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도현 서
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1 Korean Chem. Eng. Res., Vol. 46, No. 5, October, 2008, pp 총 설 전분기질에대한 Saccharomyces cerevisiae 과 Zymomonas mobilis 의에탄올발효비교 최기욱 강현우 김영란 * 정봉우 * ( 주 ) 창해에탄올창해연구소 전주시덕진구팔복동 3 가 829 * 전북대학교화학공학부 전주시덕진구덕진동 1 가 (2008 년 7 월 11 일접수, 2008 년 8 월 1 일채택 ) Comparison of Ethanol Fermentation by Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis from Starch Feedstocks Giwook Choi, Hyunwoo Kang, Youngran Kim* and Bongwoo Chung* Changhae Institute of Cassava & Ethanol Research, Changhae Ethanol Co., Ltd. 829, 3-Ga Palbok-dong, Dukjin-ku, Jeonju , Korea *Chonbuk National University, School of Chemical Engineering, , Dukjin-dong, Dukjin-gu, Jeonju , Korea (Received 11 July 2008; accepted 1 August 2008) 요 약 유가의급등과화석연료의고갈, 환경오염문제등에대비하기위하여대체수송연료로서의바이오에탄올에대한관심이고조되고있으며, 이에따라바이오에탄올생산비용절감을위한연구가매우활발하다. 본연구에서는에탄올생산성향상을위하여 Zymomonas mobilis 의에탄올발효특성을 Saccharomyces cerevisiae 와비교하였다. 음료용에탄올생산균주로오랫동안사용되어온효모와연료용에탄올생산균주로서의 의가능성을검토한바최종에탄올생성농도는큰차이가없었으나, 에탄올생성속도는 가 에비해 2 배이상빨랐다. 에탄올생산성을비교해보면현미, 쌀보리, 카사바의경우 는 2.19 g/l h, 2.60 g/l h, 3.12 g/l h 인반면 는 0.68 g/l h, 1.03 g/l h, 1.28 g/l h 이었다. 증류액내의불순물은 는 iso-amylalcohol 이 는 ethyl heptanoate 농도가상대적으로높았다. Abstract The production of ethanol by microbial fermentation as an alternative energy source has been of interest because of increasing oil price. Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis are two of the most widely used ethanol producers. In this study, characteristics of ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis was compared. Brown rice, naked barley, and cassava were selected as representatives of the starch-based raw materials commercially available for ethanol production. The volumetric ethanol productivities by Saccharomyces cerevisiae from brown rice, naked barley and cassava were 0.68 g/l h, 1.03 g/l h and 1.28 g/l h respectively. But for the Zymomonas mobilis, 2.19 g/l h(brown rice), 2.60 g/l h(naked barley) and 3.12 g/l h(cassava) were obtained. Zymomonas mobilis was more efficient strain for ethanol production than. Key words: Bioethanol, Zymomonas mobilis, Saccharomyces cerevisiae, Starch Feedstock 1. 서론 최근유가의급등과화석연료의고갈, 환경오염에대비하기위하여대체수송연료로서의바이오에탄올에대한관심이급증하고있으며이에따라에탄올생산성향상을위한균주개발과효율적인공정개발에대한중요성이부각되고있다 [1-3]. 국내의경우, 산업적으로전분질계원료를에탄올발효에이용하고있으며, 에탄올발 To whom correspondence should be addressed. changrd@chethanol.com 효균주로서는효모를사용하고있다. 전분질계원료의경우원료내전분을당으로쉽게전환하기위하여고온에서원료를팽윤시키는호화작용과액화효소를이용하여전분구조를큰단위로끊어주는액화과정을거친후, 당화효소를이용하여효모가소모할수있는당의형태인 glucose, maltose 등의형태로전환시키는당화과정등의전처리과정이필요하며, 효모를사용하여에탄올발효를실시한다. 효모는가장오랫동안사용되어온에탄올발효균주로우수한발효능과식품으로서의안정성까지확인되었다 [4, 5]. 그러나최근에는에탄올생산성을향상시키기위하여박테리아를이용 977

