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1 Korean Journal of Microbiology (2016) Vol. 52, No. 2, pp pissn DOI eissn Copyright c 2016, The Microbiological Society of Korea 보문 Alcaligenes faecalis NS13 에의한호기성종속영양질산화및탈질화 정택경 1 라창식 2 조기성 3 송홍규 1 * 1 강원대학교생명과학과, 2 강원대학교동물자원과학부, 3 한국외국어대학교생명공학과 Characterization of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by Alcaligenes faecalis NS13 Taeck-Kyung Jung 1, Chang-Six Ra 2, Ki-Seong Joh 3, and Hong-Gyu Song 1 * 1 Department of Biological Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Republic of Korea 2 Division of Animal Resource Science, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Republic of Korea 3 Department of Bioscience and Biotechnology, Hankuk University of Foreign Studies, Yongin 17035, Republic of Korea (Received March 31, 2016; Revised May 2, 2016; Accepted May 3, 2016) ABSTRACT: In order to find an efficient bacterial strain that can carry out nitrification and denitrification simultaneously, we isolated many heterotrophic nitrifying bacteria from wastewater treatment plant. One of isolates NS13 showed high removal rate of ammonium and was identified as Alcaligenes faecalis by analysis of its 16S rdna sequence, carbon source utilization and fatty acids composition. This bacterium could remove over 99% of ammonium in a heterotrophic medium containing 140 mg/l of ammonium at ph 6 9, C and 0 4% of salt concentrations within 2 days. It showed even higher ammonium removal at higher initial ammonium concentration in the medium. A. faecalis NS13 could also reduce nitrate and nitrous oxide by nitrate reductase and nitrous oxide reductase, respectively, which was confirmed by detection of nitrate reductase gene, napa, and nitrous oxide reducase gene, nosz, by PCR. One of metabolic intermediate of denitrification, N 2O was detected from headspace of bacterial culture. Based on analysis of all nitrogen compounds in the bacterial culture, 42.8% of initial nitrogen seemed to be lost as nitrogen gas, and 46.4% of nitrogen was assimilated into bacterial biomass which can be removed as sludge in treatment processes. This bacterium was speculated to perform heterotrophic nitrification and aerobic denitrification simultaneously, and may be utilized for N removal in wastewater treatment processes. Key words: Alcaligenes faecalis, aerobic denitrification, heterotrophic nitrification, nitrogen removal 자연환경에서질소의순환은생물서식지의안정적유지및생물체의생장에매우중요한데다양한질소전환중질산화반응은호기적조건에서화학무기영양성질산화세균에의해주로일어나며암모니움 (ammonium, NH + 4 ) 산화세균과아질산염 (nitrite, NO - 2 ) 산화세균이순차적으로관여한다 (Van Loosdrecht and Jetten, 1998). 