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1 The Korean Journal of Microbiology, Vol. 44, No. 1, March 2008, p Copyrightc2008, The Microbiological Society of Korea 송이자실체기저부토양으로부터항균활성을가지는 KM1-15 균주의분리및분류학적특성 김윤지 1 황경숙 1,2 * 1 목원대학교미생물생태자원연구소, 2 생명산업학부 송이자실체기저부토양으로부터분리한 268 균주를대상으로식물병원성곰팡이 7 균주 (Alternaria panax, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosprioides, Fusarium oxysporum, Phytopthora capsici, Pythium ultimum, Rizoctonia solani) 에대해항균활성을검토한결과인삼점무늬병원균 (Alternaria panax) 과인삼탄저병원균 (Colletotrichum gloeosprioides) 에강한항균활성을나타내는 KM1-15 균주가선발되었다. KM1-15 균주의 16S rdna 염기서열 (1,311 bp) 을결정하여계통학적위치를검토한결과, Bacillus koguryoae T (AY904033) 와 99.6% 의상동성을나타내었다. API 50CHE Kit 를사용하여당분해능에대해 Bacillus koguryoae T (AY904033) 와비교ㆍ검토한결과 KM1-15 균주는 L-arabinose, cellobiose, inulin, D-turanose 양성반응을나타내는생리학적특성이확인되었다. 주요지방산으로는 15:0 anteiso (35.78%), 17:0 anteiso (17.97%) 를함유하였으며, 13:0 iso 3-OH, 14:0 iso 3- OH, 15:0 iso 3-OH, 그리고 17:0 iso 3-OH 와같은다양한분지형지방산을함유하는특성을나타내었다. 퀴논종으로는 (100%) 을가지고, G+C 함량은 43.7% 를나타내었다. 또한 protein 과 starch 에대한가수분해능이탁월하여 KM1-15 균주는병해충방제제및토양개량제로매우유용하게활용될것으로사료된다. Key words antibiotic activity, forest soil, pine mushroom, plant pathogene 송림토양생태계의주요구성원인송이버섯과균근에관한연구는활발하게진행되어온반면토양세균군집에대한연구는매우미흡한실정이다 (19, 23, 25). 공동연구자는선행연구에서송이자생군락토양으로부터직접 DNA를추출하고 16S rdna- ARDRA (Amplified rdna Restriction Analysis) 지문분석법을이용하여송이자생군락토양내세균군집구조를해석한결과기존의배양방법으로는분리가곤란한난배양성세균 (VBNC; viable but non-culturable) 군집인 Acidobacteria 계통군이 85% 이상차지하고있음을밝힌바있다. 또한송이자생군락토양내세균수측정결과통상농도의육즙 (NB) 배지보다희석육즙배지 (DNB) 에서 5~10배높은세균수가측정되어송이자생군락토양에는저영양성세균이다수존재해있는것으로추정되었다 (4). 송이버섯은다당류성분인 β-1,4-16-glucans를 91.8% 함유하고있어항암활성능이다른버섯과비교하여가장강한효과를나타내는것으로보고되었다 (1). 또한송이버섯내에는독특한방향성분인 glifolin, coriorin, illudin 등테트로이드화합물및방향족화합물이함유되어있어식물병원성곰팡이인복숭아탄저병균 Alternaria alternaria와인삼뿌리썩음병균 Cylindrocarpon destructans, 그리고편도선염을일으키는병원성세균인 Streptococcus sp. 에대해항균효과가있는것으로보고되었다 (6, 7, 11). 본연구에서는송이버섯이자생하고있는토양내에항균활 성능이탁월한토착세균군집이분포해있을것으로추정되어송이자실체기저부토양으로부터토착세균을분리하기위하여선행연구에서나타난결과를바탕으로저영양배지를이용한배양법을통해토양세균의순수분리를시도하였다. 분리된이들저영양성토양세균을대상으로농작물의대표적인식물병원성곰팡이 (Alternaria panax, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosprioides, Fusarium oxysporum, Phytopthora capsici, Pythium ultimum, Rizoctonia solani) 에대한항균활성을검정하고우수균주를선발하여분류학적특성을검토하였다. 