KOREAN J. FOOD COOK. SCI. Vol. 31, No. 5, pp. 515~523 (2015) ISSN 2287-1780(Print) ISSN 2287-1772(Online) http://dx.doi.org/10.9724/kfcs.2015.31.5.515 황칠나무 (Dendropanax morbiferus Lev.) 잎에탄올추출물의항균및항산화활성 이수경 * 이승헌 1 * 박은진 제주대학교식품생명공학과, 1 제주대학교해양의생명과학부 Antimicrobial and Antioxidant Activities of Ethanol Leaf Extract of Dendropanax morbiferus Lev. Su-gyeong Lee* Seung-heon Lee 1 * Eun-Jin Park Department of Food Bioengineering, Jeju National University, Jeju, 63243, Korea 1 Department of Marine Life Sciences, Jeju National University, Jeju, 63243, Korea Abstract In the study reported here, the antimicrobial and antioxidant activities of the ethanol leaf extract of Dendropanax morbiferus Lev. from Jeju Island was investigated. Of the 14 strains of 12 species of microorganisms tested, the extract exhibited antimicrobial activity observed against seven Gram-positive bacteria of four species, but not against six Gram-negative bacteria and a yeast strain. Using the disc diffusion method, the diameter of the inhibition zone increased with application of the extract with every strain and the highest growth inhibition was exhibited with Staphylococcus aureus KCTC 1916 at 5 mg/ml. The minimal inhibitory concentration of the extract (MIC) by turbidity was 2.5 mg/ml against Bacillus cereus KACC 12672 and 15 mg/ml when with Enterococcus faecalis KCTC 3206. The minimum bacterial concentration (MBC) values defined as being 99.9% reduction in viable cells against the tested strains was higher than the MIC values. Time killing curves using the optimum MIC were performed on seven strains incubated for 48 hr. The growth of B. cereus KACC 12672 was detected after 12 hr and no significant growth was found in the others strains after 48 hr (p<0.05). The 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) scavenging activity of the ethanol leaf extract was similar to that of butylated hydroxyanisole (BHA) at the same concentration. These results indicate that leaf extract of D. morbiferus Lev. can be utilized as a natural preservative and an antioxidant. Key words: antimicrobial activity, antioxidant activity, extract, foodborne pathogen, Dendropanax morbiferus Lev. Ⅰ. 서론 식품의약품안전처의식중독발생현황통계자료에따르면식중독발생률은점차증가하는추세로 2002 년 77 건에비해 2014 년식중독발생건수는 349 건으로약 4 배이상증가하였다. 2014 년도전체발생건수중원인물질별발생률은세균성식중독이 58.3% 로가장높은비율을차지하였다. 원인미생물별발생빈도를살펴보면 Norovirus 가 15.0% 를차지하였고다음으로병원성 Escherichia coli, Salmonella spp, Vibrio parahaemolyticus, Staphylococcus aureus, Clostridisum perfrigens, Campylobacter jejuni, Bacillus cereus 순이었다 (Ministry of Food and Drug *Equal contribution Corresponding author: Eun-Jin Park, Department of Food Bioengineering, Jeju National University, 102 Jejudaehak-ro, Jeju-si, Jeju Special Self-Governing Province, 63243, Korea Tel: +82-64-754-3612 Fax: +82-64-755-3601 E-mail: ejpark@jejunu.ac.kr Safety 2015). 