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혜선 도
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1 Journal of the Korean Chemical Society 2012, Vol. 56, No. 5 Printed in the Republic of Korea Horseradish peroxidase 가변성된탄소복합바이오센서개발및전기화학적 H 2 O 2 분석 박덕수 * 부산대학교바이오피지오센서연구소 ( 접수 ; 게재확정 ) Development of HRP-modified Carbon Composite Biosensor and Electrochemical Analysis of H 2 O 2 Deog-Su Park* Instititute of BioPhysio Sensor Technology, Pusan National University, Busan , Korea * dsupark@pusan.ac.kr (Received July 24, 2012; Accepted July 30, 2012) 요약. Horseradish peroxidase (HRP), alkoxysilane인 TEOS의겔용액과 graphite를혼합하여, 전기전도성을나타내고재사용이가능하며안정성을향상시킨 carbon composite electrodes (CCEs) 바이오센서를제작하였다. TEOS의졸-겔전이반응을이용하여 HRP를 silicate gel network포획시킨바이오센서는 -0.2 V에서 H 2O 2 의환원이시작되었으며, HRP의함량과 ph를변화시켜최적분석조건을구하였다. 분석최적조건에서검량선및검출한계를구한결과, 0.2~2.2 mm의 H 2O 2 농도범위에서직선적인감응을나타내며검출한계는 mm이었다. ascorbic acid, acetaminophene, uric acid의방해작용을조사한결과 H 2O 2 의전기화학적분석에영향을주지않았다. 주제어 : 졸 - 겔, 탄소복합, Horseradish peroxide, 바이오센서, 과산화수소 ABSTRACT. A sol-gel derived carbon composite electrodes (CCEs) were fabricated by mixing horseradish peroxidase (HRP), sol of tetraethoxysilane (TESO), and graphite powder. The HRP solution was added to the sol solution of TEOS, and then graphite powder was added to this mixture. The resulting carbon ceramic network effectively encapsulated HRP and shows a catalytic reduction starting at -0.2 V for H 2O 2. The optimum conditions for H 2O 2 determination have been characterized with respect to the enzyme loading ratio and ph. The linear range and detection limit of H 2O 2 detection were from 0.2 mm to 2.2 mm and mm, respectively. The common electroactive interferences such as ascorbic acid, acetaminophene, and uric acid were not affected upon the response to H 2O 2 at the HRP biosensor due to low detection potential. Key words: Sol-gel, Carbon composite, Horseradish peroxidase, Biosensor, Hydrogen peroxide 서론과산화수소 (H 2O 2) 는염색, 펄프, 수질처리, 추진제, 의약등의산업분야에서다양하게사용되고있을뿐아니라, 생체내에서대사과정에직접관여하거나대사과정의부산물 (side product) 로생성된다. 특히각종효소반응의결과로체액또는세포내외에서발생되는 H 2O 2 는특정질병진단을위한중요생체대사물로활용되고있다. H 2O 2 가참여하는대표적인효소로는 glucose를산화시키는 glucose oxidase (GOx) 가있으며, 이외에 alcohol oxidase (AlOx), lactate oxidase (LOx), cholesterol oxidase (ChOx) 등여러가지효소가있다. H 2O 2 를분석하는기기적인방법은 fluorimetry, chemiluminescence, fluorescence, spectrophotometry 가사용되고있으나, 1-4 분석과정이복잡하고선택성이떨어지는단점이있어전기화학적인분석법이많이연구되고있다. 