질산화에의해생성된질산염 (nitrate, NO - 3 ) 은대부분혐기성종속영양세균에의한탈질화과정을통해질소기체 (N 2) 로까지환원된다. 질산화에이은탈질화는폐수처리시질소화합물을제거하는데매우중요하지만, 질산화와탈질화에관여하는미생물들의산소와유기물요구가상반되어, 대부분의처리공정에서각반응을순차적으 *For correspondence. hgsong@kangwon.ac.kr; Tel.: ; Fax: 로진행하기때문에질소제거공정이복잡하고또한효율도떨어지게된다 (Van Loosdrecht and Jetten, 1998). 그러나일부종속영양세균과진균이질소화합물의산화능을갖는것이보고되었으며 (Yoshida and Alexander, 1970; Sarioglu et al., 2012), 호기적조건에서도탈질화가일어날뿐만아니라 (Shi et al., 2013), 종속영양성질산화세균인 Alcaligenes sp. 가활발한탈질화를일으키는것이발견되었다 (Castignetti and Hollocher, 1981). 이런두가지상반된질소전환은폐수처리시질소제거에매우유리한특성이될수있다. 이에따라최근들어질산화및탈질화과정을동시에진행하는호기성질산화및탈질화 (simultaneous nitrification denitrification; SND) 에대한연구가활발히진행중에있으며관련세균으로 Bacillus methylotrophicus L7 (Zhang et al., 2012), Paracoccus versutus

2 호기성종속영양질산화및탈질화 167 (Shi et al., 2013), Acinetobacter calcoaceticus STB1 (Sarioglu et al., 2012), Alcaligenes faecalis NR (Zhao et al., 2012), Pseudomonas stutzeri YZN-001 (Zhang et al., 2011), Klebsiella pneumoniae CF-S9 (Padhi et al., 2013), Rhodococcus sp. CPZ24 (Chen et al., 2012) 등이보고되었다. 본연구는암모니움및질산염제거효율이우수하고환경의여러생장제한요소에도덜민감해서활용가치가높은종속영양호기성질산화및탈질화세균의선발을목적으로하였다. 실제폐수처리를위한여러환경조건에서균주의암모니움제거효율을측정하고탈질화작용의산물인아산화질소 (nitrous oxide, N 2O) 를측정하였으며탈질화에관여하는여러유전자의존재를조사하고암모니움이최종적으로변환되는형태를조사하였다. 재료및방법 균주분리및동정암모니움제거능이우수한균주를분리하기위해서강원도춘천시하수처리장의토양과슬러지시료를채취하였다. 채취한시료각 1 g을생리식염수 (0.85% NaCl) 35 ml에넣어교반후생리식염수로희석하였다. 희석액 0.1 ml를 ammonia oxidizing agar medium [AOAM: (NH 4) 2SO g, Na 2HPO g, KH 2PO g, MgSO 4 7H 2O 0.1 g, CaCl 2 2H 2O 0.18 g, NaHCO g, FeCl 3 6H 2O g, agar 15 g, DW 1 L)] 에도말하여 30 C에서 4일간배양하였다. AOAM에서순수분리될때까지획선배양하여얻은균주중가장빠르게자라는균주 NS13을선택하였다. 순수분리된균주의동정을위해 heterotrophic nitrification medium (HNM) (Zhang et al., 2012) 에서배양한 (160 rpm, 30 C, 2 day) 균주배양액에서 Xprep Tissue DNA Mini Kit (Philekorea Technology) 의매뉴얼에따라균주의 genomic DNA를추출한후 PCR을수행하였다. 16S rrna 유전자를증폭시키기위해서 forward primer 27f와 reverse primer 1492r를사용하였다. 추출한 g-dna를 PCR의 template로사용하였으며 10x taq polymerase buffer 2.5 μl, 2.5 mm dntp 2 μl, 10 pmol primer 각각 1 μl, Ex-taq polymerase (TaKaRa) μl, template 2 μl를섞고증류수를추가하여최종적으로 25 ml로보정하였다. PCR을수행한조건은 94 C 에서 5분, 94 C에서 30초, 49 C에서 30초그리고 72 C에서 1분으로이루어진과정을 35 cycle 반복하였고마지막으로 72 C에서 10분을수행하였다. 증폭된 16S rrna 유전자염기서열은 ( 주 ) 마크로젠에분석을의뢰하였으며결과는 National Center for Biotechnology Information (NCBI, 등록균주들과상동성을비교하여동정하였다. 분리균주중암모니아와총질소제거능이가장높은 NS13 균주의배양특성을비교하기위해 Luria-Bertani 배지 (LB) 에서 24시간선배양후생리식염수로 2 3회세척하고 heterotrophic nitrification medium (HNM) (Zhang et al., 2012) 및 5% NaCl 이포함된 HNM에각각접종하였다. HNM은 42 C, 160 rpm 에서배양하였으며 5% NaCl이포함된 HNM은 30 C, 160 rpm 에서배양하여균주의생장유무를관찰하였다. 균주의탄소기질이용및지방산분석균주의탄소원이용을조사하기위해서 Biolog EcoPlate TM (Biolog, Inc.) 를이용하였다 (Garland and Mills, 1991). 