공개특허 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) Int. Cl. C07K 16/46 ( ) C07K 14/315 ( ) C12N 15/13 ( ) A61K 39/09 (2006.

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) Int. Cl. C07K 16/46 ( ) C07K 14/315 ( ) C12N 15/13 ( ) A61K 39/09 ( ) (11) 공개번호 (43) 공개일자 년 08 월 27 일 (21) 출원번호 (22) 출원일자 2007년03월23일 심사청구일자 없음 번역문제출일자 2007년03월23일 (86) 국제출원번호 PCT/DK2005/ (87) 국제공개번호 WO 2006/ 국제출원일자 2005년08월22일 국제공개일자 2006년03월02일 (30) 우선권주장 PA PA 년 08 월 23 일 2005 년 07 월 05 일 덴마크 (DK) 덴마크 (DK) (71) 출원인메다렉스, 인코포레이티드미국 뉴저지주프린스톤스테이트로드 707 젠팜인터내쇼날, 아이엔씨. 미국캘리포니아 밀피타스코튼우드드라이브 521 (72) 발명자소렌센안데르스퍼덴마크디케이 힐레로드카알룬드스베쥐 24 벤피엘드토마스라스덴마크디케이 코펜하겐오 4. 구스타브아돌프그레이드 14 룬드그렌옌스딜링덴마크디케이 샬롯텐룬드스코브베쥐 121 켐페토마스디. 미국캘리포니아 써니베일요크타운디알 (74) 대리인박장원 전체청구항수 : 총 50 항 (54) 뉴몰리신에대한결합원 (57) 요약 본발명은뉴몰리신에특이적으로결합할수있는적어도하나의결합도메인을포함하는항 - 용혈결합원에대한것으로서, 특히적어도두개의결합도메인을갖는결합원에대한것이며, 치료뿐만아니라진단방법에있어서상기결합원의용도에대한것이다. 바람직한구체예에서, 결합원은항체, 이를테면인간항체, 또는그들의단편이고, 그것은이중특이적항체일것이다

2 대표도 도 1 특허청구의범위 청구항 1. 뉴몰리신 (Pneumolysin) 에특이적으로결합할수있는적어도하나의결합도메인을포함하는분리된항 - 용혈결합원으로서, 여기에서상기결합도메인은서열번호 11 의아미노산 에대응하는뉴몰리신의 N- 말단부분에있는에피토프를인식하는것인분리된항 - 용혈결합원. 청구항 2. 제 1 항에있어서, 여기에서상기결합도메인은서열번호 11 의아미노산 에대응하는뉴몰리신의부위에있는에피토프를인식하는것인분리된결합원. 청구항 3. 제 1 항또는제 2 항에있어서, 여기에서분리된결합원은순수하게분리된결합원인것인분리된결합원. 청구항 4. 제 1 항내지제 3 항중어느한항에있어서, 여기에서결합원은항체또는항체의면역학적활성단편또는항체의단일사슬로부터선택되는것인분리된결합원. 청구항 5. 제 4 항에있어서, 여기에서항체는모노클로날항체, 폴로클로날항체또는모노클로날항체들의혼합물로부터선택되는것인분리된결합원. 청구항 6. 제 1 항에있어서, 결합원은뉴몰리신에대해단일특이적 (monospecific) 인것인분리된결합원. 청구항 7. 제 1 항에있어서, 여기에서결합원은뉴몰리신에대해특이적인적어도하나의부분을갖는이중특이적 (bispecific) 인것인분리된결합원. 청구항

3 제 1 항에있어서, 여기에서결합원은뉴몰리신에대해적어도하나의부분을갖는다중특이적 (multispecific) 인것인분리된결합원. 청구항 9. 제 1 항에있어서, 여기에서결합원은인간항체프레임워크 (human antibody framework) 에의해수행되는것인분리된결합원. 청구항 10. 제 1 항에있어서, 여기에서결합원은인간화항체프레임워크 (humanised antibody framework) 에의해수행되는것인분리된결합원. 청구항 11. 전항들중어느한항에있어서, 여기에서상기결합원은서열번호 27 에의해포함되는에피토프를인식하는것인분리된결합원. 청구항 12. 전항들중어느한항에있어서, 여기에서상기결합원은서열번호 28, 29, 30 또는 31 에의해포함되는에피토프를인식하는것인분리된결합원. 청구항 13. 전항들중어느한항에있어서, 여기에서상기결합원은서열번호 11 에의해동정된뉴몰리신의아미노산 에의해포함되는에피토프를인식하는것인분리된결합원. 청구항 14. 전항들중어느한항에있어서, 여기에서결합도메인은서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10 또는그들의상동체 (homologue) 로부터선택되는적어도하나의아미노산서열을포함하는것인분리된결합원. 청구항 15. 전항들중어느한항에있어서, 여기에서결합도메인은서열번호 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 10, 또는그들의상동체로부터선택되는적어도하나의아미노산서열을포함하는것인분리된결합원. 청구항 16. 전항들중어느한항에있어서, 여기에서결합도메인은서열번호 10 또는그들의상동체에의해동정되는서열을포함하는아미노산서열을포함하는것인분리된결합원