전기화학적방법은전극에전압을가하여 H 2O 2 의산화 / 환원시흐르는전류를측정하는원리를사용하며전류법센서형태로제작하여구조가간단하고, 반도체기술과미세가공공정을통하여집적화 / 소형화시킬수있으며, 전기적신호를직접측정하므로감도및비용측면에서유리하다. 5 전류법센서제작시 H 2O 2 에대한감도와선택성을향상시키기위해 metal hexacyanoferrate, carbon nanotube, graphene, metal, metal oxide, 및 macrocyclic metal complex -571-

2 572 박덕수 등이사용되고있으나, 6-11 선택성측면에서 heme moiety를가지고있는 metalloprotein인 horseradish peroxidase (HRP) 를 probe로사용한전기화학적 biosensor 가가장많이사용되고있다 바이오센서 (biosensor) 는센서표면에분석대상물질과선택적으로감응하는 probe인생체수용체 (bio receptor) 를효과적이고안정적으로고정시키는것이중요하며, HRP를바이오센서표면에고정시키기위해 silica solgel, conducting polymer, ionic liquid, self-assembly monolayer, layerby-layer assembly가일반적으로사용되고있다 이들방법중 silica sol-gel법은 alkoxysilane의다공성겔지지체내에 HRP를포획 (entrapment) 시켜바이오센서표면에고정시키는방법으로, HRP 고정시편의성과안정성을동시에확보할수있어많이연구되고있다 Alkoxysilane의졸-겔전이반응은 alkoxysilane, 촉매 ( 산또는염기 ), co-solvent인알콜과물을적당한몰비로혼합하여저어주는단순한과정으로간단하게겔로전이되어 silicate 유리 network를형성한다. 26,27 Alkoxysilane의졸- 겔전이는 hydrolysis와 condensation 과정을거쳐상온에서도일어나열에의한생체수용체의변성을최소화할수있고, alkoxysilane의 silicate 유리는열적으로안정할뿐아니라전기화학적으로비활성이기때문에생체수용체의고정이용이하고응용성이매우크다. Alkoxysilane의 silica gel은전기전도성을가지지않으므로 alkoxysilane의 silica gel에포획된 HRP바이오센서는주로전도성고체 (glassy carbon, Pt, Au, ITO glass, carbon paste) 표면에얇은막형태로 gel을입혀사용하고있다 얇은막에고정된 HRP 바이오센서는막의안정성을향상시키기위해전도성고분자, chitosan 등을혼합하여사용하고있으나장기적인안정성이떨어져재사용이어려운단점이있다. 이를보완하기위해 alkoxysilane의 gel용액과 graphite를혼합하여, 전기전도성을나타내고재사용이가능하고안정성을향상시킨 carbon composite electrodes (CCEs) 가연구되고있다. CCEs는효소가포획된 silica gel 과 graphite가잉크형태로균일하게반죽을형성하여, 전도성고체표면에막형태로입혀진 silica gel보다안정성이향상되어바이오센서전극재료로적합하다. Lev에의해개발된 CCEs는전극의전도성유지와변성제 (modifier) 의포획을동시에할수있어, 전기화학의지시전극, 전기화학적방법을이용한화학 / 바이오센서연구에응용되고있다 본연구에서는 alkoxysilane인 tetraethoxysilane(teos) 을사용한졸-겔전이반응을통하여 HRP를 silicate 유리 network에포획시킨후, graphite와혼합하여 CCEs형태의 HRP 바이오센서를제작하였다. 제작한 HRP 바이오센서의전기화학적특성을조사하고, H 2O 2 검출시 HRP의함 량, ph, 방해작용등에따른분석최적조건을조사하고검량선을작성하였다. 실 시약및기기탄소가루 (graphite powder) 는 Fisher Scientific 의 No. 38을사용하였다. 완충용액제조시사용된 KH 2PO 4, K 2HPO 4 와효소인 horse radishoxidase(hrp, EC from Aspergillus niger, 150 Units/mg), tetraethoxysilane(teos, 99%), HCl, ethanol, ascorbic acid, uric acid, acetaminophene, 및 H 2O 2 는 Aldrich Co.(99% 이상 ) 를이용하였다. 