로선임되었다. IV-1-1ko 성명 IV-1-1en Name (LAST, First): IV-1-2ko 주소 IV-1-2en Address: 52, Eoeun-dong, Yuseong-gu, Daejeon 305-806 Republic of Korea 대리인 (agent) 손민 SON, Min 대한민국 135-973 서울강남구테헤란로87길 36, 6층한얼국제특허사무소 ( 삼성동, 도심공항타워 ) IV-1-3 전화번호 82-2-2016-7900 IV-1-4 팩스번호 82-2-2016-7905 IV-1-5 이메일주소 hanol@hanollawip.com IV-1-5(a) 이메일사용동의수리관청, 국제조사기관, 국제사무국, 국제예비심사기관이필요시이이메일주소를사용하여이국제출원과관련하여발행된통지서를송부할것에동의한다. IV-1-6 대리인코드 9-1999-000420-6 V 지정국 V-1 본출원서의제출로, 규칙 4.9(a) 에따라, 부여될수있는모든종류의권리보호를위하여, 그리고해당하는경우지역특허및국내특허모두를위하여당해국제출원일에 PCT에기속되는모든체약국이지정된다. V-2 V-2란은출원서제출시또는규칙 26의2.1에의해그이후출원서제6기재란에위특정관련체약국의국내선출원에대한우선권주장이포함되어있을경우당해체약국의국내법에의해해당국내선출원의효력이상실되는것을방지하기위한목적으로당해체약국의지정을제외하는데에만사용될수있다 ( 지정제외시이의취소불가능 ). KR Hanol Intellectual Property & Law 6th Floor, City Air Tower, 36, Teheran-ro 87 gil, Samsung-dong, Gangnam-gu, Seoul 135-973 Republic of Korea 서면통지서에앞서선람용사본송부

OPA12025PCT PCT 출원서 6/7 출력 ( 전자적형태가원본 ) VI-1 선국내출원에대한우선권주장 VI-1-1 출원일 2011년 03월 22일 (22.03.2011) VI-1-2 출원번호 10-2011-0025446 VI-1-3 국가 KR VI-2 VI-3 우선권주장요청 수리관청에대하여위에명시된선출원의인증등본을준비하여국제사무국에송부하여줄것을신청한다. 인용에의한보완 VI-1 조약제11조 (1)(iii)(d) 또는 (e) 에서규정하는국제출원의요소, 또는규칙 20.5(a) 에서규정하는명세서, 청구범위또는도면의일부가본국제출원에는포함되어있지않지만조약제11조 (1)(iii) 규정의요소중하나이상이수리관청에최초로접수된날에우선권주장의기초가된선출원에완전히포함되어있는경우, 그요소또는부분은규칙 20.6 규정에의한확인을조건으로, 규칙 20.6의규정과관련하여본국제출원에있어서인용에의해보완된다. VII-1 국제조사기관 (ISA) 선택 대한민국특허청 (ISA/KR) VIII 선언서 선언서개수 VIII-1 발명자의동일성에관한선언 - VIII-2 국제출원일에특허출원및특허를받을수있는출원인의자격에관한선언 - VIII-3 국제출원일에선출원의우선권을주장할수있는출원인의자격에관한선언 - VIII-4 발명자선언 ( 미국에대한지정의경우에한함 ) - VIII-5 신규성을해치지아니하는개시또는신규성상실의예외에관한선언 - IX 체크리스트 용지수 전자적파일첨부 IX-1 출원서 ( 선언서포함 ) 7 IX-2 명세서 14 IX-3 청구범위 3 IX-4 요약서 1 IX-5 도면 6 IX-7 용지매수소계 31 첨부항목 서면첨부 전자적파일첨부 IX-8 수수료계산용지 - IX-9 개별위임장원본 - IX-18 PCT-SAFE 전자출원매체 - - IX-20 요약서에수반되어야할도면번호 1 IX-21 국제출원의출원언어 한국어 X-1 출원인, 대리인또는대표자의서명또는날인 X-1-1 X-1-2 X-1-3 성명서명인의성명권한 ( 출원서를통해서명자의자격이명백하지않은경우에는그자격도표시 )

OPA12025PCT PCT 출원서 7/7 출력 ( 전자적형태가원본 ) 수리관청전용 10-1 국제출원으로제출된서류의실제접수일 10-2 10-2-1 도면 접수 10-2-2 미접수 10-3 국제출원으로제출된서류를완성하는 서류또는도면의추후기간내제출에 따른정정된실제접수일 10-4 PCT 제11조 (2) 에따라제출이요구된 보완서로서기간내제출된보완서의 접수일 10-5 국제조사기관 (ISA) ISA/KR 10-6 조사료납부시까지지연된조사용사본의 송부 11-1 국제사무국의기록원본접수일 국제사무국전용

OPA12025PCT 1/1 PCT( 부속문서 - 수수료계산용지 ) 출력 ( 전자적형태가원본 ) 이페이지는국제출원서의일부가아니며페이지수에포함되지않는다 0 수리관청전용 0-1 국제출원번호 0-2 수리관청의우편소인일자 0-4 Form PCT/RO/101 ( 부속문서 ) PCT 수수료계산용지 0-4-1 우측에기재된바와같이작성되었다. PCT-SAFE 버전 3.51.052.228 MT/FOP 20120101/0.20.5.19 0-9 출원인또는대리인의서류참조기호 OPA12025PCT 2 출원인 한국생명공학연구원 12 규정수수료계산 수수료금액 / 계수 총금액 (KRW) 12-1 송달료 T 45000 12-2-1 조사료 S 450000 12-2-2 국제조사기관 KR 12-3 국제출원수수료최초 30 장 i1 1716000 12-4 최초 30 장초과장수 1 12-5 최초 30 장초과 1 장당추가수수료 (X) 19000 12-6 총추가금액 i2 19000 12-7 i1 + i2 = i 1735000 12-12 XML 전자출원감면 R -387000 12-13 총국제출원수수료 (i-r) I 1348000 12-14 우선권서류에대한수수료 우선권서류를요청한개수 1 12-15 문서별수수료 (X) 0 12-16 총우선권서류수수료 P 12-17 우선권주장회복에대한수수료 RP 우선권주장회복에대한요청개수 0 우선권회복에대한수수료총금액 12-19 총금액 (T+S+I+P+RP) 1843000 12-21 결제방법현금

