천연물분리정제를위한 Column 의선택 YMC Co.,Ltd. (Q110613A)
오늘의주제 화합물별로대응하는 Column 의선택 Column/ 충진제선택의기본 최적의 ODS Column 선정방법 ODS 이외의 Column 선정하는경우 생체고분자의분리를위한 Column의선정 천연물정제의실례
Column/ 충진제선택의기본 (1) 소재의물성에따른선택 세공경 비표면적 세공경 (nm) 6 ~ 1 ~ 30 ~ 100 비표면적 (m /g) 650 ~ 330 ~ 150 ~ 0 시료부하량大小 관능기결합량 ( 탄소함유율 ) 大 小 시료적용범위 ( 분자량 ) 小 범용적 고분자 大특수 3
Column/ 충진제선택의기본 () 분리 Mode 종류 역상 (Reversed Phase Chromatography) 순상 (Normal Phase Chromatography ) 이온교환 SEC (Ion Exchange Chromatography) (Size Exclusion Chromatography) 그외 - Affinity chromatography - Hydrophobic chromatography etc. 어떤분리 Mode 를선택하는것이좋을까요? 4
분석시료Column/ 충진제선택의기본 (3) 분리 Mode 의선택방법 (1) 분석시료의특성 분리 Mode 수용성지용성 이온교환이온성역상 분비이온성 5 SEC 역상 SEC 순상역상 구체적인화합물별로는어떤 Mode 를사용하고계십니까?
Column/ 충진제선택의기본 (4) 화합물별분리 Mode 의선택방법 () 의약품, 항생물질, 항균제, 대사물, 스테로이드, 비타민, 저분자천연물등. 당류 역상순상역상순상 SEC 핵산류有機酸 脂肪酸유기산 지방산 역상순상 SEC Ion 교환역상순상 단백질 펩타이드 역상순상 SEC Ion 교환 構造異性体구조이성체光学異性体광학이성체 역상순상역상순상 아미노산 역상 대상화합물에따른분리 Mode 선택이중요합니다. 현재세계적으로역상의추세가강합니다. 6
Column/ 충진제선택의기본 (5) 역상 Chrpmatography 의특징 역상 Chromatography 의이점 폭넓은물질에적용가능하기때문에다른분리모드에비해적용범위가넓다 높은분리능을가지고있기때문에정밀한분리를필요로하는분취에추천할수있다. 의약 역상 Chromatography 농약식품 화학 다양한분야에적용 7
Column/ 충진제선택의기본 (6) 관능기의종류와분리특성 관능기의종류 ODS (C18) : -Si-(CH)17-CH3 Ph : C8 : -Si-(CH)7-CH3 CN : -Si- -Si-(CH)3-CN C4 : -Si-(CH)3-CH3 C30 : -Si-(CH)9-CH3 TMS(C1) : -Si-CH3 관능기 C30 C18 C8 Ph C4 CN TMS 소수성大小 수소결합성小大 평면인식능 大 小 π-π 상호작용 8
최적의 ODS Column 선택 (1) 역상에사용되는 ODS (C18) 현재는역상 Chromatography 에서는, ODS(C18) 가다용되고있다. 다양한회사의다양한 ODS 충진제를판매되고있다 YMC 만해도 YMC-Triart C18 Pro series ODS YMC-Pack ODS series J sphere ODS series YMC-PolymerC18 이렇게다양하다. 그렇다면, 어떻게 ODS 충진제를선정해야할까요? 9
합성최적의 ODS Column 선택 () 주요 ODS 컬럼의분리선택성비교 0.180 수소결0.160 (Pro C4) 고친수성 Type 소수성 : 소수소결합성 : 대 분리선택성이비슷한컬럼으로는동일 Method 이행이쉽다. 분리도를크게바꾸고싶은경우는포지션이동떨어진컬럼을선택. 0.140 0.10 0.100 0.080 Hydrosphere C18 CAPCELL PAK C18 AQ (Pro C8) Gemini C18 Develosil C30-UG Atlantis dc18 ZORBAX SB-C18 Atlantis T3 TSKgel ODS-80Ts Develosil ODS-MG CAPCELL PAK C18 MGIII Pro C18 CAPCELL PAK C18 MG Inertsil ODS-4 Hypersil GOLD Unison UK-C18 Gemini-NX C18 CAPCELL PAK C18 MGII SunFire C18 XBridge C18 Luna C18() Inertsil ODS-3 XTerra MS C18 Eternity-C18 Mightysil RP-18 L-column ODS Triart C18 Symmetry C18 Cadenza CD-C18 TSKgel ODS-100S L-column ODS ZORBAX Extend-C18 표준 ODS 소수성 : 중수소결합성 : 중 Develosil ODS-SR 고소수성 Type 소수성 : 대수소결합성 : 소 Pro C18 RS 0.060 Eluent : MeOH/W (80/0) [amylbenzene], MeOH/W (30/70) [caffeine, benzene] 0.040 1.00 3.00 5.00 7.00 9.00 11.00 13.00 15.00 소수성 (J100917A) 10