4 청구항 17. 전항들중어느한항에있어서, 여기에서결합도메인은서열번호 8 또는서열번호 17 또는그들의상동체에의해동정되는서열을포함하는아미노산서열을포함하는것인분리된결합원. 청구항 18. 전항들중어느한항에있어서, 여기에서결합도메인은서열번호 9 또는서열번호 18 또는그들의상동체에의해동정되는서열을포함하는아미노산서열을포함하는것인분리된결합원. 청구항 19. 전항들중어느한항에있어서, 여기에서결합원은두개이상의다른뉴모코커스혈청형으로부터의뉴몰리신에결합할수있는것인분리된결합원. 청구항 20. 제 14 항내지제 19 항중어느한항에있어서, 여기에서상동체는서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 로부터선택되는하나이상의서열에대하여적어도 60% 의동일성, 이를테면적어도 65% 의동일성, 이를테면적어도 70% 의동일성, 이를테면적어도 75% 의동일성, 이를테면적어도 80% 의동일성, 이를테면적어도 85% 의동일성, 이를테면적어도 90% 의동일성, 이를테면적어도 95% 의동일성, 이를테면적어도 98% 의동일성을갖는것인분리된결합원. 청구항 21. 제 1 항에있어서, 여기에서분리상수는 M 미만, 이를테면 M 미만인것인분리된결합원. 청구항 22. 전항들중어느한항에있어서, 여기에서결합원은 V L 도메인에위치하는것인분리된결합원. 청구항 23. 전항들중어느한항에있어서, 여기에서결합도메인은 V H 도메인에위치하는것인분리된결합원. 청구항 24. 제 14 항내지제 23 항중어느한항에있어서, 여기에서결합도메인은결합원에있는상보성 - 결정부위 (CDR) 로서배열되는것인분리된결합원. 청구항

5 제 3 항에있어서, 여기에서항체의단편은 Fab, Fab', F(ab) 2 및 Fv 로부터선택되는것인분리된결합원. 청구항 26. 전항들중어느한항에있어서, 상기결합원은적어도첫번째결합도메인과두번째결합도메인을포함하고, 상기첫번째결합도메인은뉴몰리신에특이적으로결합할수있고, 상기두번째결합도메인은상기첫번째결합도메인과는다른것인결합원. 청구항 27. 제 25 항에있어서, 여기에서두번째결합도메인은포유동물의단백질, 이를테면인간단백질, 이를테면 CD64 또는 CD89 로부터선택되는단백질에특이적으로결합할수있는것인분리된결합원. 청구항 28. 제 25 항에있어서, 여기에서두번째결합도메인은포유동물의세포, 이를테면인간세포, 이를테면백혈구 (leucocyte), 대식세포 (macrophages), 임파구 (lymphocytes), 호중성세포 (neutrophilic cell), 호염기세포 (basophilic cell), 및호산세포 (eosinophilic cell) 로부터선택되는세포에특이적으로결합할수있는분리된결합원. 청구항 29. 제 26 항에있어서, 여기에서두번째결합도메인은뉴모코커스 (Pneumococcus) 단백질에특이적으로결합할수있는것인분리된결합원. 청구항 30. 제 28 항에있어서, 여기에서두번째결합도메인은첫번째결합도메인과는다른뉴몰리신에피토프에특이적으로결합할수있는것인분리된결합원. 청구항 31. 제 25 항에있어서, 여기에서결합원은두개의결합도메인을포함하는것인분리된결합원. 청구항 32. 제 30 항에있어서, 여기에서두개의결합원은스페이서부위를통해연결되는것인분리된결합원. 청구항 33. 제 1 항내지제 32 항중어느한항에서정의된결합원의적어도한부분을코딩하는분리된핵산분자. 청구항

