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2 치의학석사학위논문 줄기세포를이용한치아재생에 관한고찰 A review of stem cell mediated tooth regeneration 2014 년 2 월 서울대학교치의학대학원 치의학과 김철중

3 줄기세포를이용한치아재생에 관한고찰 지도교수명훈 이논문을치의학석사학위논문으로제출함 2014 년 1 월 서울대학교대학원 치의학과 김철중 김철중의치의학석사학위논문을인준함 2014 년 2 월 위원장서병무 ( 인 ) 부위원장명훈 ( 인 ) 위원김성민 ( 인 )

4 초 록 치아는배아기구강상피세포와신경능기원의중간엽세포간의연속적인상호작용에의해발생된다. 실험실에서하나의완전한치아를생성하기위해서는이들세포의공급원을찾아각세포를분리및배양한후에재조합하는과정이필요하다. 지난 10여년간줄기세포를이용하여생체치아를생성하는것에대한많은연구가이루어졌다. 하지만, 대부분의연구가배아기줄기세포를이용한것이라임상적으로사용되기에는많은한계를가지고있었다. 최근들어성체줄기세포를이용하여생체치아생성에성공한연구들이발표되고있다. 줄기세포를이용한생체치아연구에큰진보가이루어졌다고볼수있지만아직해결해야할과제가많이남아있다. 이러한연구들도상피줄기세포와중간엽줄기세포둘중에하나는성체줄기세포를이용했지만다른하나는배아기줄기세포를이용하였다. 또한상피줄기세포와중간엽줄기세포둘중에최소한한가지는쥐의세포를사용하였기때문에면역거부반응을일으켜생체치아를사람의몸에바로이식할수없다. 생체치아생성을위해줄기세포가임상적으로활용되기위해서는상피줄기세포와중간엽줄기세포모두사람의성체줄기세포를이용해야한다. 그러면서상피줄기세포와중간엽줄기세포둘중하나는유도능력을지녀야한다. 이러한요구조건을만족시키기 1

5 위한해결책으로서세포재프로그래밍 (Cell reprogramming) 이사용될수있다. 즉, 성체줄기세포에몇가지요소를첨가함으로써생체치아발생을일으키는데필요한유도능력을갖추도록재프로그래밍하는것이다 주요어 : 줄기세포, 생체치아, 치아재생, 세포재프로그래밍학번 :

6 목 차 1. 생체치아의필요성 줄기세포의정의및특징 줄기세포를이용한생체치아생성과정 생체치아생성에사용되는줄기세포비교 치아재생 줄기세포를이용한생체치아생성의한계와발전방향 결론 참고문헌 Abstract

7 1. 생체치아 (biotooth) 의필요성 치아는치주질환, 치아우식, 외상, 그리고유전적결손등여러가지이유로상실된다. 임플란트는 20세기후반부터사용되기시작하여이제는매우일반화되고시술가격도낮아지면서치아상실시에우선적으로고려되는치료가되었다. 임플란트의성공은골유착 (osseointegration) 에달려있는데, 골유착의성공을높이기위해임플란트의재료와표면처리방법등에관한연구가많이이루어졌다. 하지만, 임플란트는어쩔수없이가지는한계점이있다. 첫째로임플란트를식립하기위해서는식립부위의골이충분한부피를가져야하며골질또한좋아야한다. 그렇기때문에많은경우임플란트식립전에치조골부피를증가시키는시술을하게된다. 둘째로임플란트를이루는티타늄과치조골의경계는완벽하게융합될수없기때문에시간이오래흐르면안정성이떨어지게된다. 셋째로, 임플란트의형태는자연치의치근형태와다르고임플란트주위에는 PDL이존재하지않기때문에저작력이완충되지못하고바로치조골로전달되어시간이흐르면임플란트주변의치조골이흡수된다. 이러한한계점때문에임플란트를대체할수있는생체공학적접근을통해치아를재생하는것에대한연구가갈수록활발해지고있다. 이상적인생체치아는사람의자가조직을이용하여생성되고악골에서자랄수있으며맹출후에는악골에단단하게결합되어안전하게기능하는치아이다. 그러한생체치아는자연치와동일한기능을가질것이고인공보철물이가지는어쩔수없는 4

8 한계점들을극복할수있을것이다. 생체치아는자연치와 마찬가지로재생능력을보유하여치아의계속성 (integrity) 와 수명을유지하도록할것이다 줄기세포의정의및특징 줄기세포란동일한딸세포를계속해서생산해낼수있고좀더제한된특성을지니는세포를생산해내는능력을지닌세포를말한다 2. 줄기세포는대칭적으로분열하거나비대칭적으로분열할수있다. 대칭적으로분열시에는줄기세포의수가증가하게되고비대칭적으로분열시에는줄기세포의수는그대로유지하면서특성이다른세포를생산한다 2. 이세포들은선조체 (progenitor) 혹은변화증식세포 (transit amplifying cells) 로서증식하거나최종분화하게된다. 선조체와변화증식세포는한정된수명을가지기때문에이식되었을때단기간동안만조직을구성할수있다 2. 반면, 줄기세포는자기재생을보여일생동안어느조직이든재생할수있다. 이것이바로성공적인줄기세포치료의핵심이다. 배양을통해줄기세포수를늘릴수있는것은재생의료에서필수적인요구조건이고, 배양과정을거쳤을때줄기세포의특성에어떤영향을주는지에대한많은연구가이루어졌다 2. 줄기세포는어느조직에서건확실성을가지고찾아낼수없다. 연구자들은표면단백질의목록, 느린세포주기, 증식성, 그리고미분화된상태등의간접적인특성을가지고줄기세포를찾아낸다 2. 하지만이러한기준들은줄기세포특이적이지않다. 줄기세포임을보이는최고의방법은자기재생능력을평가하는것이다 2. 즉, 후보 5