균주배양액의 OD 600 측정치를 1.0으로보정한뒤각 well에 150 μl 를접종하였다. 접종된 plate는 20 C에서 7일간배양하며 24 시간간격으로분광광도계로 OD 590 을측정하였다. 측정결과가 0.5 이상일경우탄소기질의이용을양성으로간주하여 + 로표시하고 1.0 이상부터 0.5 간격으로 + 의수를더해서탄소기질이용상태를달리표시하였다. 균주의지방산을분석하기위해서 trypticase soy agar (TSA; trypticase soy broth 30 g, agar 15 g, 1 L 증류수 ) 에서배양하였으며비누화, 메틸화및추출은 Sasser (1990) 의방법을이용하였다. 분석에는 gas chromatography (GC; Agilent Technologies model 7890A) 를이용하였으며 column은 HP-5 column (30 m 0.32 mm 0.25 μm) (Agilent Technologies) 을사용하였다. 지방산의분석은 Microbial Identification System (MIDI Inc.) 의 RTSBA6 database를이용하였다. 질산화및탈질화과정조사배양액내의질소화합물을조사하기위해먼저균주를 LB 배지에서 24시간선배양 (160 rpm, 30 C) 후배양액의 OD 600 을측정하고현미경을이용하여직접계수하였다. 한편배양액을원심분리 (3,400 g, 4 C, 15 min) 하여상등액을제거하고침전물을생리식염수 (0.85% NaCl) 를이용하여 2 3회세척한뒤 99 ml의 HNM이들어있는플라스크에최종부피가 100 ml가되도록균주를 1% 접종하였다. 배지의초기암모니움농도는 mg/l이며, 배양 (160 rpm, 30 C) 중 24시간주기로질소대사산물을측정하였다. 암모니움측정은네슬러방법을이용하였으며 (APHA et al., 1995), 암모니움산화산물인하이드록실아민 (hydroxylamine, NH 2OH) 측정은 Frear와 Burrell Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 2

3 168 Jung et al. (1955) 의방법에따라측정하였다. 아질산염측정은디아조화방법을이용하였으며 (APHA et al., 1995), 질산염과총질소 (total nitrogen) 측정은 second derivative spectroscopy 방법을사용하였다 (Ferree and Shannon, 2001). 균주의생장은분광광도계를이용하여 OD 600 로측정하였다. 3일간의배양이끝난뒤암모니아검지관 (No. 3 L, Gastec) 과펌프 (GV-100S, Gastec) 를이용하여플라스크 headspace에존재하는암모니아가스를측정하여정량하였다. 한편탈질화의중간산물인아산화질소는플라스크의 headspace 기체를 3-way plastic syringe로 60 ml을뽑아내어 electron capture detector가장착된 GC (Varian 450, Varian Inc.) 를이용해측정하였다 (Won et al., 2014). 배지에서자라난세균은 0.45 μm 공극의여과막으로여과한후 Kjeldahl method를이용하여총질소를측정하였으며배지의총질소도동일한방법으로측정하였다 (APHA et al., 1995). 모든실험은 triplicate sample에대해실시하여평균치 ± 표준편차로나타내었다. 질산염환원효소유전자조사주변세포질질산염환원효소유전자, napa를조사하기위해서 Klatte 등 (2011) 이 forward primer LF716 (5 -GCNGAR ATGCACCC-3 ) 와 reverse primer SR2294 (5 -GWRTGCCA RTGNTC-3 ) 를사용한 touchdown PCR protocol를변형하여이용하였으며앞에서추출된균주의 genomic DNA를 template 로사용하였다. PCR은 95 C에서 5분, 95 C에서 30초, 42.5 C 에서 30초그리고 72 C에서 2분 30초로이루어진과정을 35 cycle 반복하였고마지막으로 72 C에서 10분동안수행하였다. PCR을통해증폭된 DNA의크기를확인하기위해 PCR 산물과 6x DNA loading dye를 5:1로섞어 1% agarose gel에 100 V로약 30 40분간전기영동하여 band의위치를관찰하였다. 아산화질소환원효소유전자, nosz를조사하기위해서 forward primer noszf (5 -CGYTGTTCMTCGACAGCCAG-3 ) 와 reverse primer nosz1622r (5 -CGSACCTTSTTGCCSTY GCG-3 ) 을이용해서 Enwall 등 (2005) 이보고한 touchdown PCR protocol를변형하여증폭하였으며앞에서추출된균주의 genomic DNA를 template로사용하였다. PCR은 94 C에서 2분, 94 C에서 30초, 60 C에서 30초그리고 72 C에서 2분 30 초로이루어진과정을 10 cycle 반복하였고 94 C에서 30초, 58 C에서 30초그리고 72 C에서 2분 30초로이루어진과정을 15 cycle 반복한뒤마지막으로 72 C에서 10분동안수행하고 band의크기를조사하였다. 세균의분리와동정 결과 강원도춘천시하수처리장토양으로부터 AOAM 배지내암모니움을산화시켜빨리생장하는집락을순수분리하여그것의높은암모니움산화능을측정후 HNM 배지에서의생장여부및질소제거를확인하고최종적으로세균균주 NS13을선발하였다. 