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1 Korean Chem. Eng. Res., 56(2), (2018) PISSN X, EISSN 커피에탄올추출물의항균및미백활성 김인혜 이재화 신라대학교의생명과학대학제약공학과 부산광역시사상구백양대로 700 번길 140 (2017 년 8 월 23 일접수, 2017 년 12 월 5 일수정본접수, 2017 년 12 월 15 일채택 ) Antibacterial and Whitening Activities of Coffea arabica Ethanol Extract In Hae Kim and Jae Hwa Lee Department of Pharmaceutical Engineering, College of Medical & Life Science, Silla University, 140, Baegyang-daero 700beon-gil, Sasang-gu, Busan, 46958, Korea (Received 23 August 2017; Received in revised form 5 December 2017; accepted 15 December 2017) 요 약 본연구에서는커피 (Coffea arabica) 의에탄올추출물을이용하여기능성화장품소재로서의가능성을검토하였다. 미백활성으로는 tyrosinase 저해활성과멜라닌함량을측정하였으며, 항산화활성으로는 SOD-like activity 를측정하였고, 그결과 500 µg/ml 의농도에서 94.8 ± 6.2% 의활성을나타내었다. CAE 는 3 개의그람양성균과 6 개의그람음성균을대상으로항균활성을조사하였으며, 그결과그람음성균에대해서는폭넓은활성을나타내었지만, 그람양성균에대한활성은나타내지않았다. 하지만항생제내성균주인 MRSA CCARM3561 에는강한활성을나타내었다. 반면에 Candida albicanse 에대한항곰팡이활성은나타내지않았다. Tyrosinase 저해활성과 DOPA 산화능은대조군인 arbutin 보다는낮게나타내었고, B16-F10 melanoma cell 에대한멜라닌생합성저해능은농도의존적으로감소하는경향을보였으며, 100 µg/ml 의농도에서 89.2% 를나타내었다. 이러한결과들은커피추출물이천연물, 무독성항균제또한천연화장품소재로써의가치가있음을나타내는것이다. Abstract In this study, Coffea arabica ethanol extract (CAE) was tested for possible functional cosmetic agent. Whitening effect was measured by tyrosinase inhibition assay, and anti-oxidant activity was checked by SOD-like activity. SOD-like activity of CAE showed 94.8 ± 6.2% at 500 µg/ml. The anti-bacterial activities CAE was evaluated against three different gram-positive bacteria and six gram-negative bacteria including MRSA strains. CAE exhibited in vitro broad spectrum antimicrobial activities of gram-negative bacteria without antifungal activity. CAE was strong exhibited against MRSA CCARM3561. The tyrosinase and L-DOPA inhibitory activities of the CAE lower than those positive control arbutin. CAE reduced melanin contents of B16-F10 melanoma cell in a dose dependent manner and decrease about 89.2% at a concentration 100 µg/ml. These result highlight the potential of coffee extract as a naturally active and non-toxic antibacterial suitable for cosmetic applications. Key wards: Coffea arabica, Cosmetic, MRSA, Tyrosinase, Melanin synthesis 1. 서론 커피는세계인의대표적인기호음료로오랜기간음용되어왔으며, 전세계적으로가장많이교역하는농산물중하나이고경제적으로도매우중요한위치를차지하고있다. 전세계커피시장규모는 2조 3,000억달러 ( 약 2,600조원 ) 이며, 2014년기준으로국내시장은 52조 4,000억원으로, 지난 10년간연평균성장률이 15.3% 증가하 To whom correspondence should be addressed. jhalee@silla.ac.kr This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 고있다. 커피란건조한커피생두 (green coffee bean) 를가공한것또는이에식품첨가물을가한기호성식품을지칭하며, 커피본연의기능인카페인에대한니즈 (needs) 증가에따른소비증가, 사교및정보교환을위한식후티타임니즈증가, 개인작업을위한공간등부가적인시장이커지면서단순기호식품이아닌문화소비제품으로변화하고있다. 아프리카에티오피아가원산지인커피나무의식물학적속명은 coffea로꼭두서니과 (Rubicaceae) 에속하는쌍떡잎식물이며코페아류의커피관목으로분류한다 [1]. 2대원종으로는 Coffea arabica와 Coffea canephora가있고크기는 3~7 m, 잎의길이는 7~15 cm이며, 커피생두는빨간열매중에 245