6 제 32 항에서정의된핵산분자를포함하는벡터. 청구항 35. 제 33 항에있어서, 핵산분자에의해코딩되는항체의발현을조절하는뉴클레오타이드서열을포함하는것인벡터. 청구항 36. 제 32 항에서정의된핵산분자를포함하는숙주세포. 청구항 37. 제 1 항내지제 32 항중어느한항에서정의된결합원을발현하도록설계된세포주. 청구항 38. 개체에서뉴모코커스와관련된질병또는장애를측정하고진단하는방법으로서, - 상기개체로부터생물학적샘플을제공하고, - 상기생물학적샘플에제 1 항내지제 32 항중어느한항에서정의된적어도하나의결합원을첨가하고, - 상기생물학적샘플에결합된결합원을측정하여, 질병또는장애를측정하거나진단하는것을포함하는방법. 청구항 39. 제 1 항내지제 31 항중어느한항에서정의된적어도하나의결합원을포함하는키트로서, 상기항체가표지된것인키트. 청구항 40. 제 1 항내지제 31 항중어느한항에서정의된적어도하나의결합원을포함하는약학조성물. 청구항 41. 제 39 항에있어서, 적어도두개의다른결합원을포함하는것인약학조성물. 청구항 42. 약학조성물의생산을위한제 1 항내지제 32 항중어느한항에서정의된결합원의용도. 청구항

7 뉴모코커스감염의치료를위한약학조성물의생산을위한, 제 1 항내지제 32 항중어느한항에서정의된결합원의용도. 청구항 44. 제 1 항내지제 32 항중어느한항에서정의된결합원에의해인식되는, 서열번호 11 의아미노산 으로구성되는뉴몰리신펩타이드, 그들의단편또는유사체. 청구항 45. 서열번호 27, 28, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36 에의해동정되는아미노산서열을포함하는, 뉴몰리신펩타이드, 단편또는그들의유사체. 청구항 46. 뉴몰리신펩타이드를포함하는백신조성물로서, 여기에서뉴몰리신펩타이드는서열번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36 또는그들의유사체에의해동정되는아미노산서열을포함하는것인백신조성물. 청구항 47. 제 46 항에있어서, 어쥬번트를더포함하는것인백신. 청구항 48. 제 46 항에있어서, 여기에서뉴몰리신펩타이드는제 1 항내지제 32 항중어느한항에서정의된결합원에의해인식되는, 서열번호 11 의아미노산 , 그들의단편또는유사체를포함하는것인백신. 청구항 49. 제 46 항내지제 48 항중어느한항에있어서, 여기에서뉴몰리신펩타이드, 단편또는그들의유사체는최고 100, 이를테면 80, 60, 40, 20, 15 또는이를테면최고 12 아미노산에의해구성되는것인백신. 청구항 50. 뉴모코커스감염의에방적치료를위해제 46 항내지제 49 항중어느한항에따른백신조성물의용도. 명세서 기술분야 본발명은특히뉴몰리신 (Pneumolysin) 에결합할수있는적어도하나의결합도메인을포함하는결합원에대한것으로서, 상세하게는적어도두개의결합도메인을가지는결합원에대한것이고, 치료용뿐만아니라진단방법에있어서상기결합원의용도에대한것이다. 또한, 뉴몰리신펩타이드및뉴몰리신펩타이드를포함하는백신조성물에대한것이다. 배경기술 - 7 -