9 줄기세포를분리, 이식하여장기간동안조직을구성하는지를 평가하는것이다. 3. 줄기세포를이용한생체치아생성과정 치아는상피조직과중간엽조직으로부터형성되므로치아를생성하기위해서는치성상피세포와중간엽세포의조합을필요로한다. 치성상피세포와중간엽세포를각각분리하여재조합시에 in vitro와 in vivo에서치아를형성하였다 3, 4. 지난십여년간 in vivo 에서치아를생성하기위한여러시도가진행되었다. 쥐, 돼지, 쥐의치배에서세포를분리하여적합한생체재료에위치시킨후면역억제된동물의장막에이식하였다 이러한연구들에서는상아질과법랑질의생성을확인하였다. 이는재조합된세포들이각각의층을형성하고상아질모세포와법랑질모세포로분화한다는것을의미한다. 대부분의연구에서세포들은별도의 in vitro 과정없이생체재료에놓여졌다. In vivo 이식전에 in vitro 과정을포함하는연구에서는결과가혈청의존재여부, 혈청의유형, 배지의조성, 세포밀도, 상피와중간엽세포의비율등의여러중요한변수에의해영향을받을수있다 2. 그렇기때문에치아생성을위한정형화된프로토콜은아직정립되지않았다. 법랑질과상아질을가지는치아를 in vivo에서생성하는것은이제현실이되었다. 하지만, 장막과같이치아원래의위치가아닌곳에서생성된치아는완성된치근과치주조직과같은필수요소가결여되어있다. 최근들어쥐의악골에서치아를생성하는연구가진행되었다 12. 이연구에서상피세포와중간엽세포는 collagen gel 6

10 drop에놓여진후에성체쥐의악골에이식되었다. 그결과법랑질모세포, 상아질모세포, 치관, 치근, 치수, 혈관, 치주인대등의모든치아구조의생성이확인되었다. 따라서, 치배를악골에이식시에치아가정상적으로발달, 성숙, 맹출되고, 이는줄기세포가치아상실시에이를대체하기위한용도로쓰일수있다는것을의미한다. 4. 생체치아생성에사용되는줄기세포비교 치아 형성은 상피조직과 중간엽조직 간의 상호작용으로 이루어지기 때문에상피줄기세포와 중간엽줄기세포 두 종류의 줄기세포가필요하다. 상피줄기세포는법랑질모세포를형성하고, 중간엽줄기세포는상아질모세포, 백악질모세포, 골모세포그리고 치주인대의섬유아세포를형성한다. 따라서, 줄기세포를이용한 생체치아생성을위해서는적절한줄기세포를분리하고배양한후 재조합하여원하는치아형성세포로분화하고치아의형태를 형성할수있도록해야한다. 지금까지생체치아생성에사용된 상피줄기세포와 중간엽줄기세포를 정리하면 Table 1. 과 같이 분류할수있다. 7

11 표 1. 치아재생에사용되는줄기세포의분류 중간엽 치성세포 Adult dental pulp stem 비치성세포 Bone marrow derived 줄기세포 cells (DPSC) mesenchymal stem (MSC) Stem cell from human cells (BMSC) exfoliated deciduous teeth (SHED) Stem cells from the apical part of the papilla (SCAP) Stem cells from the dental follicle (DFPC) Periodontal ligament 상피 줄기세포 stem cells (PDLSC) Epithelial stem cells from developing molars Adult human gingival epithelial cells (EpSC) Epithelial stem cells from Palatal mucosal the labial cervical loop epithelium from of rodent incisor post-natal mice Oral epithelium of p53-deficient fetal mice E18 8

12 중간엽줄기세포 (Mesenchymal stem cell, MSC) 중간엽줄기세포는자기복제능력과중배엽계로분화할잠재력이높기때문에골, 연골, 지방, 골격근, 결합조직등을형성한다 13. 지난십여년간, 치아중간엽줄기세포를이용한생체치아생성과치아손상재생에관한연구가많이이루어졌다. 골수로부터다분화능 (multipotent) 중간엽줄기세포 (BMSC) 를발견하여그특성을파악한이후로다른조직들로부터 MSC 유사 (MSC-like) 세포를찾아냈다 그중에서지방조직과탯줄의혈액에서분리한 MSC 유사세포는다분화능 MSC 세포로서의역할을기대할수있음이밝혀졌다 18, 19. 이러한 MSC는최소한골형성 (osteogenic), 연골형성 (chondrogenic), 지방형성 (adipogenic) 의 3가지세포계열로분화할수있다. 근육형성 (myogenic), 신경형성 (neurogenic), 힘줄형성 (tenogenic) 계열또한 BMSC로부터유도될수있다. 치아조직으로부터유래된여러 MSC 유사세포들도분리되어그특성이밝혀졌다. 사람의치수조직에서치아줄기세포가처음으로분리되었고 post-natal dental pulp stem cell (DPSC) 라고명명되었다 20. 이어서 3가지치아중간엽줄기세포가분리되어특성이밝혀졌다 : stem cells from exfoliated deciduous teeth (SHED) 21, periodontal ligament stem cells (PDLSC) 22, 그리고 stem cells from apical papilla (SCAP) 23, 24. 최근의연구에서다섯째치아조직유래선조세포를분리하였고 dental follicle precursor cells (DFPC) 이라고명명하였다 25. 하지만, 이렇게서로다른줄기세포간의정확한관계에대해서는아직명확히밝혀지지않았다. 이러한치아줄기세포의특성이파악되면서 BMSC과여러면에서 9

13 비교되었다. 치아줄기세포는여러계열로분화할수있는잠재력을지니고있어최소한 3개의세포계열로분화한다 : 골 / 치아형성, 지방형성, 그리고신경형성. 치아줄기세포와 BMSC과의차이점들이밝혀졌는데, 치아줄기세포는골형성발달보다는치아형성발달로더욱치우쳐있다. 치아줄기세포의생물학적특성에관한충분한이해가선행되어야재생의학에서치아줄기세포의효용성에대한이해가이루어질수있을것이다. 치수줄기세포 (Adult dental pulp stem cells, DPSC) 치아는심한손상을받으면새로운상아질모세포가형성되어손상부위에새로운상아질을침착시켜손상부위를재생시킨다. 이런현상에근거하여치수가중간엽줄기세포를포함하고있다는 가능성이제시되었다 26, 27. 치아재생이일생동안이루어지는 과정이라는것은중간엽줄기세포가성인의치수에존재할것이라는것을의미한다고볼수있다. 성인의치수에는적절한신호를받았을때상아질모세포로분화할수있는선조세포 (progenitor cell) 를포함하고있다 28. 치아의치수에존재하는상아질모세포선조체에대해서는아직명확히밝혀지진않았지만, 조골세포로분화할수있는혈관주위세포가상아질모세포로도분화가능하다는연구결과가발표되었다 28. 사람의치수세포는 in vitro 에서극성화된세포체와석회화결절이축적된특성을보이는상아질모세포유사세포로분화될수있다 성인의치수에서처음으로분리된줄기세포가 DPSC이라고명명되었다 20. DPSC은제3대구치에서분리되었고높은분열능과산발적이지만조밀하게 10