2 246 김인혜 이재화 있는종자에서외피를벗겨내면 2개의씨가들어있고그성숙한열매의씨앗을발효건조한것이원두이다. 오늘날커피의분류는커피의품종을기준으로하는식물학적구분과국제커피무역거래시시장에서사용되는상업적인상품에명명하는것으로통용되고있다. 식물학적분류에따른커피생두의종은수백종에이르고현재상업적으로재배하는주요품종은아라비카 (Arabica, Coffea arabica) 와로브스터 (Robusta, Coffea canephora), 리베리카 (Liberica, Coffea liberica) 로 3가지품종으로나눈다. 그중맛과향기가좋아최고의품질을인정받고있는아라비카종은에티오피아의원산으로부터해발 500~1,000 m의높은지대와 15~25 o C의온도에서잘자라며브라질, 콜롬비아, 멕시코, 과테말라, 에티오피아등지에서생산되며전세계커피생산량의 70~80% 를차지하고, 로브스터종이약 20% 를차지하고있다 [2]. 커피는쓴맛, 신맛, 떫은맛및구수한등의독특한맛과향이조화되어만들어진대표적인기호식품의하나이며, 원두의종류나날씨가공방법에따라다양한맛과향을내고향신료, 조미료, 염색소등으로사용된다 [3]. 커피생두의주요구성성분은생산지, 품종, 재배등에따라차이는있으나대부분은수분 (10~13%), 탄수화물 (18~26%), 섬유소 (37%), 지방 (9~18%), 단백질 (11~13%) 의주성분으로구성되어있고, 무기질 (3.0~4.5%), 카페인 (0.9~2.4%) 과 chlorogenic acid (5.5~10%) 등이함유되어있다 [4,5]. 커피의알려진생리활성물질로는 flavonoid, caffeic acid, ferulic acid, nicotinic acid, trigonelline, qunolinic acid, tannic acid, pyrogallic acid 및 caffeine 등이보고되어있다 [6-9]. 일반적으로적당한커피섭취는일반성인의건강에여러긍정적인영향을주는것으로알려져왔고다양한생리활성이보고되어있다. 카페인에의한각성작용및기분전환의정신적인효과 [10], 파킨슨병과알츠하이머등의산화적스트레스로인한대사성질환의발병을낮춘다는보고 [11,12], 제 2형당뇨를낮춘다는것 [13] 과노화유발과천식증세완화 [14,15] 와더불어 LDL-cholesterol과 MDA (Malondialdehyde) 를줄인다는보고도있다 [16]. 또한커피에함유한폴리페놀화합물과 chlorogenic acid, caffeine, melanoidin 등과같은항산화물질의존재로항산화활성이보고되어있고 [17], 이러한항산화활성과생리활성효과는화장품원료로서의유용한특성이다. 현재화장품소재에관한연구는제제의안정성, 사용성확보를위해천연물에서유효성분추출등이대세를이루고있다. 본연구에서는이미식음료널리알려진친숙한커피생두 (Coffea arabica) 에탄올추출물을대상으로화장품원료또는미용소재로써의활용가능성을확인하고자유용성분의종류와함량을기준으로세포독성효과, 미백효과, 항산화및항균효과를검증하였고, B16-F10 mouse melanoma cell에대한세포생존율과멜라닌생합성억제효과를실시하여기능성화장품소재로써의가능성을검토하였다. 2. 실험 2-1. 재료본실험에사용한커피는로스팅하지않은커피생두 (green coffee bean) 를캄보디아 (Kingdom of Cambodia) 에서수입하였으며, 2015년경남김해시소재의더길원두커피에서구입하여사용하였다. 동결보관된커피원두는시료 1.0 kg에 10 L (1 : 10, w/v%) 의 증류수를넣어고압멸균기를이용하여 121 o C 4시간동안고압추출하였다. 그시료는원심분리 (8,000 g 20 min) 하여상층액을농축하였고, 이과장을 3번반복추출하였다. 침전물을이용하여농축한각시료는시료 : EtOH = 1 : 10 (v/v%) 의비율로에탄올을첨가하여원심분리 (10,000 g 20 min) 하여침전물을제거하였으며이단계를거친상층액은원심분리와농축과정을진행하였고, 각농축한시료는동결건조한후, 본실험에사용하였다. 동결건조한시료는 -70 o C에서보관후실온에서해동한후각실험단계별로사용하였다. 시료에대한명칭은커피에탄올추출물 (Coffea arabica ethanol extract, CAE) 로명명하였다 항산화측정 CAE의항산화활성은 Superoxide dismutase-like activity로측정하였다. 측정은 Marklund & Marklund (1975) 의방법을응용한 SOD assay kit (Dojindo Molecular Technolgies, Inc., USA) 를이용하여 superoxide anion radical (O 2 ) 의소거활성률을측정하였다. 