토양시료의채취및처리 재료및방법 경북안동시녹전면내정리용두산의송림내송이자생군락을조사지로선정하였다. 용두산송이자생군락내송이자실체기저부토양으로부터시료를채취하고 polyethylene vinyl bag과 bottle에넣어실험실로운반하여 12시간이내에실험하였다. 각토양시료는 1 g씩정량하여 99 μl의멸균수에넣고 homogenizer (Ace AM-7, Nikon Seiki Co.) 로 15,000 rpm에서 2분간충분히분산시킨다음 9ml의멸균수에순차적으로희석하여사용하였다 (16). *To whom correspondence should be addressed. Tel: , Fax: kswhang@mokwon.ac.kr 토양세균의분리 토양세균의배양배지로통상농도의육즙영양배지 (Nutrient 56

2 Vol. 44, No. 1 송림토양으로부터분리된항균활성균주의분류학적특성 57 Broth, NB) 를 10-2 배로희석한 (Diluted Nutrient Broth: DNB) 저영양배지를사용하였다. 순차적으로희석한토양시료 1ml를 DNB 평판배지에넣고혼합배양하여, 28 o C에서 50일이상장기간배양한후 DNB 평판배지상에형성된세균을순수분리하였다 (16). 식물병원균에대한항균활성검정 송이자실체기저부토양으로부터순수분리된균주들의식물병원균에대한항균활성능을검토하기위하여대표적인식물병원성곰팡이표준균주를한국농업미생물자원센터 (KACC) 로부터분양받아사용하였다. 본실험에사용된균주는인삼점무늬병원균 (Alternaria panax, KACC 42141), 잿빛곰팡이병원균 (Botrytis cinerea, KACC 40963), 인삼탄저병원균 (Colletotrichum gloeosprioides, KACC 40003), 시들음병원균 (Fusarium oxysporum, KACC 41088), 고추역병균 (Phytopthora capsici, KACC 40476), 인삼모잘록병원균 (Pythium ultimum, KACC 40705), 그리고오이모잘록병원균 (Rizoctonia solani, KACC 40117) 으로 Table 1에표기하였다. 항균활성검정은 in vitro 항균활성확인법을이용하여 PDA (Potato Dextrose Agar, Difco) 배지에상기의식물병원균을각각접종한후분리균주를대치배양하여균체주위에형성된생육저지대 (growth inhibitor clear zone) 의크기에따라항균활성수준을결정하였다 (2). 분리균주의생리학적및생화학적특성조사 분리균주의생리학적및생화학적특성조사를위해 API 50 CHE Kit (BIOMERIEUX, France) 를이용하여 49개당분해능을조사ㆍ비교하였으며 (24, 28), 고분자화합물 protein, starch, cellulose, lipid, 그리고 chitin에대한가수분해능을측정하였다. 모든측정실험에는 0.02% beef extract, 0.01% NaCl, 0.02% peptone, 0.01% yeast extract를기초배지로사용하였다. Protein 가수분해능을측정하기위해 1% (w/v) skim milk를첨가하였고, starch 가수분해능은 0.5% soluble starch를첨가하였으며, 지시약 Table 1. Plant pathogenic fungi used in this study Plant pathogenic fungi Nature of a disease Alternaria panax (KACC42141) Foliar blight and black rot Botrytis cinerea (KACC40963) Gray mold rot Colletotrichum gloeosprioides (KACC40003) Anthracnose Fusarium oxysporum (KACC41088) Fusarium wilt Phytopthora capsici (KACC40476) Phytophthora blight Pythium ultimum (KACC40705) Damping off Rizoctonia solani (KACC40117) Damping off 으로 I 2 -KI solution 을사용하였다 (5, 15). Cellulose 분해능측정에는 0.4% (w/v) carboxy methyl cellulose를첨가하였으며, 지시약으로 0.1% Congo red 용액을사용하였고, lipase 가수분해능을측정하기위해 1% (w/v) glyceryl tributyrate (TBN) 가함유된 gum arabic solution를첨가하였다 (14). 