모든용액의제조에는 Millipore사의 milli-q를사용하여얻은탈이온화된 3차증류수를사용하였다. 전기화학실험은삼전극법을이용하였다. 작업전극은 HRP가포획된 CCE를사용하였고, 기준전극은 Ag/AgCl(3 M NaCl), 보조전극은백금선을각각사용하였다. 전위조절및전류측정을위해 potentiostat (BAS 100B/W) 를사용하였으며, 전류법을이용한전류측정시용액은 magnetic stirrer를이용하여 300 rpm의속도로저어주었다. HRP-carbon composite 바이오센서제조 1.0 ml TEOS, 0.2 ml 증류수, 10.0 µl 1.0 M HCl과 0.2 ml의에탄올을혼합하여저어주면서 1시간동안반응시켜겔용액을만든다. 완충용액에녹인 µl의 HRP 용액을미리제조한 0.2 ml 겔용액에넣고 10분동안 sonication 시킨후, 0.16 g의 graphite를 HRP가포획된겔용액에넣고유리막대로골고루저어주면서 HRP가포획된 graphite 반죽을제조한다. graphite 반죽을유리관 ( 지름 3 mm, 길이 50 mm) 한쪽면에 1 cm의높이로채운후, 유리관의다른 면으로구리선을 graphite 반죽에삽입하여 potentiostat를 CCE와연결하였다. 유리관에채운 CCE는상온에서 24시간동안건조하였으며, 측정전에유산지 (weighing paper) 로표면을처리하여사용하였다. HRP의함량은 graphite 대고체 HRP의질량퍼센트 (wt%) 로환산하여 0.4~2.4 wt% 로변화시켰다. 험 결과및고찰 HRP 바이오센서의전기화학적특성및분석조건 TEOS는물의가수분해 (hydrolysis) 에의해 silanol groups (Si-OH) 이생기고, 축합반응 (condensation) 을통해 siloxane (-Si-O-Si-) 고분자형태의 3차원 silicate 유리 gel network 가생성된다. HRP는 silicate 유리 network 내에포획되어고정된다. 포획되어있는 HRP의촉매작용에의해 H 2O 2 Journal of the Korean Chemical Society

3 Horseradish peroxidase 가변성된탄소복합바이오센서개발및전기화학적 H 2O 2 분석 573 는다음과같이반응한다. H 2O 2 + HRP(red) H 2O + HRP(ox) TEOS 겔 network는 H 2O 2 와같이작은분자들을통과시킬수있으며, 겔 network에고정되어있는 HRP에의해 H 2O 2 는 H 2O로환원이일어나며, 이때전류가흐르게된다. 환원시흐르는전류는 H 2O 2 의농도가증가하면커지게된다. H 2O 2 환원에대한 HRP 바이오센서의특성을알아보기위해, 순환전압전류법 (cyclic voltammetry) 및전류법 (amperometry) 을이용하여전기화학적특성을조사하였다. phosphate 완충용액 (0.1 M, ph 7.0) 에들어있는 0.2 mm H 2O 2 용액에대해, HRP가고정되지않은 bare CCE와 HRP가고정된 HRP-CCE 바이오센서를이용하여 H 2O 2 에대한전압전류곡선 (cyclic voltammogram) 을얻었다 (Fig. 1). Bare CCE에서는 H 2O 2 의환원전류가흐르지않았으나, HRP-CCE 바이오센서의경우 -0.2 V에서 H 2O 2 의환원이 시작되어환원전위가증가하면전류도증가하였다. H 2O 2 에의한환원여부를확인하기위해 H 2O 2 의농도를증가시킨결과, 농도가증가하면환원전류도증가하여 -0.2 V 의전위에서흐르기시작하는전류는 H 2O 2 환원에의한전류임을확인하였다. 환원전위가증가하면 H 2O 2 의환원전류도증가하여 H 2O 2 분석시감도도좋아지나, 용액내용존산소와같은환원성물질들의환원에의한방해작용을최소화하기위해 -0.3 V를 H 2O 2 전류법분석시바이오센서에가하는전위로선택하였다. HRP-CCE 바이오센서를이용하여 H 2O 2 를전기화학적으로분석할경우, HRP-CCE 바이오센서의전극조성과측정용액의조건에따라바이오센서의감도가영향을받는다. Graphite 대고체 HRP의질량퍼센트 (wt%), 측정용 Fig. 2. (a) The effect of HRP loading for 0.2 mm H 2O 2 at HRP- CCE containing different HRP loading of 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0 and 2.4 wt%, respectively. Applied potential, -0.3 V; phosphate buffer solution (ph 7.0, 0.1 M); stirring rate, 300 rpm. (b) The effect of ph for 0.2 mm H 2O 2 at HRP-CCE biosensor. Applied potential, -0.3 V; HRP loading, 1.6 wt%; stirring rate, 300 rpm. Fig. 1. Cyclic voltammograms for 0.2 mm H 2O 2 at bare CCE (---) and HRP-CCE biosensor ( -). Phosphate buffer solution (ph 7.0, 0.1 M); Scan rate, 50 mv/sec. 