적정농도별로희석한시료 20 µl와 WST working solution 200 µl를첨가한후, enzyme working solution을 20 µl 첨가하여 37 o C, 20 분간반응시킨후 450 nm에서흡광도를측정하여 kit의계산법에따라 SOD 활성을측정하였다 [18]. 표준시료로는 L-Ascorbic acid (Sigma chemical Co., Louis, MO, USA) 를사용하였다. SOD-like activity (%) = [(Exp.-Blank)/Control] 항균활성 Antimicrobial activity 측정방법은 disc method와 MIC method를병행하여실시하였다. Disc method [19] 는 Tryptic soy broth, TSB (Merck & Co. Inc., Darmstadt, Germany) 배지에서 mid-logarithmic phase (OD 570 = 0.1, CFU/mL) 까지배양후, 멸균된 TSA 배지에균배양액 100 μl를도말하였다. 이후 paper disc ( 직경 8 mm) 를 plate에놓고 500 μg/disc의농도로 disc에 50 μl씩흡수시키고 37 o C incubator에서 18시간배양후, disc 주변에생성된 clear zone의크기로활성을측정하였다. MIC 측정은 broth dilution method를사용하였다 [20]. 각각의균주는 Muller-Hinton broth (Merck & Co. Inc., Darmstadt, Germany) 에흡광도 1.0 ml (OD 570 = 0.1, CFU/mL) 로조절한후실험에사용하였고 96 well plate에균배양액 Muller-Hinton broth 100 μl와시료를농도별로희석한용액 100 μl를차례대로첨가하여 37 o C, 18시간배양후, ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland) 를이용하여 630 nm에서측정하였다. 어병세균인 Vibrio parahaemolyticus KCTC2471는 30 o C에서배양하여실험에적용하였다. 실험에사용한 gram-positive bacteria와 gram-negative bacteria는한국미생물자원센터 (Korean Collection for Type Culture, KCTC) 에서분양받아사용하였고, 항생제내성균주인 Methicillin Resistance Staphylococcus aureus (MRSA) CCARM3561, CCARM3115, CCARM3089 등은항생제내성균주은행 (Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes, CCARM) 에서분양받아사용하였다. 항곰팡이활성측정은 liquid growth assay method로측정하였으며, Candida albicance KCTC7965를 Potato dextrose broth (Merck & Co. Inc., Darmstadt, Germany) 를이용하여 30 o C에서 48시간배양하였다. 곰팡이의농도는 CFU/mL이되도록희석하여 96 well plate에곰팡이

3 커피에탄올추출물의항균및미백활성 247 배양액과각시료를혼합한후 30 o C에서 48시간배양후, ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland) 를이용하여 630 nm에서측정하였다 [21]. Positive control로는 ampicillin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA) 를사용하여비교하였다 안전성시험미백, 기능성소재로써의안전성을검토하기위하여 B16-F10 mouse melanoma cell에대한세포생존율을조사하였다. B16-F10 mouse melanoma cell은한국세포주은행에서분양받아사용하였으며, 100 units/ml penicillin-streptomycin과 10% FBS가함유된 DMEM (Gibco, USA) 배지에서 37 o C, 5% CO 2 incubator로배양하여 cell viability assay를 CCK-8 assay로실험하였다 [22]. 먼저, 100 µl (5,000 cells/ well) 의세포부유액을 96 well plate에분주후, CO 2 incubator 안에서 24시간동안전배양한후, 농도별로희석한시료를 10 µl 처리, 12시간배양후 CCK-8 용액 (Enzo Life Sciences, New York, USA) 을첨가하여 2시간배양한다음 ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland) 을이용하여 450 nm 에서흡광도측정하였다. Cell viability (%) = [(Exp.