균주동정을위한 16S rrna 유전자염기서열분석결과 A. faecalis IAM12369 (GenBank accession number Table 1. Metabolic profile of A. faecalis NS13 as tested in Biolog EcoPlate TM assay during 7 days a Substrate A. faecalis NS13 Tween Tween α-cyclodextrin Glycogen D-Cellobiose α-d-lactose β-methyl-d-glucoside D-Xylose i-erythritol D-Mannitol N-Acetyl-D-glucosamine Glucose-1-phosphate D,L-α-glycerol phosphate D-Galactonic acid γ-lactone 2-Hydroxy benzoic acid 4-Hydroxy benzoic acid Pyruvic acid methyl ester +++ D-Galacturonic acid D-Glucosaminic acid γ-hydroxybutyric acid Itaconic acid α-ketobutyric acid +++ D-Malic acid L-Arginine L-Asparagine +++ L-Phenylalanine ++++ L-Serine + L-Threonine ++ Glycyl-L-glutamic acid Phenylethyl-amine Putrescine a, OD < 0.5; +, 0.5 < OD < 1.0; ++, 1.0 < OD < 1.5; +++, 1.5 < OD < 2.0; ++++, 2.0 < OD 미생물학회지제 52 권제 2 호

4 호기성종속영양질산화및탈질화 169 NR ) 와 98.0% 로가장높은상동성을보였다. 그람염색결과그람음성세균으로운동성이있는작고짧은간균의형태로관찰되었다. 또한 5% 의 NaCl이포함된 HNM에서도생장이일어났으며 42 C에서도 3일이후부터생장이활발히일어났다. 균주의탄소기질이용및지방산분석 NS13 균주의동정을위한생리학적특성을조사하기위해총 31개의탄소기질에대한활성도를측정하였다. 대조군대비 OD 이상을탄소기질을이용하는것으로판단한결과총 8종류의탄소기질인 Tween 40, Tween 80, pyruvic acid methyl ester, α-ketobutyric acid, L-asparagine, L-phenylalanine, L-serine 및 L-threonine을이용하는것으로나타났다. 이중 L-phenylalanine을이용할때가장높은활성을보였다 (Table 1). TSA에서 24시간배양한 NS13 균주의지방산을 GC를이용해서측정한결과주요성분으로는 C 16:0 (36.36%), C 17:0 cyclo (35.21%), Summed feature 2 a (C 12:0 aldehyde?; 8.51%) 및 Summed feature 3 b (C 16:1 ω7c and/or C 16:1 ω6c; 4.88%) 으로구성되었다. C 10:0, C 12:0, C 12:0 2-OH, C 14:0, C 18:0, C 19:0 cyclo ω8c, Summed feature 5 c (C 18:0 ante and/or C 18:2 ω6,9c) 및 Summed feature 8 d (C 18:1 ω7c) 는 1 2% 였으며 C 12:0 3-OH, C 16:0 3-OH, C 16:0 ω5c, C 17:0, C 17:1 ω7c, C 17:1 ante iso ω9c와 C 19:0 는 1% 이하로 측정되었다 (Table 2). 암모니움제거에미치는환경요인의영향배양온도에따른 NS13 균주의암모니움제거율을조사한결과온도가높아짐에따라암모니움제거율이증가하였다. 특히, 25, 30 및 37 C에서는배양 2일째에약 99% 이상제거되었으며, 20 C에서는 3일째에 99% 이상제거되었고 15 C에서는제거율이다소떨어지지만 7일째약 88% 이상의암모니움이제거되었다 (Fig. 1). 염분농도에따른 NS13 균주의암모니움제거율을조사한결과염분농도가높아짐에따라암모니움제거율이감소하였다. NS13 균주의생장에는염분농도가크게영향을미치지않는것으로보였지만암모니움의제거율에서는차이가뚜렷하게나타났다. 배양 1일째에염분농도가 0% 인 HNM에서암모니움제거율이약 94% 인것에반해염분농도가 4% 일때는약 73% 를나타내었다. 그러나 2일째에는염분농도와관계없이약 99% 이상의암모니움제거율을보였다 (Fig. 2). ph에따른 NS13 균주의암모니움제거율을조사한결과배양 1일째에 ph 9에서암모니움제거율이약 88 % 이상으로가장높았으며배양 2일째 ph 6 9 조건에서암모니움의제거율이 99% 이상측정되었다. 