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1 저작자표시 - 비영리 - 변경금지 2.0 대한민국 이용자는아래의조건을따르는경우에한하여자유롭게 이저작물을복제, 배포, 전송, 전시, 공연및방송할수있습니다. 다음과같은조건을따라야합니다 : 저작자표시. 귀하는원저작자를표시하여야합니다. 비영리. 귀하는이저작물을영리목적으로이용할수없습니다. 변경금지. 귀하는이저작물을개작, 변형또는가공할수없습니다. 귀하는, 이저작물의재이용이나배포의경우, 이저작물에적용된이용허락조건을명확하게나타내어야합니다. 저작권자로부터별도의허가를받으면이러한조건들은적용되지않습니다. 저작권법에따른이용자의권리는위의내용에의하여영향을받지않습니다. 이것은이용허락규약 (Legal Code) 을이해하기쉽게요약한것입니다. Disclaimer

2 보건학석사학위논문 생명정보학적분석을통한인슐린 저항성관련신호전달경로연구 - AS160 과 TBC1D1 의기질특이성분석 - Bioinformatics Research on Signaling Pathways that Affect Insulin Resistance - Analysis of substrate specificity of AS160 and TBC1D 년 8 월 서울대학교보건대학원 보건학과생명정보학전공 유태곤

3 생명정보학적분석을통한인슐린 저항성관련신호전달경로연구 - AS160 과 TBC1D1 의기질특이성분석 - 지도교수손현석 이논문을보건학석사학위논문으로제출함 2015 년 5 월 서울대학교보건대학원 보건학과생명정보학전공 유태곤 유태곤의석사학위논문을인준함 2015 년 7 월 위원장정해원 ( 인 ) 부위원장조성일 ( 인 ) 위원손현석 ( 인 )

4 국문초록 생명정보학적분석을통한인슐린저항성관련신호전달경로연구 - AS160 과 TBC1D1 의기질특이성분석 - 서울대학교보건대학원보건학과생명정보학전공 유태곤 당뇨병은신체활동이감소하고비만의유병률이증가함에따라유병률이점차증가하고있는만성질환으로, 급성합병증과만성합병증의발생위험을줄이기위해서철저하게관리해야한다. 당뇨병의 90% 이상을차지하는제 2형당뇨병은, 근육세포및지방세포의인슐린저항성이발병원인이다. 혈액내의포도당을근육세포및지방세포내로수송하는역할은 GLUT4 (Glucose transporter 4) 가담당하는데, 인슐린이 GLUT4를세포막으로유도시키는과정에문제가발생하여근육및지방세포의인슐린자극에대한반응이떨어지는현상을인슐린저항성이라고정의한다. 인슐린저항성이발생하는원인을확인하기위해서는우선인슐린에의한정상적인세포내신호전달경로를파악하는것이필수적이다. 인슐린이결합함으로써활성화된인슐린수용체는 IRS (insulin receptor substrate), PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase), PDK1 (3-phosphoinositide-dependent kinase), mtorc2 (mammalian target of rapamycin complex-2) 등의단백질을경유하여 Akt를인산화시켜활성화시킨다. 활성화된 Akt는 AS160의특정모티프를인식하고인산화시킴으로써 AS160의 Rab GAP (Rab i

5 GTPase-activating protein) 도메인을불활성화시키고, 그결과 Rab 단백질에결합된 GTP의가수분해를억제하여활성상태로유지함으로써 GLUT4의세포막으로의이동을촉진시킨다. 반면근육세포에서근육의수축이일어날경우에는 AMPK가활성화되고, 활성화된 AMPK가 AS160 및 TBC1D1을인산화시킴으로써 GLUT4의세포막으로의이동을촉진시킨다. 그러나 TBC1D1의역할및, TBC1D1의 Rab GAP 도메인이어떠한 Rab 단백질과상호작용을하는지에대해서는명확히알려져있지않다. 따라서, 이번연구에서는생명정보학적기법을사용하여 AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인의기질로어떠한 Rab 단백질들이작용하는지를분석하고, 상호작용의양상에어떠한차이가존재하는지를확인하여두단백질의역할의차이를예측하고자하였다. 이번연구에서는단백질도킹프로그램을이용하여 Rab GAP 도메인의기질특이성을분석하였다. 우선, PDB (Protein Data Bank) 에서 AS160과 TBC1D1의 Rab GAP 도메인, 그리고 Rab 단백질의구조를 PDB 파일로다운로드받았고, 도킹에앞서 FoldX를사용하여구조의오류를수정하였다. 다음단계로, 단백질도킹프로그램인 Hex와 ClusPro에수정된 PDB 파일을입력하여 Rab GAP 도메인과 Rab 단백질간의도킹을수행하였고, FoldX를이용하여각프로그램에서최적의도킹모형으로선정된단백질복합체의상호작용에너지를계산하였다. 마지막으로, 임의의절사점으로각상호작용에너지를선택하였을때에, 전체 Rab 단백질중각절사점에서 Rab GAP 도메인과상호작용하는 Rab 단백질의비율을차례대로계산하고, 이계산결과를기존실험연구결과와비교하였다. AS160과 TBC1D1 유전자의발현을동시에억제하여이중넉아웃마우스 (double knockout mouse) 를만들고, 어느정도의기능상실이일어나는지를연구하였던기존의한연구를확인해본결과, AS160과 TBC1D1이세포내로의포도당수송에관여하는비율은 ii

6 각각 47.72% 와 48.15% 였다. Hex의경우에는가상의절사점중 91.41kcal/mol이이에해당하며, 이때에 AS160 및 TBC1D1과상호작용가능성이높은단백질로는 Rab1A, Rab2A, Rab4A, Rab4B, Rab8A, Rab11A, Rab18이있었다. ClusPro의경우에는가상의절사점중 kcal/mol이이에해당하며, 이때에 AS160 및 TBC1D1과상호작용가능성이높은단백질로는 Rab1A, Rab5A, Rab7, Rab14, Rab18, Rab21이있었다. 이결과는세포외에서수행되었던기존연구결과와유사하였다. 결론적으로, Rab 단백질들중에서 AS160 또는 TBC1D1의 Rab GAP 도메인과상호작용하는비율은, 생체내에서 AS160과 TBC1D1이담당하는포도당수송의양에비례한다. 주요어 : 인슐린저항성, GLUT4, AS160, TBC1D1, Rab 단백질, 단백질도킹학번 : iii

7 부족한제자를열과성을다해이끌어주셨던지도교수님께이논문을바칩니다. iv

8 목 차 국문초록 ⅰ 목 차 ⅴ 표목차 ⅶ 그림목차 ⅷ 약어목록 ⅸ 제 1 장. 서론 1.1 연구배경 연구의필요성 연구의목적 29 제 2 장. 연구방법 2.1 도메인의기질특이성분석 데이터세트의구성 FoldX를이용한최적화 Hex와 ClusPro를이용한단백질도킹 FoldX를이용한결합자유에너지의계산 상호작용에너지절사점의선정 49 v

9 제 3 장. 연구결과 3.1 Hex와 ClusPro를이용한단백질도킹결과 FoldX를이용한상호작용에너지계산결과 임의의절사점선택시, Rab GAP 도메인과 Rab 단백질들의상호작용비율 60 제 4 장. 논의및결론 4.1 연구결과정리 AS160/TBC1D1 유전자의발현을억제하였던기존실험연구에대한고찰 기존실험연구로도출된절사점의적용 AS160/TBC1D1과상호작용가능성이높은 Rab 단백질의결정 본연구의의의와한계점 74 제 5 장. 요약및총론 5.1 연구결과요약및결론 총론및제언 79 참고문헌 81 Abstract 98 vi

10 표목차 Table 3.1 Docking results of Rab GAP domain of AS160 and TBC1D1 with Rab proteins using Hex, according to E-total 61 Table 3.2 Docking results of Rab GAP domain of AS160 and TBC1D1 with Rab proteins using ClusPro, according to size of cluster 62 Table 3.3 Calculated interaction energy of Rab GAP domain of AS160 and TBC1D1 with Rab proteins using Hex 63 Table 3.4 Calculated interaction energy of Rab GAP domain of AS160 and TBC1D1 with Rab proteins using ClusPro 65 Table 3.5 Temporary cutoff values of interaction energy and the percentage of the Rab proteins that interact with Rab GAP domains of AS160 or TBC1D1 67 vii

11 그림목차 Figure 1.1 Schematic structure of GLUT4 (Glucose transporter 4) 32 Figure 1.2 The molecular signaling pathways involved in contraction-induced GLUT4 gene activation 33 Figure 1.3 A model for intracellular GLUT4 trafficking 34 Figure 1.4 Signaling pathways for GLUT4 translocation in adipocytes 35 Figure 1.5 Schematic domain structures of human AS160 and TBC1D1 36 Figure 1.6 Signaling pathways for GLUT4 translocation in muscle cells 37 Figure 2.1 The flowchart of the protocol of protein docking using in this study 49 Figure 2.2 Structures of Rab GAP domains of AS160 and TBC1D1 50 Figure 2.3 Structures of Rab proteins 51 Figure 2.4 Repairing the PDB file (Rab4B) by using RepairPDB command of FoldX program 54 Figure 2.5 The docking process of Rab GAP domain of AS160 and Rab1A protein using Hex program 55 Figure 2.6 The docking process of Rab GAP domain of AS160 and Rab1A protein using ClusPro 56 Figure 3.1 The docking results using Hex 64 Figure 3.2 The docking results using ClusPro 66 viii

12 약어목록 ACAP1 Arf-GAP with coiled-coil, ANK repeat and PH domaincontaining protein 1 ACTN4 Alpha-actinin-4 AMPK AMP-activated protein kinase apkc Atypical protein kinase C APS Adaptor molecules containing pleckstrin homology (PH) and Srchomology 2 (SH2) domains Arf6 ADP-ribosylation factor 6 Arp3 Actin related protein-3 AS160 Akt substrates of 160kDa BNL Brookhaven National Laboratories CaMK Calcium/calmodulin-dependent protein kinases CaMKII Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II CAP c-cbl-associated protein Cav-actin Caveolin-associated filamentous actin CBD Calmodulin-binding domain Cbl Casitas b-lineage lymphoma CHC22 Clathrin heavy chain 22 CrkII CT10 regulator of kinase protein II Daxx Death associated protein 6 EDL Extensor digitorum longus EFF Empirical force field F-actin Filamentous actin FFT Fast Fourier transform GEF GLUT4 enhancer factor GGA Golgi-localized, γ-ear-containing, ADP-ribosylation factor-binding proteins GLUT4 Glucose transporter 4 GSV GLUT4 storage vesicle HAT Histone acetyltransferase HDAC5 Histone deacetylase 5 IRAP Insulin-regulated aminopeptidase IRS Insulin receptor substrate LRP1 Low density lipoprotein receptor-related protein 1 MEF2 Myocyte enhancer factor 2 mtor Mammalian target of rapamycin ix

13 mtorc2 Mammalian target of rapamycin complex-2 NAC N-acetylcysteine NMR Nuclear magnetic resonance N-WASP Neural Wiskott-Aldrich syndrome protein PDB Protein Data Bank PDK1 3-Phosphoinositide-dependent kinase PI(3,4,5)P3 Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate PI(4,5)P2 Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate PI3K Phosphatidylinositol-3-kinase PLD1 Phospholipase D1 PTB Phosphotyrosine-binding Rab GAP Rab GTPase-activating protein RMSDs Root-mean-squared deviations SFT Spherical Fourier transform SPF Spherical polar Fourier TGN Trans-Golgi network TUG Tether containing a UBX domain, for GLUT4 Ubc9 Ubiquitin carrier protein 9 UBX Ubiquitin-like VAMP2 Vesicle associated membrane protein 2 VAMP3 Vesicle-associated membrane protein 3 Vti1a Vesicle transport through interaction with t-snares homolog 1A x

14 xi

15 제 1 장. 서론 1.1 연구배경 당뇨병은급성합병증과만성합병증의발생위험을줄이기위해철저하게관리해야할만성질환중의하나이다. 신체활동이감소하고비만의유병률이증가함에따라세계적으로당뇨병의유병률은점차증가하고있다. 2010년을기준으로세계인구의약 6.4% 인 2억8500만명이당뇨병을앓고있으며, 현재의증가추세를감안하면 2030년에는당뇨병이환인구가세계인구의약 7.7% 인 4억 3900만명에도달할것으로예상된다 (Shaw et al., 2010). 당뇨병은혈관계합병증을유발하여심혈관및뇌혈관질환의발생률을 2배가량증가시킬뿐만아니라 (Sarwar et al., 2010), 모든원인으로인한사망률을 80%, 암으로인한사망률을 25% 증가시킨다는점에서체계적인관리가필요한질병이다 (Seshasai et al., 2011). 당뇨병은발생원인에따라제1형당뇨병과제2형당뇨병으로구분된다. 제1형당뇨병은인슐린을분비하는췌장베타세포의파괴로인하여발생하는절대적인인슐린양의결핍이주된발병원인이다. 반면에전체당뇨병의 90% 이상을차지하는제2형당뇨병은근육세포및지방세포의인슐린저항성및이로인해 2차적으로발생하는인슐린분비장애가발병원인이다 (American Diabetes, 2014). 인슐린저항성과인슐린분비장애는둘 1