14 석회화된결절을높은빈도로생산하는세포집단 (colony) 형성을보였다. 또한 DPSC이 ex vivo에서증식된후 HA/TCP와섞어면역억제된쥐에이식되었을때, 상아질 / 치수유사조직이형성되었다 20, 32. DPSC는혈관이형성된치수유사조직을형성하였고이는 dentin sialophosphoprotein (DSPP) 을발현하는상아질모세포유사세포의층으로둘러싸여있었다. 상아질모세포유사세포는자연치아의상아질에서처럼상아세관을포함하고있는상아질을생산하였고상아질의두께는시간이지날수록두꺼워졌다 32. DPSC을사람의상아질표면에위치시키고면역억제된쥐에이식하자수복상아질유사구조가상아질표면에생성되었다 32. 상아질을형성하는능력이외에다른연구들에서는 DPSC가상아질모세포, 지방세포, 연골세포, 조골세포와같은다른중간엽파생세포로분화할수있다는것이밝혀졌다 DPSC의일부세포군은지방세포유사그리고신경세포유사세포형태와각각의유전표지를발현하면서지방형성, 그리고신경형성분화가가능하다는것이밝혀졌다 37. 그이후에 DPSC가 in vitro에서골형성, 연골형성, 그리고근육형성분화를일으킨다는것이밝혀졌다 35, 38, 39. DPSC은기능적으로활성인뉴런으로분화하고이식된 DPSC는 endogenous axon guidance 역할을하여신경장애가있을경우세포치료법으로서의가능성이제시되었다 Carinciet의연구에서는사람의치수에서골을형성하는잠재력을지니고 in vivo에서골유사조직을생성하는줄기세포를발견하였다 43. 그들은이세포를 osteoblasts derived from human pulpar stem cells (ODHPSC) 라고이름짓고, 11

15 microarray을이용해정상골모세포와유전자프로필을비교하였다. 그들은 ODHPSC에서정상골모세포와비교할때발현이저하된유전자목록을확인하였고, 이는 ODHPSC에의해생성된골유사조직의조직학적특징이정상골모세포에의해생성된골조직과다른점을설명해준다. 유치줄기세포 (Stem cell from human exfoliated deciduous teeth, SHED) 사람의탈락된유치의치수에서분리된줄기세포인 SHED는상아질과골을형성하고다른비치성중간엽세포로분화할수있는능력이있다 21, DPSC과마찬가지로 SHED는골을형성하는그리고지방을형성하는방향으로분화될수있다 21. 게다가배양된 SHED는다양한신경세포표지를발현한다. 신경을형성하는환경에서 SHED는평소의섬유아세포유사형태가아니라여러세포질돌기를가지게된다 21. 다른연구에의해근육을형성하는그리고연골을형성하는잠재력도밝혀졌다 48. DPSC에비해 SHED는높은증식속도를보이고골유도능이높다 21. SHED를치아절편에넣은후면역억제된쥐의피하에 이식하였더니상아세관이있는상아질을형성하는상아질모세포와혈관을형성하는혈관내피세포로분화하였다 45. SHED을 ex vivo에서증식시켜면역억제된쥐에이식하였더니상아질유사구조를형성하였고, 이에바로인접하여상아질모세포유사세포를생성하였다. 생성된상아질은상아질특이 DSPP를발현하였다. 하지만, DPSC와는다르게 SHED는완전한상아질-치수유사복합체를생성하지는못하였다

16 SHED의큰특징중의하나는쥐에이식되었을때쥐의세포를골을형성하는세포로분화하도록유도할수있다는것이다. 이는 DPSC에서는발견되지않았던특징이다. SHED는직접골모세포로분화할수는없지만쥐의골을형성하는세포를불러모으는골유도의작용을함으로써골형성을유도하는것처럼보인다 21. 이러한골유도성을지님으로써 SHED는쥐의두개골에작지않은크기의결함이있을때골을형성함으로써결함을수복할수있다 49. 이러한발견은유치가영구치의맹출을안내하는역할을할뿐 아니라영구치의맹출에맞춰골형성을유도하는것에관련이있다는것을의미한다 50. SHED를비롯한치아줄기세포는두개신경능 (cranial neural crest ectomesenchyme) 에서유래하여발생학적으로동일하지만연구결과서로다른특징을지니고유전자발현또한차이가난다는것을알수있다 51. SHED는 DPSC과골수줄기세포에비해훨씬증식속도가빠르다 52. DPSC와 SHED의유전자발현을비교해보니발현량이두배이상차이나는유전자의수가 4386개였다. SHED에서더높은발현을보이는유전자는세포증식과세포외기질의형성에관련된것이었고 FGF, TGF-ß와같은여러성장인자를포함하였다 52. 특히 TGF-ß는중요한의미를가지는데, 상아질에손상이생겼을때치수줄기세포를상아질모세포로분화시키는데영향을미치기때문이다. 이러한 SHED의특징을이용하기위해아직유치를지니고있을때 SHED을보관하여어른이되어필요할때자가줄기세포로이용하려는시도가이루어지고있다 51. 일부연구에서 SHED을냉동보존시에세포의특성을 2년간유지한다는것을보였다. 13

17 하지만, 그보다장기간보관했을때에 SHED 가고유의특성을계속 유지하는지에관한연구는아직이루어지지못했다. 치주인대줄기세포 (Periodontal ligament stem cells, PDLSC) 치주인대는치조골소켓의내벽과치아의백악질사이에위치한섬유성결합조직으로서저작시에충격을흡수하는역할을한다 51. 여러연구에서 PDL은백악질모세포나골모세포로분화할수있는세포를포함하고있음이밝혀졌다 53, 54. PDL에존재하는여러세포유형은 PDL이치주조직의항상성유지와재생을위한선조세포를지니고있음을의미한다. 치주인대는저작력으로인해항상일정한압력을받기때문에 PDLSC가일정한 PDL 세포수를유지하는데역할을하고있는것으로생각된다 51. PDLSC는 STRO-1, CDs, 그리고 scleraxis ( 힘줄특이적전사인자 ) 등의 MSC 관련표지를 BMSC이나 DPSC에비해더높은정도로발현한다 50. 다른치아줄기세포와마찬가지로 PDLSC은정해진배양조건에서골형성, 지방형성, 그리고연골형성잠재력을보인다 PDLSC을 ex vivo에서증식시켜면역억제된쥐에이식했을때전형적인백악질 /PDL 유사구조가재생된다 50. 얇은층의백악질유사조직과세포가흩어져있고교원섬유가밀집된 PDL 유사구조가형성된다. In vivo에서생성된교원섬유는새롭게형성된백악질유사구조에연결되어 Sharpey s fibers의생리적부착과유사한모습을보였다 50. 백악질 /PDL 유사구조는 BMSC에의해생성된골 / 골수구조와 DPSC에의해형성된상아질 / 치수유사구조와는전혀다르다 50. 이러한발견으로부터 PDLSC가백악질모세포 / 백악질세포로분화할수있는세포와 14

