53(1)-02(김준석090).fm

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애윤 지
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1 Korean Chem. Eng. Res., 3(1), 1- () PISSN 34-18X, EISSN 전처리된섬유소계바이오매스로부터 Lactic acid 생산 안수진 * Roent Dune Cayetano** 김태현 ** 김준석 *, * 경기대학교화학공학과 경기도수원시영통구광교산로 4-4 ** 국립공주대학교환경공학과 충남천안시서북구천안대로 13-4 (14 년 월 일접수, 14 년 6 월 일수정본접수, 14 년 6 월 7 일채택 ) Lactic acid Production from Hydrolysate of Pretreated Cellulosic Biomass by Lactobacillus rhamnosus Su Jin Ahn*, Roent Dune Cayetano**, Tae Hyun Kim** and Jun Seok Kim*, *Department of Chemical Engineering, Kyonggi University, 4-4 Gwanggyosan-ro, Yeongtong-gu, Suwon , Korea **Department of Environmental Engineering, Kongju National University, 13-4 Cheonan-daero, Seobuk-gu, Cheonan, Chungnam , Korea (Received May 14; Received in revised form June 14; accepted 7 June 14) 요 약 Lactic acid( 젖산 ) 는가장널리사용되는 Hydroxy-carboxylic acid 로서일반적으로식품, 화장품, 의약품및화학산업의원료로사용된다. 하지만다양한분야의적용과대량생산의광범위한잠재력에도불구하고원재료의높은가격으로인하여 Lactic acid 생산의주된문제가된다. Lactic acid 는발효또는화학적합성에의하여얻어진다. 최근, 자연적으로생산되는 Lactic acid 의시장수요가증가하여미생물발효방법에의한 Lactic acid 생산을일반적으로사용한다. 일반적으로 Lactic acid 생산의원재료는순수한전분또는글루코오스를이용한다. 이의경제적인원재료의대안으로, 지구상에서가장풍부한재생가능자원인바이오매스를가수분해물로전환하여이용한다. 본연구에서는 Lactobacillus rhamnosus ATCC 863 을이용하여전처리된가수분해물로부터발효방법에의해 L(+)-Lactic acid 를생산하였다. 전처리된가수분해물은암모니아침출공정 (AP) 후효소당화에의하여얻었다. 효과적으로 Lactic acid 생산수율과전환율을높이기위하여순수글루코오스조건에서배지, 온도, 글루코오스농도를조절하여수행하였다. 발효최적조건에서순수글루코오스와가수분해물의 Lactic acid 생산을비교하였다. Abstract Lactic acid, the most widely occurring hydroxy-carboxylic acid, has traditionally been used as food, cosmetic, pharmaceutical, and chemical industries. Even though it has tremendous potential for large scale production and use in a wide variety of applications, high cost lactic acid materials are primarily problems. Lactic acid can be obtained on either by fermentation or chemical synthesis. In recent years, the fermentation approach has become more successful because of the increasing market demand for naturally produced lactic acid. Generally, lactic acid was produced from pure starch or from glucose. As an alternative, biomass which is the most abundant renewable resources on earth have been considered for conversion to readily utilizable hydrolysate. In this study, we conducted the fermentation