2 978 최기욱 강현우 김영란 정봉우 한에탄올발효연구도진행되고있다. 그중에서도 Zymomonas mobilis 는빠른대사속도와에탄올내성, 당내성또한우수하여바이오에탄올생산균주로주목받고있다 [6-9]. 본연구에서는기존에가장많이사용되어온발효균주인 Saccharomyces cerevisiae와 슈퍼알코올박테리아 로불리우는 Zymomonas mobilis의에탄올발효특성을규명하여두균주의에탄올생산성을비교함으로써산업적이용가능성을확인코자하였다. 2. 재료및방법 2-1. 사용된재료및균주사용된원료는음료용에탄올생산에사용되고있는국내산현미, 쌀보리, 베트남산카사바를 1 mm 이하로분쇄하여이용하였다. 각원료내의전분액화에사용된효소는 Bacillus licheniformis에서생산된 α-amylase인 Termamyl 120L (140 Kunit/g, Novozyme, Bagsvaerd, Denmark) 을사용하였고, 당화에는 glucoamylase인 Spirizyme plus (21 Kunit/g, Novozyme, Bagsvaerd, Denmark) 와복합효소제 (5 Kunit/g, Changhae Ethanol Co., Ltd., Jeonju, Korea) 를이용하였다. 에탄올발효에사용된균주는 창해에탄올연구소에서 N- methyl-n'-nitro-n-nitrosoguanidine(ntg) 처리를통해돌연변이한우수발효균주 과산업용효모 Saccharomyces cerevisiae CHY 1077을사용하였고, 그균주의유지는각각RM배지 (20 g/l glucose, 10 g/l yeast extract, 1 g/l MgSO 4 7H 2 O, 2 g/l KH 2 PO 4, 1 g/l (NH 4 ) 2 SO 4, 1 ml/l 1N-HCl(11X)) 와 YPD배지 (2.5 g/l yeast extract, 2.5 g/l peptone, 100 g/l glucose, 0.25 g/l MgSO 4 7H 2 O, 1 g/l K 2 HPO 4 ) 를이용하였다 원료의전처리및배양조건원료의전처리및배양은 Fig. 1과같이현미, 쌀보리, 카사바를 1 mm 이하로분쇄한분말 358 g에물 1380 ml를가한후, 액화효소 (Termamyl 120 L) 를 0.27 g과소포제 (Antifoam 204, Sigma) 0.15 ml를첨가하여 95 o C에서 2.5시간호화, 액화시킨후 60 o C로냉각하고정제당화효소 (Spirizyme plus) 0.51 g( 복합효소제의경우 2.11 g) 을첨가하여 1시간당화한후 35 o C로냉각하여동시당화발효하였다. 발효실험의종균접종량은 5%(v/v) 이었으며, 모든발효실험은 2 L 둥근플라스크를이용하여 working volume 1.7 L 규모로진탕배양기내에서 70 rpm으로고형물이가라앉지않을정도로교반하며 35 o C 조건에서수행하였다 전분가분석원료내의전분함량은효소당화법으로생성된환원당을 HPLC (Waters, Milford, USA) 로분석하여전분함량을환산하였다. 효소당화법은분쇄된원료분말 5 g을칭량하여증류수 100 ml와액화효소인 Termamyl 120 L을 4 mg을첨가하여 95 o C에서 2시간액화하였다. 그후 60 o C로냉각하여 0.1 N HCl로 ph를 4.5로조절한후 glucoamylase인 Spirizyme plus를 5 mg 첨가하여 60 o C에서 18 시간당화후 1L로부피보정하여 HPLC로분석하였다. HPLC분석에사용된컬럼은 Rspack KC-811(8 300 mm) column (Showa Denko, Tokyo, Japan) 을사용하였고검출기는 Refractive Index Detector(Waters 2414, Milford, USA) 를사용하였다. 이동상으로 H 2 SO %(v/v) 용액을분당 1 ml로흘려보냈다. Fig. 1. Schematic diagram showing experimental procedure and conditions 당, 유기산분석방법배양액내의잔당 (residual direct reducing sugar, RDS) 과유기산성분은배양액 10 ml를원심분리하여상등액만을 0.45 μm filter (Type PVDF filter, Whatman) 를이용하여여과한후 HPLC(Waters, Milford, USA) 를이용하여분석하였다. 단, 배양액내의잔류총당 (residual total sugar, RTS) 의분석은다음과같이실시하였다. 먼저분석시점의배양액 50 ml를취하고물 70 ml와 5% HCl 100 ml 를가하여 95 o C water bath(jisico, Seoul, Korea) 에서 2.5시간산당화시킨후냉각하였다. 28% NaOH 용액으로중화한다음 500 ml 메스플라스크에옮긴후물을첨가하여 500 ml로부피보정한다음, 그액을 RTS 시료로 0.45 μm filter를이용하여여과하고 HPLC를이용하여분석하였다. HPLC를이용한당분석은 Rspack KC-811(8 300 mm) column (Showa Denko, Tokyo, Japan) 을사용하여 refractive index detector (Waters 2414, Milford, USA) 로측정하였고, 유기산의분석은 Rspack KC-811(8 300 mm) column(showa Denko, Tokyo, Japan) 을사용하여 dual λ absorbance detector(waters 2487, Milford, USA) 로 215 nm에서측정하였다. 