8 스트렙토코커스뉴모니애 ( 폐렴연쇄구균, Streptococcus pneumoniae) 는생명을위협하는박테리아감염의주요원인중의하나이다. 개발도상국에있어서, 5 세이하의수만명의어린이들이매년 S. 뉴모니애로죽을것이라고추측되어왔다 (anonymous, 1985). 산업화된세계에서, S. 뉴모니애폐렴의발병율은 명당 5-10 명이고, 치사율은 5-7% 이다. S. 뉴모니애수막염은 명당 1-2 명에서발병하며 30-40% 의치사율을갖는다 (Lee et al., 1997). S. 뉴모니애는세균혈증 (bacteremia) 의가장빈번한원인중의하나이다. S. 뉴모니애는중이염 (otitis media. App) 을앓고있는어린이로부터분리되는가장빈번한미생물이다. 6 세미만의모든어린이의 75% 는중이염을앓게될것이다. S. 뉴모니애는쌍으로자라며짧은사슬을갖고있는그램 - 양성박테리아이다. 그표면은세개의층으로구성되어있다 : 캡슐, 세포벽및원형질막. 그캡슐은가장두꺼운층이며성장하고있는 S. 뉴모니애의내부구조를완전히감싸고있다. 올리고사카라이드 ( 폴리사카라이드 ) 의반복단위의폴리머들이캡슐을구성하고있다. 다른혈청형은캡슐의부분으로서리비톨, 아라비티놀또는포스포릴 - 콜린을포함하며, 이로인하여특정혈청형이되는화학구조가초래된다. 세포벽은테이코산 (teichoic acid) 및지질테이코산 (lipoteichoic acid) 뿐만아니라펩타이도글리칸으로구성된다. 원형질막은그세포를감싸고그것의표면에다양한분자를부착시키는이중인지질막이다 (Alonso De Velasco, 1995). 현재, S. 뉴모니애캡슐의다양성에근거하여 90 여가지의다양한타입의 S. 뉴모니애가있는것으로알려져있다. 그캡슐은 S. 뉴모니애감염의중추적인병인이다. 하나의캡슐타입에대해발생된항체는이타입으로인한감염의예방을제공할뿐, 다른캡슐타입을갖는감염을예방하지못한다. 현재 23 가의폴리사카라이드백신이가장빈번한혈청형의 60-85% 이상을예방할수있다. 뉴몰리신은몇몇그램 - 양성박테리아의주요발병인자이며, 콜레스테롤 - 결합톡신패밀리의일원이다 (de los Toyos et al., 1996). 그것은고리 - 형태의올리고머 ( 포린, porins) 를형성함으로써세포의콜레스테롤 - 함유멤브레인을붕괴시키는용해성단백질이다 (Bonev et al., 2001). 게다가, 뉴몰리신은 Fc 및보체단백질과상호작용을통해비 - 특이적방식으로보체계를활성화시킨다. 뉴몰리신의독성은뉴몰리신유전자의자리 - 지정돌연변이유발 (site-directed mutagenesis, Trp-433 을 Phe 으로치환 ) 에의해약독화될수있어이로인하여뉴몰리소이드 (PdB, pneumolysoid) 가발현된다 (Alexander et al., 1994). 뉴몰리신은테스트된 S. 뉴모니애균주들중에서보존된것으로나타난다 (Paton et al., 1983). S. 뉴모니애의다른균주들의뉴몰리신유전자에기초하여추론된아미노산서열은 >99% 이동일하다 (Mitchell et al., 1990). 뉴몰리신에대한 IgA 는성인 (17 명중 17 명 ) 및어린이 (261 명중 242 명 ) 의타액에서검출될수있다 (Simell et al., 2001). 항 - 뉴몰리신 IgG 는 2 세미만의대부분의어린이 (1108 명중 803 명 ) 및모든성인 (325 명중 325 명 ) 에있어서 EIA 에의해측정될수있다 (Rapola et al., 2000). 혈청전환 (Seroconversion) 은캐리어상태와서로관련되어있는데, 즉, 비강인두또는중이표본으로부터배양된 S. 뉴모니애로감염된어린이들은거의대부분항 - 뉴몰리신 IgG 양성이다. ELISA 법을이용한다른연구에서, IgG 는 40 명의건강한성인중 7 명에서관측되었고, 만성폐쇄폐병 (obstructive pulmonary disease) 환자 32 명중 17 명에서관측되었고, 폐렴구균성폐렴 (pneumococcal pneumonia) 환자 31 명중 13 명에서관측되었다 (Musher et al., 2001). 흥미롭게도, 폐렴과세균혈증을갖는극히적은환자들이세균혈증은없으나폐렴을앓고있는환자들에비교하여측정가능한 IgG 를갖고있었다 (4/16 대 9/15). 이는항 - 뉴몰리신항체가세균혈증으로진행하는폐렴을예방할수있을암시하고있다. 발명의상세한설명 요약 본발명은특히뉴몰리신에결합할수있는적어도하나의결합도메인을포함하는항 - 용혈결합원에대한것으로서, 여기에서상기결합원은스트렙토코커스, 특히스트렙토코커스뉴모니애와관련된질병및장애를예방및치료하기위한약학조성물에있어서용도로서적절하다. 따라서, 하나의구체예에서, 본발명은특히뉴몰리신에결합할수있는적어도하나의결합도메인을포함하는분리된결 합원에대한것으로서, 상기결합도메인은뉴몰리신에대하여 의분리상수 K d 를갖는다. 바람직하게, 그결합도 메인을포함하는결합원은상기정의된분리상수 K d 를갖는다