반면동시간대 ph 5와 10에서는각각약 50 및 74% 제거율을보였지만 4일째약 98% 이상암모 Table 2. Fatty acid composition of A. faecails NS13 * Fatty acids A. faecalis NS13 Fatty acids A. faecalis NS13 C 10: C 17:0 cyclo C 10:0 3-OH - C 17:1 ω7c tr C 12: C 17:1 ω8c - C 12:0 aldehyde - C 17:1 ante iso ω9c tr C 12:0 2-OH 1.58 C 18: C 12:0 3-OH tr C 18:1 2-OH - C 13:0 at C 18:1 ω7c - C 14: C 18:1 ω8c 11 methyl - C 14:0 2-OH - C 19:0 tr C 15:0 - C 19:0 cyclo ω8c 1.58 C 16: iso-c 19:0 - C 16:0 2-OH - C 20:2 ω6,9c - C 16:0 3-OH tr Summed feature 2 a 8.51 C 16:1 3-OH - Summed feature 3 b 4.88 C 16:0 ω5c tr Summed feature 5 c 1.02 C 17:0 tr Summed feature 8 d 2.3 * A. faecails NS13 was cultivated on TSA at 30 C for 1 day before harvesting cell mass. -, not detected; tr, < 1% of the total fatty acids. Summed feature could not be separated using the MIDI system. a Summed feature 2 comprises C 12:0 aldehyde. b Summed feature 3 comprises C 16:1 ω7c and/or C 16:1 ω6c. c Summed feature 5 C 18:0 ante and/or C 18:2 ω6,9c. d Summed feature 8 comprises C 18:1 ω7c. Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 2

5 170 Jung et al. 니움을제거하였다. 암모니움의제거율과비슷하게 NS13 균주의생장도 ph 6 9에서는활발한것에반해 ph 5와 10에서는초기에더딘생장을보였다 (Fig. 3). 초기암모니움농도에따른 NS13 균주의암모니움제거율 (A) 을조사한결과암모니움의초기농도증가에따라하루동안암모니움을제거하는양도증가되었다 mg 이하의암모니움이포함되어도 2일째에 99% 이상제거되었다. 농도가높아짐에따라암모니움제거효율이증가되었는데, 4일째에암모니움의농도가 300 mg/l 일때하루에 55.2 mg/l를제거시켰으며, 가장높은 1,500 mg/l일때는 mg/l의암모니움이제거되었다 (Table 3). (A) (B) (B) Fig. 1. Growth curve (A) and ammonium removal (B) by A. faecalis NS13 in HNM at different temperature of 15 ( ), 20 ( ), 25 ( ), 30 ( ), and 37 C ( ). Values are means ± SD (error bars) for triplicate. (A) Fig. 3. Growth curve (A) and ammonium removal (B) by A. faecalis NS13 in HNM at 30 C and initial ph of 5 ( ), 6 ( ), 7 ( ), 8 ( ), 9 (+), and 10 ( ). Values are means ± SD (error bars) for triplicate. Table 3. Ammonium removal by A. faecalis NS13 a (B) Fig. 2. Growth curve (A) and ammonium removal (B) by A. faecalis NS13 in HNM at 30 C and salt concentration of 0 ( ), 1 ( ), 2 ( ), 3 ( ), and 4% ( ). Values are means ± SD (error bars) for triplicate. Initial NH 4 + -N (mg/l) Final NH 4 + -N (mg/l) Removal efficiency (mg/d) ± ± ± ± ± ± ± ± ± a A. faecalis NS13 was cultivated for 4 days (30 C, 160 rpm) in heterotrophic nitrification medium (HNM) with different initial ammonium concentration. 미생물학회지제 52 권제 2 호

6 호기성종속영양질산화및탈질화 171 암모니움제거에따른질소평형 HNM에서배양한 NS13 균주에의해제거되는암모니움뿐만아니라질산화과정시발생되는하이드록실아민, 아질산염, 질산염및암모니움가스와탈질화시발생하는아산화질소를측정하고또한 HNM의총질소량을측정하였다. 최종적으로암모니움은 0.21 mg/l이남아 99% 이상제거되었으며하이드록실아민, 아질산염및질산염은각각 0.68, 0.67 및 mg/l로측정되었다. 암모니아가스는검출되지않았고, 아산화질소는 mg/l로측정되었다. HNM의총질소량은 mg/l로최종적으로약 42.8% 의질소가제거되었다 (Table 4). 