16 다제2형당뇨병의초기에서부터발생하며, 두기전사이의연관성에대해서는아직명확히밝혀지지않은부분이다수존재한다 (Kahn, 2003) 인슐린저항성과 GLUT4 인슐린은 GLUT4(Glucose transporter 4) 를근육및지방 세포의세포막에유도시켜혈액내의포도당을세포내로수송하는 중요한역할을담당하며, 이과정에문제가발생하여근육및지방 세포의 인슐린 자극에 대한 반응이 떨어지는 현상을 인슐린 저항성이라고정의한다 (Dugani and Klip, 2005). 한예로, GLUT4 유전자의특정염기서열에돌연변이가있는경우당뇨병의평가 기준인당화혈색소수치가더높게나오기도한다 (Xi et al., 2012). 따라서 이 인슐린 저항성이 발생하는 세포생물학적 기전을 규명하는과정은제2형당뇨병에대한근본적인이해에있어서 필수적이고이는근본적인치료제의개발로이어질수있는단서가 된다. 다음단락부터는 GLUT4의조절기전에대하여단계적으로 소개하고자한다. 우선 GLUT4의구조및유전자발현의조절에 대해알아보고, 그다음에는 GLUT4가다른세포내단백질과 어떻게 다른 분류 과정을 거치는지에 대해 확인할 것이며, 마지막으로 인슐린 또는 운동 등의 자극에 의해서 GLUT4가 세포막으로 어떻게 이동하여 포도당의 수송에 관여하는지 기술하였다 GLUT4 의구조 GLUT4는 ATP를사용하지않는촉진확산 (facilitated diffusion) 에의해, 세포외의육탄당 (hexose) 을세포내로수송하는역할을담당하는 13개의당수송체중하나이다 (Hruz and Mueckler, 2

17 2001; Joost and Thorens, 2001). 이들은지방및근육조직뿐만아니라뇌, 간, 신장등육탄당을필요로하는여러조직에분포하고있으며, 서열의유사성에따라 3개의클래스로구분된다. 이중에서 GLUT4가속해있는 클래스 I GLUT 수송체 들은포도당을수송하는역할을담당하고, 공통적인구조로나선 (helix) 5에 QL 모티프가지고있으며, 세포외고리 (extracellular loop) 7에 STSIF 모티프를가지고있는것이특징이다. 특히 QL 모티프의 Glu-161, STSIF 모티프의 Ser-294, Thr-295의경우포도당수송에필수적인잔기로알려져있으며, 이부위에돌연변이가발생하면 GLUT4의구조에변형이발생하여포도당수송능력이감소하는것으로보고되었다 (Mueckler et al., 1994; Doege et al., 1998). 클래스 I GLUT 수송체 들은포도당을필요로하는조직에광범위하게분포하고있으나, 각조직세포내부에서의분포양상은조직에따라서차이를보인다. 뇌의경우에는지속적으로많은양의포도당을필요로하며, 따라서뇌의세포막에는 GLUT 수송체의농도가지속적으로높게유지된다. 반면에지방및근육세포의경우, 평소에는 GLUT 수송체가세포내부에주로존재하다가, 인슐린이나운동등의자극이가해지는경우에는세포막으로의이동이급격히증가하여, 포도당수송량이평소의 10~40배까지증가하는양상을보인다 (Bryant et al., 2002). 뇌에존재하는 GLUT 수송체는 GLUT1과 GLUT3인반면, 지방과근육세포에서특정자극에따라세포내에서세포막으로이동하는 GLUT 수송체는 GLUT4임이밝혀졌다 (Bryant et al., 2002; Czech and Corvera, 1999). 다른 GLUT 수송체와는다른 GLUT4만의이러한특징은, 이를조절하는특이적인신호전달체계가존재함을시사하며, 동시에이와관련된특정기능을담당하는모티프가 GLUT4 아미노산서열내에위치함을의미한다 (Figure 1.1). N-말단의 FQQI 모티프와 C-말단의 LL 3

18 모티프, TELEY 모티프가이에해당하며, 이들은 GLUT4가세포내에서다른세포막단백질과는다른경로로분류되는과정에중요한역할을담당한다 (Blot and McGraw, 2008) GLUT4 유전자발현의조절 GLUT4의발현은세포내부및세포외부의다양한인자에의하여조절된다. 인슐린저항성을가지고있는당뇨환자의지방세포에서는 GLUT4 발현이저하되어있으며 (Sinha et al., 1991), 반면운동시에는골격근의 GLUT4 발현이증가하는것으로확인되었다 (Holmes and Dohm, 2004; Hussey et al., 2012). GLUT4 발현의정도가인슐린항상성의유지에필요한조건중의하나임을고려할때, 이를유발하는기전에대해확인하는것은인슐린저항성치료의목표를설정하는데에중요한시사점을제공할수있다. GLUT4 유전자 5' 말단의프로모터영역에는 2.4kb의염기서열이위치하고있으며, 이는 GLUT4의조직특이적인발현에필요한정보를모두제공할뿐만아니라, 호르몬및대사과정에의한발현조절에도일부관여한다 (Liu et al., 1992). 추가적인연구결과, 이부분에는 90% 이상의서열이보존된 2개의도메인이있는것으로확인되었다. 첫번째는 도메인 I 로, 전사개시시점으로부터 -742~- 712 지역에위치하며, GEF (GLUT4 enhancer factor) 가여기에결합하는것으로확인되었다 (Oshel et al., 2000). 두번째도메인은 MEF2 (Myocyte enhancer factor 2) 도메인 으로, 전사개시시점으로부터 - 526~-412 지역에위치하며, MEF2 전사인자가결합할수있는자리를제공하고있다 (Olson and Knight, 2003). 도메인 I 와 MEF2 도메인 사이의보존되지않은서열을제거하였을경우에는전사활성도에영향을미치지않았으나, 두도메인을모두제거하면 GLUT4의발현정도가모든조직에서뚜렷하게저하되는것으로 4

19 확인되었다 (Olson and Pessin, 1995). 그러나 도메인 I 의일부를제거하고 MEF2 도메인 을보존하였을경우에도 GLUT4의정상적인발현과는다소차이가있어, MEF2 도메인 만으로 GLUT4 프로모터의기능을모두담당하기에는충분하지않음을알수있으며 (Thai et al., 1998), 결론적으로 GEF와 MEF2 전사인자는 GLUT4의전사조절에복합적으로관여하는것으로결론을내릴수있다 (Oshel et al., 2000). 그러나구체적으로어떠한기전에의하여 GLUT4의전사과정이조절되는지에대해서는밝혀지지않은부분이많다. MEF2 도메인 에는 MEF2 동형단백질 (isoform) 중에서 MEF2A 및 MEF2D가결합하며 (Thai et al., 1998), 이중에서인슐린결핍시에결합의활성도가변화하는인자는 MEF2A가유일한것으로확인되었다 (Zheng et al., 2001; Song et al., 2002). 그러나이들이구체적으로 GLUT4의발현에어떻게관여하는지에대해서는정확히알려져있지않다. 최근의연구결과에따르면, 근육이수축하는경우세포내칼슘농도가상승하면서활성화된 CaMKII (Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II) 가 MEF2A와결합하여있던 HDAC5 (Histone deacetylase 5) 를인산화하여분리시키고, 이자리에 HAT (Histone acetyltransferase) 가결합하여히스톤꼬리를아세틸화시켜 DNA와의결합을느슨하게하며, 결과적으로 MEF2A의 MEF2 도메인 에의접근성이높아져 GLUT4의발현이증가하는것으로확인되었다 (Ojuka et al., 2012). 실제로제2형당뇨병환자가운동을하였을경우골격근의 GLUT4 발현이증가하는것도이러한사실을뒷받침한다 (Hussey et al., 2012). 또한 MEF2A가 MEF2 도메인에결합하면서 GEF의 도메인 I 에대한결합활성도가증가하며, MEF2A의부재시에는 HDAC5가 GEF와상호작용하면서 GLUT4 프로모터의활성을억제시키는것으로확인되었다 (Sparling et al., 2008). 이러한결과로부터 MEF2A가 GEF와복합체를형성하여 5

20 GLUT4의전사조절에중요한역할을담당할것으로예상할수있으나, 그정확한기전에대해서는추후연구가필요하다. 또한 GLUT4의전사를촉진하는과정에는 AMPK(AMP-activated protein kinase) 도중요한역할을담당한다. 근육의수축에의하여활성화된 AMPK는 CaMKII와마찬가지로 MEF2A를직접인산화하지는않으나, HDAC5를인산화하여분리시킴으로써 MEF2A의 MEF2 도메인에대한접근성을향상시킨다 (McGee et al., 2008). 동시에활성화된 AMPK는 GEF를인산화시킴으로써 GLUT4 유전자의프로모터부위에더잘결합하도록한다 (Holmes et al., 2005). 지금까지서술한근육의수축이 GLUT4의유전자를활성화시키는전과정은 Figure 1.2에정리되어있다. 지금까지 GLUT4의구조및유전자발현의조절에관하여설명하였다. 다음단락에는 GLUT4를포함한다른몇가지단백질이 GSV (GLUT4 storage vesicle) 내에조립되는과정에대해정리하고, 인슐린자극의유무에따라 GSV가세포내부또는세포막근처에서어떠한방식으로조절되는지에대해설명할것이다 (Figure 1.3) GLUT4 소포의생성과조절 인슐린의자극이없는상태에서는세포내 GLUT4의 75% 는소포및소관에존재하며, 나머지는 TGN(Trans-Golgi network) 및엔도솜 (endosome) 에존재한다 (Bryant et al., 2002). GLUT4를함유하는소포는다시두종류로나뉘는데, 하나는인슐린의자극에의하여세포막에융합하는 GSV이고, 다른하나는인슐린의자극과무관한세포내수송소포이다 (Kupriyanova et al., 2002). GSV의막에는 GLUT4를비롯하여 IRAP(Insulin-regulated aminopeptidase), sortilin, LRP1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1) 이 6

21 존재하며 (Jedrychowski et al., 2010), 또한소포의융합에관여하는 v- SNARE 중의하나인 VAMP2(Vesicle-associated membrane protein 2) 도존재한다 (Grusovin and Macaulay, 2003). 이들단백질은특수한세포내과정을거쳐서 GSV로이동한다. 세포막에존재하는 GSV 단백질들은세포내부의분류엔도솜 (sorting endosome) 으로이동하고, 분류과정을거쳐서 TGN의서브도메인 (subdomain) 인 donor membrane 으로이동하며, 일부는재활용엔도솜 (recycling endosome) 에도착한다. 인간의골격근에서는분류엔도솜에서 TGN으로이동하는이역행수송과정에 syntaxin-10 및 CHC22 (Clathrin heavy chain 22) 가관여한다 (Esk et al., 2010). 이처럼 GSV 단백질들이 donor membrane 으로정확하게분류될수있는이유는이들의세포질도메인 (cytoplasmic domain) 이특이적인신호로작용하기때문이며 (Shi and Kandror, 2005; Shi et al., 2008; Li et al., 2009), 이과정에서 GSV 단백질들의내강도메인 (luminal domain) 의상호작용을바탕으로 GSV 단백질들이추후 GSV로함께분류될수있도록한다 (Shi et al., 2008; Jedrychowski et al., 2010). 다음단계로, donor membrane 에서는 GSV 단백질및기타요소들의상호작용으로인하여 GSV가생성된다. 이과정에는클라트린피복 (clathrin coat) 과 GGA (Golgi-localized, γ-ear-containing, ADP-ribosylation factor-binding proteins), 그리고 ACAP1 (Arf-GAP with coiled-coil, ANK repeat and PH domain-containing protein 1) 이필요하다 (Li and Kandror, 2005; Li et al., 2007). 우선, GGA와상호작용하는유일한 GSV 단백질은 sortilin으로알려져있다. Sortilin의내강도메인이 GLUT4, IRAP, LRP1 등의다른 GSV 단백질과상호작용한다는점을고려할때, sortilin은 GSV의막에위치하면서이들을모아서큰복합체를형성하는골격으로서의역할을할것으로예상된다. 그리고, GSV 단백질들은 GGA에의하여소포의 7