1 명세서 발명의 명칭: 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 및 스크리닝 방법 [1] [2] [3] [4] [5] 기술분야 본 발명은 LRR(Leucine rich repeat) 모듈의 반복적 조합에 의하여 구성된, LRR 단백질의 패혈증 저해 단백질 치료제로서의 효능을 분석하고, 서열변이 라이브러리로부터 우수한 저해효능을 보이는 단백질 치료제를 스크리닝하는 어세이 시스템의 구축에 관한 것이다. 보다 구체적으로, LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주를 이용한 어세이 시스템에 정제된 MD-2 단백질을 첨가하는 단계를 포함하는 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법 또는 스크리닝 방법, THP-1 세포주에 정제된 MD-2 단백질을 첨가하는 단계를 포함하는 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법 또는 스크리닝 방법, 상기 효능 분석용 또는 스크리닝용 세포주, 상기 세포주 및 정제된 MD-2를 포함하는 패혈증 치료제 스크리닝용 또는 효능 분석용 키트에 관한 것이다. 배경기술 중증패혈증 환자는 미국에서만 해마다 천만명 이상 발생하고 있으며 1979년부터 2000년까지 약 3배 이상 증가된 것으로 보고되고 있다. 패혈증은 세균의 감염에 의해 발생하는 면역 과민반응에 의해 야기되며, 혈전의 생성과 다발성 장기부전, 높은 치사율(60%)등을 특징으로 하는 생명에 매우 위협적인 질환이다. 패혈증의 가장 주요한 병인원은 그람음성 세균의 세포막을 구성하고 있는 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)이며, 혈액에 감염된 세균의 LPS를 면역세포가 인지하면서 면역반응이 시작되는 것으로 알려져 있다. 인체의 면역 세포 표면에는 선천성 면역(innate immunity)을 담당하는 TLR(toll-like receptor)들이 존재하며, LPS는 이러한 TLR들 중에서 TLR4를 통해서 신호를 전달하고 사이토카인을 분비하여 면역반응을 야기한다. 이는 인체의 정상적인 면역반응이지만, 질환이나 극심한 스트레스 등으로 면역력이 급격히 저하된 사람에서는 과다한 면역반응의 진행이 중증 패혈증으로 이어질 수 있다. 하지만 LPS는 선천성 면역 수용체 중의 하나인 TLR4에 직접 결합하는 능력이 없으며, MD-2(Myeloid differentiation protein-2)를 매개로 TLR4와 MD-2의 복합체에 결합하여 세포 신호 전달을 개시하는 것으로 알려져 있다. 따라서 최근에는 TLR4, MD-2, 또는 TLR4/MD-2 복합체를 타겟으로 하여 LPS 신호 전달을 차단하는 패혈증 치료제 개발에 많은 연구가 진행되고 있다. 현재까지 FDA의 승인을 받고 시판되고 있는 패혈증 치료제는 Eli Lilly사의 지그리스(Xygris) 한 종류뿐이며, 이는 혈전을 억제하는 자연 혈액물질인 재조합 APC(activated protein C)로 대략 15%의 중증 패혈증 환자의 목숨을 구할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 일본의 Eisai사는 패혈증 치료를 목적으로 MD-2에

2 [6] [7] [8] 경쟁 결합하는, LPS와 유사한 구조의 에리토란(eritoran)을 개발하여 2009년 말 임상 3상에 돌입한 것으로 보고하고 있다. 물론 이외에도 수많은 제약회사들에서 항체를 포함하는 치료제들을 개발하여 임상시험에 돌입하였으나, 대부분 효과가 없거나 미약한 수준에 그치는 등 좋은 결실을 거두지 못하고 있다(Triantafilou et al., Expert Rev. Mol. Med. 24;6(4):1-18, 2004). 한편 LPS 신호 전달에 중요한 단백질들인 LBP와 CD14, MD-2, 그리고 가용성 TLR4(soluble TLR4, stlr4)는 각각 LPS에 의한 신호 전달을 저해하는 효과가 있는 것으로 알려져 있어 이들을 이용한 패혈증 치료제의 개발이 기대되고 있다. 그 중 stlr4와 MD-2의 복합체는 LPS 신호 전달을 저해하는 효과가 매우 우수한 것으로 알려져 있는데, 이는 단독으로 존재할 경우 비기능성 복합체(non-functional complex)를 잘 형성하는 MD-2가 stlr4와 결합하면서 구조적으로 안정화되고, 결과적으로 LPS와 결합이 가능한 stlr4/md-2가 면역세포 표면의 TLR4/MD-2 복합체와 LPS 결합을 경쟁하는 원리로 LPS 신호를 저해하게 된다(Mitsuzawa et al., J. Immunolo., 177:8133-8139, 2006; Brandl et al., J. Endotoxin Res., 11:197-206, 2005). 또한 CD14과 MD-2, 그리고 TLR4/MD-2 복합체의 LPS에 대한 결합력(Kd)은 각각 30 nm과 65 nm, 3 nm로 보고되고 있는데, 이러한 결합력의 차이로 인해 CD14 및 MD-2에 비해 stlr4/md-2 복합체가 우수한 LPS 제거효과를 보이는 것으로 보고되어 있다(Akashi et al., J. Exp. Med., 198(7):1035-1042, 2003). 하지만 stlr4는 세포막 단백질이 가지는 불용성 발현의 특징 및 거대한 분자량으로 인해 생산이 쉽지 않은 단점이 있다. 이를 해결하기 위해 TLR4의 MD-2 결합부위 단편에 먹장어의 림프구 수용체 단백질(variable lymphocyte receptor, VLR)의 단편을 융합시킨 TV3 단백질을 단독으로(MD-2없이) 실험동물(마우스)에 처리하여 패혈증 저해 효능을 관찰한 예가 있다(PLoS ONE, 4:e7403, 2009). 이러한 TV3 융합 단백질은 TLR4와 같이 루이신이 일정한 패턴으로 반복되는 LRR(leucine rich repeat) 패밀리의 단백질들을 조합하는하이브리드 LRR 기술로 만들어진 단백질 치료제로, 패혈증 치료제 개발뿐만 아니라 항체를 대체할 새로운 단백질 골격 연구에 새로운 청사진을 제시하고 있다. 한편 패혈증은 선천성 면역에 의한 신호 전달로부터 개시하여 진행되는 면역 과민반응의 결과이므로, 패혈증의 치료를 목적으로 연구되는 치료제들은 면역세포 기반의 신속한 효능 분석과정이 요구된다. 즉 패혈증 저해효능을 보이는 단백질 치료제들은 LPS 신호 전달이 가능한 세포 기반의 어세이 시스템을 필요로 하는 바, 본 발명에서는 LPS 신호 전달이 가능한 HEK293 세포주에 활성화된 NF-κB에 의해 발현이 개시되는 반딧불이 루시퍼레이즈 유전자를 도입하여, LRR 단백질 치료제에 의해 LPS신호가 차단되는 효능을 확인할 수 있는 세포기반 어세이 시스템을 구축하고자 하였다. 또한 대식세포로 분화시킨 THP-1에 LPS를 처리하여 분비된 사이토카인을 확인하는 방법으로,