세균성식중독이전체식중독발생건수대비높은비율을차지하는만큼식중독예방을위하여미생물의오염예방과제거등관리의중요성에대한비중이높아지고있다. 이에따라식품의저장및유통과정에서유해환경으로부터식품의위생과안전을확보하기위한방법으로보존제를식품에직접또는간접적으로첨가하거나 2 차오염매개체인기구와용기등의표면에살균제나소독제를사용하는방법이이용되고있다. 그러나식품에직접첨가하여사용되는화학적합성첨가물은장기간또는다량노출시인체에축적되어부작용이발생할가능성이높다. 따라서첨가물의법정허용기준을준수하여사용하는등의노력과더불어그효과가동등하거나더우수한항균물질이함유된천연자원을탐색하고이들로부터추출한성분이천연보존료로이용가능성이있는지여부를확인하는노력이지속적으로이루어져야한다 (Kim YS & Yoo IJ 1995, Park HK 등 2005). 다양한생리활성물질중항균활성을나타내는천연 515
516 이수경 이승헌 박은진 물질로식물의정유성분 (essential oil) 과색소, phenolic acid 와 flavonoid 화합물등의 phytochemicals 그리고유기산등이보고되었다 (Jang JS 등 2007). 우리나라에서현재까지식용또는약용으로이용되어온식물중에서마늘, 생강, 양파, 고추그리고초피등의향신재료와허브, 인삼, 엉겅퀴, 인진쑥, 뽕나무그리고상산나무등식물의잎과뿌리추출물로부터항균활성이확인되었다 (Chung SK 등 1999, Yoo MY 등 2005, Kim SU 등 2006, Chae GC 등 2009, Jang MR 등 2014). 현재까지수행된제주도자생식물의항균효과에관한연구에는애기달맞이꽃 (Oenothera laciniata Hill)(Kim JY 등 2007), 엉겅퀴 (Cirsium japonicum var. ussuriense) (Jang MR 등 2014), 암대극 (Euphorbia jolkini Boiss)(Kim JY 등 2006), 등대풀 (Euphorbia helioscopia)(kim JY 등 2007), 삼백초 (Saururus chinesis)(lee JH 등 2013) 그리고백년초 (Opuntia ficus indica)(seo YH 등 2012) 의추출물을이용한연구결과가있다. 앞으로도지속적으로이외에다양한천연자원의생리활성물질을연구하여천연소재의이용가능성에대한지속적인연구가필요할것으로판단된다. 우리나라는단위면적대비다양한식물자원이분포되어있다 (Kim JS 등 2014). 특히제주도는우리나라전체면적의약 8.1% 에불과한작은섬이지만지리적위치, 해발고도그리고지형등의영향으로아열대에서아한대까지의기후가분포되어있다. 이러한다양한기후의영향으로제주도에는우리나라에서식하고있는전체식물종중약 41% 가서식하고있는것으로알려져있다 (Son MC 등 2012). 제주도자생식물중하나인황칠나무 (Dendropanax morbiferus Lev.) 는두릅나무과 (araliaceae) 에속하는아열대성상록활엽교목으로동남아시아등에약 30 여종이분포하고있다. 그중우리나라에서식하는황칠나무는 1 속 1 종의특산수종으로온화한기후의남서해안지역과제주도에서만자생하고있다 (Jeong BS 등 1995, Bernart MW 등 1996). 현재까지수행된황칠나무에관한연구의대부분은잎추출물을대상으로하였으며멜라닌생성억제로인한미백 (Lim KP 등 1998), 생체방어체계강화 (Park BY 등 2004), 항산화및항암 (Hyun TK 등 2013) 그리고항당뇨 (An NY 등 2014) 효과등을나타내는것으로확인되었다. 이와같이다양한생리기능성연구는일부수행되었으나, 황칠나무와같이생리활성이강한천연물의항균활성을확인하여다양한목적의항균제로의이용가능성을확인하는연구는미흡한실정이다. 따라서본연구에서는제주도에자생하고있는황칠나무의잎에탄올추출물의항산화활성을분석하고, 식중독, 비듬그리고충치원인균과녹농균에대한항균활성을확인하여황칠잎추출물이천연항산화제와천연보존제그리고천연항균제로이용가능한소재인지여부 를검토하는기초자료로활용하고자한다. Ⅱ. 재료및방법 1. 실험재료본실험에사용된황칠잎은 2013년 7월에제주도서귀포시지역에서자생하는황칠나무 (Dendropanax morbiferus H. Lev.) 로부터채집하여사용하였다. 채집된황칠잎은그늘에서자연건조시켰으며, 잘건조된황칠잎을증류수로 2회세척하고분쇄한후, 황칠잎무게대비 10배의 70% 에탄올 (Daejung, Seoul, Korea) 을가하고 60 C로중탕가열하여 2회추출하였다. 추출액을여과지 (Whatman No.1, Whatman, Maidstone, UK) 로감압여과하고, 그여과액을회전농축기 (rotary evaporator N-1110S, EYELA, Tokyo, Japan) 로감압농축하였다. 감압농축을통하여얻은점조상의추출물을동결건조기 (FDU-1200, EYELA, Tokyo, Japan) 로건조하여분말을얻었으며 ( 수득률 29.2%), 이를항균과항산화실험에시료로사용하였다. 황칠나무잎추출물은모두 -20 C에서냉동보관하면서실험에사용하였다. 2. 