22 출아과정을거치면서 GSV의형태를갖추게된다 (Shi and Kandror, 2005). 다음단계로 ACAP1은 GLUT4의세포질쪽고리 (cytoplasmic loop) 와상호작용하여, 출아한 GSV에클라트린피복을가져와둘러싸는역할을담당한다 (Li et al., 2007). 또한 GGA와 ACAP1은 Arf6 (ADP-ribosylation factor 6) 와상호작용을하는것으로확인되었다 (Takatsu et al., 2002; Li et al., 2007). Arf6는여러세포에서엔도솜의재활용과관련된역할을담당하는단백질로 (D'Souza- Schorey and Chavrier, 2006), 특히지방세포에서핵주변부의 donor membrane 에존재하는 GLUT4와위치가겹치는양상이확인되어 GSV의생성과정에서도일정역할을담당할것으로예측된다 (Li et al., 2007). 한편세포막에위치하던 GSV 단백질이아닌, 새로합성된 GSV 단백질중에서 GLUT4와 IRAP의경우는다른막단백질처럼세포막으로바로이동하는것이아니라, 인슐린의자극에반응하는세포내소기관으로 6-9시간이내에이동한다 (Watson et al., 2004; Hou et al., 2006). 이러한특이적인이동은 GSV 단백질의세포질도메인의특이적신호에의한것이다. GLUT4의경우에는이신호를담당하는영역이 N-말단과중심부고리 (central loop) 에존재하며 (Khan et al., 2004), IRAP의경우에는 76-77번자리의 dileucine 모티프가이신호역할을담당한다 (Hou et al., 2006). 또한, 세포막으로부터재활용되는경우뿐만아니라새로합성되는 GSV 단백질의경우에도특이적인이동과정에 GGA를필요로한다 (Watson et al., 2004; Hou et al., 2006). 이과정에서재활용되는 GSV 단백질과새로합성된 GSV 단백질이서로다른기원으로부터각각이동하는지, 아니면새로합성되는 GSV 단백질이기존단백질에섞여서동일한과정을거치는지에대해서는아직밝혀지지않았다. 8

23 위의과정을거쳐서생성된 GSV는, 인슐린의자극이없는상태에서는세포내에서일정량을지속적으로유지한다. 이과정이아직명확하게밝혀진것은아니지만, 아마도 TGN과엔도솜사이의순환과정에 GSV가참여할것으로예상된다 (Govers et al., 2004; Karylowski et al., 2004). 세포내로섭취된 GLUT4가세포내에서존재하기위해서는 TGN과융합하기위한 SNARE 복합체가필요하며 (Rubin and Bogan, 2009), 인간의경우 syntaxin-16, syntaxin-10, Vti1a (Vesicle transport through interaction with t-snares homolog 1A), VAMP3 (Vesicle-associated membrane protein 3) 가이와관련된 SNARE 복합체를구성하는핵심요소로알려져있다 (Ganley et al., 2008; Esk et al., 2010). GSV가트랜스페린수용체 (transferrin receptor) 를가지고있는엔도솜과합쳐지지않는다는사실을고려할때 (Govers et al., 2004), 유력한가능성중의하나는 GSV가 TGN으로부터생성또는융합되는순환과정을반복하고, 이과정이엔도솜과완전히분리되어있어서결과적으로세포내에 GSV를충분히유지할수있다는것이다 (Bogan and Kandror, 2010). GSV를세포내부에존재하도록하는과정에서의다른필수요소중하나로 TUG (Tether containing a UBX domain, for GLUT4) 가있다 (Bogan et al., 2003; Yu et al., 2007; Rubin and Bogan, 2009). TUG는 GLUT4에특이적으로결합하며, 이과정은일차적으로는 GLUT4의세포질쪽고리에의하여매개되고 (Yu et al., 2007), 이차적으로는 GLUT4의 N-말단이이결합에관여한다 (Bogan et al., 2003). 또한 TUG가세포내에서 GLUT4와같은위치에존재한다는점을고려할때, TUG는 GSV에존재하는 GLUT4에특이적으로상호작용할것으로예상된다. 이상호작용에는 TUG의 N-말단과중심부분이관여하고, TUG의 C-말단은직접적으로 GLUT4와의상호작용에는관여하지않으나 GLUT4를세포내에유지시키는데에필수적인 9

24 요소이며, 이부분은앵커링단백질 (anchoring protein) 과상호작용하여 GLUT4를세포내에고정시키는역할을담당할것으로추측된다 (Bogan et al., 2003). 실제로 TUG의 C-말단조각을첨가하였을경우인슐린의자극이없는상태에서도 GLUT4가인슐린자극시와비슷한정도의양으로세포막으로이동하는양상을확인할수있었는데, 이는첨가한 TUG의 C-말단조각이앵커링단백질의결합부위와상호작용하면서, 세포내에존재하는 TUG 및이와연결된 GLUT4가세포내에존재하는것을방해하였기때문으로해석할수있다 (Yu et al., 2007). 또한이러한양상이트랜스페린수용체에서는나타나지않는다는점도위의가설을뒷받침하는결과이다 (Bogan et al., 2003; Yu et al., 2007). 인슐린은지방세포및근육세포를자극하여 TUG와 GLUT4의결합을해리시켜, GLUT4를포함한 GSV를세포막으로이동시키는역할을한다 (Bogan et al., 2003; Schertzer et al., 2009). TUG의 UBX (Ubiquitin-like) 도메인은세포내에서다양한역할을하는 ATPase인 p97/cvp/cdc48과결합하는것으로잘알려져있으며 (Alexandru et al., 2008; Schuberth and Buchberger, 2008), 이 p97은단백질복합체를분해하기위하여프로테아솜 (proteasome) 으로유도하는역할을주로담당한다. 이러한점을고려할때, 인슐린자극이존재할경우 p97이 TUG-GLUT4 복합체에대해서도동일한작용을하여결합을해리시킬것으로추정된다 (Bogan and Kandror, 2010). 또한 Ubc9 (Ubiquitin carrier protein 9) 과 Daxx (Death associated protein 6) 가 GLUT4에결합하여 GSV의세포내이동을조절할것으로예상되나 (Giorgino et al., 2000; Lalioti et al., 2002; Liu et al., 2007), 아직각각의역할및 p97과의관계에대해서는명확히밝혀진바가없다. 10

25 1.1.5 인슐린의자극에의한신호전달체계 앞단락에서기술한바와같이, 인슐린은근육및지방세포에서 GLUT4의세포막으로의이동을촉진시키며, 근육세포에서는운동역시 GLUT4의세포막으로의이동을촉진시킨다. 이과정은 GLUT4의전사나번역과정과는무관하게일어난다 (Rose and Richter, 2005; Herman and Kahn, 2006). 그러나인슐린과운동은서로다른세포내신호전달체계를거쳐서 GLUT4의이동에관여한다 (Figure 1.4). 혈액내로분비된인슐린은지방세포또는근육세포표면에존재하는인슐린수용체에결합한다. 인슐린수용체는알파소단위 2개와베타소단위 2개가결합하여구성된티로신인산화효소수용체 (tyrosine kinase receptor) 의일종으로, 세포외부의수용체부위에인슐린이결합할경우구조적변화를일으켜세포내부도메인에존재하는티로신인산화효소를활성화시킨다 (Ottensmeyer et al., 2000). 이에의하여 IRS(Insulin receptor substrate) 가인산화되어활성화되며, 이과정에서 IRS의 N-말단에위치한 PH 도메인이 IRS를인슐린수용체에근접시키고, PTB 도메인이 IRS를활성화된인슐린수용체와결합시키는역할을한다 (Voliovitch et al., 1995). 이러한과정을거쳐 IRS가활성화되면, IRS의 C-말단의 SH2 도메인이 PI3K (Phosphatidylinositol-3-kinase) 의 85kDa 소단위와결합하고, 이는 PI3K의 110kDa 소단위를활성화시킨다 (Myers et al., 1992; Downes et al., 2005). 활성화된 PI3K는두개의단백질인산화효소인 Akt와 apkc-λ/ξ (Atypical protein kinase C-λ/ξ) 를각각활성화시킨다. 첫번째로, PI3K는 PI(4,5)P2 (Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate) 를인산화시켜 PI(3,4,5)P3 (Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate) 으로전환시킨다. PI(3,4,5)P3는 Akt를세포막근처로유도하고, 이후에 PDK1 (3-Phosphoinositidedependent kinase) 이작용하여 Akt의 Thr-308/309를인산화함으로써 11

26 활성화시킨다 (Filippa et al., 2000). 이러한과정이일어나기위해서는 Akt의 Ser-473/474 인산화가필수적으로선행되어야함이확인되었고, Akt가완전하게활성화되기위해서는이두과정이모두일어나야하며 (Filippa et al., 2000), 후속연구에서 Rictor-mTOR (Mammalian target of rapamycin) 복합체가 Ser-473의인산화를촉진한다는것이밝혀졌다 (Sarbassov et al., 2005). 두번째로 PI3K는 PDK1의도움을받아 apkc-λ/ξ 의활성화고리에위치하는 Thr-410의인산화를촉진시키며 (Bandyopadhyay et al., 1999), 이후 turn 모티프에위치하는 Thr-560의자가인산화 (autophosphorylation) 가일어나는동시에, 인산화여부와무관하게구조의변화가일어나면서자가억제 (autoinhibition) 기능이소실되는과정을거쳐서 apkc-λ/ξ 는완전히활성화된다 (Standaert et al., 1999). 이러한과정을거쳐활성화된 Akt와 apkc-λ/ξ 는 GLUT4의세포내부에서의이동조절및세포막으로의이동조절에모두관여한다. 위의과정을거쳐활성화된 Akt는 AS160 (Akt substrates of 160kDa) 을인산화시킨다. AS160은 N-말단에 2개의 PTB (Phosphotyrosine-binding) 도메인이위치해있고, C-말단에 Rab 단백질과상호작용을하는 Rab GAP (Rab GTPase-activating protein) 도메인을가지고있으며, Akt에의하여인산화가일어나는 RXRXXS/T 모티프를여러개가지고있다 (Figure 1.5)(Kane et al., 2002). 실제로인슐린자극시에, AS160의 RXRXXS/T 모티프중 5부위 (Ser-318, Ser-570, Ser-588, Thr-642, Thr-751) 에서인산화가일어남이확인되었으며 (Sano et al., 2003), 이는 GAP 도메인의불활성화를유발하고, 결과적으로 Rab 단백질에결합된 GTP의가수분해를억제하여활성상태로유지함으로써 GLUT4의이동을촉진한다. 인슐린에의한신호전달과정은, 위에서서술한 AS160을 12

27 경유하는것이외에한가지경로가더있다고알려져있다 (Ribon and Saltiel, 1997; Liu et al., 2003). Cbl (Casitas b-lineage lymphoma) 과어댑터단백질 (adaptor protein) 인 CAP (c-cbl-associated protein) 는, APS (Adaptor molecules containing pleckstrin homology (PH) and Srchomology 2 (SH2) domains) 에의하여인슐린수용체근처로이동된다 (Ribon et al., 1998; Liu et al., 2002). 인슐린수용체에의하여 Cbl의티로신잔기가인산화되면, Cbl은구아닐뉴클레오티드교환인자 (guanyl nucleotide exchange factor) 인 C3G와함께어댑터단백질인 CrkII (CT10 regulator of kinase protein II) 를지질뗏목 (lipid rafts) 으로이동시킨다 (Chiang et al., 2001). 결과적으로 C3G는지질뗏목에존재하는 GTP-결합단백질인 TC10을활성화시킨다 (Watson et al., 2001). 이들신호전달단백질들이지질뗏목내부에서공간적구획화를이루고있는것은인슐린자극에의해서 GLUT4가세포막으로이동하는과정에필수적인것으로생각된다. 실제로 CAP에돌연변이가발생하였을경우에는, Cbl을지질뗏목으로이동시키는과정에문제가발생하여, 인슐린에의한신호전달이일어나지않는것으로밝혀졌다 (Baumann et al., 2000). 최근연구에의하면, TC10이액틴역학 (actin dynamics) 의조절에일정역할을담당하는것으로알려졌으며 (Kanzaki and Pessin, 2001; Jiang et al., 2002; Chunqiu Hou and Pessin, 2003; Inoue et al., 2003), 후속연구에서 TC10의 2개의동형단백질 (TC10α, TC10β) 중 TC10α가 GLUT4의세포막으로의이동과정에관여하는것으로확인되었다 (Chang et al., 2007; Okada et al., 2008). 특히, 액틴조절과관련된 N-WASP (Neural Wiskott-Aldrich syndrome protein), Arp3 (Actin related protein-3), 그리고엑소시스트단백질복합체 (exocyst protein complex) 가 TC10α의신호를전달받는단백질들로알려져있다 (Jiang et al., 2002; Inoue et al., 2003). N-WASP와 Arp3는액틴의중합반응을조절하고, 엑소시스트단백질복합체는 GSV가세포막에견인되어 13