그리고 chitin 가수분해능은 1% (w/v) wet colloidal chitin을첨가하여사용하였다 (2). 상기의각기질을첨가한배지에분리균주를접종하여 28 o C에서 7 일간배양한후형성된투명환의크기에따라각고분자화합물에대한가수분해능을평가하였다 (2, 9). 균체지방산조성분석 균체지방산분석을위하여 TSB (Trypticase Soy Broth) 를 10-1 배로희석하고 agar 1.5% 첨가한평판배지에균체를접종하고 28 o C에서 3일간배양한후대수기의균체를회수하였다. 회수한균체약 50 mg (wet weight) 을 teflon-lined screw cap tube ( mm, pyrex) 에옮긴후, Ikemoto & Miyagawa의방법 (18, 27) 에의해균체지방산을 methyl ester화시켜추출하였다. 지방산 methyl ester의분석에는 Microbial Identification System (MIDI; Microbial ID, Inc., Newark, USA) 을이용하여분석하였다. Quinone 분석 Isoprenoid quinone 분자종의동정은 Collins 등의방법 (17) 을이용하여건조균체로부터지질혼합물을추출하고, 이를 silica-gel TLC plate에전개하여표준물질과동일한 R f 를갖는 band를확인, 채취하여정제하였다. 이 quinone 혼합물을 Collins 등의방법 (17) 에따라각각의표준물질과함께 HPLC를이용하여각각의분자종을동정하였다 (8, 9). DNA G+C 함량측정 정제된 DNA를증류수에용해시켜농도를 350~500 μg/ml로조정한다. 농도를조정한 DNA용액 20 μl를 microtube에취하여 100 o C에서 10분간유지한후, 얼음안에서급속히냉각하여변성시키고 20 μl의 nuclease P1을첨가하여 50 o C에서 1시간반응하고 20 μl의 alkaliphosphatase 용액을첨가하여 37 o C에서 1시간반응후조제한시료를 HPLC (LC-10AD vp, Shimazu, Tokyo, Japan) 로분석하였다 (8, 26). 주사전자현미경 (SEM) 을이용한세포형태관찰 주사전자현미경관찰은 plate에형성된콜로니를중심으로배지를도려낸후 2.5% glutaraldehyde에넣어 4 o C에서 15~24시간동안전고정한후, 0.1 M phosphate buffer (ph 7.0) 로 10분씩 3 회세척한다음 1% osmium tetroxide를넣어 4 o C에서 2시간동안후고정한다. 고정된세균을 50% ethanol에서 100% ethanol 까지순차적으로탈수시킨후 50% Isoamyl acetate (isoamyl acetate:alcohol=1:1) 로 10분동안복분해시키고, 100% Isoamyl acetate로 5분동안침지시킨다음 Critical Point Dryer (CPD 030) 로임계점에서건조시킨다. 건조된시료를시료대에흡착시킨후 Sputter Coater (SCK 005) 를이용하여금으로 coating하여

3 58 Yun-Ji Kim and Kyung-Sook Whang Kor. J. Microbiol 주사전자현미경으로관찰하였다 (9). 분리균주의 16S rdna PCR 증폭 순수배양된단일 colony를주형으로사용하여직접 PCR 증폭을하였다. E. coli 16S rdna 부분의 conserved sequence를기초로한 27F; 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' primer와 1492R; 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3' primer를이용하였다 (20, 22). PCR은 27 Forward primer, 1 μl; 1492 Reverse primer, 1 μl; EF-Taq polymerase (Solgent co., Korea), 0.25 μl; dntp, 1 μl; 10 buffer, 