최적의 ODS Column 선택 (3) 관능기의밀도에의한차이 (1) 고밀도 ODS 중밀도 ODS 저밀도 ODS (n=0-8) Alkylbenzenes ODS기결합밀도 ( 탄소함유율 ) 가높을수록분리능은커진다 11
최적의 ODS Column 선택 (4) 표준적 ODS 고친수성 ODS Sample : Xanthine oxidase inhibitor and its metabolites in human serum Eluent : 10 mm CH 3 COOH-CH CH 3 COONH 4 (ph 4.5) mau 10 1 표준적 ODS (Brand I7) 탄소함유율 18% 입자경 1.7 mm mau 10 고친수성 ODS (Hydrosphere C18) 탄소함유율 1% 입자경 mm 1 O HN O NH Uric acid O N HN N NH NH O NH Hypoxanthine 3 5 1 3 HN O O NH N NH 5 4 5 3 4 5 4 Xanthine OH N N HO NH NH 0 0 (F0708Z) 1.0.0 min 0 0 (F0708F) 1.0.0 min 5 Oxipurinol OH N N Flow rate : 0.6 ml/min Temperature : 37 Detection : UV at 60 nm 고극성화합물의분리능이나분리개선에는, 수소결합성 ( 친수성 ) 이크고물비율이높은이동상에적응가능한타입이적합하다 N NH Allopurinol 1
Sample : Nicardipine HCl after light irradiation 최적의 ODS Column 선택 (5) 표준 ODS 고밀도 ODS Eluent : 0 mm KH PO 4 -K HPO 4 (ph 6.9)/methanol (5/75) 표준 ODS (YMC-Pack Pro C18) 고밀도 ODS (YMC-Pack Pro C18 RS) 1 탄소함유율 16% 관능기밀도.5 mmol/m monomeric 1 탄소함유율 % 관능기밀도 3. mmol/m polymeric Rs=.10 Rs=3.31 Nicardipine HCl 1. 원체. 분해물 Column : 150 X 4.6 mmi.d. (5 mm) Flow rate : 1.0 ml/min Temperature : 37 Detection : UV at 54 nm 소수성화합물에서구조가조금다른성분끼리의분리에는고밀도타입이적합하다 13
최적의 ODS Column 선택 (6) 최신 ODS 로 Peak 의형상과내구성개선 Peak 형상이나 Column 내구성에문제가있는경우에는, 최신 ODS 컬럼의 YMC-Triart C18 가추천합니다. YMC-Triart C18 의특징은 탁월한화학적내구성 70 까지사용가능 ph1-1의범위에서사용가능 모든조건으로뛰어난 Peak 형상 화합물조건에의존하지않는뛰어난 Peak 형상 분취용으로는, 동일한화확적내구성을가지는 Prep-Triart 시리즈가있습니다. 14
기존 ODS Column 의 Peak 형상의문제점 최적의 ODS Column 선택 (7) 최신 ODS 로 Peak 의형상개선 (1) 알칼리성화합물과실라놀에작용하는이온적상호작용에의한영향 배위성화합물과충진제중의금속불순물과의상호작용에의한영향 H 3 C CH N O 3 N + Clemastine Cl OH 8-Quinolinol (8-Hydroxyquinoline) O - Si F090717I07 Si Me Q10049B 6.0 7.0 8.0 min 0 4 min Column : 5 µm, 50 X.0 mmi.d. Eluent : A) 10 mm KH PO 4 -K HPO 4 (ph 6.7) B) acetonitrile 5-90%B (0-10 min), 90%B (10-15 min) Flow rate : 0. ml/min Detection : UV at 30 nm Temperature : 5 Column : 5 µm, 150 X 3.0 mmi.d. Eluent : 0 mm KHPO4-KHPO4(pH7.0)/methanol(35/65) Flow rate : 0.4 ml/min Detection : UV at 54 nm Temperature : 40 15
최적의 ODS Column 선택 (8) 최신 ODS 에의한 Peak 형상개선 () 염기성화합물 배위성화합물 YMC-Triart C18 (1.9 mm) Hybrid 계 C18 (Brand I7/1.7 mm) Silica 계 C18 (Brand L6/1.8 mm) Silica 계 C18 (Brand M/1.9 mm) Coreshell 입자 C18 (Brand L7/.7 mm) Coreshell 입자 C18 (Brand H/.7 mm) Coreshell 입자 C18 (Brand G6/1.7 mm) O CH 3 H 3 C H 3C N CH 3 Dextromethorphan (Peak ) 1 3 1 3 1 1 3 1 1 3,3 3 (01100700004) (01007160000) (010078000069) (0100700000) (01007900000) 1 3 1 (010079000050) (0100917000031) HO 1 O 1 1 1 1 Hinokitiol (Peak 1) 1 (010090600009) (0100715000018) (010076000031) 최적의 Peak 형상의범위 TF (Dextromethorphan) TF (Hinokitiol) Hinokitiol 이용출되지않음 (0100916000033) 0.5 1.0.0 3.0 4.0 5.0 0.0 5.0 10.0 15.0 min0.0 4.0 8.0 1.0 min Tailing factor (TF) (010071000049) (01007700001) (010077000051) Hinokitiol 흡착이큼 Hinokitiol 이용출되지않음 6.0 Column :50X.0 mmi.d. or.1 mmi.d. Flow rate : 0. ml/min Temperature : 40 Eluent : 0 mm KH PO 4 -K HPO 4 (ph 6.9) /acetonitrile (65/35) Sample : 1. Chlorpheniramine. Dextromethorphan 3. Propyl paraben (I.S.) *TF 은, Dextromethorphan, Hinokitiol 의단독값입니다. Eluent : acetonitrile/0.1% H 3 PO 4 (40/60) Sample : 1. Hinokitiol. Methyl benzoate (I.S.) Triart C18 는, 모든이온성화합물에대해뛰어난 Peak 형상보입니다. 16
최적의 ODS Column 선택 (9) 최신 ODS 에의한내구성개선 1 1. Barbital. Phenobarbital 4. Pentobarbital 5. Secobarbital Retention stability of secobarbital (peak 5) 3. Hexobarbital 3 4 5 1000 th 800 th 600 th % of initial retention time 10 100 80 60 40 0 00 00 400 600 Run number 800 1000 400 th 0 1 3 4 5 6 7 min 00 th 1 st Column : YMC-TriartC18 (5 µm, 50 X.0 mmi.d.) Eluent : A) 0 mm HCOONH 4 -NH 3 (ph 9.5) B) methanol 0-90%B (0-7 min) Flow rate : 0. ml/min Detection : UV at 40nm Temperature : 5 YMC-Triart C18 는상기와같은종래 Silica Gel 에서는곤란한알칼리성조건이어도뛰어난내구성을보이며, 장기간에걸쳐서안정된분석이가능합니다. 17
ODS 이외의 Column 을선정하는경우 (1) ODS 에서는분리되지않는경우와용출시간이나분리를크게바꾸고싶은경우 관능기종류의변경 ODS C8, C4, Ph, TMS, CN, Carotenoid (C30), etc. 18
ODS 이외의 Column 을선정하는경우 () 관능기를변경하여분리와용출시간개선 YMC-Pack Pro C18 1 3 4 5 Column : YMC-Pack Pro C18, C8, C4 (5 mm,1 nm) 150 X 4.6 mmi.d. Eluent : 0 mm KH PO 4 -K HPO 4 (ph6.9) / methanol (40/60) Flow rate : 1.0 ml/min Temperature : 37 Detection : UV at 0 nm YMC-Pack Pro C8 1 3 4 5 6 7 부정맥치료약 1. Phenytoin. Propranol HCl 3. Qunidine 4. Lidocaine 5. Diltiazem HCl 6. Verapamil HCl 7. Nicardipine HCl 6 7 YMC-Pack Pro C4 1 3 4 5 단시간에완전분리 6 7 관능기변경에따라소수성외수소결합성이나평면인식능등의분리선택성도변화한다 19
ODS 이외의 Column 을선정하는경우 (3) π-π 상호작용을이용하는경우 YMC-Pack Pro C18 YMC-Pack CN 1, 1 3 π-π 상호작용 N C 3 Si O Si Column : 50 X.0 mmi.d. Eluent : ODS - methanol / water (30/70) CN - methanol / water (0/80) Flow rate : 0. ml/min, Temperature : 37 Detection : UV at 54 nm Dinitrobenzene 이성체 1. p-dinitrobenzene. m-dinitrobenzene 3. o-dinitrobenzene π 전자를가지는화합물의경우는, CN 나 Ph 컬럼이독자적인선택성을나타낸다 0
