Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): 270-276 (2016) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2016.31.4.270 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 CHO 세포의 2 단계배양을통한 Albumin-erythropoietin 의시알산증대 임진혁, 신수아, 차현명, 김동일 * Enhanced Sialylation of Albumin-erythropoietin by Biphasic Cultivation in CHO Cells Jin-Hyuk Lim, Soo-Ah Shin, Hyun-Myoung Cha, and Dong-Il Kim* Received: 31 August 2016 / Revised: 17 December 2016 / Accepted: 21 December 2016 2016 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: In glycoprotein, Terminal sialic acid residues of N- linked glycan are imperative things because they prevent the recognition from asialoglycoprotein-receptor that affect the half-life of glycoproteins. So establishment of culture process for enhancing sialic acid is important to maximize sialic acid contents of glycoprotein. In this study, we investigated effects of biphasic culture of Chinese hamster ovary (CHO) cells producing albumin-erythropoietin to increase sialylation. Biphasic cultures were performed with shift of CO 2 concentrations and temperatures at day 5 when viable cell density was decreased and sialidase was started to be released by cell lysis. The examined temperature set points were 33, 35 and 37 o C respectively and the CO 2 concentration was 1, 5, 10 and 15%. We confirmed that sialidase activity was the lowest in biphasic culture that was shifted from normal culture condition to 1% of CO 2 and 33 o C on day 5. However, the temperature and concentration of CO 2 have little effect on activity of α2,3-sialyltransferase. Also, sialic acid contents were enhanced 1.13-fold higher than that in control culture. In conclusion, Biphasic cultivation in CHO cells led to inhibition of sialidase activity and increases of sialylated glycan. Keywords: Albumin-erythropoietin, Biphasic culture, Chinese hamster ovary cells, Glycosylation, Sialidase These authors contributed equally to this work as the first author. 인하대학교공과대학생물공학과 Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea Tel: +82-32-860-7515, Fax: +82-32-872-4046 e-mail: kimdi@inha.ac.kr 1. INTRODUCTION Chinese hamster ovary (CHO) 세포는다양한장점을가지는세포주로치료용단백질을생산하기위해널리이용되고있다. CHO 세포는무혈청배지에서현탁식배양이가능하여대량의단백질생산이가능하고, 유전자증폭기술을이용하여높은단백질생산성을가질수있다 [1]. 또한, post-translational modification 과정이가능하여인간과유사한글리칸 (glycan) 을가진당단백질을생산할수있다. CHO 세포의유전자서열을분석한결과 glycosylation 에관여하는유전자의 99% 이상이인간과유사하므로 CHO 세포에서생산된단백질을치료제로사용할경우기능이나면역반응에문제가없다 [2]. 