5 μl; band doctor, 5 μl; H 2 O, μl를 0.2 ml PCR tube에넣고잘혼합한후 94 에서 5분간반응한다음 94 o C에서 denaturation 1분, 55 o C에서 annealing 1분, 72 o C에서 extention 1분을 30회반복하고, 72 o C에서 10분간 final extention 의조건으로 PCR (GeneAMPR PCR System 9700, Applied Biosystems) 반응을실시하였다. PCR 증폭산물은전기영동 (Mupid-21, Gel documentation system, Bio-Rad) 하여추출여부를확인하였다. 분리균주의 16S rdna 염기서열분석 정제한 16S rdna를주형으로 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) 를사용하여염기서열을결정하였다. Sequencing PCR은 BigDye 1.3 μl, T7 primer 1 μl, 16S rdna sample 1 μl (100 ng), 2 buffer 3.4 μl에멸균증류수 13.3 μl를잘혼합한후 cycle sequencing 실시하였다. PCR 산물은 100% ethanol 50 μl와 3 M sodium acetate (ph 5.2) 2 μl를첨가한후 22,040 g 에서 25분간침전시키고. 250 μl의 70% ethanol로세척하여건조시킨후 HiDi Formamide 20 μl를첨가하여 95 o C에서 2분동안 denaturation한후얼음위에서냉각시키고 ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems) 를사용하여 16S rdna (500~580 bp) 염기서열을결정하였다 (8). 분리균주의계통도작성 결정된 16S rdna 염기서열의 homology 는 DDBJ/ NCBI/ GenBank database의 BLAST program을이용하여비교하였다. 각염기서열의상동성은 alignment CLUSTAL X algorithm를이용하여병렬로정렬하였으며계통도의작성은근린결합법에의거하여결정하였다 (29). 결과및고찰분리균주의식물병원균에대한항균활성검정송이자생군락토양내에는저영양성세균이다수분포해있다는선행연구의결과 (4) 를바탕으로본연구에서는송이자실체기저부토양으로부터세균을분리하기위해저영양배지를이용하여총 268균주를순수분리하였다. 이들분리균주들을식물병원성곰팡이인인삼점무늬병원균 (Alternaria panax), 잿빛곰팡이병원균 (Botrytis cinerea), 인삼탄저병원균 (Colletotrichum gloeosprioides), 시들음병원균 (Fusarium oxysporum), 고추역병균 (Phytopthora capsici), 인삼모잘록병원균 (Pythium ultimum), 오이모잘록병원균 (Rizoctonia solani) 과각각대치배양을통해길항력을검토하였다. 항균활성검토결과 KM1-15균주가인삼점무늬병원균 (Alternaria panax) 과인삼탄저병원균 (Colletotrichum gloeosprioides) 에대해가장강한항균력을나타내는것으로최종선발되었다 (Fig. 1). 특히, Alternaria panax와 Colletotrichum gloeosprioides는인삼에병을일으키는병원균으로, 본연구에서선발된 KM1-15균주는국내토양에서분리한토착세균으로인삼병방제제에활용가치가높을것으로사료된다. KM1-15 균주의 16S rdna 염기서열분석 KM1-15균주에대하여 16S rdna 염기서열 (1,311 bp) 을결정하여계통학적위치를검토하였다. 16S rdna 염기서열결과를 NCBI/ RDP/ GenBank의 database와상동성비교를한후계통수를작성한결과 Bacillus 속에속하였으며, Bacillus koguryoae T (AY904033) 와가장가까운유전적거리를나타내었다 (Fig. 2) (21). 또한 Bacillus 속에속하는근연종들과 KM1-15 균주의유사도를조사한결과, Bacillus koguryoae T (AY904033) 와 99.62% 의가장높은상동성을나타내었다. KM1-15 균주의염기서열 Fig. 1. Antibiotic activity of strain KM1-15 to Alternaria panax and Colletotrichum gloeosprioides.