-Blank)/Control] 미백활성 CAE의미백활성은 L-tyrosine과 L-DOPA in vitro tyrosinase 저해활성으로측정하였다 [23]. L-Tyrosine inhibition assay는 0.1 M potassium phosphate buffer (ph 6.8) 200 μl, 추출물시료 20 μl, tyrosinase (1,000~1,500 U/mL) 20 μl에 1.5 mm L-tyrosine 20 μl를혼합하여 37 o C 15분간반응시킨후, ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland) 를이용하여 490 nm에서흡광도를측정하였다. L-DOPA 에대한 tyrosinase inhibition assay는다음과같이측정하였다. 0.1 M potassium phosphate buffer (ph 6.8) 100 μl, 시료 20 μl, tyrosinase (1,000~1,500 U/mL) 20 μl에 1.5 mm L-DOPA 20 μl를혼합하여 37 o C 10분간반응시킨후, ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland) 을이용하여 475 nm에서흡광도를측정하였다. 표준물질로는 arbutin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA) 을사용하였다. 3. 결과및고찰 3-1. 항산화효과활성산소는 superoxide anion, peroxide, hydroxy radical 등의형태로피부조직과의결합을통해피부조직파괴, 주름형성등을야기하는원인이된다. 이러한활성산소를제거하는물질로는 Vitamin C, E와 SOD-catalase 등많은항산화물질들이알려져있고, 항산화제의역할은피부노화의주범인자유전자기의활동을방해하는것이다. SOD (Superoxide dismutase) 란 superoxide radical을산소로산화시켜활성산소를안전한물질로만들어활성산소가야기하는생체내의손상을보호하는작용기전을지니고있는효소이며, 이효소의작용으로인해산화방지, 주름방지, 나아가 anti-aging에도관여하는것으로알려져있어서화장품관련실험으로폭넓게사용하고있는방법이다. 또한, 식물유래의항산화물질은다수의 phenyl hydroxyl기를가지고있어유리라디칼과결합하여세포의산화손상에대한화학적예방효과가있다고알려져있다 [25]. 농도에따른 CAE의 SOD-like activity를보면, 각농도별 500, 250, 125, 62.5 μg/ml에서 94.8 ± 6.2, 55.0 ± 5.7, 44.8 ± 3.9, 36.8 ± 9.4의높은 SOD-like activity를나타내었다 (Fig. 1). 본실험결과를통해 CAE의항산화물질함량을확인하였으며, 이는천연항산화제화장품소재로의매우적합함을확인할수있었다 항균활성커피는다양한생리활성과산화적스트레스로인한대사성질환에효과적이며, 풍부한폴리페놀화합물과 chlorogenic acid, caffeine 등항산화물질로인해다양한균주에대한항균활성등이보고되어있다. 특히, Streptococcus sp. 에대한활성이보고되어있고 [26], Stphylococcus aureus에대한활성과 gram-negative bacteria인 E. coli, Enteroccoccus sp. 에대한활성들도보고되어있다. 하지만커피는로스팅과정중에탄수화물, 단백질, 아미노산, 특히페놀화합물의구성변화로인해정확한항균활성에대한메커니즘은밝혀지지않고있다 [27,28]. 본연구에서는항생제내성균주에대한활성을조사하였는데그 Tyrosinase inhibition ratio (%) = [(Exp.-Blank)/Control] 100 세포내의멜라닌생합성저해효과를측정하기위하여 6 well plate에세포를 cells/well로분주하여 24시간동안배양한후시료를농도별로처리하고 1시간후에 200 nm의 α-msh를각세포에처리하여 48시간동안배양하였다. 배양된세포는 PBS로세척한뒤 10% DMSO가포함된 1 N NaOH 용액을처리하여 60 o C에서 1시간동안반응시킨후 ELISA Multiscan Reader (Thermo scientific, Finland) 을이용하여 490 nm에서흡광도측정하였다 [24] 통계처리본연구에대한실험결과는 3회반복실험에의한평균값으로나타내었고, 대조군과실험군의통계학적유의성검정은 Student s t-test를사용하였으며표준편차 (p-value < 0.05) 수준에서평가하였다. Fig. 1. Superoxide dismutase (SOD) like activity of Coffea arabica ethanol extract (CAE). L-ascorbic acid concentration was 1 mm. Results are expressed as percentages of control and data are presented as mean ± SD. for independent triplicate experiments (p <0.05).

248 김인혜 이재화이러한결과는항생제내성균주의세포벽과는특이적으로결합하여활성을나타내는것으로판단되어지며, 이러한항생제내성균주 MRSA에대한활성메커니즘은항산화활성과관련하여좀더심도있게연구할주제로삼아야할것으로생각된다. 또한 Candida albicanse에대한활성은나타내지않았다. Fig. 2.