28 도킹되는과정을조절한다. 이러한상호작용은 SNARE 단백질들 (SNAP-23, syntaxin-4, Synip, Munc18c, VAMP2) 에의하여 GSV와세포막이융합되는과정에필수적이다. 이과정에대해서는 1.1.6에서더자세히서술할예정이다 액틴역학에의한 GSV 유도 이번절에서는, 1.1.5에서서술한경로에의해서신호를전달받은 GSV가실제로어떠한세포내메커니즘을이용하여이동및세포막과의융합과정을거치는지에대해언급하고자한다. 지금까지수행된연구결과를종합하여보면, GSV가짧은거리를이동하는데에는액틴이관여하고, 긴거리를이동하는데에는미세소관이관여하는것으로알려져있다 (Brozinick et al., 2007; Zaid et al., 2008; Eyster and Olson, 2009). 실제로미세소관은인슐린의자극이없는기저상태에서 GSV가세포내에분포하는데에는관여하지만. 인슐린의자극에의한 GLUT4의세포막으로의이동에는관여하지않는다 (Eyster et al., 2006). 예를들면, 기저상태에서는 GSV가세포막아래를따라긴거리를이동하는양상이관찰되며, 그들의궤적은세포막전체에광범위하게퍼져있는양상을보인다 (Xu et al., 2007). 반면에인슐린자극이가해졌을때에는 GSV의이러한긴움직임이중단되고, GSV와세포막간의견인, 도킹, 그리고융합이관찰된다 (Lizunov et al., 2005). 최근연구결과들은인슐린의자극에의해서 GSV의움직임이바뀌는이러한양상이, 세포막아래에있는미세소관과액틴의접합부에서일어난다는주장을뒷받침하고있다. 인슐린이액틴필라멘트를그물망의형태로급격하게리모델링하도록유도하고, 이그물망은지방세포및근육세포모두에서 GLUT4의세포막으로의이동에필수적이라는사실은이미잘알려져있다 (Brozinick et al., 2007). 예를들면, 액틴필라멘트를 14

29 세포내구조와연결시키는데에필요한 ACTN4 (Alpha-actinin- 4) 라는단백질은인슐린자극시에 GLUT4를세포막으로이동시키는데에필요하다 (Talior-Volodarsky et al., 2008). 인슐린의자극을받은 ACTN4는액틴필라멘트를따라 GLUT4와동일한위치에존재하며, 이는 ACTN4가 GSV를액틴세포골격에견인하는데에일정역할을담당할가능성이있음을시사한다. 액틴그물망의견인기능은, 세포막에존재하는 SNARE 복합체와 GSV에존재하는 VAMP2 (Vesicle associated membrane protein 2) 에의해서이루어지는 GSV와세포막간의도킹및융합의최종단계에일정역할을담당할것으로예상된다 (Watson and Pessin, 2007). 이러한연구결과를종합하여보면, ACTN4가 GSV를인슐린에의해서조직된액틴그물망으로유도함으로써, SNARE 복합체에의한도킹메커니즘과연결되도록촉진하는역할을담당하는것으로결론을내릴수있다. 그러나 ACTN4가견인및도킹과정에서담당하는상세한역할및중요성에대해서는아직명확히알려져있지않다. 지방세포에서는, 진화적으로보존되어있는견인복합체인엑소시스트복합체가 GSV를세포막의특정부위로유도하는역할을한다 (Inoue et al., 2003; Inoue et al., 2006). 8개의소단위로구성되어있는이복합체는, 세포외로배출되는소포와그융합대상이되는세포막의특정부위를처음인식하는과정에관여한다. 지방세포에서 GSV 엑소시스트복합체는세포막의지질뗏목부위에서조립되며, 그과정에서 1.1.5에서술한대로인슐린에의한 TC10α의활성화가필요하다. 활성화된 TC10α는엑소시스트복합체의구성요소인 Exo70, Sec6, Sec8을구성하는과정을조절한다 (Inoue et al., 2006). 흥미로운사실은, TC10α의활성화가 F- 액틴 (filamentous actin, F-actin) 을재조직하는데에필수적이라는것이다. 인슐린은 AS160에위치한 Rab GAP 도메인의활성을 15

30 억제시켜 GSV의이동을촉진하고, Rho GTPase인 TC10α를활성화시켜 GSV가세포막의특정부위에도착할수있도록유도할뿐만아니라, GSV와연관되어있는 Ral GTPase인 RalA를활성화시킴으로써세포막에인접하여있는엑소시스트복합체와 GSV가연결되도록한다 (Chen et al., 2007). 여기에서 RalA는 GSV의이동과정에서분자모터 (molecular motor) 역할을담당하는 Myo1c와의상호작용을통해, 소포의이동및견인을집중시키는역할을담당한다 (Chen et al., 2007; Yip et al., 2008). 한편 Rab 단백질의활성화와유사한양상으로, 인슐린이 RalA에신호를전달하는과정역시 PI3K에의하여매개된다 (Chen et al., 2007). PI3K가 Rab 단백질에신호를전달하는과정에서 Akt가 AS160을활성화시킨다는사실은 1.1.5에서언급하였듯이잘알려져있다. 그러나 PI3K가 RalA에신호를전달하는과정에서도 Akt 및 AS160이관여하는지, 아니면이외의다른단백질이관여하는지에대해서는명확히알려져있지않다. 액틴과관련해서, α-와 β-fodrin 동형단백질이지방세포막의지질뗏목에풍부하게존재한다는사실은주목할만하다 (Liu et al., 2006). Fodrin은실모양의 α-β 이형이량체 (heterodimer) 를형성하는비적혈구계스펙트린 (nonerythroid spectrin) 으로, 세포막아래에서반복적인연결망의형태로존재하며, 양끝이액틴에결합되어있다. 흥미로운것은, α-fodrin과 syntaxin-4는쥐의지방세포에서동일한위치에존재하면서상호작용을하고, 인슐린이이러한상호작용을강화시킨다는사실이다. 이와는대조적으로, latrunculin A에의해서액틴이파괴될경우에는 α-fodrin과 syntaxin-4 사이의상호작용이감소하고, α-fodrin의리모델링및 GLUT4의세포막으로의이동이억제된다. 이러한사실로부터, fodrin과액틴의연결망은 GSV의 VAMP2를 syntaxin-4에접근하도록허용함으로써 GSV와세포막이 16

31 융합되도록하는데에핵심적인역할을담당함을알수있다. 만약인슐린의자극에의해서 α-fodrin의리모델링이발생하게되면, GLUT4의세포막으로의이동과정은 latrunculin A의영향을받지않게되어, 결과적으로 GSV의외포작용이일어나게된다 (Liu et al., 2006). 이번절의내용을요약하자면다음과같다. 인슐린자극에의한 GSV의이동은 RalA 및 TC10α에대한인슐린의신호전달이필수적이다. RalA의활성화가 GSV를세포막의지질뗏목에위치한엑소시스트복합체로견인하기위해이동시키는과정을촉진하는반면에, 활성화된 TC10α는 GSV의견인에필요한엑소시스트복합체의형성을조절하고, GSV의도킹에필요한 F-액틴을재조직한다. 또한, fodrin은 synyaxin-4와의상호작용을통해서엑소시스트복합체에견인된 GSV를세포막의특정부위에위치하여있는 SNARE 도킹기구로이동시키는과정에관여할것으로예상된다 세포막의지질층과 GSV 의융합과의관련성 세포막아래에있는액틴필라멘트의그물망이 GSV의여정중에서견인및도킹과정에중요한역할을담당하는것은분명하다. 그에더해서, 인슐린의자극에의한세포막지질층의변화가 GSV와세포막의융합을촉진시킨다는증거가밝혀지고있다. 세포막의지질층은포도당대사이상과관련된질병에서병태생리의핵심을담당하는요인이기때문에, 이지질층이인슐린의작용과 GLUT4의세포막으로의이동과정에어떠한역할을하는지에대한연구가각광을받고있다. 실제로현미경을이용한몇몇세포막연구로부터, 인슐린에의하여 GSV와세포막간의융합과정에새로운시사점을제공해주는결과들이도출되고 17

32 있다. 포낭 (caveolae) 은세포막의다른부위와는형태적으로차이가있는스핑고지질-콜레스테롤미세도메인 (sphingolipid-cholesterol microdomain) 의형태를갖추고있으며, 이는포낭단백질에의하여안정화된다 (Parton and Simons, 2007). 수년동안, 포낭이인슐린과 GLUT4에미치는영향및담당하는역할에대해서많은가설이제기되었다. 포낭의구조를연구하는과정에서사용된수많은접근전략이내포하는여러가지문제점으로인하여결과의해석에는주의가필요함에도불구하고, TC10α와엑소시스트복합체의포낭을기반으로한견인및 F-액틴의분산매커니즘은포낭과액틴의연관성을증명해주고있다 (Kanzaki and Pessin, 2002; Foti et al., 2007). 형광물질로포낭과 F-액틴을표지한결과, 액틴필라멘트가포낭의미세도메인으로부터나온다는사실이확인되었다 (Kanzaki and Pessin, 2002). 포낭과연결되어있는 F-액틴구조인이 Cav-액틴 (Caveolinassociated filamentous actin, Cav-actin) 을 latrunculin B나 TC10의돌연변이 (TC10/T31N) 로파괴할경우에는군집된포낭의조직화에영향을주지못하였다. 그러나, 군집된포낭을 methyl-betacyclodextrin으로파괴할경우에는 Cav-액틴구조가분산되는결과가나타났다 (Kanzaki and Pessin, 2002). 추후에정량전자현미경과동결할단법 (freeze-fracture method) 을이용한분석결과, 액틴을비롯한세포골격의구성요소들은포낭의목부위에위치한세포막에풍부하게존재한다는사실이밝혀졌다 (Foti et al., 2007). 이를종합하면, 포낭은 F-액틴의조직화에일정역할을담당하고있음을알수있다. 인슐린에의한 GLUT4의이동과정에서 F- 액틴이갖는명백한중요성을고려하여볼때, 이러한연구결과는 GLUT4의조절과정에서포낭의중요성또한강조하고있다고볼수있다. Cav-액틴구조의조절과관련되어서흥미로운것은, 18

33 전자현미경을이용한후속연구에서포낭의가장자리에 PIP2가높은농도로관찰되었다는점이다 (Fujita et al., 2010). PIP2가이곳에서국소화되어있다는것은, 세포막과세포골격의상호작용, 그리고 F-액틴의안정성을조절하는데에지질뗏목이필요하다는사실과부합하는연구결과이다 (Kwik et al., 2003). 흥미로운것은, 고인슐린혈증으로인한 GLUT4 이동의장애로인하여인슐린저항성이유발된지방세포및근육세포에서는세포막의 PIP2와 F- 액틴이감소하여있으나, F-액틴의구조와인슐린자극에의한 GLUT4의세포막으로의이동과정은외부로부터 PIP2를세포막에첨가하였을때에원상태로회복되었다는것이다 (Chen et al., 2004; McCarthy et al., 2006). GLUT4의조절에관한세포막의기능성에대한실험적증거들에덧붙여서, 최근연구에서는 GSV와 GLUT4의조절양상을정확히평가하기위하여전반사형광현미경 (total internal reflection fluorescence microscopy) 을도입하였다. 이현미경은세포막에인접하여있는세포의제한된영역안에서, 선택적으로빛을비추어형광물질을활성화시키기위하여소멸파 (evanescent wave) 를사용한다. 후속연구에서는이를이용하여기존연구결과를확장하였고, 그결과세포막의일부분이인슐린에의해활성화되는과정이 GSV와세포막의융합과정에필수적이라는사실을밝혀내었다 (Koumanov et al., 2005). 예를들어전반사형광현미경을이용한몇몇연구에서는, 세포막과 GSV가융합할수있도록준비시키는중요한세포막신호의존재에대한강력한증거를제시하고있다 (Gonzalez and McGraw, 2006; Bai et al., 2007; Jiang et al., 2008). PI3K와 Akt의활성을억제하고분석한결과, Akt는인슐린자극에의한 GSV와세포막간의융합전단계 ( 모집, 견인, 도킹 ) 를조절하는중요한역할을담당할것으로예상되었다 (Gonzalez and 19