4 Vol. 44, No. 1 송림토양으로부터분리된항균활성균주의분류학적특성 59 Fig. 2. Phylogenetic relationships of strain KM1-15 and genera Bacillus based on similarities of 16S rdna. The phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method. Bootstrap values ard shown at nodes. Scale bar, 1 nucleotide substitutions in 100 bases. (1,311 bp) 은 GenBank 에 accession no. AB 로등록하였다. 고, G+C 함량은 43.7% 로측정되었다 (Table 2). KM1-15 균주의화학분류분리균주 KM1-15의지방산 methyl ester에대한균체지방산을분석한결과, 주요지방산으로 15:0 anteiso (35.78%) 와 17:0 anteiso (17.97%) 를함유하였으며, KM1-15 균주와근연관계에위치해있는 Bacillus 속에속하는표준균주들과균체지방산성분을비교한결과, 13:0 iso 3-OH, 14:0 iso 3-OH, 15:0 iso 3- OH, 그리고 17:0 iso 3-OH와같은다양한분지형지방산을함유하는독특한특성을나타내었다. 또한유전학적으로가장유사했던 Bacillus koguryoae T 의경우, 주요지방산이 15:0 iso와 15:0 anteiso로 KM1-15 균주와차이를보였으며, 다른 Bacillus 속표준균주들과도같은결과를나타내는것을확인할수있었다. 이와같은결과는지방산의높은변이성때문으로같은 Bacillus 속에속하더라도배양조건에따라지방산성분이달라질수있어상기와같은차이가보여지는것이며, 이는지방산으로는정확한동정이어렵다는것을시사한다 (30). Isoprenoid quinone 종의분석결과, KM1-15 균주는 menaquinone 을함유하고있었으며 HPLC에의한정량분석결과, 이 100% 로검출되어표준균주들과같이주요퀴논종으로동정되었 KM1-15 균주의형태학적특성 인삼점무늬병원균 (Alternaria panax) 과인삼탄저병원균 (Colletotrichum gloeosprioides) 에대해강한길항력을나타낸 KM1-15 균주의콜로니형태와세포형태특성을조사하였다. DNB 평판배지에형성된콜로니의특징은연한노란색의불규칙적인형태의콜로니가관찰되었고, 전자현미경하에서세포형태를관찰한결과약 μm의간균임이관찰되었다 (Fig. 3). KM1-15 균주의생리학적및생화학적특성 고분자화합물 protein, starch, cellulose, lipid, 그리고 chitin에대한가수분해능을측정한결과, protein 가수분해능검정배지에나타난투명환의크기는 8 mm이었으며, starch의경우 9 mm로 protein과 starch에대한가수분해능이우수한특징을나타냈다 (Fig. 4). API 50CHE Kit를이용하여 KM1-15 균주의당분해능을조사한결과, glycerol, L-arabinose, ribose, D-xylose, glucose, fructose, mannose, mannitol, sorbitol, α-methyl-d-glucoside, amygdalin, arbutin, esculin, salicin, cellobiose, maltose, melibiose, sucrose, trehalose, inulin, raffinose, starch, glycogen, gentiobiose,

60 Yun-Ji Kim and Kyung-Sook Whang Kor. J. Microbiol Table 2. Some characteristics of strain KM1-15 and related Bacillus species Strain 1 2 3 4 5 6 7 26.7 1.13 2.46 31.8 29.27 15.6 8 9 10 11 0.98 1.

53 14.83 12.37 11.3 3.5 0.51 1.67 1.55 3.45 1.99 Branched chain fatty acid i-14:0 1.63 i-15:0 3.69 i-16:0 6.56 i-17:0 3.55 ai-15:0 35.78 26.0 ai-17:0 17.97 6.9 i-17:1 w5c 0.62 18.0 15.