액의 ph 변화에따른 H 2O 2 검출최적조건을전류법으로조사하였다 (Fig. 2). Fig. 1의전압전류곡선결과로부터전류법측정시 HRP-CCE 바이오센서에가하는전위는 -0.3 V 로하였으며, 측정동안 300 rpm의속도로용액을저어주었다. Fig. 2(a) 는 0.2 mm H 2O 2 용액 (phosphate 완충용액, 0.1 M, ph 7.0) 에대해, graphite 대고체 HRP의질량퍼센트 (wt%) 를 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0 및 2.4% 로변화시키면서전류크기를조사하였다. HRP의함량이증가함에따라전류도증가하였으며, HRP의함량이 0.8% 에서 1.2% 로증가하면 H 2O 2 의환원전류가크게증가하고, 1.6% 이상의 HRP 함량에서일정한전류를나타내었다. Fig. 2(b) 는 ph 6.0~8.5 범위에서 ph를변화시킬때, ph 변화에따른 0.2 mm H 2O 2 의전류변화를측정전압 -0.3 V에서 1.6 wt% HRP- CCE 바이오센서를이용하여조사하였다. ph 6.0에서 , Vol. 56, No. 5

4 574 박덕수 으로높아지면환원전류는증가하여 ph 7.0에서최대전류에도달하고, 이후의 ph에서는전류가감소한다. HRP 가최적의활성을나타내는 ph는 7.0로알려져있으며, HRP-CCE 바이오센서의최대전류가 ph 7.0에서관찰되므로포획된 HRP의활성이변하지않고유지되어 CCE가 HRP의고정에효과적임을알수있다. 이상의전류법결과로부터 H 2O 2 를분석할경우측정전압 V, HRP의함량 1.6% 및 ph 7.0을최적조건으로하여전류를측정하였다. H 2O 2 분석검량선작성및방해작용 Fig. 3에 H 2O 2 농도에따른 HRP-CCE 바이오센서의전류변화를전류법 (apmerometry) 으로조사하여검량선을나타내었다. Fig. 2에서구한 H 2O 2 분석최적조건 ( 측정전압 : -0.3 V, HRP 함량 : 1.6 wt%, ph 7.0) 에서 H 2O 2 의농도를 0.2 mm 단위씩변화시키면서시간에따른 HRP-CCE 바 Fig. 3. (a) Amperometric response of HRP-CCE biosensor for successive addition of 0.2 mm H 2O 2. (b) Calibration plot of HRP-CCE biosensor. Applied potential, -0.3 V; phosphate buffer solution (ph 7.0, 0.1 M); stirring rate, 300 rpm; HRP loading, 1.6 wt%. 이오센서의전류를측정하였다 (Fig. 3(a)). H 2O 2 의농도가증가함에따라전류도증가하며, 각농도에대하여센서의전류는 25초이내에최대전류에도달하였다. Fig. 3(a) 의시간 vs. 전류변화를농도 vs. 전류변화로나타내어검량선을작성하였다 (Fig. 3(b)). 0.2~2.2 mm의 H 2O 2 농도범위에서직선적인감응을나타내며, 2.4 mm 이상의고농도에서는직선에서벗어나는경향을나타내었다. 직선감응농도범위에서검량선의직선식은 y(µa)=1.2536(mm) 이며, R 2 =0.9922인우수한직선성을나타내었다. 0.5 mm H 2O 2 용액에서 5회반복측정하여구한센서신호의상대표준편차는 4.9% 였으며, 최적분석조건에서구한검출한계는 mm 이었다. HRP-CCE 바이오센서의분석특성을검증하기위해 ph 7.0 완충용액에 10 ml에최종농도가 0.2 mm이되도록 H 2O 2 를첨가하여최적조건에서 recovery test를실시하였다. 검량선을이용하여농도를측정한결과, mm에해당하는전류신호를나타내어 95.5% 의 recovery 효율을나타내었다. HRP-CCE 바이오센서의안정성을확인하기위해 2일에한번씩최적분석조건에서 0.2 mm H 2O 2 표준용액을이용하여전류신호를측정하였다. 3달동안조사한결과처음전류신호의 78% 가유지되어 HRP-CCE 바이오센서에서 HRP의활성이안정적으로유지되었다. 전기화학적으로생체시료 ( 혈액, 소변세포등 ) 에들어있는 H 2O 2 를검출할경우산화성물질들의산화에의한방해작용이분석의결과에영향을미치며, 대표적인방해물질들은 ascorbic acid, acetaminophene, uric acid 등이있다. 