3 [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] 첨가한 단백질 치료제에 의해 LPS 신호가 차단되는 효과를 확인할 수 있는 세포기반 분석 시스템을 구축하고자 하였다. 그러나 위 두 세포모델의 경우 LPS 신호 전달에 필요한 TLR4 및 MD-2가 생산되는 균주임에도 불구하고, stlr4나 TV3, 또는 하이브리드 LRR 기술로 만들어지는 단백질 치료제들을 단독으로(MD-2없이) 사용하는 경우에 LPS 신호를 차단하는 효과를 나타내지 않는 단점이 있었다. 발명의 상세한 설명 기술적 과제 이러한 배경 하에, 본 발명자들은 LPS 신호 전달을 차단하는 단백질 치료제를 스크리닝 및 효과를 신속하게 분석할 수 있는 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 세포기반 어세이에 정제한 MD-2를 함께 제공하는 경우에만 MD-2가 stlr4와 TV3, 또는 LRR단백질과 안정적인 복합체를 형성하여 LPS를 포획하고 신호 전달을 감소시키는 등, 정제한 MD-2를 외부에서 첨가하는 세포기반 어세이 방법이 단백질 치료제의 효능분석과 탐색에 효과적 방법임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. 과제 해결 수단 본 발명의 목적은 세포 기반 어세이 시스템에 MD-2를 제공하여 LPS 신호 전달을 차단하는 패혈증 치료제의 효능 분석방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 하나의 목적은 세포 기반 어세이 시스템에 MD-2를 제공하여 LPS 신호 전달을 차단하는 패혈증 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다. 발명의 효과 본 발명에 따른 세포기반 어세이 시스템은 MD-2와 결합하여 구조적 안정성을 유지시켜주어, LPS의 포획이 가능하도록 하는 단백질 치료제의 효능 분석 및 탐색에 유용하게 사용될 수 있다. 도면의 간단한 설명 도 1은 LPS 신호 전달 과정 및 본 발명에 따른 세포기반 단백질 치료제의 효능 분석 방법에 관한 도면이다. A: 루시퍼레이즈 리포터를 이용한 세포기반 단백질 치료제의 효능 분석 방법, B: 면역세포 기반 TNF-α의 ELISA 확인을 이용한 단백질 치료제의 효능 분석 방법을 나타낸다. 도 2는 LPS와 결합하고 있는 TV3/MD-2 복합체의 X-ray 결정구조를 보여주는 도면이다. 도 3은 LPS 신호 전달로 활성화된 NF-κB에 의해 발현이 개시되는 반딧불이

4 [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] 루시퍼레이즈 리포터 벡터(Invivogen사)와, 레닐라 루시퍼레이즈를 발현하는 내부표준 벡터(Promega사)의 개열지도를 나타낸 도면이다. A: 반딧불이 루시퍼레이즈 리포터 벡터의 개열지도, B: 레닐라 루시퍼레이즈를 발현하는 내부표준 벡터의 개열지도를 나타낸다. 도 4는 TLR4/MD-2/CD14이 세포표면에 발현된 HEK293 모델세포에 루시퍼레이즈 벡터들을 도입하여, LPS 저해제, 또는 길항제 등에 의한 신호 전달 차단효과를 확인하는 세포기반 어세이 방법의 타당성을 보여주는 도면이다. A: Polymyxin B에 의한 LPS 신호 전달 저해효과, B: LPS-RS에 의한 LPS 신호 전달 저해효과를 나타낸다. 도 5는 TLR4/MD-2/CD14이 세포표면에 발현된 HEK293 모델세포에 루시퍼레이즈 벡터들을 도입하는 세포기반 어세이 방법에서, MD-2의 공급이 단백질 치료제의 효능에 미치는 영향을 분석한 도면이다. 도 6은 PMA를 처리하여 분화시킨 THP-1 세포에 LPS 저해제인 polymyxin B를 처리하여, 배지로 분비되는 TNF-α 사이토카인 양의 감소를 ELISA로 확인하는 세포기반 어세이 방법의 타당성을 보여주는 도면이다. 도 7은 분화시킨 THP-1 세포의 TNF-α 사이토카인 분비량을 ELISA로 확인하는 세포기반 어세이 방법에서, MD-2의 공급이 단백질 치료제의 효능에 미치는 영향을 분석한 도면이다. 발명의 실시를 위한 최선의 형태 상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) LPS(lipopolysaccharide) 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터, 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 도입하는 단계; (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 단백질 치료제들을 미리 섞어서 준비하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 단백질 치료제와 접촉된 실험군이 비교하고자 하는 단백질 치료제와 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 실험군의 패혈증 단백질 치료제의 기능이 대조군의 패혈증 단백질 치료제보다 효능이 좋은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법을 제공한다. 또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게

5 [28] [29] [30] 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 도입하는 단계; (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 치료제 후보물질을 함께 또는 패혈증 치료제 후보물질 없이 미리 섞는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 후보물질과 접촉시킨 실험군이 후보물질과 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 후보물질을 패혈증 치료제라고 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 방법은 바람직하게는 반딧불이 루시퍼레이즈를 기반으로 하는 단백질 치료제의 효능 분석 또는 스크리닝을 하는 방법으로서, LPS 신호 전달 수용체인 TLR4와 MD-2, CD14이 표면에 발현된 HEK293세포에 루시퍼레이즈 발현벡터와 레닐라 루시퍼레이즈 발현벡터를 동시에 도입하여, LPS 신호전달로 활성화된 NF-κB에 의해서 발현이 개시되는 반딧불이 루시퍼레이즈의 활성수준을 일정수준으로 상시 발현되는 레닐라 루시퍼레이즈의 활성과 비교하여 NF-κB에 의한 활성 증가분을 비교 분석하는 방법이다. 이와 같은 본 발명의 효능 분석 또는 스크리닝 방법의 대략적인 모식도를 도 1A에 나타냈다. 본 발명에서 용어, "LPS 신호 전달 수용체"란 LPS의 신호 전달에 필요한 수용체로서 세포 표면에 발현되는 단백질로서, 패혈증 발생에 있어서 그 원인이 되는 LPS 신호 전달을 매개하는 수용체는 제한 없이 포함되나, 그 예로 CD14, MD-2, TLR4 등이 있을 수 있다. 본 발명에서 용어, "LPS(lipopolysaccharide)"란 지질(lipid)과 탄수화물(polysaccharide)의 공유결합 거대분자로, 그람음성 세균의 세포막을 구성하는 성분이다. 이는 endotoxin으로도 불리며 동물의 면역체계에 작용하여 강한 면역반응을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 면역세포에서 선천성 면역을 담당하는 TLR(toll-like receptor)들 중에서 TLR4/MD-2 복합체에 결합하여 면역반응을 유발하는 것으로 보고되어 있다. 즉 LPS 신호 전달이 과다하게 이루어진 경우, 면역과민 반응에 의해 패혈증을 일으키게 된다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명의 세포 기반 어세이 시스템을 사용할 경우, 정제된 MD-2를 추가하지 않은 시스템에 비해 MD-2를 외부에서 추가하였을 경우에 효과적으로 패혈증 단백질 치료제가 LPS 신호 전달을 유의미하게 저해하는 것을 확인하였으며(도 5 및 7), 이와 같이 패혈증 치료제의 효능 분석 또는 스크리닝을 하기 위한 시스템은 패혈증 단백질 치료제 또는 후보물질(LRR 단백질)만을 처리하여 확인하는 것이 아닌, 정제한 MD-2를 외부에서 첨가하여 분석하는 경우에 정확도가 높다는 것에 기초한 것이다. 본 발명의 일 실시예에서 사용된 단백질 치료제인 TV3와 MD-2의 복합체가 LPS와 결합한 구조는 도 2에서 확인되며, MD-2는 TLR4와 결합한 상태에서 LPS에 대한 친화력이 증가(Akashi et al., J. Exp. Med., 198(7):1035-1042, 2003)하므로 단백질 치료제의 효능 분석 또는 새로운 단백질 치료제인 LRR 패밀리 단백질을 스크리닝하기 위해서는 정제 단백질 MD-2의 제공이 바람직하다.