18 교원섬유를형성할수있는세포를포함하고있다고추측할수있다 50. PDLSC을면역억제된쥐의치주결손부에이식했을때 PDL유사조직이재생되었고 PDLSC이재생된 PDL에인접한해면골과도밀접한연관이있음이밝혀졌다. 이는 PDLSC이치조골재생에도관여함을의미한다 22. 치근유두줄기세포 (Stem cells from the apical part of the papilla, SCAP) 치근유두는형성중인영구치의치근단에위치한연조직을말한다 23, 24. 치근유두조직은치아가구강내로맹출하기이전의치근형성중일때만존재한다 58. DPSC와 SHED와유사하게, ex vivo에서증식된 SCAP는치아를형성하는방향으로분화될수있다. 치수와치근유두의차이점은치근유두는치근치수의선조조직이라는것이다. 그런면에서 SCAP가치관부위의상아질을형성하는상아질모세포로분화하는치아유두 (dental papilla) 에있는줄기세포와유사할것이라고짐작할수있다 50. SCAP가상아질을형성하는세포로분화할수있음이다른치아줄기세포와유사한방법을통해밝혀졌다 50. SCAP가면역억제된쥐에적합한운반자기질을통해이식되었을때전형적인상아질-치수유사복합체가형성되었다 50. 치근유두가치수로바뀔때 SCAP가 DPSC로바뀌는지아니면 DPSC가다른줄기세포로부터유도되는지에대해서는아직명확하지않다 50. SCAP는 DPSC와유사하면서도차이점을보인다. SCAP는상아질모세포와지방세포로분화할수있으며 DPSC에비해높은증식속도를보인다 23. SCAP와 PDLSC을같이 minipig의발치와에 15

19 이식하였더니상아질과치주인대가형성되었다. 이는 SCAP가 PDLSC와같이임플란트를대신하여생물학적으로치근을생성할수있음을의미한다 51. 대부분발달초기의조직은줄기세포를분리하기위해임상적으로접근하기가쉽지않다. 하지만치근은출생후에발달하고치근유두는임상적으로발치된사랑니에서쉽게얻을수있다. SCAP는치근상아질형성을담당하는상아질모세포의기원이되는반면 DPSC는재생상아질을만드는상아질모세포의기원이되는것으로보인다 50. Minipigs를이용한연구에서, 치근유두를발달단계초기에외과적으로제거하자치근형성이중지되었지만치수조직은정상적으로발달하였다 50. 치아주머니줄기세포 (Stem cells from the dental follicle, DFPC) 치아가맹출하기전발달중인치배의법랑기관과치아유두를감싸고있는밀집된외배엽성중간엽조직부분을치아주머니 (dental follicle) 라고한다. 치아주머니에는상아질모세포, 백악질모세포, 치주인대의선조세포가포함되어있다고믿어져왔다. 매복된제3대구치의치아주머니에서선조세포들이분리되었다. 치아주머니의세포는 Nestin과 Notch-1과같은줄기세포표지를발현하였다. DFC은전형적인섬유아세포의형태를보이고 Nestin, Notch-1, 교원질 type I, bone sialoprotein (BSP), osteocalcin (OCN), 그리고 FGFR1-IIIC 등을발현하였다 60. DFPC은 in vitro에서유도시에골을형성하는방향으로분화할수있음이밝혀졌다 50. 다른치아줄기세포와마찬가지의방법으로 DFPC을이식하였을때섬유성의혹은견고한조직으로구성된구조가형성되었다. 면역 16

20 억제된쥐에이식되었을때 BSP와 OCN의유전자발현은 100배이상증가되었고교원질 type I은감소되었다. 치아주머니세포는 PDL 섬유아세포로분화하여 PDL을형성하고 SCID 쥐에이식시에백악모세포유사세포를형성하였다 61, 62. 하지만면역억제된쥐에 DFPC을이식하였을때는상아질이나백악질, 골의형성은잘나타나지않았다 63. 저자는이런결과의이유가줄기세포배양에서세포수가적었기때문이라고설명하였다. 골수줄기세포 (Bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSC) 형태학적으로 BMSC은이종 (heterogeneous) 세포들의집합이다 64. 또한증식된세포는각세포마다분화의성숙도가서로다른 세포들의집합이다 65, 66. 정제된세포집단은유전자와단백질발현에있어서배양된이종 (heterogeneous) MSC와다르다. 클론수준에서각세포집단 (colony) 중오직소수의비율만이많은증식을이룰수있고 in vivo에서완전하게골수를재생할수있다 50. BMSC은 in vitro에서골형성, 연골형성, 지방형성, 근육형성, 그리고신경형성계열등의여러세포계열로분화가가능하다. 여러연구에서동물모델에서 BMSC을근육조직, 특히심근 (myocardium) 에이식하였을때 BMSC의근육을형성하는잠재력이보고되었다 많은임상실험에서사람의줄기 / 선조세포를심장에이식하였을때다양한수준의성공이보고되었다 71. 지금껏보고된 BMSC을이용한임상시도가많지는않지만허혈성심근증 (ischemic cardiomyopathy) 치료를위해자가 BMSC을 17

