User s Guide AccuPower FMDV Real-Time RT-PCR MasterMix Kit FMV-1114-A Qualitative test Kit FMDV RNA

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한나 강
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2 AccuPower FMDV Real-Time RT-PCR MasterMix Kit 사용설명서 100 Version No.: 0.0 ( ) Please read all the information in booklet before using the unit 바이오니아대전광역시대덕구문평서로 8-11 Tel: Fax: AccuPower,AccuPrep, Exicycler and ExiPrep are trademarks of Bioneer Corporation. Copyright Bioneer Corporation. All Rights Reserved. 1

3 안전경고및주의사항 1) 본키트는연구용 (Research Use Only, RUO) 으로연구외의목적으로사용할수없습니다. 2) 본키트는임상검체의사용과분자생물학실험에자격이있고숙련된검사자만이사용해야합니다. 3) 본키트를사용하기에앞서반드시정식사용안내서를숙지하고제품에포함된구성품을확인한후실험을수행하시기바랍니다. 4) 본제품은 Exicycler 96 Real-Time Quantitative thermal block 또는이에상응하는장비를이용하여 Real- Time PCR 을수행해야합니다. 5) 사용한키트구성물은일회용이므로재사용하지않도록하며, 다른 lot 의구성물과혼합하여사용하지않도록해야합니다. 6) 제품은 -20 이하의온도에서냉동보관해야하며, 제품을 3 회이상냉 / 해동하지않도록하고제품에기재된보증기간내에서안정성을보증합니다. 제품의사용기한은제품박스에표시된내용을참고하시기바랍니다. 7) 본제품의물질안전보건자료 (MSDS) 정보가필요할경우바이오니아고객서비스센터에요청바랍니다. 8) 실험에사용한일회용실험물품들 ( 검체와접촉한 tip, tube 등 ) 은사용안내서에따라취급하고법적으로지정된방법으로폐기해야합니다. 9) 모든실험과정은각검사실의안전규칙에따라진행해야합니다. 보증과책임 1) 바이오니아는보증기간 ( 제품외관기재 ) 동안제품의품질을보증합니다. 제품의품질에문제가발생할경우, 즉시고객서비스센터로연락주시기바랍니다. 2) 바이오니아는본사용안내서에제시된사용법과다른방법을사용하여발생된문제에대해서는책임을지지않습니다. 법적고지문 1) 본키트로수행되는일부응용프로그램은특정국가에서의기존특허와관련하여사용이제한될수있습니다. 2) 키트의구매는특허의권한을포함하거나제공하지않으며, 사용자는국가및용도에따라권한을취득하여야합니다. 당사는특허권한의무단사용을금합니다. 2

4 문의사항및 A/S 접수 - 제품에대한문의사항및 A/S 접수는 (ds@bioneer.co.kr) 을이용해주시기바랍니다. - 제품문의시아래표에기재된정보를보내주시면정확한상담과신속한처리가가능합니다. Category 핵산추출정보 Real-Time PCR 정보해당 ex3 파일 (.ex3) 해당 log 파일 (.txt) Information 핵산추출장비 ( 제조사 / Serial No.) 핵산추출시약 ( 제조사 / Lot No.) Real-Time PCR 장비 ( 제조사 / Serial No.) Real-Time PCR 키트 (Cat. No / Lot No.) C:\ExiData\Guest\ C:\ExiData\Log\ 3

5 목차 1. 사용목적 서론 테스트의특징과원리 키트구성품및사용장비 키트구성품 사용장비 보관및사용기한 부가적으로필요한재료와장비 일반적인유의사항 실험과정 실험전준비사항 생물안전작업대사용 검체 검체채취 검체운반 검체보관 저해물질 Work Flow 실험과정 핵산추출 PCR의준비 결과분석 실험결과예시 결과분석방법 Troubleshooting Specification Limit of detection (LoD) Measurement rang & linearity Cross reactivity Precision Whole system failure rate Repeatability Reproducibility Stability Storage temperature stability Transport simulation stability

6 Freezing and thawing stability 장비호환성실험 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) PCR protocol Data result Fast Real-Time PCR Instrument System (ABI) PCR protocol Data result 참고문헌 심볼설명