ODS 이외의 Column 을선정하는경우 (4) ODS C30 (YMC Carotenoid) 표준 ODS,3 4 monomeric End cap 활용 4 1,3 End cap 비활용 4 1 3 C30 밀도 : 중 1 0 5 10 min Column : 150 X 4.6 mmi.d. Eluent : methanol/tbutylmethylether /water (81/15/4) Flow rate : 1.0 ml/min Temparature : 30 Detection : UV/VIS at 480 nm Xanthophyll 류 1. Astaxanthin. Lutein 3. Zeaxanthin 4. Canthaxanthin polymeric C30 밀도 : 고 0 1 1 3 4 0 1 0 0 0 1 0 1 3 0 10 0 관능기의변경과아울러, 그결합밀도나 End-capping 유무에의한선택성변화의활용이효과적 C30 에서는 Carotenoid 류와같은지용성이높고분자사이즈가큰화합물군에는, Polymeric End-cap cap 비활용의 C30 고정상 (YMC Carotenoid) 이유효합니다. min min 0 4 min min 1
생체고분자의분석을위한 Column 선택 (1) 생체고분자의경우는, 대상화합물의분자량이나성질을고려해, 최적인분리모드 / 충진제를선택하는것이중요. 분리 Mode 역상 관능기의종류충진제의세공경 Ion exchange SEC(GPC/GFC)
생체고분자의분석을위한 Column 선택 () 생체고분자의분리 mechanism 과역상 Chromatography ~10 µm 단백질 CH3CN (%) Time 3
생체고분자의분석을위한 Column 선택 (3) 충전제의세공경지름에의한생체고분자분리에의영향 Angiotensin II (MW 1,046) VWD1 A, Wavelength=0 nm (A-80\0460031.D) VWD1 A, Wavelength=0 nm (AP-80\0410038.D) mau mau 1400 1400 100 1 nm 100 30 nm 1 nm 30 nm 1000 1000 800 800 600 600 400 400 00 00 0 0-00 5 6 7 8 9 min -00 5 6 7 8 9 min mau 1400 100 1000 BSA (MW 66,000) VWD1 A, Wavelength=0 nm (A-80\046001.D) VWD1 A, Wavelength=0 nm (AP-80\041001.D) mau 1400 100 1 nm 30 nm 1 nm 1000 30 nm 800 800 600 600 400 400 00 00 0 0-00 6 8 10 1 14 min -00 6 8 10 1 14 min 시료의분자사이즈에대해서충진제세공경지름이너무작아도, 너무커도 Peak 의확대가발생 분자사이즈에적절한세공경지름의선택이중요 4
생체고분자의분석을위한 Column 선택 (4) 충진제의관능기에의한분리 600000 1 nm 30 nm Insulin Chain B, Oxidized (MW 3,495) BSA (MW 66,000) 300000 Efficiency (plates/m) 400000 00000 C4 C18 C8 C4 C8 C18 00000 100000 C4 C8 C18 C4 C8 C18 0 0 0.05 0.05 0.1 0.5 0.5 1 Mass (mg) 0.05 0.05 0.1 0.5 0.5 1 Mass (mg) 작은단백질 펩티드에서는소수성의큰관능기가, 분자량수만정도의단백질에서는소수성의작은관능기가높은컬럼효율을나타낸다 5
생체고분자의분석을위한 Column 선택 (5) Column/ 충진제선택의기준 시료의분자량 官能基細孔径 C18 C8 C4 1 nm 5,000 0 nm 0,000 100,000 30 nm : excellent : good : moderate 6
생체고분자의분석을위한 Column 선택 (6) 세공경 관능기에의한분리비교 1. Cytochrome c 1,400. Insulin 5,733 3. Amyloid b-protein 4,330 4. Lysozyme 14,300 5. a-lactalbumin 14,100 6. Myoglobin 17,000 C8, 0 nm 최적화 1 4 3 조건 6 5 Column : 5 mm, 150 X 4.6 mmi.d. Eluent : A) water / TFA (100/0.1) B) acetonitrile / TFA (100/0.1) 5-60%B (0-0 min) Flow rate : 1.0 ml/min Temperature : 37 Detection : UV at 0 nm (040800.D) 0 5 10 15 min 세공경 비교 관능기 비교 C8, 1 nm 1 3 4 5 6 C18, 0 nm 1 3 4 5 6 (04073006.D) 1, (0407910.D) C8, 30 nm 1 3 4 5 6 C4, 0 nm 4 3 5 6 (0408004.D) (0407300.D) 0 5 10 15 min 0 5 10 15 min 7
생체고분자의분석을위한 Column 선택 (7) 생체고분자의분리 mechanism 과 Ion 교환 Chromatography 일반적인분리조건 고정상 +의해리기 ( 음이온교환체 )/ - 의해리기 ( 양이온교환체 ) 를결합시킨친수성고분자 이동상 10~50 mm완충액을초기이동상으로서카운터이온 (NaCl 가일반적 ) 을첨가 용출이동상중의카운터이온 (NaCl 농도 ) 을높이고, 총전하의작은시료로부터용출음이온교환 Chromatography 의경우 + + Cl- + Cl- NaCl (M) Time 8