사용균주및배양조건본실험에사용한균주는식중독, 비듬그리고충치의원인이되는미생물로서그종류와배양조건을 Table 1에나타내었다. 미생물은그람양성균 4 종 (species) 과그람음성균 6종, 효모 1종으로구성되어있다. 충치원인세균과비듬원인효모로알려진 Streptococcus mutans와 Malassezia Furfur, 녹농균인 Pseudomonas aeruginosa 그리고그외의균주들은식중독을유발하는것으로알려진것들이다. 실험에사용된균주는한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM, Seoul, Korea), 한국생명공학연구원미생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC, Daejeon, Korea) 그리고농촌진흥청농업유전자원정보센터 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC, Jeonju, Korea) 로부터분양받았다. 분양받은균주는 3회계대배양후 40% glycerol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액과혼합하여 -18 C에서보관하면서실험에사용하였다. 보관된균주는실험직전증식을위한액체배지에접종하여각각최적배양조건에서 2회계대배양후사용하였다. 3. 디스크확산법 (disc diffusion method) 을이용한추출물의항균활성추출물은멸균된증류수를이용하여 0.5, 1, 5, 10, 30 그리고 50 mg/ml 농도로제조하였다. 농도별로제조된추출물은멸균된 paper disc(diameter 6 mm, Advantec, 한국식품조리과학회지제 31 권제 5 호 (2015)
황칠나무 (Dendropanax morbiferus Lev.) 잎에탄올추출물의항균및항산화활성 517 Table 1. List of microorganisms and growth conditions used for antimicrobial activity test Strains Reference No. Culture medium Growth temperature Gram positive bacteria Enterococcus faecalis KCTC 1) 3206 TSA 4) / TSB 5) Staphylococcus aureus KCTC 1621 Staphylococcus aureus subsp. aureus KCTC 1916 Listeria monocytogenes KCTC 3710 37 C Listeria monocytogenes KCTC 13064 Bacillus cereus KACC 2) 12672 Streptococcus mutans KACC 16833 TSA+0.30%YE/TSB+0.30%YE Gram negative bacteria Salmonella enterica KCTC 2057 TSA/TSB Enterobacter sakazakii KCTC 2949 Bacillus subtilis KCTC 1022 37 C Pseudomonas aeruginosa KCTC 1750 Vibrio parahaemoliticus KCTC 2729 Shigella sonnei KCTC 2518 TSA+0.10%NaCl/TSB+0.10%NaCl TSA/TSB Yeast Malassezia Furfur KCCM 3) 12679 YMA 6) +0.10% olive oli/ymb 7) +0.10% olive oil 28 C 1) Korea Collection for Type Cultures (Daejon, Korea) 2) Korean Agricultural Culture Collection (Jeonju, Korea) 3) Korea Culture Center of Microorganism (Seoul, Korea) 4) Trypic Soy Agar (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) 5) Trypic Soy Broth (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) 6) Yeast Malt Agar (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) 7) Yeast Malt Broth (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) Toyo Roshi Co., Tokyo, Japan) 에 20 µl씩을흡수시킨후무균상 (clean bench) 안에서건조하였다. 실험균주를각각최적조건에서배양한후그생균수를 1 10 7 CFU/mL로조정한배양액을 1% agar가첨가된배지와 1:1 비율로혼합시킨후 1.5% 평판한천배지에중층 (overlay method) 하였다. 중층한배양액이응고되면추출물을흡수한 paper disc를표면에밀착시켜각각최적생육조건에서배양하였다. 배양이완료된후 paper disc 주위에생성된생육저해환 (inhibition zone) 의직경 (mm) 을측정하여항균활성을비교하였다. 4. 추출물의최소저해농도 (minium inhibitory concentration, MIC) Disc diffusion method 실험에서추출물의항균활성이확인된균주를대상으로최소저해농도 (MIC) 실험을실시하였다. 추출물을 0.5-50 mg/ml 농도로희석하고균주와혼합하여배양한후흡광도를측정하여각각대상균주의생육을저해하는정확한농도를확인하고자하였다. 