34 McGraw, 2006). 이와는대조적으로, 인슐린자극에의한 GSV와세포막의융합은 Akt의활성과는독립적으로발생하는것으로나타났다. 즉, GSV와세포막간의융합이전단계는 Akt의활성을억제하였을경우그효율이감소하지만, 세포막에이미도킹되어있는 GSV의융합과정은인슐린에의하여변함없이촉진된다는것이다. 그러나 wortmannin을투여했을경우에는 GSV와세포막간의융합이억제되었으며, 이는도킹이후의과정이 PI3K의영향을받음을시사한다. 컴퓨터를이용하여 GSV를동적추적 (dynamic tracking) 한결과, 인슐린은 PI3K 및 Akt의신호를이용하여 GSV와세포막의융합전단계를가속화시키지만, GSV와세포막을융합시키기위한준비과정에는다른신호를사용한다는사실이확인되었다 (Bai et al., 2007). 추가적인분석과정에서이두번째신호가 PI3K를필요로할가능성이제기되었지만, 아직확실한결론은내려져있지않다. GSV와세포막간의융합을준비하는과정에서 PI3K가담당하는구체적인역할에대해서는추후연구를통하여확인이필요하다. 그러나이와관련하여, PI3K가 PKC-λ/ξ/Munc18c와 PLD1 (Phospholipase D1) 에신호를전달하여 GSV와세포막의융합을촉진시킬수있다는점은주목할만하다 (Thurmond et al., 2000; Hodgkinson et al., 2005; Lee et al., 2005). 인슐린의신호가 PKC-λ/ξ를경유해서 Munc18c를 syntaxin-4와분리시키고, 이는도킹이후및융합이전과정에필요하다 (Thurmond et al., 2000; Hodgkinson et al., 2005). 반면에인슐린에의하여활성화된 PLD1은융합이가능한세포막을만드는역할을담당한다 (Huang et al., 2005). PLD1은지질포스파티딘산 (phosphatidic acid) 을생성하고, 이물질은융합구멍이생성되고확장되는동안세포막이구부러지는과정의활성화에너지를낮추어서원활한융합이이루어지도록한다 (Kooijman et al., 20

35 2003). 요컨대, PI3K는 GSV와세포막의도킹이후에융합되는필수적인기전을조절하기위해서두개의서로다른신호를사용한다 근육의수축에의한신호전달체계 근육세포에서는 1.1.5에서언급하였던인슐린의자극뿐만아니라, 근육의수축역시 AS160의인산화를유발하여 GLUT4의세포막으로의이동을촉진한다 (Bruss et al., 2005). 그러나이과정은인슐린에의한신호전달과정과는다소다른경로를거쳐서 GSV에작용하는것으로알려져있으며, 아직완전하게밝혀져있지는않다. 근육의수축에의해서포도당의수송이일어나는기전은, 탈분극에의하여근소포체 (sarcoplasmic reticulum) 로부터방출된 Ca2+ 에의하여직접활성화되는피드포워드 (feed-forward) 신호전달과, Ca2+ 에의하여활성화된근육의수축및이온펌핑 (ion pumping), 그리고그결과로인하여근육세포에가해지는에너지자극에의한피드백 (feedback) 신호전달로구분된다. 그러나이는실제신호전달경로를극도로단순화시킨설명에불과하다. 이와관련해서현재까지알려져있는사실을요약하자면다음과같다 (Figure 1.6). 근육의수축과포도당수송과의관계를알아보기위한최초의연구는, 카페인에담근개구리의 sartorius 근육을이용하여수행되었다. 카페인은근소포체로부터 Ca2+ 를분비시켰고, 이는포도당수송의증가로이어졌다. 이연구결과, 근육이수축하는동안포도당수송이증가하는과정에서는탈분극은필요하지않으며 Ca2+ 의분비만이필요함을알게되었다 (Holloszy and Narahara, 1965; Holloszy and Narahara, 1967). 쥐의근육을대상으로실험한후속연구결과에서도, 근육을수축시키기에충분하지않은농도의 21

36 카페인에담갔던근육에서포도당수송이증가하는양상이관찰되었다 (Youn et al., 1991; Wright et al., 2004; Wright et al., 2005). 또한, Ca2+ 를분비시키는화합물인 N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1- naphtalenesulfonamide를사용하여동일한조건으로실험했을때에도유사한결과가나타났다 (Youn et al., 1991). 이러한결과들로미루어볼때, Ca2+ 자체만으로도근육에서의포도당수송량을증가시키기에충분함을알수있다. 그러나, 몇몇후속연구에서근육의수축없이도카페인이근육세포의에너지를감지하는 AMPK의활성도를증가시키는현상이관찰되었다 (Jensen et al., 2007; Raney and Turcotte, 2008; Egawa et al., 2011). 후속연구에서, AMPK의우성음성 (dominant negative) 돌연변이체를과발현시켜서자연상태의 AMPK의활성도를매우낮춘상태의쥐의 soleus 근육을대상으로실험하였을때, 포도당수송량을증가시키는카페인의능력이손상된것이확인되었다 (Jensen et al., 2007). 결론적으로, 카페인투여시에포도당의수송량이증가하는이유는, Ca2+ 의증가자체가원인이아니라, AMPK의활성화를거쳐서근육에에너지자극이가해지기때문인것이다. AMPK에대한자세한내용은이절의중반부에기술할예정이다. 칼슘은 AMPK가아닌, 다른하위신호전달분자들의활성화를통해서포도당의수송을증가시키는것으로생각되고있다. 한가지가능성은 CaMK (Calcium/calmodulin-dependent protein kinases) 에서찾을수있다. 인간의골격근에는 CaMKII와 CaMKIII, 그리고상위의인산화효소인 CaMKK가높은정도로발현되어있으나, CaMKIV와 CaMKI는발견되지않는다 (Rose et al., 2005; Rose et al., 2006). 쥐에서는, 다른 CaMK와 CaMKK와더불어 CaMKI도발견되고있다 (Jensen et al., 2007; Witczak et al., 2007; Abbott et al., 2009; Abbott et al., 2011). CaMKII의차단제인 KN62와 KN93이근육에서 22

37 수축에의한포도당의수송을감소시키는현상으로볼때, CaMKII는근육의수축에의한포도당수송에연관되어있음이확인되었다 (Macpherson et al., 2002; Jensen et al., 2007). 최근에, CaMKII에특이적인억제자를쥐의 tibialis anterior 근육에전기천공법 (electroporation) 으로주입하였을때, 근육의수축에의한포도당의수송이 30% 감소한다는결과도보고되었다 (Witczak et al., 2010). 그러나근육의수축을차단함으로써에너지소모를막았을경우에는, 근육내칼슘농도가증가한다고해도포도당의수송량은거의증가하지않았다 (Jensen and Richter, 2010). 이를분석하여보면, 근육이수축하는동안의포도당수송의증가는주로에너지를감지하는신호전달경로를활성화시키는에너지사용에기인하며, Ca2+ 은단지간접적인효과만을담당할뿐임을알수있다. 일산화질소합성효소 (nictric oxide synthase) 는근육세포에발현되며, 근육이수축할경우에효소의활성및일산화질소 (nitric oxide) 의생성이증가한다. 설치류를대상으로한실험결과, 이효소가근육의수축에의한포도당수송과정에관여하는지에대해서는결과가일관적이지않다. 몇몇연구에서는일산화질소합성효소의작용을억제하더라도근육의수축에의한포도당수송량을감소시키지못한다고주장하였으며 (Etgen et al., 1997; Higaki et al., 2001; Rottman et al., 2002), 다른몇몇연구에서는포도당수송량의감소가확인되었다 (Balon and Nadler, 1997; Roberts et al., 1997; Stephens et al., 2004; Merry et al., 2010). 특히후자의연구중하나에대해자세히살펴보면, 일산화질소합성효소를억제하였을경우에오직속근 (fast-twitch muscle) 인 EDL (extensor digitorum longus) 근육에서만포도당수송량의감소를가져왔고, 지근 (slow-twitch muscle) 인 soleus 근육에서는이러한효과가관찰되지않았다 (Merry et al., 2010). 이것은아마도일산화질소합성효소가 soleus 23

38 근육보다는 EDL 근육에더많이발현되어있는것과관계가있을가능성이높으며, 결론적으로일산화질소가근육의수축시에포도당수송에미치는영향은근섬유의유형에따라다를수있다는점을시사한다. 활성산소 (reactive oxygen species) 또한근육의수축시에포도당의수송기전을활성화시키는것으로알려져있다. 운동중에는활성산소의생성량이증가하며 (Reid, 2008), 골격근을과산화수소에담갔을경우에는포도당의수송량이증가하였다 (Jensen et al., 2008). 반면에, 쥐의 EDL 근육을활성산소제거제인 NAC(N-acetylcysteine) 에담갔을때에는근육수축에의한포도당수송량이감소하였다 (Sandstrom et al., 2006; Merry et al., 2010). 이러한효과가 AMPK 유전자를억제한근육과그렇지않은정상근육에서동일하게나타나는것으로미루어볼때, NAC의효과는 AMPK와무관한것으로결론을내릴수있다. 그러나이러한종류의자극은생리적인수축과정을거의반영하지못한다는단점이있다. 자극의강도를약하게하였을때에는, NAC는활성산소의생성을감소시켰음에도불구하고포도당수송량의감소효과를나타내지못하였다 (Merry et al., 2010). NAC를인간에게주사하였을경우역시, 운동에의한포도당수송량이감소하는효과는관찰되지않았다 (Merry et al., 2010). 종합하면, 생체외에서아주강한전기적자극을가하였을경우에는활성산소가근육의포도당수송에관여하지만, 생리적인운동이일어나는동안활성산소의중요성은상대적으로떨어진다고결론을내릴수있다. 근육이수축하는동안, 근육의에너지전하는운동의강도와시간에비례하여감소한다. 그결과크레아틴인산 (creatine phosphate) 농도가감소하고, 강렬하거나장시간의운동을할경우에는 ATP의농도도감소한다. 반면에, 크레아틴 (creatine) 과 AMP의농도는 24

39 증가한다 (Broberg and Sahlin, 1989). 이러한변화에의해서세포의에너지감지기인 AMPK가활성화된다 (Hardie, 2007). AMPK는촉매작용을하는 α-소단위와조절역할을하는 β- 그리고 γ-소단위로구성되어있는이형삼량체효소 (heterotrimeric enzyme) 이다. α- 와 β- 소단위는각각두개의동형단백질 (α1, α2; β1, β2) 이존재하며, γ- 소단위는세개의동형단백질 (γ1, γ2, γ3) 이존재한다. 골격근이운동을하는동안에는, γ-소단위에 AMP와 ADP의결합이증가하고, ATP의결합이감소하면서 AMPK의생리적인활성화가일어난다. 인간의골격근에서는, AMPK의삼량체의구성이세가지복합체에국한되어있다. α2β2γ1과 α1β2γ1이전체의 80% 가량을차지하며, α2β2γ3이나머지 20% 가량을차지한다 (Wojtaszewski et al., 2005). 흥미로운것은, α2β2γ3 복합체는골격근에특이적으로존재하며 (Wojtaszewski et al., 2005; Birk and Wojtaszewski, 2006), 운동시에주로활성화되는것은 α2β2γ3 복합체라는점이다 (Birk and Wojtaszewski, 2006). α2β2γ1 복합체는운동이지속될경우에만활성화되며, α1β2γ1 복합체는운동중에전혀활성화되지않거나아주약간활성화되는정도에그쳤다 (Treebak et al., 2007). 위과정을통하여활성화된 AMPK는 AS160 및 TBC1D1을인산화시켜궁극적으로 GLUT4의세포막으로의이동을촉진한다 에서도언급하였듯이 AS160은지방세포에서인슐린에의한신호를연결하여 GLUT4를이동시키는핵심단백질로확인된바있다 (Kane et al., 2002; Sano et al., 2003). 이때에주목할만한사실은, 근육이수축을하는동안에는 1.1.5에서언급하였던인슐린에의한신호전달경로중근위부의경로는일반적으로활성화되지않는다는점이다. 골격근과관련된최근연구결과에의하면, Akt 이하의신호전달경로에서는인슐린에의한경로와근육의수축에 25