method to produce L(+)-lactic acid production from pretreated hydrolysate was investigated by Lactobacillus rhamnosus ATCC 863. The hydrolysate was obtained from pretreatment process of biomass using Ammonia percolation process (AP) followed by enzymatic hydrolysis. In order to effectively enhance lactic acid conversion and product yield, controlled medium, temperature, glucose concentration was conducted under pure glucose conditions. The optimum conditions of lactic acid production was investigated and compared with those of hydrolysate. Key words: Lactic Acid, Lactobacillus rhamnosus, Cellulosic Biomass, Pretreatment To whom correspondence should be addressed. jskim84@kyonggi.ac.kr This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 1

2 안수진 Roent Dune Cayetano 김태현 김준석 1. 서론 Lactic acid는가장널리사용하는 Hydroxy-carboxylic acid로서보존성과신맛을주기때문에식품방부제와산성제로이용되고있으며그밖의의약품, 화장품및각종유기화합물의원료로광범위하게사용되고있다. 또한최근에 Lactic acid는재생가능한탄소원으로서생분해성및생체활성고분자등의기능성고분자합성을위해이용하며빠른시간내에자연적으로분해되는능력을가지는생분해성고분자의원료로이들의시장수요는몇년간기하급수적으로성장하고있다 [1]. Lactic acid는일반적으로화학적합성또는미생물발효로생산된다. 화학적합성법으로는 Racemic lactic acid 형태로 L-lactic acid와 D-lactic acid의이성질체혼합물로생산되기때문에물성을자유롭게조절하는데어려움이따르는반면미생물발효방법에의한 Lactic acid 생산은공해문제가적고한가지형태인 L-(+)-lactic acid로생산되어인체의몸에서생물학적으로분해된다. 이에의해 Lactic acid는주로미생물발효방법으로제조되고있다 []. 일반적으로미생물발효방법에의한 Lactic acid 생산에가장많이사용되는원료는순수한전분또는가용성탄소원인글루코오스 (Glucose) 이다. 하지만순수한전분또는글루코오스의높은가격으로인하여 Lactic acid 공정의원료비를높이고있다. 그러므로경제적인 Lactic acid 생산을위하여저렴하고재생가능한대체원료인바이오매스를이용하여 Lactic acid를생산하는연구에관심이증가되고있다 [3-7]. 바이오매스는일반적으로 Cellulose, Hemicellulose, Lignin으로구성되어있다. 효율적인발효를위하여최근에는 Lignin의함량을줄인전처리된가수분해물을이용하여경제적으로 Lactic acid를생산하는연구가진행되고있으며본논문에서는 Lignin 제거에가장효과적인암모니아침출공정 (AP) 을이용하여전처리하였다 [8-11]. 전처리된가수분해물은 Lactic acid 생산을위한저렴하고친환경적공급원으로서글루코오스로구성되어있고독성물질이없기 때문에미생물을이용한발효방법에용이한장점을갖고있다. 본논문에서는암모니아침출공정을통한전처리된바이오매스를효소가수분해하여글루코오스로전환하고이를 Lactobacillus rhamnosus ATCC 863을이용하여발효방법에의해 Lactic acid를생산하였다. Lactobacillus rhamnosus ATCC 863은일반적으로혐기성조건에서 L-(+)-Lactic acid을선택적으로생산하는균주이다 [1].. 실험재료및방법 -1. 사용균주본연구에사용된 Lactobacillus rhamnosus ATCC 863은한국미생물보존센터에서분양받았으며 MRS배지를이용하여배양온도 37 o C, 1 rpm, 7시간배양하였고이의보존은 Glycerol stock 으로냉동보관하였다. MRS배지는 Protease peptone No. 3 :. g, Beef extract:. g, Yeast extract :. g, Glucose:. g(difco, USA), Ammonium citrate :. g, Sodium acetate :. g, K HPO 4 :. g, MgSO 4. 