일반적으로대사과정에의해발생하는 H 2O 2 는 +0.6 V 보다큰전위에서산화가일어나며, 산화전위를가하여 H 2O 2 를분석할경우 ascorbic acid, acetaminophene, uric acid 등도동시에산화가일어나방해작용을일으킨다. 본연구에서사용한 HRP-CCE바이오센서는방해물질들의산화가일어나지않는전위에서 HRP의촉매작용에의해 H 2O 2 환원시흐르는전류를측정하므로방해물질들의산화에의한영향을최소화할수있다. Fig. 1의전압전류곡선의결과로부터 HRP-CCE 바이오센서는 ascorbic acid, acetaminophene, uric acid 의산화가일어나지않는 -0.3 V 의전위에서촉매환원전류를측정하여, 이들물질들의방해작용을전류법으로조사하였다. Fig. 4에분석최적조건에서 0.2 mm H 2O 2 용액에 0.1 mm의 ascorbic acid, acetaminophene, uric acid 을각각첨가한결과를나타내었다. H 2O 2 만존재할경우의전류크기를 100% 로하여환산하였을경우, ascorbic acid, acetaminophene, uric acid 를첨가하였을때각각 99.2%, 101.1% 및 99.0% 의전류값을나타내어세물질의방해작용이거의일어나지않음을확인하였다. Journal of the Korean Chemical Society

5 Horseradish peroxidase 가변성된탄소복합바이오센서개발및전기화학적 H 2O 2 분석 575 REFERENCES Fig. 4. Interference effect of HRP-CCE biosensor for successive addition of 0.1 mm ascorbic acid, acetaminophene, and uric acid. Applied potential, -0.3 V; phosphate buffer solution (ph 7.0, 0.1 M); stirring rate, 300 rpm; HRP loading, 1.6 wt%. 결 본연구에서는 Horseradish peroxidase (HRP), alkoxysilane 인 TEOS의겔용액과 graphite를혼합하여전기전도성을나타내고재사용이가능하며안정성을향상시킨 carbon composite electrodes (CCEs) 바이오센서를제작하였다. TEOS의졸-겔전이반응을이용하여 HRP를 silicate gel network포획시킨후, graphite와혼합하여유리관에채운후 H 2O 2 를전기화학적으로검출하였다. 전압전류법및전류법을이용하여 H 2O 2 에대한바이오센서의전기화학적인특성과 H 2O 2 분석최적조건및방해작용을조사하였다. silicate gel network에포획된 HRP의촉매작용에의해 H 2O 2 는 -0.2 V부터환원전류가나타났으며, HRP의함량및 ph에따른바이오센서의감응특성을조사하여 H 2O 2 분석최적조건을구하고검량선및검출한계를구하였다. 전류법으로 H 2O 2 를분석할경우측정전압 V, HRP의함량 1.6 wt% 및 ph 7.0을최적조건으로하여전류를측정하였고, 0.2 mm~2.2 mm의 H 2O 2 농도범위에서직선적인감응을나타내며최적조건에서검출한계는 mm 이었다. H 2O 2 표준물을이용하여 recovery test를실시하여바이오센서의성능을평가하고, ascorbic acid, acetaminophene, uric acid의방해작용을조사한결과 H 2O 2 의전기화학적분석에영향을주지않았다. Acknowledgments. 이논문은 2009년도정부 ( 교육과학기술부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업임 (No ). 론 1. Lee, J. H.; Tang, I. N.; Weinstein-Lloyd, J. B. Anal. Chem. 1990, 62, Hanaoka, S. Anal. Chim. Acta 2001, 426, Fernandes, E.; Gomes, A.; Lima, J. L. F. C. J. Biochem. Biophys. Methods 2005, 65, Nogueira, R. F. P.; Oliveria, M. C.; Paterlini, W. C. Talanta 2005, 66, Wang, J. Biosens. Bioelectron. 2006, 21, Karyakin, A. A. Electroanalysis 2001, 13, Wang, J.; Musameh, M. Anal. Chem. 2003, 75, Dong, S. J.; Zhou, M.; Zhai, Y. M. Anal. Chem. 2009, 81, Miscoria, S. A.; Barrera, G. D.; Rivas, G. A. Electroanalysis 2002, 14, Lin, Y. H.; Cui, X. L.; Li, L. Y. Electrochem. Commun. 