4 248 김인혜 이재화이러한결과는항생제내성균주의세포벽과는특이적으로결합하여활성을나타내는것으로판단되어지며, 이러한항생제내성균주 MRSA에대한활성메커니즘은항산화활성과관련하여좀더심도있게연구할주제로삼아야할것으로생각된다. 또한 Candida albicanse에대한활성은나타내지않았다. Fig. 2. Anti-microbial activities of Coffea arabica ethanol extract (CAE). A 50 μl aliquots of each extracts was applied to filter paper and the paper lown placed on a MRSA CCARM3561 (A), MRSA CCARM3115 (B) and MRSA CCARM3089. a: Ampicillin, b: CAE. Sample concentrations were 500 μg/ml. 결과는다음과같다. CAE의항생제내성균주인 MRSA CCARM3089 에대한활성은 clear zone의크기가 18 mm이며 MRSA CCARM3115 는 12 mm로나타났고특히 MRSA CCARM3561에대한활성은 42 mm로 clear zone의크기가가장크게나타난것으로미루어볼때에대조군으로사용한 ampicillin 보다더큰활성을나타내었다 (Fig. 2). 이러한결과는커피의항산화능력과더불어커피의항균능력또한우수하며특히, 항생제내성균주에강력한활성을지니는것은기능성식품으로만인식되는커피추출물이천연항노화화장품, 기능성화장품소재로써의강력한후보군임을확인할수있었다. 다음으로는 CAE의최소억제농도 (MIC) 와항곰팡이활성을살펴보면 gram-positive bacteria에대한활성은나타내지않았고, Staphylococcus aureus에대한활성은 > 250 μg/ml의높은농도에서미미한활성을보였다. Gram-negative bacteria에대해모든농도에서활성이있음을확인할수있었다 (Table 1). 먼저, E. coli D31에서는 62.5 μg/ml의농도에서 Enterobacter aerogens는 250 μg/ml, Klesiella pnumoniae는 250 μg/ml, Pseudomonas aerginos는 62.5 μg/ml, Salmonella typhium은 250 μg/ml의농도에서활성을나타내었고어병세균인 Vibrio parahemolyticus은 125 μg/ml의농도에서고르게활성을나타냄을확인하였다. Gram-positive bacteria에대한활성은항생제내성균주에만특이적으로활성을나타내었고 Table 1. Anti-microbial activities of Coffea arabica ethanol extract (CAE) Minimal inhibitory concentration Micro-organisms (µg/ml)* CAE Ampicillin Gram positive bacteria Bacillus subtilis PM125 NA** 15.6 Micrococcus luteus KCTC1056 NA 15.6 Staphylococcus aureus KCTC1916 > Gram negative bacteria Esherichia coli D Enterobacter aerogense KCTC Klesiella pnumoniae KCTC Pseudomonas aerginosa KCTC Salmonella typhium KCTC Vibrio parahemolyticus KCTC Fungus Candia albicanse KCTC7965 NA NA * Results are representative of three independent experiments. ** ND: Not activity 미백활성사람의피부색은표피에존재하는멜라닌과혈관속에존재하는헤모글로빈, 피하조직에존재하는 β-카로틴등의색소에의해결정되며멜라닌색소의양과분포에의해외관상피부색이결정된다. 멜라닌은자외선이조사되면멜라닌형성세포 (melanocyte) 의멜라닌생성반응과정 (melanogenesis) 을통해피부색을검게변화시켜자외선으로부터피부색을보호하는역할을하며, 멜라닌에는흑색의불용성중합체인유멜라닌 (eumelanin) 과적갈색의수용체중합체인피오멜라닌 (pheomelanin) 이존재한다. 멜라닌의합성은 L- tyrosine 이라는아미노산을기질로하여 tyrosinase를주효소로하고 tyrosinase related protein Ι (TRP1), TRP2에의해 L-3,4-dihydroxylphenylalanin (L-DOPA) 를거쳐 DOPA quinone으로전환된후최종적으로멜라닌이생성되며, 이중 tyrosinase는멜라닌생성반응을조절하는중요한효소로알려져있다. 미백소재인 arbutin, kijoic acid 등은 tyrosinase 활성억제를하는대표적인물질로알려져있다. 특히본연구의표준시료인 arbutin은멜라닌전구체인 L-tyrosine과경쟁적으로작용하는저해제역할을하며 kojic acid는 tyrosinase 활성부위를킬레이팅하여 L-DOPA와 DOPA quinone이생성되는것을억제하는것으로알려져있다 [29]. CAE에의한 tyrosinase 저해활성을측정하기위하여 mushroom tyrosinase에의한 L-tyrosine의산화정도를측정하였다. L-tyrosine을 DOPA로바꾸는데관여하는 tyrosinase의저해활성은표준물질인 arbutin을이용해비교하였다. 실험한결과, 농도의존적으로활성을억제하였다. 농도별 tyrosinase 저해활성결과는 CAE 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 µg/ml에서각각 10.5%, 11.2%, 13.4%, 17.8%, 20.0% 그리고 32.4% 의 tyrosinase 저해활성을나타내었다 (Fig. 3(a)). DOPA를 DOPA quinone으로바꾸는 oxylation 반응에관여하는 tyrosinase의저해활성결과도농도의존적으로활성이감소하는것을확인할수있었고, 그결과는 200 µg/ml에서 25.0%, 100 µg/ml에서 16.9%, 50 µg/ml에서 16.8%, 25 µg/ml에서는 13.6% 로 12.5 µg/ml에는 8.1% 그리고 6.25 µg/ml에서는 5.7% 로저해활성을나타내었다 (Fig. 3(b)). 결과적으로 CAE는기질로서 L-DOPA 가관여하는반응보다 L-tyrosine 관여반응에서효소활성억제능력을더크게보여주었으며, 이는멜라닌생성에있어초기속도결정단계를늦추는것으로알려져있는 L-tyrosine을 DOPA로변환하는과정에작용하여미백활성을결정하는것으로판단되어진다. CAE의 mouse B16-F10 melanoma cell에서의세포생존능력을발색측정으로정량화하기위해 WST [2-(4-lodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)- 5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetra zolium, monosodium salt] 분석을통한 CCK-8 assay 시행하였다. WST 분석은 tetrazolium 성분을배양액에첨가한후발색을정량화하여세포의수, 증식정도등을알수있는데, 이는 tetrazolium 성분이세포내의미토콘드리아가가진탈수소효소에의해특정색으로변하게되어발색정도에따라서세포내의미토콘드리아의활성도확인가능하다고알려져있다 [30]. CAE의농도변화에따른세포의생존율을확인한결과, 100

Results are expressed as percentages of control and data are presented as mean ± SD. for independent triplicate experiments (p < 0.05). Fig. 3.