21 심장내로이식하는시도가긍정적인결과를보여주었다 72. 하지만, 심장연구의대부분에서나타난 BMSC의이점은 BMSC가기능하는심근세포로분화하기때문이라기보다는 BMSC의근거리분비 (paracrine) 효과때문인것으로보인다 50. 쥐에서 BMSC은성상세포로분화하고쥐의뇌에이식되었을때는뉴런으로도분화하는것이밝혀졌다 73. 쥐와사람의 BMSC은 in vitro에서뉴런으로분화되도록유도될수있으나 74, 신경형성잠재력은신경조직에서유래된줄기세포보다더약한것으로나타났다 75, 76. BMSC은 DPSC과비슷한특징을지니고있고, 둘다치아조직과골조직을형성할수있다. 하지만, BMSC가 DPSC에비해상아질형성에더낮은잠재력을보였다 77. 이는기원이다른 MSC은동일하지않다는것을의미한다. DPSC은신경능세포에서기원하였고, BMSC은중배엽에서기원하였다. 그리고, 기원이다른 MSC의골형성능과지방형성능을비교한결과, 세포가동일한유전자표지를지니고있음에도세포가동일하지않고특정방향으로분화가이미이루어져있었다 78. 처음으로성인의비치성세포를이용하여생체치아생성에성공한연구 79 에서는배아기치아상피세포와성인의골수기질세포를재조합하였다. 신경줄기세포가 E14 배아기의상지 (upper limb) 에서아래목부위 (lower cervical region) 까지의척수에서분리되고, 6주에서 9주된암컷 CD-1 쥐의 tibiae와 femora에서채취된골수세포를분리하였다. 이전까지는원기를성체의원래위치에이식하여완전한기관이발생하는것을보여주지못하고, 신피막 (renal capsule) 이나눈의전방 (anterior 18

22 chamber) 이이용되었다. 이두곳은면역무방비상태이고이식된조직에적절한혈액공급이가능하기때문에기관과조직발생에주로이용되어왔다. Ohazama 79 는배아기치아원기를성체쥐의악골에이식하여완전한치아가발생함을보임으로써배아기원기가성체환경에서발생할수있음을보여주었다. 19

23 표 2. 치아재생에사용되는중간엽줄기세포의분화능과특징 50 MSC Differentiation potency 특징 DPSC Osteo/dentinogenic Adiopogenic 상아질 / 치수유사복합체형성 재생상아질형성 Chondrogenic Myogenic neurogenic SHED dentinogenic Adiopogenic DPSC, BMSC에비해훨씬증식속도빠름 Chondrogenic 완전한상아질 / 치수 유사 복합체를 Myogenic Neurogenic Osteo-inductive 형성못함 DPSC에비해골유도능높음 쥐에이식시쥐의세포를골형성 세포로분화하도록유도 SCAP dentinogenic Adiopogenic Chondrogenic DPSC에비해증식속도빠름 상아질-치수유사복합체가형성 치근상아질형성 Myogenic neurogenic DFPC Cementogenic Odontogenic Adiopogenic Chondrogenic Myogenic neurogenic In vivo에서상아질이나백악질, 골의형성은잘나타나지않음 PDLSC Osteo/cementogenic MSC 관련 표지를 BMSC이나 Adiopogenic DPSC에비해더높은정도로발현 Chondrogenic Myogenic neurogenic BMSC Odontogenic Osteogenic Adiopogenic Chondrogenic Myogenic neurogenic DPSC에비해상아질형성에더낮은잠재력을보임 20

24 상피줄기세포 (Epithelial Stem Cells, EpSC) 지난십여년간치성중간엽줄기세포에대한수많은연구에서다양한치성중간엽줄기세포의특성이밝혀졌지만, 사람의치성상피줄기세포에대해서는밝혀진것이거의없다. 이는법랑질모세포나법랑질모세포전구체와같은치성상피세포가치아가맹출된이후에는남아있지않기때문이다. 그리하여 in vivo에서자극을받았을때법랑질을형성할수있는상피세포가사람의성체치아에는존재하지않는다. 따라서, 법랑질을재생하기위해서는줄기세포를이용한접근이유일한방법이될것이다 2. 그렇기때문에기존의많은연구는치성중간엽줄기세포만을가지고상아질, 치수, 백악질, 치주인대, 치조골등치아와치주조직의일부구조를재생하는것에국한되었다. 왜냐하면생체치아전체를 de novo로생성하기위해서는상피줄기세포도필요하기때문이다. 생체치아연구를위해두가지접근방법이사용되었다. 첫째는배아기치성상피줄기세포를이용하는것이고둘째는성체의비치성상피줄기세포를이용하되유도성을지닌치성중간엽줄기세포와재조합하는것이다. Epithelial stem cells from developing molars 여러연구에서태어난지얼마안된동물의제3대구치에서분리된상피줄기세포를이용하였다. 제3대구치에서상피세포를분리하고증식시킨후같은치아에서분리된중간엽줄기세포와 in vitro에서재조합하였다 6, 8, 11. 이방법은생체치아를생성하고재생하는데쓰일수있지만임상적으로널리사용되기에는한계가있다. 왜냐하면이방법은어린이로부터제3대구치치배를기증 21

25 받는것이필요하기때문이다. 자가줄기세포를이용하는것이 바람직하지만적당한줄기세포공급원이마땅하지않을수있다는 문제가있다. Epithelial stem cells from the labial cervical loop of rodent incisor 쥐의절치는사람과달리일생동안치아가자라기때문에치성상피줄기세포를연구하기에좋은대상이다. 쥐의절치상피의근단쪽부분에위치한상피줄기세포 niche가끊임없는법랑질생산을책임지고있다 이증식성이높은부분에서미분화된상피세포가절치의앞쪽부분으로이동하여법랑질모세포로분화한다. 하지만이치성상피줄기세포공급원은사람의치아재생에쓰일수는없다. 왜냐하면이방법은쥐의세포를사람의체내에가져오는것이고, 이는면역거부반응을일으킬것이기때문이다. Adult human gingival epithelial cells 치아형성과정을시작할때, 상피는중간엽조직에첫유도신호를보낸다. 그러면중간엽조직은상피로대응하는신호를보내게된다. 배아기가아닌세포를이용하여치아를형성하기위해서는상피혹은중간엽조직둘중에하나는다른하나에게유도신호를보낼수있어야한다. 초기치성상피는비치성중간엽과의조합에서중간엽이줄기세포의특성을지니고있는경우치아형성을유도할수있다. Ohazama 79 는성인의골수간질의중간엽줄기세포를이용한실험에서배아기치성상피가 22