탈질화유전자조사 탈질화과정중질산염을아질산염으로환원시키는데관여하는유전자를조사한결과 1,800 bp 크기의질산염환원효소유전자, napa의존재를 PCR 증폭된 band로확인하였다 (Fig. Table 4. Change of nitrogen compounds in heterotrophic nitrification medium (HNM) by A. faecalis NS13 after 3 days of incubation Nitrogen compounds Time 0 Day 3 NH + 4 -N (mg/l) ± 0.23 NH 2OH-N (mg/l) ± 0.14 NO - 2 -N (mg/l) ± 0.18 NO - 3 -N (mg/l) ± 0.78 NH 3 (mg/l) 0 0 ± 0 N 2O (mg/l) ± 9.33E-09 Bacterial total nitrogen (mg/l) ± 0.86 Total nitrogen (mg/l) ± 1.17 % N lost Fig. 4. Detection of denitrification genes, periplasmic nitrate reductase gene, napa (A, M; 1 kb ladder) and nitrous oxide reductase gene, nosz (B, M; 100 kb ladder) in A. faecalis NS13. 4A). 또한탈질화과정중아산화질소를질소로환원시키는데관여하는유전자를조사한결과 453 bp 크기의아산화질소환원효소유전자, nosz의 band를확인하였다 (Fig. 4B). 고찰 본연구에서는호기적인조건에서질산화와탈질화를모두수행하여암모니움제거효율이우수한세균균주 NS13을분리하고 16S rrna 유전자의염기서열을분석하여동정한결과 A. faecalis IAM12369와 98% 의상동성을보였다. 동정의신뢰도를높이기위해서 A. faecalis NS13 균주를 42 C에서배양한결과다소느리지만생장이 3일째부터활발하였으며 5% 의 NaCl이포함된 HNM에서도생장하였다. 이는 A. faecalis subsp. parafaecalis (Schroll et al., 2001), A. defragrans (Foss et al., 1998) 와 A. aquatilis는 42 C에서배양되지않지만 (Van Trappen et al., 2005), A. faecalis는소량의 NaCl 및 42 C에서생장한다고보고와일치하는결과이다 (Rehfuss and Urban, 2005; Yokoyama et al., 2012). NS13 균주의지방산을분석한결과 C 16:0 와 C 17:0 cyclo가가장높은수치를나타냈으며각각 36.36% 와 35.21% 로측정되었다 (Table 2). 이는 A. faecalis LMG1229 T 균주의주요지방산구성성분이 C 16:0 와 C 17:0 cyclo 로각각 36.8% 와 28.8% 를차지하고있다는결과와유사하다. A. aquatilis (Van Trappen et al., 2005) 는지방산구성비율이 NS13 균주와유사하였지만 C 17:0 cyclo가 13.3% 로 NS13 균주의 35.21% 와는큰차이를보였다. 또한 A. defragrans 54Pin (Foss et al., 1998) 균주는 C 12:0 과 C 15:0 가차지하는비율이각각 5.9% 와 2.2% 인것에반해 NS13 균주는각각 1.57% 와 0% 로측정되어지방산구성비율의차이를보였다. 이와같은분석을통해 NS13 균주는최종적으로 A. faecalis로동정되었다. 배양온도에따른 A. faecalis NS13의생장율과암모니움 ( 초기농도 mg/l) 제거율을측정한결과 C에서 48시간이내에 99% 이상의제거율을보였으며기존에알려진 A. faecalis 종의최적생장온도인 37 C에서가장활발하게생장을하였으며온도가낮아짐에따라서생장율도같이감소하는경향을보였다 (Fig. 1). 이는질산화및탈질화가우수하다고보고된 Bacillus methylotrophicus L7 (Zhang et al., 2012) 이 37 C에서암모니움제거율이약 78% 이며, 또한같은농도의암모니움을 78% 까지제거하는데걸리는시간이 108시간이며초기접종량도 2배에이른다는점에서 A. faecalis NS13의암모니움제거율이월등히우수하다는것을알수있다. 또한적용온도범위도훨씬광범위한데, B. methylotrophicus L7은 Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 2

7 172 Jung et al. 20 C에서약 10% 의암모니움을제거시킨반면 A. faecalis NS13은 20 C에서 72시간이내에동량의암모니움을 99% 이상제거시켰다. Paracoccus versutus LYM은 30 C에서 120 mg/l의암모니움을최종적으로약 75% 를제거했다고보고되었으며 (Shi et al., 2013), Klebsiella pneumoniae CF-S9는 30 C 에서 24시간동안 4.3 mg/l/h의암모니움을제거하였다고보고되었다 (Padhi et al., 2013). 배지조성과배양조건이약간다르지만초기암모니움농도가 120 mg/l이었으며 18시간후에균주의생장이정체기인것을감안한다면비록 A. faecalis NS13과 24시간이전의암모니움제거율은비슷할지라도 K. pneumoniae CF-S9 균주를계속배양하여도 85% 의제거율이상으로증가되지않았을것으로생각된다. 반면에 A. faecalis NS13은 24시간이지나도생장기단계였으며암모니움제거가계속진행되어 48시간이전에약 140 mg/l의암모니움을제거하였다. 염분농도가높을수록질산화과정이억제되며실제로염분농도가 2% 보다높을경우질산화반응이억제된다고보고되었다 (Ludzack and Noran, 1965). A. faecalis NS13은 0 4% 의염분이포함된배지에서염분농도가높아짐에따라 24시간이내에암모니움제거율은다소떨어졌지만 48시간이내에염분농도와관계없이 99% 이상암모니움을제거하였다 (Fig. 2). 특히 24시간이내에 0% 염분농도의 HNM에서암모니움제거율은약 5.5 mg/l/h로가장높았다. 