5 60 Yun-Ji Kim and Kyung-Sook Whang Kor. J. Microbiol Table 2. Some characteristics of strain KM1-15 and related Bacillus species Strain Branched chain fatty acid i-14: i-15: i-16: i-17: ai-15: ai-17: i-17:1 w5c i-17:1 w7c Fi-15: :1 cis i-17:1 cis OH i-13: OH i-14: OH i-15: OH i-17: Quinone system G+C content (mol%) * Data from Ko et al., 2006 Strains: 1; KM1-15, 2; B. koguryoae, 3; B. cibi, 4; B. subtilis, 5; B. amyloliquefaciens, 6; B. vallismortis, 7; B. mojavensis, 8; B. atrophaeus, 9; B. sonorensis, 10; B. licheniformis, 11; B. pumilus Fig. 4. Hydrolysis of protein (A) and starch (B) by strain KM1-15. Fig. 3. Scanning electron micrograph (SEM) of strain KM1-15. panax)과 인삼탄저병원균(Colletotrichum gloeosprioides)에 가장 그리고 D-turanose를 분해하는 특성을 나타내었다(Table 3). 계통 뛰어난 항균력을 나타내었다. 인삼점무늬병을 일으키는 학적으로 매우 유사한 Bacillus koguryoae의 경우 galactose, inositol, N-acethyl-glucosamine, xylitol, gluconate, 5-keto- Alternaria panax는 바람에 의하여 전염되는 대표적인 공기전염 성으로 전국 어디에서나 많이 발생하며 전염 속도가 빠른 것이 gluconate에 양성반응을 나타내었으나, KM1-15 균주는 음성반응 특징이다. 인삼 점무늬병은 잎에 불규칙한 흑색의 반점이 형성되 을 나타내었다. 반면 KM1-15의 경우 L-arabinose, cellobiose, 고 검은색으로 변색되면서 줄기가 서 있는 상태로 말라 죽게 하 inulin, D-turanose에는 양성반응을 나타내었으나, B. koguryoae는 는데 모종삼 줄기는 매우 짧기 때문에 병원균이 잎에 오염되면 음성반응을 보여 계통학적으로는 매우 유사하지만 표현형적 특 줄기를 통해 쉽게 뇌두와 뿌리로 내려가 검은색으로 부패 시킨 성에는 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 다. 인삼탄저병은 전국적으로 모종밭에서 피해가 가장 심한 병이 본 연구에서 송이 자실체 기저부 토양으로부터 분리된 KM1- 며 병을 일으키는 Colletotrichum gloeosprioides는 포자가 끈적끈 15 균주는 인삼에 병을 일으키는 인삼점무늬병원균(Alternaria 적한 점액물질에 쌓여 형성되었다가 점액물질이 빗물에 의해 녹

6 Vol. 44, No. 1 송림토양으로부터분리된항균활성균주의분류학적특성 61 Table 3. Carbohydrate fermentation of strain KM1-15 by API 50CHE Kit Carbohydrates Strain KM1-15 Type strain of B. koguryoae Glycerol + + Erythritol - - D-Arabinose - - L-Arabinose + - Ribose + + D-Xylose + + L-Xylose - - Adonitol - - β-methyl-d-xylopyranside - - Galactose - + Glucose + + Fructose + + Mannose + + Sorbose - - Rhamnose - - Dulcitol - - Inositol - + Mannitol + + Sorbitol + + α-methyl-d-mannopyranside - - α-methyl-d-glucoside + + N-Acethyl-glucosamine - + Amygdalin + + Arbutin + + Esculin + + Salicin + + Cellobiose + - Maltose + + Lactose - - Melibiose + + Sucrose + + Trehalose + + Inulin + - MeleZitose - - Raffinose + + Starch + + Glycogen + + Xylitol - + Gentiobiose + + D-Turanose + - D-Lyxose - - D-Tagatose - - Table 3. Continued Carbohydrates Strain KM1-15 Type strain of B. koguryoae D-Fucose - - L-Fucose - - D-Arabitol - - L-Arabito - - Gluconate Keto-gluconate Keto-gluconate - + * Data from Ko et al., ; Fermented, - ; Not fermented. 아서지표면을따라흐르는물에의해이동된다. 우리나라대표적약용작물인인삼은한곳에서 3~5년재배해야하는특성을지니기때문에병해에의한피해와생육불량이발생하는등연작장해의문제를가지고있다 (13). 특히한국에서발생되는주요병원균들은 Alternaria, Colletotrichum, Phytophthora, Cylindrocarpon, Fusarium, Sclerotinia, Erwinia, Pseudomonas 등이있으며, 대부분토양전염성으로병을일으키는것으로보고되었다 (13). 