7H O : g, MnSO 4. 4H O :. g(sam-chun Chemicals, Korea) 으로조성되어있다. Table 1. Medium optimization composition A (g/l) B (g/l) C (g/l) D (g/l) Glucose Protease peptone No. 3 Beef extract Yeast extract Ammonium citrate Sodium acetate K HPO 4 MgSO 4 7H O MnSO 4 4H O FeSO 4 7H O CaCl H O 발효조건 --1. 배지최적화 MRS배지에 FeSO 4, CaCl 성분을첨가하여조성이다른 4종류의배지로실험하였다. 삼각플라스크혐기발효로진행하였으며글루코오스농도를 g/l로조절하였다. Lactobacillus rhamnosus ATCC 863을접종한후 4 o C, 1 rpm에서 1시간배양하였을때의 Lactic acid 생산량을측정비교하였다. 배지의조성은 Table 1에나타내었다. --. 발효온도최적의발효온도를찾기위하여배지최적화를통해얻은최적의 D배지를이용하였다. 삼각플라스크혐기발효로수행하였으며발효온도 3 o C, 4 o C, o C에서 1 rpm, 96시간동안배양하였을때생성되는 Lactic acid 생성량을비교하여최적의발효온도를도출하였다 글루코오스농도효율적인발효를위하여글루코오스농도에따른 Lactic acid 생산량을비교하였다. 배지최적화와최적의발효온도인 D배지, 4 o C 조건에서삼각플라스크혐기조건으로실험을진행하였다. 글루코오스농도를각각 g/l, g/l, 3 g/l로조절한후 Lactobacillus rhamnosus ATCC 863을접종, 1 rpm, 7시간배양하였을때의 Lactic acid 생산량을비교분석하였다. -3. 가수분해물발효 전처리본연구에사용된바이오매스는농업부산물계열의볏짚 (Rice straw), EFB (Empty Fruit Bunch), 돼지감자줄기 (Jerusalem artichoke) 를사용하였으며 16%(v/v) 암모니아수에의한침출공정 ((AP; Ammonia percolation process) 을통하여전처리하였다 [9]. 기질과용액을 1:의비율로혼합하여 17 o C, 분반응하였다. 전처리후깨끗한물로세척하였고오븐에서 4 o C로건조하여잔류수분을제거하였다. 전처리전바이오매스의구성성분을 Table 에나타내었다 효소당화전처리된가수분해물의당화는삼각플라스크에서진행하였다. 당화는전처리된기질을삼각플라스크에넣고 sodium citrate buffer solution(. M, ph 4.8) 와혼합한후 18 rpm의진탕배양기에서 Korean Chem. Eng. Res., Vol. 3, No. 1, February,

3 전처리된섬유소계바이오매스로부터 Lactic acid 생산 3 Table. Major Compositions of various biomass Rice straw EFB Jerusalem artichoke Glucose (%) Xylose (%) Lignin (%) Others (%) 진행하였다. 당화조건은온도 o C, 기질농도 % (w/v) 이다. 효소는 Celluclast (Cellulase, Novo Co., Denmark) 1. L와 Novozyme-188 (β-glucosidase, Novo Co., Denmark) 을사용하였다. 효소의평균비활성도는 Filter paper activity는 6FPU/ml, β-glucosidase activity는 3CBU/ml이다 발효전처리된가수분해물로부터 Lactic acid 생성량을비교하여분석하였다. 각각의당화액은 11 o C에서 3분동안멸균한후상온에서냉각하였다. 그후각당화액을 ml로조절후삼각플라스크혐기발효로진행하였다. Lactobacillus rhamnosus ATCC 863을접종, 1 rpm, 7시간배양하였을때의 Lactic acid 생산량을비교분석하였다. -4. 분석방법발효후당분석및발효액의분석은 HPLC(Waters, USA) 를사용하였다. 성분분석에사용된 Column은 Biorad사의 Aminex HPX-87P column을사용하였다. 당화액및발효액의분석은 Aminex HPX- 87H을사용하였다. 검출에사용된 Detector는 Waters 4 RI detector(waters, USA) 를사용하였다. 이동상은 mm의 H SO 4 를사용하였고유속을.6 ml/min으로운전하였다. 각 column과 detector의온도는 HPX-87H는 6 o C, HPX-87P는 8 o C, RI detector는 o C이다. 3. 결과및고찰 3-1. 배지최적화발효배지의최적조건을설정하기위하여 MRS배지에 FeSO 4, CaCl 함량에따라 4종류의배지로나눈후 4 o C에서 일간혐기발효한결과 Table 3에나타내었다. 