같은조건에서 108시간동안 B. methylotrophicus L7의암모니움제거약 84%, 제거율 1.08 mg/l/h (Zhang et al., 2012) 에비하면훨씬우수하다. 염분농도가 4% 인배지에서는 B. methylotrophicus L7에의해최종적으로제거된암모니움양은 39.5% 로급격히떨어진반면에 A. faecalis NS13은 24시간이내에 4.3 mg/l/h으로염분농도가 0% 일때보다는제거율이약간떨어졌지만훨씬이른시간에동량의암모니움을 99% 이상제거하였다. 또한배지조성및배양조건이약간다르지만염분농도가약 3.5% 에서생장할수있는 Acinetobacter calcoaceticus STB1이염분농도가 0.2% 인배지에서 72시간동안 100 mg/l의암모니움을약 93% 밖에제거하지못한것 (Sarioglu et al., 2012) 에비해서도상당히우수한결과이다. 산성보다는중성또는약염기성에서질산화반응이더빠르게일어난다고알려져있듯이 (Chang and Hao, 1996; Yokoyama et al., 2012), A. faecalis NS13 균주는배지의초기 ph가 7 9 범위일때생장및암모니움제거율이높았다 (Fig. 3). 질산화효율이높다고알려진 Alcaligenes sp. W1 균주는배지가산성화및염기성화되면서효율이떨어졌으며 ph 5와 10에서배양이되지않았던반면 A. faecalis NS13 균주는 ph 5와 10에서도생 장과동시에암모니움을상당량제거하였다. 배양후 24시간후에 ph 7 9에서각각 80, 84 및 88% 의암모니움을제거하였으며 ph 6과 10에서도 71% 와 72% 를제거시켰다. 48시간이전에 ph 6 9에서 99% 이상의암모니움제거율을보였으며 ph 5와 10에서는 99% 이상제거하는데걸리는시간이 96시간이었다. B. methylotrophicus L7 균주를같은조건에서실험했을경우 ph 7과 8에서각각 58.4와 55.0% 밖에암모니움을제거하지못했으며 ph 9에서는 30% 이하, ph 5, 6 및 10에서는 20% 이하로질산화에 ph의영향을상당히많이받았다 (Zhang et al., 2012). 온도외에초기암모니움농도가질산화세균에영향을미쳐서 mg/l인경우질산화활성이억제된다고보고되었다 (Fdz-Polanco et al., 1994). HNM에들어가는암모니움양을 50과 100 mg/l로낮춰서측정한결과 48시간이전에 99% 이상제거하였으며, 농도가높아짐에따라시간당암모니움제거율이증가하였다 (Table 3). B. methylotrophicus L7 균주가암모니움농도 427.4와 1,121.2 mg/l일때각각 41.2와 90.1 mg/l/d의제거율을나타내어암모니움농도증가에따른제거율증가를나타내었지만 (Zhang et al., 2012) A. faecalis NS13 균주의제거율이이보다훨씬높았다. 또한 Yang 등 (2011) 은 Bacillus subtilis A1 균주가암모니움농도가약 536 mg/l일때제거율이 4.1% 이었으며그이상농도이면생장및질산화활성이거의나타나지않았다고보고하였다. 초기암모니움농도약 300 mg/l이며염분농도 0% 인배지에서 A. faecalis OKK17 균주의암모니움제거율이 6.5 mg/l/h였다 (Nishio et al., 1998). A. faecalis NS13 균주는동시간대에암모니움제거율이 7.5 mg/l/h였으며, 염분농도가 3% 임에도불구하고제거속도가 A. faecalis OKK17 균주보다빨랐다. 뿐만아니라 A. faecalis OKK17 균주를 20시간이후계속배양한결과배양액내에암모니움양이오히려늘어난반면에 A. faecalis NS13 균주는지속적으로암모니움을제거하였다. 만약초기염분농도가 0% 였다면제거하는속도가월등히우수했을것으로생각된다. A. faecalis NS13 균주는초기암모니움농도가 1,500 mg/l일때제거효율이 56% 이상인것을감안하면더높은암모니움농도에서도질산화활성이나타날것으로기대된다. A. faecalis NS13 균주의질산화후여러질소화합물의농도를측정한결과 HNM에접종후 3일후에초기 mg/l의암모니움은 0.21 mg/l로감소하였으며가스상태의암모니아는검출되지않았다. 질산화과정시생성되는중간산물들인하이드록실아민, 아질산염및질산염은각각 0.68, 0.67 및 mg/l로상당히낮은수준을유지하였다. A. faecalis 미생물학회지제 52 권제 2 호

8 호기성종속영양질산화및탈질화 173 NS13 균주의탈질화에의해서생성된중간산물중하나인아산화질소는 mg/l로상당히소량존재하였다. 배지에남아있는모든질소성분및 A. faecalis NS13 균주에동화되어들어간질소를포함한총질소량을측정한결과처음 mg/l에서 mg/l로감소하였다 (Table 4). A. faecalis NS13 균주와같은종으로기존에보고된 A. faecalis NR 균주 (Zhao et al., 2012) 결과와비교하면하이드록실아민과아질산염은극히소량이며질산염은 mg/l사이를유지하고, 아산화질소도미량측정되었다. 비록 A. faecalis NS13 균주를대상으로최종물질인 N 2 를측정하지는않았지만기존의보고된결과와탈질화에관여하는유전자인 napa와 nosz 의존재를 PCR 증폭을통해서확인했기때문에 (Fig. 4) 질소화합물이 N 2 로상당량전환되었을것으로생각된다. 호기적인조건에서탈질화가일어난다고보고된 K. pneumoniae CF-S9 균주에서도동일한 primer를이용해서 napa의존재가확인되었다 (Padhi et al., 2013). 