5 커피에탄올추출물의항균및미백활성 249 Fig. 4. Effect of Coffea arabica ethanol extract (CAE) on cell viability of mouse B16-F10 melanoma cell. After incubation of B16- F10 mouse melanoma cells with various concentration of the CAE in a 96 well plate for 24 h, cell viability was determined by WST assay. Results are expressed as percentages of control and data are presented as mean ± SD. for independent triplicate experiments (p < 0.05). Fig. 3. Inhibitory effect of Coffea arabica ethanol extract (CAE) against mushroom tyrosinase activity. (a) The activity of mushroom tyrosinase which is involved hydroxylation reaction from L-tyrosine to DOPA was measured by the change in absorption at 490 nm after incubation with various concentration of CAE. (b) The activity of mushroom tyrosinase which is involved oxylation reaction from DOPA to DOPA quinone was measured by the change in absorption at 490 nm after incubation with various concentration of CAE. Results are expressed as percentages of control and data are presented as mean ± SD. for independent triplicate experiments (p < 0.05). µg/ml의농도까지는 94.4% 이상의세포생존율을확인하였으나그이상의농도에서세포독성확인을할수있었다. 반면 200 µg/ml 의농도에서 86.6%, 500 µg/ml의농도에서 77.7% 까지감소하여세포에독성을보이므로, 세포를이용한이후추가실험에서는 CAE가독성을보이지않는 100 µg/ml 이하의농도에서실험을진행하였다 (Fig. 4). CAE 처리시세포내에서멜라닌의생성정도를확인하기위해 mouse melanoma cell에 CAE 추출물처리후세포내생성된멜라닌함량을측정하였다. 그결과 CAE는농도의존적으로멜라닌생성억제효과를나타내었으며, 시료를처리하지않은 control을 100% 의 melanin contents (%) 로나타내었고, 시료의농도 12.5 µg/ml, 25 µg/ml, 50 µg/ml에서각각 98.1%, 94.4%, 92.0% 그리고세포독성을보이지않는최고농도인 100 µg/ml에서 89.2% 의멜라닌생성억제효과를확인하였으며, 대조군인 arbutin의 100 µg/ml의농도에서 76.7% 의멜라닌생성억제를확인할수있었다 (Fig. 5). Arbutin과비교하여 B16-F10 mouse melanoma cell 내의멜라닌생성억제력은낮지만우수한항산화능력, 항생제내성균주에대한항균활성과더불어 tyrosinase 저해활성등으로미루어볼때, 기능성식품으로서만인식되는커피의소재적특성에천연화장품 Fig. 5. Inhibitory effect of Coffea arabica ethanol extract (CAE) on α-msh stimulated melanogenesis of mouse B16-F10 melanoma cells. Melanin content in CAE-treated B16-F10 cells at day 3. Cells were cultured at 37 o C for 72 h in DMEM supplemented with α-msh (200 nm) with the extract in a concentration dependent manner. Arbutin concentration was 100 μg/ml. Results are expressed as percentages of control and data are presented as mean ± SD. for independent triplicate experiments (p < 0.05). 소재로써의특성을확인할수있었으며차후의화장품제형에적용시많은참고자료가될것으로생각되어진다 [31,32]. 4. 결론 본연구에서는로스팅하지않은커피생두 (green coffee bean) 의에탄올추출물 (Coffea arabica ethanol extract, CAE) 에대하여기능성화장품소재로써의특성을분석하고자 in vitro 상에서항산화, 항균, 미백활성을측정하였으며, B16-F10 mouse melanoma cell에대하여세포생존율및멜라닌생성억제효과를조사하였다. 항산화활성인 SOD-like activity는 500 µg/ml의농도에서 94.8 ± 6.2% 의활성을나타내었고, 항생제내성균주인 MRSA CCARM3561에대하여 clear zone의크기가 42 mm로나타났으며대조군으로사용

6 250 김인혜 이재화 한 ampicillin 보다더큰활성을나타내었다. 또한 gram-positive bacteria 보다 grem-negative bacteria에대하여활성을나타내었고, 항곰팡이활성은나타내지않았다. 미백활성으로 tyrosinase 저해활성은 200 µg/ml의농도에서기질이 L-tyrosine인경우, 25.0% 의억제활성을나타났으며기질로서 L-DOPA 가관여하는반응보다 L-tyrosine 관여반응에서효소활성억제능력을더크게보여주었다. B16-F10 mouse melanoma cell에대한세포생존율을확인한결과, CAE 100 µg/ml의농도까지는 94.4% 이상의세포생존율을보였고, 500 µg/ml의농도에서 77.7% 의세포생존율을확인할수있었다. 멜라닌생성억제효과는농도가증가함에따라감소하는경향을나타내었고, 세포독성을보이지않는최대농도인 100 µg/ml 에서 89.2% 의멜라닌생성억제효과를보여주었다. 