발효결과순수 MRS배지인 A, FeSO 4 가첨가된 B, CaCl 가첨가된 C에비하여 FeSO 4, CaCl 모두첨가한 D배지에서가장많은 Lactic acid를생성하였다. 또한 A, B, C, D배지모두 48~7시간에서최대 Lactic acid를생성하였다. 결과로부터 FeSO 4, CaCl 는발효에긍정적인영향을주는요소임을확인하였으며, 최적의배지로 D배지를선택한후실험에적용하여수행하였다 [6]. Table 3. Lactic acid production from glucose Time (h) A (g/l) B (g/l) C (g/l) D (g/l) Fig. 1. Effect of temperature on lactic acid production from 1 wt% of glucose. Glucose (, 3 o C;, 4 o C;, o C); Lactic acid (, 3 o C;, 4 o C;, o C). 3-. 발효온도글루코오스농도 g/l, D배지를사용하여 96시간동안발효하였다. 서로다른발효온도에따라글루코오스의상대적인 Lactic acid 생산량에대해조사하였다. 발효에적합한최적의배양온도를선정하기위하여각각의온도 3 o C, 4 o C, o C로실험한결과 Fig. 1에나타내었다. Fig. 1에서 3 o C, 4 o C의배지는반응시간이증가함에따라모든글루코오스를소비하였다. 반면 o C의배지는글루코오스소비와 Lactic acid를생성하지않는다는사실을확인하였다. 이로부터 o C의온도에서발효가정상적으로이루어지지않는다는결과를얻었다. 또한최적의발효온도를얻기위하여두온도를비교하였다. 3 o C의그래프를확인해보면 4시간부터 48시간이될때가장많은글루코오스를소비하였다. 가장많은 Lactic acid는 48시간에서 7.1 g/l로수율 7.% 를얻었다. 반면 4 o C 그래프를확인해보면 4시간에서모든글루코오스를소비하고최대 Lactic acid 생성량 7. g/l, 수율 7.6% 를얻었다. Volumetric productivity를비교하였을때 3 o C, 4 o C에서각각. g/l/h,.3 g/l/h의값을얻었다. 이로부터 4 o C의온도에서발효가가장효과적임을확인하였다 글루코오스농도초기글루코오스농도에따른 Lactic acid 생산을비교하였다. 최적의 D배지와최적온도 4 o C로고정한후글루코오스초기농도 g/l, g/l, 3 g/l 로달리하여 7시간발효한후글루코오스의감소량과 Lactic acid의생성량을확인하였다. 이에따른결과를 Fig. 에나타내었다. Fig. 에서글루코오스 g/l는 4시간에서모든글루코오스를소비하고최대 Lactic acid량 7. g/l를생성하였다. 또한글루코오스 g/l는 48시간에서모든글루코오스를소비하고최대 Lactic acid량 13.8 g/l를생성하였다. 반면가장높은농도인글루코오스 3 g/l의경우 7시간동안모든글루코오스를소비하지못하였으며이때의글루코오스잔류량은.1 g/l였고 Lactic acid 생성량은. g/l이다. 이에따른 Lactic acid 생성수율은각각 g/l, g/l, 3 g/l에서 7.6%, 73%, 71.7% 로글루코오스 g/l의 Korean Chem. Eng. Res., Vol. 3, No. 1, February,

4 4 안수진 Roent Dune Cayetano 김태현 김준석 Fig.. Time course of lactic acid production from various concentration of glucose at 4 o C. Glucose (, 1 wt%;, wt%;, 3 wt%); Lactic acid (, 1 wt%;, wt%;, 3 wt%). Table 4. Major compositions of AP-treated biomass Rice straw EFB Jerusalem artichoke Glucose (%) Xylose (%) Lignin (%) Others (%) 수율이가장높음을확인하였다. 이로부터생산속도와수율을비교하였을때글루코오스농도 g/l에서가장효율적임을확인하였다 가수분해물발효전처리된바이오매스를효소당화를거쳐얻어진가수분해당화액을이용하여 Lactic acid 생산량을확인하여비교하였다. 세종류의바이오매스 Rice straw, EFB, Jerusalem artichoke를암모니아침출공정을이용하여전처리한후각바이오매스의구성성분을 Table 4에나타내었다. 각바이오매스의전처리전, 후성분분석을비교하였을때세종류의바이오매스모두글루코오스와 Xylose 함유율의손실이거의없는것으로나타났다. 반면 Lignin 함유율은감소하였으며이에따른감소율은각각 Rice straw의경우 1.4% 에서 4.