7 1. 사용목적 는구제역에감염된우제류동물의리보핵산을실시간역전사중합효소연쇄반응 (Real-time RT-PCR) 기법을이용하여한번의 PCR 반응으로구제역을검출하는정성검사용고위험성동물전염병유전검사용시약입니다. 2. 서론 구제역 (Foot and mouth disease) 감염은주로발굽이 2 개로갈라진우제류동물 ( 소, 돼지, 양, 흑염소, 사슴등 ) 에서발생하고, 직 간접접촉에의해전파속도와전염성이매우높은수포성질환입니다. 질병 발생시치사율, 생산성이감소, 질병방제, 살처분, 국제교역제한등으로인한막대한경제적피해가 발생합니다. 우리나라에서의최초발생보고는 1917 년이며, 최근에는 2010 년 11 월말경상북도안동의한양돈장 에서발생한구제역이전국으로확산되어많은경제, 사회적인문제를유발하였습니다. 구제역은다양한 방법으로농장, 국가, 대륙사이에전파되기때문에아시아, 아프리카, 남미일부국가에서지속적으로 발생하고있어세계동물보건기구 (OIE) 의관리질병이며, 국내 1 종전염병으로분류되고있습니다. 는실시간역전사중합효소연쇄반응 (Real-time RT-PCR) 을이용하여구제역바이러스의 3D region 을신속하고, 간편하게검출하도록고안되어있습니다. 1300bp 5 UTR 7000bp L VP4 VP2 VP3 VP1 2A 2B 2C 3A 3B 3B 3B 3C 3D 90bp 3 UTR Fig 1. Schematic diagram of FMDV genome 3. 테스트의특징과원리 Real-time PCR 은특정 DNA sequence 를증폭시키는과정에서발생하는형광강도를 PCR 의매 주기마다측정하여증폭산물의양을실시간으로모니터링할수있는기술입니다. 증폭되는특정 sequence 에특이적인 primer 와형광물질로표지된 probe 를이용하여 PCR 산물의증폭량을측정하기때문에높은특이도를나타냅니다. Real-time PCR 에주로사용되는 TaqMan Probe 는 5 말단에 형광물질과 3 말단에 quencher 로표지되어있어주형 DNA 와결합하여있을때는빛을주어도형광물질의 에너지가 quencher 로전이되어형광을발하지않습니다. 하지만 PCR 과정이진행됨에따라 DNA polymerase 의 5 3 exonuclease 가활성화되어형광물질 probe 로부터분리됨으로써형광을발하게 됩니다. 발생된형광은실시간으로측정하여 PCR 의각주기마다 PCR 증폭곡선으로나타낼수있고, 이를 이용하여시료내특정 DNA 의정량분석을가능하게합니다. 본키트는특정부분을증폭하는 primer 와이기법에필요한모든요소들이단일 tube 에제공되어민감하고 빠른시간내에검출하도록고안되었으며정교한 bioinformatics 알고리즘에의해설계된 primer 및 probe 6

set 를통해증폭효율을높였습니다. 4. 키트구성품및사용장비 4.1 키트구성품 5 4 1 2 3 Table1.

8 set 를통해증폭효율을높였습니다. 4. 키트구성품및사용장비 4.1 키트구성품 Table1. Contents of 구성품 포장단위 수량 1 FMDV MasterMix (All-in) 890 μl / tube 5 tube 2 Internal Positive Control RNA 120 μl / tube 2 tube 3 DEPC-DW 1800 μl / tube 1 tube 4 Quick manual - 1 sheet 5 Product box - 1 box 4.2 사용장비 는 Exicycler 96 장비또는이에상응하는장비에 사용가능합니다. 장비에따른실험과정은사용안내서 8. 실험과정을참고하시기바랍니다. 5. 보관및사용기한 는자외선또는태양광을피하여 -20 이하의온도에서냉동보관해야하며, 키트에기재된보증기간내에서안정성을보증합니다. 제품내포함된 IPC (Internal Positive Control) 의냉동과해동의반복은제품품질에영향을미치므로반드시피해야합니다. 만약키트를간헐적으로사용할경우, 필요한수량의구성품만꺼내어사용하며구성품을재사용하지않도록합니다. 또한 PCR Mixture를포함한시약은 4 에보관하지않도록합니다. 7

9 6. 부가적으로필요한재료와장비 ( 키트에제공되지않음 ) - 분자실험에적합한일회용장갑 - 적절한용량의 micropipette set - 멸균된 filtered pipette tip ml micro tube 또는 15 ml conical tube - 핵산추출을위한프로토콜및시약 ( 핵산추출, 핵산추출참고 ) AccuPrep Viral RNA Extraction Kit (Cat. No. K-3032) ExiPrep TM Dx Viral RNA Kit (Cat. No. K-3535) 7. 일반적인유의사항 - 본제품은 Exicycler 96 Real-Time Quantitative thermal block 또는이에상응하는장비를사용하여 Real-Time PCR 을수행해야합니다. - 생물학적으로유해한시약및임상검체를다룰때는반드시장갑과마스크를착용합니다. - 사용한키트구성물은일회용이므로재사용하지않도록하며, 다른 lot 의구성물과혼합하여사용하지않도록해야합니다. - 실험과정을생략하거나원하는결과를얻기위해임의로변경하지않아야합니다. - 멸균된 filter pipette tip 을이용하여실험을수행합니다. - 임상검체또는 PC DNA 는다른시약을보관하는냉동고와분리하여냉동저장할것을권장합니다. - 모든키트의구성물은최소실험 10 분전에실온에꺼내어천천히녹여준비해놓아야합니다. - 녹인키트구성물은사용하기전에 vortexing 과 spin-down 을하여최상의결과를얻을수있도록준비합니다. - PC 는 premix 준비에사용되는공간과별도로분리된공간에서반응액을첨가해야합니다. 8. 실험과정 8.1 실험전준비사항 본준비사항의숙지로검사자와검사실의안전에유의하며내부환경오염에주의하시기바랍니다 생물안전작업대사용 시료전처리및준비는음압생물안전작업대 (class 이상 ) 내에서수행해야합니다. 음압 생물안전작업대는필터를통과한외부공기가작업공간내로들어가고, 작업공간내오염된 공기는다시필터를통과하여외부로배출되기때문에검사실내감염과오염을방지할수있습니다. 8