각농도의추출물 100 µl과생균수를 1 10 7 CFU/mL로조정한실험균주배양액 2 µl를 96-well plate(intron biotechnology, Seongnam, Korea) 에넣은후각각균주에적합한배양조건에서배양하였다. 균주배양액대신액체배지를혼합한시료를대조군으로하였다. 배양후에는 UV-Vis spectrometer(spectra PLUS 384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 를이용하여 600 nm 에서흡광도를측정하였다. 대조군과비교하여균주의증식이관찰되지않는추출물의최소농도를 MIC 로결정하였다. 5. 추출물의최소사멸농도 (minimum bactericidal concentration, MBC) Disc diffusion method 와 MIC 실험을통하여추출물에의한생육저해효과가확인된균주를대상으로최소사멸농도 (MBC) 실험을수행하였다. MBC 는액체배지에 MIC 의추출물과실험균주를넣고배양한후, 배양시료 100 µl 를취하여십진희석후평판배지에도말하고각각최적조건에서배양하여생성되는 colony( 집락 ) 를확인하였다. MIC 에서 colony 가관찰되면높은농도로재수행하여최종적으로실험균주를 99.9% 이상사멸시키는최소농도를 MBC 로결정하였다. Korean J. Food Cook. Sci. Vol. 31, No. 5 (2015)
518 이수경 이승헌 박은진 6. 추출물의생육저해효과 (time killing curve assay) 추출물에의한생장억제작용이관찰된균주들의최소저해농도 (MIC) 에서균주들을 24-48 시간배양하면서 3 시간간격으로 UV-Vis spectrometer(molecular Devices) 를이용하여흡광도값을측정하였다. 96-well plate(intron biotechnology) 에추출물 100 µl, 2 배농축된액체배지 100 µl 그리고생균수를 1 10 7 CFU/mL 로조정한배양액 2 µl 을혼합한후각각최적배양조건에서배양하였다. 생육저해효과는균주들각각의배양시간에따른생육곡선으로나타내었다. 7. DPPH 의라디칼소거능을이용한추출물의항산화활성추출물에의한라디칼소거능을확인할수있는비교적안정한물질인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 가반응후변색되는원리를이용하여항산화활성을측정하였다. 추출물은 50% 에탄올과 0.1, 0.5, 1 그리고 5 mg/ml 농도가되도록혼합하였고, DPPH도 50% 에탄올에용해시켜 2.0 mm DPPH를제조하였다. 빛이차단된갈색시험관에각농도의추출물 0.1 ml와 2 mm DPPH 0.9 ml를혼합하여실온에서 15분동안반응시킨후, UV-Vis spectrometer (Molecular Devices) 로 517 nm에서흡광도를측정하였다. 표준물질로는 BHA(butylated hydroxyanisole, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 를사용하였다. 추출물과표준물질의라디칼소거능은아래의식을이용하여계산하였으며, DPPH의농도가 50% 감소하는데필요한시료의농도를 IC 50(half maximal inhibitory concentration) 값으로나타내었다. DPPH free radical scavenging capacity (%) = [(A - B)]/A 100 A: absorbance of the control, B: absorbance of the sample 8. 통계처리모든실험을 3회이상의독립적인실험을수행하여결과를평균 ± 표준편차로나타내었다. 각각의실험결과는 SPSS 통계분석프로그램 (SPSS 18.0K for windows, SPSS Institute Inc., Chicago, IL, USA) 의분산분석 (analysis of variance) 을수행하고 Duncan s multiple range test에의해평균값에대한유의차 (p<0.05) 를검증하였다. Ⅲ. 결과및고찰 1. 항균활성효과측정 (disc diffusion method) 황칠나무잎에탄올추출물의식중독, 비듬그리고충치의원인이되는미생물에대한항균활성측정결과를 Table 2에나타내었다. 실험을수행한총 12종 14개의균주중그람양성균 5종 7개에서만생육저해환 (inhibition zone) 을관찰할수있었고, 생육저해환의크기는추출물의농도가증가할수록유의적으로커짐을확인할수있었다 (p<0.05). 황칠잎추출물에대한민감도는시험미생물에따라다르게나타났으며, 가장낮은농도인 5 mg/ml 에서 S. aureus KCTC 1916가유일한생육저해환 (6.7 mm) 을보여가장높은항균활성을나타내었다. 이어시험농도 10 mg/ml에서는 S. aureus KCTC 1621와 B. cereus KACC 12672가각각 8.7과 7 mm의생육저해환을나타내었으며, S. aureus KCTC 1916는 7 mm로 S. aureus의경우같은종 (species) 에서도황칠추출물에대한민감도에차이가있음을확인하였다. 특히 S. mutans KACC 16833은시험농도중 50 mg/ml에서만 11 mm의생육저해환을나타내었으며, E. faecalis KCTC 3206와 L. monocytogenes KCTC 3710는모두 30과 50 mg/ml에 Table 2. Inhibition of various pathogenic microbial growth by ethanol leaf extract of Dendropanax morbiferus Lev. Strians Diameter of inhibition zone on plate (mm) 1) 50 mg/ml 30 mg/ml 10 mg/ml 5 mg/ml 1 mg/ml 0.5 mg/ml E. faecalis KCTC 3206 7.0±0.0 d3) 6.8±0.3 d - 2) - - - S. aureus KCTC 1621 11.3±0.6 a 10.0±0.0 c 8.7±0.0 b - - - S. aureus subsp. aureus KCTC 1916 11.0±1.0 a 10.0±0.0 c 7.0±0.0 d 6.8±0.0 d - - L. monocytogenes KCTC 3710 7.0±0.0 d 7.0±0.0 d - - - - L. monocytogenes KCTC 13064 9.7±0.6 c 8.7±1.2 b - - - - B. cereus KACC 12672 10.0±0.0 c 8.3±0.6 b 7.0±0.0 d - - - S. mutans KACC 16833 11.0±0.0 a - - - - - All values are means±standard deviation of three replicates. Different superscript letters in the same column and concentration (mg/ml) show differences at p<0.05 by Duncan s multiple range test. 1) Diameter (mm). 2) Not showed antimicrobial activity. 한국식품조리과학회지제 31 권제 5 호 (2015)
황칠나무 (Dendropanax morbiferus Lev.) 잎에탄올추출물의항균및항산화활성 519 서만각각생육저해환이관찰되었고농도에따른유의적인차이는없었다 (p<0.05). 또하나의 Listeria 속 (genus) 인 L. monocytogenes KCTC 13064 역시 30 과 50 mg/ml 에서생육저해환이확인되었으며농도의증가에따라그크기도유의적으로커졌다 (p<0.05). 낮은농도인 0.5 와 1 mg/ml 에서는모든균주에서생육저해환이관찰되지않았다. 탁도측정을통한항균활성농도확인은좀더세밀한농도측정이가능하다는장점이있으나탁도에영향을미치는추출물이나배지조성그리고사균 (dead cell) 이존재할때는그영향을받을수있다는단점이있다. 그러나 disc agar diffusion 방법을통한항균활성측정은탁도에영향을미치는인자들이배제된방법이므로섬세한농도결정은어렵지만오히려비교적정확한항균활성농도를확인할수있다는장점이있다. 현재까지황칠추출물의항균활성에대한연구가보고되어있지않기때문에다양한제주의자생식물추출물의항균활성과그효과를비교해보고자하였다. 제주해안가모래땅에서흔히볼수있는애기달맞이꽃 (Oenothera laciniata Hill) 의에탄올추출물도그람양성균인 S. aureus, L. monocytogens 그리고 B. cereus 에대해농도에비례한생육저해환을확인하여본실험결과와비슷한양상을보였다. 그러나본연구에서는항균활성을확인하지못한그람음성균인 E. coli, S. enteritidis 그리고 S. typhimurium 에대해서도생육저해환이관찰되어애기달맞이꽃추출물의항균스펙트럼 (spectrum) 이황칠잎추출물보다넓다는것을알수있었다 (Taniguchi S 등 2002, Kim JY 등 2007). 제주도습지에서자생하는다년생초본인삼백초 (Saururus chinesis) 추출물역시본실험과유사한결과를보였다. 그람음성균주 E. coli 와 S. typhimurium 에대해서는생육저해환이나타나지않은반면에메탄올과헥산분획물에서그람양성균인 B. subtilis 와 S. aureus 에대한생육저해환이확인되었다 (Lee JH 등 2013). 제주도해안가에서자생하는대극과식물인등대풀 (Euphorbia helioscopia) 의에탄올추출물은그람양성균인 B. subtilis 와그람음성균인 Pseudomonas aeruginosa 에대한높은항균활성을나타내었다 (Kim JY 등 2007). 최근제주에서재배가증가하고있는백년초 (Opuntia ficus-indica) 물추출물역시그람음성균인 E. coli 와그람양성균인 L. monocytogens 에대한항균활성이확인되었다 (Seo YH 등 2012). 제주도하천을따라분포하고있는구실잣밤나무 (Castanopsis cuspidata) 잎에탄올추출물또한그람양성균인 B. subtilis 와그람음성균인 E. coli, P. aeruginosa 의생육저해효과가있음을확인하였다 (Kim JY 등 2011). 이들추출물의 disc diffusion method 수행결과를종합적으로살펴보면전체적으로황칠나무잎추출물의저해환관찰농도보다비교적낮은농도에서저해환을관찰하였고, 그람양성균뿐만아니라본연구에 서항균활성이관찰되지않은그람음성균에대한생육저해효과를확인하였다. 본연구에서도 S. enterica, E. sakazakii, B. subtilis, P. aeruginosa, V. parahaemolyticus 그리고 S. sonnei 등의그람음성균과효모인 Malassezia furfur 를대상으로항균활성실험을수행하였으나추출물 50% 희석액에서도저해환을확인할수없었다. 그러나이러한추출물에따른생육저해효과차이는실험에사용한 paper disc 의크기와두께그리고추출물의 paper disc 에의흡수력차이등에따라결과가다르게나타날수있기때문에최소저해농도 (MIC) 와최소사멸농도 (MBC) 의측정을통한비교가필요할것으로판단된다. 식물과해조류등의추출물의항균활성을확인한연구결과들을살펴보면전체적으로그람음성균보다그람양성균에대한항균스펙트럼이넓다는것을알수있다 (Yoon SY 등 2010). 이는그람음성균의세포벽이그람양성균보다얇지만구조가더복잡하며, 외막으로둘러싸여있어서외부로부터의물질흡수를방해하는것으로판단된다. 그러나그람음성균일부에대해서도항균활성을보이는것은세균분류상그람음성균과양성균으로구분하고는있지만, 각각의세포구조에차이가있으므로이에따른각 strain 간의특성차이때문인것으로판단된다. 또한위에서열거한애기달맞이꽃과삼백초, 대풀, 백년초그리고구실잣밤나무잎추출물의항균활성은주로플라보노이드성분에기인하는것으로확인되었다. 현재까지보고된바에따르면황칠나무에는정유물질에속하는쌍환성세스퀴테르펜 (sesquiterpene), 알코올그리고에테르등의성분이함유되어있어서이들성분중에서일부가항균활성에역할을할것으로예상되지만 (Ahn JC 등 2002), 황칠나무잎추출물의항균활성성분에대해서는앞으로그물질확인및분리등의심도있는연구가추가로수행되어야할것으로판단된다. 2. 추출물의최소저해농도 (MIC) 와추출물의최소사멸농도 (MBC) Disc diffusion method에서추출물에의한생육저해가확인된 7가지균주에대하여항균활성을나타내는최저농도를세밀하게측정하기위하여흡광도측정을통한최소저해농도 (MIC) 를확인하였으며, 그결과를 Table 3에나타내었다. 실험을실시한균주중 B. cereus KACC 12672가가장낮은농도인 2.5 mg/ml에서생육이저해되었으며, S. aureus KCTC 1916은 3 mg/ml, S. aureus KCTC 1621은 4 mg/ml, S. mutans KACC 16833는 5 mg/ml, L. monocytogenes KCTC 13064는 7.5 mg/ml, L. monocytogenes KCTC 3710는 10 mg/ml의 MIC를확인하였다. 또한 E. faecalis KCTC 3206의 MIC는 15 mg/ml로실험대상균주중가장높은수치의 MIC를나타내었다. Korean J. Food Cook. Sci. Vol. 31, No. 5 (2015)
520 이수경 이승헌 박은진 앞서 disc diffusion method 에서확인한바와같이, 같은종 (species) 내에서도 strain 간의 MIC 차이가있음을알수있었다. 제주자생식물추출물의항균활성을확인한결과를살펴보면, MIC 가대체적으로가장낮게확인된 S. aureus 에대한 MIC 는애기달맞이꽃추출물 10 µg/ml, 구실잣밤나무잎추출물 0.5 mg/ml 그리고삼백초추출물 2.5 mg/ml 등으로확인되었다. 또한 L. monocytogenes 의경우에는구실잣밤나무잎과애기달맞이꽃추출물의 MIC 가각각 1 과 50 mg/ml 로나타나같은실험균주에대해서도식물추출물종류에따라 MIC 에큰차이가있음을알수있었다. 본연구에서사용된황칠나무잎추출물의미생물에대한 MIC 를동일대상균주별로비교하여살펴보면, S. aureus 는 3-4 mg/ml, L. monocytoges 는 7.5-10 으로확인되어위에언급한추출물과농도를단순비교하였을때중간정도되는항균활성을나타내는것으로판단된다. Disc diffusion method 를이용하여측정한항균활성최저농도와 MIC 를비교하면, 대부분 1/2-1/4 정도 MIC 가낮게나타났고, S. mutans KACC 16833 는 MIC 수치가 1/10 정도낮게측정되었다. 이와같이결과가나타난이유중하나는두실험방법의차이때문이라고추측된다. Disc diffusion method 인경우, 고체배지를사용하여항균활성을측정하기때문에대상추출물이고체배지로의확산이어렵거나확산속도가현저히떨어진다면추출물과미생물이접촉하는표면적이넓은액체배지를이용한 MIC 실험결과보다그민감도가감소할것이다. 또한 MIC 는흡광도를이용하여측정하는시험법이므로황색의황칠나무잎추출물처럼흡광도에영향을미치는색소를가지는시료의경우에추출물의색이탁도에영향을미쳐서 MIC 결정에영향을미칠것으로판단된다. 그러나이와같은경우에는흡광도측정의대조군을추출물을첨가한배지로사용하기때문에오차를감소시킬수있다고생각된다. 따라서 disc diffusion method 와 MIC 수행으로농도의범위를축소시킨이후에배양을통하여시료의생균수를직접측정하는최소사멸농도 (MBC) 측정이추가로수행되었다. 생균수측정을통하여각실험균주를 99.9% 이상사멸하는 MBC 를확인한결과 (Table 3), 모든대상균주에서 MBC 는 MIC 보다높은것으로확인되었다. MIC 가 10 mg/ml 미만인균주들은비슷한양상의 MBC 를보였으나, 10 mg/ml 이상인균주들은 MIC 와 MBC 양상이다르게나타났다. 실험균주 B. cereus KACC 12672 는 MBC(MIC) 는 5(2.5) mg/ml, 다음으로 S. aureus KCTC 1621 과 KCTC 1916 이각각 6(3) 과 8(4) mg/ml 그리고 S. mutans KACC 16833 이 10(5) mg/ml 으로확인되었다. 그러나 E. faecalis KCTC 3206, L. monocytogenes KCTC 3710 과 KCTC 13064 는각각 30(15), 40(10) 그리고 40 Table 3. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of ethanol leaf extract of Dendropanax morbiferus Lev. against various pathogenic microorganisms Strains MIC (mg/ml) MBC (mg/ml) E. faecalis KCTC 3206 15.0±0.0 e 30.0±0.0 S. aureus KCTC 1621 3.0±0.0 d 6.0±0.0 S. aureus subsp. aureus KCTC 1916 4.0±0.0 d 8.0±0.0 L. monocytogenes KCTC 3710 10.0±0.0 c 40.0±0.0 L. monocytogenes KCTC 13064 7.5±0.0 c 40.0±0.0 B. cereus KACC 12672 2.5±0.0 b 5.0±0.0 S. mutans KACC 16833 5.0±0.0 a 10.0±0.0 All values are means±standard deviation of three replicates. Different superscript letters in the same column and concentration (mg/ml) show differences at p<0.05 by Duncan s multiple range test. (7.5) mg/ml 의 MBC(MIC) 값을나타내어 MBC 와 MIC 간의농도증감에대한상관관계를확인할수없었다. 뿐만아니라같은종 (species) 인 S. aureus KCTC 1621 과 KCTC 1916 그리고 L. monocytogenes KCTC 3710 과 KCTC 13064 는각각다른 MBC 와 MIC 농도를나타내어, disc diffusion method 결과와더불어같은종 (species) 이라도각각의 strain 에따라항균물질에대한민감성에차이가있음을확인할수있었다. 일반적으로 MIC 가미생물의생육을저해하는항균물질의최소농도를의미하지만, 이농도가반드시미생물을멸균시키는않는다. 액체배지배양후흡광도상에서는미생물증식을확인할수없지만이를고체배지에도말했을때는집락 (colony) 를확인할수있는농도라는것이다. 따라서이러한액체배양액을고체배지에도말했을때도 colony 가확인되지않은농도를 MBC 로결정하고, 이농도에서는미생물이 99.9% 이상사멸됨을의미한다. 일반적으로특정병원균에대한항균물질투여시, MIC 보다수배높은농도를사용한다 (Archer GL & Polk RE 2008). 그러나 MIC 나 MBC 실험은특정시간에서만미생물증식을확인하기때문에어느시점부터미생물생육이억제되는지또는활성화되는지등의전체적인경향에관한분석이어렵다. 따라서실제미생물증식에필요한시간동안혹은그이상의시간동안일정시간대별로흡광도를측정하여시간에따른항균물질에대한미생물의반응양상을확인하는생육저해효과 (time killing curve assay) 를분석하는실험이수행되어야한다. 3. 추출물의생육저해효과황칠잎에탄올추출물에의하여증식억제가확인된 한국식품조리과학회지제 31 권제 5 호 (2015)
황칠나무 (Dendropanax morbiferus Lev.) 잎에탄올추출물의항균및항산화활성 521 MIC 를첨가한액체배지에서대상미생물배양을시작한직후부터이후총 48 시간동안 3-12 시간간격으로그흡광도를측정한결과를 Fig. 1 에나타내었다. 추출물을첨가하지않은미생물은배양 3 시간이후급격하게증식하는대수기에접어들었음을알수있었다. 그러나 E. faecalis KCTC 3206, S. aureus KCTC 1916, L. monocytogenes KCTC 3710 과 13064 그리고 S. mutans KACC 16933 은전체배양시간동안흡광도를통한증식은확인할수없었다. 반면 S. aureus KCTC 1921 은 3 시간이후그리고 B. cereus KACC 12672 는 12 시간이후흡광도를통한미약한증식을확인할수있었다. 따라서흡광도측정을통한 MIC 를확인하고자하는경우나특정시간에배양을통한 MBC 를확인하고자할때는한시점이아닌 2-3 개의여러시점을정해서그결과를측정하는것이실험결과에서오차를줄일수있을것으로판 단된다. 4. 추출물의항산화효과 (DPPH 의라디칼소거능 ) 항산화활성을나타내는기작은이들물질이인체에서노화와세포손상에의한질병의원인이되는자유라디컬 (free radical) 를소거하는것이다. 시험물질로는비교적안정한라디컬인 DPPH를이용하여이를소거하는정도를수치로계산하여물질의항산화활성을나타낸다. 황칠잎에탄올추출물의항산화효과를확인하기위하여추출물과합성항산화제인 BHA의 DPPH 라디칼소거활성을분석하고그결과를 Table 4에제시하였다. 황칠추출물의 DPPH 라디칼소거능은 5, 1, 0.5 그리고 0.1 mg/ml에서각각 89.8%, 76.4%, 44.7% 그리고 19.1% 로측정되었으며, 농도감소에따라그활성도유의적으로감소하였다 (p<0.05). 추출물의항균활성정도를비교하기 Fig. 1. Growth curves of microorganisms treated with ethanol leaf extract of Dendropanax morbiferus Lev. Korean J. Food Cook. Sci. Vol. 31, No. 5 (2015)