26 성인의비치성중간엽세포를유도하여치아를형성할수있음을보여주었다. 마찬가지로배아기중간엽줄기세포는비치성상피세포와의조합에서상피세포가분화가되지않은경우치아형성을유도할수있다. Volponi 85 는성인의치성상피세포와배아기의치아유도중간엽세줄기포간의상호작용또한치아를형성할수있음을보여주었다. 그들은성인의잇몸조직에서상피세포를추출하고 CD-1 쥐배아의하악구치에서중간엽조직을추축하여재조합하였다. 7일간의배양후성체 SCID 쥐의신장캡슐에이식하였다. 총 30개의치아원기중 6개가치아를형성하였다. 저자는이식된치아원기중오직 20% 만이치아발생에성공한이유에대해서치아원기를다루고이동하는과정에서상피세포와중간엽세포가물리적으로분리되었기때문일것이라고설명하고있다. 형성된치아는상아질, 법랑질, 혈관화된치수, 그리고치근형성의초기단계를보이고법랑질을둘러싸고있는법랑질모세포-유사상피세포가존재하였다. 각세포의기원을알기위해사람의 MHC class I 단백질에대한면역조직화학검사결과법랑질모세포유사 (ameloblast-like) 상피세포와형성중인치근을싸고있는 rests of Malassez 모두사람의상피세포에서기원함을알수있었다. 즉, 의도한대로성인의잇몸상피세포가생체치아생성에참여하였음을확인하였다. Palatal mucosal epithelium from post-natal mice & Oral epithelium of p53-deficient fetal mice E18 비록사람이아닌쥐의세포를이용하긴했지만성체의비치성 23

27 상피줄기세포를이용하여치아생성에성공한연구는 Volponi 51 가처음은아니다. Nakagawa 86 는출생후의쥐의구개점막상피를유도성을지닌배아기중간엽줄기세포와재조합하여치아와유사한구조를형성함을보여주었다 86. 다른연구에서는배아기 18일째 (E18) 의 p53 결손쥐의구강상피와 E16.5 치성중간엽세포와재조합하였을때클론의세포주가형성되고치아와유사한석회화된구조가생성되었다

28 표 3. 바이오치아생성에성공한연구들비교 EpSC MSC Human / Adult / Dental / Mouse Embryonic Non-dental Ohazama Embryoni Adult ESC: ESC: ESC: A c tooth bone Mouse Embryonic Dental epitheliu marrow m stromal MSC: MSC: MSC: cells Mouse Adult Non-dental Nakagaw Palatal Mouse ESC: ESC: ESC: a 2009 mucosal inducing Mouse Adult Non-dental epitheliu mesench m from yme MSC: MSC: MSC: post- Mouse Embryonic Dental natal mice Takahas Oral E16.5 ESC: ESC: ESC: hi 2010 epitheliu dental Mouse Embryonic Non-dental m of mesench p53- yme MSC: MSC: MSC: deficient Mouse Embryonic Dental fetal mice E18 Volponi Adult Mouse ESC: ESC: ESC: 2013 human embryoni Human Adult Non-dental gingival c molar epithelial mesench MSC: MSC: MSC: cell yme Mouse Embryonic Dental 25

29 5. 치아재생 줄기세포를이용한치아연구는크게두가지로나눌수있다. 첫째는치아를상피줄기세포와중간엽줄기세포를재조합하여치아원기에서부터완전한치아로발달시켜생체치아를생성하는것이고, 둘째는치아를구성하는상아질, 치수, 백악질, 치주인대, 치조골등의여러구조중일부가손상되었을때손상된부위를재생을통해회복하는것이다. 위에서많은성체치아줄기세포를비교하였지만이들성체치아줄기세포를이용한많은연구가치성중간엽줄기세포만을가지고치아와치주조직의일부구조를재생하는것에국한되었다. 왜냐하면생체치아전체를 de novo로생성하기위해서는상피줄기세포도필요한데치성상피줄기세포가치아가맹출된이후에는남아있지않기때문이다조직이손상되었을때이를재생하기위해치아줄기세포를이용하는연구가많이이루어졌다. 이는상아질, 치주인대, 치수조직뿐아니라 88, 89 법랑질조직을재생하는연구도이루어졌다 90. 심지어는치아줄기세포를이용하여뼈와신경과같은치아가아닌조직의손상을재생하는시도또한이루어졌다 91. 생체치아를생성하기위해사용되는세포는모든필요한세포유형이존재하는치아싹 (tooth buds) 으로부터얻어져야한다. PDL, 상아질, 치수와같은치아조직의일부분이손상된경우이를재생하기위해서는한두개의특정한유형의치아줄기세포면충분하다. 26

30 치주재생 (Periodontal regeneration) 치주조직은치아를둘러싸고있는여러조직의집합체로서치아를지지하여치아가악골에유지될수있도록해준다. 치주염이생기면결합조직부착과치조골에손상이생기게되고이는비가역적인과정이다. 치아줄기세포를이용한치주조직의재생은새로운치주인대와치조골을형성하고치아와새롭게형성된치주인대, 치조골이정상적으로연결되는것이다. 하지만이들조직이치아형성과정에서시간적으로그리고공간적으로다르게형성되는조직이라서성공적인재생이쉬운일은아니다 51. 현재이루어지고있는연구중의하나는여러종류의치아줄기세포를이용하여치주조직발달의중요한단계를시공간적으로모방하여손상된조직의재생이연속적으로이루어지게하는것이다 63. 치주조직재생을위해가장쉽게생각할수있는방법은 PDLSC을이식하는것이다 88. 사람의제3대구치에서 PDLSC을분리하고배양하여흉선이없는쥐의치주조직과백악질이제거된제1대구치에이식하였다. 정상적인치주인대섬유와유사한섬유연결과무세포성백악질유사층 (acellular cementum-like layer) 이관찰되었다. 이방법은치주조직재생에활용가능하지만골조직의재생이동반되지않는다는한계가있다. 한임상증례보고서에서는자가 BMSC을이용하여치주손상을재생하였다 92. 치주손상을재생하기위해서는뼈를재생하는것만큼 PDL을재생하는것이중요하다는것이인식되었다. 오직뼈의재생에만초점을맞추어 rhbmp-2(human bone morphogenetic protein-2) 을이용하면임상적으로유의한치조골과백악질의재생은얻을수있지만기능적으로형성된 27