당과유기산의분석모두황산농도를 0.25%(v/v) 로제조한용액을이동상 (mobile phase) 으로사용하였고, flow rate는 1 ml/min, column 온도 60 o C, sample injection volume 은 20 μl를주입하여 20분간분석하였다 에탄올농도및불순물분석방법배양액내의에탄올농도는배양액 100 ml를간이증류하여얻은증류액을기체크로마토그래피 (Agilent 4890, Agilent Technologies, Wilmington, DE., USA) 를이용하여분석하였다. 사용된컬럼은 Supelco 6.6% CARBOWAX 20M(Supelco, 화학공학제 46 권제 5 호 2008 년 10 월

3 전분기질에대한 Saccharomyces cerevisiae 과 Zymomonas mobilis 의에탄올발효비교 979 Belefonte, USA) 이었고, detector는 FID였다. 내부표준물질로는 isopropanol을사용하였고, carrier gas로는질소를사용하였다. injector, oven, detector의온도는각각 200 o C, 100 o C, 250 o C 이었고, 운전조건은 100 o C에서 1 분, 12 o C/min으로 120 o C까지승온시킨후 20 o C/min으로 200 o C 까지승온시켜 3분간유지하였다. 최종배양액내의불순물농도분석은배양액 100 ml을간이증류하여얻은증류액을 INNOWAX column(hp 19091N-233, 30 m 0.25 mm 0.5 µm) 이장착된기체크로마토그래피를이용하여분석하였고, 기체크로마토그래피의운전조건은 40 o C에서 1분, 6 o C/min 으로 100 o C 까지승온시킨후, 8 o C/min으로 200 o C 까지승온시켜 10분간유지하였다. 사용한외부표준물질은 acetaldehyde, acetone, methyl acetate, ethyl acetate, methanol, sec-butyl alcohol, n- propyl alcohol, ethyl isovalerate, iso-butyl alcohol, ethyl heptanoate, iso-amyl alcohol 및 n-propanol 이었다. 3. 결과및고찰 3-1. 와 의에탄올발효속도비교기존의에탄올발효균주로잘알려진 와본연구에사용된 를동일조건하에서에탄올발효속도를비교하였다. 원료는각각현미와쌀보리, 카사바를이용하였으며, 각원료의전분함량은효소당화법을이용하여현미, 쌀보리, 카사바순으로 69.87, 58.07, 70.39% 로확인되었다. 각원료분말에물을가하여호화및액화의과정을거친후, 정제당화효소를사용하여 1시간당화시킨후동시당화발효조건에서종균을 5%(v/v) 로접종하여시간에따른에탄올생성량을비교하였다. 그결과는 Fig. 2와같다. 와 의발효종료시간은각각현미의경우 110시간, 36시간이었으며, 쌀보리는 72시간, 24시간이었고, 카사바는 72시간, 24시간으로세가지전분질원료에서 가 S. cerevisiae에비해현저하게에탄올생성속도가빨랐다. 각원료별최종에탄올생성량은각원료의전분함량에따라차이가나지만, 와 간에는거의차이가나지않았다. 의대사속도가 에비해월등히빨라에탄올생성속도면에서우수한결과를보인것으로판단된다 [10]. 두균주간의에탄올생산성 (productivity) 의비교는 Table 1과같이현미, 쌀보리, 카사바각각 는 2.19 g/l h, 2.60 g/l h, 3.12 g/l h인반면 S. cerevisiae 는 0.68 g/l h, 1.03 g/l h, 1.28 g/l h로두균주모두카사바에서가장우수하였고, 현미에서두균주간의차이가현저하게나타났다. 현미를이용한발효의경우두균주모두다른원료에비해에탄올발효가 1.5배가량느리게진행되는것을볼수있었으나 Fig. 3 과같이정제당화효소대신복합효소제를사용한경우 와 모두에탄올생성속도를타원료와동일한수준으로향상시킬수있음을확인하였다. 복합효소제는 α-amylase, β-amylase, glucoamylase 등의당화관련효소이외에부수적으로 protease, lipase, cellulase, pullulanase 등의미량효소와배양과정에다양한대사물질등을생산할수있는 Aspergillus usamii mut. Shiro-usamii 고체국의건조물이다. 이러한복합효소제에포함된여러당화효소의작용으로현미의복잡한전분구조에대한당화작용이용이하고, 복합효소제배양과정중에생성되는다양한아미노산관련대사물 Fig. 2. Bioethanol production of ( ) and ( ) using glucoamylase from brown rice (A), naked barley (B), and cassava (C). Table 1. Comparison of ethanol productivity of and Strain Brown rice Naked barley Cassava 0.68 (110 h) 1.03 (72 h) 1.28 (72 h) HZ (36 h) 2.60 (24 h) 3.12 (24 h) Unit: Ethanol productivity (g/l h) 질들이에탄올생성을촉진시킬수있는것으로사료된다. 반면카사바의경우는전분구조가단순하여정제당화효소 (glucoamylase) 의작용만으로도 생육속도에알맞은기질을제공할수있어그차이가적은것으로판단된다. 그러나복합효소제를이용하여현미, 쌀보리와같은곡류원료에서의에탄올발효속도를향상시켰다할지라도 와 Z. Korean Chem. Eng. Res., Vol. 46, No. 5, October, 2008