단백질의총전하생체고분자의분석을위한 Column 선택 (8) 시료의전하에의한분석조건의설정단등전점 (pi pi) 단백질의정과부의전하가평형을이루는 ( 총전하가제로가된다 ) 점의 ph 단백질의+ 양이온교환체 (- 의해리기 ) 에결합 pi 총전0 하- 4 6 8 10 ph 음이온교환체 (+ 의해리기 ) 에결합 양이온교환체 시료의 pl 로부터 0.5~1.0 이상낮은 ph( 통상 ph 5~7) 의완충액을선택 음이온교환체 시료의 pi 로부터 0.5~1.0 이상높은 ph( 통상 ph 7~9) 의완충액을선택 단백질 :pi 나안정성을고려해완충액의 ph, 종류, 및이온교환체를선택한다 DNA 및 Oligonucleotide : 음이온교환체를선택한다 9
생체고분자의분석을위한 Column 선택 (9) 양이온 음이온교환 Column 의사용구분 monoclunal 항체의 Ion exchange mode 의분리 MAb : Mouse monoclonal IgG1 (Anti-human IgG4, Purified by DEAE chromatography, containing NaN 3 ) YMC-BioPro QA-F YMC-BioPro SP-F 5 mm, 100 X 4.6 mmi.d. 5 mm, 100 X 4.6 mmi.d. mau 4 3 NaN 3 MAb mau 6 NaN 3 MAb 4 1 0 P08044A 0 10 0 30 40 min 0 0 4 8 1 16 V11003B min Eluent : A) 0 mm Tris-HCl (ph 8.1) B) 0 mm Tris-HCl (ph 8.1) containing 0.5 M NaCl 10-5%B (0-60 min) Flow rate : 1.0 ml/min Temperature : 5 Detection : UV at 0 nm Injection : 14 ml Eluent : A) 0 mm MES-NaOH (ph 5.6) containing 30 mm NaCl B) 0 mm MES-NaOH (ph 5.6) containing 180 mm NaCl 0-40%B (0-0 min) Flow rate : 180 cm/hr (0.5 ml/min) Temperature : 30 Detection : UV at 80 nm Injection : 10 ml (1 mg/ml) 화합물의성질, 분리가목적에따라양이온교환, 음이온교환을구사하는것이유효. 30
생체고분자의분석을위한 Column 선택 (10) 생체고분자의분리 mechanism 과크기배제 Chromatography(SEC) 5~30 µm 일반적인분리조건 고정상그물코구조의세공 ( 포아 ) 을가지는 Silica Gel이나 Polymer 이동상시료의용해성이나안정성이높은 ph의완충액 ( 인산buffer, ph 7 부근이일반적 ) 충진제와의상호작용저감을위해소금이나수용성유기용매의첨가도유효 용출초기이동상의 Isocratic 용출 Time 31
생체고분자의분석을위한 Column 선택 (11) 크기배제 Chromatography(SEC) 화합물의분자 Size 에의한세공경을선택한다. YMC 에서는 다양한세공경의 SEC 용 Column YMC-Pack Diol 을준비.. Diol-60 분자량10,000 이하 Diol-10 분자량5,000-100,000정도 Diol-00 분자량10,000부터수십만 Diol-300 분자량수십만부터 3
YMC-Pack Diol-300 5 mm, 300 X 8.0 mmi.d. mau 생체고분자의분석을위한 Column 선택 (1) 사람혈청중의단백질 YMC-Pack Diol-00 5 mm, 300 X 8.0 mmi.d. mau :IgG (MW 150,000) :Transferrin (MW 75,000) Albumin (MW 66,000) 00 00 100 100 0 N080619A 0 10 0 30 min 0 N080619O 0 10 0 30 min Diol-300 과 Diol-00 의연결 YMC-Pack Diol-300 + Diol-00 5 mm, 300 X 8.0 mmi.d. X mau Eluent : 0.1 M KH PO 4 -K HPO 4 (ph 7.0) containing 0. M NaCl Flow rate : 0.5 ml/min Temperature : ambient (5 ) Detection : UV at 80 nm Injection : 0 ml Sample : Human serum (100 ml/ml) 100 0 N080616A 0 10 0 30 40 50 60 min 연결에의해 IgG 보다고분자부분및 IgG 와 Transferrin Albumin 의분리를모두개선 33
오늘의주제 화합물별로대응하는 Column 의선택 Column/ 충진제선택의기본 최적의 ODS Column 선정방법 ODS 이외의 Column 선정하는경우 생체고분자의분리를위한 Column의선정 천연물정제의실례 34
천연물정제의실례 Catechin류의분리 Polyphenol류의분리 Alkaloid류의분리 Capsaicin의분리 Banaba의 Corosolic acid의분리 펩타이드불순물의분취정제예 Insulin 최종정제 계란항체 IgY의정제 35