31 PDL은얻지못하여결국치아와새로형성된뼈가유착되게된다 93. Minipig 모델을이용한최근의연구에서는 PDLSC을이용하여치주조직의손상이회복되었다 94. PDLSC을이용한치료를통해 PDL의재생뿐아니라치조골의높이도회복되었다. 이러한시도들의쟁점은재생된치주조직이오랜시간동안형태를유지하고저작과같은정상적인기능을발휘할수있는가하는것이다. 치수재생 (Pulp regeneration) 치수에비가역적이염증이생기면우리는근관치료를통해치수강과치근관내의모든치수조직을제거하고인공적인치관충전재로치근관의공간을채운다. 이러한근관치료를받은치아는비생활치가되기때문에치아줄기세포를이용한치수조직의재생은다른치아조직의재생보다훨씬큰중요성을지니고임상적활용도가높다고할수있다. 치수조직재생에줄기세포를이용하는것은 DPSC, SHED, SCAP 등의줄기세포를분리하고특성을파악하면서시작되었다. 합성 scaffolds을이용하여 SHED를치수강에이식하자상아질표면을따라조상아세포유사세포 (odontoblast-like cell) 가형성되었다 46. 하지만, 치수공간에서치수유사조직의재생은관찰되지않았다. 이는줄기세포와 scaffolds를치근단을통해서만혈액공급을받는치근관에이식하면이식된세포가살수있는충분한혈액공급이이루어지기힘들기때문인것으로생각된다 50. 혈액공급에관한문제때문에원하는치수조직의재생에성공하기위해서는가공된치수를단계적으로삽입하는방법이임상적으로도입되어야한다는 28

32 주장이제기되었다 58. BMSC과 DPSC이면역억제된쥐의피하공간에이식되었을때두줄기세포는골수유사복합체 (BM-like complex) 와상아질-치수유사복합체 (dentin-pulp-like complex) 를형성하였다 20. 최근의한연구에서는 DPSC과 SCAP을이용하여빈치근관공간에서치수조직의재생에성공하였다 89. 사람의제3대구치에서분리된 DPSC와 SCAP을치근조각의치근관공간에넣은후 SCID 주의피하에이식하였다. 3~4개월후치근관공간이치수유사조직으로가득채워져있고혈관화도잘이루어져있는것이관찰되었다. 또한상아질과유사한석회화된조직층이치근관의기존상아질벽에침착되어형성되었다. 쥐에서유전자표식된세포를이용한최근의연구에서는세포의대부분이혈관을통해공급되므로줄기세포를공급하는것이빈치수공간에서치수조직의재생에별차이를주지않는다는주장을제기하였다 95. 이에따르면치수조직의재생은외부에서줄기세포를공급하는것이문제가아니라충분한혈액공급이유지될수있도록외과적인처치를해주는것이더중요한것이다. 치근재생 (Root regeneration) Sonoyama 23 은 SCAP와 PDLSC을이용하여치주인대조직이있는생체치근을재생하였다. Minipigs 모델을사용하였고자가조직의 SCAP와 PDLSC을 HA/TCP와 gelfoam scaffolds에넣은후하악의발치와에이식하였다. 세달후, 생체치근이형성되었다. 생체치근은주로 SCAP에의해생성된상아질로구성되어있고치주인대조직으로둘러싸여있으며주변뼈와정상적인관계를 29

33 갖고있었다. 6. 줄기세포를이용한생체치아생성의한계와발전방향 지난십여년간줄기세포를이용하여생체치아를만드는것에대한많은연구가이루어졌다. 하지만, 대부분의연구가배아기줄기세포를이용한것이라임상적으로사용되기에는많은한계를가지고있었다. 배아기줄기세포를이용하기위해서는수정이되지않은난자의기증 (unfertilized donor eggs) 이필요하고버려지는배아 (discarded embryos) 가발생되기때문이다. 이론적으로제3대구치에서사람의배아기치아세포를얻을수는있지만일반적인생체치아생성에쓰이는데에는한계가있다. 성체중간엽줄기세포를이용하여치아재생이아닌생체치아생성에성공한것은오직골수줄기세포를이용한연구 79 뿐이며, 이연구도상피줄기세포는배아기줄기세포를이용하였기때문에임상적으로큰의미를지니기에는한계가있다. 최근성인의잇몸상피세포를이용하여생체치아생성에성공한연구가발표되었다 85. 줄기세포를이용한생체치아연구에큰진보가이루어졌다고볼수있지만아직해결해야할과제가많이남아있다. 첫째로, 상피줄기세포는사람의세포를이용했지만중간엽줄기세포는쥐의세포를이용하였다. 기본적으로자기자신의세포가아닌세포가체내로들어오게되면우리몸은면역거부반응을일으키게된다. 많은 in vivo 연구에서 중간엽줄기세포의면역억제효과를확인하였지만 72, 동종 30

34 중간엽줄기세포는수용체에서잘받아들여지는반면이종중간엽줄기세포는이식후에수용체에서거부반응을일으킨다 96. 따라서사람이아닌동물의세포를이용하는것은면역거부반응때문에임상적으로의미가없다. 둘째로, 상피줄기세포는성인의잇몸세포를이용했지만중간엽줄기세포는쥐의배아기치아중간엽세포를이용하였다. 배아기줄기세포를이용하는것은임상적으로의미가없기때문에중간엽줄기세포는성체의골수세포를이용했지만상피줄기세포은배아기치아상피를이용한 Ohzama 79 의연구에서와같이반쪽짜리성공이라할수있다. 따라서임상적으로더큰의미를지니기위해서는우선사람의배아기치아중간엽세포를이용하여치아발생에성공하고, 결국엔사람의 DPSC과같은성체중간엽줄기세포를이용하여치아발생에성공해야할것이다. Volponi 51 에따르면상피세포와중간엽세포둘중하나만유도성 (inductive) 을지녀도다른하나가반응성 (responsive) 을지닌다면치아발생이이루어진다 85. 오래된연구에의하면치아상피가첫유도신호를하방의신경능기원의중간엽조직에제공한다 97, 98. 또한상피로부터첫유도신호를받은치아중간엽세포와비치성상피와의조합은치아를형성한다. 중요한것은이러한실험들을통해반응하는 (responding) 중간엽세포는줄기세포유사 (stem-cell-like) 특성을지녀야하는반면반응하는상피세포는줄기세포유사특성을지니지않아도된다는것이다. 이는상피세포와중간엽세포가치아구조에기여하는정도를생각하면이해할수있다. 즉, 중간엽세포는다수의분화된세포유형을형성해야하기때문이다 99. 이러한결과를토대로치아를 31