6 [31] [32] [33] [34] [35] 본 발명에서 용어, "CD14(cluster of differentiation 14)"란 면역세포에서 분비되거나, 세포표면에 발현된 단백질로 선천성 면역에서 다양한 기능을 수행하며, TLR4/MD-2 복합체에 LPS가 잘 결합하도록 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 본 발명에서 용어, "MD-2(Myeloid differentiation protein-2)"란 lymphocyte antigen 96으로도 불리며 LPS와 65 nm의 친화력(Kd)을 보이는 당단백질로서, 면역세포의 표면에서 TLR4와 함께 복합체를 형성하며, LPS와 결합하여 세포내 신호 전달이 가능하도록 하는 LPS와 TLR4 사이를 매개하는 단백질이다. 본 발명에서 용어, "TLR4(Toll-like receptor 4)"란 면역세포 표면에 발현되어 선천성 면역 기능을 수행하는 TLR(toll-like receptor)들 중의 하나로 CD284(cluster of differentiation 284)로 불리기도 한다. 면역세포 표면의 TLR4는 MD-2와 복합체를 이룬 상태에서 MD-2를 매개로 LPS와 복합체를 형성하고, 이렇게 만들어진 TLR4/MD-2/LPS의 복합체는 다시 이량체(dimer)를 형성하며 세포 내부의 신호 전달을 개시한다. LPS의 신호 전달은 NF-κB와 결합하고 있는 IκB(inhibitor of NF-κB)를 인산화시키고, IκB로부터 해제된 NF-κB 전사인자는 핵으로 이동하여 다양한 사이토카인들의 전사에 관여하며, 최종적으로는 전염증성(proinflammatory) 사이토카인을 분비하는데 중요한 역할을 한다. 이와 같이, LPS 신호 전달은 NF-κB 전사인자를 핵으로 이동시키기 때문에 본 발명의 어세이 시스템의 일 실시예에서는 NF-κB 결합 모티프를 프로모터에 결합시킨 벡터를 이용하여 효율적으로 패혈증 단백질 치료제의 효능을 분석 또는 스크리닝할 수 있다. 상기 LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현되는 세포는 본 발명의 어세이 시스템에 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 HEK293 세포주에 LPS 신호전달이 가능하도록 CD14과, MD-2, TLR4 등의 LPS 수용체들이 모두 발현되도록 한 세포주(stable cell line)일 수 있다. LPS 신호전달 기능을 유지하면서 안정된 계대배양이 가능하고, 반딧불이 루시퍼레이즈 리포터 벡터의 세포내 도입이 용이한, 본 발명에서 목적하는 세포기반 어세이 시스템의 구축에 적합한 세포주는 제한 없이 포함되며, LPS 수용체들의 발현은 각 단백질들의 유전자 발현이 가능한 벡터들의 세포내 도입으로도 가능하나, 재현실험에 의한 안정된 결과를 얻기 위해서는 CD14과 MD-2, TLR4가 모두 발현된 지속 가능한 세포주를 선별하여 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에서는 CD14과 MD-2, TLR4가 모두 발현되며 안정된 계대배양이 가능한 세포주인 HEK293/hTLRA-MD2-CD14(Invivogen, USA)을 이용하였다. 본 발명에서 용어, "NF-κB 결합 모티프"란 NF-κB 전사인자와 결합하여 상기 모티프와 연결된 프로모터가 작동하여 다운스트림에 존재하는 유전자의 발현이 이루어질 수 있게 하는 모티프를 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는 목적하는 세포기반 어세이를 위하여 "NF-κB 결합 모티프"를 포함하는 반딧불이 루시퍼레이즈 벡터(Invivogen, USA)와 일정수준으로 상시 발현되는 레닐라

7 [36] [37] [38] [39] 루시퍼레이즈 벡터(Promega, USA)를 동시에 세포내로 도입하여 이용하였다. 본 발명의 상기 각 (a) 단계의 LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로 도입하는 NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 중 NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터는 상기 LPS 신호 전달에 의해 IκB로부터 해제된 NF-κB 전사인자가 결합하여 다운스트림에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질을 발현하게 하며, NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터는 LPS 신호 전달을 포함한 다양한 외부 인자(예를 들어, NF-κB 전사인자 등)와 무관하게 발현되는 프로모터로서, 다운스트림에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질을 발현하게 된다. 바람직하게는 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터는 HSV-TK프로모터를 사용할 수 있으나, 당업계에 사용되는 프로모터는 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명에서 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은, 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되면 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편의 영향을 받지만, 이들 핵산 단편의 여러 가능한 결합 조합 중에서 각 단편이 그 기능을 수행하는데 있어 검출할 만한 영향이 없는 상태의 결합을 의미한다. 즉, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 작동가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다. 상기 (a) 단계의 리포터 단백질은 각각 서로 다른 단백질로, 구별할 수 있는 리포터 단백질은 다양하게 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 그 예로 녹색 형광 단백질(GFP), CAT(CM acetyl transferase), β-갈락토시데이즈 (β-galactosidase), SEAP(secreted alk-phosphate), 반딧불이 루시퍼레이즈, 또는 레닐라 루시퍼레이즈일 수 있다. 바람직하게는 반딧불이 루시퍼레이즈 및 레닐라 루시퍼레이즈 일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 반딧불이 루시퍼레이즈를 코딩하는 유전자를 작동가능하게 연결한 벡터(도 3A) 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터인 HSV-TK 프로모터에 레닐라 루시퍼레이즈를 코딩하는 유전자를 작동가능하게 연결한 벡터(도 3B)를 사용하였다. 상기 HSV-TK 프로모터에 레닐라 루시퍼레이즈를 코딩하는 유전자를 작동가능하게 연결한 벡터는 LPS 신호 전달과 무관하게 HSV-TK 프로모터에 의해 발현이 유지되므로 반딧불이 루시퍼레이즈의 대조군으로 적합하다. 본 발명에서 용어, "도입"이란 형질전환 또는 형질도입에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질전환은 염화칼슘(CaCl2) 침전법, CaCl2 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인