Catechin 류의정제 OH OH OH OH OH OH HO O OH OH HO O OH HO O OH HO O OH OH OH OH OH OH OH OH OH EGC EC EGCg OH ECg OH OH 분석컬럼 50 4.6 mmi.d. Semi- 분취컬럼 50 0 mmi.d. 분취 Fraction의분석 Flow rate:0.5 ml/min Load :0.4 mg(catechins) 19 9.5 ml/min 7.6 mg (catechins) Column : YMC-Pack R&D ODS-A (5µm,1nm) Eluent : acetonitrile/ethylacetate/ 0.05% TFA (1//86) Temperature : ambient Detection : UV at 80 nm 컬럼의 Size 를키워서간단하게 Scale Up 36
Polyphenol 류의분취정제 (1) 세공경비교 단량체 SIL (S-5 mm, 1 nm) 량체 3 량체 4 량체 각다량체는다수의이성체를형성해, 각 Peak는이성체가혼합물로서존재 목표순도 80%( 이성체혼합 ) Column : 50 X 4.6 mmi.d. Eluent : n-hexane/methanol/thf/formic acid (55/33/11/1) Flow rate :.0 ml/min Temperature : 5 Detection : UV at 80 nm Injection : 5 ml (0. mg/ml) SIL (S-5 mm, 6 nm) 량체 3 량체 4 량체 세공경지름 6 nm 를선택해분리의개선뿐만아니라, 비표면적이크기때문에높은부하량이가능 37
Polyphenol 류의분취정제 () 분취실시 분취조건의최적화 (500 X 10 S-10 mm, 6 nm mmi.d.) 7.1 ml/min 470 mg Load 량체 3 량체 4 량체 본정제 (500 X 100 mmi.d.) S-10 mm, 6 nm 710 ml/min.86 mg Load 량체순도 9.4% 3량체순도 80.6% 4 량체순도 86.8% Eluen t : n-hexane/methanol/thf/formic acid (55/33/11/1) Temperature : ambient Detection : UV at 80 nm 38
Alkaloid 류의정제 기본분리조건의탐색 150X4.6 mmi.d. (5 µm, 1 nm) 분석컬럼 -YMC-Pack Pro C18 (5 µm, 1 nm) Semi 분취컬럼 -Prep Pro C18 (10 µm, 1 nm) 분취의실현 50X 0 mmi.d. (10 µm, 1 nm) Berberine Flow rate : 1.0 ml/min loading : 10µg 분취 Fraction 분석 150X4.6 mmi.d. (5 µm, 1 nm) 분취조건의최적화 50X6.0 mmi.d. (10 µm, 1 nm) 0 10 0 30 40 50 min Flow rate :.0 ml/min loading : 500µg Flow rate : 0 ml/min loading : 10 mg Eluent : methanol/thf/10mm CH 3 COONH 4 (15//75) Temperature : 40 Detection : UV at 54 nm Eluent : acetonitrile/50mm KH PO 4 (50/50) containing 6mM SDS Flow rate : 1.0 ml/min Temperature : 40 Detection : UV at 54 nm 39
Capsaicin 의정제 Analysis Purification 40
Banaba 의 Corosolic acid 의정제 (1) 분취조건최적화 S-5 mm, 1 nm 1.0 ml/min S-10 mm, 1 nm 1.0 ml/min 압력이나 cost 삭감을고려해 10 um 로검토 Corosolic Acid 목표순도 95% 입자지름변경에의해불순물과의분리도저하 Column : YMC-Pack ODS-AQ 50 X 4.6 mmi.d. Eluent : methanol/water/tfa (85/15/0.05) Temperature : ambient Detection : UV at 10 nm S-10 mm, 1 nm 0.5 ml/min 유속의조절로분리를개선 41
Banaba 의 Corosolic acid 의정제 () 분취실시 부하량검토 50 X 4.6 mmi.d. 0.4 mg 부하 0.6 mg 부하 0.8 mg 부하 어느부하량에서도 목표순도를달성 순도 99.4% 순도 98.5% 순도 96.8% 목표순도를얻을수있는 최대부하량으로분취 순도 98.1% 50 X 50 mmi.d. 목표순도 ( 95%) 를달성 Column : ODS-AQ (S-10 µm, 1 nm) 50 X 50 mmi.d. Eluent : methanol/water/tfa (85/15/0.05) Temperature : ambient Detection : UV at 10 nm Injection : 94 mg 4