기존의기능성식품으로만인식되는커피의항산화, 미백활성, 그리고항생제내성균주에대한항균활성을확인하였고, 천연화장품, 기능성화장품소재로써의가치를확인할수있었다. Reference 1. Yang, I., Lee, K. H. and Oh, S. C., Manufacture and Performance Evaluation of Medium-density Fiberboard Made with Coffee bean Residues-Wood Fiber, J. Korean Wood Sci. & Tech., 41(4), (2013). 2. Seo, H. S., Kang, H. J., Jung, E. H. and Hwang, I. K., Application of GC-SAW(Surface Acoustic Wave) Electronic Nose Classification of Origins and Blended Commercial Brands in Roasted Ground Coffee Beans, Korean J Food Cookery Sci., 22(3), (2006). 3. Choi, Y. H., Kim, S. E., Huh, J., Han, Y. H. and Lee, M. J., Antibacterial Antioxidative Activity of Roasted Coffee and Red Ginseng Mixture Extracts, J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr., 41(3), (2012). 4. Schwartz, J. and Weiss, S. T., Caffeine Intake and Asthma Symptoms, Ann. Epidemiol., 2(5), (1992). 5. Esquivel, P. and Jimėnez, V., Functional Properties of Coffee and Coffee by-products, Food Res. Internal., 46(2), (2012). 6. Cornelis, M. C. and Ahmed, E. S., Coffee, Caffein, and Coronary Heart Disease, Curr. Opin. Clin. Nutr. & Metab. Care, 10(6), (2007). 7. Lee, W. J. and Zhu, B. T., Inhibition of DNA Methylation by Caffeic Acid and Chlorogenic Acid, Two Common Catechol-Containing Coffee Polyphenols, Carcinogenesis, 27(2), (2006). 8. Casal, S., Oliveira, M. B. P. P., Alves, M. R., and Ferreira, M. A., Discriminate Analysis of Roasted Coffee Varieties for Trigonelline, Nicotinic Acid, and Caffeine Content, J. Agric. Food Chem., 48(8), (2000). 9. Minamisawa, M., Yoshida, S. and Takai, N., Determination of Biologically Active Substances in Roasted Coffees Using a Diode- Array HPLC System, Analytic. Sci., 20(2), (2004). 10. Dorea, J. G, and Helina, T., Is Coffea a Functional Food?, Brit. J. Nutr., 93(6), (2005). 11. Higdon J. V. and Balz, F., Coffea and Health: A Review Recent Human Research, Crit. Rev. Food Sci., 46(2), (2007). 12. Lindsay, J., Laurin, D., Verreault, R., Hebert R., Hill, G. B. and McDowell, I., Risk Factors for Alzehimer s Diaease: a Prospective Analysis from the Canadian Study of Health and Aging, Am. J. Epidermiol., 156(5), (2002). 13. Salazar, M. E., Willett, W. C., Ascherio, A,, Manson, J. E., Leitzmann, M. F., Stampfer, M. J. and Hu, F. B., Coffee Consumption and Risk for Type 2 Dabetes Mellitus, Ann. Intern. Med., 140, 1-8(2004). 14. Nakanshi, N., Nakamura K., Nakajima, K., Suzuki. K. and Tatara, K., Coffee Consumption and Decreased Serum Gamma-glutamyltransferase: a Study of Middle-aged Japanese Man, Eur. J. Epidemiol., 16(5), (2000). 15. Schwartz, J. and Weiss, S. T., Caffeine Intake and Asthma Symptoms, Ann. Epidemiol., 2(5), (1992). 16. Yukawa, G. S., Mune, M., Otani, H., Tone, Y., Liang, X. M., Iwahashi, H. and Sakamoto, W., Effects of Coffee Consumption on Oxidative Susceptibility of Low-Density Lipoproteins and Serum Lipid Levels in Humans, Biochemistry, 69(1), 70-74(2004). 17. Daglia, M., Papetti, A., Grisoli, P., Aceti, C., Spini, V. and Dacarro, C., Isolation, Identification, and Quantification of Roasted Coffee Antibacterial Compounds, J. Agri. Food Chem., 55(25), (2007). 