4 980 최기욱 강현우 김영란 정봉우 3-2. 와 의에탄올발효후의잔당비교두균주의발효후잔당비교는전분질원료의에탄올발효에대한경제성과각균주의당이용성에관련이있다. 두균주의에탄올발효후잔당을분석한결과를 Table 2에나타냈다. 는 72~110시간이상이경과해야대부분의당을모두소모하는반면 Z. mobilis는 24~36시간만에 0.2% 수준의잔당만을남기고모두소모했다. 잔당의대부분은 maltose 성분으로효모를이용한발효구의경우 72~110시간경과후에도잔존하는것으로보아 glucoamylase 가분해할수없는 α-1,6 glucoside 결합을가진이당류 (melibiose) 가포함된것으로판단된다. 이는 pullulanase와같은 α-1,6 glucanase 를이용하면당이용율을높일수있으나경제성이함께고려되어야만한다 [11]. 반면, 경우는 maltose에대한기질제한성으로인해 maltose가 보다많은양이잔존했지만그차이는크지않았고, 전분질원료의발효에서는잔존하는당화효소에의해 maltose는 glucose로전환이가능하므로적절한발효조건이나당화효소조건으로극복될수있을것으로사료된다. 현미, 쌀보리, 카사바에대한각균주의당소모는두균주모두카사바, 쌀보리, 현미의순으로그이용율이높았으며, 이는앞서말한전분구조에따른차이로판단된다 와 의에탄올발효후의유기산생성비교두균주를이용한에탄올발효종료후, 부산물인유기산의생성은 Table 3에나타냈다. 생성된유기산은 citric acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid, lactic acid 이었고, 는그중 succinic acid가현미, 쌀보리, 카사바순으로 3.74, 9.4, 8.85 g/l로다른유기산에비해많은양이생성되었다. 이는 의대사적특성상 TCA cycle에의한축적으로 에비해많은양이나발효후에탄올회수시증류과정에서제거되므로연료용알코올품질에는문제되지않을것이다 [12]. 그러나유기산의생성은부산물이므로그생성량을균체자체의이용량만으로최소화할수있다면에탄올수율향상에도움이될것으로사료된다. Fig. 3. Bioethanol production of ( ) and ( ) using complex enzyme from brown rice (A), naked barley (B), and cassava (C). mobilis 간의에탄올생산성측면에서 가 의두배이상우수한결과를나타냈다 와 의에탄올발효후의불순물생성비교에탄올발효후배양액을간이증류하여에탄올을회수하고그증류액내의불순물을비교하기위해 gas chromatograph를이용하여분석하였다. 분석된항목은 acetaldehyde, ethyl acetate, methanol, 2-butanol, n-propyl alcohol, iso-butanol, iso-amyl alcohol, ethyl heptanoate 로 Table 4와같이세가지원료에서모두 는 주로 iso-amyl alcohol 이, 는 whisky 의 ester 성분인 ethyl Table 2. Analysis of residual directed sugars in fermented broth by and Feedstock Brown rice Naked barley Cassava Strain 화학공학제 46 권제 5 호 2008 년 10 월 Fermentation time 110h 36h 72h 24h 72h 24h Sugar (g/l) Maltose Glucose Fructose Ribose Total

5 전분기질에대한 Saccharomyces cerevisiae 과 Zymomonas mobilis 의에탄올발효비교 981 Table 3. Analysis of organic acids in fermented broth by and Organic acid (g/l) Feedstock Brown rice Naked barley Cassava Strain Fermentation time 110h 36h 72h 24h 72h 24h Citric acid Tartaric acid Malic acid Succinic acid Lactic acid Table 4. Analysis of volatile compounds in fermented broth by and Volatile compounds (ppm) Feedstock Brown rice Naked barley Cassava Strain Fermentation time 110h 36h 72h 24h 72h 24h Acetaldehyde Ethyl acetate Methanol butanol n-propyl alcohol Iso-butyl alcohol Iso-amyl aclcohol Ethyl heptanoate heptanoate[13] 의함유량이많았다. 이러한불순물들은다단증류과정에서제거되므로에탄올품질과는무관하며증류탑운전에대한참고자료로활용될수있다. 