40 의한경로가하나로수렴되는것으로밝혀졌다. 골격근에서이와같은수렴이일어나는지점은 AS160과, 그리고이와유사한아미노산서열및도메인구조를가지고있는 TBC1D1이다. TBC1D1은 AS160과아미노산서열이 50% 일치하고, PTB 도메인및 Rab GAP 도메인등유사한도메인구조를가지고있으며 (Park et al., 2011), AS160과마찬가지로 Akt에의해인산화될수있는장소를여러개가지고있다 (Peck et al., 2009). 그러나 AS160과는달리 AMPK에의해인산화될수있는장소인 Ser-237이있고 (Taylor et al., 2008), 모든조직에비슷한정도로분포하는 AS160과는달리골격근에높은정도로발현되어있다 (Figure 1.5). 그러나 AS160과비교하였을때 TBC1D1의역할이무엇인지에대해서는명확히알려진바가없다. AS160과 TBC1D1은둘다 CBD 도메인을가지고있다. 근육수축과정에서세포내 Ca2+ 가증가하면, 이와결합하는단백질인 calmodulin이활성화되어결과적으로 CBD 도메인이있는 AS160과 TBC1D1이근육수축동안에일정역할을담당할것으로예측하기도하였다. 실제로 calmodulin이 CBD 도메인에결합하는것을차단하였을때, 근육의수축에의한포도당수송량은 40% 가량감소한반면인슐린의자극에의한포도당수송량은변화가없었다 (Kramer et al., 2007). 또한, Rab GAP 도메인의돌연변이가일어난 AS160의경우에는근육의수축에의한포도당수송량의감소가원상태로회복되었다. 이러한사실은 CBD가 AS160의 Rab GAP 도메인의기능을불활성화시킴으로써포도당수송을유발할수있음을시사한다. 그러나이러한작용이 TBC1D1에서도동일하게일어나는지에대해서는아직알려진바가없다. 최근한연구결과에의하면, AMPK에의해활성화된 TBC1D1은그자체로 GLUT4의세포막으로의이동을촉진하는역할을담당하기도하나, 또다른 26

41 경로로 PTB1 도메인의존재하에 AMPK에의해 Ser-237이인산화되면서인슐린반응성을획득하고, 결과적으로 AS160과유사한방식으로 Akt에의해 Thr-596의인산화가일어남으로써 GLUT4의세포막으로의이동에관여한다고한다 (Hatakeyama and Kanzaki, 2013). 그러나이를뒷받침하기위한후속연구는아직부족한실정이다. 이번연구에서는그해답을, AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인이어떠한 Rab 단백질과상호작용을하는지, 그리고그결합친화도는얼마나되는지에중점을두고찾고자한다. 이를위하여, 우선 Rab 단백질에대하여지금까지연구된바를정리하면다음과같다. Rab 단백질은다양한세포내부에서막단백질의이동에관여하는 G단백질로인간에서는 63종류이상이존재하며 (Zerial and McBride, 2001), 이중에서인슐린의자극에의한 GLUT4의세포내이동에관여할것으로예상되는 Rab 단백질로 Rab4, Rab5, Rab8A, Rab10, Rab14 등이제시되었다 (Cormont et al., 2001; Huang et al., 2001; Ishikura et al., 2007; Sano et al., 2008). 이중에서 Rab10은지방세포에서 GSV와결합하여세포막까지같이이동하는유일한 Rab 단백질로확인되었고 (Chen and Lippincott-Schwartz, 2013), Rab14는재활용을위해세포막에서분류엔도솜으로이동한 GLUT4를 TGN으로이동시키는역할을담당한다 (Reed et al., 2013). 근육세포에서는 Rab10 대신에 Rab8A가, GSV를동적유지 (dynamic retention) 상태로부터해방시켜서세포의말초부위로이동할수있도록만드는역할을할것으로예상되고있다 (Ishikura et al., 2007; Randhawa et al., 2008). 그러나각 Rab 단백질들이 GLUT4의세포내이동에구체적으로어떻게관여하는지는밝혀지지않았으며, TBC1D1과상호작용하는 Rab 단백질이 AS160과동일한지, 아니면다른 Rab 단백질인지에대해서도알려지지않았다. 생체외에서 27

42 AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인의 GSV 내 Rab 단백질들에대한활성도를측정한결과, 둘모두 Rab2A, Rab8A, Rab8B, Rab10, Rab14가기질로작용할가능성이높음이확인된적은있으나 (Miinea et al., 2005; Roach et al., 2007), 생체내에서의연구결과를포함하여이를뒷받침하는후속연구는아직미흡한실정이다. 28

43 1.2 연구의필요성 제2형당뇨병의주된병태생리인인슐린저항성이발생하는기전에대해서는아직명확하게밝혀지지않은부분이많다. 특히인슐린저항성과관련된세포내신호전달경로에관여하는여러단백질중에서, GLUT4의세포막으로의이동에관여할것으로예상되는단백질인 TBC1D1의역할에대해서는아직명확히알려진바가없으며, 이과정에서 TBC1D1의 Rab GAP 도메인이어떠한 Rab 단백질과상호작용을하는지에대해서도확인된바가없다. 특히 1.1.8에서언급하였듯이, AS160이인슐린의자극및근육의수축에의해활성화되어 GLUT4의이동에관여함에도불구하고, 근육세포에서 TBC1D1이별도로존재하는생물학적의미에대해서고찰해볼필요가있다. 이에대하여연구함으로써근육세포내의 GLUT4 이동과관련된신호전달경로를정확히밝혀내는것은, 당뇨병의근본적원인을규명하고치료전략을개발하는데에도움이될가능성이높다. 예를들면, 제2형당뇨병환자를대상으로유전자검사를실시하였을때, 만약특정유전자에이상이발견될경우해당유전자를대상으로한맞춤약물치료나유전자치료를시행함으로써, 당뇨병에대하여보다더근본적이고효율적인치료를시행할수있을것으로사료된다. 1.3 연구의목적 따라서이번연구에서는, 주로근육세포내에존재하는 TBC1D1의역할을규명하는것을목표로하였다. 이와관련하여생체내에서의실험연구를진행하기이전에, 생명정보학적기법을사용하여 AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인의기질로어떠한 29

44 Rab 단백질들이작용하는지를분석하고, 상호작용의양상에차이가존재하는지를확인함으로써두핵심단백질의역할에어떠한차이가있을지를예측해보고자한다. 단백질은대사, 정보처리, 수송, 그리고구조형성등세포기능의모든측면에있어서중요한역할을담당한다. 특히, 단백질간의상호작용은환경의변화를감지하고, 신호전달을매개하며, 대사및신호전달과관련된효소들의활성을조절하고, 세포의구성을유지하는것과같은기능을조절하는역할을한다 (Braun and Gingras, 2012). 그러나실험적인방법만으로는단백질복합체의 3차원구조를결정하는데에기술적인어려움이있고비용이많이들기때문에, 단백질도킹이실험적인방법을보완할수있는중요한전산학적도구로활용되고있다 (Huang, 2015). 이단백질간의도킹을정확하게예측하는것은단백질복합체에대한구조적인지식을제공함으로써궁극적으로기존에밝혀지지않은단백질의기능에대한정보를추론할수있도록한다. 이번연구에서는기존연구에서밝혀져있지않은 TBC1D1의 Rab GAP 도메인의기질특이성을단백질도킹방법을이용하여분석하고, 그결과를 AS160의 Rab GAP 도메인의기질특이성분석결과와비교하여두단백질의역할에어떠한차이가있는지를유추하고자한다. 본연구에서 TBC1D1의역할과관련하여입증하고자하는가설은다음과같다. AS160과 TBC1D1은다양한 Rab 단백질과상호작용을하고, 그결과두핵심단백질은생체내의포도당수송과정에서일정비율만큼의역할을담당할것이라는추측이다. 만약이가설이참이라고가정한다면, 전체 Rab 단백질중에서 AS160과 TBC1D1의 Rab GAP 도메인과상호작용하는 Rab 단백질의비율은, AS160 또는 TBC1D1의기능이상실되었을때에 30

45 포도당수송량이감소하는비율과유사할것이다. 따라서 AS160 및 TBC1D1 유전자의발현을억제시킨넉아웃마우스 (knockout mouse) 에서포도당수송량이어느정도로감소하는지를측정하였던기존의연구결과를이용한다면, AS160 및 TBC1D1과여러가지 Rab 단백질간의상호작용에너지중에서상호작용유무를판단하는절사점 (cutoff value) 을선택할수있다. 만약이렇게선택된절사점을기준으로하였을때, AS160 또는 TBC1D1과상호작용할것으로예상되는 Rab 단백질과, 생체외에서수행된기존연구에서 AS160 또는 TBC1D1과상호작용하는것으로밝혀진 Rab 단백질의종류가유사하다면, 앞에서제시한 TBC1D1의역할에대한가설은참일가능성이높다고결론을내릴수있다. 31

46 Figure 1.1 Schematic structure of GLUT4 (Glucose transporter 4). The unique sensitivity of GLUT4 to insulin-mediated translocation appears to be derived from sequences shown in the N-terminal (required phenylalanine) and C-terminal (required dileucine and acidic residues) regions. These sequences are likely involved in rapid internalization and sorting of GLUT4 in GSVs (GLUT4 storage vesicles) (Huang and Czech, 2007). 32

47 Figure 1.2 The molecular signaling pathways involved in contraction-induced GLUT4 gene activation. Skeletal muscle contraction leads to activation of AMPK (AMP-activated protein kinase) and CaMKII (Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II). The activated AMPK phosphorylates GEF (GLUT4 enhancer factor), and HDAC5 (Histone deacetylase 5) are phosphorylated by AMPK and CaMKII. As a result, the activated GEF binds to domain I, and HDAC5 is exported out of the nucleus, which allows MEF2A (Myocyte enhancer factor 2A) to bind to MEF2 domain. Finally, the GLUT4 gene is activated (Richter and Hargreaves, 2013). HAT, Histone acetyltransferase. 33

48 Figure 1.3 A model for intracellular GLUT4 trafficking. In unstimulated cells, GLUT4 is localized predominantly in the perinuclear region in GSVs (GLUT4 storage vesicles). In addition to GLUT4, these vesicles contain IRAP (Insulinregulated aminopeptidase), LRP1 (Low density lipoprotein receptor-related protein 1), and VAMP2 (Vesicle associated membrane protein 2), and sortilin. The GSVs exist in a dynamic equilibrium with donor membranes that are a subdomain of the TGN (Trans-Golgi network) and recycling endosomes. Formation of the GSVs requires GGA (Golgi-localized, γ-ear-containing, ADP-ribosylation factor-binding proteins), ACAP1 (Arf-GAP with coiled-coil, ANK repeat and PH domain-containing protein 1), and clathrin. Once formed, GSVs are retained intracellularly by TUG (Tether containing a UBX domain, for GLUT4), Ubc9 (Ubiquitin carrier protein 9), and other proteins. When the insulin is added, GSVs move and fuse with the plasma membrane. Meanwhile, The GSV component proteins are internalized into sorting endosomes and returned to donor membranes by cellugyrin-containing transport vesicles (Bogan and Kandror, 2010). 34

49 Figure 1.4 Signaling pathways for GLUT4 translocation in adipocytes. Insulin activates Akt mediated by the activation of IRS (Insulin receptor substrate), PI3K (Phosphatidylinositol-3-kinase), PDK1 (3-Phosphoinositide-dependent kinase), and mtorc2 (Mammalian target of rapamycin complex-2). Activated Akt phosphorylates AS160 (Akt substrates of 160kDa), which inhibit Rab GAP (Rab GTPase-activating protein) activity toward particular Rab isoforms (especially Rab10). Inhibition of GAP promotes conversion of less active GDP-loaded Rab to more active GTP-loaded Rab. The more active GTP-loaded Rab then allows GSVs (GLUT4 storage vesicles) to move to and fuse with the plasma membrane. PDK1 also activates apkc (Atypical protein kinase C), which involves in translocation of GSVs (Sakamoto and Holman, 2008). PIP2, Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. PIP3, Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate. 35

50 Figure 1.5 Schematic domain structures of human AS160 and TBC1D1. Akt stimulates phosphorylation of AS160 (Akt substrates of 160kDa) at 5 sites, and mutation of AS160 in which 4 of phosphorylation sites (Ser-318, Ser-588, Thr-642, Ser-751) had been mutated to alanine (AS160-4P) abolished insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes (Sano et al., 2003). Akt phosphorylates Thr596, and AMPK (AMP-activated protein kinase) phosphorylates Ser-237 of TBC1D1 (Sakamoto and Holman, 2008). PTB, Phosphotyrosine-binding domain. CBD, Calmodulin-binding domain. GAP, Rab GTPase-activating protein domain. 36

51 Figure 1.6 Signaling pathways for GLUT4 translocation in muscle cells. Contraction through energy depletion leads to activation of AMPK (AMP-activated protein kinase). The activated AMPK and Akt phosphorylates AS160 (Akt substrates of 160kDa) and TBC1D1 at multiple phosphorylation sites. This is thought to regulate translocation of GLUT4 via particular Rab proteins. Elevated intracellular Ca2+ may be involved in this signaling pathway by activating CaMKII (Calcium/calmodulindependent protein kinase II), but their exact role is not clearly known (Sakamoto and Holman, 2008; Richter and Hargreaves, 2013). 37