18. Marklund, S. and Marklund, G., Involvement of Superoxide Anion Radical in the Oxidation of Pyrogallol and a Convenient Assay for Superoxide Dismutase, Eur. J. Biochem., 4(3), (1974). 19. Lehrer, R. I., Rosenmen, M., Harwig, S., Jackson, R. and Eisenhauer, P., Ultrasenstive Assays for Endogenous Antimicrobial Polypeptides, J. Immuno. Methods, 137(2), (1991). 20. Kim, I. H., Lee, D. G., Lee, S. H., Ha, J. M., Ha, B. J., Kim, S. K. and Lee, J. H., Antibacterial Activity of Ulva lactuca Against Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Biotechnol. Bioprocess Eng., 12(5), (2007). 21. Gibson, B. W., Tang, D., Mandrell, R., Kelly, M. and Spindel, E. R., Bombinin-like Peptides with Antimicrobial Activity from Skin Secretions of Asian Toad, Bombina orientalis, J. Biol. Chem., 266, (1991). 22. Chang, Y., Yang, S, T., Liu, J. H., Dong, E., Wang, Y., Cao, A., Liu, Y. and Wang, H., In Vitro toxicity Evaluation of Graphene Oxide on A549 Cells, Toxicology Lett., 200(3), (2011). 23. Ishihara, Y., Oka, M., Tsunakawa, M., Tomita, K., Hatori, M., Yamamoto, H., Kamei,H., Miyaki, T., Konishi, M. and Oki, T., Melanostatin, a New Melanin Synthesis Inhibitor. Production, Isolation, Chemical Properties, Structure Biological Activity, J. Antibiot., 44(1), 25-32(1991). 24. Nakajima, H., Wakabayashi, Y., Wakamatsu, K. and Imokawa, G., An Extract of Withania somnifera Attenuates Endothelin-1-stimulated Pigmentation in Human Epidermal Equivalents Through the Interruption of PKC Activity within Melanocytes, Phytother. Res., 25(9), (2011). 25. Gupta, A. S., Webb, R. P., Holaday, A. S. and Allen, R. D., Overexpression of Superoxide Dismutase Protects Plants from Oxidative Stress, Plant Physiol., 103, (1993). 26. Daglia, M., Cuzzoni, M. T., and Dacarro, C., Antibacterial Activity of Coffee, J. Agri. Food Chem., 42(10), (1994). 27. Runti, G., Pacor, S., Colomban, S., Gennaro, R., Navarini, L. and Scocchi, M., Arabica Coffee Extract Shows Antibacterial Activity against Staphylococcus epidermidis and Enterococcus faecalis and Low Toxicity towards a Human Cell Line, LWT-Food Sci. Technol., 62(1), (2015). 28. Almeida, A. A., Farah, A., Silva, D. A., Nunan, E. A. and Gloria,

7 커피에탄올추출물의항균및미백활성 251 M. B., Antibacterial Activity of Coffee Extracts and Selected Coffee Chemical Compounds against Enterobacteria, J. Agri. Food Chem., 54(23), (2006). 29. Lin, J. Y. and Fisher, D. E., Melanocyte Biology and Skin Pigmentation, Nature, 445, (2007). 30. Lee, S. K., Hong, H. K., Kim, S. J., Kim, Y. K. Son, Y. S. Ha, Y., Lee, D. W. and Khang, G. S., The Comparison of Sponges and PLGA Scaffolds Impregnated with DBP on Growth Behaviors of Human Intervertebral Disc Cells, Polymer (Korea), 34(5), (2010). 31. Kim, H. W., Shin, H.J., Hwang, D. B., Lee, J. E., Jung, H. L. and Kim, D. U., Functional Cosmetic Characteristics of Momordica charantia Fruit Extract, Korean Chem. Eng. Res., 53(3), (2015). 32. Cha, S. H., Ahn, W. A., Lee, J. S., Kim, Y. S., Kim, D. U., Byun, T. G. and Park K. P., The Effect of Fcoidan Molecular Weight on Cosmetic Function, Korean Chem. Eng. Res., 50(4), (2012).

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,