2005, 7, Wang, K.; Xu J.-J.; Chen, H.-Y. Biosens. Bioelectron. 2005, 20, Wang, Y.; Ma, X.; Wen, Y.; Xing, Y.; Zhang, Z.; Yang, H. Biosens. Bioelectron. 2010, 25, Tang, B.; Li, F.; Feng, Y.; Wang, Z.; Yang L. M.; Zhuo, L. H. Biosens. Bioelectron. 2010, 25, Sun, L. X.; Xiang, C.; Zou, Y.; Xu, F. Sens. Actuators, B 2009, 136, Xu, J.; Shang, F.; Luong, J. H. T.; Razeeb, K. M.; Glennon, J. D. Biosens. Bioelectron. 2010, 25, Xian, Y. Z.; Wu, F. H.; Xu, J. J.; Tian, Y.; Hu, Z. C.; Wang L. W.; Jin, L. T. Biosens. Bioelectron. 2008, 24, Bi, S. P.; Di, J. W.; Zhang, M.; Yao, K. A. Biosens. Bioelectron. 2006, 22, Kong, Y. T.; Boopathi, M.; Shim, Y. B. Biosens. Bioelectron. 2003, 19, Safavi, A.; Maleki, N.; Moradlou, O.; Sorouri, M. Electrochem. Commun. 2008, 10, Razeeb, K. M.; Xu, J.; Shang, F. J.; Luong, J. H. T.; Glennon, J. D. Biosens. Bioelectron. 2010, 25, Feng, J. J.; Xu, J. J.; Chen, H. Y. Biosens. Bioelectron. 2007, 22, Tian, F.; Xu, B.; Zhu, L.; Zhu, G. Anal. Chim. Acta 2001, 443, Li, F.; Chen, W.; Tang, C.; Zhang, S. Talanta 2009, Chen, H.; Dong, S. Biosens. Bioelectron. 2007, 22, Smith, K.; Silvernail, N. J.; Rodgers, K. R.; Elgren, T. E.; Castro, M.; Parker, R. M. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, Brinker, C. J.; Scherer, G.W. Sol-gel Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing; Academic Press: New York, Klein, L. C. Sol-Gel Technology for Thin Films, Fibers, Performs, Electronics and Specialty Shapes; Noyes Publications: Park Ridge, NY, Shi, A. W.; Qu, F. L.; Yang, M. H.; Shen, G. L.; Yu, R. Q. 2012, Vol. 56, No. 5

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기구명 ph meter volumetric flask Erlenmeyer flask mass cylinder 뷰렛비이커 pipet 저울스탠드 & 클램프 isotonicity 측정기 필요량 500ml짜리 1개, 50ml짜리 5개, 100ml짜리 1개, 250ml짜리 6개

기구명 ph meter volumetric flask Erlenmeyer flask mass cylinder 뷰렛비이커 pipet 저울스탠드 & 클램프 isotonicity 측정기 필요량 500ml짜리 1개, 50ml짜리 5개, 100ml짜리 1개, 250ml짜리 6개 7. 완충용액 Introduction 일반적으로약산과그짝염기또는약염기와그짝산의혼합물로이루어진용액은외부에서산이나염기를첨가하여도 ph가크게변하지않는다. 이처럼 ph의변화에저항하는용액을완충용액이라한다. 이번실험에서는완충용액을직접제조하여그성질을파악하고완충방정식및완충용액을구해보고자한다. 또한산-염기중화적정곡선을 ph로부터그려보고이로부터산의해리상수도구하여보고자한다. Materials