522 이수경 이승헌 박은진 Table 4. DPPH radical scavenging activity of ethanol leaf extract of Dendropanax morbiferus Lev. Concentrations (mg/ml) BHA 1) Dendropanax morbiferus Lev. extracts. 5.0 92.6±0.1 a 89.8±0.0 a 1.0 92.5±0.1 a 76.4±2.9 b 0.5 90.0±0.2 a 44.7±0.7 d 0.1 49.0±0.2 c 19.1±3.6 e IC 50 2) 0.6±0.0 1.0±0.1 All valus are means±standard deviation of three replicates. Different superscipt letters in the same column and concentration (mg/ml) show differences at p<0.05 by Duncan s multiple range test. 1) Butylated hydroxyanisole (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 2) The half maximal inhibitory concentration of radicals. 위하여사용한 BHA 는추출물과같은농도인 5, 1, 0.5 그리고 0.1 mg/ml 에서각각 92.6, 92.5, 90 그리고 49% 로확인되었으며, 0.1% 에서만활성에유의적인감소를보였다 (p<0.05). 추출물과 BHA 의농도에따른 DPPH 라디칼소거능수치만살펴보면비슷한활성을나타내지만, 추출물의수득률 (29.2%) 만단순히고려하면황칠잎은측정된값의 1/3 정도의활성을보이는것으로판단할수있다. 본연구에서는에탄올추출물을분석하였지만, 물과에탄올추출물의항산화활성을비교한연구결과에서추출용매에따른유의적인차이는확인할수없었다 (Cho YJ 2014). 구실잣밤나무추출물은사용한용매종류에따라 DPPH 소거능에차이가있었으며, 물이가장높고, 에탄올과에틸아세테이트등을사용했을때는 BHA 와비슷한수치의항산화활성을나타내었다 (Kim JY 등 2011). 따라서추후에는황칠나무잎의생리활성을확인하기위하여에탄올뿐만아니라순차적용매분획물에대한연구도수행되어야할것으로판단된다. 결과로제시하지는않았지만황칠잎추출물의활용범위를넓히고자추출물이첨가된배지에젖산균 (Leuconostoc mesenteroides KACC 17862, Weisella koreensis KACC 11853 그리고 Lactobacillus plantarum KACC 11451) 을접종하여발효과정을거친후획득한발효액의항균활성을분석하였다. 그결과황칠잎추출물에의한증식억제가관찰되지않았던그람양성의 P. aeruginosa 와그람음성인 V. parahaemolyticus 가발효된황칠잎추출물에의해서는그증식이억제됨을확인하였다. 추출물을제외하고젖산균만을이용한발효액에서는항균활성이나타나지않았기때문에이는발효에의해추출물이다른물질로분해또는합성되어항균활성을나타내는것으로추측된다. 따라서추출물뿐만아니라황칠잎을직접발효시킨후이에대한다양한생리활성을분석하는연구가추가로수행되어야할것으로판단된다. 최근들어황칠잎 분말을빵과국수등에첨가하고자하는연구가진행되고있으며, 이에따라본연구결과는추후개발되는황칠첨가식품의생리활성기능을제시해줄수있는기초자료가될것으로기대한다. Ⅴ. 결론 본연구에서는제주도에자생하고있는황칠나무잎에탄올의항산화활성을분석하고다양한유해균에대한항균활성을확인하고자하였다. 실험에이용된총 12 종 14 개균주중그람양성인 7 개균주에서만추출물의생육저해효과를확인하였다. 생육저해환의크기는추출물의농도증가에비례하여유의적으로커졌으며, S. aureus KCTC 1916 만이가장낮은농도인 5 mg/ml 에서생육이저해되어민감도가높았다. 흡광도를측정하여확인한 MIC 항균활성실험에서는가장낮은농도인 2.5 mg/ml 에서 B. cereus KACC 12672 의생육이저해됨을확인하였고, E. faecalis KCTC 3206 은가장높은농도인 15 mg/ml 에서생육이저해됨을알수있었다. 생균수측정을통하여실험균주 99.9% 이상을사멸하는 MBC 를확인한결과, 모든대상균주에서 MBC 가 MIC 보다높은것으로확인되었다. 추출물에의하여증식억제가확인된 MIC 를첨가한액체배지에서대상미생물을배양한후총 24-72 시간동안 3 시간간격으로그흡광도를측정한결과, B. cereus KACC 12672 에서만 12 시간이후흡광도를통한미약한증식을확인할수있었다. 황칠추출물의 DPPH 라디칼소거능은 5, 1, 0.5 그리고 0.1 mg/ml 에서각각 89.8, 76.4, 44.7 그리고 19.1% 로측정되었으며, 농도감소에따라그활성도유의적으로감소하였다. 이는추출물과같은농도의 BHA 를대조군으로사용하였을때와비슷한수치이다. 본연구에서확인된항균활성과항산화활성결과로부터황칠잎에탄올추출물의천연보존제및천연항산화제로의이용가능성을확인하였으며이는추후황칠을이용한식품제조를위해서기초자료가될것으로기대한다. 감사의글 이논문은 2015 학년도제주대학교학술진흥연구비지원사업에의하여연구되었음. References Ahn JC, Kim MY, Kim OT, Kim KS, Kim SH, Kim SH, Hwang B. 2002. Selection of the high yield capacity of Hwangchil lacquer and identification of aromatic components in essential oil of Dendropanax morbifera Lev. Korean J Med 한국식품조리과학회지제 31 권제 5 호 (2015)
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