8 [40] [41] [42] [43] Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로 박테리아 매개된 형질전환법, 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 미세주입법(microinjection), 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등의 당업계에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 (a) 단계의 각 벡터가 도입된 세포주가 LPS 저해제인 polymyxin B 및 길항제인 LPS-RS 처리에 의해 루시퍼레이즈의 상대적 활성 감소를 관찰하여(도 4A 및 4B), 본 발명의 상기 세포주가 LPS 저해제, 즉 패혈증 치료제의 효능 분석 또는 스크리닝에 적합한 세포임을 확인하였다. 본 발명에서 용어, "단백질 치료제"란, 면역세포 표면의 TLR4/MD-2 복합체에 LPS가 결합하여 면역반응이 진행되는 것을 방해할 목적으로 제공되는 단백질들로, 단독으로 존재하는 경우 불용성 복합체를 잘 형성하는 MD-2에 결합하여 MD-2가 LPS에 결합 가능한 구조를 유지하도록 도움을 주는 기능을 수행하며, TLR4의 세포외부 도메인으로 구성된 가용성 TLR4(soluble TLR4, stlr4), 또는 하이브리드 LRR 기술로 만들어진 TV3 단백질, 또는 TLR4와 유사한 계열의 LRR 단백질 단편들이 융합된 형태의 하이브리드 LRR 단백질 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 반복단백질 TV3, 또는 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, 인공항체단백질인 InlB-VLR 패밀리 중 In-VLR5-c일 수 있다(대한민국특허 출원번호 10-2010-0086055). 이와 같은 단백질 치료제는 LRR 모듈의 반복적 조합에 의하여 구성된, LRR 단백질 또는 서열변이 라이브러리로부터 선택될 수 있으며, 패혈증 치료제 후보물질도 유사하게 선별될 수 있다. 아울러, 본 발명에서 용어, "패혈증 치료제 후보물질"이란 LPS 신호 전달을 저해하여 패혈증을 치료할 수 있도록 하는 물질을 의미하며, 화합물, 효소, 단백질 또는 핵산 등을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 면역세포 표면의 TLR4/MD-2 복합체에 LPS가 결합하여 면역반응이 진행되는 것을 방해할 목적으로 제공되는 단백질일 수 있다. 본 발명의 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법은 (b) MD-2, LPS 및 효능을 비교하고자 하는 패혈증 단백질 치료제들을 각각 미리 섞어서 준비한 후, 준비된 혼합액을 각각 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시킨 후, 비교하고자 하는 단백질 치료제를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 실험군의 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 실험군의 패혈증 단백질 치료제의 기능이 대조군의 패혈증 단백질 치료제보다 단백질 치료제로서의 효능이 좋은 것으로 판단하여 수행될 수 있다. 즉, MD-2, LPS 및 효능을 비교하고자 하는 패혈증 단백질 치료제를 혼합한 혼합액과 접촉시킨 실험군과 MD-2, LPS 및 실험군과 다른 패혈증 단백질

9 [44] [45] [46] [47] [48] [49] 치료제를 혼합한 혼합액을 접촉시킨 세포군을 대조군으로 이용할 수 있다. 이와 같은 효능 분석 방법은 패혈증 단백질 치료제로 선별된 패혈증 단백질 간의 기능 분석 또는 이미 알려진 패혈증 단백질 치료제가 실제적으로 LPS 신호전달을 차단하는지 여부를 판단하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 패혈증 치료제의 스크리닝 방법은 MD-2, LPS 및 패혈증 치료제 후보물질을 함께 또는 패혈증 치료제 후보물질 또는 MD-2 단독으로, LPS와 미리 섞어서 준비한 후, 준비된 혼합액을 각각 (a) 단계의 세포주에 접촉시킨 후, 패혈증 치료제 후보물질과 MD-2를 동시에 접촉시킨 실험군의 리포터 단백질의 발현양이 패혈증 치료제 후보물질 단독, MD-2 단독 및 LPS만 접촉시킨 대조군의 리포터 단백질의 발현양 보다 적은 경우, 패혈증 치료제 후보물질이 패혈증 치료제라고 판단하여 수행될 수 있다. 상기 (d) 단계의 단백질 치료제와 MD-2를 함께 접촉시킨 실험군이 비교하고자 하는 단백질 치료제를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 실험군이 패혈증 단백질 치료제로서의 기능이 우수한 것으로 판단하는 단계 또는 단백질 후보물질과 접촉시킨 실험군이 후보물질과 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 패혈증 치료제 후보물질을 패혈증 치료제라고 판단하는 단계는 바람직하게는 NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값을 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값으로 나눈 값(즉, 상대적 발광값)을 비교하여, 대조군에 비해 낮은 경우, 패혈증 단백질 치료제의 효능이 좋은 것으로 판단하거나, 후보물질이 패혈증 치료제라고 판단하는 방법에 의해서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 기존의 패혈증 단백질 치료제의 상대적 리포터 단백질의 발현양을 비교하여 보다 우수한 패혈증 단백질 치료제의 효능을 분석할 수 있으며, 또한 패혈증 치료제 후보물질 중에서 손쉽고 빠르게 치료제를 스크리닝할 수 있다. 또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) THP-1 세포주를 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 분화시키는 단계; (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 단백질 치료제들을 미리 섞어서 준비하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 패혈증 단백질 치료제와 접촉시킨 실험군이 비교하고자 하는 패혈증 단백질 치료제를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 TNF-α를 분비하는 양이 적은 경우, 상기 실험군이 패혈증 단백질 치료제로서의 기능이 대조군의 패혈증 단백질 치료제보다 효능이 좋은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법을 제공한다. 또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) THP-1 세포주를 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 분화시키는 단계; (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및

10 [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] 패혈증 치료제 후보물질을 함께 또는 패혈증 치료제 후보물질 및 MD-2 단독으로 LPS와 미리 섞는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 MD-2와 후보물질이 동시에 섞여 있는 혼합액과 접촉된 실험군이 후보물질과 접촉되지 않은 대조군 및 후보물질 및 MD-2 단독으로 LPS와 혼합된 대조군에 비해 TNF-α를 분비하는 양이 적은 경우, 상기 후보물질을 패혈증 치료제라고 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 THP-1을 이용한 방법의 대략적인 모식도는 도 1B에 나타낸 바와 같다. 본 발명의 목적상 상기 TNF-α는 LPS 신호 전달에 의해 증가되는 NF-κB 전사인자의 결합에 의해 발현이 증가되는 사이토카인으로 교체될 수 있다. 본 발명에서 용어, "THP-1"은 인간의 단핵구 유래 대식세포의 속성을 가진, 면역세포화학 분석(immunocytochemical analysis)에 폭넓게 사용하는 세포주로, 장기간의 계대배양이 가능하며 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 또는 비타민 D3에 의해 쉽게 대식세포로 분화되는 특징이 있다. 특히 LPS 수용체 단백질들이 표면에 발현되어 있는 단핵구의 세포모델로 많이 사용되는, 본 발명에서 목적하는 세포기반 어세이 시스템의 구축에 적합한 세포주이다. 단백질 치료제 또는 후보물질은 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 (d) 단계의 TNF-α의 분비는 당업계에 공지된 단백질의 발현양을 분석하는 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 배지에 분비된 TNF-α의 양을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 측정하는 것에 의해 수행될 수 있다 본 발명의 일 실시예에 따르면, PMA로 분화시킨 THP-1 세포에 LPS 저해제인 polymyxin B를 첨가한 경우에 TNF-α 분비가 줄어드는 것을 확인하여(도 6), 본 발명의 THP-1 세포주가 LPS 저해제, 즉 패혈증 치료제의 효능 분석 또는 스크리닝에 적합한 세포임을 확인하였다. 또한, MD-2를 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, 인공항체단백질인 InlB-VLR(대한민국특허 출원번호 10-2010-0086055)과 함께 처리한 경우에 단백질 치료제인 InlB-VLR이 TNF-α의 분비를 유의미하게 줄어들도록 하는 것을 확인하여(도 7), 본 발명의 상기 세포주 및 어세이 시스템이 패혈증 치료제의 효능 분석 또는 스크리닝에 사용될 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 상기 세포주 및 MD-2를 포함하는 패혈증 치료제 효능 분석 방법 또는 패혈증 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다. 또 하나의 양태로서, 본 발명은 LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로서, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가

11 [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터가 도입된 패혈증 치료제 효능 분석용 또는 스크리닝용 세포주를 제공한다. 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 세포주 및 MD-2를 포함하는 패혈증 치료제 효능 분석용 또는 패혈증 치료제 스크리닝용 키트를 제공한다. 본 발명의 목적상 상기 키트에는 세포주의 배양에 필요한 배지, 사용방법을 설명한 설명서가 포함될 수 있다. 또 하나의 양태로서, 본 발명은 LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터가 도입된 세포주의 패혈증 치료제 효능 분석 또는 스크리닝에 사용되는 용도를 제공한다. 발명의 실시를 위한 형태 본 발명에서 제공하는 단백질 치료제들의 효능 분석 또는 스크리닝 방법은 LPS 수용체들이 표면에 발현된 세포주들을 이용하여 LPS 신호 전달에 의한 반딧불이 루시퍼레이즈의 발광값, 또는 TNF-α 사이토카인의 분비량 등을 정량적으로 분석하는 방법이다. 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다. 실시예 1: TLR4와 MD-2, CD14이 세포표면에 발현된 HEK293 세포와 루시퍼레이즈 리포터들을 이용한 세포기반 어세이 방법의 구축 본 발명자들은 반딧불이 루시퍼레이즈 리포터 벡터인 pnifty-luc (Invivogen)와 대조군으로 레닐라 루시퍼레이즈 발현벡터인 prl-tk(promega)를 이용하여, 도 1A와 같이 LPS에 의한 TLR4-MD-2 수용체의 활성화 여부를 확인할 수 있는 시스템을 하기와 같이 구축하였다. 본 발명에 사용된 반딧불이 루시퍼레이즈 발현벡터(pNiFty-Luc)는 LPS 신호 전달에 의해 루시퍼레이즈 유전자의 발현이 개시될 수 있도록 NF-κB결합 부위가 프로모터 부위에 존재한다(도 3A). 또한 레닐라 루시퍼레이즈 발현벡터(pRL-TK)는 LPS 신호 전달을 포함한 다양한 외부 인자들에 의해 영향을 받지 않는 HSV-TK 프로모터에 의해 발현이 유지되므로, 반딧불이 루시퍼레이즈 발현벡터의 대조군으로 적합하다(도 3B).

12 [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] <1-1> HEK293 모델세포와 발현벡터의 준비 본 발명에서는 LPS에 의한 TLR4-MD-2 수용체의 활성화 여부를 확인할 수 있도록, HEK293 세포주에 TLR4와 MD2, CD14 발현 유전자들이 도입되어 안정적으로 발현하는 HEK293/hTLR4A-MD2-CD14 모델 세포주(Invivogen)를 이용하였다. HEK293/hTLR4A-MD2-CD14 세포주는 10%의 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)이 포함된 RPMI 배지(Invitrogen)를 이용하여 37, 5% CO2 조건을 유지하는 배양기에서 계대배양하며 실험에 사용할 수 있도록 준비하였다. 또한 본 발명에서 사용한 두 종류의 루시퍼레이즈 발현 벡터는 벡터가 형질 전환된 DH5α 균주로부터 Endofree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)를 이용하여 endotoxin이 제거된 상태로 준비하였다. <1-2> LPS 저해제와 길항제 및 단백질 치료제들의 준비 본 발명에서 사용된 LPS 저해제인 polymyxin B(Invivogen) 및 길항제인 LPS-RS(Invivogen)는 RPMI 배양액에 0.01-100 / 의 농도로 희석하여 10 ng/ 농도의 LPS와 함께 37 에서 1시간 동안 충분히 반응시켜 준비하였다. 단백질 치료제들은 RPMI 배양액에 5 / 의 TV3와 100 ng/ 의 MD-2, 10 ng/ 의 LPS를 동시에 첨가하여 준비하였으며, RPMI 배양액에 5 / 의 TV3와 LPS, 100 ng/ 의 MD-2와 LPS를 첨가한 대조군을 함께 준비하여 1시간 동안 37 에서 충분히 반응시켰다. <1-3> 루시퍼레이즈 리포터 어세이 분석 루시퍼레이즈 리포터 벡터들은 HEK293/hTLR4A-MD2-CD14 세포에 LipofectaminTM 2000(Invitrogen)을 이용하여 아래의 방법으로 도입시켰다. 먼저 T-25 flask의 바닥에 HEK293/hTLR4A-MD2-CD14 세포의 개수가 90% 정도 되도록 37, 5% CO2 조건에서 충분히 배양시킨 후, trypsin-edta를 처리하여 세포를 flask의 바닥에서 분리하여 24-well plate에 2x105 cell/well의 개체수가 되도록 분주하고 37, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 24 시간이 지난 후 LipofectaminTM 2000을 이용하여 pnifty-luc 벡터와 prl-tk 벡터를 동시에 세포에 도입시킨 후, 4시간 뒤에 10%의 혈청이 포함된 RPMI 배지로 교환하여 37, 5% CO2 조건에서 하루 동안 배양하였다. 다음 날 24-well plate에서 배양액을 제거한 뒤, 상기 실시예 <1-2>에서 준비한 LPS 저해제와 길항제, 또는 단백질 치료제 등이 LPS와 함께 포함된 RPMI 배양액을 세포에 첨가하고, 37, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 6시간이 경과한 후 LPS 신호 전달에 의한 반딧불이 루시퍼레이즈의 활성화 정도를 Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)을 이용하여 아래와 같이 확인하였다. 먼저 24-well plate에서 배지를 모두 제거하고 PBS 완충용액으로 2회 세척한 후, 각 well당 200 의 세포용해 완충액(passive lysis buffer, PLB)을 첨가하여 세포를 용해시켰다. 약 30분이 경과한 후 세포 용출액을 20 씩 취하여 새로운 96 well 플레이트에

13 [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] 옮겨준 후, 반딧불이 루시퍼레이즈의 기질이 포함된 100 의 LAR II 시약을 첨가하여 발광되는 정도를 VICTOR X Multilabel Plate Reader(PerkinElmer)를 이용하여 0.5초간 측정하였다. 반딧불이 루시퍼레이즈의 발광도 측정 후에는, 레닐라 루시퍼레이즈 기질이 포함된 100 의 Stop&Glow 시약을 처리하여 레닐라 루시퍼레이즈의 발광도를 0.5초간 측정하였다. 즉, LPS 수용체인 TLR4와 MD-2, CD14이 표면에 발현된 HEK293 세포에, 루시퍼레이즈 발현벡터와 대조군인 레닐라 루시퍼레이즈 발현벡터를 동시에 도입하여, LPS 신호 전달로 활성화된 NF-κB에 의해서 발현이 개시되는 반딧불이 루시퍼레이즈의 발광정도를 대조군인 레닐라 루시퍼레이즈의 발광정도로 비교 분석하는 상대적 분석 방법이다(도 1A). 반딧불이 루시퍼레이즈의 발광값은 레닐라 루시퍼레이즈의 발광값으로 나누어 LPS에 의한 TLR4/MD-2 수용체의 활성화 지표로 이용하였으며, 이러한 방법에 의해 LPS 저해제인 polymyxin B의 농도 증가에 의한 LPS 신호 전달의 감소를 반딧불이 루시퍼레이즈의 상대적 활성 감소로 확인할 수 있었으며(도 4A), 마찬가지로 LPS 길항제인 LPS-RS의 농도 증가에 따른 LPS 신호 전달 감소를 반딧불이 루시퍼레이즈의 상대적 활성 감소로 확인할 수 있었다(도 4B). 이와 같은 결과는 본 발명의 어세이 시스템이 LPS 저해제, 또는 길항제 등에 의한 신호 전달 차단효과를 정확히 분석할 수 있음을 뒷받침하는 것이다. 또한 위와 동일한 조건에서 본 발명에서 제공하는 단백질 치료제의 LPS 신호 전달 저해효능을 확인한 결과, LPS와 함께 TV3, 혹은 MD-2를 단독으로 처리한 조건보다 TV3와 MD-2를 함께 처리한 조건에서 유의미한 저해 효능의 증가를 확인할 수 있었다(도 5). 이와 같은 결과는 MD-2를 제공하는 본 발명의 어세이 시스템이 안정적으로 패혈증 치료제의 효과를 분석할 수 있음을 뒷받침하는 결과이다. 실시예 2: 분화시킨 THP-1 세포의 TNF-α 사이토카인 분비량을 ELISA로 확인하는 세포기반 어세이 방법의 구축 본 발명자들은 또한 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 또는 비타민 D3에 의해 쉽게 대식세포로 분화되는 특징이 있는 백혈병 환자 유래의 단핵구 세포주인 THP-1을 이용하여, LPS 신호 전달에 의한 사이토카인 TNF-α의 분비량을 ELISA로 측정하는 방법(도 1B)을 이용하여, 세포기반 어세이 방법을 하기와 같이 구축하였다. <2-1> THP-1 세포의 배양 및 준비 단핵세포인 THP-1(TIB-202TM, ATCC)세포주를 10% 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)과 50 μm 2-mercaptoethanol이 첨가된 RPMI 배지로, 37, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포의 밀도가 90%에 도달하면 PBS 완충액(pH 7.4)으로 세척한 후, LPS에 대한 감도를 높이기 위해 PMA(phorbol 12-myristate-13-acetate) 200 nm이

14 [91] [92] [93] [94] [95] [96] 첨가된 RPMI배지에 부유시켜 96-well plate에 2.5 104세포/well로 분주하고, 72 시간 동안 37, 5% CO2 조건에서 충분히 분화시켰다. <2-2> THP-1 세포의 사이토카인 분비를 ELISA로 확인하는 방법의 구축 실험에 앞서 LPS의 저해제인 polymyxin B를 1-100 / 의 농도로 RPMI에 희석하여 37 에서 1시간 동안 반응시켜 준비하였다. 또한 10 / 의 TV3와 MD-2를 LPS와 동시에 첨가한 RPMI 배양액과, 10 / 의 InlB-VLR과 MD-2를 LPS와 동시에 첨가한 RPMI 배양액, 그리고 10 / 의 InlB-VLR, TV3, MD-2들을 단독 첨가한 RPMI 배양액을 37 에서 1시간 동안 반응시켜 준비하였다. 이후 PMA에 의해 대식세포로 분화된 THP-1세포들을 PBS 완충액(pH 7.4)으로 3회 세척하고, 단백질 치료제와 대조군들이 포함된 RPMI 배양액, 또는 대조군들을 20 ng/ 의 LPS와 함께 THP-1에 처리하여 37, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 6시간이 경과한 후 각 well에서 일정량의 배양액을 취하여 PBS 완충액(pH 7.4)으로 4-8배 희석하고, 분비된 TNF-α를 통상의 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assays, ebioscience)방법으로 분석하였으며, TNF-α 표준 곡선으로부터 그 결과를 계산하였다. 그 결과, LPS 저해제인 polymyxin B의 농도에 따른 LPS 신호 전달의 감소를 확인할 수 있었으며(도 6), 동일한 조건에서 단백질 치료제들의 LPS 신호 전달 저해효능을 확인한 결과, LPS와 함께 TV3, 혹은 MD-2를 단독으로 처리한 조건보다 TV3와 MD-2, 또는 InlB-VLR과 MD-2를 함께 처리한 조건에서 유의미한 저해 효능의 증가를 확인할 수 있었다(도 7). 이와 같은 결과는, 본 발명의 어세이 시스템이 MD-2를 첨가한 조건에서 단백질 치료제의 효능을 보다 정확하게 분석할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

15 [청구항 1] [청구항 2] [청구항 3] [청구항 4] 청구범위 (a) LPS(lipopolysaccharide) 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터, 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 도입하는 단계; (b) 정제 MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 단백질 치료제들을 미리 섞어서 준비하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 단백질 치료제와 접촉시킨 실험군이 비교하고자 하는 패혈증 단백질 치료제를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 실험군의 패혈증 단백질 치료제의 기능이 대조군의 패혈증 단백질 치료제보다 효능이 좋은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 리포터 단백질 각각은 서로 다른 리포터 단백질로서, 반딧불이 루시퍼레이즈 및 레닐라 루시퍼레이즈인 것인 방법. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값을 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값으로 나눈 값을 비교하여, 대조군에 비해 낮은 경우, 패혈증 단백질 치료제의 효능이 좋은 것으로 판단하는 것인 방법. (a) THP-1 세포주를 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 분화시키는 단계; (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 단백질 치료제들을 미리 섞어서 준비하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 패혈증 단백질 치료제와 접촉시킨 실험군이 비교하고자 하는 패혈증 단백질 치료제를 접촉시키지 않은 대조군에 비해 TNF-α를 분비하는 양이 적은 경우, 상기 실험군의 패혈증 단백질 치료제의 기능이 대조군의 패혈증 단백질 치료제보다 효능이 좋은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 단백질 치료제의 효능

16 [청구항 5] [청구항 6] [청구항 7] [청구항 8] [청구항 9] [청구항 10] [청구항 11] 분석 방법. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 패혈증 단백질 치료제는 LRR(Leucine rich repeat) 패밀리 단백질인 것인 방법. 제5항에 있어서, 상기 LRR 패밀리 단백질은 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된, In-VLR5-c인 것인 방법. 제4항에 있어서, 상기 TNF-α의 측정은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)방법에 의한 것인 방법. (a) LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터를 도입하는 단계; (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 치료제 후보물질을 함께 또는 패혈증 치료제 후보물질 없이 미리 섞는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 후보물질과 접촉시킨 실험군이 후보물질과 접촉시키지 않은 대조군에 비해 리포터 단백질의 발현양이 적은 경우, 상기 후보물질을 패혈증 치료제라고 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 치료제의 스크리닝 방법. 제8항에 있어서, 상기 (a) 단계의 리포터 단백질 각각은 서로 다른 리포터 단백질로서, 반딧불이 루시퍼레이즈 및 레닐라 루시퍼레이즈인 것인 방법. 제8항에 있어서, 상기 (d) 단계는 NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값을 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 작동가능하게 연결된 리포터 단백질의 발광값으로 나눈 값을 비교하여, 대조군에 비해 낮은 경우, 패혈증 치료제라고 판단하는 것인 방법. (a) THP-1 세포주를 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 분화시키는 단계; (b) MD-2(Myeloid differentiation protein-2), LPS 및 패혈증 치료제 후보물질을 함께 또는 패혈증 치료제 후보물질 없이 미리 섞는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 준비된 혼합액을 상기 (a) 단계의 세포주에

17 [청구항 12] [청구항 13] [청구항 14] [청구항 15] [청구항 16] 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 후보물질과 접촉시킨 실험군이 후보물질과 접촉시키지 않은 대조군에 비해 TNF-α를 분비하는 양이 적은 경우, 상기 후보물질을 패혈증 치료제라고 판단하는 단계를 포함하는, 패혈증 치료제의 스크리닝 방법. 제8항 또는 제11항에 있어서, 상기 패혈증 치료제 후보물질은 LRR(Leucine rich repeat) 패밀리 단백질인 것인 방법. 제12항에 있어서, 상기 LRR 패밀리 단백질은 반복단백질 TV3, 또는 인터날린 B 단백질의 N-말단, VLR(Variable Lymphocyte Receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VLR 단백질의 C-말단이 융합된 In-VLR5-c인 것인 방법. 제11항에 있어서, 상기 TNF-α의 측정은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법에 의한 것인 방법. LPS(lipopolysaccharide) 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주로, NF-κB 결합 모티프가 결합된 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터, 및 NF-κB 결합 모티프가 없는 프로모터에 리포터 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 발현 카세트를 포함하는 벡터가 도입된 패혈증 치료제 효능 분석용 또는 스크리닝용 세포주. 제15항의 세포주 및 MD-2를 포함하는 패혈증 치료제 효능 분석용 또는 패혈증 치료제 스크리닝용 키트.

18 요약서 본 발명은 LRR(Leucine rich repeat) 모듈의 반복적 조합에 의하여 구성된, LRR 단백질의 패혈증 저해 단백질 치료제로서의 효능을 분석하고, 서열변이 라이브러리로부터 우수한 저해효능을 보이는 단백질 치료제를 스크리닝하는 어세이 시스템의 구축에 관한 것이다. 보다 구체적으로, LPS 신호 전달 수용체가 표면에 발현된 세포주를 이용한 어세이 시스템에 정제한 MD-2 단백질을 첨가하는 단계를 포함하는 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법 또는 스크리닝 방법, THP-1 세포주에 정제한 외래 MD-2 단백질을 첨가하는 단계를 포함하는 패혈증 단백질 치료제의 효능 분석 방법 또는 스크리닝 방법, 상기 효능 분석용 또는 스크리닝용 세포주, 상기 세포주 및 정제한 외래 MD-2를 포함하는 패혈증 치료제 스크리닝용 또는 효능 분석용 키트에 관한 것이다.

1/6 [Fig. 1]

2/6 [Fig. 2]

3/6 [Fig. 3]

4/6 [Fig. 4]

5/6 [Fig. 5] [Fig. 6]

6/6 [Fig. 7]