(52) CPC 특허분류 C12N 15/70 ( ) C12N 15/74 ( ) C12P 7/6409 ( ) (72) 발명자 워너, 조셉, 알. 미국 캘리포니아주산클레멘테비스타마리나 258 루이, 마이클 미국 콜로라도

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 15/63 ( ) C12N 15/52 ( ) C12N 15/70 ( ) C12N 15/74 ( ) (52) CPC 특허분류 C12N 15/63 ( ) C12N 15/52 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제 ) 2013 년 08 월 09 일 심사청구일자 없음 (85) 번역문제출일자 2015 년 03 월 10 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2013/ (87) 국제공개번호 WO 2014/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2014 년 02 월 13 일 61/682, 년 08 월 10 일미국 (US) 61/682, 년 08 월 10 일미국 (US) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2015년04월14일 (71) 출원인 오피엑스바이오테크놀로지스, 인크. 미국 콜로라도주보울더 55 번스트리트 (72) 발명자 리아오, 한스 미국 콜로라도주슈피리어홀요크레인 2157 스핀들러, 아일린 미국 콜로라도주라파예트이사벨로드 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 양영준, 김영 전체청구항수 : 총 15 항 (54) 발명의명칭지방산및지방산유도된산물의생산을위한미생물및방법 (57) 요약 본발명은지방산또는지방산유도된산물의생산을위한말로닐 -CoA 의증가된이용이존재하는대사적으로조작된미생물균주, 예컨대박테리아균주에관한것이고, 여기서변형된미생물은말로닐 -CoA 의존성이지만말로닐 -ACP 독립성인메카니즘을통해지방아실 -CoA 중간체를생산한다. 대표도 - 1 -

2 (52) CPC 특허분류 C12N 15/70 ( ) C12N 15/74 ( ) C12P 7/6409 ( ) (72) 발명자 워너, 조셉, 알. 미국 캘리포니아주산클레멘테비스타마리나 258 루이, 마이클 미국 콜로라도주브룸필드위노나플레이스 4597 리블, 웬디 미국 콜로라도주아르바다웨스트 80 티에이치서클 5827 프래더, 브리트니 미국 콜로라도주볼더스위트 티에이치스트리트 2425 에반스, 론 미국 콜로라도주볼더스위트 티에이치스트리트 2425 립스콤, 타냐, 이. 더블유. 미국 콜로라도주볼더유클리드애비뉴 5333 린치, 마이클, 디. 미국 콜로라도주웨스트민스터 #307 멜로디드라이브

3 명세서청구범위청구항 1 지방산쇄길이가 4 내지 > 18로부터선택될수있고, 지방산이성장하는지방아실-CoA 쇄를통해생산되고, 추가로지방산쇄가적어도하나의말로닐-CoA 분자에의해서및말로닐-ACP의사용없이연장되는것인, 지방산또는지방산유도된산물을생산하는유전자변형미생물. 청구항 2 제1항에있어서, 부티릴-CoA 산물 / 중간체가아세틸-CoA 및말로닐-CoA로부터제조되는것인유전자변형미생물. 청구항 3 제1항에있어서, 부티릴-CoA 산물 / 중간체가말로닐-CoA로부터제조되는것인유전자변형미생물. 청구항 4 제1항에있어서, 4 초과의쇄길이를갖는아실-CoA ( 길이 n) 산물 / 중간체가아세틸-CoA 및아실-CoA 쇄 ( 길이 n-2) 로부터제조되는것인유전자변형미생물. 청구항 5 제1항에있어서, 4 초과의쇄길이를갖는아실-CoA ( 길이 n) 산물 / 중간체가말로닐-CoA 및아실-CoA 쇄 ( 길이 n-2) 로부터제조되는것인유전자변형미생물. 청구항 6 제1항에있어서, 산물이쇄길이 C4가풍부한지방산혼합물이고, C4 쇄가질량 (g) 기준으로전체지방산산물의 > 9%, > 50%, > 85% 또는 > 95% 백분율을차지하는것인유전자변형미생물. 청구항 7 제1항에있어서, 산물이쇄길이 C6이풍부한지방산혼합물이고, C6 쇄가질량 (g) 기준으로전체지방산산물의 > 10%, > 50%, > 85% 또는 > 95% 백분율을차지하는것인유전자변형미생물. 청구항 8 제1항에있어서, 산물이쇄길이 C8이풍부한지방산혼합물이고, C8 쇄가질량 (g) 기준으로전체지방산산물의 > 10%, > 50%, > 85% 또는 > 95% 백분율을차지하는것인유전자변형미생물. 청구항 9 제1항에있어서, 산물이쇄길이 C10이풍부한지방산혼합물이고, C10 쇄가질량 (g) 기준으로전체지방산산물의 > 10%, > 50%, > 85% 또는 > 95% 백분율을차지하는것인유전자변형미생물. 청구항 10 제1항에있어서, 산물이쇄길이 C12가풍부한지방산혼합물이고, C12 쇄가질량 (g) 기준으로전체지방산산물의 > 10%, > 50%, > 85% 또는 > 95% 백분율을차지하는것인유전자변형미생물. 청구항 11 제1항에있어서, 산물이쇄길이 C14가풍부한지방산혼합물이고, C14 쇄가질량 (g) 기준으로전체지방산산물의 > 10%, > 50%, > 85% 또는 > 95% 백분율을차지하는것인유전자변형미생물

4 청구항 12 제1항에있어서, 산물이쇄길이 C16이풍부한지방산혼합물이고, C16 쇄가질량 (g) 기준으로전체지방산산물의 > 10%, > 50%, > 85% 또는 > 95% 백분율을차지하는것인유전자변형미생물. 청구항 13 제1항에있어서, 산물이쇄길이 C18이풍부한지방산혼합물이고, C18 쇄가질량 (g) 기준으로전체지방산산물의 > 10%, > 50%, > 85% 또는 > 95% 백분율을차지하는것인유전자변형미생물. 청구항 14 지방산또는지방산기재산물이생산되는것인, 제1항내지제13항중어느한항으로부터의미생물을사용한발효공정. 청구항 15 제1항내지제13항중어느한항에있어서, 아실-CoA를알콜, 알데히드, 알켄, 알칸또는이산을비롯한지방산유도된산물로전환시키도록추가로유전자변형된유전자변형미생물. 발명의설명 [0001] [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 기술분야관련출원에대한상호참조본원은가출원 : 2012년 8월 10일에출원된미국출원번호 61/682,127 및 2012년 8월 10일에출원된미국출원번호 61/682,138을우선권주장한다. 연방정부가후원하는연구에대한성명본발명은미국에너지부에의해수여된 DE-AR 하의정부지원으로이루어졌다. 미국정부는본발명에대한특정권리를갖는다. 발명의분야본발명은말로닐-CoA 의존성이지만말로닐-ACP 독립성인대사경로를통한지방산또는지방산유도된산물의생산을위한말로닐-CoA의증가된이용이존재하는대사적으로조작된미생물, 예컨대박테리아균주에관한것이다. 상기산물은이러한화학산물로부터제조된알데히드, 알콜, 알칸, 알켄, 및이산및추가의하류산물을포함할수있다. 또한, 하나이상의화학산물을제공하도록유전자변형이이루어질수있다. 참조에의한포함본원에인용된모든출원, 특허및간행물은모든목적을위해그전문이본원에참조로포함된다. [0009] [0010] 배경기술석유계탄화수소공급이감소하여그의비용이궁극적으로증가한다는것이점차받아들여지면서, 화학물질및연료의생산을위한산업용미생물시스템의개발및개선에대한관심이증가해왔다. 이러한산업용미생물시스템은특정화학물질의생산을위한석유계탄화수소의사용을완전히또는부분적으로대체할수있다. 이러한수단을통해항생제및항-말라리아제약제품에서고품질화학물질내지에탄올과같은연료에이르기까지수많은화학물질이생산된다. 그러나, 다양한지방산및지방산유도된산물과같은것이지만이에제한되지않는화학산물의미생물생산경로에서기질로서말로닐-CoA를갖는화학산물을생산하도록적응된변형된미생물에대한상업적필요성이여전히존재한다. [0011] [0012] 발명의내용 발명의개요 한실시양태에따르면, 본발명은 i) 탄소원및미생물세포배양물을조합하여지방산, 알콜, 알데히드, 알칸, - 4 -

5 알켄또는이산을포함하지만이에제한되지않는지방산또는지방산유도된산물을생산하는것을포함하며, 여기서 a) 상기세포배양물이지방산신타제의억제제를포함하거나또는상기미생물이미생물의지방산신타제경로에서의감소된효소활성을위해유전자변형되거나 ; 또는 b) 상기미생물이미생물의말로닐-CoA 의존성, 말로닐-ACP 독립성지방아실-CoA 대사경로 ("MDMIFAA") 에서의감소된효소활성을위해유전자변형된것인, 상기지방산또는지방산유도된산물을생산하는방법에관한것이다. 이경로는또한본원에서말로닐- CoA 의존성이지만말로닐-ACP 독립성인지방아실-CoA 대사경로로서도지칭된다. 미생물의말로닐-CoA 의존성, 말로닐-ACP 독립성지방아실-CoA 대사경로에서의이러한증가는아세토아세틸-CoA 티올라제의발현또는활성에서의감소와조합한아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 신타제 ( 또는엘롱가제 ), 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제및 / 또는 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제를포함하는유전자또는경로의증가된활성또는발현에의해달성될수있다. 대안적으로, 미생물의말로닐-CoA 의존성, 말로닐-ACP 독립성지방아실-CoA 대사경로에서의증가된활성은아세토아세틸-CoA 티올라제의발현또는활성에서의감소와조합한아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 티올라제, 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제및 / 또는 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제를포함하는유전자또는경로의증가된발현에의해달성될수있다. 다양한측면에서, 미생물에제공된탄소원은약 1.0 x 이상의탄소-12에대한탄소-14의비를갖는다. [0013] [0014] [0015] 본발명에따른탄소원은대부분글루코스, 수크로스, 프룩토스, 덱스트로스, 락토스, 크실로스, 다른셀룰로스당또는그의조합일수있다. 대안적으로, 탄소원은글리세롤이다. 다양한실시양태에서, 지방산또는지방산유도된산물의생산에서의증가는본발명의유전자변형및 / 또는배양시스템특징을포함하지않은미생물에서의산물생산보다적어도 20 퍼센트, 적어도 50 퍼센트, 적어도 75 퍼센트, 적어도 100 퍼센트또는적어도 150 퍼센트많다. 특정실시양태에서, 세포배양물은지방산신타제의억제제를포함하거나또는상기미생물은미생물의지방산신타제경로에서의감소된효소활성을위해유전자변형된다. 예를들어, 지방산신타제의억제제는티오락토마이신, 트리클로산, 세룰레닌, 티에노디아자보린, 이소니아지드및그의유사체로이루어진군으로부터선택될수있다. 세포배양물이유전자변형미생물을포함하는것인실시양태가본발명에포함된다. 유전자변형미생물은미생물의지방산신타제경로에서의감소된효소활성, 말로닐-CoA 의존성, 말로닐-ACP 독립성지방아실-CoA 대사경로의하나이상의효소에서의증가된효소활성, 미생물의지방아실-CoA 티오에스테라제활성에서의증가된효소활성, 미생물의아세토아세틸-CoA 신타제활성에서의증가된효소활성, 미생물의아세토아세틸-CoA 티올라제활성에서의감소된효소활성, 미생물의아세틸-CoA 카르복실라제경로에서의증가된효소활성및그의조합으로부터선택된형질을위해변형될수있다. 예를들어, 유전자변형미생물은미생물의지방산신타제경로에서의감소된효소활성을위해변형될수있다. 대안적으로, 감소된효소활성은베타 -케토아실-ACP 리덕타제, 3-히드록시아실-ACP 데히드라타제또는에노일-ACP 리덕타제로이루어진군으로부터선택된효소의효소활성에서의감소이다. 다양한측면에서, 미생물의지방산신타제경로에서의감소된효소활성은지방산신타제경로에서의효소또는그의상동체를코딩하는서열에작동가능하게연결된유도성프로모터를코딩하는이종핵산서열, 또는감소된활성을갖는지방산신타제경로에서의효소또는그의상동체를코딩하는이종핵산서열의도입을통해발생한다. 다양한측면에서, 지방산신타제경로에서의효소또는그의상동체는온도-민감성베타-케토아실-ACP 또는온도-민감성에노일-ACP 리덕타제활성을갖는폴리펩티드이 다. 이. 콜라이 (E. coli) 에서, 이러한온도 - 민감성돌연변이유전자는 fabi ts (S241F), fabb ts (A329V) 또는 fabd ts (W257Q) 를포함할수있다. [0016] [0017] [0018] 다양한실시양태에서, 미생물의말로닐-CoA 의존성이지만말로닐-ACP 독립성인지방아실-CoA 대사경로에서의증가된효소활성은피드백저항성효소, 예컨대판토테네이트키나제또는피루베이트데히드로게나제의증가된발현을통해발생할수있다. 이. 콜라이에서, 이러한피드백저항성돌연변이유전자는각각 coaa(r106a) 및 lpd(e354k) 를포함할수있다. 다양한실시양태에서, 미생물의말로닐-CoA 의존성, 말로닐-ACP 독립성지방아실-CoA 대사경로에서의증가된효소활성은아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 티올라제, 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제및 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제를포함하는경로의증가된발현을통해발생할수있다. 에노일-CoA 리덕타제는보조인자 NADH 또는 NADPH 또는대안적으로 NADPH 및 NADH 둘다를이용할수있다. 또한, 케토아실- CoA 리덕타제는보조인자 NADH 또는 NADPH 또는대안적으로 NADPH 및 NADH 둘다를이용할수있다. 다양한실시양태에서, 미생물의말로닐-CoA 의존성이지만말로닐-ACP 독립성인지방아실-CoA 대사경로에서의 - 5 -

6 증가된효소활성은아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 신타제 ( 또는엘롱가제 ), 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제및 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제를포함하는경로의증가된발현을통해발생할수있다. 에노일-CoA 리덕타제는보조인자 NADH 또는 NADPH 또는대안적으로 NADPH 및 NADH 둘다를이용할수있다. 또한케토아실-CoA 리덕타제는보조인자 NADH 또는 NADPH 또는대안적으로 NADPH 및 NADH 둘다를이용할수있다. [0019] [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] 다양한실시양태에서, 미생물의말로닐-CoA 의존성이지만말로닐-ACP 독립성인지방아실-CoA 대사경로를통한지방산또는지방산유도된산물의증가된생산은유전자결실, 파괴또는유전자돌연변이를통한아세토아세틸-CoA 티올라제활성에서의감소를통해발생할수있다. 다양한실시양태에서, 미생물의말로닐-CoA 의존성이지만말로닐-ACP 독립성인지방아실-CoA 대사경로를통한지방산또는지방산유도된산물의증가된생산은미생물 tig 유전자의유전자결실, 파괴또는유전자돌연변이를통한세포분열과관련된유발인자활성또는분자샤페론의활성에서의감소를통해발생할수있다. 미생물의 NADPH-의존성트랜스히드로게나제경로에서의증가된효소활성은뉴클레오티드트랜스히드로게나제활성을코딩하는폴리펩티드를코딩하는이종핵산서열의도입에의해발생할수있다. 다양한실시양태에서, 미생물의말로닐-CoA 의존성이지만말로닐-ACP 독립성인지방아실-CoA 대사경로를통한지방산또는지방산유도된산물의증가된생산은유전자결실, 파괴또는유전자돌연변이를통한지방아실- CoA 신테타제또는리가제활성에서의감소를포함하지만이에제한되지는않는지방산베타-산화활성에서의감소를통해발생할수있다. 다양한실시양태에서, 지방산또는지방산유도된산물의증가된생산은아세틸-CoA 카르복실라제활성을갖는효소의과다발현을통해달성될수있다. 다양한실시양태에서, 증가된세포내비카르보네이트수준은시아나제및 / 또는탄산안히드라제활성을갖는폴리펩티드를코딩하는이종핵산서열의도입에의해발생한다. 다양한실시양태에서, 지방산의증가된생산은지방아실-CoA 티오에스테라제활성의수준을증가시킴으로써발생할수있다. 다양한실시양태에서, 지방산산물의증가된쇄길이특이성은쇄길이특이적지방아실-CoA 티오에스테라제활성의수준을증가시키고바람직하지못한지방산쇄길이에대한지방아실-CoA 티오에스테라제활성의활성을감소시킴으로써발생할수있다. 다양한실시양태에서, 지방산또는지방산유도된산물의증가된쇄길이특이성은쇄길이특이적케토아실- CoA 티올라제, 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제또는 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제활성의수준을개별적으로또는조합하여증가시킴으로써발생할수있다. 에노일-CoA 리덕타제는보조인자 NADH 또는 NADPH 또는대안적으로 NADPH 및 NADH 둘다를이용할수있다. 또한, 케토아실-CoA 리덕타제는보조인자 NADH 또는 NADPH 또는대안적으로 NADPH 및 NADH 둘다를이용할수있다다양한실시양태에서, 지방산또는지방산유도된산물의증가된쇄길이특이성은쇄길이특이적케토아실- CoA 신타제 ( 또는엘롱가제 ), 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제또는 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제활성의수준을개별적으로또는조합하여증가시킴으로써발생할수있다. 에노일-CoA 리덕타제는보조인자 NADH 또는 NADPH 또는대안적으로 NADPH 및 NADH 둘다를이용할수있다. 또한, 케토아실-CoA 리덕타제는보조인자 NADH 또는 NADPH 또는대안적으로 NADPH 및 NADH 둘다를이용할수있다. 다양한실시양태에서, 지방산생산의증가된쇄길이특이성은쇄길이특이적지방아실-CoA 티오에스테라제활성의수준을증가시키고바람직하지못한쇄길이에대한지방아실-CoA 티오에스테라제활성의활성을감소시킴으로써발생할수있다 g/gdcw-hr 초과, 0.08g/gDCW-hr, 0.1g/gDCW-hr 초과, 0.13g/gDCW-hr 초과, 0.15g/gDCW-hr 초과, 0.175g/gDCW-hr 초과, 0.2g/gDCW-hr 초과, 0.25g/gDCW-hr 초과, 0.3g/gDCW-hr 초과, 0.35g/gDCW-hr 초과, 0.4g/gDCW-hr 초과, 0.45g/gDCW-hr 초과또는 0.5g/gDCW-hr 초과의속도로부터선택된특정속도로지방산또는지방산유도된산물을생산할수있는유전자변형미생물이본발명의범위내에있다. 다양한실시양태에서, 본발명은, 수성배지중탄소원및본원에서의청구항중어느한항에따른유전자변형미생물을포함하며, 여기서예컨대수성배지의부피가 5 ml 초과, 100 ml 초과, 0.5 L 초과, 1 L 초과, 2 L - 6 -

7 초과, 10 L 초과, 250 L 초과, 1000 L 초과, 10,000 L 초과, 50,000 L 초과, 100,000 L 초과또는 200,000 L 초과로부터선택되는경우, 예컨대수성배지의부피가 250 L 초과이고강철용기에함유된경우에, 상기유전자변형미생물이 0.05 gdcw/l 초과, 0.1 gdcw/l, 1 gdcw/l 초과, 5 gdcw/l 초과, 10 gdcw/l 초과, 15 gdcw/l 초과또는 20 gdcw/l 초과로부터선택된양으로존재하는것인배양시스템을포함한다. [0032] 다양하게, 이러한배양시스템을위한탄소원은덱스트로스, 수크로스, 펜토스, 폴리올, 헥소스, 헥소스및펜토스둘다, 및그의조합으로부터선택되고, 수성배지의 ph는 7.5 미만이고, 배양시스템은예컨대 i) 산소 5 mmol/l-hr 초과내지산소 200 mmol/l-hr 미만 ; ii) 산소 5 mmol/l-hr 초과내지산소 100 mmol/l-hr 미만 ; iii) 산소 5 mmol/l-hr 초과내지산소 80 mmol/l-hr 미만 ; 및 iv) 산소 5 mmol/l-hr 초과내지산소 50 mmol/l-hr 미만으로부터선택된산소전달속도로통기된다. [0033] 도면의간단한설명본발명의신규특징은청구항에구체적으로제시된다. 본발명의원리를이용한예시적실시양태를제시하는하기상세한설명, 및하기첨부도면을참조함으로써, 본발명의특징및이점에대한보다나은이해가얻어질것이다. 도 1은본발명의측면과관련된, 보다구체적으로는중간체말로닐-CoA를통한유동을증가시키기위한유전자변형과관련된미생물의대사경로를도시한다. 도 2는본발명의측면과관련된, 보다구체적으로는부티릴-CoA 및부티릴-CoA 유도된산물의생산과관련된미생물의대사경로를도시한다. 도 3a는본발명의측면과관련된, 보다구체적으로는지방아실-CoA, 지방산및지방산유도된산물의생산과관련된미생물의대사경로를도시한다. 도 3b는본발명의측면과관련된, 보다구체적으로는지방아실-CoA, 지방산및지방산유도된산물의생산과관련된미생물의대사경로를도시한다. 도 4는이. 콜라이에서의엘롱가제유전자 ELO1의활성을도시한다. 도 5는지방산생물생산에대해본발명에의해제공된대사경로의한실시양태를도시한다. 도 6은유리지방산 (FFA) 생물생산활성을증가시키는유전자변형의조합을보유하는미생물의한실시양태를도시한다. 표가또한본원에제공되며, 이는명세서의일부이다. [0034] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명은다양한생산방법및 / 또는다양한화학산물의발효적생산에대한유용성을갖는유전자변형미생물, 이들미생물의집단을용기에서이용하는이러한화학산물의제조방법, 및이들미생물및방법을사용하는화학적생산시스템에관한것이다. 본발명의이익중에는, 이러한미생물이발효사건또는주기동안화학산물을생산할때의증가된비생산성이있다. 본발명은말로닐-CoA의지방아실분자로의전환을조절하는하나이상의수단으로관심화학산물, 예컨대지방산또는지방산유도된산물을생산하기위한생산기술및 / 또는유전자변형미생물을제공하고, 여기서생산경로는말로닐-CoA는기질로서사용하지만말로닐-ACP는기질로서사용하지않는효소전환단계를포함한다. 말로닐-CoA의지방아실분자로의전환을조절하는수단은미생물바이오매스로의탄소흐름과화학산물로의탄소흐름의균형을맞추는데효과적이고, 놀랍게도상승된비생산성비율을달성하게한다. 특히, 지방산또는지방산유도된산물은미생물의말로닐-ACP 의존성지방산신타제경로의억제와조합한미생물의말로닐-CoA 의존성및말로닐-ACP 독립성지방산생산경로에의존하는방식으로생산된다. 미생물의말로닐-CoA 의존성및말로닐-ACP 독립성지방산생산경로는 2가지경로중하나를포함한다. 첫번째대안은아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 티올라제, 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제및 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제를포함하는경로의증가된발현및임의로아세토아세틸-CoA 티올라제활성의감소된활성을포함한다. 두번째대안은아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 신타제 ( 또는엘롱가제 ), 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제및 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제를포함하는경로의증가된발현및임의로아세토아세틸-CoA 티올라제활성의감소된활성을포함한다. 이들경로는세포내지방아실-CoA 산물을생산하는데사용된다

8 [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] 미생물의세포내지방아실-CoA 산물은다시알콜, 알데히드, 알파올레핀및알칸을포함하지만이에제한되지는않는지방산또는지방산유도된산물을포함하는화학산물로전환될수있다. 한화학산물은 4 내지 18개초과탄소의임의의쇄길이의지방산일수있다. 이군의화학산물은다음을포함한다 : 부티레이트또는부티르산, 헥사노에이트또는헥산산, 옥타노에이트또는옥탄산, 데카노에이트또는데칸산, 도데카노에이트또는도데칸산, 미리스테이트또는미리스트산, 팔미테이트또는팔미트산, 팔미톨레에이트또는팔미톨레산, 스테아레이트또는스테아르산, 및올레에이트또는올레산. 이들지방산산물은지방아실-CoA 티오에스테라제의활성을통해지방아실-CoA 중간체로부터생산될수있다. 대안적으로, 이들지방산은먼저지방아실-포스페이트를생산하는지방아실-CoA 포스포트랜스퍼라제와이어서지방아실-포스페이트로부터지방산을생산하도록작동하는지방산키나제작용의합동활성을통해지방아실-CoA 중간체로부터생산될수있다. 또다른화학산물은 4 내지 18개초과탄소의임의의쇄길이의지방알데히드일수있다. 이군의화학산물은다음을포함한다 : 부탄알, 헥산알, 옥탄알, 데칸알, 옥탄알, 데칸알, 도데칸알, 미리스트알데히드, 팔미트알데히드, 팔미톨레산알데히드, 스테아르알데히드및올레산알데히드. 이들알데히드산물은지방아실-CoA 리덕타제또는아실-CoA 리덕타제의활성을통해지방아실-CoA 중간체로부터생산될수있다. 지방산을제조하는생산균주가또한지방알데히드를생산하는데사용될수있다. 또다른화학산물은 4 내지 18개초과탄소의임의의쇄길이의지방알콜일수있다. 이군의화학산물은다음을포함한다 : 부탄올, 헥산올, 옥탄올, 데칸올, 도데칸올, C14 지방알콜, C16 지방알콜또는 C18 지방알콜. 이들지방산산물은알데히드리덕타제의활성을통해지방알데히드로부터생산될수있다. 지방산을제조하는생산균주가또한지방아실-CoA 또는유리지방산을지방알콜로전환하는효소를코딩하는유전자를발현시킴으로써지방알콜을생산하는데사용될수있다. 이들효소의예는알콜-형성아실-CoA 리덕타제 (EC ), 또는장쇄-지방아실-CoA 리덕타제 (EC ) 플러스알콜데히드로게나제 (EC ), 또는알데히드데히드로게나제 (EC ) 및알콜데히드로게나제의조합을포함한다. 지방아실-CoA 리덕타제활성을갖는폴리펩티드는아시네토박터 (Acinetobacter) SP. ADP1, 등록번호 YP_047869의 fabg 유전자에의해제공된다. 지방아실리덕타제활성을갖는폴리펩티드는봄빅스모리 (Bombyx mori), 등록번호 BAC79425의 FAR-N_SDR_e 유전자에의해제공된다. 알데히드데히드로게나제를갖는폴리펩티드는게오바실루스써모데니트리피칸스 (Geobacillus thermodenitrificans) NG80-2, 등록번호 YP_ 의 ALDH 유전자에의해제공된다. 알콜데히드로게나제활성을갖는폴리펩티드는이. 콜라이, 등록번호 AP_ 의 yqhd 유전자에의해제공된다. 이들활성의추가적공급원은관련기술분야에공지되어있고, 지방알콜을생산하는생산균주를생성하기위해조합될수있다. 또다른화학산물은 4 내지 18개초과탄소의임의의쇄길이의알파올레핀일수있다. 또다른화학산물은 4 내지 18개초과탄소의임의의쇄길이의알칸일수있다. 또다른화학산물은 4 내지 18개초과탄소의임의의쇄길이의이산일수있다. 이러한지방산산물은관련기술분야에공지된효소에의한오메가또는말단산화를통해지방산으로부터생산될수있다. 이들중임의의것이선택된화학산물또는관심화학산물로서본원에기재될수있다. 또한, 상기목록의임의의하위군을비롯한임의의군이 " 선택된화학산물 ", " 관심화학산물 " 등으로지칭되는것으로간주될수있다. 임의의이들화학산물에대해, 미생물은이러한화학산물의목적한생산을달성하기위해, 이러한화학산물로의생합성경로를선천적으로포함할수있고 / 거나이러한생합성경로를제공또는완성하기위해하나이상의이종핵산서열의부가를필요로할수있다. 본원에나타낸바와같이, 본발명의다양한측면은말로닐-CoA로부터관심화학산물, 예컨대상기기재된것들로의대사경로를포함하는미생물세포에대한것이고, 말로닐-CoA의아실 ACP 분자로의전환을조절하는수단이또한제공된다. 이어서, 조절수단이이러한전환을감소시키도록조절하는경우, 비례해서보다많은수의말로닐-CoA 분자가 1) 생산되고 / 거나 2) 말로닐-CoA로부터화학산물로의대사경로를통해전환된다. 유전자변형미생물집단에의한예기치못한비생산성에서의증가는, 미생물이말로닐-CoA로부터선택된화학산물로의미생물생산경로, 뿐만아니라미생물의지방산신타제시스템의선택된효소 ( 보다구체적으로는, 그의말로닐-ACP 의존성지방산연장효소 ) 의효소활성에서의감소, 이에더하여미생물의말로닐-CoA 의존성이지만말로닐-ACP 독립성인지방아실-CoA 생산경로의증가된활성을갖는것인방법및시스템에서달성될수있다. 다양한실시양태에서, 상기방법및시스템을추가로개선시키기위해이러한미생물집단을포함하 - 8 -

9 는생물반응기용기에대한특정보충물이또한제공될수있다. [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] 다른추가의유전자변형이다양한실시양태로본원에개시되어있다. I. 정의명세서및청구범위에사용된바와같은단수형태는문맥상명백하게달리지시되지않는한복수지시대상을포함한다. 따라서, 예를들어 " 발현벡터 " 에대한언급은단일발현벡터뿐만아니라동일하거나 ( 예를들어, 동일한오페론 ) 또는상이한복수의발현벡터를포함하고 ; " 미생물 " 에대한언급은단일미생물뿐만아니라복수의미생물을포함하는식이다. 본원에사용된바와같은 " 감소된효소활성 ", " 효소활성감소 " 등은미생물세포또는단리된효소가비교가능한동일한종의세포또는그의천연효소에서측정된활성수준보다낮은활성수준을나타냄을의미한다. 즉, 해당효소에대해공지된표준조건하에나타낸기질 ( 들 ) 에서나타낸산물 ( 들 ) 로의효소전환은특정된표준조건하에천연 ( 비-변형 ) 효소에의한동일한생화학적전환에대한효소활성보다적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는적어도 90% 작다. 상기용어는또한효소활성의제거를포함할수있다. 효소의감소된효소활성을갖는세포는관련기술분야에공지된임의의방법을사용하여확인될수있다. 예를들어, 효소활성검정을사용하여감소된효소활성을갖는세포를확인할수있다. 예를들어, 문헌 [Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc., New York 200 7] 을참조한다. 본원에사용된바와같은용어 " 이종 DNA", " 이종핵산서열 " 등은하기중하나이상에해당하는핵산서열을지칭한다 : (a) 핵산서열이주어진숙주미생물에대해이질적이거나 ( 즉, 천연적으로발견되지않거나 ); (b) 서열이주어진숙주미생물에서천연적으로, 그러나비천연의 ( 예를들어예상했던것보다많은 ) 양으로발견될수있거나 ; 또는 (c) 핵산서열이천연에서서로에대해동일한관계로발견되지않는둘이상의하위서열을포함한다. 예를들어, (c) 의경우, 재조합적으로생산된이종핵산서열은새로운기능적핵산을생산하도록배열된비관련성유전자로부터의둘이상의서열을가질것이다. 용어 " 이종 " 은용어 " 외인성 " 을포함하는것으로의도되며, 후자의용어가관련기술분야에서일반적으로사용된다. 이종핵산서열의도입전숙주미생물의게놈과관련하여, 효소를코딩하는핵산서열은 ( 이종핵산서열이상기게놈에도입되든지안되든지간에 ) 이종이다. 본원에사용된바와같은용어 " 유전자파괴 " 또는이의문법적동의어 ( 및 " 효소기능을파괴하는 ", " 효소기능의파괴 " 등포함 ) 는, 변형되지않은미생물세포에서또는그로부터의폴리펩티드활성과비교하여감소된폴리펩티드활성을갖는코딩된유전자산물을만드는미생물에대한유전자변형을의미하는것으로의도된다. 유전자변형은, 예를들어전체유전자의결실, 전사또는번역에필요한조절서열의결실또는다른변형, 말단절단된유전자산물 ( 예를들어, 효소 ) 을생성하는유전자의일부분의결실, 또는코딩된유전자산물의활성을감소시키는 ( 검출할수없는활성수준으로의감소를포함 ) 임의의다양한돌연변이전략일수있다. 파괴는효소를코딩하는핵산서열의전부또는일부의결실을포함하며, 또한다른유형의유전자변형, 예를들어정지코돈의도입, 프레임이동돌연변이, 유전자의일부분의도입또는제거, 및분해신호의도입을포함하지만이에제한되지는않고, 상기유전자변형은 mrna 전사수준및 / 또는안정성에영향을주고, 효소를코딩하는유전자상류의프로모터또는리프레서를변경시킨다. 다양한문맥에서, 유전자파괴는 DNA, DNA로부터코딩된 mrna, 및상응하는아미노산서열에대한, 폴리펩티드활성을감소시키는임의의유전자변형을의미하는것으로여겨진다. 수많은다양한방법을이용하여, 감소된폴리펩티드활성을갖는세포를생산할수있다. 예를들어, 세포는통상의돌연변이유발또는녹-아웃기술을이용하여, 파괴된조절서열또는폴리펩티드-코딩서열을갖도록조작될수있다. 예를들어, 문헌 [Methods in Yeast Genetics (1997 edition), Adams et al., Cold Spring Harbor Press (1998)] 을참조한다. 한특히유용한유전자파괴방법은완전한유전자결실인데, 이것이본발명의유전자변형미생물에서유전자복귀의발생을감소시키거나제거하기때문이다. 따라서, 그의산물이효소인유전자의파괴는그로인해효소기능을파괴한다. 대안적으로, 안티센스기술을이용하여특정폴리펩티드의활성을감소시킬수있다. 예를들어, 세포는폴리펩티드가번역되는것을방지하는안티센스분자를코딩하는 cdna를함유하도록조작될수있다. 또한, 유전자침묵을이용하여특정폴리펩티드의활성을감소시킬수있다. 본원에사용된바와같은용어 " 안티센스분자 " 는내인성폴리펩티드의코딩가닥에상응하는서열을함유하는임의의핵산분자또는핵산유사체 ( 예를들어, 펩티드핵산 ) 을포함한다. 안티센스분자는또한플랭킹서열 - 9 -

10 ( 예를들어, 조절서열 ) 을가질수있다. 따라서, 안티센스분자는리보자임또는안티센스올리고뉴클레오티 드일수있다. [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] 본원에사용된바와같은리보자임은제한없이헤어핀, 해머헤드또는액스헤드구조를포함하는임의의일반구조를가질수있고, 단분자는 RNA를절단한다. 용어 " 감소 " 또는 " 감소시키는 " 은이러한문구및그의문법적동의어로사용되는경우에상기전환 ( 들 ) 의완전한제거를포함하는것으로의도된다. 본원에사용된바와같은생물생산은호기성, 미세호기성또는혐기성일수있다. 본원에사용된바와같은용어 " 충분히상동성인 " 은단백질또는이의일부분이본원에서제공된아미노산서열 ( 서열번호 / 서열목록포함 ) 의아미노산서열과비교시동일또는동등한아미노산잔기의최소수를포함하여단백질또는그의일부분이각각의효소반응및 / 또는다른기능을달성할수있도록하게함을지칭한다. 특정한단백질또는그의일부분이충분히상동성인지여부를결정하는것은효소활성검정, 예컨대관련기술분야에통상적으로공지된것에의해결정될수있다. 서열동일성및상동성에대한기재및방법은예시적인것으로의도되고, 이들개념은관련기술분야에서널리이해되는것으로인식된다. 또한, 핵산서열은변할수있고, 목적하는기능성을나타내는효소또는다른폴리펩티드를코딩할수도있으며, 이러한변이는본발명의범위내에속한다고이해된다. 핵산서열에더하여, " 혼성화 " 는 2개의단일가닥폴리뉴클레오티드가비-공유결합으로결합하여안정한이중가닥폴리뉴클레오티드를형성하는과정을지칭한다. 용어 " 혼성화 " 는또한삼중가닥혼성화를지칭할수있다. 생성되는 ( 통상의 ) 이중가닥폴리뉴클레오티드는 " 하이브리드 " 또는 " 듀플렉스 " 이다. " 혼성화조건 " 은전형적으로약 1 M 미만, 보다통상적으로는약 500 mm 미만및약 200 mm 미만의염농도를포함할것이다. 혼성화온도는 5 만큼낮을수있으나, 전형적으로는 22 초과, 보다전형적으로는약 30 초과이고, 종종약 37 를초과한다. 혼성화는통상적으로엄격한조건, 즉프로브가그의표적하위서열에혼성화될조건하에수행된다. 엄격한조건은서열-의존성이며다양한환경에서상이하다. 보다긴단편은특이적혼성화를위해보다높은혼성화온도를필요로할수있다. 염기조성및상보적가닥의길이, 유기용매의존재및염기불일치의정도를비롯한다른인자가혼성화의엄격성에영향을미칠수있으므로, 파라미터의조합은임의의한파라미터단독의절대적측정보다중요하다. 일반적으로, 엄격한조건은한정된이온농도및 ph에서특정서열에대해 T m 보다약 5 더낮도록선택된다. 예시적인엄격한조건은 ph 7.0 내지 8.3 및 25 이상의온 도에서 0.01 M 이상내지 1 M 이하의 Na 이온농도 ( 또는다른염 ) 의염농도를포함한다. 예를들어, 조건 5 X SSPE (750 mm NaCl, 50 mm Na 포스페이트, 5 mm EDTA, ph 7.4) 및 의온도는대립유전자-특이적프로브혼성화에적합하다. 엄격한조건에대해서는, 예를들어혼성화프로토콜에대한참조로본원에포함된문헌 [Sambrook and Russell and Anderson "Nucleic Acid Hybridization" 1 st Ed., BIOS Scientific Publishers Limited (1999)] 을참조한다. " 특이적으로 ~ 에혼성화되는 " 또는 "~ 에특이적으로혼성화되는 " 등의표현은서열이복합체혼합물 ( 예를들어, 전체세포 ) 의 DNA 또는 RNA에존재하는경우에엄격한조건하에서실질적으로특정뉴클레오티드서열또는서열들에또는오직특정뉴클레오티드서열또는서열들에만분자가결합하거나, 듀플렉스를형성하거나, 혼성화되는것을지칭한다. [0060] [0061] [0062] 어구 " 관심절편 " 의사용은관심유전자및임의의다른핵산서열절편둘다를포함하도록의도된다. 관심절편을수득하는데사용되는방법의한예는미생물의배양물을획득하는것이며, 여기서상기미생물의게놈은관심유전자또는핵산서열절편을포함한다. 유전자산물, 즉효소의유전자변형이청구범위를비롯한본원에서언급되는경우, 그유전자변형은언급된유전자산물, 즉효소를통상적으로코딩하는유전자와같은또는이를포함하는핵산서열이라고이해된다. 일부실시양태에서, 말단절단된각각의폴리펩티드는각각의천연효소를코딩하는핵산서열에의해코딩되는폴리펩티드전체길이의적어도약 90%, 보다특히각각의천연효소를코딩하는핵산서열에의해코딩되는폴리펩티드전체길이의적어도 95% 를갖는다. 폴리펩티드의참조아미노산서열에예를들어적어도 95% " 동일한 " 아미노산서열을갖는폴리펩티드는, 청구된폴리펩티드의아미노산서열이참조서열과동일하되청구된폴리펩티드서열이폴리펩티드의참조아미노산의각 100개아미노산당 5개이하의아미노산변경을포함할수있다고의도된다. 다시말하면, 참조아미노산서열과적어도 95% 동일한아미노산서열을갖는폴리펩티드를수득하기위해서는, 참조서열내아미노산잔기의 5% 이하가결실되거나또다른아미노산으로치환될수있거

11 나, 또는참조서열내총아미노산잔기의 5% 이하의개수의아미노산이참조서열로삽입될수있다. 참조서열의이러한변경은참조아미노산서열의아미노또는카르복시말단위치에서또는이들말단사이의임의의위치에서일어나, 참조서열의잔기사이에개별적으로배치되거나또는참조서열내에서하나이상의인접기로배치될수있다. 다른실시양태에서, 말단절단은본원에기재된바와같이보다실질적일수있다. [0063] [0064] [0065] [0066] 종및다른계통적확인은미생물학분야의통상의기술자에게공지된분류에따른다. 본원에기재된방법및단계가특정순서로일어나는특정사건을나타내는경우에, 통상의기술자는특정단계의순서가변형될수있고상기변형이본발명의변이에따름을인식할것이다. 추가로, 특정단계는가능하다면병렬공정으로동시에수행될수있을뿐만아니라순차적으로수행될수있다. 본원에제공된예측실시예는광범위하게예시하는것임을의미하며어떤방식으로든제한됨을의미하지않는다. 약어의의미는하기와같다 : "C" 는그의용법으로부터분명한것처럼섭씨또는섭씨도를의미하고, "DCW" 는건조세포중량을의미하고, "s" 는초를의미하고, "min" 은분을의미하고, "h", "hr" 또는 "hrs" 는시간을의미하고, "psi" 는평방인치당파운드를의미하고, "nm" 은나노미터를의미하고, "d" 는일수를의미하고, "μl" 또는 "ul" 또는 "ul" 은마이크로리터를의미하고, "ml" 은밀리리터를의미하고, "L" 은리터를의미하고, "mm" 은밀리미터를의미하고, "nm" 은나노미터를의미하고, "mm" 은밀리몰농도를의미하고, "μm" 또는 "um" 은마이크로몰농도를의미하고, "M" 은몰농도를의미하고, "mmol" 은밀리몰을의미하고, "μmol" 또는 "umol" 은마이크로몰을의미하고, "g" 은그램을의미하고, "μg" 또는 "ug" 은마이크로그램을의미하고, "ng" 는나노그램을의미하고, "PCR" 은폴리머라제연쇄반응을의미하고, "OD" 는광학밀도를의미하고, "OD 600 " 은 600 nm의광자파장 에서측정된광학밀도를의미하고, "kda" 는킬로달톤을의미하고, "g" 는중력상수를의미하고, "bp" 는염기쌍 ( 들 ) 을의미하고, "kbp" 는킬로염기쌍 ( 들 ) 을의미하고, "% w/v" 는중량 / 부피퍼센트를의미하고, "% v/v" 는부피 / 부피퍼센트를의미하고, "IPTG" 는이소프로필-μ-D-티오갈락토피라노시드를의미하고, "RBS" 는리보솜결합부위를의미하고, "rpm" 은분당회전수를의미하고, "HPLC" 는고성능액체크로마토그래피를의미하고, "GC" 는기체크로마토그래피를의미한다. [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] II. 생물생산방법 A. 탄소원본발명에서사용되는, 지방산또는지방산유도된산물에대한생합성경로를갖는재조합미생물을갖는생물생산배지는의도된대사경로에적합한탄소원또는기질을함유하여야한다. 적합한기질로는모노사카라이드, 예컨대글루코스및프룩토스, 올리고사카라이드, 예컨대락토스또는수크로스, 폴리사카라이드, 예컨대전분또는셀룰로스또는이들의혼합물및재생가능한공급원료, 예컨대치즈유장투과액, 옥수수침출액, 사탕무당밀및보리맥아로부터의비정제혼합물을포함할수있으나, 이에제한되지는않는다. 추가로, 탄소기질은또한중요생화학적중간체로의대사전환이입증된이산화탄소, 일산화탄소또는메탄올과같은 1-탄소기질일수있다. 추가로, 탄소기질은또한이산화탄소및수소또는그의조합, 예컨대합성가스일수있다. 메탄올자화미생물은 1 및 2 탄소기질이외에또한다수의다른탄소함유화합물, 예컨대메틸아민, 글루코사민및대사활성을위한각종아미노산을이용하는것으로공지되어있다. 상기언급된탄소기질및이들의혼합물모두가본발명에서탄소원으로서적합하다고고려되지만, 탄소원으로서사용되는통상적인탄소기질은글루코스, 프룩토스및수크로스, 뿐만아니라이들당의임의의혼합물이다. 다른적합한기질은상업적으로이용가능한것으로서의크실로스, 아라비노스, 다른셀룰로스-기재 C-5 당, 고-프룩토스옥수수시럽, 및다양한다른당및당혼합물을포함한다. 수크로스는사탕수수, 사탕무, 카사바, 바나나또는다른과일, 및단수수와같은공급원료로부터얻을수있다. 글루코스및덱스트로스는옥수수, 밀, 호밀, 보리및귀리와같은곡물을포함한전분기재공급원료의당화를통해얻을수있다. 또한, 일부실시양태에서탄소원의모두또는일부는글리세롤일수있다. 대안적으로, 글리세롤은첨가되는탄소원으로서배제될수있다. 한실시양태에서, 탄소원은글루코스, 프룩토스, 수크로스, 덱스트로스, 락토스, 글리세롤, 및이들의혼합물로부터선택된다. 다양하게, 탄소원중이들성분의양은탄소원의약 50% 초과, 약 60% 초과, 약 70% 초과, 약 80% 초과, 약 90% 초과, 또는그초과, 100% 이하또는본질적으로 100% 일수있다. 또한, 메탄올자화미생물은다수의다른탄소함유화합물, 예컨대메틸아민, 글루코사민및대사활성을위한

12 각종아미노산을이용하는것으로공지되어있다. 예를들어, 메탄올자화효모는메틸아민으로부터의탄소를이용하여트레할로스또는글리세롤을형성하는것으로공지되어있다 (Bellion et al., Microb. Growth C1 Compd. (Int. Symp.), 7th (1993), Editor(s): Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, UK). 유사하게, 칸디다 (Candida) 의다양한종은알라닌또는올레산을대사할것이다 (Sulter et al., Arch. Microbiol. 153: (1990)). 따라서, 본발명의실시양태에이용된탄소원은광범위한탄소-함유기질을포함할수있다고고려된다. [0073] [0074] [0075] 또한, 발효가능한당은, 예를들어미국특허공보번호 2007/ A1 ( 본원에참조로포함됨 ) 에기재된바와같이, 전처리및당화공정을통해셀룰로스및리그노셀룰로스바이오매스로부터얻을수있다. 바이오매스는임의의셀룰로스또는리그노셀룰로스물질을지칭하며, 셀룰로스및임의로는헤미셀룰로스, 리그닌, 전분, 올리고사카라이드및 / 또는모노사카라이드를추가로포함하는물질을포함한다. 바이오매스는또한추가의성분, 예컨대단백질및 / 또는지질을포함할수있다. 바이오매스는단일공급원으로부터유래될수있거나, 또는바이오매스는하나초과의공급원으로부터유래된혼합물을포함할수있으며 ; 예를들어, 바이오매스는옥수수속대와옥수수대의혼합물, 또는풀과잎의혼합물을포함할수있다. 바이오매스는생물에너지작물, 농업잔류물, 도시고형폐기물, 산업용고형폐기물, 제지로부터의슬러지, 정원폐기물, 목재및산림폐기물을포함하지만이에제한되지않는다. 바이오매스의예는옥수수낟알, 옥수수속대, 옥수수잔류물, 예컨대옥수수껍질, 옥수수대, 잔디, 밀, 밀짚, 보리, 보리짚, 건초, 벼짚, 스위치그래스, 폐기종이, 사탕수수바가스, 수수, 대두, 낟알, 나무, 가지, 뿌리, 잎, 목재칩, 톱밥, 관목및덤불의분쇄로수득한성분, 채소, 과일, 꽃및동물퇴비를포함하지만이에제한되지않는다. 이러한임의의바이오매스를생물생산방법또는시스템에사용하여탄소원을제공할수있다. 셀룰로스바이오매스를보다입수하기용이하고이용가능한탄소분자, 예를들어당의혼합물로분해하기위한다양한접근법은하기를포함한다 : 진한또는묽은산 ( 예를들어, < 1% 황산 ) 의존재하에가열 ; 암모니아로처리 ; 이온염으로처리 ; 효소적분해 ; 및이들의조합. 이들방법은통상적으로는기계적분리및분쇄를따르며, 적절한분리공정이이어진다. 다양한실시양태에서, 수크로스, 글루코스, 크실로스, 셀룰로스또는헤미셀룰로스를포함하는 ( 이에제한되지는않음 ) 광범위한당중임의의당은, 예컨대한정배지 ( 예컨대 M9 최소배지, 황산칼륨최소배지, 효소합성최소배지및다수의기타배지또는이들의변형배지를포함하는 ( 이에제한되지는않음 ) 최소염배지 ), 하나이상의지방산또는지방산유도된생합성경로대안을제공하는미생물접종물, 및탄소원이배합되어있을수있는반응기용기를포함하는산업용시스템에서미생물에제공된다. 탄소원은세포에진입하여포스포에놀피루베이트 (PEP) 를비롯한통상적인대사중간체를산출하는널리공지된통상적인대사경로에의해이화된다. ( 당에대한기초대사이화경로의교시에대해참조로포함된문헌 [Molecular Biology of the Cell, 3rd Ed., B. Alberts et al. Garland Publishing, New York, 1994, pp , 66-74]; 주요대사경로의교시에대해참조로포함된문헌 [Principles of Biochemistry, 3rd Ed., D. L. Nelson & M. M. Cox, Worth Publishers, New York, 2000, pp ]; 및또한주요대사경로의도시에대해참조로포함된문헌 [Biochemistry, 4th Ed., L. Stryer, W. H. Freeman and Co., New York, 1995, pp ] 을참조한다.) 생물-기재탄소는 ASTM D6866을포함하는 ( 이에제한되지는않음 ) 각종방법또는기타다양한기술에따라석유-기재탄소로부터구별될수있다. 예를들어, 탄소-14 대탄소-12 비는생물-기재탄소원대석유-기재공급원에서상이한데, 생물-기재탄소원에서보다높은탄소-14 비가발견된다. 다양한실시양태에서, 탄소원은석유-기재가아니거나, 대부분석유-기재가아니다. 다양한실시양태에서, 탄소원은약 50% 초과의비-석유기재, 약 60% 초과의비-석유기재, 약 70% 초과의비-석유기재, 약 80% 초과의비-석유기재, 약 90% 초과의비 - 석유기재, 또는그초과이다. 다양한실시양태에서, 탄소원은약 1.0 x 이상의탄소 -12 에대한탄소 -14 의비를갖는다. [0076] [0077] [0078] B. 미생물본원에기재및청구된특징은본원의목록으로부터선택된미생물, 또는하나이상의천연, 도입또는증진된지방산또는지방산유도된산물생물생산경로를또한포함하는또다른적합한미생물에서제공될수있다. 따라서, 일부실시양태에서미생물은내인성지방산또는지방산유도된산물생산경로 ( 이는상기일부실시양태에서증진될수있음 ) 를포함하는반면, 다른실시양태에서미생물은내인성지방산또는지방산유도된산물생산경로를포함하지않는다. 각종의상기유전자변형미생물은 1인이상의본발명자 ( 들 ) 의다른특허출원및 / 또는본특허출원의소유자에게양도된다른특허출원에기재되어있을수있는유전자변형및 / 또는다른시스템변경을포함할수

13 있다. [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] 실시예는특정박테리아및효모미생물에대한특정변형및평가를기재한다. 본발명의범위는상기종으로제한됨을의미하는것이아니라, 광범위한적합한미생물에일반적으로적용될수있음을의미한다. 일반적으로, 본발명에사용되는미생물은박테리아, 시아노박테리아, 사상진균및효모로부터선택될수있다. 일부실시양태의경우, 선택된화학산물의생물생산을위해최초로선택된미생물숙주는또한글루코스를포함한당을고비율로이용할것이다. 대부분의미생물은탄수화물을이용할수있다. 그러나, 특정환경의미생물은탄수화물을고효율로이용할수없으므로, 첨가되는주요탄소원으로서글루코스또는다른탄수화물이의도되는상기실시양태에는적합한숙주가아닐것이다. 다양한종의게놈이공지되어있기때문에, 본발명은지속-증가하는범위의적합한미생물에용이하게적용될수있다. 또한, 유전자서열분석의비교적낮은비용을고려할때, 관심종의유전자서열을용이하게결정하여 ( 공지된게놈서열을갖는미생물에대한유전자변형적용의용이성을기초로 ) 본발명의측면의적용을보다용이하게얻을수있도록할수있다. 보다구체적으로, 본원에기재된다양한기준을기초로, 화학산물의생물생산에적합한미생물숙주는일반적으로임의의그람음성미생물, 보다구체적으로는엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae) 과의구성원, 예컨대이. 콜라이, 또는올리고트로파카르복시도보란스 (Oligotropha carboxidovorans), 또는슈도모노나스 (Pseudomononas) 종 ; 임의의그람양성미생물, 예를들어바실루스서브틸리스 (Bacillus subtilis), 락토바실루스 (Lactobaccilus) 종또는락토코쿠스 (Lactococcus) 종 ; 효모, 예를들어사카로미세스세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae), 피키아파스토리스 (Pichia pastoris) 또는피키아스티피티스 (Pichia stipitis); 및다른군또는미생물종을포함할수있지만이에제한되지않는다. 보다구체적으로, 지방산또는지방산유도된산물의생물생산에적합한미생물숙주는일반적으로클로스트리디움 (Clostridium), 지모모나스 (Zymomonas), 에스케리키아 (Escherichia), 살모넬라 (Salmonella), 로도코쿠스 (Rhodococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실루스, 락토바실루스, 엔테로코쿠스 (Enterococcus), 알칼리게네스 (Alcaligenes), 클레브시엘라 (Klebsiella), 파에니바실루스 (Paenibacillus), 아르트로박터 (Arthrobacter), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 피키아 (Pichia), 칸디다, 한세눌라 (Hansenula) 및사카로미세스속의구성원을포함하지만이에제한되지않는다. 특히관심있을수있는숙주는다음을포함한다 : 올리고트로파카르복시도보란스 ( 예컨대, 균주 OM5), 에스케리키아콜라이 (Escherichia coli), 알칼리게네스유트로푸스 (Alcaligenes eutrophus) ( 쿠프리아비두스네카토르 (Cupriavidus necator)), 바실루스리케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 파에니바실루스마세란스 (Paenibacillus macerans), 로도코쿠스에리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis), 슈도모나스푸티다 (Pseudomonas putida), 락토바실루스플란타룸 (Lactobacillus plantarum), 엔테로코쿠스파에시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코쿠스갈리나리움 (Enterococcus gallinarium), 엔테로코쿠스파에칼리스 (Enterococcus faecalis), 바실루스서브틸리스및사카로미세스세레비지아에. 보다구체적으로, 지방산또는지방산유도된산물의생물생산에적합한미생물숙주는일반적으로클로스트리디움, 지모모나스, 에스케리키아, 살모넬라, 로도코쿠스, 슈도모나스, 바실루스, 락토바실루스, 엔테로코쿠스, 알칼리게네스, 클레브시엘라, 파에니바실루스, 아르트로박터, 코리네박테리움, 브레비박테리움, 피키아, 칸디다, 한세눌라및사카로미세스속의구성원을포함하지만이에제한되지않는다. 특히관심있을수있는숙주는다음을포함한다 : 올리고트로파카르복시도보란스 ( 예컨대균주 OM5 T ), 에스케리키아콜라이, 알칼리게네스유트로푸스 ( 쿠프리아비두스네카토르 ), 바실루스리케니포르미스, 파에니바실루스마세란스, 로도코쿠스에리트로폴리스, 슈도모나스푸티다, 락토바실루스플란타룸, 엔테로코쿠스파에시움, 엔테로코쿠스갈리나리움, 엔테로코쿠스파에칼리스, 바실루스서브틸리스및사카로미세스세레비지아에. 또한, 이들종의임의의공지된균주가출발미생물로서이용될수있으며, 그의각각의균주를포함한하기종중어느하나일수있다 - 쿠프리아비두스바실렌시스 (Cupriavidus basilensis), 쿠프리아비두스캄피넨시스 (Cupriavidus campinensis), 쿠프리아비두스길라르디 (Cupriavidus gilardi), 쿠프리아비두스라하르시스 (Cupriavidus laharsis), 쿠프리아비두스메탈리두란스 (Cupriavidus metallidurans), 쿠프리아비두스옥살라티쿠스 (Cupriavidus oxalaticus), 쿠프리아비두스파우쿨루스 (Cupriavidus pauculus), 쿠프리아비두스피나투보넨시스 (Cupriavidus pinatubonensis), 쿠프리아비두스레스피라쿨리 (Cupriavidus respiraculi), 및쿠프리아비두스타이와넨시스 (Cupriavidus taiwanensis). 일부실시양태에서, 재조합미생물은그람-음성박테리아이다. 일부실시양태에서, 재조합미생물은지모모나

14 스, 에스케리키아, 슈도모나스, 알칼리게네스및클레브시엘라속으로부터선택된다. 일부실시양태에서, 재조 합미생물은에스케리키아콜라이, 쿠프리아비두스네카토르, 올리고트로파카르복시도보란스및슈도모나스푸 티다종으로부터선택된다. 일부실시양태에서, 재조합미생물은이. 콜라이균주이다. [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] 일부실시양태에서, 재조합미생물은그람-양성박테리아이다. 일부실시양태에서, 재조합미생물은클로스트리디움, 살모넬라, 로도코쿠스, 바실루스, 락토바실루스, 엔테로코쿠스, 파에니바실루스, 아르트로박터, 코리네박테리움및브레비박테리움속으로부터선택된다. 일부실시양태에서, 재조합미생물은바실루스리케니포르미스, 파에니바실루스마세란스, 로도코쿠스에리트로폴리스, 락토바실루스플란타룸, 엔테로코쿠스파에시움, 엔테로코쿠스갈리나리움, 엔테로코쿠스파에칼리스및바실루스서브틸리스종으로부터선택된다. 특정한실시양태에서, 재조합미생물은비. 서브틸리스균주이다. 일부실시양태에서, 재조합미생물은효모이다. 일부실시양태에서, 재조합미생물은피키아, 칸디다, 한세눌라, 클레브시엘라, 이사첸키아 (Issatchenkia) 및사카로미세스속으로부터선택된다. 특정실시양태에서, 재조합미생물은사카로미세스세레비지아에이다. 본개시내용에비추어, 임의의상기미생물은지방산또는지방산유도된산물이외의화학산물의생산에사용될수있음이또한이해된다. 숙주를유전자변형시킬수있는능력은임의의재조합미생물의생산에필수적이다. 유전자전달기술의방식은전기천공, 접합, 형질도입, 또는천연형질전환에의할수있다. 광범위한숙주접합성플라스미드및약물내성마커가이용가능하다. 클로닝벡터는상기숙주에서기능할수있는항생제내성마커의성질에기반하여숙주미생물에맞게구축될수있다. C. 배지및배양조건본원에개시된유형의탄소원으로부터선택된것과같은적절한탄소원이외에, 생물생산배지는통상의기술자에게공지된, 본발명하의화학산물생물생산에필요한효소경로의촉진및배양물의성장에적합한미네랄, 염, 보조인자, 완충제및기타성분을함유하여야한다. 본발명의또다른측면은본발명의유전자변형미생물및임의로보충물을포함하는배지및배양조건에관한것이다. 전형적으로세포는적절한배지에서약 25 내지약 40 범위, 뿐만아니라호열성미생물의경우 70 이하의온도에서성장시킨다. 본발명에적합한성장배지는시판용으로제조된통상적배지, 예컨대루리아베르타니 (Luria Bertani) (LB) 브로쓰, 테리픽브로쓰 (Terrific Broth) (TB), M9 최소배지, 사부라우드덱스트로스 (Sabouraud Dextrose) (SD) 브로쓰, 효모배지 (YM) 브로쓰, (Ymin) 효모합성최소배지, 및본원에기재된바와같은최소배지, 예컨대 M9 최소배지이다. 다른한정또는합성성장배지가또한사용될수있으며, 특정미생물의성장에적절한배지는미생물학또는생물생산과학분야의통상의기술자에의해공지되어있을것이다. 다양한실시양태에서, 보다낮은수준으로첨가되는각종성분, 예를들어 10, 5, 2 또는 1 g/l 미만의복합질소공급원 ( 효모추출물, 펩톤, 트립톤, 대두가루, 옥수수침출액또는카세인을포함하지만이에제한되지않음 ) 을포함하지않거나갖는최소배지가개발및사용될수있다. 이들최소배지는또한비오틴, 비타민 B12 및비타민 B12의유도체, 티아민, 판토테네이트및다른비타민을포함하는비타민혼합물의한정된보충물을가질수있다. 최소배지는또한 28, 17 또는 2.5 mm 미만의포스페이트, 25 또는 4 mm 미만의술페이트, 및 130 또는 50 mm 미만의총질소를함유하는한정된단순무기영양공급원을가질수있다. 유전자변형미생물을이용한본발명의실시양태에서사용되는생물생산배지는의도된대사경로에적합한탄소기질을함유하여야한다. 상기기재된바와같이, 적합한탄소기질로는일산화탄소, 이산화탄소, 및다양한단량체및올리고머당이포함된다. 생물생산에적합한 ph 범위는 ph 3.0 내지 ph 10.0이며, 여기서 ph 6.0 내지 ph 8.0이초기조건에대해전형적인 ph 범위이다. 그러나, 특정실시양태에대한실제배양조건이이들 ph 범위로제한됨을의미하지않는다. 생물생산은교반하면서또는교반없이호기성, 미세호기성또는혐기성조건하에서수행될수있다. 생물생산배지에서생산된지방산또는지방산유도된산물의양은일반적으로관련기술분야에공지된수많은방법, 예를들어고성능액체크로마토그래피 (HPLC), 기체크로마토그래피 (GC) 또는 GC/ 질량분광분석법 (M S) 을사용하여측정될수있다

15 [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] D. 반응기및시스템본발명에따른방법및 / 또는조성물을이용하는발효시스템이또한본발명의범위내에속한다. 본원에기재되고 / 거나언급된임의의재조합미생물은, 미생물이상업적으로실행가능한작업에서탄소원을지방산또는지방산유도된산물로전환시키는산업용생물생산시스템에도입될수있다. 생물생산시스템은상기재조합미생물을생물반응기용기에도입시키는것을포함하며, 여기서탄소원기질및생물생산배지는재조합미생물을성장시키는데적합하고, 일부기질분자에서선택된화학산물로의목적하는전환을얻기에적합한시간동안적합한온도범위 ( 및반응이호기성또는미세호기성인경우용존산소농도범위 ) 내에서생물생산시스템을유지시키기에적합하다. 산업용생물생산시스템및그의작동은화학공학및생물공정공학분야의통상의기술자에게널리공지되어있다. 생물생산은교반하면서또는교반없이호기성, 미세호기성또는혐기성조건하에서수행될수있다. 호기성, 미세호기성및혐기성조건을달성하기위한미생물집단및배양물의운용은관련기술분야에공지되어있고, 영양배지및상기미생물집단을포함하는액체배양물의용존산소수준은목적하는호기성, 미세호기성또는혐기성조건을유지하거나확인하기위해모니터링될수있다. 합성가스가공급원료로서사용되는경우에, 호기성, 미세호기성또는혐기성조건이이용될수있다. 당이사용되는경우에, 혐기성, 호기성또는미세호기성조건이다양한실시양태에서이행될수있다. 본원에기재되고 / 거나언급된임의의재조합미생물은, 미생물이상업적으로실행가능한작업에서탄소원을선택된화학산물로전환시키는산업용생물생산시스템에도입될수있다. 생물생산시스템은상기재조합미생물을생물반응기용기에도입시키는것을포함하며, 여기서탄소원기질및생물생산배지는재조합미생물을성장시키는데적합하고, 일부기질분자에서선택된화학산물로의목적하는전환을얻기에적합한시간동안적합한온도범위 ( 및반응이호기성또는미세호기성인경우용존산소농도범위 ) 내에서생물생산시스템을유지시키기에적합하다. 다양한실시양태에서, 합성가스성분또는당은, 예컨대한정배지 ( 예컨대 M9 최소배지, 황산칼륨최소배지, 효모합성최소배지및다수의기타배지또는이들의변형배지를포함하는 ( 이에제한되지는않음 ) 최소염배지 ), 본원에교시된생합성경로 ( 들 ) 의실시양태를제공하는미생물의접종물, 및탄소원이배합되어있을수있는반응기용기를포함하는산업용시스템에서미생물에제공된다. 탄소원은세포에진입하여포스포에놀피루베이트 (PEP) 또는아세틸-CoA를비롯한통상적인대사중간체를산출하는널리공지된통상적인대사경로에의해이화된다. ( 당에대한기초대사이화경로의교시에대해참조로포함된문헌 [Molecular Biology of the Cell, 3 rd Ed., B. Alberts et al. Garland Publishing, New York, 1994, pp , 66-74]; 주요대사경로의교시에대해참조로포함된문헌 [Principles of Biochemistry, 3 rd Ed., D. L. Nelson & M. M. Cox, Worth Publishers, New York, 2000, pp ]; 및주요대사경로의교시에대해참조로포함된문헌 [Biochemistry, 4 th Ed., L. Stryer, W. H. Freeman and Co., New York, 1995, pp ] 을참조한다.). [0104] [0105] 산업용생물생산의유형에더하여, 본발명의다양한실시양태는배치유형의산업용생물반응기를이용할수있다. 전형적인배치생물반응기시스템은, 배지의조성이각각의생물생산사건시작시에설정되고실질적으로생물생산사건의말기에종료되는시간동안인공적인변형및첨가에제공되지않음을의미하는 " 폐쇄형 " 으로여겨진다. 따라서, 생물생산사건의시작시에, 배지는목적하는미생물또는미생물들로접종되고, 생물생산은시스템에임의의물질을첨가하지않고일어나도록허용된다. 그러나, 전형적으로, 생물생산사건의 " 배치 " 유형은탄소원의첨가와관련된배치이고, 종종 ph 및산소농도와같은제어요소에대한시도가이루어진다. 배치시스템에서, 시스템의대사물질및바이오매스조성은생물생산사건이중단되는시간까지일정하게변화한다. 배치배양물내에서, 세포는정적유도기에서고성장대수기로조정되어, 마침내성장률이감소되거나중단되는정지기에이른다. 처리되지않는경우, 정지기에서의세포는결국사멸할것이다. 대수기에서의세포는일반적으로목적하는최종산물또는중간체의벌크생산을담당한다. 표준배치시스템에대한변형은공급-배치시스템이다. 공급-배치생물생산공정은또한본발명에적합하며, 기질을비롯한영양분이생물생산이진행됨에다라증분으로첨가되는것을제외하고는전형적인배치시스템을포함한다. 공급-배치시스템은이화물질억제가세포의대사를억제하기쉽고배지에제한된양의기질이존재하는것이바람직한경우에유용하다. 공급-배치시스템중실제영양분농도의측정은, 예컨대상이한시간에서샘플분석에의해직접측정될수있거나, 측정가능한인자, 예컨대 ph, 용존산소및 CO 2 와같은폐기가스

16 의부분압의변화를기초로평가될수있다. 배치및공급-배치접근법은관련기술분야에통상적이며널리공지되어있고, 실시예는생물생산에대한일반적인설명을위해본원에참조로포함된문헌 [Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass., Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227, (1992)] 및 [Biochemical Engineering Fundamentals, 2 nd Ed. J. E. Bailey and D. F. Ollis, McGraw Hill, New York, 1986] 에서찾을수있다. [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] 본발명의실시양태가배치모드또는공급-배치모드로수행될수있지만, 본발명은연속생물생산방법에적용가능할것이라고생각된다. 연속생물생산은한정된생물생산배지가생물반응기에연속적으로첨가되고동일한양의컨디셔닝배지가공정으로부터동시에제거되는 " 개방형 " 시스템으로여겨진다. 연속생물생산은일반적으로, 세포가주로증식기성장에있는제어된밀도범위내에서배양물을유지시킨다. 두가지유형의연속생물반응기작업은케모스탯 (chemostat) 을포함하며, 여기서신선한배지가용기에공급되면서동시에동일한비율의용기내용물이제거된다. 이러한접근법의한계는세포가소실되며일반적으로높은세포밀도가달성될수없다는것이다. 실제로, 전형적으로는공급-배치공정을이용하여훨씬높은세포밀도를얻을수있다. 또다른연속생물반응기는관류배양물을이용하는데, 이는용기로부터제거된스트림이생존가능한세포를다시용기로재순화시키는분리기술에제공된다는것을제외하고는캐모스탯접근법과유사하다. 이러한유형의연속생물반응기작업은공급-배치보다유의하게높은세포밀도를생성하는것으로나타났으며연속적으로작동될수있다. 연속생물생산은특히산업용작업에유리한데, 이는다음생물생산사건을위한장비를배수, 세척및준비하는데관련된시간을감소시키기때문이다. 또한, 전형적으로는증류와같은하류단위작업을연속적으로수행하는것이그를배치모드로수행하는것보다훨씬경제적이다. 연속생물생산은세포성장이나최종산물농도에영향을미치는하나의인자또는임의의수의인자를조절한다. 예를들어, 한방법은제한영양분, 예컨대탄소원또는질소수준을고정비율로유지시켜모든다른파라미터를적당하게만들것이다. 다른시스템에서, 성장에영향을미치는수많은인자들은배지혼탁도에의해측정된세포농도가일정하게유지되는동안연속적으로변경될수있다. 연속생물생산공정을위해영양분및성장인자를조절하는방법뿐만아니라산물형성속도를최대화하기위한기술은산업용미생물학분야에널리공지되어있으며, 각종방법이상기브록 (Brock) 의문헌에상세하게기재되어있다. 본발명의실시양태는배치, 공급-배치또는연속공정을사용하여실시될수있으며임의의공지된생물생산모드가적합할것이라고고려된다. 세포는전세포촉매로서불활성스캐폴드상에고정될수있으며화학적산물생물생산에적합한생물생산조건에제공되거나또는배양용기와같은용기내액체배지에서배양될수있다고고려된다. 따라서, 상기공정및이들공정을사용하는생물생산시스템에서이용되는실시양태들은본발명의유전자변형미생물집단, 상기집단을위한영양분을포함하는배지내상기집단을포함하는배양시스템, 및선택된화학산물의제조방법을포함한다. 본발명의실시양태는생물생산시스템에서의선택된화학산물의제조방법을포함하며, 이들방법중일부는상기생물생산사건후에지방산또는지방산유도된산물을수득하는것을포함할수있다. 예를들어, 지방산또는지방산유도된산물의제조방법은적합한영양분을포함하는배지를배양용기에제공하는것 ; 본원에기재된유전자변형을포함하는유전자변형미생물의접종물을배양용기에제공하여상기미생물이합성가스및 / 또는당분자로부터선택된화학산물을생산하도록하는것 ; 및유전자변형미생물이선택된화학산물을생산하기에적합한조건하에서배양용기를유지시키는것을포함할수있다. 하나이상의변형이결여된대조군미생물에비해화학산물생물생산을적어도 20 퍼센트증가시키기에유효한하나이상의측면을변형하도록유전자조작된재조합미생물을, 선택된화학산물의생산을위한산업용생물생산시스템을비롯한생물생산방법및시스템에서생산및이용하는것은본발명의범위내에속한다. 다양한실시양태에서, 본발명은, 미생물세포배양에적합한발효탱크 ; 발효탱크로부터의내용물을추출및 / 또는분리용기로방출시키기위한라인 ; 세포배양폐기물로부터화학산물을제거하기에적합한추출및 / 또는분리용기를포함하는, 본원에기재된바와같은화학산물의생물생산을위한시스템에관한것이다. 다양한실시양태에서, 상기시스템은하나이상의예비-발효탱크, 증류칼럼, 원심분리용기, 역추출칼럼, 혼합용기, 또는이들의조합을포함한다. 하기공개된문헌은, 이들관련분야의기술수준을나타내고, 필요에따라서는당공급원으로부터본발명하에생산되는화학산물 ( 들 ) 의산업용생물생산의생산방법및사용방법, 및또한본발명의임의의재조합미생물을이용하여상기전환을달성하는데사용될수있는산업용시스템을교시하는개시내용을지지하기위해

17 각각의교시를위해본원에참조로포함된다 ( 문헌 [Biochemical Engineering Fundamentals, 2 nd Ed. J. E. Bailey and D. F. Ollis, McGraw Hill, New York, 1986] ( 나타낸목적에대한전체서적 ) 및 [Chapter 9, pages ] ( 특히생물학적반응기디자인에대한것 ); [Unit Operations of Chemical Engineering, 5 th Ed., W. L. McCabe et al., McGraw Hill, New York 1993] ( 나타낸목적에대한전체서적및특히공정및분리기술분석에대한것 ); [Equilibrium Staged Separations, P. C. Wankat, Prentice Hall, Englewood Cliffs, NJ USA, 1988] ( 분리기술교시에대한전체서적 )). [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] E. 유전자변형, 뉴클레오티드서열및아미노산서열본발명의실시양태는, 숙주미생물에서통상적으로발견되거나발견되지않는효소를코딩하는핵산서열을함유하는발현백터를숙주미생물에도입시키는것으로부터유래될수있다. 숙주세포를유전자변형시킬수있는능력은임의의유전자변형 ( 재조합 ) 미생물의생산에필수적이다. 유전자전달기술의방식은전기천공, 접합, 형질도입, 또는천연형질전환에의할수있다. 광범위한숙주접합성플라스미드및약물내성마커가이용가능하다. 클로닝벡터는상기숙주에서기능할수있는항생제내성마커의성질에기반하여숙주미생물에맞게구축될수있다. 또한, 본원에개시된바와같이, 유전자변형 ( 재조합 ) 미생물은플라스미드도입을통한변형이외에그의게놈 DNA에대한변형을비롯한변형을포함할수있다. 아미노산서열중일부아미노산이단백질의구조또는기능에대한유의한영향없이변할수있다는것은오래전부터관련기술분야에서인식되어왔다. 포함되는변이체는, 나타낸효소활성이유의하게불리한영향을받지않는한결실, 삽입, 역전, 반복및유형치환을구성할수있다. 어떤아미노산변화가표현형상침묵할것같은지에관한지침은특히문헌 [Bowie, J. U., et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247: (1990)] 에서찾을수있다. 이문헌은상기교시를위해참조로포함되나, 이는또한통상의기술자에게일반적으로공지되어있다. 다양한실시양태에서, 본발명의폴리뉴클레오티드분자의발현에의해수득된폴리펩티드는, 지방산또는지방산유도된산물내성-관련및생합성경로에대해본원에기재된유전자및 / 또는핵산서열에의해코딩된하나이상의아마노산서열과적어도대략 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 의동일성을가질수있다. 실용적인문제로서, 임의의특정폴리펩티드가본원에기재된임의의폴리펩티드의임의의참조아미노산서열 ( 본원에기재된특정핵산서열에상응할수있음 ) 과적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하든지간에, 상기특정폴리펩티드서열은통상적으로공지의컴퓨터프로그램, 예컨대베스트핏 (Bestfit) 프로그램 ( 위스콘신서열분석패키지, 버전 8 포유닉스 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix), 미국 위스콘신주메디슨사이언스드라이브 575 유니버시티리처시파크소재의제네틱스컴퓨터그룹 (Genetics Computer Group)) 을사용하여결정될수있다. 특정서열이본발명에따른참조서열과예를들어 95% 동일한지여부를결정하기위해베스트핏또는임의의다른서열정렬프로그램을사용하는경우, 동일성백분율이참조아미노산서열의전체길이에대해계산되고참조서열중아미노산잔기의전체개수에대해 5% 이하의상동성차이가허용되도록파라미터가설정된다. 예를들어, 구체적실시양태에서참조서열 ( 질의서열, 즉본발명의서열 ) 과대상서열사이의동일성은또한전체적인서열정렬로서지칭되며, 브루틀래그 (Brutlag) 등의알고리즘 (Comp. App. Biosci. 6: (1990)) 을기초로한 FASTDB 컴퓨터프로그램을이용하여결정될수있다. FASTDB 아미노산정렬에서사용되는, 동일성이좁게해석되는특정실시양태를위한바람직한파라미터는다음과같다 : 스코어링설계 =PAM ( 돌연변이허용백분율 ) 0, k-투플 =2, 미스매치페널티 =1, 연결페널티 =20, 무작위군길이 =0, 컷오프스코어 =1, 윈도우크기 = 서열길이, 갭페널티 =5, 갭크기페널티 =0.05, 윈도우크기 =500 또는대상아미노산서열의길이 ( 이중에서더짧은것 ). 이러한실시양태에따라, 대상서열이내부결실이아니라 N- 또는 C-말단결실로인해질의서열보다더짧은경우에, FASTDB 프로그램이전체적인동일성백분율계산시에대상서열의 N- 및 C-말단말단절단을설명하지못한다는사실을고려하여결과가수동으로보정된다. 질의서열에비해 N- 및 C-말단에서말단절단된대상서열에대해, 동일성백분율은상응하는대상잔기와매치 / 정렬되지않는, 대상서열의 N- 및 C-말단에위치하는질의서열의잔기의수를질의서열의총염기의백분율로서계산함으로써보정된다. 잔기가매치 / 정렬되는지의여부는 FASTDB 서열정렬의결과에의해결정된다. 이어서, 상기백분율은최종동일성백분율스코어를얻기위해특정된파라미터를사용하는 FASTDB 프로그램에의해계산된동일성백

18 분율로부터차감된다. 상기최종동일성백분율스코어는본실시양태의목적을위해사용되는것이다. 질의서열과매치 / 정렬되지않는, 대상서열의 N- 및 C-말단에위치하는잔기만이동일성백분율스코어를수동으로조정하기위한목적으로고려된다. 즉, 대상서열의가장먼 N- 및 C-말단잔기바깥쪽의질의잔기위치만이상기수동보정을위해고려된다. 예를들어, 90개아미노산잔기의대상서열은동일성백분율을결정하기위해 100개잔기의질의서열과정렬된다. 결실은대상서열의 N-말단에서발생하고, 따라서 FASTDB 정렬은 N-말단에서처음 10개의잔기와매치 / 정렬되지않는다. 10개의짝을이루지않은잔기는서열의 10% ( 매치되지않는 N- 및 C- 말단의잔기의수 / 질의서열내의잔기의총수 ) 이고, 따라서 10% 를 FASTDB 프로그램으로계산된동일성백분율스코어로부터차감한다. 나머지 90개의잔기가완벽하게매칭된다면, 최종동일성백분율은 90% 일것이다. 또다른예에서, 90개잔기의대상서열은 100개잔기의질의서열과비교된다. 이때결실은내부결실이고, 따라서대상서열의 N- 또는 C-말단에는질의서열과매치 / 일치되지않는잔기가없다. 이경우에, FASTDB로계산된동일성백분율은수동으로보정되지않는다. 다시말해, 질의서열과매치 / 일치되지않는, FASTDB 정렬에서제시되는대상서열의 N- 및 C-말단끝바깥쪽의잔기위치만이수동으로보정된다. [0120] [0121] 보다일반적으로, 제어서열과상용가능한조건하에이. 콜라이와같은미생물에서코딩서열의발현을지시하는하나이상의 ( 여러 ) 제어서열에작동가능하게연결된효소활성을갖는폴리펩티드를코딩하는단리된폴리뉴클레오티드를포함하는핵산구축물이제조될수있다. 단리된폴리뉴클레오티드는폴리펩티드를발현시키도록조작될수있다. 폴리뉴클레오티드의서열을벡터내로삽입하기전에조작하는것이발현벡터에따라바람직하거나필요할수있다. 재조합 DNA 방법을이용하여폴리뉴클레오티드서열을변형하는방법은관련기술분야에널리확립되어있다. 제어서열은본발명의폴리펩티드를코딩하는폴리뉴클레오티드의발현을위해숙주세포에의해인식되는뉴클레오티드서열인적절한프로모터서열일수있다. 프로모터서열은폴리펩티드의발현을매개하는전사제어서열을함유한다. 프로모터는돌연변이, 말단절단및하이브리드프로모터를포함한, 선택된숙주세포에서전사활성을나타내는임의의뉴클레오티드서열일수있으며, 숙주세포에대해동종또는이종인세포외또는세포내폴리펩티드를코딩하는유전자로부터수득될수있다. 특히, 이. 콜라이숙주세포에서핵산구축물의전사를지시하기에적합한프로모터의예로는 lac 프로모터 (Gronenborn, 1976, MoI. Gen. Genet. 148: ), tac 프로모터 (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25), trc 프로모터 (Brosius et al, 1985, J. Biol. Chem. 260: ), T7 RNA 폴리머라제프로모터 (Studier and Moffatt, 1986, J. MoI. Biol. 189: ), 파지프로모터 p L (Elvin et al., 1990, Gene 87: ), teta 프로모터 (Skerra, 1994, Gene 151 : ), arabad 프로모터 (Guzman et al., 1995, J. Bacteriol. 177: ), 및 rhap BAD 프로모터 (Haldimann et al., 1998, J. Bacteriol. 180: ) 가있다. 다른프로모터는문헌 [Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94]; 및 [Sambrook and Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Third Edition 2001 (volumes 1-3), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 에기재되어있다. [0122] [0123] 제어서열은또한전사를종결하도록숙주세포에의해인식되는서열인적합한전사종결자서열일수있다. 종결자서열은폴리펩티드를코딩하는뉴클레오티드서열의 3' 말단에작동가능하게연결된다. 이. 콜라이세포에서기능하는임의의종결자가본발명에사용될수있다. 또한, 숙주세포의성장에대해폴리펩티드의발현을조절하는조절서열을추가하는것이바람직할수있다. 조절시스템의예는, 조절화합물의존재를비롯한화학적또는물리적자극에대한반응에있어서유전자의발현이켜지거나꺼지도록하는시스템이다. 원핵생물계에서의조절시스템은 lac, tac, 및 trp 오퍼레이터시스템을포함한다. 본발명의다양한실시양태에있어서, 유전자조작은임의의각경로에서확인된효소또는효소활성의조절, 및그에따른최종활성을변화시키도록지시되는조작을비롯한다양한유전자조작을포함하는것으로기재될수있다. 상기유전자변형은선택및 / 또는확인된배양조건하에효소활성및 / 또는선택성의변화를일으키는전사, 번역및번역-후변형, 및 / 또는지방산또는지방산유도된산물생산과관련된효소의카피수및 / 또는돌연변이체를증가시키기위한것과같은추가의핵산서열의제공에관한것일수있다. 상기유전자변형을달성하기위한특정방법및접근법은통상의기술자에게널리공지되어있으며, 내인성유전요소의발현증가 ; 리프레서유전자의기능성감소 ; 이종유전요소의도입 ; 지방산또는지방산유도된산물을생산하도록효소전환단계를촉매화하는폴리펩티드를코딩하는핵산서열의카피수증가 ; 특정효소활성을증가시키도록돌연변이된단백질을제공하기위해유전요소를돌연변이시키는것 ; 과다발현 ; 저발현 ; 샤페론의과다발현 ; 프로테아제의녹아웃 ; 피드백억제의변경또는변형 ; 리프레서및 / 또는경쟁적억제제에대한하나이상의손상된결합부위를포함하는효소변이체의제공 ; 리프레서유전자의녹아웃 ; 유효수준의개선을달성하기위한

19 유효카피수및프로모터를갖는플라스미드의사용뿐만아니라 mrna 안정성을개선시키기위한진화, 선택및 / 또는다른접근법을포함하지만이에제한되지않는다. 임의의상기또는다른언급된접근법에속할수있는유전자변형을제공하도록무작위돌연변이유발이실시될수있다. 유전자변형은또한광범위하게는, 관심핵산에의하나이상의핵산의부가 ( 삽입포함 ), 결실 ( 예컨대돌연변이에의한것 ) 및치환으로분류된다. 다양한실시양태에서, 유전자변형은효소의비활성및 / 또는효소의턴오버수를개선시킨다. 제한되지않으면서, 변화는하기중하나이상으로측정될수있다 : K M ; K cat ; 및 K 결합력. [0124] [0125] [0126] [0127] [0128] [0129] 다양한실시양태에서, 보다효율적으로기능하기위해, 미생물은하나이상의유전자결실을포함할수있다. 예를들어, 이. 콜라이에서, 락테이트데히드로게나제 (ldha), 포스페이트아세틸트랜스페라제 (pta), 피루베이트옥시다제 (poxb), 및피루베이트-포르메이트리아제 (pflb) 를코딩하는유전자가파괴 ( 결실포함 ) 될수있다. 이러한유전자파괴 ( 결실포함 ) 는이에제한됨을의미하지않으며다양한실시양태에서다양한조합으로이행될수있다. 유전자결실은돌연변이성유전자결실접근법에의하고 / 거나, 감소되거나또는발현되지않는하나이상의이들효소를갖는돌연변이균주로출발하고 / 거나, 통상의기술자에게공지된다른방법에의해달성될수있다. 유전자결실은진브릿지스 (Gene Bridges) ( 진브릿지스게엠베하 (Gene Bridges GmbH), 독일드레스덴, << 에의해시판되는키트및기타시약을사용하여 RED/ET 방법을비롯한 ( 이에제한되지는않음 ) 수많은공지의특정방법중임의의방법에의해수행될수있다. 후자의방법에관하여보다구체적으로, Red/ET 재조합의이용은통상의기술자에게공지되어있으며미국특허번호 6,355,412 및 6,509,156 ( 스튜어트 (Stewart) 등에게허여되고이방법의교시를위해본원에참조로포함됨 ) 에기재되어있다. 상기방법을위한물질및키트는진브릿지스 ( 진브릿지스게엠베하, 독일드레스덴, << 로부터입수가능하고, 상기방법은제조업체의지침서에따라진행할수있다. 상기방법은 λ-파지로부터의리콤비나제에의해수행되는상동성재조합을통해표적유전자를선택가능한마커로대체하는것을포함한다. λ-red 리콤비나제를발현하는숙주미생물은표적유전자와상동성인종결영역 ( 일반적으로 ~50 bp, 및대안적으로약 ~300 bp 이하 ) 이인접하는선택가능한마커를코딩하는선형 DNA 산물로형질전환된다. 이어서, 마커는 FLP-리콤비나제또는 Cre와같은또다른재조합효소를보유한플라스미드벡터에의해수행되는또다른재조합단계에의해제거될수있다. 미생물염색체 DNA 일부의표적화된결실또는미생물염색체에의외래유전물질의부가를실시하여숙주세포의대사를변경함으로써목적하지않는대사산물의생산을감소시키거나제거할수있고, 예컨대아세테이트, 에탄올, 락테이트등, 또는그의조합을제거할수있다 ( 예를들어, 도 5 참조 ). 이는본원의일반실시예에기재된바와같은다른유전자변형과조합되어사용될수있다. 본상세한설명에서는, 다수의실시양태를참조하고, 본발명을실시할수있는특정예시적실시양태의예시를통해나타낸첨부도면을참조하였다. 이들실시양태는통상의기술자가본발명을실시할수있도록충분히상세하게기재되어있고, 다양한개시실시양태에대한변형이통상의기술자에의해이루어질수있다고이해될것이다. 추가로, 지방산또는지방산유도된산물생산을위해, 상기유전자변형은각지방산또는지방산유도된산물생산경로내의특정효소전환단계를통해보다높은유동속도를달성하도록선별및 / 또는선택될수있으며, 따라서기초적방식및 / 또는주요방식으로일반적인세포대사에영향을미칠수있다. 예를들어, 일부실시양태에서, 속도는당으로부터아세틸-CoA로의유동을증가시키는유전자변형에의해증가될수있다. 아미노산 " 상동성 " 은보존적치환, 즉한폴리펩티드에서소정의아미노산을유사한특성의또다른아미노산으로대체하는것을포함한다고이해될것이다. 전형적으로하기대체가보존적치환으로여겨진다 : 지방족아미노산, 예컨대 Ala, Val, Leu 및 Ile을또다른지방족아미노산으로대체 ; Ser을 Thr으로대체하거나또는그반대 ; 산성잔기, 예컨대 Asp 또는 Glu을또다른산성잔기로대체 ; 아미드기를갖는잔기, 예컨대 Asn 또는 Gln을아미드기를갖는또다른잔기로대체 ; 염기성잔기, 예컨대 Lys 또는 Arg을또다른염기성잔기로교환 ; 및방향족잔기, 예컨대 Phe 또는 Tyr을또다른방향족잔기로대체. 본원에제공된모든핵산및아미노산서열에대해, 이들서열의보존적으로변형된변이체가포함되며, 그의다양한실시양태에서본발명의범위내에속한다고이해된다. 보존적으로변형된변이체뿐만아니라보다광범위하게변이된서열을포함할수있는기능적으로동등한핵산및아미노산서열 ( 기능적변이체 ) ( 이들은통상의기술자의기술내에속함 ), 및이들을포함하는미생물이또한본발명의다양한실시양태의범위내에속하고, 상기서열및 / 또는미생물을포함하는방법및시스템도마찬가지이다. 다양한실시양태에서, 충분히상동성인단백질또는그의일부분을코딩하는핵산서열이본발명의범위내에속한다. 보다일반적으로, 본발명에이용된특정아미노산서열을코딩하는핵산서열은유전코드의축중성으로인해변할수있으나, 그럼

20 에도불구하고본발명의범위내에속한다. 하기표는보존적치환및덜보존적치환이기초로삼을수있는 아미노산사이의유사성의요약, 및또한상기축중성을반영하는다양한코돈중복을제공한다. [0130] 표 1: 아미노산사이의유사성 [0131] [0132] [0133] 범례 : 측기및다른관련특성 : A= 산성 ; B= 염기성 ; Ali= 지방족 ; Ami= 아민 ; Aro= 방향족 ; N= 비극성 ; PU= 극성비하전 ; NEG= 음으로하전 ; POS= 양으로하전. 또한, 본원에인용된특정핵산서열의변이체및일부및각각의코딩된아미노산서열은, 상기핵산서열변이체및 / 또는일부가본원에인용된핵산서열에제시된임의의 15개의뉴클레오티드서열 ( 뉴클레오티드번호 1에서시작하여뉴클레오티드번호 15에서종료되는서열, 뉴클레오티드번호 2에서시작하여뉴클레오티드번호 16에서종료되는서열, 뉴클레오티드번호 3에서시작하여뉴클레오티드번호 17에서종료되는서열등을포함하지만이에제한되지않음 ) 과동일한 15개의뉴클레오티드서열을함유하는경우, 목적하는기능성, 예를들어선택된수준의효소활성을나타낼수있다. 본발명은또한, 15개초과의뉴클레오티드 ( 예를들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개, 또는그초과의뉴클레오티드 ) 길이이며본원에인용된핵산서열에제시된서열의임의의부분과동일한뉴클레오티드서열을함유하는단리된핵산을제공한다. 예를들어, 본발명은본원에인용된임의의하나이상 ( 임의의군포함 ) 의핵산서열에제시된임의의 25 개의뉴클레오티드서열 ( 뉴클레오티드번호 1에서시작하여뉴클레오티드번호 25에서종료되는서열, 뉴클레오티드번호 2에서시작하여뉴클레오티드번호 26에서종료되는서열, 뉴클레오티드번호 3에서시작하여뉴클

21 레오티드번호 27에서종료되는서열등을포함하지만이에제한되지않음 ) 과동일한 25개의뉴클레오티드서열을함유하는단리된핵산을제공한다. 추가의예는 50개이상의뉴클레오티드 ( 예를들어, 100, 150, 200, 250, 300개, 또는그초과의뉴클레오티드 ) 길이이며본원에개시된임의의서열의임의의부분과동일한뉴클레오티드서열을함유하는단리된핵산을포함하지만이에제한되지않는다. 이러한단리된핵산은, 예컨대지방산또는지방산유도된산물생산경로, 지방산신타제시스템의효소를코딩하는핵산서열, 또는지방산또는지방산유도된산물내성에관한논의및 / 또는예의임의의한섹션에서나타낸핵산서열을함유하는단리된핵산을포함할수있지만이에제한되지않는다. 예를들어, 본발명은단일삽입, 단일결실, 단일치환, 복수삽입, 복수결실, 복수치환, 또는이들의임의의조합 ( 예를들어, 단일결실과함께복수삽입 ) 을함유하는, 본원에열거된핵산서열을함유하는단리된핵산서열을제공한다. 이러한단리된핵산분자는본원에열거된 ( 즉, 서열목록내 ) 핵산서열과적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열동일성을공유할수있다. [0134] [0135] [0136] [0137] [0138] 추가의예는비제한적으로, 50개이상의아미노산잔기 ( 예를들어, 100, 150, 200, 250, 300개, 또는그초과의아미노산잔기 ) 길이이며본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열의임의의부분과동일한아미노산서열을코딩하는핵산서열을함유하는단리된핵산을포함한다. 또한, 본발명은본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열의변이를갖는아미노산서열을코딩하는핵산서열을함유하는단리된핵산을제공한다. 예를들어, 본발명은단일삽입, 단일결실, 단일치환, 복수삽입, 복수결실, 복수치환, 또는이들의임의의조합 ( 예를들어, 단일결실과함께복수삽입 ) 을함유하는, 본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열을코딩하는핵산서열을함유하는단리된핵산을제공한다. 이러한단리된핵산분자는본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열과적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 또는 99% 서열동일성을공유하는아미노산서열을코딩하는핵산서열을함유할수있다. 보존적및다른아미노산치환을위한염기를제공하는성질의예가상기표 1에예시되어있다. 따라서, 통상의기술자는목적하는기능성을나타내는아미노산서열변이체를얻기위해수많은치환을만들수있다. BLASTP, CLUSTALP, 및다른정렬및비교도구를사용하여, 거의치환이이루어지지않을수있는고도로보존된영역을평가할수있다 ( 선택된수준으로활성을변경하도록지시되지않는한복수의치환을필요로할수있음 ). 활성부위또는다른결합또는구조모티프와관련이없다고인식되거나생각되는영역에서보다많은치환이이루어질수있다. 상기표 1에따르면, 예를들어, 임의로크기 / 분자량을고려하면서, 열거된서열중극성비전하 (PU) 아미노산대신한극성비전하아미노산을사용할수있다 ( 즉, 트레오닌대신세린을사용함 ). 어떤아미노산변화가표현형상침묵할것같은지에관한지침은특히문헌 [Bowie, J. U., et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247: (1990)] 에서찾을수있다. 이문헌은상기교시를위해참조로포함되나, 이는또한통상의기술자에게일반적으로공지되어있다. 인식된보존적아미노산치환은하기를포함할수있다 ( 한세트중각콜론뒤가치환가능한아미노산임 ): ala:ser; arg:lys; asn:gln 또는 his; asp:glu; cys:ser; gln:asn; glu:asp; gly:pro; his:asn 또는 gln; ile:leu 또는 val; leu:ile 또는 val; lys: arg 또는 gln 또는 glu; met:leu 또는 ile; phe:met 또는 leu 또는 tyr; ser:thr; thr:ser; trp:tyr; tyr:trp 또는 phe; val:ile 또는 leu. 특정종에대한코돈선호도및코돈사용표는그특정종의코돈사용선호도를이용하는단리된핵산분자를조작하는데사용될수있음을주목한다. 예를들어, 본원에제공된단리된핵산은특정관심미생물에의해우선적으로사용되는코돈을갖도록설계될수있다. 수많은소프트웨어및서열분석서비스가상기서열코돈- 최적화에이용가능하다. 본발명은본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열의전체아미노산서열을함유하는폴리펩티드를제공한다. 또한, 본발명은본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열의일부를함유하는폴리펩티드를제공한다. 예를들어, 본발명은본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열의임의의 15개의아미노산서열 ( 아미노산잔기번호 1에서시작하여아미노산잔기번호 15에서종료되는서열, 아미노산잔기번호 2에서시작하여아미노산잔기번호 16에서종료되는서열, 아미노산잔기번호 3에서시작하여아미노산잔기번호 17에서종료되는서열등을포함하지만이에제한되지않음 ) 에동일한 15개의아미노산서열을함유하는폴리펩티드를제공한다. 본발명은또한 15개초과의아미노산잔기 ( 예를들어, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개, 또는그초과의아미노산잔기 ) 길이이며본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열의임의의부분과동일한아미노산서열을함유하는폴리펩티드를제공한다고이해될것이다. 예를들어, 본발명은본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열의임의의 25개의아미노산

22 서열 ( 아미노산잔기번호 1에서시작하여아미노산잔기번호 25에서종료되는서열, 아미노산잔기번호 2에서시작하여아미노산잔기번호 26에서종료되는서열, 아미노산잔기번호 3에서시작하여아미노산잔기번호 27에서종료되는서열등을포함하지만이에제한되지않음 ) 과동일한 25개의아미노산서열을함유하는폴리펩티드를제공한다. 추가의예는비제한적으로, 50개이상의아미노산잔기 ( 예를들어, 100, 150, 200, 250, 300개, 또는그초과의아미노산잔기 ) 길이이며본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열의임의의부분과동일한아미노산서열을함유하는폴리펩티드를포함한다. 또한, 상기에따라, 15개의뉴클레오티드서열은 5개의아미노산서열을제공할것이고, 후자및보다긴아미노산서열은본원에제공된서열과동일성을갖는상기기재된뉴클레오티드서열길이에의해정의될수있다고이해된다. [0139] [0140] [0141] [0142] [0143] [0144] 또한, 본발명은아미노산서열이본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열에제시된아미노산서열의변이를갖는것인폴리펩티드를제공한다. 예를들어, 본발명은단일삽입, 단일결실, 단일치환, 복수삽입, 복수결실, 복수치환, 또는이들의임의의조합 ( 예를들어, 단일결실과함께복수삽입 ) 을함유하는본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열을함유하는폴리펩티드를제공한다. 상기폴리펩티드는본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열과적어도 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 또는 99% 서열동일성을공유하는아미노산서열을함유할수있다. 특정변이아미노산서열은임의의수의변이뿐만아니라변이유형의임의의조합을포함할수있다. 본원에나타낸바와같이, 변이체아미노산서열을갖는폴리펩티드는효소활성을보유할수있다. 상기폴리펩티드는표준절차, 예컨대부위-지정돌연변이유발또는다양한 PCR 기술을사용하여폴리펩티드를코딩하는뉴클레오티드서열을조작함으로써생성될수있다. 본원에나타낸바와같이, 변형의한유형은 1개이상의아미노산잔기를유사한화학적및 / 또는생화학적성질을갖는아미노산잔기로치환하는것을포함한다. 예를들어, 폴리펩티드는하나이상의보존적치환을포함하는, 본원에열거되거나또는달리개시된아미노산서열에제시된아미노산서열을가질수있다. 덜보존적인치환을선택하고 / 거나, 보다중요할수있는서열의영역에서는, 예를들어 (a) 치환영역에서예를들어시트형또는나선형배열로서의폴리펩티드백본구조 ; (b) 표적부위에서폴리펩티드의전하또는소수성 ; 또는 (c) 측쇄의부피를유지시키는효과에있어서매우유의하게상이한잔기를선택함으로써, 보다실질적인변화를얻을수있다. 일반적으로폴리펩티드기능의최대변화를가져올것으로예상되는치환은 (a) 친수성잔기, 예를들어세린또는트레오닌을소수성잔기, 예를들어류신, 이소류신, 페닐알라닌, 발린또는알라닌대신사용하거나 ( 또는이들로치환하거나 ); (b) 시스테인또는프롤린을임의의다른잔기대신사용하거나 ( 또는이들로치환하거나 ); (c) 양전하측쇄를갖는잔기, 예를들어리신, 아르기닌또는히스티딘을음전하잔기, 예를들어글루탐산또는아스파르트산대신사용하거나 ( 또는이들로치환하거나 ); 또는 (d) 부피가큰측쇄를갖는잔기, 예를들어페닐알라닌을측쇄를갖지않는잔기, 예를들어글리신대신사용하는것 ( 또는이들로치환하는것 ) 이다. 이들아미노산치환 ( 또는다른결실또는부가 ) 의효과는효소활성을갖는폴리펩티드에대해, 그폴리펩티드가관련된천연폴리펩티드와동일한기질에서관련된천연폴리펩티드의동일한산물로의전환을촉매화하는능력을분석함으로써평가할수있다. 따라서, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 또는그초과의보존적치환을갖는폴리펩티드가본발명에서제공된다. 폴리펩티드및폴리펩티드를코딩하는핵산은표준 DNA 돌연변이유발기술, 예를들어 M13 프라이머돌연변이유발에의해생성될수있다. 이들기술의상세설명은문헌 [Sambrook and Russell, 2001] 에서제공된다. 핵산분자는분자가도입될특정미생물의코돈사용경향에맞춘코딩영역의변화를함유할수있다. 대안적으로, 코딩영역은, 핵산서열이실질적으로변경되지만그럼에도불구하고천연아미노산서열과동일하거나실질적으로유사한아미노산서열을갖는폴리펩티드를코딩하도록하는방식으로코딩서열을변경하도록유전코드의축중성을이용함으로써변경될수있다. 예를들어, 알라닌은오픈리딩프레임에서뉴클레오티드코돈트리플렛 GCT에의해코딩된다. 유전코드의축중성때문에, 3개의다른뉴클레오티드코돈트리플렛-- GCA, GCC 및 GCG--도또한알라닌을코딩한다. 따라서, 오픈리딩프레임의핵산서열은이위치에서, 코딩된폴리펩티드의아미노산서열또는폴리펩티드의특성에영향을미치지않으면서상기 3개의코돈중임의의코돈에대해변할수있다. 유전코드의축중성을기초로, 핵산변이체는본원에기재된바와같은표준 DNA 돌연변이유발기술을사용하거나또는핵산서열의합성에의해본원에개시된핵산서열로부터유래될수있다. 따라서, 다양한실시양태에있어서, 본발명은동일한폴리펩티드를코딩하지만유전코드의축중성에의해핵산서열이변한핵산분자를포함한다. 본발명은또한, 적어도약 12개염기길이 ( 예를들어, 적어도약 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30,

23 40, 50, 60, 100, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 또는 20000개염기길이 ) 이며혼성화조건하에서본원에열거되거나또는달리개시된서열을갖는핵산의센스또는안티센스가닥에혼성화된단리된핵산을제공한다. 혼성화조건은보통또는고도의엄격한혼성화조건일수있다. [0145] [0146] [0147] [0148] F. 천연말로닐-ACP 의존성지방산합성으로부터말로닐-CoA 의존성지방산합성으로의말로닐-CoA 재지시본발명의조성물, 예컨대유전자변형미생물은말로닐-CoA가기질인지방산또는지방산유도된산물에대한생산경로를포함하며, 또한하나이상의미생물의말로닐-ACP 의존성지방산신테타제시스템유전자에의해코딩된효소의활성을감소시키는하나이상의유전자변형을포함할수있다. 조성물은본발명의방법및시스템에사용될수있다. 관심있는다수의상업적발효미생물에서의수많은지방산또는지방산유도된산물의미생물발효와관련하여, 말로닐-CoA는통상적인성장조건하에서지방산및그의유도체, 예컨대인지질로전환된다음세포막및다른중요한세포기능에사용되는대사중간체이다. 예를들어, 에스케리키아콜라이에서, 지방산신타제시스템은유형 II 또는분해된지방산신타제시스템이다. 이시스템에서, 말로닐-ACP 의존성지방산생산경로의효소는별개의유전자에의해코딩되고, 많은중요한대사경로에대해공통적이며, 예컨대상류효소를억제하는하류산물에의해잘조절된다. 다양한미생물에서, 지방산합성시스템 ( 즉, 경로또는복합체 ) 을통한대사중간체말로닐-CoA의지방산으로의전환은말로닐-CoA의유일한또는주요한용도이다. 미생물에다른화학산물로의생산경로가존재하는경우, 상기말로닐-CoA의지방산으로의전환을감소시키는것이그다른화학산물의생산을위한계량을개선시킬수있다고결정되어있다. 예를들어, 다수의미생물세포에서, 지방산신타제시스템은하기효소활성을갖는폴리펩티드를포함한다 : 말로닐-CoA-아실운반단백질 (ACP) 트랜스아실라제 ; β-케토아실-acp 신타제 ; β -케토아실-ACP 리덕타제 ; β-히드록시아실-acp 데히드라타제 ; 3-히드록시아실-ACP 데히드라타제 ; 및에노일-ACP 리덕타제. 다양한실시양태에서, 이들폴리펩티드의온도-민감성형태를코딩하는핵산서열이천연효소를대신해도입될수있고, 상기유전자변형미생물이승온에서배양되는경우 ( 여기서이들열불안정성폴리펩티드는단백질구조의변경또는완전한변성으로인해부분적으로또는완전히불활성화됨 ), 화학산물에서의증가 가관찰된다. 이. 콜라이에서, 이들온도 - 민감성돌연변이유전자는 fabi ts (S241F), fabb ts (A329V) 또는 fabd ts (W257Q) 를포함할수있다. 다른실시양태에서, 예컨대하나이상의상기폴리펩티드의보다낮은효소활성을조절하도록하는다른유형의유전자변형이이루어질수있다. 다양한실시양태에서, 상기유전자변형의결과로말로닐-CoA 이용을이동시켜, 바이오매스전체에걸쳐천연경로를통한말로닐-CoA로부터지방산으로의감소된전환을가능하게하고, 이에비례하여말로닐-CoA 의존성및말로닐-ACP 독립성경로를통한탄소원의지방산또는지방산유도된산물을포함하는화학산물로의전환을증가시킨다. 다양한실시양태에서, 미생물학적으로생산된화학산물의비생산성은예상치않게높다. 또한, 예컨대말로닐-CoA 생산을증가시키는것과같은추가의유전자변형이특정실시양태에서이루어질수있다. 도 1은중간체말로닐-CoA를통한유동을증가시키기위한유전자변형과관련된미생물의대사경로를도시한다. [0149] [0150] 한효소에노일-아실운반단백질리덕타제 (EC 번호 , 에노일-ACP 리덕타제라고도지칭됨 ) 는말로닐- CoA로부터의지방산생합성을위한중요효소이다. 에스케리키아콜라이에서, 이효소 FabI는유전자 fabi에의해코딩된다 (fabi 및지방산신타제시스템의논의를위해참조로포함된문헌 ["Enoyl-Acyl Carrier Protein (fabi) Plays a Determinant Role in Completing Cycles of Fatty Acid Elongation in Escherichia coli," Richard J. Heath and Charles O. Rock, J. Biol. Chem. 270:44, pp (1995)] 참조 ). 본발명은발효사건동안조절될수있는에노일-ACP 리덕타제효소활성을갖는폴리펩티드를코딩하는핵산서열 ( 폴리뉴클레오티드 ) 이제공되는미생물을이용할수있다. 예를들어, 온도-민감성에노일-ACP 리덕타제를코딩하는핵산서열은천연에노일-ACP 리덕타제대신에제공될수있어, 상승된배양온도가효소활성을감소시키도록한다음, 말로닐-CoA를목적하는화학산물의생산에이용하도록이동시킨다. 이러한승온에서, 효소는온도와마찬가지로비-허용성으로여겨진다. 한상기서열은이. 콜라이의돌연변이온도-민감성 fabi (fabi TS ) 또는 fabi TS (S241F) 이다. [0151] 이. 콜라이이외의종에서에노일 -ACP 리덕타제에대한핵산및아미노산서열은공지의게놈데이터베이스, 예 컨대 BLASTN 및 BLASTP 에서상동성조사를수행함으로써용이하게얻어진다고이해된다. 다른종에서의상동체 및기능적동등서열을얻는접근법이본원에기재되어있다. 따라서, 본발명은통상의기술자에의해관심있

24 는다수의상업용미생물종에대해실시될수있다고이해된다. [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] 온도-민감성에노일-ACP 리덕타제이외의다른접근법, 예컨대천연에노일-ACP 또는에노일-CoA 리덕타제를이효소에대한유도성프로모터를포함하는핵산서열로대체하여, 초기의유도이후다른유도가존재하지않게함으로써, 선택된세포밀도가달성된후에노일-ACP 또는에노일-CoA 리덕타제효소활성을감소시키는방법 ( 이에제한되지는않음 ) 이통상의기술자에게공지된바와같이이용될수있다. 일부측면에서, 본발명은, 말로닐-CoA를선택된화학산물로전환시키는데유효한선택된화학산물생산경로를제공하거나완성하거나증진시키는하나이상의유전자변형을포함하고, 추가로미생물세포에서비카르보네이트수준을증가시키는탄산안히드라제의유전자변형및 / 또는비카르보네이트및 / 또는카르보네이트를함유한배양배지의보충물을포함하며, 추가로하나이상의아세틸-CoA 카르복실라제및 NADPH-의존성트랜스히드로게나제의효소활성을증가시키는하나이상의유전자변형을포함할수있는유전자변형미생물을포함한다. 관련방법및시스템은상기유전자변형미생물을이용한다. 다양한실시양태에서, 본발명은말로닐-CoA로부터의화학산물의생산을위한생산경로를포함하는유전자변형미생물집단의선택된세포밀도를용기에제공하는단계 ; 및유전자변형미생물의말로닐-ACP 의존성지방산신타제경로의하나이상의효소의효소활성을감소시키는단계를포함하는, 화학산물을제조하는방법에관한것이다. 다양한실시양태에서, 미생물숙주세포에서에노일-ACP 리덕타제의효소활성을감소시키는것은상승된비생산성및부피생산성으로화학산물을생산하도록한다. 또다른실시양태에서, 미생물숙주세포에서에노일- ACP 리덕타제의효소활성을감소시키는것은상승된비생산성및부피생산성으로화학산물을생산하도록한다. 도 2는말로닐-CoA 의존성방식을통한지방아실-CoA 합성을위한부티릴-CoA 프라이머를생산하는미생물의대사경로를도시한다. 이것은말로닐-CoA 의존성아세토아세틸-CoA 신타제효소의증가된활성을단독으로또는미생물의아세토아세틸-CoA 티올라제활성의감소와조합하여포함한다. 이어서, 아세토아세틸-CoA의말로닐-CoA 의존성생산은 3-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제또는 3-케토아실-CoA 리덕타제활성뿐만아니라에노일-CoA 히드라타제및트랜스-2-에노일-CoA 리덕타제활성의증가에의한부티레이트로의환원으로이어진다. 이어서, 부티릴-CoA 프라이머는장쇄지방아실-CoA 또는대안적으로부티레이트, 부탄올또는다른산물을생산하는데사용될수있다. 도 3a는프라이머부티릴-CoA로출발하는아세틸-CoA 의존성방식을통한지방아실-CoA 합성을생산하는미생물의대사경로를도시한다. 이것은 3-케토아실-CoA 티올라제활성, 3-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제또는 3-케토아실-CoA 리덕타제활성뿐만아니라에노일-CoA 히드라타제및트랜스-2-에노일-CoA 리덕타제활성의활성증가를포함한다. 도 3b는프라이머부티릴-CoA로출발하는말로닐-CoA 의존성방식을통한지방아실-CoA 합성을생산하는미생물의대사경로를도시한다. 이것은 3-케토아실-CoA 신타제또는엘롱가제활성, 3-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제또는 3-케토아실-CoA 리덕타제활성뿐만아니라에노일-CoA 히드라타제및트랜스-2-에노일-CoA 리덕타제활성의활성증가를포함한다. 이들효소의효소활성을감소시키는유전자변형에대한또다른접근법은상기한효소를촉진하는유도성프로모터, 예컨대에노일-ACP 리덕타제유전자 ( 예를들어, 이. 콜라이에서의 fabi) 를제공하는것이다. 상기예에서, 상기프로모터는본원의방법의제1 단계동안 ( 예컨대이소프로필-μ-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)) 에의해유도될수있으며, IPTG가고갈되거나제거되거나희석소멸된후, 에노일-ACP 리덕타제효소활성을감소시키는제2 단계가시작될수있다. 본원에기재되고 / 거나통상의기술자에게공지된바와같은다른접근법이효소발현및활성을제어하는데적용될수있다. 예를들어, 포스페이트고갈에반응하여켜지는프로모터를사용하여목적하는유전자를제어가능하게발현시킬수있다. 이러한프로모터는이. 콜라이에서의 yibd 또는 psts 유전자프로모터를포함할수있다. 에노일-CoA 리덕타제가지방산신타제시스템의중요한효소로고려되는동안, 본원에열거된것과같은상기시스템의효소활성을나타내는폴리펩티드를코딩하는폴리뉴클레오티드 ( 핵산서열 ) 의임의의조합에유전자변형이이루어질수있다. 예를들어, β-케토아실-아실운반단백질신타제 I인 FabB는포화및불포화지방산둘다의성장및생합성에필수적인이. 콜라이에서의효소이다. FabB의불활성화는지방산연장을억제하고세포성장을감소시킬뿐만아니라말로닐-ACP의말로네이트잔기를다시아세틸-CoA로재순환시키는쓸모없

25 는사이클을제거한다. β- 케토아실 - 아실운반단백질신타제 II 인 FabF 는포화지방산의합성및세포에서의 막유동성제어에필요하다. 두효소모두세룰레닌에의해억제된다. [0161] [0162] [0163] [0164] [0165] [0166] [0167] FabF의과다발현은지방산생합성을감소시킨다고보고된다. FabF는말로닐-CoA:ACP 트랜스아실라제인 FabD와의결합에대해 FabB와경쟁한다고제시된다. FabB와 FabD의결합은지방산연장을개시하는축합반응에필요하다 ( 문헌 [Microbiological Reviews, Sept. 1993, p Vol. 57, No. 3; K. Magnuson et al., "Regulation of Fatty Acid Biosynthesis in Escherichia coli," American Society for Microbiology; W. Zha et al., "Improving cellular malonyl-coa level in Escherichia coli via metabolic engineering," Metabolic Engineering 11 (2009) ] 참조 ). 상기지방산신타제효소를감소시키는유전자변형에대한대안은하나이상의상기효소의적합한억제제를배양시스템에제공하는것이다. 이러한접근법은독립적으로또는유전자변형접근법과조합하여실시될수있다. 하나이상의지방산신테타제시스템유전자에의해코딩되는효소의활성을감소시키도록지시된유전자변형또는세룰레닌, 티오락토마이신및트리클로산 ( 이목록에제한되지않음 ) 과같은억제제는단독으로또는조합하여이용될수있다. 특정이론에얽매이지않으면서, 미생물에서에노일-ACP 리덕타제 ( 및 / 또는지방산신타제시스템의다른효소 ) 의효소활성을감소시키는것은효소의상류대사중간체인말로닐-CoA의축적및 / 또는회피를유도하고, 이후상기말로닐-CoA는미생물세포가말로닐-CoA를이용하는대사경로를포함하는화학산물로전환될수있다고생각된다. 본발명의특정조성물, 방법및시스템에서, 유전자변형미생물의충분한세포밀도가달성된후에노일-ACP 리덕타제 ( 또는보다일반적으로지방산신타제시스템 ) 의효소활성의감소가일어난다. 이러한 2 단계배양접근법은특정생산속도를지지하는세포바이오매스에서의목적하는생체촉매양과수율간에균형을맞추어, 에노일-ACP 리덕타제활성 ( 및 / 또는지방산신타제시스템의다른효소의활성 ) 이감소된후탄소가세포매스에대해덜지시되도록하는데부분적으로기여할수있다. 이는말로닐-CoA의순이용을이동시켜, 목적하는화학산물로보다많은탄소가유동되도록한다. 본발명의다양한실시양태에서, 비생산성이상승하여전체적으로신속하고효율적인미생물발효방법및시스템이생성된다. 다양한실시양태에서, 부피생산성또한실질적으로상승한다. 교시및이전데이터 ( 예컨대지방산에대한것 ) 에기초한비생산성및부피생산성파라미터둘다에서의개선은예상치못했던것이며기술을진보시킨다. 에노일-ACP 리덕타제활성및 / 또는지방산신타제시스템의다른효소의감소는본원에논의된바와같은수많은방식으로달성될수있다. 말로닐-CoA의지방아실-ACP 또는지방아실-CoA 분자및지방산분자로의전환을 " 조절하는수단 " 은하기중어느하나를의미한다 : 1) 말로닐-ACP 의존성지방산신타제시스템효소 ( 예컨대본원에인용된것 ) 중하나의활성을갖는하나이상의폴리펩티드를코딩하는하나이상의폴리뉴클레오티드를미생물세포내에제공하는것 ( 여기서코딩된폴리펩티드는 ( 예컨대돌연변이및 / 또는프로모터치환등에의해 ) 보다낮은효소활성을갖거나또는 ( 예컨대온도민감도, 유도성프로모터등에의해 ) 감소된효소활성을갖도록조절될수있음 ); 2) 하나이상의말로닐-ACP 의존성지방산신타제시스템효소 ( 예컨대본원에인용된것 ) 의효소활성을억제하는억제제를이들하나이상의효소의효소활성을감소시키는데유효한용량으로, 미생물세포또는집단을포함하는용기에제공하는것. 이들수단은서로조합되어제공될수있다. 조절수단이발효사건동안, 예컨대온도-민감성지방산신테타제시스템폴리펩티드 ( 예를들어, 에노일-ACP 리덕타제 ) 를포함하는유전자변형미생물집단을포함하는배양용기의온도를증가시키거나억제제를첨가함으로써, 보다높은활성의지방산신테타제시스템으로부터보다낮은활성의지방산신테타제시스템으로의전환을포함하는경우, 두가지모드, 즉상기지방산신테타제시스템의보다높은활성이존재하는제1 모드및상기지방산신테타제시스템의보다낮은활성이존재하는제2 모드가구상된다. 보다낮은활성모드동안, 말로닐-CoA에서선택된화학산물의보다많은이용으로의이동이하나이상의말로닐-CoA 의존성, 말로닐-ACP 독립성지방아실-CoA 대사경로의증가된활성을통해진행될수있다. 조절이사실상나타낸효소활성 ( 들 ) 을감소시키면, 조절된각각의효소활성은 ( 예컨대세포또는단리된세포에서의 ) 비-조절된천연효소활성과비교하여적어도 10 퍼센트, 적어도 20 퍼센트, 적어도 30 퍼센트, 적어도 40 퍼센트, 적어도 50 퍼센트, 적어도 60 퍼센트, 적어도 70 퍼센트, 적어도 80 퍼센트또는적어도 90 퍼센트감소할수있다. 유사하게, 말로닐-CoA의지방아실-ACP 또는지방아실-CoA 분자로의전환은비-조절된세포또는다른시스템에서의상기전환과비교하여적어도 10 퍼센트, 적어도 20 퍼센트, 적어도 30 퍼센트, 적어도 40 퍼센트, 적어도 50 퍼센트, 적어도 60 퍼센트, 적어도 70 퍼센트, 적어도 80 퍼센트또는적어도 90 퍼센트

26 감소할수있다. 마찬가지로, 말로닐 -CoA 의지방산분자로의전환은비 - 조절된세포또는다른시스템에서의 상기전환과비교하여적어도 10 퍼센트, 적어도 20 퍼센트, 적어도 30 퍼센트, 적어도 40 퍼센트, 적어도 50 퍼센트, 적어도 60 퍼센트, 적어도 70 퍼센트, 적어도 80 퍼센트또는적어도 90 퍼센트감소할수있다. [0168] [0169] [0170] [0171] [0172] [0173] [0174] G. 말로닐-CoA로부터지방아실-CoA 의존성산물로의생산경로다양한실시양태에서, 본발명의조성물, 방법및시스템은말로닐-CoA를지방산또는지방산유도된산물로전환시키는대사생산경로의포함과관련된다. 임의의상기폴리펩티드는 NADH- 또는 NADPH-의존성일수있고, 관련기술분야에공지된방법을사용하여특정효소를어느한형태로전환시킬수있다. 보다구체적으로, 임의의방법을사용하여보조인자로서 NADPH를사용하는폴리펩티드를보조인자로서 NADH를사용하는폴리펩티드로전환시킬수있으며, 예컨대이들은다른문헌 [Eppink et al., J Mol. Biol., 292 (1) : (1999), Hall and Tomsett, Microbiology, 146 (Pt 6): (2000)] 및 [Dohr et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 98 (1) : (2001)] 에기재되어있다 ( 예를들어, WO 2002/ 참조 ). 다양한실시양태에서, 선택된화학산물의생물생산은, 예컨대본원에개시된방법중하나를사용하여적어도 1, 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 및적어도 50 g/ 리터역가에도달할수있다. 선택된화학산물의상업적발효에관한본원개시의진보를이해함으로써깨달을수있는바와같이, 본발명의실시양태는다른유전자변형및 / 또는방법또는시스템조절과조합되어, 최종 ( 예를들어소비된 ) 발효브로쓰 1 리터당적어도 10 그램, 적어도 20 그램, 적어도 30 그램, 적어도 40 그램, 적어도 45 그램, 적어도 50 그램, 적어도 80 그램, 적어도 100 그램또는적어도 120 그램의화학산물을생산하기에유효한미생물 ( 및상응하는방법 ) 을얻도록하면서이와함께본원에개시된비생산성및 / 또는부피생산성비율을달성하도록할수있다. 일부실시양태에서, 미생물화학생물생산사건 ( 즉, 미생물의배양된집단을사용하는발효사건 ) 은본원에기재된바와같은유전자변형미생물을사용하여진행되며, 여기서비생산성은시간당건조중량기준으로미생물세포그램당생산된선택된화학산물 0.01 그램내지 0.60 그램 (g 화학산물 /g DCW-hr) 이다. 다양한실시양태에서, 비생산성은 0.01 g 화학산물 /g DCW-hr 초과, 0.05 g 화학산물 /g DCW-hr 초과, 0.10 g 화학산물 /g DCW-hr 초과, 0.15 g 화학산물 /g DCW-hr 초과, 0.20 g 화학산물 /g DCW-hr 초과, 0.25 g 화학산물 /g DCW-hr 초과, 0.30 g 화학산물 /g DCW-hr 초과, 0.35 g 화학산물 /g DCW-hr 초과, 0.40 g 화학산물 /g DCW-hr 초과, 0.45 g 화학산물 /g DCW-hr 초과또는 0.50 g 화학산물 /g DCW-hr 초과이다. 비생산성은특정한미생물화학적생산사건에서 2, 4, 6, 8, 12 또는 24시간의기간에걸쳐평가될수있다. 보다구체적으로, 화학산물에대한비생산성은 0.05 내지 0.10 g 화학산물 /g DCW-h, 0.10 내지 0.15 g 화학산물 /g DCW-h, 0.15 내지 0.20 g 화학산물 /g DCW-h, 0.20 내지 0.25 g 화학산물 /g DCW-h, 0.25 내지 0.30 g 화학산물 /g DCW-h, 0.30 내지 0.35 g 화학산물 /g DCW-h, 0.35 내지 0.40 g 화학산물 /g DCW-h, 0.40 내지 0.45 g 화학산물 /g DCW-h, 또는 0.45 내지 0.50 g 화학산물 /g DCW-hr, 0.50 내지 0.55 g 화학산물 /g DCW-h, 또는 0.55 내지 0.60 g 화학산물 /g DCW-hr이다. 다양한실시양태는상기생산성을입증하는배양시스템을포함한다. 또한, 본발명의다양한실시양태에서, 달성된부피생산성은시간당리터당 0.25 g 지방산 ( 또는다른화학산물 ) (g ( 화학산물 )/L-hr) 일수있거나, 0.25 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 0.50 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 1.0 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 1.50 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 2.0 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 2.50 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 3.0 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 3.50 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 4.0 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 4.50 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 5.0 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 5.50 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 6.0 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 6.50 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 7.0 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 7.50 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 8.0 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 8.50 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 9.0 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 9.50 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있거나, 또는 10.0 g 지방산 ( 또는다른화학산물 )/L-hr 초과일수있다

27 [0175] [0176] [0177] [0178] [0179] [0180] [0181] [0182] [0183] [0184] [0185] [0186] 일부실시양태에서, 24-시간발효 ( 배양 ) 기간에걸쳐측정된비생산성은 (24-시간기간의종료시최종 DCW 기준으로 ) 미생물의그램 DCW당화학산물 0.01, 0.05, 0.10, 0.20, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0 또는 12.0 그램초과일수있다. 본발명의다양한측면및실시양태에서, 지방산 ( 이에제한되지는않음 ) 과같은미생물화학적생산의발효기술및상업적경제실행가능성을진보시키는미생물비생산성의실질적증가가존재한다. 또다른방식으로기술하면, 다양한실시양태에서, 비생산성은 0.01 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이거나, 0.05 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이거나, 0.10 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이거나, 0.15 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이거나, 0.20 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이거나, 0.25 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이거나, 0.30 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이거나, 0.35 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이거나, 0.40 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이거나, 0.45 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이거나, 0.50 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이거나, 또는 0.60 g 화학산물 /g DCW-hr 초과 ( 이상 ) 이다. 보다일반적으로, 임의로는본원에기재된보충물과조합한본원에기재된유전자변형의다양한조합을기준으로, 지방산또는지방산유도된산물및본원에기재된다른화학산물에대한비생산성값은 0.01 g 화학산물 /g DCW-hr 초과일수있고, 0.05 g 화학산물 /g DCW-hr 초과일수있고, 0.10 g 화학산물 /g DCW-hr 초과일수있고, 0.15 g 화학산물 /g DCW-hr 초과일수있고, 0.20 g 화학산물 /g DCW-hr 초과일수있고, 0.25 g 화학산물 /g DCW-hr 초과일수있고, 0.30 g 화학산물 /g DCW-hr 초과일수있고, 0.35 g 화학산물 /g DCW-hr 초과일수있고, 0.40 g 화학산물 /g DCW-hr 초과일수있고, 0.45 g 화학산물 /g DCW-hr 초과일수있고, 0.50 g 또는 0.60 g 화학산물 /g DCW-hr 초과일수있다. 상기비생산성은특정한미생물화학생산사건에서 2, 4, 6, 8, 12 또는 24 시간의기간에걸쳐평가될수있다. 본발명의실시양태에의해달성된개선은, ( 미생물집단을포함하는용기에첨가된본원교시의보충물의존재또는부재하에 ) 본원에교시된특정한유전자변형의조합이결여된적절한대조군미생물과비교하여, 비생산성의백분율증가또는부피생산성의백분율감소에의해결정될수있다. 특정한실시양태및그의군에서, 상기비생산성및 / 또는부피생산성개선은상기적절한대조군미생물의각각의비생산성및 / 또는부피생산성에비해적어도 10 퍼센트, 적어도 20 퍼센트, 적어도 30 퍼센트, 적어도 40 퍼센트, 적어도 50 퍼센트, 적어도 100 퍼센트, 적어도 200 퍼센트, 적어도 300 퍼센트, 적어도 400 퍼센트, 및적어도 500 퍼센트이다. 본명세서의특정방법및교시, 및 / 또는참조로포함된인용문헌이실시예에포함될수있다. 또한, 화학산물의생산은다양한실시양태에서적어도 1, 적어도 2, 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 30, 적어도 40, 및적어도 50 g/ 리터역가에도달할수있다. 계량은임의의조성물, 예를들어유전자변형미생물, 예를들어화학산물을생산하는방법, 및시스템, 예를들어본원에개시된유전자변형미생물및 / 또는방법을이용하는발효시스템에적용될수있다. 본원에제공된전략및방법을사용하며경로및경로일부의상호관련성발견에기반한반복적개선은, 생물생산사건의결과에서훨씬더많은화학산물생물생산을유도할수있다고이해된다. H. 유전자변형의조합일부실시양태에서, 효소활성을감소시키는적어도하나의유전자변형은유전자파괴이다. 일부실시양태에서, 효소활성을감소시키는적어도하나의유전자변형은유전자결실이다. 일부실시양태에서, 유전자변형은선택된화학산물을생산하는상기적어도하나의유전자변형이결여된대조군미생물의속도또는역가를초과하여상기선택된지방산또는지방산유도된산물의미생물합성을증가시킨다. 일부실시양태에서, 유전자변형은그유전자변형이결여된대조군미생물의효소적전환보다적어도약 5 퍼센트, 적어도약 10 퍼센트, 적어도약 20 퍼센트, 적어도약 30 퍼센트또는적어도약 50 퍼센트선택된화학산물로의효소적전환을증가시키는데유효하다. 효소또는효소활성에대한몇몇이들비-제한적유전자변형을하기표 2에나열한다

28 [0187] 표 2: 유전자변형 [0188]

29 [0189]

30 [0190]

31 [0191]

32 [0192]

33 [0193] [0194] [0195] 또한, 표 2의교시를기준으로효소기능을감소시키는것과관련하여, 본원에기재된다른유전자변형과조합된특정실시양태에서하기효소기능중어느하나또는조합이감소할수있다 : β-케토아실-acp 신타제 I, 3-옥소아실-ACP-신타제 I; 말로닐-CoA-ACP 트랜스아실라제 ; 에노일 ACP 리덕타제 ; 및 β-케토아실-acp 신타제 III. 따라서, 상기다양한섹션에기재된바와같이, 본발명의일부조성물, 방법및시스템은선택된화학산물, 예컨대지방산또는지방산유도된산물에대한생산경로, 및감소된활성을나타내는말로닐-ACP 의존성지방산신타제시스템의효소를코딩하는변형된폴리뉴클레오티드둘다를포함하는유전자변형미생물을제공하는것을포함하여, 상기변형이결여된비교가능한 ( 대조군 ) 미생물과비교하여말로닐-CoA의이용이생산경로쪽으로이동하도록한다. 상기방법은영양배지가제공된용기에서상기유전자변형미생물의집단을사용하여화학산물을제조하는것을포함한다. 다른효소, 예컨대아세틸-CoA 카르복실라제및 / 또는 NADPH-의존성트랜스히드로게나제에대한본원기재의다른유전자변형이일부상기실시양태에존재할수있다. 이들효소활성을나타내는폴리펩티드를코딩하는폴리뉴클레오티드의추가의카피를제공하는것은지방산또는지방산유도된산물생산을증가시키는것으로보인다. 이들각각의효소활성을증가시키는다른방식은관련기술분

34 야에공지되어있으며본발명의다양한실시양태에적용될수있다. [0196] [0197] 또한, 화학산물을제조하는일부다중-상방법실시양태에서의제1 단계는상기미생물, 예컨대박테리아, 및보다특히엔테로박테리아세아에과의구성원, 예컨대이. 콜라이의집단을제공하기위해용기, 예컨대배양물또는생물반응기용기에, 영양배지, 예컨대통상의기술자에게공지된바와같은최소배지, 및유전자변형미생물의접종물을제공함으로써예시될수있지만이에제한되지않으며, 여기서유전자변형미생물은말로닐 -CoA를선택된화학산물로전환시키는대사경로를포함한다. 이접종물은세포밀도가방법의다음단계를고려한전반적인생산성계량을만족시키는지방산또는지방산유도된산물의생산수준에이르기에적합한세포밀도로증가하도록용기에서배양된다. 다양한대안적인실시양태에서, 이들유전자변형미생물의집단은제1 준비용기에서제1 세포밀도로배양될수있으며, 이어서선택된세포밀도를제공하기위해언급된용기로전달될수있다. 수많은다중-용기배양전략은통상의기술자에게공지되어있다. 임의의상기실시양태는방법의언급된제1 단계에따라선택된세포밀도를제공한다. 또한, 다양한실시양태에서조합하여실시될수있는후속적인단계가또한 2가지접근법에의해예시될수있지만, 이는제한되지는않는다. 제1 접근법은그의에노일-ACP 리덕타제효소활성이조절될수있도록유전자변형미생물에유전자변형을제공한다. 하나의예로서, 유전자변형은온도-민감성돌연변이에노일-ACP 리덕 타제 ( 예를들어, 이. 콜라이에서의 fabi TS ) 로천연에노일-ACP 리덕타제를대체하도록만들어질수있다. 전자는배양온도를, 예를들어 34, 35, 36, 37 또는심지어는 42 로상승시키는것이에노일-ACP 리덕타제의효소활성을감소시키도록, 30 초과의온도에서는감소된효소활성을나타내지만 30 에서는정상효소활성을나타낼수있다. 이러한경우에, 30 에서보다많은말로닐-CoA가지방산또는지방산유도된산물또는또다른화학산물로전환되며, 여기서말로닐-CoA의지방산으로의전환은덜효과적인에노일-ACP 리덕타제에의해방해되지않는다. [0198] [0199] [0200] [0201] [0202] [0203] [0204] 산업적생물생산에서의선택된화학산물의상승된역가를야기할수있는본발명의생산증가측면에대해서, 유전자변형은미생물에대한하나이상의핵산서열의도입을포함하며, 여기서하나이상의핵산서열은하나이상의생산경로효소 ( 또는생산경로의효소의효소활성 ) 를코딩하고발현한다. 다양한실시양태에서, 이들개선은이로써선택된화학산물의산업적생물생산제조의효율및효능을증가시키고결과적으로이에대한비용을낮추기위해합해진다. 다양한실시양태에서, 유전자변형은선택되고 / 되거나확인된배양조건하에효소활성및 / 또는선택성의변화를유발하는전사적, 번역적및번역-후변형에대해지시될수있다. 따라서, 다양한실시양태에서, 더효율적으로기능하기위해미생물은하나이상의유전자결실을포함할수있다. 유전자결실은돌연변이성유전자결실접근법에의하고 / 거나, 감소되거나또는발현되지않는하나이상의이들효소를갖는돌연변이균주로출발하고 / 하거나, 통상의기술자에게공지된다른방법에의해달성될수있다. 본발명의측면은또한선택된탄소원을선택된화학산물, 예컨대폴리케티드로전환시키는것에대한미생물전반적인효과를개선시키기위해다중유전자변형의공급을고려한다. 실시예에서와같이, 유전자변형의더기초적인조합보다실질적으로비생산성, 부피생산성, 역가및수율을증가시키기위한특정조합이나타난다. 추가의유전자변형이본발명의미생물균주에서제공될수있다. 수많은상기변형이특정표현형을부여하기위해제공될수있다. 예를들어, 수크로스를이용하는능력이제공될수있으며, 이는지방산또는지방산유도된산물또는다른화학산물을생산하기위해이용될수있는공급원액의범위를확장한다. 이. 콜라이의일반적인실험실및산업적균주, 예컨대본원에기재된균주는수크로스를유일한탄소원으로서이용하지못한다. 수크로스및수크로스-함유공급원액, 예컨대당밀은풍부하고, 종종미생물발효에의한제조를위해공급원액으로서사용되기때문에, 수크로스의섭취및사용을허용하기위해적절한유전자변형을추가하는것이본원에제공된바와같은다른특징을갖는균주에서실시될수있다. 다양한수크로스섭취및대사시스템은관련기술분야에공지되어있으며 ( 예를들어, 미국특허번호 6,960,455), 상기교시를위해참조로포함된다. 이들및다른접근법이본발명의균주에서제공될수있다. 실시예는적어도 2가지접근법을제공한다. 또한, 더복잡한탄소원, 예컨대셀룰로스바이오매스또는그의산물의분해를위한기능성을, 이러한탄소원의섭취및 / 또는이용을위해추가하기위한유전자변형이제공될수있다. 예를들어, 수많은셀룰라제및셀룰라제-기재셀룰로스분해시스템이연구되고, 특성화되었다 ( 예를들어, 상기교시를위해본원에참조로

35 포함된문헌 [Beguin, P and Aubert, J-P (1994) FEMS Microbial. Rev. 13: 25-58; Ohima, K. et al. (1997) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 14: ] 참조 ). [0205] [0206] [0207] [0208] [0209] [0210] [0211] [0212] 상기기재된유전자변형에더하여, 다양한실시양태에서보조인자 NADPH의풀및이용가능성및 / 또는결과적으로 NADPH/NADP + 비를증가시키기위한유전자변형이또한제공된다. 예를들어, 이. 콜라이에대한다양한실시양태에서, 이는활성을증가시킴으로써, 예컨대하나이상의하기유전자의유전자변형 : pgi ( 돌연변이형태 ), pntab 과다발현, gapa:gapn 치환 / 대체, 및가용성트랜스히드로게나제, 예컨대 stha의파괴또는변형, 및 / 또는하나이상의 zwf, gnd 및 edd의유전자변형에의해수행될수있다. 임의의상기유전자변형이상기기능성을갖지않거나또는상기기능성의원하는수준미만을갖는종에대해제공될수있다. 보더일반적으로, 그리고유전자변형을위해선택된미생물의특정대사경로에따라, 임의의유전자변형의하위집단이아세테이트, 아세토인, 아세톤, 아크릴, 말레이트, 지방산에틸에스테르, 이소프레노이드, 글리세롤, 에틸렌글리콜, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 이소부틸렌, 에틸아세테이트, 비닐아세테이트, 다른아세테이트, 1,4-부탄디올, 2,3-부탄디올, 부탄올, 이소부탄올, sec-부탄올, 부티레이트, 이소부티레이트, 2-OH-이소부티레이트, 3-OH-부티레이트, 에탄올, 이소프로판올, D-락테이트, L-락테이트, 피루베이트, 이타코네이트, 레불리네이트, 글루카레이트, 글루타레이트, 카프로락탐, 아디프산, 프로판올, 이소프로판올, 퓨젤알콜, 및 1,2-프로판디올, 1,3-프로판디올, 포르메이트, 푸마르산, 프로피온산, 숙신산, 발레르산, 및말레산으로이루어진군으로부터선택된발효산물 ( 들 ) 의세포생산을감소시키도록이루어질수있다. 유전자결실은본원에일반적으로개시된바와같이이루어질수있으며, 다른접근법이또한선택된발효산물의세포성생산의원하는감소를달성하기위해사용될수있다. I. 개시된실시양태는비-제한적이다본발명의다양한실시양태를본원에나타내고기재하였지만, 상기실시양태는예로서만제공된다는것이강조되어야한다. 수많은변동, 변화및치환이본발명으로부터벗어나지않고그의다양한실시양태에서만들어질수있다. 구체적으로및무슨이유로든, 목록, 표또는다른군에언급되거나또는달리제시된임의의군의화합물, 핵산서열, 폴리펩티드, 예컨대특정단백질, 예컨대기능적효소, 대사경로효소또는중간체, 요소, 또는다른조성물, 또는농도 ( 예컨대도면에나타낸대사경로효소 ) 에대해, 명백히달리언급하지않는한, 각각의상기군은, 각각의언급된군의하나이상의구성원 ( 또는하위세트 ) 의배제에의해이러한군의모든하위세트를그의가장넓은범위에서포함하는다양한하위세트실시양태에대한기반을제공하여이를확인하는역할을하도록의도된다. 또한, 임의의범위가본원에기재된경우, 명백히달리언급하지않는한, 그범위는그안의모든값및그안의모든하위범위를포함한다. 또한, 그리고더일반적으로, 본원의개시, 논의, 예및실시양태에따라, 관련기술분야내의통상의분자생물학, 세포생물학, 미생물학및재조합 DNA 기술이사용될수있다. 상기기술은문헌에완전하게설명되어있다 ( 예를들어, 문헌 [Sambrook and Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Third Edition 2001 (volumes 1-3), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; [Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed., 1986.] 참조 ). 이들간행된자료는그안에서발견되는표준실험실방법그각각의교시에대해본원에참조로포함된다. 이러한포함은최소한본원에서참고문헌을인용하는경우언급될수있는특정한교시및 / 또는다른목적에대한것이다. 특정한교시및 / 또는다른목적이언급되지않았으면, 간행된자료는참고문헌의표제, 요약서및 / 또는개요중하나이상에의해나타낸교시 ( 들 ) 에대해구체적으로포함된다. 상기구체적으로확인된교시및 / 또는다른목적이관련성이없으면, 간행된자료는적용가능한경우본발명이관련된최신기술을더완전하게기재하고 / 하거나일반적으로통상의기술자에게공지된바와같은교시를제공하기위해포함된다. 그러나, 본원에서간행된자료의인용은이러한것이본발명에대한선행기술이라는것을인정하는것으로해석되어서는안된다는것이구체적으로언급된다. 또한, 포함된하나이상의간행된자료가정의된용어, 용어용법, 기재된기술등을포함하지만이에제한되지않는것에있어서본원과상이하거나또는모순되는경우에는본원이우선한다. 실시예에서의대상은이미존재하지않는정도까지이섹션에포함된다. III. 실시예본원의실시예는유전자변형및보충물첨가의조합의몇몇예를제공하며, 이에제한되지는않는다. 하기실시예는실제실시예및예측실시예모두를포함한다

36 [0213] [0214] [0215] [0216] [0217] [0218] [0219] [0220] [0221] [0222] 달리나타내지않는한, 온도는섭씨온도이고, 압력은해발대략 5,340 피트 (1,628 미터 ) 에서의대기압또는이에근접한대기압이다. 외부분석및합성기관에서수행된일은해발대략 5,340 피트 (1,628 미터 ) 에서의대기압또는이에근접한대기압에서수행되지않는다는것이주목된다. 달리나타내지않는한, 모든시약은상업적으로입수한다. 종및다른계통발생학적식별자는미생물학의통상의기술자에게공지된분류에따른것이다. 주요공급업체의명칭및도시주소가본원에제공된다. 또한, 퀴아젠 (Qiagen) 제품에관하여, 퀴아프렙 (QIAprep) 스핀 (" 미니프렙 "), 카탈로그번호 27106이플라스미드 DNA 정제에사용되고, 퀴아퀵 (QIAquick) 겔추출키트, 카탈로그번호 28706이본원에기재된바와같은겔추출에사용된다. 실시예 1 숙주세포에대한유전자변형의일반적실시예본실시예는관심핵산서열을도입하기위한선택된미생물의유전자변형에대한비제한적접근법을기재하고자한다. 대안및변형이본일반적실시예내에제공된다. 본실시예의방법을수행하여, 선택된미생물종및이들의기능적등가물, 예컨대다른박테리아및다른미생물종에서의목적하는유전자변형의조합, 예컨대본섹션에기재된바와같은유전자변형의조합을달성한다. 관심유전자또는다른핵산서열절편을특정한종 ( 예컨대, 본원에기재된바와같은이. 콜라이 ) 에서확인하고, 이러한유전자또는절편을포함하는핵산서열을획득한다. 관심절편의말단에위치하거나또는그의말단에인접한핵산서열에기초하여, 5' 및 3' 핵산프라이머를제조한다. 각각의프라이머가이러한말단또는인접영역과혼성화되는충분한중첩부분을갖도록설계한다. 이러한프라이머는후속적인벡터혼입또는게놈삽입에사용될수있는트랜스포사제삽입부의제한소화를위한효소인식부위를포함할수있다. 이들부위는전형적으로혼성화중첩부분의외측에위치되도록설계한다. 프라이머서열을주문에따라제조하는다수의계약서비스가공지되어있다 ( 예를들어, 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스 (Integrated DNA Technologies), 미국아이오와주코랄빌 ). 프라이머를설계및제조한후에, 폴리머라제연쇄반응 (PCR) 을수행하여관심목적절편을특이적으로증폭시킨다. 이방법에의해미생물의게놈으로부터분리된관심영역의다수의카피가얻어진다. 미생물의 DNA, 프라이머및고온성폴리머라제를완충용액에서칼륨및 2가양이온 ( 예를들어, Mg 또는 Mn), 및충분한양의데옥시뉴클레오시드트리포스페이트분자와함께합한다. 이혼합물을온도상승및하강의표준계획에노출시킨다. 그러나, 온도, 성분, 농도및주기횟수는카피될서열의길이에따른반응, 어닐링온도근사치, 및공지되거나또는통상의기술자에의한통상적인실험을통해용이하게학습된다른요인에따라달라질수있다. 대안적실시양태에서, 관심절편은미생물또는다른천연 DNA 공급원으로부터얻기보다는, 예컨대상업적판매처에의해합성하고, PCR을통해제조할수있다. 이어서, 핵산서열을, 예컨대아가로스겔상에서전기영동을통해정제및분리한다. 임의로, 상기영역을정제한후에, 표준 DNA 서열분석방법론으로검증할수있고, 벡터에도입할수있다. 일반적으로관련기술분야의통상의기술자에공지된마커를포함하는다수의벡터중임의의것을사용할수있고, 이러한도입에대한표준방법론을통상적으로사용한다. 통상적으로사용되는벡터시스템은 psmart ( 루시겐 (Lucigen), 미국위스콘신주미들턴 ), pet 이. 콜라이발현시스템 ( 스트라타진 (Stratagene), 미국캘리포니아주라졸라 ), psc-b 스트라타클론 (StrataClone) 벡터 ( 스트라타진, 미국캘리포니아주라졸라 ), pranger-btb 벡터 ( 루시겐, 미국위스콘신주미들턴 ) 및 TOPO 벡터 ( 인비트로겐코포레이션 (Invitrogen Corp.), 미국캘리포니아주칼스배드 ) 이다. 이어서, 유사하게, 상기벡터를다수의숙주세포중임의의것에도입한다. 통상적으로사용되는숙주세포는이. 클로니 (E. cloni) 10G ( 루시겐, 미국위스콘신주미들턴 ), 이. 클로니 10GF' ( 루시겐, 미국위스콘신주미들턴 ), 스트라타클론적격세포 ( 스트라타진, 미국캘리포니아주라졸라 ), 이. 콜라이 BL21, 이. 콜라이 BW25113 및이. 콜라이 K12 MG1655이다. 이들벡터중일부는관심서열이삽입될영역 ( 예컨대, 다중클로닝부위 ) 에인접한프로모터, 예컨대유도성프로모터를갖는반면에, 다른벡터, 예컨대 psmart 벡터 ( 루시겐, 미국위스콘신주미들턴 ) 는프로모터없이탈인산화된평활말단과함께제공된다. 이러한플라스미드-포함세포의배양은플라스미드복제및이에따른관심절편의복제 ( 이는종종관심절편의발현에해당함 ) 를가능하게한다

37 [0223] [0224] [0225] [0226] [0227] [0228] [0229] [0230] [0231] [0232] [0233] 다양한벡터시스템은선택가능한마커, 예컨대규정된조건하에서의성장또는생존에필요한단백질을코딩하는발현가능한유전자를포함한다. 골격벡터서열상에함유된통상의선택가능한마커는, 영양결핍을보완하거나또는특정한배양배지에존재하지않거나여기서이용불가능한중요한영양소를공급하는데요구되는유전자, 뿐만아니라항생제저항성에요구되는하나이상의단백질을코딩하는유전자를포함한다. 또한, 벡터는관심숙주세포에적합한복제시스템을포함한다. 이어서, 관심절편을함유하는플라스미드를통상의방법으로단리할수있고, 이는다른관심미생물숙주세포에의도입에이용가능하다. 다양한도입방법은관련기술분야에공지되어있으며, 벡터도입또는게놈통합을포함할수있다. 다양한대안적실시양태에서, 관심 DNA 절편을이러한플라스미드이외의수단에의해관심숙주세포에도입할경우에는, 이를다른플라스미드 DNA로부터분리할수있다. 일반적인예측실시예의단계들은플라스미드의사용을포함하지만, 관련기술분야에공지된다른벡터가대신사용될수도있다. 이들은코스미드, 바이러스 ( 예를들어, 박테리오파지, 동물바이러스, 식물바이러스 ) 및인공염색체 ( 예를들어, 효모인공염색체 (YAC) 및박테리아인공염색체 (BAC)) 를포함한다. 관심절편이도입되는숙주세포를특정한효소적단계에관련한수행능, 및 / 또는내성또는관심화학적화합물에대한생물생산에대해평가할수있다. 전체수행능, 내성, 또는관심화학물질의생성또는축적에대해선택함으로써, 보다양호하게수행되는유전자변형숙주세포의선택이이루어질수있다. 이러한절차는단일유전자 ( 또는다른관심핵산서열절편 ) 또는다중유전자 ( 개별프로모터또는단일프로모터의제어하 ) 를혼입시킬수있고, 상기절차를반복하여발현벡터내에목적하는이종핵산서열을생성할수있고, 이어서이를선택된미생물에공급하여, 예를들어본원에개시된대사경로중임의의것에대한효소적전환단계기능의바람직한보완을갖게한다는것이주목된다. 그러나, 다수의접근법이폴리펩티드, 예컨대효소를수득하기위한관심서열의전부또는일부의전사, 및이어서전사된 mrna의번역을통한발현에의존하고있지만, 특정관심서열이이러한발현이외의수단에의해효과를발휘할수있음도주목된다. 이러한접근법에사용되는구체적인실험실방법은관련기술분야에널리공지되어있으며, 관련기술분야에공지된다양한참고문헌, 예컨대문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition 2001 (volumes 1-3), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] ( 이하, 문헌 [Sambrook and Russell, 2001]) 에서찾을수있다. 상기에대한대안으로서, 다른유전자변형, 예컨대숙주세포게놈의핵산서열의결실을또한실시할수있다. 이를달성하기위한하나의비제한적방법은, 관련기술분야에공지되고미국특허번호 6,355,412 및 6,509,156 ( 스튜어트 (Stewart) 등에게허여되고, 본방법의교시를위해본원에참조로포함됨 ) 에기재된 Red/ET 재조합의사용에의한것이다. 이러한방법을위한물질및키트는진브릿지스 ( 진브릿지스게엠베하, 독일드레스덴, << 로부터입수가능하고, 상기방법은제조업체설명서에따라진행할수있다. 게놈 DNA의표적화된결실을실시하여, 원치않는대사산물의생산을감소시키거나제거하도록숙주세포의대사를변경시킬수있다. 이는본원의이러한일반적실시예에기재된바와같은다른유전자변형과조합하여사용될수있다. 실시예 2 지방산및다른지방산유도된산물의생산을위한공급원료로서의수크로스의이용이. 콜라이의통상적인실험실및산업적균주, 예컨대본원에기재된균주는수크로스를단독탄소공급원으로서이용할수없고, 이러한특성은다수의야생형균주, 예컨대병원성이. 콜라이균주에서도발견된다. 수크로스및수크로스-함유공급원료, 예컨대당밀은풍부하여, 유기산, 아미노산, 비타민및다른산물의미생물발효에의한생산을위한공급원료로서종종사용된다. 따라서, 수크로스를이용할수있는지방아실-CoA의추가의유도체-생산균주가지방산및지방산유도된산물에이용될수있는공급원료의범위를확장시킬것이다. 다양한수크로스섭취및대사시스템은관련기술분야에공지되어있으며 ( 예를들어, 미국특허번호 6,960,455), 이러한교시를위해참조로포함된다. 본발명자들은비-포스포트랜스퍼라제시스템을통해수크로스를이용하는능력을부여하는 csc 유전자를갖는이. 콜라이균주의구축을기재하고있으며, 여기서 csc 유전자는수크로스히드롤라제를코딩하는 csca, 수크로스퍼미아제를코딩하는 cscb, 프룩토키나제를코딩하는 csck, 및리프레서를코딩하는 cscr로구성된다. 이들유전자의서열은 NCBI 데이터베이스에등록번호 X

38 AF473544로주석이달려져있다. 이. 콜라이유전자중매우풍부한코돈을이용하는효과적인발현을가능하게하기위해, cscb, csck 및 csca를함유하는오페론을설계하고, 상업적인합성 DNA 제공기관 (DNA 2.0, 미국캘리포니아주멘로파크 ) 의서비스를사용하여합성하였다. 유전자의아미노산서열은각각 cscb - 서열 014; csck - 서열 015: csca - 서열 016으로서제시된다. 합성오페론은 alda 유전자의바로 5' ( 상류 ) 에이. 콜라이게놈영역의 60개의염기쌍, csc 유전자의발현을추진하는컨센서스강력프로모터, 리보솜결합부위를함유하지만프로모터가없는짧은유전자간영역을갖는 cscb, csck 및 csca에대한코딩영역, 및 alda 유전자의바로 3' ( 하류 ) 에 60개의 bp로이루어진다. alda 유전자를플랭킹하는서열과상동성인절편을사용하여 alda의결실을수반하면서 csc 오페론유전자의이. 콜라이염색체로의삽입을표적화할것이다. 합성 csc 오페론을, 플라스미드 p15a로부터유래된복제기점및암피실린에대한저항성을부여하는유전자를제공하는플라스미드 pj214 (DNA 2.0, 미국캘리포니아주멘로파크 ) 에구축하였다. 적합한숙주세포, 예컨대이. 콜라이균주 BX_595를상기플라스미드 ptrc_kan_mcr 또는다른적합한플라스미드로동시에형질전환시키고, 형질전환된균주를암피실린및카나마이신을함유하는 LB 배지플레이트상에서선별하였다. 두플라스미드를모두갖는형질전환물을성장시키고, 배지중의글루코스를동일한농도의수크로스로대체한것을제외하고는그외에기재된바와같이진탕플라스크에서지방산또는지방산유도된산물생산에대해평가하였다. [0234] [0235] [0236] [0237] 이. 콜라이에의한수크로스의이용을가능하게하는기능을부여하는유전자는또한포스포에놀피루베이트- 의존성탄수화물흡수포스포트랜스퍼라제시스템 (PTS) 에대한유전자를갖는자연단리물 pur400 (Cowan, P.J., et al. J. Bacteriol. 173: , 1991) 으로부터획득할수있었다. 이들유전자는 PTS 수송복합체의효소 II 성분을코딩하는 scra, 수크로스-6 포스페이트히드롤라제를코딩하는 scrb, 프룩토키나제를코딩하는 scrk, 및포린을코딩하는 scry로이루어진다. 이들유전자를상기기재된바와같이단리또는합성하고, 플라스미드상에혼입하고, 다른적합한플라스미드로동시에적합한숙주세포, 예컨대이. 콜라이균주 BX_845 ( 표 3.1) 내에동시에형질전환시키고, 형질전환된균주를적절한항생제를함유하는 LB 배지플레이트상에서선별하였다. 두플라스미드를모두갖는형질전환물을성장시키고, SM3 배지중의글루코스를동일한농도의수크로스로대체한것을제외하고는진탕플라스크에서지방산생산에대해평가하였다. 실시예 3 지방산생산균주의구축및평가본원에기재된유전적요소 ( 부가, 결실및변형 ) 의다양한조합을포함하는다른균주를제조하고, 이를상업적-규모의생산을포함한지방산생산에대해평가하고, 이를위해사용하였다. 하기 2개의표는이러한다수의균주를예시한다. 표 3.1은몇몇의유전자변형숙주균주이. 콜라이의모유전자형을제공하는한편, 표 3.2는유전자과다발현을위한플라스미드가혼입된것을비롯한, 특정유전자변형지방산생산균주에대한유전자형을제공한다. 하기기재된균주모두는통상적인방법섹션에기재된바와같은플라스미드구축및염색체변형에대한표준방법론을통해구축하였다. BW25113의유전자형은 F-, Δ(araD-araB)567, Δ lacz4787(::rrnb-3), LAM-, rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdr514이다

39 [0238] < 표 3.1> 균주 [0239]

40 [0240] < 표 3.2> 유리지방산생산균주 [0241]

41 [0242] [0243] [0244] [0245] 실시예 4 지방산합성억제를통한, 말로닐-CoA 의존성산물의생산을증가시키기위한유전자변형지방산합성의억제는말로닐-CoA 생산의피드백억제의제거로이어질수있으며, 이는세포내말로닐-CoA 풀을증가시키고, 중간체말로닐-CoA로부터의산물형성속도를증가시킨다 ( 예를들어, 본원에참조로포함된영국특허번호 GB , 국제특허출원번호 PCT/US2010/050436, PCT/US2011/ 참조 ). 말로닐-CoA 유도된산물의생산에대한하나의비제한적실시예는다음과같다 : 1,3,6,8-테트라히드록시나프탈렌 (THN) 신타제효소의제어가능한발현을코딩하는벡터를사용하여, 표 3.1에열거된균주중임의의것을형질전환시킬수있다. 이는 ptrc_thns 플라스미드 ( 서열 018) 의형질전환을통해달성할수있다. 이어서, 이러한균주를진탕플라스크에서 THN 또는그의자주색산화유도체플라비올린의생산에대해평가할수있다. 간략하게, 밤샘종균배양물을적절한항생제를포함하는테리픽브로쓰 (Terrific Broth) (TB) 50 ml 중에제조하고, 225 rpm에서진탕시키면서 30 에서 16-24시간동안인큐베이션할수있다. 이러한배양물을사용하여각균주의 150 ml 배양물을 SM11 최소배지중에출발접종물및항생제로서 0.8의 OD 600 및 5% TB 배양물캐리오버로접종 한다. 2 시간후에, IPTG 를각플라스크에최종농도 0.5mM IPTG 로첨가할수있다. 이배양물을 30 에서대 략추가 2 시간동안 의 OD 600 으로성장시킬수있고, 2 시간후에세포를 37 로이동시키고, 최대 72 시간 동안 THN 또는플라비올린 ( 자주색산물 ) 형성에대해모니터링하였다. [0246] [0247] [0248] 실시예 5 유전자변형이. 콜라이 - 1에서의티올라제를통한말로닐-CoA 및아세틸-CoA를통한지방산생산유전자변형이. 콜라이균주를통상적인방법섹션에기재된관련기술분야에널리공지된방법에따라구축하였다. 유전자형이표 3.1 및 3.2에주어져있는이들균주는표 5.1 및 5.2에하기열거된다. 측정시점, 농도 ( 역가 g/l) 를포함하는결과가표 5.1 및 5.2에주어진다. 균주를통상적인방법섹션에기재된하나이상의진탕플라스크생산프로토콜에따라평가하였다. 브로쓰샘플을생산개시 24, 48 및 / 또는 72시간후에취

42 하여, 4 내지 18 쇄길이범위의유리지방산의생산에대해평가하였다. 표 5.1에프로토콜비교가제시되며, 여기서진탕플라스크의온도는 30 에서일정하게유지되거나또는프로토콜에따라 37 로이동되었다. 이는정상말로닐-ACP 의존성지방산합성의억제의효과및증가된말로닐-CoA 풀의평가를가능하게하였다 ( 실시예 4 참조 ). 표 5.2에서, 증가된지방산생산에대한유전적요건을보다잘규정하기위해몇몇다른균주를평가하였다. [0249] < 표 5.1> FFA > C4 의생산에대한온도변화의평가 [0250] [0251] < 표 5.2> FFA > C4 의생산에대한유전적요건의평가 [0252] [0253] [0254] [0255] 실시예 6 유전자변형이. 콜라이 - 1에서의신타제를통한말로닐-CoA를통한지방산생산유전자변형이. 콜라이균주를구축하였다. 이들균주중몇몇은유리지방산생산에대한케토아실-CoA 신타제또는엘롱가제의사용을평가하기위해구축하였다. 본실시예에사용된특정한엘롱가제효소 ELO1은진핵인간기생충인트리파노소마브루세이 (Trypanosoma brucei) 로부터의것이다 (Lee et al., Cell 126, , 2006). ELO1 ( 티. 브루세이 ) 을이. 콜라이에서성공적으로이종발현시켰다. 진스크립트 (GenScript) ( 미국뉴저지주피스카타웨이 ) 를사용하여재조합 ELO1 유전자를합성하였다. 합성된 DNA는공개된유전자서열 ( 등록번호 XM_840948) 에기초하며, 이. 콜라이에서의발현에코돈최적화되었다. 이어서, 합성 ELO1 유전자를플라스미드 pet28b ( 노바젠 (Novagen), 서열 001) 에서브-클로닝하여, 서열 005를생성하였다. 방법 5에기재된바와같은조건하에 ELO1을갖는이. 콜라이균주로부터제조된전체막분획은말로닐-CoA를옥타노일-CoA와축합시키고, β-케토-데카노일-coa를생산하는것으로나타났다. 특이적 ELO1 활성은말로닐-CoA 소모에기초하여 3.4 nmol/ 분-막단백질 mg인것으로추정되었다. 한편, ELO1이없는이. 콜라이균주로부터제조된전체막분획은어떠한말로닐-CoA도소모하지않았을뿐만아니라 β-케토-데카노일-coa도생산하지않았다. 데이터는도 4에제시되어있다. 몇몇균주는유리지방산생산에대한 ELO1 활성의효과를평가하기위해구축하였다. 유전자형이표 3.1 및 3.2에주어져있는이들균주는표 6.1에하기열거된다. 균주를통상적인방법섹션에기재된하나이상의진탕플라스크생산프로토콜에따라평가하였다. 브로쓰샘플을취하여, 4 내지 18 쇄길이범위의유리지방산의생산에대해평가하였다. 생산된지방산의농도 ( 역가 g/l) 뿐만아니라특정한쇄길이의백분율을포함하는결과가표 6.1에주어진다. 이들데이터는또한 4개의데이터포인트 (0, 24, 48 및 72시간 ) 에기초한 FFA 축적비율 (C6-C18:1) 을포함한다

43 [0256] < 표 6.1> ELO1 의존성지방산생산 [0257] [0258] [0259] [0260] [0261] [0262] [0263] 실시예 7 유전자변형미생물에서의티올라제를통한말로닐-CoA 및아세틸-CoA를통한지방산생산본발명의유전자변형미생물은, 예를들어바실루스서브틸리스, 쿠프리아비두스네카토르 ( 이전에는랄스토니아또는알칼리게네스유트로파 (Alcaligenes eutropha) 로서공지됨 ), 코리네박테리움글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 지모모나스모빌리스 (Zymomonas mobilis), 스트렙토미세스코엘리코로르 (Streptomyces coelicolor), 클로스트리디움아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum) 또는슈도모나스푸티다일수있다. 이러한미생물은유리지방산을생산하도록유전자변형될수있는박테리아숙주로서작용할수있다. 또한, 사카로미세스세레비지아에, 쉬조사카로미세스폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로미세스마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 야로위아리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 아스페르길루스니거 (Aspergillus niger), 피키아파스토리스및이사트켄키아오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis) 는, 본발명의유전자변형미생물일수있으며유리지방산을생산하도록구축될수있는예시적인효모또는진균이다. ELO1, npht7, hbd, crt 및 / 또는 ter 코딩이종유전자를염색체로의재조합에의해또는자기-복제플라스미드또는에피솜요소로서이들숙주에도입할수있다. 대안적인신타제, 티올라제, 3-케토-아실-CoA 리덕타제, 3-히드록시-아실-CoA 데히드라타제및 / 또는에노일-CoA 리덕타제를유사한접근법을사용하여이들숙주에도입할수있다. 이종발현을위해설계된유전자는증가된발현효율을위해특정한숙주에서우선적으로이용되는코돈을사용하여합성할수있다. 말로닐-CoA 및아세틸-CoA를통한유리지방산의생산을최대화하기위해, 숙주에서의특정유전자변화가고려된다. 이는, 아세틸-CoA 카르복실라제의활성을증가시키고, 경쟁경로, 예컨대아실운반단백질 (ACP)-의존성지방산합성 (FAS) 경로의활성을감소시킴으로써말로닐-CoA의이용가능성을증가시키는것을포함한다. FAS 경로의활성을조건적으로감소시키는것은온도-민감성대립유전자를사용하고성장온도를증가시키거나, 화학적억제제를사용하거나또는 FAS 유전자의발현을조절함으로써달성할수있다. 또한, 단쇄기질, 예컨대부티릴-CoA에대한아실-CoA 티오에스테라제활성의제거가유리하다. 이는유전자변형생산숙주에서, 예를들어이. 콜라이 tesb 유전자산물에대한상동성에의해또는숙주균주의용해물에서의티오에스테라제활성에대한효소적검정, 티오에스테라제효소정제및예를들어질량분광측정법을사용한폴리펩티드의특성화에의해확인되는특이적티오에스테라제유전자의결실에의해달성될수있다. 또한, 예를들어 β-산화경로에의한유리지방산의재소모의제거는유리지방산산물의분해를방지할것이고, 산물형성을최대화할것이다. 이는유전자변형생산숙주에서특정지방산흡수및분해기능의결실에의해달성될수있다. 실시예 8 유전자변형이. 콜라이 - 1에서의말로닐-CoA를통한부티레이트생산유전자변형이. 콜라이균주를통상적인방법섹션에기재된관련기술분야에널리공지된방법에따라구축하였다. 유전자형이표 3.1 및 3.2에주어져있는이들균주는표 8.1에하기열거된다. 균주를통상적인방법섹션에기재된하나이상의진탕플라스크생산프로토콜에따라평가하였다. 브로쓰샘플을생산개시 24시간후에취하여, 4 내지 18 쇄길이범위의부티레이트를포함하는유리지방산의생산에대해평가하였다. 생산된지방산의농도 ( 역가 g/l) 뿐만아니라특정한쇄길이의백분율을포함하는결과가표 8.1에주어진다

44 [0264] < 표 8.1> 부티레이트생산 [0265] [0266] [0267] [0268] 실시예 9 유전자변형이. 콜라이 - 1에서의말로닐-CoA를통한헥산산생산유전자변형이. 콜라이균주를통상적인방법섹션에기재된관련기술분야에널리공지된방법에따라구축하였다. 유전자형이표 3.1 및 3.2에주어져있는이들균주는표 9.1에하기열거된다. 균주를통상적인방법섹션에기재된하나이상의진탕플라스크생산프로토콜에따라평가하였다. 브로쓰샘플을생산개시 24시간후에취하여, 4 내지 18 쇄길이범위의부티레이트를포함하는유리지방산의생산에대해평가하였다. 생산된지방산의농도 ( 역가 g/l) 뿐만아니라특정한쇄길이의백분율을포함하는결과가표 9.1에주어진다

45 [0269] < 표 9.1> 헥산산생산 [0270] [0271] [0272] [0273] 실시예 10 유전자변형이. 콜라이 - 1에서의말로닐-CoA를통한옥탄산생산유전자변형이. 콜라이균주를통상적인방법섹션에기재된관련기술분야에널리공지된방법에따라구축하였다. 유전자형이표 3.1 및 3.2에주어져있는이들균주는표 10.1에하기열거된다. 균주를통상적인방법섹션에기재된하나이상의진탕플라스크생산프로토콜에따라평가하였다. 브로쓰샘플을취하여, 4 내지 18 쇄길이범위의부티레이트를포함하는유리지방산의생산에대해평가하였다. 생산된지방산의농도 ( 역가 g/l) 뿐만아니라특정한쇄길이의백분율을포함하는결과가표 10.1에주어진다

46 [0274] < 표 10.1> 옥탄산생산 [0275] [0276] [0277] [0278] 실시예 11 유전자변형이. 콜라이 - 1에서의말로닐-CoA를통한도데칸산 (C12 지방산 ) 생산유전자변형이. 콜라이균주를통상적인방법섹션에기재된관련기술분야에널리공지된방법에따라구축하였다. 유전자형이표 3.1 및 3.2에주어져있는이들균주는표 11.1에하기열거된다. 균주를통상적인방법섹션에기재된하나이상의진탕플라스크생산프로토콜에따라평가하였다. 브로쓰샘플을취하여, 4 내지 18 쇄길이범위의유리지방산의생산에대해평가하였다. 생산된지방산의농도 ( 역가 g/l) 뿐만아니라특정한쇄길이의백분율을포함하는결과가표 11.1에주어진다

47 [0279] < 표 11.1> 이. 콜라이에서의도데칸산생산 [0280] [0281] [0282] [0283] 실시예 12 유전자변형이. 콜라이 - 1에서의말로닐-CoA를통한미리스트산 (C14 지방산 ) 생산유전자변형이. 콜라이균주를통상적인방법섹션에기재된관련기술분야에널리공지된방법에따라구축하였다. 유전자형이표 3.1 및 3.2에주어져있는이들균주는표 12.1에하기열거된다. 균주를통상적인방법섹션에기재된하나이상의진탕플라스크생산프로토콜에따라평가하였다. 브로쓰샘플을취하여, 4 내지 18 쇄길이범위의부티레이트를포함하는유리지방산의생산에대해평가하였다. 생산된지방산의농도 ( 역가 g/l) 뿐만아니라특정한쇄길이의백분율을포함하는결과가표 12.1에주어진다

48 [0284] < 표 12.1> 이. 콜라이에서의미리스트산생산 [0285] [0286] [0287] [0288] 실시예 13 유전자변형이. 콜라이 - 1에서의말로닐-CoA를통한팔미트산 (C16:0 지방산 ) 생산유전자변형이. 콜라이균주를통상적인방법섹션에기재된관련기술분야에널리공지된방법에따라구축하였다. 유전자형이표 3.1 및 3.2에주어져있는이들균주는표 13.1에하기열거된다. 균주를통상적인방법섹션에기재된하나이상의진탕플라스크생산프로토콜에따라평가하였다. 브로쓰샘플을취하여, 4 내지 18 쇄길이범위의부티레이트를포함하는유리지방산의생산에대해평가하였다. 생산된지방산의농도 ( 역가 g/l) 뿐만아니라특정한쇄길이의백분율을포함하는결과가표 13.1에주어진다

49 [0289] < 표 13.1> 이. 콜라이에서의팔미트산생산 [0290] [0291] [0292] [0293] 실시예 14 유전자변형이. 콜라이 - 1에서의말로닐-CoA를통한팔미톨레산 (C16:1 지방산 ) 생산유전자변형이. 콜라이균주를통상적인방법섹션에기재된관련기술분야에널리공지된방법에따라구축하였다. 유전자형이표 3.1 및 3.2에주어져있는이들균주는표 14.1에하기열거된다. 균주를통상적인방법섹션에기재된하나이상의진탕플라스크생산프로토콜에따라평가하였다. 브로쓰샘플을취하여, 4 내지 18 쇄길이범위의부티레이트를포함하는유리지방산의생산에대해평가하였다. 생산된지방산의농도 ( 역가 g/l) 뿐만아니라특정한쇄길이의백분율을포함하는결과가표 14.1에주어진다

50 [0294] < 표 14.1> 이. 콜라이에서의팔미톨레산생산 [0295] [0296] [0297] [0298] 실시예 15 유전자변형이. 콜라이 - 1에서의말로닐-CoA를통한올레산및스테아르산 (C18:1 지방산 ) 생산유전자변형이. 콜라이균주를통상적인방법섹션에기재된관련기술분야에널리공지된방법에따라구축하였다. 유전자형이표 3.1 및 3.2에주어져있는이들균주는표 15.1에하기열거된다. 균주를통상적인방법섹션에기재된하나이상의진탕플라스크생산프로토콜에따라평가하였다. 브로쓰샘플을취하여, 4 내지 18 쇄길이범위의부티레이트를포함하는유리지방산의생산에대해평가하였다. 생산된지방산의농도 ( 역가 g/l) 뿐만아니라특정한쇄길이의백분율을포함하는결과가표 15.1에주어진다

51 [0299] < 표 15.1> 이. 콜라이에서의올레산생산 [0300] [0301] [0302] [0303] [0304] 실시예 16 유전자변형이. 콜라이 - 1에서의지방산생산의쇄길이특이성변경유리지방산산물쇄길이의분포는합성및방출활성의조합에의해결정하였다. 엘롱가제에의해촉매된것과같은합성활성은, 티. 브루세이 ELO1이 C10-CoA 산물을생산하고 ELO2가 C14-CoA 산물을생산하도록하는산물쇄길이선호도를갖는다 (Lee, et al., 2006; Cell 126: ; Denic and Weissman, 2007, Cell 130: ). ELO1 반응의즉각적인산물은 3-케토-헥사노일-CoA이다. 케토-아실-CoA 리덕타제 (KCR), 3-히드록시-아실-CoA 데히드라타제 (3HDh) 및에노일-CoA 리덕타제 (ECR) 의연속적작용은, 말로닐-CoA로부터의 2- 탄소단위에의한후속적인연장에대한프라이머로서작용하는헥사노일-CoA를생성시킨다. 이들활성의쇄길이특이성은또한최종산물의분포를결정하고, 목적하는명시된쇄길이의산물을우선적으로생산하도록조작될수있다. 티오에스테라제는아실-CoA 또는아실-ACP의각각유리지방산및조효소 A 또는 ACP로의가수분해를촉매하며, 이에따라유리지방산산물을방출시킨다. 다양한공급원으로부터의다수의티오에스테라제가공지되어있고, 아실-ACP 기질에대한그의쇄길이특이성은문서로기록되어있다 ( 예를들어, 문헌 [Jing et al. 2011, BMC Biochemistry 12: 1-16]). 본발명자들은다수의티오에스테라제를발현시키고검정하여, 아실-CoA 기질에대한그들의쇄길이특이성을결정하였다. 이들단백질에대한티오에스테라제활성및쇄길이선호도는통상적인방법에기재된바와같이이. 콜라이에서이들단백질을발현시킴으로써결정하였다. 마이크로플루이다이저 (Microfluidizer) 를통한세포의압출에의해용해물을제조하고, G-25 스핀칼럼 (GE ) 을사용하여용해물을탈염시켰다. 200-μl 검정물은 7 mm 인산칼륨, ph 8.0, 20% (v/v) 글리세롤, 0.04% 트리톤 (Triton) X100, 0.10 mm DTNB (5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산 ), 시그마 (Sigma) D8130, ETOH 중 25 mm), 0.40 mm 아실-CoA 기질을함유하였고, G-25 정제된용해물을첨가하여반응을개시하였다. 5-티오-2-니트로벤조산 (TNB) 산물의형성을 412nm에서동역학적으로모니터링하였고, 결과는표 16.1에표로나타내었다

52 [0305] < 표 16.1> 용해물중티오에스테라제의비활성 (U/mg) [0306] [0307] [0308] [0309] [0310] 표 16.1에나타난바와같이, 이들티오에스테라제는상이하며뚜렷한쇄길이선호도를나타낸다. AtTE는 C8- CoA로출발하는단쇄아실-CoA 기질을선호하는반면, 가용성 'tesa는 C12 및보다장쇄의기질에대해가장활성이다. 추가의티오에스테라제유전자및유전자산물을유사한방식으로평가할수있다. 잠재적유전자는특히울무스아메리카나 (Ulmus americana) (AAB71731), 락토바실루스플란타룸 (CAD63310), 락토바실루스브레비스 (Lactobacillus brevis) (ABJ63754), 클로스트리디움페르프린겐스 (Clostridium perfringens) (ABG82470), 슈도모나스아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) (PA2801) 로부터의티오에스테라제를포함한다. 단백질조작또는방향적진화기술의적용에의해, 특정한쇄길이에대한보다높은선호도를갖는변이체를생성하도록아실-CoA에대한쇄길이특이성을변경시킬수있다. 예를들어, 티오에스테라제-코딩유전자를셔플링하여 (Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad., Sci. USA 91: ) 변이체의라이브러리를생성할수있다. 특정한쇄길이의아실-CoA에대한증가된활성을갖는변이체의단리는상기특정한쇄길이의아실-CoA에대한활성및바람직하지않은쇄길이의아실-CoA에대한감소된활성에대해스크리닝함으로써달성하였다. 실시예 17 비. 리케니포르미스 (B. LICHENIFORMIS) 에서의지방산또는지방산유도된산물생물생산의개선비. 서브틸리스에서복제한대부분의플라스미드및셔틀벡터를사용하여비. 리케니포르미스를원형질체형질전환또는전기천공에의해형질전환시켰다. 유리지방산생합성에요구되는핵산서열을적절하게코돈최적화된다양한공급원으로부터단리하고, 플라스미드 pbe20 또는 pbe60 유도체에클로닝하였다 (Nagarajan et al., Gene 114: (1992)). 비. 리케니포르미스를형질전환시키는방법은관련기술분야에공지되어있다 ( 예를들어, 문헌 [Fleming et al. Appl. Environ. Microbiol., 61(11): (1995)] 참조 ). 이러한공개된자원은그의각각의지시된교시및조성물을위해참조로포함된다. 비. 서브틸리스에서의이종효소의

53 발현을위해구축한플라스미드를비. 리케니포르미스로형질전환시켜, 개선된지방산또는지방산유도된산물 생산을입증하는재조합미생물을생성시켰다. [0311] [0312] [0313] [0314] [0315] [0316] [0317] [0318] [0319] [0320] [0321] [0322] [0323] [0324] 실시예 18 파에니바실루스마세란스에서의지방산또는지방산유도된산물생물생산의개선플라스미드를비. 서브틸리스에서의이종효소의발현을위해본원에기재된바와같이구축하고, 이를사용하여원형질체형질전환에의해파에니바실루스마세란스로형질전환시켜, 개선된지방산또는지방산유도된산물생산을입증하는재조합미생물을생성시켰다. 실시예 19 알칼리게네스 ( 랄스토니아 ) 유트로푸스 ( 현재는쿠프리아비두스네카토르로서지칭됨 ) 에서의지방산또는지방산유도된산물생물생산의개선. 알칼리게네스유트로푸스에서의유전자발현및돌연변이의생성을위한방법은관련기술분야에공지되어있다 ( 예를들어, 문헌 [Taghavi et al., Appl. Environ. Microbiol., 60(10): (1994)] 참조 ). 이러한공개된자원은그의지시된교시및조성물을위해참조로포함된다. 지방산생합성을개선하는것으로확인된핵산서열중임의의것을적절하게코돈최적화된다양한공급원으로부터단리하고, 본원에기재된광범위한숙주범위벡터중임의의것에클로닝하고, 전기천공하여, 개선된지방산또는지방산유도된산물생산을입증하는재조합미생물을생성시켰다. 중요하게는, 씨. 네카토르 (C. necator) 균주를사용하여서는, 지방산또는지방산유도된산물이탄소및환원당량의단독공급원으로서의이산화탄소및수소로부터생산될수있는데, 이는이러한미생물이화학무기영양체식으로성장할수있기때문이다. 실시예 20 슈도모나스푸티다에서의지방산또는지방산유도된산물생물생산의개선슈도모나스푸티다에서의유전자발현을위한방법은관련기술분야에공지되어있다 ( 예를들어, 이러한교시를위해본원에참조로포함된미국특허번호 6,586,229 (Ben-Bassat et al.) 참조 ). 지방산또는지방산유도된산물생합성을개선하는것으로확인된핵산서열중임의의것을적절하게코돈최적화된다양한공급원으로부터단리하고, 본원에기재된광범위한숙주범위벡터중임의의것에클로닝하고, 전기천공하여, 지방산또는지방산유도된산물생합성생산을입증하는재조합미생물을생성시켰다. 예를들어, 이러한핵산서열을 pucp18에삽입하고, 이러한라이게이션된 DNA를전기적격슈도모나스푸티다 KT2440 세포에전기천공하여, 증가된지방산또는지방산유도된산물형성을나타내는재조합피. 푸티다미생물을생성시켰다. 실시예 21 락토바실루스플란타룸에서의지방산또는지방산유도된산물생물생산의개선락토바실루스속은락토바실라레스 (Lactobacillales) 과에속하고, 바실루스서브틸리스및스트렙토코쿠스의형질전환에사용된다수의플라스미드및벡터를락토바실루스에사용하였다. 적합한벡터의비제한적예는 pam. 베타.1 및그의유도체 (Renault et al., Gene 183: (1996); 및 O'Sullivan et al., Gene 137: (1993)); pmbb1 및 phw800, pmbb1의유도체 (Wyckoff et al. Appl. Environ. Microbiol 62: (1996)); pmg1, 접합플라스미드 (Tanimoto et al., J. Bacteriol. 184: (2002)); pnz9520 (Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol. 63: (1997)); pam401 (Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol. 67: (2001)); 및 pat392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38: (1994)) 를포함한다. 락토바실루스플란타룸으로부터의몇몇플라스미드가또한보고되었다 ( 예를들어, 문헌 [van Kranenburg R, Golic N, Bongers R, Leer R J, de Vos W M, Siezen R J, Kleerebezem M. Appl. Environ. Microbiol March; 71(3): ]). 지방산또는지방산유도된산물생합성을개선하는것으로확인된핵산서열중임의의것을적절하게코돈최적화된다양한공급원으로부터단리하고, 본원에기재된벡터중임의의것에클로닝하고, 도입하여, 지방산또는지방산유도된산물생합성생산을입증하는재조합미생물을생성시켰다. 실시예 22 지방알콜의생산

54 [0325] [0326] [0327] [0328] [0329] [0330] [0331] [0332] [0333] [0334] [0335] [0336] [0337] 지방산을생산하는생산균주를또한사용하여, 지방아실-CoA 또는유리지방산을지방알콜로전환시키는효소를코딩하는유전자를발현시킴으로써지방알콜을생산할수있다. 이러한효소의예는알콜-형성아실-CoA 리덕타제 (EC ), 또는장쇄-지방-아실-CoA 리덕타제 (EC ) + 알콜데히드로게나제 (EC ), 또는알데히드데히드로게나제 (EC ) 및알콜데히드로게나제의조합을포함한다. 지방아실 -CoA 리덕타제활성을갖는폴리펩티드는아시네토박터 SP. ADP1의 fabg 유전자, 등록번호 YP_047869에의해제공된다. 지방-아실리덕타제활성을갖는폴리펩티드는봄빅스모리의 FAR-N_SDR_e 유전자, 등록번호 BAC79425에의해제공된다. 알데히드데히드로게나제활성을갖는폴리펩티드는게오바실루스써모데니트리피칸스 NG80-2의 ALDH 유전자, 등록번호 YP_ 에의해제공된다. 알콜데히드로게나제활성을갖는폴리펩티드는이. 콜라이의 yqhd 유전자, 등록번호 AP_ 에의해제공된다. 이러한활성의추가의공급원은관련기술분야에공지되어있으며, 이들을조합하여지방알콜을생산하는생산균주를생성시킬수있다. IV. 일반방법섹션이섹션에서의모든방법은언급되는경우실시예에포함시키기위해제공된다. 서브섹션 A. 미생물종및균주, 배양물, 및성장배지필요에따라이용될수있는박테리아종은다음과같다 : 아키네토박터칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) (DSMZ #1139) 는진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을뇌심장침출액 (BHI) 브로쓰 ( 알피아이코포레이션 (RPI Corp), 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ) 에재현탁시켰다. 재현탁된에이. 칼코아세티쿠스배양물의연속희석액을 BHI로만들고, 포화될때까지 37 에서 48시간동안 250 rpm에서호기적으로성장하도록하였다. 바실루스서브틸리스는길랩 (Gill lab) ( 볼더소재의유니버시티오브콜로라도 ) 으로부터기증된것이며, 왕성하게성장하는배양물로서얻었다. 왕성하게성장하는비. 서브틸리스배양물의연속희석액을루리아브로쓰 ( 알피아이코포레이션, 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ) 로만들고, 포화될때까지 37 에서 24시간동안 250 rpm에서호기적으로성장하도록하였다. 클로로비움리미콜라 (Chlorobium limicola) (DSMZ #245) 는진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을 DSMZ 지침서에기재된바와같이페니히 (Pfennig) 배지 I 및 II (#28 및 29) 를사용하여재현탁시켰다. 씨. 라미콜라를 25 에서일정한볼텍싱하에성장시켰다. 시트로박터브라키이 (Citrobacter braakii) (DSMZ #30040) 는진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을뇌심장침출액 (BHI) 브로쓰 ( 알피아이코포레이션, 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ) 에재현탁시켰다. 재현탁된씨. 브라키이배양물의연속희석액을 BHI로만들고, 포화될때까지 30 에서 48시간동안 250 rpm에서호기적으로성장하도록하였다. 클로스티리디움아세토부틸리쿰 (DSMZ #792) 은진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을 DSMZ 지침서에기재된바와같이클로스티리디움아세토부틸리쿰배지 (#411) 에재현탁시켰다. 씨. 아세토부틸리쿰을포화될때까지 37 에서 250 rpm에서혐기적으로성장시켰다. 클로스티리디움아미노부틸리쿰 (Clostridium aminobutyricum) (DSMZ #2634) 은진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을 DSMZ 지침서에기재된바와같이클로스티리디움아미노부틸리쿰배지 (#286) 에재현탁시켰다. 씨. 아미노부틸리쿰을포화될때까지 37 에서 250 rpm에서혐기적으로성장시켰다. 클로스티리디움클루이베리 (Clostridium kluyveri) (DSMZ #555) 는왕성하게성장하는배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 씨. 클루이베리배양물의연속희석액을 DSMZ 지침서에기재된바와같이클로스티리디움클루이베리배지 (#286) 로만들었다. 씨. 클루이베리를포화될때까지 37 에서 250 rpm에서혐기적으로성장시켰다. 쿠프리아비두스메탈리두란스 (DMSZ #2839) 는진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을뇌심장침출액 (BHI) 브로쓰 ( 알피아이

55 코포레이션, 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ) 에재현탁시켰다. 재현탁된씨. 메탈리두란스배양물의연속 희석액을 BHI 로만들고, 포화될때까지 30 에서 48 시간동안 250 rpm 에서호기적으로성장하도록하였다. [0338] [0339] [0340] [0341] [0342] [0343] [0344] [0345] [0346] [0347] [0348] 쿠프리아비두스네카토르 (DSMZ #428) 는진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을뇌심장침출액 (BHI) 브로쓰 ( 알피아이코포레이션, 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ) 에재현탁시켰다. 재현탁된씨. 네카토르배양물의연속희석액을 BHI로만들고, 포화될때까지 30 에서 48시간동안 250 rpm에서호기적으로성장하도록하였다. 다른곳에서언급된것과같이, 이종에대한이전의명칭은알칼리게네스유트로푸스및랄스토니아유트로푸스 (Ralstonia eutrophus) 이다. 데술포비브리오프룩토소보란스 (Desulfovibrio fructosovorans) (DSMZ #3604) 는진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을 DSMZ 지침서에기재된바와같이데술포비브리오프룩토소보란스배지 (#63) 에재현탁시켰다. 디. 프룩토소보란스를포화될때까지 37 에서 250 rpm에서혐기적으로성장시켰다. 에스케리키아콜라이크룩스 (Escherichia coli Crooks) (DSMZ #1576) 는진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을뇌심장침출액 (BHI) 브로쓰 ( 알피아이코포레이션, 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ) 에재현탁시켰다. 재현탁된이. 콜라이크룩스배양물의연속희석액을 BHI로만들고, 포화될때까지 37 에서 48시간동안 250 rpm에서호기적으로성장하도록하였다. 에스케리키아콜라이 K12는길랩 ( 볼더소재의유니버시티오브콜로라도 ) 으로부터기증된것이며, 왕성하게성장하는배양물로서얻었다. 왕성하게성장하는이. 콜라이 K12 배양물의연속희석액을루리아브로쓰 ( 알피아이코포레이션, 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ) 로만들고, 포화될때까지 37 에서 24시간동안 250 rpm 에서호기적으로성장하도록하였다. 할로박테리움살리나룸 (Halobacterium salinarum) (DSMZ #1576) 은진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을 DSMZ 지침서에기재된바와같이할로박테리움배지 (#97) 에재현탁시켰다. 에이치. 살리나룸을포화될때까지 37 에서 250 rpm에서호기적으로성장시켰다. 락토바실루스델브루에키이 (Lactobacillus delbrueckii) (#4335) 는왕성하게성장하는배양물로서와이이스트유에스에이 (WYEAST USA) ( 미국오리건주오델 ) 로부터얻었다. 왕성하게성장하는엘. 델브루에키이배양물의연속희석액을뇌심장침출액 (BHI) 브로쓰 ( 알피아이코포레이션, 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ) 로만들고, 포화될때까지 30 에서 24시간동안 250 rpm에서호기적으로성장하도록하였다. 메탈로스파에라세둘라 (Metallosphaera sedula) (DSMZ #5348) 는왕성하게성장하는배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 엠. 세둘라배양물의연속희석액을 DSMZ 지침서에기재된바와같이메탈로스파에라배지 (#485) 로만들었다. 엠. 세둘라를포화될때까지 65 에서 250 rpm에서호기적으로성장시켰다. 프로피오니박테리움프레우덴레이키이아종세르마니이 (Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii) (DSMZ #4902) 는진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을 DSMZ 지침서에기재된바와같이 PYG-배지 (#104) 에재현탁시켰다. 피. 프레우덴레이키이아종세르마니이를포화될때까지 30 에서 250 rpm에서혐기적으로성장시켰다. 슈도모나스푸티다는길랩 ( 볼더소재의유니버시티오브콜로라도 ) 으로부터기증된것이며, 왕성하게성장하는배양물로서얻었다. 왕성하게성장하는피. 푸티다배양물의연속희석액을루리아브로쓰 ( 알피아이코포레이션, 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ) 로만들고, 포화될때까지 37 에서 24시간동안 250 rpm에서호기적으로성장하도록하였다. 스트렙토코쿠스뮤탄스 (Streptococcus mutans) (DSMZ #6178) 는진공건조된배양물로서저먼콜렉션오브마이크로오가니즘스앤드셀컬쳐스 ( 독일브라운슈바이크 ) 로부터얻었다. 이어서, 배양물을루리아브로쓰 ( 알피아이코포레이션, 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ) 에재현탁시켰다. 에스. 뮤탄스를포화될때까지 37 에서 250 rpm에서호기적으로성장시켰다. 하기비-제한적인균주또한실시예에서의출발균주로서사용할수있다 : DF40 [Hfr(PO2A), garb10, fhua22,

56 ompf627(t2r), fadl701(t2r), rela1, pita10, spot1, rrnb-2, pgi-2, mcrb1, crec510], BW25113 [F-, Δ (arad-arab)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3), & 람다-, rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdr514], JP111 [Hfr(PO1), gale45(gals), fabi ts, rela1, spot1, thi-1]. 이들균주는확인된유전자변형을가지며, 공공배양물공급원, 예컨대예일콜라이지네틱스톡콜렉션 (Yale Coli Genetic Stock Collection) ( 미국코네티컷주뉴헤이븐 ) 으로부터입수가능하다. 이들균주로부터발생된균주는실시예에기재되어있다. [0349] [0350] [0351] [0352] [0353] [0354] [0355] [0356] [0357] [0358] [0359] [0360] [0361] [0362] [0363] [0364] [0365] [0366] [0367] [0368] [0369] [0370] [0371] [0372] [0373] [0374] [0375] [0376] [0377] 일반적실험배지는상업적으로제조된배지, 예컨대루리아베르타니 (LB) 브로쓰, 테리픽브로쓰 (TB) 및 M9 최소배지를포함한다. SM11 배지의함량은다음과같다 (1000 ml당 ): 2 ml FM10 미량미네랄스톡 2.26 ml 1M MgSO 4 30 g 글루코스 200 mm MOPS (ph 7.4) 1 g/l 효모추출물 1.25 ml VM1 비타민믹스 g K 2 HPO g KH 2 PO 4 3 g (NH 4 ) 2 SO g 시트르산 ( 무수 ) FM10 미량미네랄스톡은다음으로이루어진다 : 1 ml의진한 HCl 4.9 g CaCl 2 *2H 2 O 0.97 g FeCl 3 *6H 2 O 0.04 g CoCl 2 *6H 2 O 0.27 g CuCl 2 *2H 2 O 0.02 g ZnCl g Na 2 MoO 4 *2H 2 O g H 3 BO g MnCl 2 *4H 2 O 100 ml까지의 DI수적당량 VM1 비타민믹스용액은다음으로이루어진다 : 5 g 티아민 5.4 g 판토텐산 6.0 g 니아신 0.06 g 1000 ml까지의 DI수적당량서브섹션 B: 겔제조, DNA 분리, 추출, 라이게이션및형질전환방법

57 [0378] 분자생물학등급아가로스 ( 알피아이코포레이션, 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ) 를 1x TAE에첨가하여 TAE 중 1% 아가로스를제조하였다. 50x TAE를얻기위해, 242 g 트리스염기 ( 알피아이코포레이션, 미국일리노이주엠티. 프로스펙트 ), 57.1 ml 빙초산 ( 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich), 미국미주리주세인트루이스 ), 18.6 g EDTA ( 피셔사이언티픽 (Fisher Scientific), 미국펜실베이니아주피츠버그 ) 를 900 ml 증류 H 2 O에첨가 하고, 추가의증류수로부피를 1 L로조절하였다. 1x TAE를얻기위해, 50x TAE 20 ml를증류수 980 ml에첨가하였다. 이어서, 아가로스-TAE 용액을비등이일어나고아가로스가완전히용해될때까지가열하였다. 용액을 50 로냉각되도록하고, 이후 10 mg/ml 브롬화에티듐 ( 아크로스오가닉스 (Acros Organics), 미국뉴저지주모리스플레인스 ) 을 1% 아가로스용액 100 ml당 5 μl의농도로첨가하였다. 일단브롬화에티듐을첨가하면, 용액을간단히혼합하고, 샘플분석당적절한수의빗살형을갖는겔캐스팅트레이 ( 아이디어사이언티픽캄파니 (Idea Scientific Co.), 미국미네소타주미네아폴리스 ) 에부었다. 이어서, DNA 샘플을이에따라 5X TAE 로딩완충액과혼합하였다. 5X TAE 로딩완충액은 5X TAE ( 본원에서기재된것과같은 50X TAE로부터희석한것 ), 20% 글리세롤 ( 아크로스오가닉스, 미국뉴저지주모리스플레인스 ), 0.125% 브로모페놀블루 ( 알파에이사 (Alfa Aesar), 미국메사추세츠주워드힐 ) 로이루어져있으며, 증류수로부피를 50 ml로조절하였다. 이어서, 로딩된겔을 25 내지 30분동안 125 볼트의정전압에서 1X TAE로충전된겔리그 ( 아이디어사이언티픽캄파니, 미국미네소타주미네아폴리스 ) 에서실행하였다. 이시점에, 겔을전압을갖는겔박스로부터제거하고, UV 투조기 ( 포토다인인크.(FOTODYNE Inc.), 미국위스콘신주하틀랜드 ) 하에시각화하였다. [0379] [0380] [0381] [0382] [0383] [0384] [0385] [0386] [0387] 이어서, 겔추출을통해단리된 DNA를제조업체의지침서에따라퀴아퀵겔추출키트 ( 퀴아젠 ( 미국캘리포니아주발렌시아 )) 를사용하여추출하였다. 유사한방법은통상의기술자에게공지되어있다. 통상의기술자에게공지된제한효소 / 라이게이션방법론또는상동재조합방법, 예컨대깁슨어셈블리 (Gibson Assembly) ( 뉴잉글랜드바이오랩스인크.(New England BioLabs Inc.), 미국매사추세츠주입스위치 ) 또는진아트심러스클로닝 (GeneArt Seamless Cloning) ( 인비트로젠인크.(Invitrogen Inc.), 미국캘리포니아주칼스배드 ) 을사용하여플라스미드구축을수행하였다. 일반적형질전환및관련된배양방법 : 화학적적격형질전환프로토콜을제조업체의지침서에따라또는문헌 [Molecular Cloning (Sambrook and Russell, 2001)] 에포함된문헌에따라수행하였다. 일반적으로, 플라스미드 DNA 또는라이게이션산물을화학적적격세포를갖는용액중에서 5 내지 30분동안얼음상에서냉각시켰다. 화학적적격세포는생명공학분야에서널리사용되는제품이고, 여러제조사, 예컨대이서브섹션에서언급된제조사로부터입수가능하다. 냉각기간에이어서, 세포를일반적으로 42 에서 30초동안진탕없이열충격에적용하고, 재-냉각시키고, 250 마이크로리터의풍부배지, 예컨대 S.O.C. 와조합하였다. 이어서, 세포를 250 rpm에서 1시간동안진탕시키면서 37 에서인큐베이션하였다. 최종적으로, 적절한항생제를함유하는배지에플레이팅하여세포를성공적인형질전환에대하여스크리닝하였다. 대안적으로는, 선택된세포를전기천공방법, 예컨대통상의기술자에게공지된것에의해형질전환시킬수있다. 통상의기술자에게공지된람다-레드레콤비나제기술 ( 문헌 [Datsenko and Wanner, 2000] 및진브릿지스게엠베하, 독일드레스덴 ) 을사용하여이. 콜라이의염색체내유전자조작을달성하였다. 이는유전자결실, 삽입및돌연변이를포함하였다. 통상의기술자에게공지된제한효소 / 라이게이션방법론또는상동재조합방법, 예컨대깁슨어셈블리 ( 뉴잉글랜드바이오랩스인크., 미국매사추세츠주입스위치 ) 또는진아트심러스클로닝 ( 인비트로젠인크., 미국캘리포니아주칼스배드 ) 을사용하여플라스미드구축을수행하였다. 플라스미드형질전환을위한이. 콜라이숙주균주의선별은플라스미드안정성, 플라스미드상용성, 플라스미드스크리닝방법및단백질발현과같은요인을고려하여결정한다. 본원에기재된바와같은플라스미드 DNA 를단순정제하고, 플라스미드를실험필요사항에의해결정되는바와같은바람직하거나또는달리적절한이. 콜라이숙주균주, 예컨대임의의흔히사용되는클로닝균주 ( 예를들어, DH5α, Top10F', 이. 클로니 10G 등 ) 로형질전환시켜균주배경을변화시킬수있다. 플라스미드 DNA는제조업체의지침서에따라퀴아젠 ( 미국캘리포니아주발렌시아 ) 으로부터의시판미니프렙키트를사용하여제조하였다

58 [0388] [0389] [0390] 본원에기재된실시양태, 변동, 서열및도면은본발명의유용성및다기능성의표시를제공하여야한다. 본원에제시된모든특징및이점을제공하는것은아닌다른실시양태또한본발명의취지및범위로부터벗어나지않으면서이용될수있다. 이러한변형및변동은본발명의범위내인것으로간주된다. 서브섹션 C. 진탕플라스크균주평가프로토콜진탕플라스크방법 1: 균주를유리지방산 (FFA) 의생산에대해진탕플라스크에서평가하였다. 3벌평가를수행하였다. 간략하게, 밤샘종균배양물을적절한항생제를포함하는테리픽브로쓰 50 ml 중에제조하고, 225 rpm에서진탕시키면서 30 에서 16-24시간동안인큐베이션하였다. 이러한배양물을사용하여각균주의 150 ml 배양물을 SM11 최소배지중에출발접종물및항생제로서 0.8의 OD 600 및 5% TB 배양물캐리오버로접종 하였다. 배양물을 225 rpm에서진탕시키면서 30 에서 2시간동안인큐베이션하였다. 2시간후에, 세포를 SM11 ( 포스페이트없음 ) 로세척하였다. 세포를 2회회전침강시키고 (4,000 rpm, 15분 ), 상청액을가만히따르고, 펠릿을 SM11 ( 포스페이트없음 ) 150ml 중에재현탁시켰다. 배양물을사용하여각균주의 3X 50 ml를 SM11 ( 포스페이트없음 ) 중에접종하였다. 배양물을대략 2시간동안 30 에서 의 OD 600 으로성장시키고, 2시간후에세포를 37 로옮기고, 72시간에걸쳐지방산측정을위해샘플을주기적으로제거하였다. [0391] 진탕플라스크방법 2: 균주를 FFA의생산에대해진탕플라스크에서평가하였다. 3벌평가를수행하였다. 간략하게, 밤샘종균배양물을적절한항생제를포함하는테리픽브로쓰 50 ml 중에제조하고, 225 rpm에서진탕시키면서 30 에서 16-24시간동안인큐베이션하였다. 이러한배양물을사용하여각균주의 150 ml 배양물을 SM11 최소배지중에출발접종물및항생제로서 0.8의 OD 600 및 5% TB 배양물캐리오버로접종하였다. 2시간 후에, 세포를 SM11 ( 포스페이트없음 ) 로세척하였다. 세포를 2회회전침강시키고 (4,000 rpm, 15분 ), 상청액을가만히따르고, 펠릿을 SM11 ( 포스페이트없음 ) 150ml 중에재현탁시켰다. 배양물을사용하여각균주의 3X 50 ml를 SM11 ( 포스페이트없음 ) 중에접종하고, 0.5 mm IPTG를각각에첨가하였다. 배양물을대략 2시간동안 30 에서 의 OD 600 으로성장시키고, 그후에배양물을 37 로옮기고, 72시간에걸쳐지방산측정을위해샘플을주기적으로제거하였다. [0392] 진탕플라스크방법 3: 균주를 FFA의생산에대해진탕플라스크에서평가하였다. 3벌평가를수행하였다. 간략하게, 밤샘종균배양물을적절한항생제를포함하는테리픽브로쓰 50 ml 중에제조하고, 225 rpm에서진탕시키면서 30 에서 16-24시간동안인큐베이션하였다. 이러한배양물을사용하여각균주의 300 ml 배양물을테리픽브로쓰배지중에출발접종물및항생제로서 0.8의 OD 600 및 5% TB 배양물캐리오버로접종하였다. 배 양물이 의 OD 600 에도달할때까지배양물을 225 rpm에서진탕시키면서 30 에서 4-6시간동안인큐베이션하였다. 4-6시간후에, 세포를 SM11 ( 포스페이트없음 ) 로세척하였다. 세포를 2회회전침강시키고 (4,000 rpm, 15분 ), 상청액을가만히따르고, 펠릿을 SM11 ( 포스페이트없음 ) 300ml 중에재현탁시켰다. 배양물을사용하여각균주의 3X 100 ml를 SM11 ( 포스페이트없음 ) 중에접종하였다. 배양물을대략 16시간동안 25 에서성장시킨다음, 37 로옮기고, 72시간에걸쳐지방산측정을위해샘플을주기적으로제거하였다. [0393] 진탕플라스크방법 4: 균주를 FFA의생산에대해진탕플라스크에서평가하였다. 3벌평가를수행하였다. 간략하게, 밤샘종균배양물을적절한항생제를포함하는테리픽브로쓰 50 ml 중에제조하고, 225 rpm에서진탕시키면서 30 에서 16-24시간동안인큐베이션하였다. 이러한배양물을사용하여각균주의 300 ml 배양물을테리픽브로쓰배지중에출발접종물및항생제로서 0.8의 OD 600 및 5% TB 배양물캐리오버로접종하였다. 배 양물이 의 OD 600 에도달할때까지배양물을 225 rpm에서진탕시키면서 30 에서 4-6시간동안인큐베이션하였다. 4-6시간후에, 세포를 SM11 ( 포스페이트없음 ) 로세척하였다. 세포를 2회회전침강시키고 (4,000 rpm, 15분 ), 상청액을가만히따르고, 펠릿을 SM11 ( 포스페이트없음 ) 300ml 중에재현탁시켰다. 배양물을사용하여각균주의 3X 100 ml를 SM11 ( 포스페이트없음 ) 중에접종하고, 0.5 mm IPTG를각각에첨가하였다. 배양물을대략 16시간동안 25 에서성장시킨다음, 37 로옮기고, 72시간에걸쳐지방산측정을위해샘플을주기적으로제거하였다. [0394] [0395] 서브섹션 D. 분석물정량화프로토콜스타빌왁스 (Stabilwax) 칼럼을사용하는기체크로마토그래피에의한분석전에지방산을발효배지중에서에스테르화하여메틸에스테르 (FAME) 를제조함으로써지방산의정량화를수행하였다. 에스테르화는 2시간동안 100 에서염산중메탄올로하였다. FAME를 GC 칼럼상에서분리하고, 화염이온화검출 (FID) 에의해검출하였다. 실행시작시의각성분의표준곡선을사용하여 FAME를정량화하였다. 데이터는배지중각 FAME의양

59 (mg) 으로보고하였다. [0396] [0397] [0398] [0399] [0400] [0401] [0402] [0403] 용매및완충제메틸에스테르화용액 (83% 메탄올 /8.3% 염산 /8.3% 클로로포름 ) 은다음과같이제조하였다 : 100mL 메탄올을 100 ml 유리병에첨가하고, 10mL 염산을첨가하고, 10 ml 클로로포름을첨가하고, 완전히혼합하였다 ( 실온에서저장 ). 추출용액 (80% 헥산 /20% 클로로포름 ) 은다음과같이제조하였다 : 80mL 헥산을 100mL 유리병에첨가하고, 20 ml 클로로포름을첨가하고, 완전히혼합하였다 ( 실온에서저장 ). 절차 GC는다음구배하에작동시켰다 : 4분동안 50, 150 까지 7 / 분, 3분유지, 220 까지 40 / 분, 2분유지, 전체실행시간 25분. 운반기체는유량 4.0 ml/ 분의헬륨이고, 구성기체는유량 30 ml/ 분의헬륨이다. 수소유량 35 ml/ 분, 공기유량 340 ml/ 분, 속도 55.3cm/ 초, 압력 , 스플릿비 17:1, 스플릿유량 68 ml/ 분, 주입부피 1μL, 유입구온도 250 및검출기온도 300. 펜타데칸을내부표준으로서사용하였다. GC 소프트웨어및선형회귀함수를사용하여표준의농도를기준으로각지방산에대한표준곡선을제작하였다. GC 보정소프트웨어를사용하여각샘플및대조군중각지방산의양 (mg) 을결정하였다. 검정허용기준은지방산표준곡선에대한상관계수가 0.99 초과일것을요구하였다. 표준의농도는기록범위내에있어야한다. 샘플은하기와같이제조하였다 : 반응바이알에 < 2 ml 배양물을첨가하였다. 대략 60분동안스피드백 (SpeedVac) 내의샘플을열로건조시켰다. 3 ml 메틸에스테르화용액을첨가하였다. 10 μl 내부표준용액을첨가하였다. 2시간동안 85 에서인큐베이션하였다. 인큐베이터에서제거하여실온으로냉각시켰다. 1 ml 탈이온수를첨가하였다. 2 ml 추출용액을첨가하였다. 1분동안격렬하게와동시키고, 혼합물을가라앉혀분리시켰다. 유기층 ( 상부 ) 을제거하여호박색 GC 바이알내의바이알인서트에넣었다. 질량분광계검출기를사용하는것은 GC-FID에따른동일한샘플제조방법을사용하는것으로이루어진다. 화학물질확인의추가적도구는유리지방산 (FFA) 을검증하기위한 NIST08 라이브러리를통한것이다. 이것은체류시간을표준과일치시킬뿐만아니라질량분광계를사용하여표적및정성자이온을표준에일치시킨다

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