4. 결론 바이오에탄올에대한관심이증대되는국제정세의흐름에맞춰에탄올발효균주로잘알려진 와 를이용하여산업용전분질원료인현미, 쌀보리, 카사바로부터에탄올발효특성을비교하였다. 최종에탄올생성량에는크게차이가없었으나생성속도면에서 가 에비해 2배이상빨랐다. 에탄올생산성을비교해보면, 현미, 쌀보리, 카사바순으로 는 2.19 g/l h, 2.60 g/l h, 3.12 g/l h, 는 0.68 g/ l h, 1.03 g/l h, 1.28 g/l h 였다. 에탄올발효후잔당은두균주모두 0.3% 이하였으며, 유기산의생성은 가 succinic acid를 3.7 ~9.4 g/l로다소많이생산하였다. 발효후에탄올증류액내의불순물을비교해볼때 는주로 iso-amyl alcohol이 는 ethyl heptanoate의함유량이많았다. 감 본연구는농촌진흥청 [ 과제번호 ] 의연구비지원으로수행되었습니다. 사 참고문헌 1. Von Blottnitz, H. and Curran, M. A., A Review of Assessments Conducted on Bio-ethanol as a Transportation Fuel from a Net Energy, Greenhouse Gas, and Environmental Life Cycle Perspective, J. Clean. Prod., 15(7), (2007). 2. Willke, T. and Vorlop, K. D., Industrial Bioconversion of Renewable Resources as An Alternative to Conventional Chemistry, Appl. Microbiol. Biotechnol., 66(2), (2004). 3. Aristidou, A. and Penttila, M., Metabolic Engineering Applications to Renewable Resource Utilization, Curr. Opin. Biotechnol., 11(2), (2000). 4. Camacho-Ruiz, L., Perez-Guerra, N. and Roses, R. P., Factors Affecting the Growth of Saccharomyces cerevisiae in Batch Culture and in Solid Sate Fermentation, Electron. J. Environ. Agric. Food Chem., 2(5), (2003). 5. Ergum, M. and Mutlu, S. F., Application of Statistical Technique to the Production of Ethanol from Sugar Beet Molasses by Saccharomyces cerevisiae, Bioresour. Technol., 73(3), (2000). 6. Kim, B. G. and Choi, C. Y., A Study on the Ethanol Production by Immobilized Cells of Zymomonas mobilis, Korean J. Chem. Eng., 1(1), 13-19(1984). 7. Dien, B. S., Cotta, M. A. and Jeffries, T. W., Bacteria Engineered for Fuel Ethanol Production Current Status, Appl. Microbiol. Biotechnol., 63, (2003). 8. Ingram, L. O., Gomez, P. F., Lai, X., Moniruzzaman, M., Wood, B. E., Yomano, L. P. and York, S. W., Metabolic Engineering of Bacteria for Ethanol Production, Biotechnol. Bioeng., 58(2), (1998). 9. Rogers, P. L., Jeon, Y. J., Lee, K. J. and Lawford, H., Zymomonas mobilis for Fuel Ethanol and Higher Value Products, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 108, (2007). 10. Rogers, P. L., Lee, K. J. and Tribe, D. E., Kinetics of Alcohol Production by Zymomonas mobilis at High Sugar Concentrations, Biotechnol. Lett., 1(4), (1979). Korean Chem. Eng. Res., Vol. 46, No. 5, October, 2008

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(전형진)697.hwp Trans. of Korean Hydrogen and New Energy Society, Vol. 28, No. 6, 2017, pp. 697-703 DOI: https://doi.org/10.7316/khnes.2017.28.6.697 KHNES pissn 1738-7264 eissn 2288-7407 보리를이용한고효율바이오에탄올생산연구 전형진 1 고경모