이러한문제때문에토양훈증제처리에의한화학적방제가실시되고있지만지속적인효과가약할뿐만아니라토양생태계파괴를초래할수있다. 환경에대해부담을적게주면서생산성향상과작물의안정성을높일수있는고품질친환경미생물제제의필요성이더욱커지고있다 (3, 10, 11, 12). 본연구를통해송이자실체기저부토양으로부터분리된 KM1-15 균주는인삼병원균에대한항균활성능이탁월하고고분자화합물의분해능이우수하여친환경병해충방제제및토양개량제로의활용에기여할수있을것으로사료된다. 감사의말 본논문은 2007년도농촌진흥청바이오그린21사업 ( ) 지원에의하여수행되었으며, 이에감사드립니다. 참고문헌 1. 강창율, 심미자, 최응칠, 이영남, 김병각 한국산담자균류의항암성분에관한연구. 한국생화학회지 14, 고영희외 생체활성물질탐색을위한미생물의분리에관한연구 (I). 과학기술처연구보고서 BSG 김성욱외 항진균생물농약소재를개발하기위한길항미생물 Bacillus 의육종. 과학기술부연구보고서 BSNB 김윤지, 황경숙 송이자생군락토양내난배양성세균군집의계통학적특성. Korean J. Microbiol. 43, 김태운, 김정희, 김경남, 민승기 김치에서단백질분해효소활성균주분리및동정. 한국식품과학회지 35,

7 62 Yun-Ji Kim and Kyung-Sook Whang Kor. J. Microbiol 6. 민태진, 김은미, 이선정, 배강규 버섯중항균물질의검색및개발에관한연구 - 버섯중항진균활성물질의검색 (I). Korean J. Mycol. 23, 민태진, 김은미, 유선호 한국산버섯추출물의항진균및항세균활성검색 (II). Korean J. Mycol. 24, 박진숙, 황경숙, 천종식 미생물의분류동정실험법, 월드사이언스. 9. 양창술, 김종식역 토양미생물실험법. 월드사이언스. 10. 이병대, 박훈 Bacillus subtilis B-4228 의인삼근부병억제효과. 고려인삼학회지 28, 이은탁, 김상달 Phytophthora capsici 를길항하는 Pseudomonas flurescens 2112 가생산하는항진균항생물질 2,4-diacetylphloroglucinol. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 29, 정희경, 류재천, 김상달 진균성식물병해방제를위한항생물질생산길항미생물의복합제제화. J. Korean. Soc. Appl. Biol. Chem. 48, 조대휘, 박규진, 유연현, 오승환, 이호자 Cylindrocarpon destructans (Zinssm.) Scholten 에의한連作地 2 年根人蔘의根腐病發病特性. Krean J. Ginseng Sci. 19, 최원석, 배동훈 토양으로부터분리한균주로부터섬유소분해효소생산. 신소재연구논집 12, 최원석, 배동훈 토양미생물로부터전분가수분해효소의생산과그특성. 신소재연구논집 12, 황경숙, 유승헌 유기영양분농도에따른토양세균의증식양상과통상및편성저영양세균의분리. Korean J. Microbiol. 21, Collins, M.D. and D. Jones Distribution of isoprenoid quinone structural types in bacteria and their taxonomic implications. Microbiol. Rev. 45, Ikemoto, S., M. Kuraishi, K. Komagata, R. Azuma, R. Suto, and H. Murooka Cellular fatty acid composition in Pseudomonas species. J. Gen. Appl. Microbiol. 24, Ito, T The present status of Matsutake production technique in Japan. Kor. J. Mycol. 9, Johnson, J.L Similarity analysis of rrnas. In P. Gerhardt, R.G.E. Murray, W.A. Wood, and N.R. Krirg (eds.). Methods for general and molecular bacteriology, p American Society for Microbiology, Washington, D.C., USA. 21. Ko, K.S., W.S. Oh, M.Y. Lee, J.H. Lee, H. Lee, K.R. Peck, N.Y. Lee, and J.H. Song Bacillus infantis sp. nov. and Bacillus idriensis sp. nov., isolated from a patient with neonatal sepsis. IJSEM 56, Lane, D.J S/23S rrna sequencing. In E. Stackebrandt and M. Goodfellow (eds.). Nucleic acid techniques in bacterial systematics, pp John Wiley and Sons, Chichester, UK. 23. Lee, C.-Y., O.-P. Hong, M.-J. Jung, and Y.-H. Han Effect of carbon sources and vitamins on myclial growth of Tricholoma matsutake DGUM Kor. J. Mycol. 25, Macfaddin, J.F Biochemical tests for identification of medical bacteria, 2nd ed. Williams & Wilkins, USA. 25. Makoto Ogawa Mycorrhiza in the Pine forest-the ecological study of Matsutake as a microorganism. Kor. J. Mycol. 9, Mesbah, M., U. Premachandran, and W.B. Whitman Precise measurement of the G+C content of deoxyribonucleic acid by high-performance liquid chromatography. Int. J. Syst. Bacteriol. 39, Miyagawa, E., R. Azuma, and T. Suto Cellular fatty acid composition in Gram-negative obligately anaerobic rods. J. Gen. Appl. Microbiol. 25, Roh, H.J., Y.S. Shin, K.S. Lee, and M.K. Shin Effect of water extract of green tea on thd quality and shelf life of cooked rice (in Korean). Korean J. Food Sci. Technol. 28, Thomson, J.D., D.G. Higgins, and T.J. Gibson CLUSTAL W; improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, Venkateswaran, K., D.P. Moser, M.E. Dollhopf, D.P. Lies, D.A. Saffarini, B.J. MacGregor, D.B. Ringelberg, D.C. White, M. Nishijima, H. Sano, J. Burghardt, E. Stackebrandt, and K.H. Nealson Polyphasic taxonomy of the genus Shewanella and description of Shewanella oneidensis sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, (Received November 27, 2007/Accepted February 24, 2008) ABSTRACT : Isolation and Taxonomical Characterization of Strain KM1-15 with Antibiotic Activity from Pine Mushroom (Tricholoma matsutake) Basal Soil Yun-Ji Kim 1 and Kyung-Sook Whang 1,2 * ( 1 Institute of Microbial Ecology & Resources, 2 Department of Biotechnology, Mokwon University, Daejeon , Republic of Korea) Two hundred and sixty-eight bacterial strains were isolated from pine mushroom (Tricholoma matsutake) basal soil. In the course of screening for antifungal activity against seven plant pathogenic fungi (Alternaria panax, Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosprioides, Fusarium oxysporum, Phytopthora capsici, Pythium ultimum, Rizoctonia solani) of isolates, strain KM1-15 showed strong antibiotic activity against Alternaria panax and Colletotrichum gloeosprioides. In determining its relationship on the basis of 16S rdna sequence, KM1-15 strain was most closely related to Bacillus koguryoae T (AY904033) (99.62%). When assayed with the API 50CHE Kit, unlike Bacillus koguryoae, it is positive for utilization of L-arabinose, cellobiose, inulin, and D-turanose. Results of cellular fatty acid analysis showed that major cellular fatty acids were 15:0 anteiso (35.78%) and 17:0 anteiso (17.97%). In particular, hydroxyl fatty acids such as 13:0 iso 3-OH, 14:0 iso 3-OH, 15:0 iso 3-OH, and 17:0 iso 3- OH were only restricted to strain KM1-15. DNA G+C content was 43.7 mol% and quinone system was (100%) in strain KM1-15.

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- 2 - - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - [ 그림 1] 산수유 [ 그림 2] 더덕 - 6 - - 7 - sample [ 그림 3] 균분리를위한접종 - 8 - PCA PCA with inoculum Slide glass [ 그림 4] Slide culture 모식도 - 9 - - 10 - Nutrient Medium Paperdisk with Antibiotics