35 생성하기위해서는유도하는세포가반응하는세포와결합되어야하고중간엽세포는유도하든지반응하든지줄기세포유사특성을지녀야한다. 상피세포와중간엽세포의재조합에관한최근의연구에따르면세포기반의 (cell-based) 재조합은실제하나의치아원기에존재하는수보다훨씬많은수의세포를필요로한다 100, 101. 그러므로임상적으로의미있는줄기세포소스는치아유도성혹은반응성이있고배양을통해충분한세포수를제공할수있어야한다. 생체치아생성에성공한연구들을보면치아원기 (primordium) 를쥐의성체악골에이식하여발생시킨연구와신피막 (renal capsule) 에이식하여발생시킨연구로나눌수있다. 신피막은눈의전방 (anterior chamber) 과함께 면역무방비 상태이고이식된조직에적절한혈액공급이가능하기때문에기관과조직발생에주로이용되어왔다. 하지만발생된치아가정상적으로기능하기위해서는법랑질, 상아질, 백악질, 치수등의치아자체뿐아니라치주인대를포함한치주조직이갖추어져야한다. 따라서, 임상적으로더큰의미를지니려면악골에이식된치아원기가정상적인치아와치주조직을갖추면서발생되는것을보여주어야할것이다. 지금까지의내용을종합해보면생체치아생성을위해줄기세포가임상적으로활용되기위해서는상피줄기세포와중간엽줄기세포모두사람의성체줄기세포를이용해야한다. 그러면서상피줄기세포와중간엽줄기세포둘중하나는유도능력을지녀야한다. 하지만불행하게도성체줄기세포는치아발생을일으키는데필요한유도능력을지니고있지못하는것으로보인다. 이는 32

36 생체치아생성에성공한연구들에서상피줄기세포와중간엽줄기세포둘중하나는꼭배아기줄기세포를이용했다는사실에근거하여알수있다. 이러한요구조건을만족시키기위한해결책으로서세포재프로그래밍 (Cell reprogramming) 이사용될수있다. 즉, 성체줄기세포에몇가지요소를첨가함으로써치아발생을일으키는데필요한유도능력을갖추도록 재프로그래밍하는것이다. 최근의연구에서체세포에 3-4 가지 요소를첨가하여배아기줄기세포유사한세포로변환에성공하였고 102, 103 이는세포를조작하여다능성의 (pluripotent) 줄기세포로변환하는것에가능성을열어주었다. 이것이가능해진다면 Volponi 51 의연구에서반응성인상피줄기세포는성인의잇몸상피세포를이용하고, 유도성인중간엽줄기세포는성인의 DPSC이나 BMSC를세포재프로그래밍을거쳐얻은다음이둘을재조합하여생체치아를발생시킬수있을것이다. 앞에서언급하였듯이법랑질모세포나법랑질모세포전구체와같은치성상피세포가치아가맹출한이후에는남아있지않기때문에상피줄기세포는비치성상피줄기세포를이용할수밖에없다. 이상적인상피줄기세포의조건으로는쉽게접근이가능하고, 성인의몸에서채득이가능해야하며, 분리된세포가법랑질을생산할수있어야한다. 그렇다면세포재프로그래밍을통해상피줄기세포와중간엽줄기세포둘중하나에유도성을부여할때, 비치성상피줄기세포 보다는치성중간엽줄기세포에유도성을 부여하는것이생체치아를성공적으로생성하는데더가능성이 높은접근방법이라고생각된다. 33

37 7. 결론 지난십여년간줄기세포를이용하여생체치아생성에관한많은연구가이루어졌지만, 대부분의연구가배아기줄기세포를이용한것이라임상적으로사용되기에는많은한계를가지고있었다. 최근들어성체줄기세포를이용하여생체치아생성에성공한연구들이발표되고있다. 하지만, 이러한연구들도상피줄기세포와중간엽줄기세포둘중에하나는성체줄기세포를이용했지만다른하나는배아기줄기세포를이용하였다. 이는생체치아발생을위해서는상피줄기세포와중간엽줄기세포둘중에하나는유도성을지녀야하는데성체줄기세포는치아발생을일으키는데필요한유도능력을지니고있지못하기때문이다. 이를해결하기위한방법으로세포재프로그래밍을통해성체줄기세포에몇가지요소를첨가함으로써치아발생을일으키는데필요한유도능력을갖추도록하는시도가이루어져야할것이다. 이에성공한다면상피줄기세포와중간엽줄기세포둘다성체줄기세포를이용하고둘중에하나에세포재프로그래밍을통해치아발생에필요한유도성을지니도록하여생체치아를발생시킬수있을것이다. 하지만, 이러한문제가해결된다고하더라도몇가지중요한문제가남아있다. 우선, 생성된생체치아가주어진치아상실부위의크기에적합한크기를지니도록발생시킬수있는지, 그리고기능적인교합평면에도달할때까지생체치아가완전히맹출될수있는지등에대한문제또한해결되어야할것이다. 결국줄기세포를이용하여치아를생성하는것은아직해결해야할부분이많이남아있어임상적으로이용되기에는아직 34

38 많은시간과노력이필요할것으로보인다. 그전까지는치아와치주조직을이루고있는여러구조중일부가여러가지원인으로인해손상되었을때손상된부위를재생시키기위한치료법으로써줄기세포를이용한방법이사용될수있을것이다. 35

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54 Abstract A review of stem cell mediated tooth regeneration Kim Cheoljung Department of Dentistry The Graduate School Seoul National University Tooth develops as a result of interaction between oral epithelium and neural-crest-derived mesenchyme. Over the last decade, many studies about biotooth development using stem cell have been conducted. However, their clinical value is limited because most of them used embryonic stem cell. Recently some studies published their success in biotooth development using adult stem cell. But they also used embryonic stem cell as a source of epithelial stem cell or mesenchymal stem cell. Moreover they used cell from mice as a source of at least one of epithelial stem cell or mesenchymal stem cell. It has limited clinical value because biotooth made from mice cell cannot be implanted in human body. To make biotooth development using stem cell became reality, both epithelial stem cell and mesenchymal stem cell should be obtained from adult human. And one of epithelial stem cell and mesenchymal stem cell should have inductive capability. 51

55 As a possible approach, cell reprogramming can be used. By introducing several factors to adult cell, they can have the ability to induce tooth development. Keywords: stem cell, bio-tooth, tooth regeneration, cell reprogramming Student Number: