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1 동의생리병리학회지제 21 권 6 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 21(6): , 2007 미생물발효영지버섯추출액의다당체에관한연구 황유연 정명수 김혜자 이기남 * 원광대학교한의과대학예방의학교실 Studies on the Polysaccharide of Ganoderma lucidium Extract by Microorganism Fermentation Yu Yeon Hwang, Myong Soo Chong, Hae Ja Kim, Ki Nam Lee* Department of Preventive Medicine, College of Oriental Medicine, Wonkwang University In order to investigate the totale yield, the content of soluble polysaccharide and the others of FEW extract from the yeast fermentated Ganoderma lucidium by supersonic method, the yeast strain was inoculated after pretreatment and subsequently followed fermentation and supersonic extract. The main construction of the extract method is composed of the main glucose and together with the xylose, fucose, galactose and mannose. Results show that because of the generated lactic acid and ethanol, ph value of extract decreases and the safety as well as the preservation is improved. The extract yield, the total soluble polysaccharide, SOD-like activity, cytotoxic effect and growth inhibitory effect against cancer cell line are much higher in FE method than RE method, especially FEW3 extracts fermented during 24hrs. It is concluded that yeast fermentation makes the extract yield increase because of the cell disintegration, the useful ingredients of the germ body, the metabolic products, the insoluble ingredients due to the generation of ethanol, and the cell fragmentation caused by the supersonic waves vibration. Content of generated ethanol, total soluble polysaccharide and extract yield all increase during the fermentation time from 24 to 72 hours and the optimum fermentation condition is at 27 for 72 hours. The bitter taste and smell of the Ganoderma lucidium extract is diminished, fragrant-bitter taste and smell is generated so that the whole functional quality is improved. Key words : Ganoderma lucidium, microorganism fermentation, polysaccharide, SOD-like activity 서론 영지버섯은구멍쟁이버섯과에속하는버섯으로赤芝, 黑芝, 靑芝, 白芝, 黃芝, 紫芝의 6종으로분류되어있으며, 우리나라에서재배되는것은주로赤芝이다. 영지버섯은예로부터귀중한약재로사용되어왔고최근에는인공재배에성공함으로써그약효성분의분리도가능하게되었다 1). 영지자실체는물또는유기용매로추출한것을맛보았을때가장특이한점은고미를나타낸다는것이다. 이쓴맛의성분이각종생리활성을나타내는것으로알려져있고이러한고미성분은액체배양한균사체에서는거의생성되지않지만자실체에서는갓의표면에집중되어있는것으로알려져있다 2). 이러한영지버섯은오래전부터진귀한신 * 교신저자 : 이기남, 전북익산시신용동 원광대학교한의과대학 kinam1@wonkwang.ac.kr, Tel : 접수 : 2007/10/17 채택 : 2007/11/23 약으로인식되어졌는데 < 神農本草經 > 에는생명에無毒이면서수명을연장한다는불로초로영지를기록하기도하였으며 3) 자양강장, 진정, 진통, 항종양, 혈압강하제로써그리고동맥경화, 기관지염, 만성관절염, 급만성간염등의치료에만병통치의약제로쓰여져왔다 4). 영지를이용한한의학적치료방법은영지를이용한한방적치료방법은 < 중약대사전 > 5) 에만성위장병, 만성기관지염, 기관지천식, 백혈구감소증, 관상동맥경화성심장병, 부정맥, 급성간염등에사용하는것으로되어있으며, 김등 6) 의연구에서는국내산재배영지추출수용성다당체 (Polysaccharides) 가흰쥐에투여하였을때육종이 87.6% 억제된다고보고하였으며, 다른연구 7-11) 에서는영지버섯추출물이항암효과를나타내어간암, 페암및기타여러암들에대한우수한치료및예방효과를가지고있어항종양활성이있다고보고하였다. 효모 (Yeast) 는진균류 (Fungi) 에속하는진핵생물로당을분

2 미생물발효영지버섯추출액의다당체에관한연구 해하여알코올과 CO 2 를만들어내는특징이있으며양질의단백질과무기질, 비타민 B군, 다당류등을많이함유하고 12) 있으며, 특히효모의세포벽속의 β-glucan 등은각종항암성면역강화기능이있는것으로보고되고있다 13). 본연구에서는각종약리기능이있는영지버섯추출물에효모균주에속하는 Saccharomyces cerevisiae를배양하여접종, 발효시킴으로써약리성분의추출을극대화하고유용성분의분자구조를분해시켜인체흡수율과이용률을상승시켜발효산물에의한부가적기능성이외에도맛, 냄새및기호도등을개선할수있는방법을연구하고실험하였다. 또한기존의고온추출방법을저온초음파추출방법으로전환하여고온추출에서발생하는유용성분의열손실을감소시키고초음파의세포파쇄기능 14) 을적용시켜추출수율특히효모세포벽속에함유되어있는 β-glucan 등을효율적으로추출할수있는지를연구하고효모발효조건을탐색하여최적의발효방법을실시하여유의한결과를규명하고, 영지버섯추출물의생리활성에대하여 SOD-like activity 활성, Nitric oxide 생성, 암세포저해율, IC50 값을측정, 실험한결과본연구에의한영지버섯발효초음파추출물이항산화기능, 성인병예방, 항암활성, 면역증강등의생리활성효과에있어유의한결과를얻었기에이에보고하는바이다. 을가하여 100 에서 1시간, 60 에서 2시간동안환류냉각열수추출기 (Daewoong, Korea, DWG-11,000R) 에서열수추출한후에여과지 (Whatman NO.2) 로여과하여원심분리기 (Sigma, USA) 로 7,500rpm에서 40분간원심분리하여상등액을 RE 추출액으로하고 REW로명명, 사용하였다. (2) 발효추출 (Fermented extraction: FE) 40mesh로습식분쇄한영지버섯시료 50 g에증류수 600 ml 을가하여 Autoclave(Sanyo, Japan) 에서 121 로 20분간멸균한후에효모배양액을 5% 접종하여배양기에서 27 의온도로각각 24 hr, 48 hr, 72 hr, 96 hr 동안발효시켰다. 그후각각의시료를 65 에서 15분간효소활성을실활시킨다음초음파 (Branson, USA, 3510-EDTH) 진동을 30분씩 2회가한후에여과지 (Whatman NO.2) 로여과하여원심분리기 (Sigma, USA) 로 7,500 rpm에서 40분간원심분리하여상등액을 FEW로하였으며, 발효시간에따라각각 FEW1(24hr), FEW2(48hr), FEW3(72hr), FEW4(96hr) 로명명, 사용하였다. REW와 FEW 제조방법을도식화하여 Fig. 1에나타내었다. 재료및방법 1. 재료본연구에사용한영지버섯은한국산재배영지버섯 (Ganoderma lucidium : 국내산 ) 을서울경동시장에서구입하여실험에사용하였으며, 효모는동결건조된 Saccharomyces cerevisiae 균주를 ( 주 ) 송은통상에서구입하여 -40 에보관하면서 YM액체배지 (yeast extract 3 g, glucose 10 g, malt extract 3 g, peptone 5 g, D.W 1 L, ph 5.0) 에서 12~14시간마다 2회이상계대배양하여그배양액을종균으로사용하였다. 그리고대식세포주 Raw 264.7과섬유성육종세포 HT1080 (Fibro sarcoma, Human) 을 KCLB에서구입하여실험에사용하였다. 2. 방법 1) 재료의전처리 (1) 영지버섯영지버섯 200 g에증류수 600 ml을가하여 20 에서 4시간동안침지시킨후분쇄기 (Hanil, Korea, 500W) 를이용하여 40mesh 정도크기의입자로습식분쇄하였다. (2) 효모전배양한효모배양액을 1회더계대배양하여 27 배양기 (Vision Scientific. Co. Korea) 에서 2~3일정도본배양하여총균수가 cfu/ml 되도록증식시켜 starter로사용하였다. 2) 추출및발효 (1) 환류냉각열수추출 (Reflux extraction: RE) 40mesh로습식분쇄한영지버섯시료 50 g에증류수 600 ml Fig. 1. Extraction Method of the Ganoderma lucidium 3) 효모의생육도, ph 및총산도측정생육도측정은 REW는원액을, FEW는희석액을각각 1 ml 씩취하여효모판별용 YM 고체평판배지에도말하여 27 에서 2~3일간배양한후나타난 Colony를총균수로산출하여생육상태로하였다. ph는 ph meter(m-8s, Horiba, Co.) 로측정하였고, 총산도는 REW와 FEW를각각 10 ml씩취한것에 10 ml의증류수를가하고 0.5%(W/V) phenolphtalein-50% ethanol 3방울을적가해서혼합한후뷰렛을이용하여 0.1 N-NaOH(F=1.000) 용액으로시료가분홍색 (ph 8.3) 으로변할때까지중화적정하였다. 이때소비된 0.1 N-NaOH의 ml 양을다음식을이용하여젖산 (Lactic acid)% 로환산하였다

3 황유연 정명수 김혜자 이기남 젖산 (%, W/V) = 적정치 x 0.009/10 x 100 4) Ethanol 정량 Ethanol 정량은 Gas chromatography(gc) 로수행하였다. Ethanol 분석용시료 1 ml에 10 M phosphoric acid 0.1 ml을가한후원심분리기 (Sigma, USA) 로 12,000 rpm에서 5분간원심분리하여미량의단백질을침전시키고상등액 1 ul를취하여 1회주입량으로하였다. 이때 ethanol 농도는 5 mm ethanol 표준시약의 peak와비교하여 ethanol 양으로환산하였다. 5) 추출수율측정 REW와 FEW1(24 hr), FEW2(48 hr), FEW3(72 hr), FEW4(96 hr) 시료각각을회전진공농축기 (Sanyo, Japan) 를사용하여감압농축시킨후동결건조하여가용성고형분무게를측정한후 100 g에대한추출율로환산하였다. 6) 수용성다당체의함량측정 REW와 FEW1(24 hr), FEW2(48 hr), FEW3(72 hr), FEW4(96 hr) 시료각각을 ethanol 침전 (ethanol 80% 이상 ) 하여 4 에서 24 시간침전시켜 20분간원심분리하여분리된침전물에 5% 의증류수를가하여용해시킨후 105 에서 ethanol을증류하고한외여과막으로여과하여동결건조기 (Eyela FDU 540, Japan) 에서동결건조하여분리한후고형분무게를측정하여수용성다당체함량으로환산하였다. 수용성조배당체의함량측정과정을도식화하여 Fig. 2에나타내었다. Fig. 2. Extraction Method of the Soluble Polysaccharide from the Ganoderma lucidium 7) 수용성조배당체의성분분석 FEW를가수분해하여얻은가수분해물을표준단당류와함께환원성아민화반응에의해형광기를결합시킨당을제조하여전기영동에의해분리한다음 UV lamp(uv-retrachter, Camag) 를사용하여 366nm에서확인하고 HPLC(Spectra phsics Co.) 로분석하였다. 8) 관능검사 REW와 FEW1(24 hr), FEW2(48 hr), FEW3(72 hr), FEW4(96 hr) 시료각각을일정량취하여냄새, 맛, 그리고전체적인기호도를평가하였다. 관능검사원은사전에식별훈련을받은사람중에서예비실험을거쳐 10명을최종선정하였고, 관능평가항목은쓴맛 (Bitter taste), 향긋한쓴맛 (Fragrant taste) 과이에상응하는냄새 (Smell), 그리고전체기호도 (Total acceptability) 로써조사방법은척도법으로등급화하여 1등급에서 5등급으로각각구분하여그도가약함은 1등급으로, 그정도가강함은 5등급으로표시하도록하였다. 관능검사에대한통계처리는 SAS program으로실시하였고, 그결과의차이는 ANOVA 분산분석법으로분석하여유의적인차이가있는경우는 Student Newman Keul의다중비교법에의하여검정하였다. 9) SOD 유사활성 (SOD-like Activity) REW와 FEW1~4의 SOD 유사활성은 H 2O 2 로전환시키는반응의촉매 pyrogallol의생성량을측정하였다. REW와 FEW1~4 각각의시료 0.2 ml에 ph8.5로보정한 tri-hcl buffer(50 mm tri[hydroxymethyl] amino-methane +10 mm EDTA, ph 8.5) 3 ml와 7.2 mm pyrogallol 0.2 ml을첨가하여 25 에서 10분간반응시킨후 1N HCl 1 ml을가하여반응을정지시켰다. 반응액중산화된 pyrogallol의양은 420 nm에서흡광도를측정하였으며 SOD 유사활성을다음과같이계산하였다. SOD-like activity(%) = 100-(solution without extracts/ solution with extracts 100) 10) Nitric Oxide 생성대식세포주 (Raw264.7) 를 10% fetal bovine serum(fbs) 와 streptomycine 및 penicillin(100 ug/100 unit) 을포함하는 dulbeco's modified eagle medium (DMEM) 에서배양하여사용하였다. Nitrite 측정은 griss 반응을이용하여 cytokine에의한 Raw264.7 세포가발생하는 nitrite의농도를측정하였다. Raw 세포를 hemocytometer를이용하여 cell/ml, 12well에 1ml 씩분주하여 37, 5% CO 2 에서 2시간배양한후에비부착성대식세포를제거하고다시시료 (REW와 FEW1~4, 100 ug/ml) 를포함한배지 1.5 ml을각각첨가하여 3 7, 5% CO 2 에서 24시간배양하였다. 상등액 100 ul을취하여 96well에넣고 griss reagent(1% sulfanilamide/ 0.1% naphthylene diamine dihydrochloride/ 2.5% H 3PO 4) 100 ul을넣고 15분간 20 에방치하나후 540 nm 에서 microplate reader(elisa) 를이용하여흡광도를측정하였다. Positive control은 lipopolysaccharide(lps) 를사용하였다. 11) 항암활성영지버섯추출물의항암활성측정을위하여섬유성육종암세포 (HT 1080, fibrosarcoma, human) 을 10% fetal bovine serum (FBS) 와 100unit/mL penicillin/streptomycin을함유한 RPMI1640 medium에서 37, 5% CO 2 에서배양하여사용하였다. 시료의항암활성효과는 MTT Assay로수행하였다

4 미생물발효영지버섯추출액의다당체에관한연구 MTT(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 분석은세포의생육및분화를측정하는방법으로서이실험은살아있는세포의미토콘드리아내의 dehydrogenase 가황색수용성물질인 MTT에의해 dark blue formazan을생성하는점을기초로한것이다. 배양한 HT 1080세포를 10% fetal bovine serum을함유한 RPMI 1640 배지 (100 unit/ml penicillin/streptomycin) 를 cell/ml 농도로각각의 well에 100 ml씩첨가하여 37, 5% CO 2 에서 24시간배양시킨후 REW와 FEW1~4를 1.0 mg/ml의농도로 100 ul씩첨가하여 48시간배양하였다. 여기에 MTT (5 ug/5 ul) 용액을 20 ul씩첨가하여 48시간배양시켜 formazan을형성시킨후 aspirator로상등액을제거시켰다. 그리고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 150 ul를첨가하여 formazan을녹인후 540 nm에서 microplate reader(elisa) 를이용하여흡광도를측정하였다. Control 은 phosphate buffered saline 20 ul을분주하여사용하였다. Growth inhibition rate(%) = (Control absorbance- Experimental absorbance/control absorbance) ) 통계처리본연구의실험결과들은 SPSS를이용하여각군의평균과표준편차를산출하고시료간의차이검증은 One-way ANOVA 를사용하였고, Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서유의성을검증하였다. 모든값은 mean ± standard deviation 값으로표기하였다. 결과및고찰 1. 효모균주의생육도, ph, 총산도, Ethanol 함량생육도, ph, 총산도및 ethanol 함량을실험한결과는 Table 1과같았는데, REW와비교해볼때발효처리한 FEW1~4에서균주의생육도, 총산의생성및 ethanol 함량이모두더높게나타났다. 총균수는발효시간이경과하면서점차증가하였는데특히 72시간과 96시간발효한 FEW3과 FEW4에서다른시료보다유의적인차이 (p<0.05) 를나타냈으며, 증식속도는발효 48시간에서 72시간사이인 FEW2와 FEW3에서빠른증식속도를보이다가발효 96시간째인 FEW4에서는완만하게증식하는것을볼수있었다. REW보다효모발효에의해 ph는점차적으로더낮아지고, 반면에산생성이유의적인차이로더증가하는것을볼수있으며, Ethanol 함량또한 REW보다 FEW에서유의적인차이로높게나타났으며, FEW 시료간에는 FEW2가약 mm로가장높았으며, 그다음 FEW3가약 mm로나타났다. 이상의실험결과에서효모의증식속도와 ethanol 생성량은비례하며, 효모발효의최적조건은 48~72시간이적합한것을알수있었다. 발효대사산물에는유기산, 알코올, CO 2 등이함유되어있어 ph를낮추어보존성을높여주고, 알코올에의한불용성성분이추출될수있으며거부감이있는맛과냄새를제거하여준다고이미알려져있으며, 본실험에서도이와동일한결과를얻을수 있었다. Table 1. Growth Pattern, ph, Total Acidity and Ethanol Production by Yeast in REW, FEW Samples Sample Cell growth Total acidity Ethanol ph (log,cfu/ml) (% as lactic acid) (mm) REW 1) 0.00 ± )c * 4.80 ± 0.07 a 0.30 ± 0.02 c 0.00 ± 0.00 e ** FEW1 2) 5.10 ± 0.45 b 4.79 ± 0.02 ab 0.33 ± 0.03 bc ± 2.18 d FEW2 3) 5.35 ± 0.25 b 4.76 ± 0.04 ab 0.37 ± 0.02 ab ± 3.08 a FEW3 4) 7.38 ± 0.67 a 4.71 ± 0.02 bc 0.41 ± 0.03 a ± 0.56 b FEW4 5) 7.72 ± 0.38 a 4.65 ± 0.03 c 0.42 ± 0.04 a ± 1.23 c 1) Reflux extract with hot water, 2 times. 2) Fermented extract with Yeast for 24hrs. 3) Fermented extract with Yeast for 48hrs. 4) Fermented extract with Yeast for 72hrs. 5) Fermented extract with Yeast for 96hrs. 6) All data were represented as mean SEM of three independent experiments. * :a~e Different superscripts in the table indicate significant difference at the p<0.05 level by Duncan's multiple range test. ** : Not Detected 2. 추출수율및수용성다당체의함량 REW와 FEW1~4의추출수율과수용성다당체의함량을측정한결과는 Table 2와같았다. Table 2에서 RE방법보다 FE방법에의한추출물의추출수율과수용성다당체의함량이유의적인차이로높은것으로나타났다. RE방법에의한추출수율은약 mg/g으로 FE방법중에서가장높은수치를보이는 FE4에의한추출수율인약 mg/g 비하여유의적인차이로낮은추출수율을나타내고있는데, 이는효모발효에의한세포분해효과, 효모의유용성분및효모발효에의한대사산물및 ethanol 생성으로불용성성분의추출효과, 초음파진동에의한세포파쇄로인한추출수율상승효과등에의한것으로판단된다. 본실험결과효모발효시간이 24~72시간까지는추출수율및수용성다당체의함량이유의적인차이로증가하고있으나 72시간이후에는큰변화를보이지않고있는것으로보아효모배양액 5% 접종시의최적발효시간은 27 에서 72시간으로확인되었다. Table 2. Extraction Yield and Totale Soluble Polysaccharide of Ganoderma lucidium 1) Total Soluble Sample Extraction Yield(mg/g) Polysaccharide(mg/g) 2) REW ± )d * 3.20 ± 0.28 c FEW ± 0.79 c 5.00 ± 0.23 b FEW ± 0.46 b 5.24 ± 0.25 b FEW ± 0.54 a 6.76 ± 0.62 a FEW ± 0.04 a 7.14 ± 0.22 a 1) mg Soluble solid/g dry matter. 2) mg Soluble crude polysaccharide/g dry matter. 3) All data were represented as mean SEM of three independent experiments. * :a~d Different superscripts in the table indicate significant difference at the p<0.05 level by Duncan's multiple range test. 3. 수용성다당체의성분분석 FEW에서최적추출조건으로판단된 FEW3의수용성다당체의성분을분석한결과는 Table 3에나타난바와같이대부분이 Glucose로서약 94.93% 로이루어져있으며 Xylose와 Fucose 가미량존재하고 Galactose와 Mannose 등이극미량결합되어있는것으로나타났다. 권등 15) 은영지버섯자실체다당류가 Glucose, Galactose, Mannose, Fucose, Xylose가각각 62.5%, 20.7%, 13.9 %, 2.0%, 0.86% 의비율로함유되어있다고보고한바있으며, 이등 16) 은

5 황유연 정명수 김혜자 이기남 Glucose, Mannose, Xylose, Galactose의순으로많다고보고하기도하였다. 본실험에의한결과로미루어볼때영지버섯의수용성다당체는 Glucose를주요구성당으로하여 Xylose, Fucose, Galactose, Mannose 등이영지버섯에함유되어있는미량의단백질과결합 9) 하여 Hetero Glucan 형태로이루어져있을것으로판단된다. 한편 FEW의당성분은효모발효및초음파추출에의한효모세포벽속의 β-glucan도일부추출되어전체적인구성당의비율에다소간의유의차가생겼을것으로보인다. Table 3. Compositional Sugar Analysis of Polysaccharide from Ganoderma lucidium FEW3 Sugar Contents(%) 1) Glucose ± )a * Xylose 3.20 ± 0.70 b Fucose 1.87 ± 0.21 c Galactose 0.00 ± )d Mannose 0.00 ± )d 1) : Area percent in HPLC chromatogram. 2) : Trace. 3) All data were represented as mean SEM of three independent experiments. * :a~d Different superscripts in the table indicate significant difference at the p<0.05 level by Duncan's multiple range test. 4. 관능검사 REW와 FEW1~4의관능적특성의변화를측정한결과는 Table 4와같았다. 냄새, 맛, 전체적인기호도등모든항목에서 REW와 FEW1~4 시료간에 p<0.01 또는 p<0.001 수준에서유의적인차이를보였는데, 발효가진행됨에따라영지의쓴맛과냄새는계속감소하는반면에향긋하고상큼한냄새와맛이향상및증가되었으며, 특히향긋한맛은열수추출보다효모발효한시료에서상당한차이를보여 p<0.001 수준에서유의적인차이가나타났다. 전체적인기호도는 48에서 72시간발효를한 FEW2와 FEW3가다른실험군과 p<0.01 수준에서유의적인차이를보였다. 이상에서살펴본바와같이효모발효를함으로써효모가생성하는 ethanol을비롯한다양한휘발성화합물들이부여되면서맛, 냄새등전체적인기호도가개선되는효과를얻을수있었다. 이는김등 17) 과 Heath 18) 와 Furia 등 19) 이이미효모 (Saccharomyces fermentati) 배양액에서휘발성화합물의조성및향기성분의특성을분리, 동정한바있으며본실험에서도이와일치된결과를얻을수있었다. Table 4. Statistical Analysis of Taste, Smell and Total Acceptability Evaluation Score between Samples Sample Smell Taste Total Bitter Fragrant bitter Bitter Fragrant bitter acceptability REW 3.50 a 1.38 b 4.13 a 2.00 b 3.06 b FEW ab 2.13 a 3.50 b 2.88 a 3.13 b FEW ab 2.38 a 3.19 b 3.00 a 3.88 a FEW b 2.33 a 3.19 b 3.00 a 4.13 a FEW b 2.50 a 3.00 b 3.13 a 3.25 b F value 8.65** 6.24** 8.37** 10.80*** 7.58** Means with the same letter are not significantly different(p<0.005). * : Significant at p<0.05. ** : Significant at p<0.01. *** : Significant at p< SOD 유사활성 SOD는 ROS(Reative oxygen species, 활성산소종 ) 에대한항산화효소의일종으로강한독성을갖는 Superoxide radical anion(o - 2 ) 을 hydrogen peroxide(h 2O 2) 와 O 2 로바꾸어주어세포를보호하는물질로퇴행성뇌질환, 심혈관계질환등각종질병과관련이있는것으로보고되어있다 20). 이러한 SOD에대하여 pyrogallol을이용한 SOD 유사활성능을 REW와 FEW1~4에서측정한결과를 Table 5에나타내었다. REW와 FEW1~4의모든추출물에서 SOD 활성유사능이있었으며특히 FEW3과 FEW4의추출물에서다른시료보다유의적인차이를보여각각약 15.27% 와 14.49% 로높게나타났다. 따라서영지버섯발효추출물은 SOD-like activity 생성능에의한항산화능력이뛰어난것으로판단된다. Table 5. SOD-like Activity of Extracts from REW, FEW1-4 Sample Conc(mg/ml) SOD-like Activity(%) REW ± )d * FEW ± 0.23 c FEW ± 0.56 c FEW ± 0.43 a FEW ± 0.45 b 1 All data were represented as mean SEM of three independent experiments.* :a~d Different superscripts in the table indicate significant difference at the p<0.05 level by Duncan's multiple range test. 6. Nitric Oxide 생성 대식세포 (Macrophage) 는미생물감염에대한방어기능과항상성유지기능을하며골수에서생성되어혈관내에서는백혈구의일종인단핵세포 ( 단구 ) 형태로, 조직내에서는대식세포로존재하는것으로알려져있다 21). 또한대식세포는 T-cell에서생성되는 Lymphokine에의해활성화되어 superoxide(o 2-), hydrogen peroxide(h 2O 2) 와같은반응산소중간물질이나 NO와같은반응질소중간물질을생성하여이물질을분해시키고 Interleukin (IL-1, IL-6), tumor necrosis fater와같은 cytokine 및 NO를생산하여종양세포구에대한세포특성을나타내는것으로보고되어있다 21). NO는매우불안정한 free radical 중의하나로산소등에의해 NO 2, N 2O 3, nitrite(no - 2 ) 와같은안전한 nitrogen oxide로바꿔진다고보고되어있다 8). 그리고 NO는대식세포에의한식균작용후에 Interferon 등의자극으로 nitric oxide synthetase (NOS) 가산소와결합하여 L-arginine을산화시켜생성되는것으로알려져있다 9). NOS는 endotherial NOS(eNOS) 와 neuronal NOS(nNOS) 같은항상성유지에필요한 NO를생성하는것과 inducible NOS(iNOS) 와같은염증성인자등에의해유도되는것으로분류되고있다 9). 마우스대식세포주인 Raw264.7에서나타난 NO 생성능은 Table 6과같다. Table 6. Response Relationship for REW, FEW1-4 the Nitric Oxide Formation in Raw264.7 Cell Line Sample conc(ug/ml) Nitric Oxide (um) REW ± )d * FEW ± 0.55 d FEW ± 0.67 c FEW ± 0.58 a FEW ± 0.52 b 1) All data were represented as mean SEM of three independent experiments. * :a~ddifferent superscripts in the table indicate significant difference at the p<0.05 level by Duncan's multiple range test

6 미생물발효영지버섯추출액의다당체에관한연구 FEW3는 REW와 FEW1,2,4에비해 100 ug/ml에서비교하였을때상대적으로 NO 생성능이유의적으로높은것으로나타났는데이것으로보아영지버섯추출물중 FEW3가암세포독성과대식세포의증가및대식세포에의한식균기능이가장클것으로판단된다. 7. 암세포성장억제 영지버섯추출물에는각종생리활성물질이존재하고있는것으로알려져오고있다. 특히영지버섯의항암성분에대한연구에서영지버섯의단백다당체는종양에대한생체방어력을높여간접적으로종양세포를저지한다고알려져있으며또한대식세포의수를증가시켜각종암세포를사멸시킨다고보고되어있다 9). 버섯류의항암효과는 Ikekawa 등 22) 에의하여말굽버섯과 (polyporaceae) 를비롯한식용균류의자실체열수추출물이 sarcoma180 등의동물이식암에대하여현저한항종양활성이있는것이보고되었으며특히영지버섯의약효성분은주로다당류와단백질이결합된 polysaccharide protein complex로서그화학적조성도밝혀진바있으며동물실험에서도암세포억제효과가입증되기도하였다 23). 본연구에서는암세포에대한세포독성을규명하기위하여섬유성육종암세포 (HT1080, fibrosarcoma, human) 을이용하여 REW와 FEW1~4에대한 MTT assay를실시하여 Table 8과같은결과를얻었다. 영지버섯추출물인 REW와 FEW1~4를 1 mg/ml 첨가시에약 46.74%~ 62.94% 의암세포성장억제율을나타내고있으며특히 FEW3에서가장높은억제율을나타내고있었다. REW와 FEW1~4의 IC 50 을구한결과 FEW3의 IC 50 값이 REW와 FEW 1,2,4에비해낮으므로암세포성장저해효과가높을것으로판단된다. 