52 제 2 장. 연구방법 2.1 도메인의기질특이성분석 이번연구에서는서론의연구목적부분에서언급된단백질도킹프로그램을이용하여인간의 Rab 단백질에대한 AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인의기질특이성을분석하였다 (Figure 2.1). 우선, PDB (Protein Data Bank) 에서 AS160과 TBC1D1의 Rab GAP 도메인, 그리고 Rab 단백질의구조정보를 PDB 파일형태로수집하였고, 본격적인단백질도킹에앞서단백질구조상의오류를수정하고최적화하기위하여 FoldX (foldx.crg.es) 의 RepairPDB 명령어를사용하였다. 다음단계로, 단백질도킹프로그램인 Hex (hex.loria.fr) 와 ClusPro (cluspro.bu.edu) 에수정된 PDB 파일을입력하여 Rab GAP 도메인과 Rab 단백질간의도킹을수행하였고, FoldX의 Stability 명령어를이용하여각프로그램에서최적의도킹모형으로선정된단백질복합체의상호작용에너지를계산하였다. 마지막으로, 임의의절사점으로각상호작용에너지를선택하였을때에, 전체 Rab 단백질중각절사점에서 AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인과상호작용하는 Rab 단백질의비율을차례대로계산하였다. 만약에, 연구목적에언급한대로 AS160과 TBC1D1의기능을억제하였을때에포도당수송량이감소하는비율이전체 Rab 단백질들중에서 Rab GAP 도메인과상호작용하는비율과유사하다고 38

53 가정을한다면, 특정절사점을기준으로하였을때 Rab GAP 도메인과상호작용하는 Rab 단백질들에는어떠한것이있는지확인할수있다. 만약이결과가기존실험연구결과와일치한다면앞에서세운가정이참임을입증할수있으며, 이로부터 TBC1D1은 AS160과는서로다른 Rab 단백질들과상호작용을함으로써근육세포내의포도당수송과정에서 AS160과더불어일정역할을담당한다고결론을내릴수있다. 39

54 2.2 데이터세트의구성 이번연구에서는생명정보학데이터베이스인 PDB를활용하였다. PDB는 1971년에 BNL (Brookhaven National Laboratories) 에의하여구축된, 단백질을비롯한생물학적거대분자의구조에관련된자료가정리되어있는인터넷상의데이터베이스이다 (Berman et al., 2000). 이곳에는 X선결정분석법 (Xray crystallography) 이나핵자기공명분광법 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 에의하여밝혀진거대분자의구조적정보가저장되어있으며, 이정보를 PDB 파일의형태로다운로드받을수있다. 단백질도킹을수행하기위해, 첫번째로 X선결정분석법에의해밝혀진인간의 AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인의구조를 PDB 파일로다운로드받았다 (Park et al., 2011). 두번째로, 기존실험연구에의하여 GSV 내에존재하는것으로알려진 Rab 단백질들의구조를 PDB 파일로다운로드받았다. 기존연구에서 GSV 내에서발견된 Rab 단백질로는 Rab1A, Rab2A, Rab3A, Rab4A, Rab4B, Rab5A, Rab6, Rab7, Rab8A, Rab10, Rab11A, Rab11B, Rab14, Rab18, Rab21, Rab27A, Rab27B, Rab35가있으며 (Miinea et al., 2005), 이중인간에서의구조가밝혀져 PDB에공개되어있는 Rab 단백질에는 Rab1A, Rab2A, Rab4A, Rab4B, Rab5A, Rab6, Rab7, Rab8A, Rab11A, Rab11B, Rab14, Rab18, Rab21가있다. 이번연구에서는이 Rab 단백질들의구조를 PDB 파일로다운로드받아분석과정에이용하였다 (Zhu et al., 2004; Eathiraj et al., 2005; Huber and Scheidig, 2005; Scapin et al., 2006; McCray et al., 2010; Guo et al., 2013). 이과정에서동일한 Rab 단백질의구조가여러개존재할경우에는돌연변이가없는것을선택하였으며, 만약 PDB 파일이해당 Rab 단백질을포함하여여러개의사슬 (chain) 로구성되어있는경우에는그 40

55 중에서 Rab 단백질에해당되는파일만을다운로드받아서사용하였다. AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인과각 Rab 단백질들의 3차원구조는 PyMOL ( 을사용하여확인하였다 (Figure 2.2, Figure 2.3). 41

56 2.3 FoldX 를이용한최적화 현재개발되어있는단백질도킹프로그램중에서, 단순히 PDB 파일을입력하는것만으로 100% 신뢰할만한도킹결과를제시할수있는프로그램은존재하지않는다. 그이유는크게두가지로구분된다. 첫번째이유는, 아무리복잡하고정교한힘장 (force field) 도완전히신뢰할수없기때문이다. 두번째이유는, 단백질의구조를 X선결정분석법으로확인하는과정이매우낮은온도나 ph 등생리적이지않은환경에서진행되는경우가흔하고, 이러한과정을통해얻어진단백질구조에는원자간의거리나각도가표준적이지않은경우가존재하기때문이다. 따라서이번연구에서는다운로드받은파일을도킹에사용하기에앞서, FoldX를이용하여수정하는과정을시행하였다. FoldX는단백질또는단백질복합체의안정성에돌연변이가미치는영향을빠르고정확하게평가하기위하여개발된경험적힘장 (Empirical force field, EFF) 으로, 이에의한단백질의자유에너지 (kcal/mol) 는다음의식으로표현될수있다 (Schymkowitz et al., 2005). 위공식에서 (a i) 는자유에너지계산에사용되는서로다른에너지항들에대한상대적인가중치이다. 는모든원자들의반데르발스힘의총합이다. 와는, 극성기 (polar group) 및무극성기 (apolar group) 가접히지않은상태 (unfolded state) 에서접힌상태 (folded state) 로변화할때의용매화에너지 (salvation energy) 의차이다. 는물분자가단백질과하나이상의수소결합을이루면서안정화되는데에추가로필요한자유 42

57 에너지다. 는단백질과용매사이의수소결합형성과비교하였을때, 단백질내수소결합형성과의자유에너지차이를뜻한다. 은나선쌍극자 (helix dipole) 를포함하여전하를띤기 (charged group) 의정전기적기여도를나타낸다. 는접힌상태에서뼈대 (backbone) 를고정시키는데에필요한엔트로피비용이며, 는곁가지 (side chain) 를특정형태로고정시키는데에필요한엔트로피비용이다. 마지막으로, 는단백질구조를구성하고있는원자들간의입체적인위치상의중복을계산하는항목이다. FoldX는앞서언급한 PDB 파일의오류를수정할수있는 RepairPDB라는명령어를제공하고있다. 이를이용하여 PDB에서다운로드받은 AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인, 그리고 GSV 내에존재하는 Rab 단백질들의구조를모두수정하고최적화하여새로운 PDB 파일을얻었고, 이를추후단백질도킹프로그램에입력할데이터로사용하였다 (Figure 2.4). 43

58 2.4 Hex 와 ClusPro 를이용한단백질도킹 컴퓨터를이용하여단백질도킹을예측하는과정에서는일반적으로단백질간의결합부위에대한정보가부족하기때문에, 6개의자유도 (3방향축의병진운동과 3방향의회전운동 ) 하에결합가능한단백질간의도킹을탐색하는과정이필요하게되었다. 단백질의뼈대와곁가지에주어진이러한높은자유도하에서이루어지는단백질도킹은그과정에서엄청난컴퓨터자원을요구할수밖에없었으며, 이러한이유로단백질도킹프로그램에있어서검색전략의효율성이가장중요한요소로자리잡게되었다. 이러한전략하에, 지난수년간다양한알고리즘과스코어링함수 (scoring function) 를기반으로한단백질도킹프로그램이개발되었다 (Huang, 2014). 단백질도킹프로그램들은검색전략에따라서여러가지범주로구분되며, 그중에서도 FFT (Fast Fourier transform) 또는 SFT (Spherical Fourier transform) 기반의도킹알고리즘을사용한도킹프로그램이현재가장많이사용되고있다. 이들은도킹하는단백질의구조가고정되어있다는가정하에자유도 6의검색공간내에서가능한모든도킹모형을검색하고, 이들단백질복합체각각의자유에너지를계산한후가장자유에너지가낮은도킹모형을최적의모형으로선택하는과정을거친다. 이번연구에서는단백질도킹을수행하는생명정보학적도구로 Hex와 ClusPro를사용하여, FoldX를통해최적화된 PDB 파일을입력하여최적의도킹모형을탐색하였다. Hex는두단백질의 3차원구조에대한정보만으로단백질간의상호작용을계산하고분석하는단백질도킹프로그램중의하나이다 (Ritchie et al., 2008; Macindoe et al., 2010). Hex 이전에개발되었던단백질도킹프로그램들은 3차원데카르트좌표계 (3D Cartesian grid) 기반의 FFT 도킹알고리즘을사용함으로써축 44

59 3방향의자유도에대한검색과정만이가속화되어결과를도출하는과정에시간이많이소요된다는단점이있다. 이러한단점을보완하기위해서 Hex는회전상관함수 (rotational correlation) 를사용한 SPF (Spherical polar Fourier) 상관함수를도입함으로써, 축 3방향뿐만아니라회전 3방향에대한검색과정역시가속화시킬수있고, 결과적으로기존프로그램과비교하였을때단백질도킹과관련된계산과정을더빠르게진행할수있도록개발되었다. 또한 Hex는도킹결과를그림으로나타내는기능을갖추고있다. 이번연구에서는 Hex 버전을사용하였으며, 각단백질간의최적의도킹모형을탐색하기위하여사용된매개변수설정은다음과같다. Correlation type: Shape + Electro + DARS FFT Mode: 3D fast lite Grid Dimension: 0.6 Receptor Range: 180 Ligand Range: 180 Twist Range: 360 Distance Range: 40 처음단백질도킹프로그램이고안될당시의스코어링함수는, 상호작용을하는두단백질의형태의상보성 (shape complementarity) 만기초를두고있었다 (Katchalski-Katzir et al., 1992). 그러나보다더자연상태에가까운단백질도킹의필요성이강조됨에따라, 정전기적상호작용 (electrostatic interaction) 에대한항목이스코어링함수에포함된도킹프로그램들이개발되기시작하였으며 (Gabb et al., 1997; Mandell et al., 2001), Hex는이를고려하여만들어진단백질도킹프로그램들중의하나이다 (Ritchie 45

60 and Kemp, 2000). 또한, 이두요소만으로는일부단백질도킹과정에서의정확도가현저히떨어지는문제가발견되었으며, 이에따라새롭게도입된방법이 DARS (Decoys As the Reference State) 이다 (Chuang et al., 2008). 이것은, 원자의종류는고려하지않은상태에서좋은구조적상보성을가지는도킹된단백질구조들의집합을만들고, 이집합중에서특정상호작용이일어나는빈도수를기준상태 (reference state) 로사용하는방법이다. 이결과값은단백질간의실제상호작용에가까운도킹구조를탐색하는데에효과적이며, 기존의다른항목들과함께스코어링함수에포함될수있다. Hex 버전에는 DARS를스코어링함수에포함시킬수있는옵션을제공하고있어서, 보다더정확한단백질도킹을위하여상관함수의유형 (correlation type) 으로 Shape + Electro + DARS 를선택하여분석을진행하였다 (Figure 2.5). ClusPro는컴퓨터프로그램을통해결정된단백질도킹모형들이자연상태에서의도킹모형에클러스터링 (clustering) 하는특성을이용하여, 에너지함수만을기준으로단백질도킹모형의순위를결정하여최적의모형을탐색하였던기존단백질도킹프로그램의단점을보완한프로그램이다 (Kozakov et al., 2005)(Figure 2.6). ClusPro의알고리즘은크게세단계로진행된다. 첫번째로, FFT 상관함수를이용한단백질도킹프로그램인 PIPER를실행하여, 단백질을구성하는각원자들간의상호작용에의한에너지를계산하고, 이에너지가가장낮은 1000개의모형을선택한다. 이때에단백질복합체의자유에너지함수는다음의식으로표현된다. 위공식에서 는에너지함수를구성하는서로 다른에너지항들에대한상대적인가중치이다. 와 는 46