펩타이드불순물의분취정제예 (1) 분취 Target 목표순도펩타이드 99% 불순물 95% 분석 Chromatogram 불순물 함유량 1.8% 펩타이드 함유량 98.% Column : YMC-Pack C4 (5 µm, 30 nm) 150 X 4.6 mmi.d. Eluent : A) water/tfa (100/0.1) B) acetonitrile/tfa (100/0.085) 10-4%B (0-10 min), 4-30%B (10-30 min) Flow rate : 1.0 ml/min Temperature : 40 Detection : UV at 14 nm Injection : 0 µl (0. mg/ml) 43
펩타이드불순물의분취정제예 () Isocratic vs. Gradient 검토용분석컬럼 : YMC-Pack C4 (5 µm, 30 nm), 50 X 4.6 mmi.d. Isocratic 용출 3%CH 3 CN 1.0 ml/min 4 µg Load 100 µg Load Gradient 용출 0-8%CH 3 CN (0-40 min) 1. ml/min 4 µg Load 100 µg Load Eluent : A) water/tfa (100/0.1) B) acetonitrile/tfa (100/0.085) Temperature : 40 Detection : UV at 14 nm Isocratic 용출보다 Gradient 용출이 Peak 형상이샤프하고, 고농도회수가능 ( 분취 fraction의용량을저감 ) Gradient 용출을선택해유량검토후, 1 단계 Scale Up 으로 44
펩타이드불순물의분취정제예 (3) 부하량검토 (LAB Scale) 충진제컬럼 Size 유속부하량 : C4 (15 µm, 30 nm) : 50 X 10 mmi.d. : 5.7 ml/min : 945 µg (4 mg/ml X 35 µl) 용매혼합시의기포발생에의한노이즈발생을억제하기위해용리액조성을변경 A)water/TFA (100/0.1) B)acetonitrile/TFA (100/0.085) 0-8%B (0-40 min) 불순물 순도 45.6% 펩타이드 순도 99.3% A)acetonitrile/water/TFA (10/90/0.1) B)acetonitrile/water/TFA (50/50/0.1) 5-45%B (0-40 min) Temperature Detection : ambient : UV at 14 nm 불순물의목적순도 ( 95%) 를채우려면부하량을극단적으로줄일필요가있어서 펩티드의순도를기준으로최대부하량을결정하고불순물 fraction은재분취에 45
펩타이드불순물의분취정제예 (4) φ50 mm Column 에의한분취실시 50 x 50 mmi.d. 14 ml/min 5 mg Load 충진제 : C4 (15 µm, 30 nm) Eluent : A) acetonitrile/water/tfa (10/90/0.1) B) acetonitrile/water/tfa (50/50/0.1) 5-45%B (0-40 min) Temperature : ambient Detection : UV at 14 nm 펩타이드 순도 99.7% 펩타이드순도 99% 펩타디드순도 99% 분술물순도 0% 재분취 회수재분취에의한목적순도달성! 불순물 순도 97.4% 충분한분리도를얻기어려운경우나, 함유량이적어서부하량이늘어나지않는경우, 재분취를실시하는편이종합적으로는효율적인경우도있습니다. 46
Insulin 최종정제예 (1) 분취조건의최적화 5 µm, 0 nm 1.0 ml/min 55-60%B (0-30 min) 0.5 ml/min 57-60%B (0-15 분취조건의최적화 min) 5 µm 0 nm Column : YMC-Pack C8 150 4.6 mm I.D. Eluent : A) water / HCl (100/0.05N) B) methanol / HCl (100/0.05N) Detection : UV at 0 nm Temp. : ambient Sample : Insulin (bovine/human=10/1) 15 µm, 0 nm 세공경변경 0.5 ml/min 57-60%B (0-15 min) Particle Size를키워도목적물을얻을수있다면, Cost Down이가능 47
Insulin 최종정제예 () 분취실현 부하량검토 (150 X 4.6 mmi.d.) Loading amount mg 6 mg 분취의실현 (150 mm 50 mm I.D.) Load: 700 mg Purity 99% 99% Production 1.9 mg 5.3 mg Recovery 95% 88% 순도, 회수율및분취의효율을 고려하고, 부하량을결정 Scale Up의실현 Analytical Preparative Column size 150 X4.6 mmi.d. 150 X 50 mmi.d. Particle size 5 µm 15 µm Loading amount 6 mg 700 mg Flow rate 0.5 ml/min 60 ml/min Purity 99% Production 60 mg Recovery 88% Column : YMC * GEL C8, 15 µm, 0 nm Flow rate : 60 ml/min Eluent : A) water / HCl (100/0.05N) B) methanol / HCl (100/0.05N) 57-60%B (0--15 min, linear) Detection : UV at 0 nm Temperature : ambient 48