따라서영지버섯의 FEW3 추출물은암세포성장저해율이높고상대적으로 IC 50 값이낮은것으로보아각종종양등에대하여항암활성이높을것으로판단된다. Table 7. MTT Assay of Extracts from REW, FEW1-4 against HT1080 Cell Line and IC 50 Value Sample Growth Inhibiton rate(%) (conc : 1 mg/ml) IC 50(ug/mL) REW 49.40± )e * ± 4.61 a FEW ± 0.55 d ± 0.47 b FEW ± 0.27 c ± 3.19 bc FEW ± 0.83 a ± 4.10 e FEW ± 0.39 b ± 2.50 cd 1) All data were represented as mean SEM of three independent experiments. * :a~edifferent superscripts in the table indicate significant difference at the p<0.05 level by Duncan's multiple range test. 결 론 영지버섯효모발효초음파추출액 (FEW) 과영지버섯열수추출액 (REW) 의발효및추출방법, 추출수율및수용성다당체함량, 다당체의성분, 관능적특성, SOD-like activity, 암세포성장저해율, IC 50 값을연구하여다음과같은결론을얻었다. FEW에유기산 (Lactic acid) 과 Ethanol 등의성분이생성된것을확인하였으며이로인해 ph를낮추어안전성과보존성을높여주고, 알코올에의한불용성성분이추출될수있음이확인 되었다. RE방법보다 FE 추출방법에서추출수율과수용성배당체의함량이유의적인차이 (P<0.05) 로더높게나타났다. 효모발효시간이 24에서 72시간까지는 ethanol 생성, 추출수율및수용성배당체의함량이유의적인차이 (P<0.05) 로증가하였으나그이후에는큰변화를보이지않아효모배양액 5% 접종시의최적발효조건은 27 에서 72시간으로확인되었다. FEW3에함유된수용성다당체는 Glucose를중심으로 Xylose, Fucose, Galactose 및 Mannose로구성되어있는것을알수있었다. FEW는효모발효로인해 ethanol을비롯한다양한휘발성화합물들이생성되어영지의쓴맛과냄새가감소된반면에향긋하고상큼한냄새와맛이부여되는등전체적인관능적특성이개선되는효과를얻을수있었다. FEW3는 SOD-like activity가 15.27±0.43% 의높은활성능을나타내고있어항산화활성이있는것으로판단되었다. FEW3는 NO 생성능이 27.72±0.58 um, 암세포성장저해율이 62.94±0.83% 로높고, IC 50 값이 ±4.10 ug/ml로상대적으로낮은값을나타내고있어각종항암활성및생리활성기능이있는것으로판단되었다. 참고문헌 1. 정승용, 김성애, 김성희, 김한수, 김군자, 김희숙, 정효숙. 영지열수추출액이식이성고콜레스테롤혈증흰쥐의지질대사에미치는영향. 한국영양식량학회지 19(2): , Kikuchi, T., Kanomi, S., Kadota, S., Mural, T., Yubono, K., Ogita, Z. Chem Pharm Bull 34: , 김선환. 버섯의문헌에의한영양학적고찰. 중부대학교자연과학논문집 8(1):33-41, 권석형, 김춘년, 김철용, 권석태, 박기문, 황보식. 버섯균사체에의한암세포성장억제효과. 한국식품영양학회지 16(1): 15-21, 강소신의학원편. 중약대사전. 상해, 상해과학기술출판사, pp , 김병각, 정회수, 정경수, 양문식. 한국산담자균류의항암성분에관한연구. 한국균학회지 8(2): , Mizuno, T., Kato, N., Totsuka, A., Takenaka, K., Shinkai, K., Shimizu, M. Fractionation structural features and antitumor activity of water soluble polysaccharide from "Reishi", the fruit body of Ganoderma lucidium. Nippon Noegeikagaku Kaiski 58(9): , 강창율, 심미자, 최응칠, 이영남, 김병각. 한국산담자균류의항암성분에관한연구 - 만년버섯의균사배양및항암성분. 한국생화학회지 14(2): , 김성환, 김을상, 김영식. 영지에서분리한항암성다당체에관한연구. J. Korea, Soc, Food Nutr; 24(1): , 김명자, 김하원, 이영순, 심미자, 최응칠, 김병각. 영지의안전성에관한연구. 한국균학회지14(1):49-59, Hikino, H., Konno, C., Mirin, Y., Hayashi, T. Isolation and hypoglycemic activity of ganoderans A and B, glycans of

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