아산화질소의질소기체로의반응은 nosz 유전자에의해서일어나며 Enwall 등 (2005) 은탈질화세균의군집을조사할때 nosz 유전자를마커로사용하였다. 따라서 A. faecalis NS13 균주의 DNA에서 napa와 nosz 유전자의존재는호기적인조건에서질산화뿐만아니라탈질화과정이동시에진행될수있다는또다른증거가될수있다. 배양후배지안에남아있는총질소화합물은약 15 mg/l정도이며 NS13 균주에동화된양은약 65 mg/l이었다. 따라서실제폐수처리시 A. faecalis NS13 균주의질산화및탈질화가끝난뒤에세포물질을슬러지로처분한다면약 90% 의암모니움제거효과를거둘수있을것이다. 이는 Zhao 등 (2012) 이질산화및탈질화가우수하다고보고한 A. faecalis NR 균주를이용해서초기암모니움농도가비슷한폐수처리시약 79% 의암모니움제거율보다 11% 더높다. 다양한온도, ph, 염분농도및초기암모늄이온농도조건에서암모니움제거율이우수한호기성종속영양질산화및탈질화세균 A. faecalise NS13 균주는폐수처리시질소제거미생물제로서가치가있다고판단된다. 적요 호기적조건에서질산화와탈질화를동시에진행하는 Alcaligenes faecalis NS13 균주를분리하여다양한특성을파악하였다. 이균주는 C 온도에서생장할수있으며암모니움산화율이높고고농도의암모니움환경에서도생장이저해되지않고초기암모니움농도증가에따라제거량이증 가하였다. ph와염분농도에대해서도내성범위가넓어암모니움산화가영향을받지않았다. 질산화에이어진탈질화로인해질산염의축적이일어나지않았으며탈질화의중간산물인아산화질소는미량검출되었지만배양후모든질소화합물을측정한결과약 42.8% 가 N 2 로전환된것으로추정되었다. 탈질화는 PCR 증폭을통해서탈질화에관여하는유전자 nitrate reductase gene, napa과 nitrous oxide reductase gene, nosz의존재로뒷받침되었다. 또한배지내질소의 46.4% 가 NS13 균주로동화되었기때문에폐수처리시질산화및탈질화후에슬러지로처분한다면실질적으로 89% 이상의우수한암모니움의제거효과를거둘수있을것이다. 감사의말 이논문은 2012년중소기업청연구비지원 (C ) 에의해수행되었으며이에감사드립니다. References APHA, AWWA, and WPCF Standard methods for the examination of water and wastewater, 19th ed. pp American Public Health Association, Washington, DC, USA. Castignetti, D. and Hollocher, T Vigorous denitrification by a heterotrophic nitrifier of the genus Alcaligenes. Curr. Microbiol. 6, Chang, C.H. and Hao, O.J Sequencing batch reactor system for nutrient removal: ORP and ph profiles. J. Chem. Technol. Biotechnol. 67, Chen, P., Li, J., Li, Q.X., Wang, Y., Li, S., Ren, T., and Wang, L Simultaneous heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by bacterium Rhodococcus sp. CPZ24. Bioresour. Technol. 116, Enwall, K., Philippot, L., and Hallin, S Activity and composition of the denitrifying bacterial community respond differently to long-term fertilization. Appl. Environ. Microbiol. 71, Fdz-Polanco, F., Villaverde, S., and Garcia, P Temperature effect on nitrifying bacteria activity in biofilters: activation and free ammonia inhibition. Water Sci. Technol. 30, Ferree, M. and Shannon, R Evaluation of a second derivative UV/visible spectroscopy technique for nitrate and total nitrogen analysis of wastewater samples. Water Res. 35, Foss, S., Heyen, U., and Harder, J Alcaligenes defragrans sp. nov., description of four strains isolated on alkenoic monoterpenes (+)-menthene, α-pinene, 2-carene, and α-phellandrene and nitrate. Syst. Appl. Microbiol. 21, Frear, D. and Burrell, R Spectrophotometric method for Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 2

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