61 단백질도킹의 3차원구조에따라발생하는원자간의척력과인력을뜻한다. 는정전기적기여도를나타내는항이며, 는앞서 Hex의알고리즘설명과정에서언급하였던 DARS 퍼텐셜을뜻한다 (Kozakov et al., 2006). 두번째로, 도킹하는단백질중수용체 (receptor) 에해당하는단백질의특정원자를기준으로 10Å 이내에위치하는리간드 (ligand) 원자들의 RMSDs (Root-mean-squared deviations) 에따라서클러스터링을시행하고, 클러스터의크기가큰순서대로상위 30개를선택함으로써최적의에너지를가진단백질도킹모형을탐색한다 (Kozakov et al., 2005). 세번째로, Monte Carlo simulation을이용하여이클러스터들의안정성을분석하고, 최적화과정을통해서마지막으로단백질도킹모형을수정한다. 이러한분석결과는첫단계의분석과정에서사용한에너지함수를구성하는각항목의가중치에따라서 (1) Balanced, (2) Electrostatic-favored, (3) Hydrophobic-favored, (4) VdW+Elec 네가지로제시된다. 이번연구에서는 Balanced의결과중에서클러스터의크기가가장큰도킹모형을선택하였으며, 이때에가중치를적용한단백질복합체의자유에너지함수는다음과같다. 47

62 2.5 FoldX 를이용한결합자유에너지의계산 앞단계에서 Hex와 ClusPro로각각구한최적의도킹모형을 PDB 파일로저장한후에, 이를 FoldX로분석하여 AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인과각 Rab 단백질간의상호작용에너지를계산하고, 이를바탕으로각단백질간의상대적인결합친화도를비교및평가하였다. 우선 FoldX의 Stability 명령어를사용하여, 앞서 2.3에서 RepairPDB 명령어를통하여최적화과정을거친 AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인, 그리고각 Rab 단백질들의자유에너지를계산하였다. 그다음으로, Hex와 ClusPro 프로그램에서각각최적의도킹모형으로도출된단백질복합체의자유에너지를, 위와동일한방식으로 FoldX의 Stability 명령어를사용하여계산하였다. 이계산결과를바탕으로, 다음의공식을이용하여상호작용에너지값을도출하였다. 상호작용에너지 단백질복합체의자유에너지 각단백질의자유에너지 48

63 2.6 상호작용에너지절사점의선정 앞단계에서도출한상호작용에너지를바탕으로해서, AS160 또는 TBC1D1의 Rab GAP 도메인에대한각 Rab 단백질의결합친화도의우선순위를결정하였다. 각단백질도킹프로그램마다제시하는알고리즘에차이가있고, 또한이는생체내에서의상태를완벽히반영하지는못하기때문에, 특정 Rab 단백질과의상호작용유무를절대적인절사점을기준으로판별하는것은다소무리가있다. 따라서본연구에는, 우선각단백질도킹프로그램 (Hex, ClusPro) 을통해얻어진상호작용에너지의값들을크기를기준으로차례대로나열한후, 임의의절사점을작은값에서부터시작하여큰값으로올려가면서설정하였다. 이때에, 각 Rab 단백질이임의로설정한절사점에서 AS160 또는 TBC1D1의 Rab GAP 도메인과상호작용하는지의여부를조사하고, 전체 Rab 단백질중각절사점에서 Rab GAP 도메인과상호작용하는 Rab 단백질의비율을차례대로계산하였다. 마지막으로이결과를기존실험연구에서도출된결과와비교하고, 고찰부분에서는본연구를통해서새로밝혀진사실및한계점에대해논의하고자한다. 49

64 Figure 2.1 The flowchart of the protocol of protein docking using in this study. See text 2.1 for details. 50

65 Figure 2.2 Structures of Rab GAP domains of (a) AS160 and (b) TBC1D1. (Park, Jin et al 2011, viewing in PyMOL) 51

66 (a) (b) (c) (d) Figure Structures of Rab proteins. (a) Rab1A, (b) Rab2A, (c) Rab4A, and (d) Rab4B (Eathiraj et al., 2005; Huber and Scheidig, 2005, viewing in PyMOL). 52

67 (a) (b) (c) (d) Figure Structures of Rab proteins. (a) Rab5A, (b) Rab6, (c) Rab7 and (d) Rab8A (Zhu et al., 2004; Eathiraj et al., 2005; McCray et al., 2010; Guo et al., 2013, viewing in PyMOL). 53

68 (a) (b) (c) (d) (e) Figure Structures of Rab proteins. (a) Rab11A, (b) Rab11B, (c) Rab14, (d) Rab18, and (e) Rab21 (Eathiraj et al., 2005; Scapin et al., 2006, viewing in PyMOL). 54

69 Figure 2.4 Repairing the PDB file (Rab4B) by using RepairPDB command of FoldX program. The X-ray structures downloaded from Protein Data Bank may have errors such as non-standard angles or distances, and biased conformations. So it is necessary to run RepairPDB command of FoldX prior to any energy calculation. 55

70 Figure 2.5 The docking process of Rab GAP domain of AS160 and Rab1A protein using Hex program. See text 2.4 for details. 56

71 Figure 2.6 The docking process of Rab GAP domain of AS160 and Rab1A protein using ClusPro. This first web page is used to specify the PDB files to be uploaded. See text 2.4 for details. 57

72 제 3 장. 연구결과 3.1 Hex 와 ClusPro 를이용한단백질도킹결과 Hex를이용하여 AS160 또는 TBC1D1의 Rab GAP 도메인과, GSV 내에존재하는것으로밝혀진 Rab 단백질들의도킹을시행한결과는 Table 3.1에제시되어있다. 각 Rab 단백질들의최적의도킹모형의에너지값을기준으로보았을때, AS160의 Rab GAP 도메인과결합친화도가높을것으로예상되는 Rab 단백질들은 Rab4B ( KJ/mol), Rab5A ( KJ/mol), Rab8A ( KJ/mol), Rab14 ( KJ/mol), Rab21 ( KJ/mol) 등이있으며, TBC1D1의 Rab GAP 도메인과결합친화도가높을것으로예상되는 Rab 단백질들은 Rab5A ( KJ/mol), Rab7 ( KJ/mol), Rab11B ( KJ/mol), Rab14 ( KJ/mol), Rab21 ( KJ/mol) 등이있다. 다만이결과는 FoldX를이용한최종계산과정을거치지않은상태로, 해석에는다소제한이있음을참고할필요가있다. ClusPro를이용하여 AS160 또는 TBC1D1의 Rab GAP 도메인과, GSV 내에존재하는것으로밝혀진 Rab 단백질들의도킹을시행한결과는 Table 3.2에제시되어있다. 각 Rab 단백질들의최적의도킹모형의클러스터크기를기준으로보았을때, AS160의 Rab GAP 도메인과결합친화도가높을것으로예상되는 Rab 단백질들은 Rab4A (138), Rab5A (145), Rab6 (161), Rab18 (171) 등이있으며, TBC1D1의 Rab GAP 도메인과결합친화도가높을것으로예상되는 Rab 단백질들은 Rab1A (138), Rab6 (129), 58

73 Rab8A (163), Rab18 (262) 등이있다. 다만이결과역시 FoldX 를 이용한최종계산과정을거치지않은상태로, 해석에는다소 제한이있음을참고할필요가있다. 3.2 FoldX 를이용한상호작용에너지계산결과 Hex 및 ClusPro에서최적의도킹모형으로도출된 Rab GAP 도메인과 Rab 단백질의복합체를, FoldX를이용하여분석하여상호작용에너지를계산한결과는 Table 3.3과 Table 3.4에제시되어있다. 우선, AS160의 Rab GAP 도메인의자유에너지는 kcal/mol, TBC1D1의 Rab GAP 도메인의자유에너지는 kcal/mol로확인되었다. 그리고각 Rab 단백질들의자유에너지와, Rab GAP 도메인 - Rab 단백질복합체들의자유에너지는 Table 3.3과 Table 3.4에제시되어있다. 이결과를바탕으로 AS160 및 TBC1D1의 Rab GAP 도메인과 Rab 단백질들간의상호작용에너지를계산하였다. Hex를사용하였을때, AS160의 Rab GAP 도메인과결합친화도가높을것으로예상되는 Rab 단백질들은 Rab1A (71.05kcal/mol), Rab2A (71.48kcal/mol), Rab11B (76.88kcal/mol) 등이있으며, TBC1D1의 Rab GAP 도메인과결합친화도가높을것으로예상되는 Rab 단백질들은 Rab1A (74.43kcal/mol), Rab4A (71.85kcal/mol), Rab4B (82.39kcal/mol) 등이있다 (Table 3.3, Figure 3.1). ClusPro를사용하였을때, AS160의 Rab GAP 도메인과결합친화도가높을것으로예상되는 Rab 단백질들은 Rab1A (223.49kcal/mol), Rab7 (219.03kcal/mol), Rab21 (207.53kcal/mol) 등이있으며, TBC1D1의 Rab GAP 도메인과결합친화도가높을것으로예상되는 Rab 단백질들은 Rab1A (243.13kcal/mol), Rab7 (225.27kcal/mol), Rab14 59

74 (254.41kcal/mol) 등이있다 (Table 3.4, Figure 3.2). 3.3 임의의절사점선택시, Rab GAP 도메인과 Rab 단백질들의상호작용비율 Table 3.3과 Table 3.4에서도출된상호작용에너지값들을크기순서대로나열하여각각을임의의절사점으로선택하고, 해당절사점에서전체 Rab 단백질들중 AS160 또는 TBC1D1의 Rab GAP 도메인과상호작용하는 Rab 단백질들의비율을백분율로나타낸결과는 Table 3.5와같다. 예를들면, Hex 프로그램으로부터도출된결과분석시에상호작용에너지의절사점을 91.41kcal/mol로임의로선택하였을경우, 전체 Rab 단백질들중 AS160의 Rab GAP 도메인과상호작용하는 Rab 단백질들의비율은 23.08% 이고, TBC1D1의 Rab GAP 도메인과상호작용하는 Rab 단백질들의비율은 46.15% 이다. 또한, ClusPro 프로그램으로부터도출된결과분석시에상호작용에너지의절사점을 kcal/mol로임의로선택하였을경우, 전체 Rab 단백질들중 AS160의 Rab GAP 도메인과상호작용하는 Rab 단백질들의비율은 46.15% 이고, TBC1D1의 Rab GAP 도메인과상호작용하는 Rab 단백질들의비율은 30.77% 이다. 그러나 Table 3.5에제시되어있는여러개의절사점중에서어떤것이 Rab GAP 도메인과각 Rab 단백질간의실제상호작용을정확하게반영하는지에대해서는, 상호작용여부를판단할절대적인기준점이존재하지않기때문에이결과만으로결론을내릴수는없다. 따라서고찰부분에서는이번연구결과를, AS160과 TBC1D1 유전자의기능이상실되었을때에포도당 60

75 수송량에어느정도의변화가있는지를확인하였던기존실험연구 결과와비교분석하고, 이를바탕으로 2.1 에서제시하였던가설이 합당한지판단해보고자한다. 61

76 Table 3.1 Docking results of Rab GAP domain of AS160 and TBC1D1 with Rab proteins using Hex, according to E-total (KJ/mol) Rab GAP domain of AS160 Rab GAP domain of TBC1D1 Rab1A Rab2A Rab4A Rab4B Rab5A Rab Rab Rab8A Rab11A Rab11B Rab Rab Rab

77 Table 3.2 Docking results of Rab GAP domain of AS160 and TBC1D1 with Rab proteins using ClusPro, according to size of cluster Rab GAP domain of AS160 Rab GAP domain of TBC1D1 Members Center Lowest Lowest Members Center energy energy Rab1A Rab2A Rab4A Rab4B Rab5A Rab Rab Rab8A Rab11A Rab11B Rab Rab Rab

78 Table 3.3 Calculated interaction energy of Rab GAP domain of AS160 and TBC1D1 with Rab proteins using Hex (kcal/mol) Free energy of Rab protein AS160 Free energy of Interaction complex energy TBC1D1 Free energy of Interaction complex energy Rab1A Rab2A Rab4A Rab4B Rab5A Rab Rab Rab8A Rab11A Rab11B Rab Rab Rab

79 (a) (b) (c) (d) (e) (f) Figure 3.1 The docking results using Hex. Rab GAP domain of AS160 and (a) Rab1A, (b) Rab2A, (c) Rab11B. Rab GAP domain of TBC1D1 and (d) Rab1A, (e) Rab4A, (f) Rab4B. (viewing in PyMOL) 65

80 Table 3.4 Calculated interaction energy of Rab GAP domain of AS160 and TBC1D1 with Rab proteins using ClusPro (kcal/mol) Free energy of Rab protein AS160 Free energy of Interaction complex energy TBC1D1 Free energy of Interaction complex energy Rab1A Rab2A Rab4A Rab4B Rab5A Rab Rab Rab8A Rab11A Rab11B Rab Rab Rab

81 (a) (b) (c) (d) (e) (f) Figure 3.2 The docking results using ClusPro. Rab GAP domain of AS160 and (a) Rab1A, (b) Rab7, (c) Rab21. Rab GAP domain of TBC1D1 and (d) Rab1A, (e) Rab7, (f) Rab14. (viewing in PyMOL) 67