당단백질의글리칸구조는치료효능과조직분포도, 체내반감기등에큰영향을준다 [3]. 따라서, 유전자조작이나배양환경조절을통하여치료목적에맞게최적화된글리칸을당단백질에부착시키는것이중요하다. 생물의약품에대한연구가초기에는단백질의생산성을증대시키는데집중되었지만최근에는글리칸과같은단백질효능과관련된품질을향상하는연구가집중되고있다 [4,5]. 글리칸은여러종류의효소들이순차적으로작용하여당단백질에부착이된다 [2]. 따라서, 생산세포주및배지조성, 배양환경등다양한요소들이글리칸생합성에영향을주어비균질한글리칸이형성된다 [6]. 생산세포주의종류에따라서고유의글리칸형태를형성하기때문에치료목적에맞게적절한세포주를선택하는것이중요하다 [7]. 또한, 글리칸생합성에관련된유전자를결손시키거나과발현하여당단백질에부착되는글리칸을최적화할수있다. 배양중 ph, CO 2, 온도등과같은배양조건을변경하여글리칸형태를조절하는방법도이용되고
CHO 세포의 2 단계배양을통한 Albumin-erythropoietin 의시알산증대 271 있다 [8]. Recombinant human erythropoietin (rhepo) 은조혈줄기세포를자극하여적혈구세포로분화시키며구조적으로최대 3 개의 N- 글리칸과 1 개의 O- 글리칸을가지며글리칸의차이로인해분자량에차이가발생한다. rhepo 와같은사이토카인의경우체내반감기가중요한요소로글리칸말단에존재하는시알산 (sialic acid) 에의해조절될수있다 [9]. 시알산이캡핑 (capping) 된글리칸은갈락토스의노출을막아주고, 당단백질이비시알산당단백질수용체 (asialoglycoprotein receptor) 와결합하여분해되는것을억제한다 [10]. 그러므로최대 14 개의시알산이부착될수있는 rhepo 의글리칸말단의시알산함량을조절하여약동학적특성이나체내반감기를향상시킨연구가진행되었다. 시알산함량을증가시키기위해 N- acetylmannosamine 을첨가하거나 CMP-sialic acid transporter 와 sialyltransferases 를과발현하여시알산의부착을향상시키는방법이있다 [11,12]. 배양중세포의사멸로인해용해 (lysis) 가발생하면세포내에존재하던 sialidase 가배양액으로방출되어생산된당단백질말단의시알산을분해한다 [13,14]. Sialidase 는 NEU1, NEU2, NEU3, NEU4 가존재하며이중배양후반부세포사멸로인하여방출되는대표적인것은 NEU1 이있다. 방출된 sialidase 는 37 o C, ph 5.9 에서최적의활성을나타내는것으로알려졌다 [15]. 당단백질의 sialidase 에의한분해를억제하기위한방법으로는유전자조작을통하여 sialidase 발현을억제하거나배양조건을조절하여 sialidase 의활성을조절하는것이있다 [16]. 이와같은방법으로 sialidase 로부터글리칸에부착된시알산을보호하여당단백질의시알산함량을증가시킬수있다. 하지만이와같은유전자를조작하는방법은시간이오래소요되는단점이있다. 이와반대로배양공정을조절하는방법은세포주개발에대한시간소요를줄일수있다. 하지만배양공정조절을통하여 sialidase 를억제하는연구는미비하다. 본연구에서는 Albumin-erythropoietin (Alb-EPO) 을생산하는 CHO 세포의 2 단계배양 (biphasic culture) 을통하여 sialidase 의활성을억제함으로서 Alb-EPO 의시알산함량증대를목적으로하였다. 세포의사멸로 sialidase 가배양액으로방출될가능성이높은배양 5 일차에온도와 CO 2 의공급을조절하여 2 단계배양을진행하였다. Sialidase 의활성이가장낮은조건을선정하여시알산관련효소의유전자발현정도와활성을측정하고 2 단계배양을통해글리칸말단의시알산이증가한것을확인하였다. 2. MATERIALS AND METHODS 2.1. 세포주및세포배양실험에사용한세포주는 Alb-EPO 를생산하는 CHO DUKX- B11 를사용하였다 [17]. 배양은 125-mL Erlenmeyer flask 에 20 ml 의 working volume 으로 ProCHO5 (Lonza, Verviers, Belgium) 배지를분주한후 4 mm glutamine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 을첨가하여진행하였다. 또한 orbital shaker (Vision Scientific Co., Daejeon, Korea) 에서 100 rpm 과 37 o C humidified CO 2 incubator (Sanyo Electric, Osaka, Japan) 에서배양하였다. 초기세포접종농도는 3 10 5 cells/ml 로배양을하였다. 배양중온도와 CO 2 를조절하는 2 단계배양에서는 0 일차에 5% CO 2 로배양을진행후 5 일차에온도는 33, 35, 37 o C 로 CO 2 는 1, 5, 10, 15% 로각각조절하였다. 2.2. 세포수및생존도측정배양중 24 시간마다샘플링을하여 trypan blue (Sigma-Aldrich) 로염색을진행후광학현미경 (Olympus, Tokyo, Japan) 을이용하여 hemocytometer (Superior, Marienfeld, Germany) 로세포수및생존도를확인하였다. 2.3. 배양중생산된 Alb-EPO 정량분석회수한배양액을 enzyme-linked immunosorbent assay (EL- ISA) 를이용하여정량분석하였다. Sandwich ELISA 를진행하기위하여 1 차항체로 albumin 에결합하는 goat anti-human albumin antibody (Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) 와 2 차항체로 peroxidase-labeled goat anti-human albumin antibody (Abcam Inc., USA) 를사용하였다. 항체와 Alb-EPO 와의결합이완료된후기질로 ABTS peroxidase substrate (KPL, Gaithersburg, MD, USA) 를이용하여발색반응을진행하였다. 발색후 Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) 를이용하여 405 nm 에흡광도를측정하였다. 2.4. Sialidase 활성분석배양액에존재하는 sialidase 를측정하기위하여회수한배양액을 Neuraminidase assay kit (Abcam Inc., USA) 를사용하여 sialidase 의활성을측정하였다. 샘플을 assay buffer 에희석후 NeuroBlue dye stock solution 을첨가하여 37 o C 에서 60 분동안암반응을시켰다. 반응후 DyNA Quant 200 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) 을이용하여 Ex/Em=365/460 nm 에서측정하였다. 2.5. Sialyltransferase 활성분석세포내의 sialyltransferase 활성을측정하기위하여 3, 6, 8 일차의세포를 7 10 5 개회수하여 PBS 로 3 회세척하였다. Protein Extraction Solution (Elpis biotech, Korea) 을이용하여 lysis 반응을진행한후 12,500 g 에서원심분리후상등액을회수하였다. 회수한상등액은 sialyltransferase activity kit (R&D Systems, USA) 를사용하여메뉴얼에따라서실험을진행하였고 Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) 를이용하여 620 nm 에서흡광도를측정하였다.
272 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): 270-276 (2016) Table 1. Oligonucleotide primers for detection of mrnas mrna Sense / antisense sequences Size (bp) Annealing temperature ( o C) GAPDH 5'-CCTCTACTGGCGCTGCCAAG-3 5'-TCCGACGCCTGCTTCACCAC-3' 175 57 α2,3-st 5'-CAGAAAAACAACTGGCCGAA-3' 5'-GGCCTGATTGTTCCAGGATT-3' 201 57 NEU1 5'-AAGCGATCAAGCAGCGACTA-3' 5'-CCTCAGTTTGAATGCATGGG-3' 65 57 2.6. 역전사중합효소연쇄반응 (RT-PCR) 과 quantitative RT-PCR 세포를회수하여 RNeasy PlusMini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) 를사용하여 RNA를추출하였다. RNA를정량후 Maxime RT Premix Kit (intron, Seongnam, Korea) 를이용하여 T 100 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 에서 cdna 를합성하였다. 합성한 cdna를이용하여 GAPDH, α2,3-sialyltransferase (α2,3-st), NEU1 유전자를확인하기위하여제작한 primer와함께 PCR반응을진행후전기영동을통하여확인하였다. 사용한 primer의정보및 Annealing temperature 는 Table 1과같다. 2.7. Alb-EPO 정제배양종료인 8 일차에배양액을회수하여원심분리후상등액을회수하였다. Econo-column (Bio-Rad, USA) 에 Blue Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 레진을충전시키고유체를흘려주었다. Binding buffer 는 20 mm sodium phosphate (ph 7.0) 를사용하였고 elution buffer 는 20 mm sodium phosphate 로실험을진행하였다. 2.8. 시알산함량분석시알산함량을분석하기위하여정제된 Alb-EPO 10 μg 과 10 mm sodium periodate (Sigma-Aldrich, USA) 를 20 μl 를 4 o C 에서 45 분간반응시켰다. 다음단계로 50 mm sodium thiosulfate (Sigma-Aldrich, USA) 를이용하여반응을정지시킨후 500 μl 와 100 mm acetoacetanilide (Alfa Aesar, Ward Hill, MA, USA) 400 μl 를첨가하여상온에서 10 분간반응시켰다. 반응진행후 microplate reader (Safire2, Tecan Group Ltd., Maennedorf, Switzerland) 를이용하여 Ex/Em=388/471 nm 의조건에서확인하였다. 2.9. High-performance liquid chromatography (HPLC) Alb-EPO의 antennary 구조를확인하기위하여 HPLC를이용하여분석하였다. 동결건조한 Alb-EPO 100 μg을 PNGase F (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) 처리를하였다. Graphitized carbon columns (Grace Davison Discovery Sciences, Deerfield, IL, USA) 을이용하여유리화된 N-글리칸만을정제하여 2-aminobenzamide (2-AB; TCI, Tokyo, Japan) 와반응시켰다. 2-AB labeling 후에 GlycoClean S-cartridge (Prozyme, San Leandro, CA, USA) 을이용하여 N-글리칸을정제하 고 TSKgel DEAE-5PW column (Tosoh bioscience,tosoh, Tokyo, Japan) 을사용하여 HPLC 분석을하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 2 단계배양에의한세포의 viable cell density (VCD), 생존도및생산성확인 CHO 세포배양에영향을미치는가장큰요인중온도와 CO 2 농도에대한효과를확인하기위하여배양을진행하였다. 배양중 CO 2 농도가높아지면배양액의 ph 가낮아지는효과를얻을수있었다 (data not shown). 낮은온도와 CO 2 농도로배양조건을변화시킨각각의조건에서 8 일차의 VCD 가높은것으로확인되었다 (Fig. 1(a)). 33 o C 로온도를변화시킨실험군은 1, 5, 10, 15% 의 CO 2 농도에서 37 o C 로배양한같은 CO 2 농도의실험군에비하여 8 일차 VCD 가각각 1.16, 1.29, 1.34, 1.81 배증가한것을확인할수있었다. 또한 35 o C 로온도를변화시킨실험군은각각의 CO 2 조건에서 37 o C 로배양한실험군에비하여 1.02, 1.05, 1.36, 1.22 배 VCD 가증가한것을알수있었다. 이를통하여같은 CO 2 농도에서온도가감소할수록 VCD 가높아지는것을알수있었다. 같은온도의실험군에서 CO 2 농도변화에따른 VCD 를비교하였을때모든온도에서 CO 2 의농도가가장낮은 1% 조건에서 8 일차에 VCD 가가장높게확인되었다. 5 일차이후 33, 35, 37 o C 의온도조건의순서로생존도가높게유지되는것을확인할수있었다 (Fig. 1(b)). 또한같은온도의배양조건에서 CO 2 의값이낮아질수록생존도가 5 일차이후높게확인되었다. 이를통하여 33 o C 1% 의조건에서가장높은생존도를확인하였다. 이러한결과에따른생산성을확인하였다 (Fig. 1(c)). 8 일차의생산성을확인한결과 1, 5, 10, 15% 의 CO 2 농도순서로 33 도의조건에서 30.2±0.6, 36.4±2.3, 35.0±0.8, 28.8±0.7 mg/l 의생산성을확인하였으며 35 o C 와 37 o C 의배양조건에서도같은 CO 2 농도순서로 29.41±0.80, 33.60±1.76, 32.67±2.65, 27.96±1.19 mg/l 와 31.43±2.22, 28.21±0.87, 33.74±1.07, 29.81±0.98 mg/l 의생산성을확인하였다. 시간에따른생산성을확인한결과 VCD 와생존도와유사하게낮은온도와 CO 2 의농도에따라서생산성이높아지는것을확인할수있었다. 하지만일부실험군에서 VCD 의증가에비해생산성이많이증가하지않은것을확인할수있었다. CHO 세포배양중온도및 ph 를조절해주는 CO 2 의농도를
CHO 세포의 2 단계배양을통한 Albumin-erythropoietin 의시알산증대 273 Fig. 2. mrna expressions of lysosomal sialidase (NEU1) gene and alpha-2,3-sialyltransferase (α2,3-st) gene at day 3, 8. Fig. 3. Measurement of the extracellular sialidase activities on different biphasic culture condition at (A) day 7 and (B) day 8. Values of each parameter represent average ± SD from three independent experiments (n=2). Fig. 1. Effect of biphasic culture on (a) cell density, (b) viability and (c) titer of Alb-EPO. Cultivation temperature and concentration of CO 2 were shifted at day 5. Values of each parameter represent average ± SD from three independent experiments (n=2). 변화시키면세포의증식및생산성에많은영향을미치게된다. 선행연구에서배양시 37 o C 보다낮은온도로배양을진행하게되면세포의생존도가높아지는것으로보고되었다 [17, 18]. 본실험은배양세포사멸이시작하는 5 일차부터조건을 변화시켰기때문에선행연구결과처럼생산성의증가가확인되었지만큰상승이없는것으로사료된다. 3.2. 2 단계배양에의한 sialidase 활성비교배양후반부배지내영양분고갈등의원인으로세포사멸이발생하게된다. 세포사멸이발생하게되면세포내존재하는 sialidase 가배양액으로방출되어생산된당단백질말단에위치하는시알산을분해하는데영향을준다 [13]. 2 단계배양이세포내 sialidase 의발현에영향을주는지확인하기위하여 RT-PCR 을진행하였다. 확인결과온도와 CO 2 의농도변화에
274 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(4): 270-276 (2016) 따라서 sialidase 의 mrna 발현에는크게영향을주지않는것으로확인되었다 (Fig. 2). 이후세포사멸이가장많이일어나는시점인배양 7 일차와 8 일차의배양액내의 sialidase 를측정하였다 (Fig. 3). 배양 7 일차와배양 8 일차모두온도와 CO 2 가감소함에따라서 sialidase 의활성도가감소하였다 (Fig. 3(a)). 배양 7 일차의 33 o C, 1% CO 2 농도조건에서는같은온도의 10% CO 2 농도조건에비하여 sialidase 활성이 28% 낮게확인되었다. 하지만 35 o C 와 37 o C 의조건에서는 CO 2 농도에따라서 sialidase 활성에크게영향을주지않음을확인하였다. 배양 8 일차의경우온도와 CO 2 농도에따른 sialidase 활성과의관계가배양 7 일차보다확연하게관찰되었다 (Fig. 3(b)). 하지만같은 CO 2 의농도에서온도의변화에따른 sialidase 활성도의차이는크지않은것으로관찰되어 2 단계배양시온도에따른영향보다는 CO 2 농도에따른영향이더큰것을확인하였다. CHO 세포는 37 o C 의온도와 ph 7.0-7.2 에서가장높은증식률을보인다. 선행연구에따르면 CHO 세포의 sialidase 활성도는 37 o C 와 ph 5.9 에서가장높은활성을보이는것으로확인되었다 [15]. 하지만 ph 5.9 는 CHO 세포의배양에는적절하지않은조건이므로세포의증식에부정적인영향을주지않는범위내에서 sialidase 활성도를억제하는것이중요하다. 배양 8 일차는배양기간의마지막에해당하므로배양종반부인 7 일차에가장 sialidase 활성도가낮게측정되는 33 o C, 1% CO 2 를최적조건으로선정하여향후실험을진행하였다. 3.3. 2 단계배양에의한 α2,3-st 활성비교앞서진행한방법과같이 2 단계배양이 α2,3-st 의 mrna 발현에영향을주는지확인한결과 mrna 발현에는영향을주지않는것을알수있었다 (Fig. 2). 2 단계배양이 α2,3-st 의활성에미치는영향을확인하기위하여배양 3, 6, 8 일차의세포를 lysis 하여분석을진행하였다. 33 o C, 1% CO 2 농도와동물세포에서기준으로사용하는조건인 37 o C, 5% CO 2 에서각 각분석을진행하였다 (Fig. 4). 6 일차 α2,3-st 의활성이대조군보다 1.1 배높게확인되었고 3, 8 일차는각각큰차이가없는것으로확인되었다. 따라서세포내 α(2,3)-st 의활성도는배양조건에따라서유사한결과를나타나는것으로확인하였다. 앞서 sialidase 는 33 o C 1% CO 2 에서가장활성이낮게확인된반면 α2,3-st 의활성은같은조건에서변화가없는것을알수있었다. 이러한이유는 sialidase 는세포사멸로인하여배지내에존재하기때문에온도나 ph 에따른영향을많이받게된다.ss 하지만 α2,3-st 는세포내에존재하므로세포의항상성으로인해세포내부의환경은유지되기때문으로사료된다. 3.4. Alb-EPO 의시알산정량및 glycosylation 안테나구조분석앞서얻은결과를통하여 33, 1% CO 2 의 2 단계배양이 Alb- EPO 의시알산및안테나구조에어떠한영향을주는지확인하기위하여배양 8 일차의샘플을회수하여분석하였다. 첫번째로 Alb-EPO 의전체시알산함량을분석하여 2 단계배양이어떠한영향을주었는지확인하였다 (Fig. 5). 그결과 sialidase 의활성이가장낮게확인된 33 o C, 1% CO 2 의조건에서대조군에비하여시알산의함량이 13.3% 높게확인되었다. 또한시알산이포함된안테나구조를확인하기위하여분석을진행하였다. 대조군에비하여실험군에서 Bi-, tri-, tetraantenna 의상대비율이모두증가한것을알수있었다. Biantenna 는 16.8% 에서 18.8% 로, tri-antenna 는 17.0% 에서 20.5% 로 tetra-antenna 는 10.7% 에서 11.5% 로대조군보다실험군에서각각함량이증가한것을알수있었다. Alb-EPO 의시알산은체내반감기에중요한역할을한다. 시알산의부가및제거에영향을주는효소는앞서언급한것과같이 sialidase 와 CHO cell 에서발현하는 α2,3-st 가있다. Fig. 4. Measurement of the α2,3-st activities on biphasic condition at day 3, 6, 8. Values of each parameter represent average±sd from three independent experiments (n=2). Fig. 5. Relative amount of sialic acid content of Alb-EPO. Values of each parameter represent average±sd from three independent experiments (n=2).
CHO 세포의 2 단계배양을통한 Albumin-erythropoietin 의시알산증대 275 Table 2. Sialylation profile of the 2-AB-glycans from the Alb- EPO produced by biphasic culture Sialylated glycans Control (%) Biphasic culture (%) Bi- 16.8 18.8 Tri- 17.0 20.5 Tetra- 10.7 11.5 실험결과 33 o C, 1% CO 2 의조건에서 sialidase 는최대 28% 까지활성이감소하는것을알수있었다 (Fig. 3). 반면에같은조건에서시알산을부가해주는 α2,3-st 의활성에는영향이없는것을알수있었다 (Fig. 3). 이러한결과를종합할때 Alb-EPO 의전체시알산함량의증가는 2 단계배양을통한 sialidase 의활성억제가주요한역할을한것으로사료된다. 4. CONCLUSION CHO 세포배양을통하여생산하는당단백질은 glycosylation 이단백질의품질에중요한역할을한다. 특히 N- 글리칸의말단에위치하는시알산은당단백질의체내반감기에많은영향을주게된다. 본연구에서는 CHO 배양중방출되는 sialidase 의활성을 ph 에영향을주는 CO 2 농도와온도조절을통하여 2 단계배양을진행하였다. sialidase 의방출이증가하는 5 일차에배양조건변화를통하여 33 o C, 1% CO 2 의조건이가장배양액내의 sialidase 의활성이낮은것을확인하였다. 또한이러한조건이 N- 글리칸에시알산을부가해주는 α2,3-st 의활성에는영향을미치지않는것으로확인되었다. 최종적으로시알산함량을분석한결과대조군에비하여 13% 의시알산이증가한것을확인하였다. 이러한결과를바탕으로 CHO 세포의 2 단계배양이 N- 글리칸의시알산함량에긍정적인효과를얻는것으로확인되었으며치료용단백질생산에유용하게사용될수있을것으로사료된다. Acknowledgements 본연구는정부 ( 미래창조과학부 ) 의재원으로한국연구재단바이오의료기술개발사업 (No. NRF-2013M3A9B6075887) 으로수행되었으며이에감사드립니다. REFERENCES 1. Jayapal, K. P., K. F. Wlaschin, W. -S. Hu, and M. G. S. Yap (2007) Recombinant protein therapeutics from CHO Cells - 20 years and counting. Chem. Eng. Prog. 103: 40-47. 2. Xu, X., H. Nagarajan, N. E. Lewis, S. Pan, Z. Cai, X. Liu, W. Chen, M. Xie, W. Wang, S. Hammond, M. R. Andersen, N. Neff, B. Passarelli, W. Koh, H. C. Fan, J. Wang, Y. Gui, K. H. Lee, M. J. Betenbaugh, S. R. Quake, I. Famili, B. O. Palsson, and J. Wang (2011) The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nat. Biotechnol. 29: 735-741. 3. Lingg, N., P. Zhang, Z. Song, and M. Bardor (2012) The sweet tooth of biopharmaceuticals: Importance of recombinant protein glycosylation analysis. Biotechnol. J. 7: 1462-1472. 4. Kaisermayer, C., D. Reinhart, A. Gili, M. Chang, P. -M. Aberg, A. Castan, and R. Kunert (2016) Biphasic cultivation strategy to avoid Epo-Fc aggregation and optimize protein expression. J. Biotechnol. 227: 3-9. 5. Schmidberger, T., C. Posch, A. Sasse, C. Glch, and R. Huber (2015) Progress toward forecasting product quality and quantity of mammalian cell culture processes by performance-based modeling. Biotechnol. Prog. 31: 1119-1127. 6. Davies, S. L., C. S. Lovelady, R. K. Grainger, A. J. Racher, R. J. Young, and D. C. James (2013) Functional heterogeneity and heritability in CHO cell populations. Biotechnol. Bioeng. 110: 260-274. 7. Li, F., N. Vijayasankaran, A. Shen, R. Kiss, and A. Amanullah (2010) Cell culture processes for monoclonal antibody production. mabs. 2: 466-479. 8. Costa, A. R., M. E. Rodrigues, M. Henriques, R. Oliveira, and J. Azeredo (2014) Glycosylation: Impact, control and improvement during therapeutic protein production. Crit. Rev. Biotechnol. 34: 281-299. 9. Long, D. L., D. H. Doherty, S. P. Eisenberg, D. J. Smith, M. S. Rosendahl, K. R. Christensen, D. P. Edwards, E. A. Chlipala, and G. N. Cox (2006) Design of homogeneous, monopegylated erythropoietin analogs with preserved in vitro bioactivity. Exp. Hematol. 34: 697-704. 10. Bork, K., W. Reutter, W. Weidemann, and R. Horstkorte (2007) Enhanced sialylation of EPO by overexpression of UDP-GlcNAc 2- epimerase/manac kinase containing a sialuria mutation in CHO cells. FEBS Lett. 581: 4195-4198. 11. Wong, N. S. C., M. G. S. Yap, and D. I. C. Wang (2006) Enhancing recombinant glycoprotein sialylation through CMP-sialic acid transporter over expression in Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 93: 1005-1016. 12. Zhang, X., S. H. L. Lok, and O. L. Kon (1998) Stable expression of human a-2,6-sialyltransferase in Chinese hamster ovary cells: Functional consequences for human erythropoietin expression and bioactivity. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1425: 441-452. 13. Munzert, E., J. Mthing, H. Bntemeyer, and J. Lehmann (1996) Sialidase activity in culture fluid of Chinese hamster ovary cells during batch culture and its effect on recombinant human antithrombin III integrity. Biotechnol. Prog. 12: 559-563. 14. Chuan, K. H., S. F. Lim, L. Martin, C. Y. Yun, S. O. H. Loh, F. Lasne, and Z. Song (2006) Caspase activation, sialidase release and changes in sialylation pattern of recombinant human erythropoietin produced by CHO cells in batch and fed-batch cultures. Cytotechnology. 51: 67-79. 15. Gramer, M. J. and C. F. Goochee (1993) Glycosidase activities in Chinese hamster ovary cell lysate and cell culture supernatant. Biotechnol. Prog. 9: 366-373. 16. Ngantung, F. A., P. G. Miller, F. R. Brushett, G. L. Tang, and D. I. C. Wang (2006) RNA interference of sialidase improves glycoprotein sialic acid content consistency. Biotechnol. Bioeng. 95: 106-
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