단백질정제에있어서 Column 의재생 초기열화회복주입0회세정 110419P01 0 4 6 8 10 1 14 min 110419P0 0 4 6 8 10 1 14 min 110419P 0 4 6 8 10 1 14 min 시료부하 insulin bovine + human serum 알칼리세정 0.1M NaOH/acetonitrile (50/50) 3CV Column : YMC-Triart prep C8 (S-10 µm, 0 nm) 50 X 4.6 mmi.d. Eluent : A)water/TFA (100/0.1) B)acetonitrile/TFA (100/0.1) 8-35%B(0-15 min) Flow rate : 1.0 ml/min Temperature : 5 Detection : UV at 0 nm Sample : 10 mg/ml insulin bovine + human serum (1:1) Injection : 40 µl 단백질등에의한컬럼의흡착에는알칼리세정이유용 주의사항 Guard Column 이나전처리로단백질의흡착을막는다 사용가능 ph 번위가낮은컬럼에서는알칼리에의해열화하는일이있다 고알칼리내성의 YMC-Triart 를추천합니다. 49
계란항체 IgY 의정제예 (1) Ion Exchange Column 과 SEC 를이용 원료 노른자 청정화 Lipo 단백질제거 IgY(MW : 170KDa) 중간정제 음이온교환 Chromatography 순도 :53% 최종정제 SEC Chromatography 순도 >99% 50
계란항체 IgY 의정제 () 음이온교환 Chromatography 에의한중간정제 mv 500 400 300 IEC 에의한중간정제 Sample Crude extract from egg yolk Column 75 mm, YMC-BioPro Q75 SEC mau 5 0 15 10 5 Column 중간정제 Fraction 의분석 purity 53% YMC-Pack Diol-00 IgY Column : YMC-Pack Diol-00 300 X 4.6 mmi.d. Eluent : 0.1M KH PO 4-K HPO 4 (ph 6.9) containing 0. M NaCl Flow rate : 0.3 ml/min Temperature : ambient Detection : UV at 80 nm 00 0 A09084J 0 5 10 15 0 min 100 0 A09084C Non-reduced SDS-PAGE 분취 Marker 전 IEC 후 0 10 0 30 40 50 60 min Column : 50 X 4.6 mmi.d. Eluent : A) 0mM Tris-HCl (ph 8.1) B) 0mM Tris-HCl (ph 8.1) containing 0.5M NaCl 10%B (0-15 min), 30%B (15-30 min), 90%B (30-40 min) Flow rate : 0.5 ml/min (180 cm/hr) Temperature : ambient Detection : UV at 80 nm Injection : 1 ml ( 約 0 mg Protein) SEC 에의한최종정제로 97.kDa 66.4kDa 45.0kDa 9.0kDa 0.1kDa 14.3kDa 51
계란항체 IgY 의정제 (3) SEC Chromatography 에의한최종정제 SEC 에의한최종정제 mv 100 75 Sample Fraction purified by IEX Column 5 mm, YMC-Pack Diol- 00 SEC mau 7.5 5.0.5 Column 최종정제 Fraction 의분석 purity >99% YMC-Pack Diol-00 IgY Column : YMC-Pack Diol-00 300 X 4.6 mmi.d. Eluent : 0.1M KH PO 4-K HPO4 (ph 6.9) containing 0. M NaCl Flow rate : 0.3 ml/min Temperature : ambient Detection : UV at 80 nm 50 0.0 A09085E 5 0 0 5 10 15 0 min Non-reduced SDS-PAGE 분취 Marker 전 IEC 후 SEC 후 표준품 IgY 0 5 10 15 0 5 30min Column : 300 X 8 mmi.d. Eluent : 0.1M KH PO4-KHPO4 (ph 6.9) containing 0. M NaCl Flow rate : 0.7 ml/min for 8 mmi.d. Temperature : ambient Detection : UV at 80 nm Injection : 1 ml ( 約 0.45 mg IgY) A09085A 97.kDa 66.4kDa 45.0kDa 9.0kDa 0.1kDa 14.3kDa 5
맺음말 분리정제에최적의 Column 선정을위해서는 목적화합물에관한정보수집 분리화합물의구조 성질을파악 분리조건에관한정보수집 문헌 Application Data 등의기존정보수집 분리목적의확인 목적화합물과화합물내의무엇을분리하고싶은것인지명확히해, 목적에알맞은최적인분리모드를선정 분취 Scale로의검토를실시하는경우, 분취 Scale로의시료량과컬럼 / 충전제의확보 53