% 로 66.13% 감소하였고 EFB는 1.1% 에서 7.4% 로 64.93% 감소하였으며 Jerusalem artichoke는.9% 에서 8.8% 로 7.9% 감소하였다. 이로부터암모니아침출공정에의한전처리공정은 Lignin 제거에효율적임을알수있다. 각바이오매스가수분해물의시간에따른글루코오스와 Lactic acid의농도를 Fig. 3에나타내었다. Rice straw, EFB, Jerusalem artichoke 의초기글루코오스농도는각각 17.4 g/l, 4.66 g/l, 17.1 g/l 로단위부피당당농도를비교하였을때 EFB의당농도가가장높은값임을알수있다. Rice straw는발효후 48시간에서모든글루코오스를소비하였으며 7시간에서가장많은 Lactic acid을생산하였다. 반면 EFB와 Jerusalem artichoke의경우 4시간에서모든글루코오스를소비하였으며 7시간에서최대 Lactic acid을생산하였다. Rice straw, EFB, Jerusalem artichoke의최대 Lactic acid 농도는 Fig. 3. Lactic acid production from pretreated hydrolysate. Glucose (, Rice straw;, EFB;, Jerusalem artichoke); Lactic acid (, Rice straw;, EFB;, Jerusalem artichoke). 각각 4.3 g/l, 6.17 g/l, 4.31 g/l임을확인하였고이에따른수율은각각 73.6%, 7%, 7.8% 를나타내었다. 암모니아침출공정에의한전처리된바이오매스세종류와순수글루코오스의발효를비교하였을때수율은거의비슷한값인 73~76% 를나타내었다. 그러므로 Lactic acid 발효의원재료로순수한글루코오스대신전처리된바이오매스를사용하여경제적으로높은효과를얻을수있다는결론을내릴수있다. 감 본연구는 13년도산업통상자원부의재원으로한국에너지기술평가원 (KETEP) 의지원을받아수행한연구과제 (No ) 입니다. 사 References 1. Sauer, M., Porro, D., Mattanovich, D. and Branduardi, P., Microbial Production of Organic Acids: Expanding the Markets, Trends Biotechnol., 6, -8(8).. Lu, Z., He, F., Shi, Y., Lu, M. and Yu, L., Fermentative Production of L(+)-Lactic Acid Using Hydrolyzed Acorn Starch, Persimmon Juice and Wheat Bran Hydrolysate as Nutrients, Bioresour. Technol., 1, (). 3. Phrueksawan, P., Kulpreecha, S., Sooksai, S. and Thongchul, N., Direct Fermentation of l(+)-lactic Acid from Cassava Pulp by Solid State Culture of Rhizopus Oryzae, Bioprocess. Biosyst. Eng., 3(8), (1). 4. Saito, K., Hasa, Y. and Abe, H., Production of Lactic Acid from Xylose and Wheat Straw by Rhizopus Oryzae, J. Biosci. Bioeng., 114(), (1).. Adsul, M. G., Varma, A. J. and Gokhale, D. V., Lactic Acid Production from Waste Sugarcane Bagasse Derived Cellulose, Green Chem., 9, 8-6(7). 6. Dumbrepatil, A., Adsul, M., Chaudhari, S., Khire, J. and Gokhale, D., Utilization of Molasses Sugar for Lactic Acid Production Korean Chem. Eng. Res., Vol. 3, No. 1, February,

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48(6)-08(김준석).fm

48(6)-08(김준석).fm , pp. 704-711 억새를이용한바이오에탄올생산을위한암모니아침출공정최적화 김경섭 김준석 경기대학교화학공학과 443-760 수원시영통구이의동산 94-6 (2010 년 6 월 1 일접수, 2010 년 7 월 8 일채택 ) Optimization of Ammonia Percolation Process for Ethanol Production from Miscanthus