10 8.2 검체 모든임상검체는감염성물질로취급해야합니다. AccuPower FMDV Real-Time RT- PCR MasterMix Kit 용추천시료는우제류동물의수포액, 병변조직, 타액, 비즙, 혈액시료등입니다 검체채취 는우제류동물의수포액, 병변조직, 타액, 비즙등으로부터추출된 RNA 의진단에최적화되었습니다. 검체채취시차폐연구시설에서 실시하며, 교차오염등을방지하기위해가급적핵산추출장비의사용을권장합니다 검체운반 모든임상검체는누출로인한감염가능성을없애기위해완전히밀봉하고쉽게부서지지않는운반용기에의해운반해야합니다. 또한, 4 C를유지하여운반하고 24시간내운송이불가능한경우는 -70 C에보관하는것이좋습니다. 타지역으로의운반시에는해당지역 / 국가의생물학적위험물운송지침과구제역긴급행동지침 SOP에따라야합니다 검체보관 검체는 2~8 C 조건에서최대 7 일까지보관이가능합니다. 장기간보관을위해서는임상검체를 1 회실험분량으로분주하여 -20~-80 C 에서보관해야합니다 저해물질 임상검체는여러가지 PCR 저해물질을포함하고있습니다. 따라서효율적인 PCR 반응을 위해서는 RNA 추출과정에서 PCR 저해물질을반드시제거해야합니다. 8.3 Work Flow 는 Exicycler 96 이나이에상응하는 Realtime PCR 장비에사용가능합니다. 간략한실험과정은아래와같습니다. 9

11 샘플수포액, 병변조직, 타액, 비즙, 혈액등 RNA preparation -AccuPrep Viral RNA Extraction kit (K-3033) - ExiPrep Dx Viral RNA Kit (K-3535) Real-Time RT-PCR Mixture FMDV Master mix 44 ul IPC 1 ul Sample RNA or positive control RNA: 5 ul Total : 50 ul Vortexing and spin down - Exispin (A-7040) Real time RT-PCR Exicycler 96 (A-2060) Fig 2. Work flow 8.4 실험과정 핵산추출 임상검체로부터 RNA를분리하기위해서는 RNA extraction kit를사용하여야합니다. 제조사의지시사항에따라 RNA를추출하시기바랍니다. Note: 핵산추출방법과 kit의품질에따라 PCR 결과에영향을미칠수있습니다. Note: 검체내포함되어있는저해물질로인하여 PCR 반응이영향을받을수있습니다. 저해물질을제거할수있는핵산추출방법사용을권장합니다. 최상의결과를위하여다음과같은바이오니아추출키트및장비의사용을권장합니다. Table 2. 에기재된바이오니아추출키트및장비의사용방법은각제품의사용안내서를참고하시기 바랍니다. Table 2. Viral RNA extraction kits from Bioneer Products Cat. No. Platform AccuPrep Viral RNA Extraction Kit K-3033 Manual ExiPrep TM Dx Viral RNA Kit K-3535 ExiPrep TM 16 Dx PCR 의준비 1) 필요한수량의 control RNA [PC (not supplied), IPC] 를검사전최소 10분전에꺼내어상온에서녹입니다. 추출한검체 DNA를냉동보관하였다면검사전최소 10분전에꺼내어상온에서녹입니다. FMDV MasterMix는검사전에꺼내어준비합니다. NTC (2 tubes) 와 PC (2 tubes) 에 4개의 tube가사용되기때문에한번의실험에필요한 tube 수는다음과같습니다. 10

12 4 (experimental controls) + number of samples 2) 정확한실험결과를위해사용에앞서모든시약, control 및 sample 들을 10 초이상 vortexing 하고 spin-down 합니다. 3) 반응당 44 μl의 FMDV MasterMix 에 1 μl IPC 를첨가하여 spin-down 합니다. 이때손실되는 양을고려하여필요량보다최소 1 tube 이상의양으로계산합니다. 다음은반응 tube 에따라 필요한시약의양을정리한표입니다. Table 3. Reaction mixture 검체수량 (+ 여분 ) 1 8 (+2) 16 (+4) IPC 1 μl 10 μl 20 μl FMDV MasterMix 44 μl 440 μl 880 μl Total volume 45 μl 450 μl 900 μl Volume per well 45 μl Each 45 μl Each 45 μl 4) 모든 PCR tube에앞서준비한 mixture를 45 μl씩분주합니다. 5) NTC well에는 DEPC-DW (NTC) 5 μl를넣은후 optical sealing film으로 well을밀봉하여다음 단계에서발생할수있는오염을사전에방지합니다. 6) 오염을방지하기위하여 tube 를분리된공간으로옮겨 PC well 에 PC (Not supplied) 를각각 5 μl씩분주합니다. 7) 나머지 PCR tube 에는시료의핵산을각각 5 μl씩분주한후결과의혼동을막기위해해당 시료에따라각 well 을기록합니다. 8) Optical sealing film을가위나칼을이용하여크기에맞게자른후, applicator를이용하여 tube를완전히밀봉합니다. Note: tube 밀봉이완벽하게되지않으면 PCR 반응및결과에영향을미칠수있으니반드시확인하시기바랍니다. 9) RNA와잘섞기위해 ExiSpin 을이용하여 [vortex 5초 (hard), spindown (2,500rpm) 1초 ]x25회후에 spindown (2,500rpm) 3분으로진행합니다. Note: 시약이완벽하게 down 되지않은상태에서 PCR을수행하면결과에이상을초래하게되므로반드시시약이완벽하게 down된상태에서 PCR을수행하시기바랍니다. 10) ExiSpin 을사용하는동안 Exicycler 96의프로그램설정을완료합니다. 11) 혼합이완료된 PCR MasterMix tube 를바로 Exicycler 96 에장착하여검사를시작합니다. 12) Exicycler 96 기기뒷면의대기전원스위치를켜면전면의 LED 상태표시등이붉은빛을 나타냅니다. (Fig 3-1) 11

이때, 2개의 NTC tube의위치가 A1과 B1에그리고 2개의 PC tube의위치가 C1과 D1에위치하도록놓습니다. PCR tube의장착이완료되면 door 버튼을 2초간눌러 door를닫습니다.

13 Fig 3. Operation button (door button, power button and status LED) of Exicycler 96 13) 붉은 LED 상태표시등을확인한후, 기기전면의작동전원스위치를 2 초간누릅니다. 작동이개시되어일련의 self test 가끝나면짧은신호음과함께 LED 상태표시등이초록빛을 내며깜박거립니다. (Fig 3-2) 14) Door 버튼을 2초간눌러 96-well thermal block이나오면반응 tube를미리정해놓은위치에장착합니다. 이때, 2개의 NTC tube의위치가 A1과 B1에그리고 2개의 PC tube의위치가 C1과 D1에위치하도록놓습니다. PCR tube의장착이완료되면 door 버튼을 2초간눌러 door를닫습니다. Note: 6 strip 이하로 PCR을실행할경우 PCR tube가위치하는반대편 (column 12) 에 balance strip을추가적으로위치시켜 Exicycler 96의 thermal block의균형을맞춰주어야합니다. Fig 4. Door-open status of Exicycler 96 and 96-well thermal block 15) Run Exicycler3 아이콘을더블클릭하여프로그램을실행합니다. 이때 Device is Not ready 라는문구가나타나면프로그램을끄고장비전원상태를확인하고 self-test가끝난다음프로그램을다시실행합니다. System is ready 라는문구가뜨면장비와컴퓨터가성공적으로연결된것입니다. 12

00 0:0:5 4 Incubate at 55.00 0:0:5 5 Scan 6 Go to Step 3, Cycle: 45 7 Incubate at 72.00 0:5:0 Fig 7. Protocol tab 18) Plate tab을클릭하여 probe를선택하고사용하려는 well을지정합니다.

14 Fig 5. Run Exicycler3 icon 16) PCR 반응에필요한프로토콜을설정하기위해상단의메뉴바에서 File - Design Experiment 를클릭합니다. Fig 6. File - Design Experiment 17) Quick Start 창이나타나면 Protocol tab 에서 PCR cycle 을다음과같이설정합니다. Step Protocol Time 1 Incubate at :30:0 2 Incubate at :5:0 3 Incubate at :0:5 4 Incubate at :0:5 5 Scan 6 Go to Step 3, Cycle: 45 7 Incubate at :5:0 Fig 7. Protocol tab 18) Plate tab을클릭하여 probe를선택하고사용하려는 well을지정합니다. 먼저, Add Probe 를클릭하고, FAM 과 TAMRA 를선택합니다. 다음으로 PCR을위해준비된 strip의위치를지정합니다. 앞서준비한 NTC와 PC를포함한시료수만큼 well을클릭하고아래의 FAM 과 TAMRA 를체크한후, Assign 을클릭합니다. 추가적은시료의정보 (PC, NTC, 시료정보 ) 를기입하려면해당 well을클릭하고 Sample Name 옆빈칸에정보를기록한후 Sample Name 을클릭하면됩니다. 또한 probe 정보에서 Type well을클릭하면 sample, 13

ex3) 됩니다. Fig 9. Run button ( ) 8.4.3 결과분석 1) 실험결과로얻은데이터는 Analysis Exicycler3 프로그램을통해파일을열어분석 가능합니다.

15 IPC, NTC 등의정보가나타나며이들중해당하는 type 을선택할수있습니다. Target PC IPC Filter FAM TAMRA Fig 8. Plate tab 19) 작성이올바른경우 OK 버튼을클릭합니다. 모든정보가기입되면오른쪽상단의 OK 를클릭합니다. PCR을실행하기위해상단의툴바에위치한 버튼을클릭합니다. Note: 해당시험의결과파일명은 Real-Time PCR 사용일 ( 컴퓨터날짜기준 ) 로자동저장 (.ex3) 됩니다. Fig 9. Run button ( ) 결과분석 1) 실험결과로얻은데이터는 Analysis Exicycler3 프로그램을통해파일을열어분석 가능합니다. 해당프로그램을이용한데이터분석에대한자세한사항은기기의사용안내서를 참고하시기바랍니다. Fig 10. Analysis Exicycler3 icon 2) File Open 을선택하여분석할데이터파일 (.ex3) 을실행합니다. 데이터파일은 14

$C:\ExiData\GUEST 폴더에저장되어있습니다. Fig 11. File Open 3) Flu.$ Well vs Ct 창에서는시료들의 Ct값분포를확인할수있습니다.

창에서는해당시료의정보와 Ct값, Ct Threshold 등을확인할수있습니다. Fig 12.

16 C:\ExiData\GUEST 폴더에저장되어있습니다. Fig 11. File Open 3) Flu. Graph 창에서는실험의증폭형광곡선을확인할수있습니다. Well vs Ct 창에서는시료들의 Ct값분포를확인할수있습니다. Plate Info 창에서는시험이진행된 well의정보를알수있으며, Report Form 창에서는해당시료의정보와 Ct값, Ct Threshold 등을확인할수있습니다. Fig 12. Analysis Exicycler3 Result tab Flu. Graph 창에서는화면을 *.jpg 파일로저장할수있습니다. 툴바의이미지저장아이콘 ( ) 을클릭하면저장할수있고, 툴바의시트저장아이콘 ( ) 을클릭하면 *.xls 파일 형식으로저장할수있습니다. Fig 13. Flu. Graph tab 8.5 실험결과예시 FMV-1114-A E : 113% R^2 :

Lane 1~Lane 5 : 10 7 ~10 3 copies/rxn, Black : PC (3D), Red : IPC Fig 14. Result examples using PC FMV-1114-A E : 102% R^2 : 0.9991 1 2 3 4 5 6 Lane 1~Lane 6 : 1ng~10fg, Black : vaccine RNA Fig 15.

PC: FMDV RNA가 PCR 과정에서올바르게증폭되었는지판단 IPC: PCR 반응에따른각 well의핵산증폭여부판단및시료에의한 PCR 반응저해여부확인 ( 고농도시료의경우 PCR 경쟁반응에의하여 IPC signal이감소될수있음 ). 기타자세한내용은사용안내서 9.

17 Lane 1~Lane 5 : 10 7 ~10 3 copies/rxn, Black : PC (3D), Red : IPC Fig 14. Result examples using PC FMV-1114-A E : 102% R^2 : Lane 1~Lane 6 : 1ng~10fg, Black : vaccine RNA Fig 15. Result examples using vaccine RNA 8.6 결과분석방법 NTC 및 PC를각각 2 well 이상씩사용하는것을권장하며, 시료각각의 PCR 반응여부를확인하기위하여 NTC, PC를포함한모든시료 well에 IPC를사용합니다. NTC: 시료전처리, 핵산추출, PCR 준비과정에서발생할수있는오염여부를판단. PC: FMDV RNA가 PCR 과정에서올바르게증폭되었는지판단 IPC: PCR 반응에따른각 well의핵산증폭여부판단및시료에의한 PCR 반응저해여부확인 ( 고농도시료의경우 PCR 경쟁반응에의하여 IPC signal이감소될수있음 ). 기타자세한내용은사용안내서 9. Troubleshooting에따라적절한조치를취하시기바랍니다. 9. Troubleshooting 문제상황에따른해결방안의제안 IPC 가검출되지않은경우 모든 well (control 포함 ) 에서 TAMRA (IPC) signal이검출되지않은경우 추출또는 PCR Protocol 상의오류 실험에사용되는 Kit 의종류에알맞은추출및 PCR protocol 이 program 상에설정되었는지확인한다. 또한사용자에의한 준비과정이정확한 protocol 에따라수행되었는지도확인한다. 필요에따라재시험을수행한다. 사용안내서 8. 실험과정참고 잘못된추출또는 PCR 시약을사용한경우 실험목적에맞는시약을사용하였는지확인한다. 유효기간이지났거나잘못된보관으로 kit 가훼손된경우 보관조건이나유효기간을확인한후새로운시약으로 재검사하여결과를비교한다. 사용안내서 5. 보관및사용기한참고 16

18 특정 well에서만 TAMRA (IPC) signal이검출되지않은경우 PCR 이 inhibition 된경우 시료는 PCR 결과에영향을미치는다양한 inhibitor 를포함하고 있기때문에시료의 inhibitor 를최대한배제시킬수있도록 처리하여재검사를수행한다. 시료를종류에따라검증된방법으로전처리하였는지 확인한다. PC 가검출되지않은경우 PC well에서 FAM signal이검출되지않은경우 NTC well에서 FAM signal이검출된경우 유효기간이지났거나잘못된보관으로 kit 가훼손된경우 보관조건이나유효기간을확인한후새로운시약으로 재시험하여결과를비교한다. 사용안내서 5. 보관및사용기한참고 시약의재사용으로 kit 가훼손된경우 시약을절대재사용하지않는다. 재사용혹은반복된 냉동 / 해동은시약의성능을저하시키며결과적으로실험 결과에까지영향을미칠수있으므로필요한경우새로운 시약으로재검사를수행한다. 사용안내서 5. 보관및사용기한, 7. 일반적인유의사항참고 PCR Protocol 오류 PCR 준비과정을정확한 protocol 에따라 수행하였는지 확인한다. 특히 PC 로설정된 well 에정확한양의해당시약이 분주되었는지확인한다. 사용안내서 PCR 의준비참고 Pipetting 오류 Pipette 을점검하고정확한사용요령을숙지한다. NTC 가검출된경우 오염이발생한경우 실험장소나도구등의오염원을찾아제거한후재검사한다. 유효기간이지났거나잘못된보관으로 kit 가훼손된경우 보관조건이나유효기간을확인한후새로운시약으로 재시험하여결과를비교한다. 사용안내서 5. 보관및사용기한참고 PCR Protocol 오류 PCR 준비과정을정확한 protocol 에따라 수행하였는지 확인한다. 특히 S/W 상에지정된 well 에정확한양의 control ( 특히 NTC) 및시료가분주되었는지확인한다. 사용안내서 5. 보관및사용기한, 7. 일반적인유의사항참고 Pipetting 오류 Pipette 을점검하고정확한사용요령을숙지한다. 17

RNA와불활화정제구제역백신에서추출한 RNA를이용하였습니다. 적용농도는 PC를이용하여 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.

91 copies/rxn로 8개농도, 그리고백신 RNA를이용하여 100,000, 10,000, 1,000, 100, 10 fg/rxn 농도로준비하여

19 10. Specifications 10.1 Limit of detection (LoD) 의최소검출한계 (limit of detection, LoD) 를측정하기위하여 FMDV Positive RNA와불활화정제구제역백신에서추출한 RNA를이용하였습니다. 적용농도는 PC를이용하여 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 7.81, 3.91 copies/rxn로 8개농도, 그리고백신 RNA를이용하여 100,000, 10,000, 1,000, 100, 10 fg/rxn 농도로준비하여 를이용해각농도별로반복측정하였습니다. 의 LoD는 FMV-1114-A의경우, 14.1 copies/test, 10 fg/rxn이고 FMV-1114-B의경우, 13.8 copies/rxn, 10 fg/rxn입니다. 500 copies / rxn 250 copies / rxn 125 copies / rxn 62.5 copies / rxn copies / rxn copy/test 7.81 copy/test 3.91 copy/test 18

적용농도는 1x10 7 copies/test부터 10-fold dilution 하여 1x10 2 copies/test 까지준비하고 를이용하여각농도별로측정하였습니다. 측정된결과를바탕으로직선성을평가하여 R 2 값이 0.

20 1ng 100pg 10pg 1pg 100fg 10fg 1fg 100ag NTC Fig 16. Probit analysis of 10.2 Measurement range & linearity 의검출범위및직선성을측정하기위하여 FMDV Positive RNA를이용하였습니다. 적용농도는 1x10 7 copies/test부터 10-fold dilution 하여 1x10 2 copies/test 까지준비하고 를이용하여각농도별로측정하였습니다. 측정된결과를바탕으로직선성을평가하여 R 2 값이 0.99 이상도출되는구간을검출범위및직선성유지구간으로설정하였습니다. AccuPower FMDV Real-Time RT-PCR MasterMix Kit 의검출범위및직선성유지구간은 1x10 2 ~ 1x10 7 copies/test 입니다. 1x10 7 FMDV RNA 1x10 6 FMDV RNA 1x10 5 FMDV RNA 1x10 4 FMDV RNA 1x10 3 FMDV RNA 1x10 2 FMDV RNA IPC RNA(Mouse) R^2:0.9993, Effi:99% 19

21 Fig 17. Measurement range and linearity of 10.3 Cross reactivity 의교차반응을방지하기위하여 FMDV에특이적인 primer, probe를제품에적용하였습니다. Gene bank ( 에등록되어있는서열정보를확인하여 primer, probe간교차반응이없는것을확인하였습니다. 음성돼지혈청 10종에대해 AccuPrep Viral RNA Extraction Kit로리보핵산을추출하여교차반응을확인하였습니다. 교차반응확인에사용한음성혈청목록은 table 4에표시하였으며, 시험에사용한리보핵산과의교차반응은없는것으로나타났습니다. Table 4. List of sample for cross reactivity testing No. Sample AccuPower FMDV Real-Time RT-PCR MasterMix Kit FMDV signal IPC Signal 1 음성돼지혈청 음성돼지혈청 음성돼지혈청 음성돼지혈청 음성돼지혈청 음성돼지혈청 음성돼지혈청 음성돼지혈청 음성돼지혈청 음성돼지혈청 Precision Whole system failure rate 의시스템안정성을확인하기위하여저역가샘플을이용하여 96 반복검사를수행하였습니다. 모든시험결과에서 100% 양성결과를나타내어시스템안정성을확인하였습니다 Repeatability 의반복성을확인하기위하여검사내정밀도 (within-run assay), 검사간정밀도 (between-run assay), 날짜간정밀도 (betweenday assay), 검사실내정밀도 (total precision) 를측정하였습니다. 3가지농도 (1x10 3, 1x10 4, 1x10 5 copies/rxn) 로희석하여 10일간, 매일 2회, 매검사마다 2회반복하여시험하였습니다. 통계분석한시험결과는 table 5. 에표시하였습니다. 20

22 Table 5. Total precision data of Concentration (copies/rxn) Average SD CV (%) 1.0 x x x Reproducibility 의재현성을확인하기위하여검사장소간, 장비간, 검사자간, Lot 간정밀도를측정하였습니다. 3 가지농도 (1x10 3, 1x10 4, 1x10 5 copies/rxn) 로희석하여 5 일간, 매일 2 회, 매검사마다 2 회반복하여시험하였습니다. 통계 분석한시험결과는 table 6. 에표시하였습니다. Table 6. Reproducibility data of Assay 검사자간 Concentration (copies/rxn) Category 1x10 3 1x10 5 1x10 7 Average SD CV (%) Average 장비간 SD CV (%) Average 검사장소간 SD CV (%) Average Lot 간 SD CV (%) Stability Storage temperature stability 의안정성을확인하기위하여 실제보관온도시험 (Storage temperature stability) 을수행하였습니다. 완제품 3 개 batch 를이용하여 1x10 3, 1x10 4, 1x10 5, 1x10 6, 1x10 7 copies 로실제보관온도 (-20 이하 ) 에서 1 개월 단위로 7 개월까지시험했습니다. 실제보관온도시험결과를바탕으로 AccuPower Real-Time RT-PCR MasterMix Kit 의유효기한은 -20 C 에서보관시 6 개월로설정되었습니다. 21

23 Storage temperature stability 의수송안정성 ( 환경및운반조건변화 ) 을확인하기위하여국내 1개지역에제품을배송한후다시반송받아제조사에서안정성확인시험을수행하였습니다. 완제품제조공정과동일하게제조된제품을사용하여완제품 ( 개봉전 ) 1개 Lot를제품배송절차에따라포장, 배송하였습니다. 배송후제조사에다시반송되는시일은 2~3일이소요되었으며, 각지역에서수거한제품은본사에서보관중인제품 (-20 C 이하보관 ) 과성능비교하였습니다. 적용농도는 1x10 3, 1x10 4, 1x10 5, 1x10 6,1x10 7 copies로농도별 3반복시험하여각농도의 Ct값을산출하였으며, 이를바탕으로 SD, CV(%) 값을계산하였습니다. 수송안정성검사결과국내배송시제품의안정성이유지되는것을확인하였습니다 Freezing and thawing stability 의반복적인냉 / 해동을진행하여안정성확인시험을수행하였습니다. 적용농도는백신 RNA를이용하여 10 pg, 1 pg, 100 fg으로농도별 2반복시험으로하여각농도의 Ct값을산출하였으며, 이를바탕으로 SD값을계산하였습니다. 냉 / 해동안정성검사결과 3번의냉 / 해동진행에대한안정성을확인하였습니다. Table 7. Transport simulation stability of Concentration (copies/rxn) Average SD CV (%) NTC x x x x x Table 8. Freezing and thawing stability of 1차해동 2차해동 3차해동 Concentration Average SD Average SD Average SD NTC pg pg fg

24 11. 장비호환성실험 의 Exicycler 96 Real-time Quantitative Thermal Block에상응하는장비에대한호환성을측정하기위하여 PC (3D region, positive control) 와불활화정제구제역백신에서추출한 RNA를이용하였습니다. CFX96과 ABI 7500FAST 장비에서각농도별로실험한결과, 의타사장비호환성을확인하였습니다 CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System ( 이하 CFX96, Bio-Rad) Note : 자세한내용은장비 Manual 을참조하시기바랍니다 PCR protocol Step Protocol Time 1 Incubate at :30:0 2 Incubate at :5:0 3 Incubate at :0:15 4 Incubate at :0:50 5 Scan 6 Go to Step 3, Cycle: 45 7 Incubate at :5:0 Target PC IPC Filter FAM TAMRA filter가없어 HEX로대체이용 Data result FMV-1114-A E : 99.9% R^2 : Lane 1~Lane 5 : 10 7 ~10 3 copies/rxn, Black : PC (3D), Red : IPC Fig 18. Result examples using PC 23

25 FMV-1114-A E : 91.2% R^2 : Lane 1~Lane 5 : 1ng~100fg, Black : vaccine RNA Fig 19. Result examples using vaccine RNA FAST Real-Time PCR Instrument System ( 이하 ABI 7500FAST, ABI) Note : 자세한내용은장비 Manual 을참조하시기바랍니다 PCR protocol 검체수량 (control 포함 ) 1 8 (+2) 16 (+4) IPC 0.5 μl 5 μl 10 μl FMDV MasterMix 22 μl 220 μl 440 μl Total volume 22.5 μl 225 μl 450 μl Volume per well 22.5 μl Each 22.5 μl Each 22.5 μl Note : ABI 7500FAST는장비특성상최대 30μl로반응하는것을권장합니다. 자세한내용은장비 manual을참조하시기바랍니다. Step Protocol Time 1 Incubate at :30:0 2 Incubate at :5:0 3 Incubate at :0:25 4 Incubate at :0:50 5 Scan 6 Go to Step 3, Cycle : 45 7 Incubate at :5:0 Target PC IPC Filter FAM TAMRA 24

26 Data result FMV-1114-A E : 91.2% R^2 : Lane 1~Lane 5 : 5X10 6 ~5X10 2 copies/rxn, Blue : PC (3D), Green : IPC Fig 20. Result examples using PC FMV-1114-A E : 101.2% R^2 : Lane 1~Lane 5 : 500pg~50fg, Black : vaccine RNA Fig 21. Result examples using vaccine RNA 25

27 12. 참고문헌 동물질병표준검사법 , 농림축산검역본부 Callahan JD et al., Use of a portable real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. J Am Vet Met Assoc 심볼설명 Catalog number Upper limit of temperature Research Use Only Contains sufficient for test Manufacturer Caution, consult accompanying documents Batch code Expiration date Do not reuse Consult instructions for use 26

28 8-11 Munpyeongseo-ro, Daedeok-gu, Daejeon, 34302, Republic of Korea (Korea: ) Marina Village PKWY, Suite 110, Alameda, CA 94501, USA (Toll-free) us.bioneer.com Korea Bio Park BLDG #B-702, 700 Daewangpangyo-ro, Bundang-gu, Seongnam-si Gyeonggi-do, 13488, Republic of Korea

실험 Set Up Guide 실험주제 Real Time PCR 실험원리 Quantitative Real-Time PCR (qrt-pcr) 은 1992년에도입되어생명공학에응용되기시작하였이기술은잘알려져있는 PCR기법을개량한것이다. PCR은핵산의효소증폭을이용하며, 극히적은양

실험 Set Up Guide 실험주제 Real Time PCR 실험원리 Quantitative Real-Time PCR (qrt-pcr) 은 1992년에도입되어생명공학에응용되기시작하였이기술은잘알려져있는 PCR기법을개량한것이다. PCR은핵산의효소증폭을이용하며, 극히적은양의시료를대량으로증폭할수있다는장점과그과정이간단하여 Cloning, Sequencing 등의기본기술로응용되었다.