9 높은결합강도로인하여, 결합원은약학조성물어서의용도로적절하다. 게다가, 항용혈활성을갖는좀더많은결합원들이더욱유익하다. 다른측면에서, 본발명은적어도첫번째결합원과두번째결합을포함하는분리된결합원에대한것으로서, 상기첫번째결합도메인은특히뉴몰리신에결합할수있다. 본발명에따른결합원은항체또는항체의단편이바람직하다. 이항체는당업자에게잘알려진임의의적절한방법에의해생산될수있으나, 결합원의적어도일부분은재조합방법을통해생산되는것이바람직하다. 따라서, 본발명은한측면에서상기에서정의된결합원의적어도일부분을코딩하는분리된핵산분자, 뿐만아니라상기정의된그핵산분자를포함하는벡터및상기정의된핵산분자를포함하는숙주세포에대한것이다. 또한본발명은상기정의된결합원의적어도일부분을발현하도록조작된세포주에대한것으로서, 더욱바람직하게는상기정의된전체결합원을발현하도록조작된것이다. 다른측면에서, 본발명은개체에서뉴모코커스 (Pneumococcus, 폐렴구균 ) 와연관된질병또는장애를측정하거나진단하는방법에대한것으로서, 그방법은다음을포함한다 : - 상기개체로부터생물학적샘플을제공하고 - 상기생물학적샘플에상기에서정의된적어도하나의결합원을첨가하고 - 상기생물학적샘플에결합된결합원을측정하고, 이에의해그질병또는장애를측정또는진단하는것. 또한, 그방법에있어서, 본발명은상기에서정의된적어도하나의결합원을포함하는키트에대한것으로서, 상기결합원은표지되어있어진단방법에서이용될수있다. 또다른측면에서본발명은상기정의된적어도하나의결합원을포함하는약학조성물에대한것이다. 게다가, 본발명은스트렙토코커스뉴모니애와관련된장애또는질병, 이를테면폐렴 (pneumonia), 수막염 (meningitis) 및 / 또는패혈증 (sepsis) 의치료또는예방을위한약학조성물의생산을위한상기정의된결합원의용도에대한것이다. 또다른측면에서본발명은스트렙토코커스뉴모니애와관련된장애또는질병, 이를테면폐렴 (pneumonia), 수막염 (meningitis) 및 / 또는패혈증 (sepsis) 을앓고있는환자에게상기정의된결합원의유효량을투여함으로써치료또는예방하기위한방법에대한것이다. 또다른측면은항 - 용혈결합원에의해인지된뉴몰리신펩타이드및그펩타이드를포함하는백신조성물에대한것이다. 정의 친화도 : 수용체와그들의리간드사이의결합강도, 예를들어항체와그것의항원사이의결합강도. 항원항체결합강도 (Avidity): 에피토프와파라토프사이반응의친화도, 및항체와항원의수가 (valencies) 모두에관련된, 항체의그것의항원에대한기능적결합강도. 아미노산잔기 : 아미노산은그것의펩타이드결합에서폴리펩타이드의화학적소화 ( 가수분해 ) 로형성된다. 여기에서설명된아미노산잔기들은 "L" 이성질체형태인것이바람직하다. 그러나, "D" 이성질체형태의잔기들은폴리펩타이드가목적으로하는기능적성질을보유하는한, 임의의 L- 아미노산잔기로치환될수있다. NH 2 는폴리펩타이의아미노말단에존 재하는유리아미노기를말한다. COOH 는폴리펩타이드의카르복시말단에존재하는유리카르복실기를말한다. 표준폴리펩타이드로유지함에있어서, 아미노산잔기를위한약어는다음의대응표에서보여지고있다. 대응표 - 9 -

10 기호 1-문자 3-문자 아미노산 Y Tyr 티로신 G Gly 글라이신 F Phe 페닐알라닌 M Met 메티오닌 A Ala 알라닌 S Ser 세린 I Ile 이소루이신 L Leu 루이신 T Thr 트레오닌 V Val 발린 P Pro 프롤린 K Lys 라이신 H His 히스티딘 Q Gln 글루타민 E Glu 글루탐산 Z Glx Glu 및 / 또는 Gln W Trp 트립토판 R Arg 아르기닌 D Asp 아스파르산 N Asn 아스파라긴 B Asx Asn 및 / 또는 Asp C Cys 시스테인 X Xaa 모름또는기타 여기에서일반식으로대표되는모든아미노산잔기서열들은아미노말단에서카르복시말단으로의통상적인방향으로왼쪽에서오른쪽오리엔테이션을갖는것임을인지하여야한다. 추가로, " 아미노산잔기 " 어구는대응표에기재된아미노산뿐만아니라변형되고보통이아닌아미노산을포함하도록넓게정의된다. 게다가, 아미노산잔기서열의시작또는말단에서의대시 (dash) 는하나이상의아미노산잔기의다른서열에의펩타이드결합또는아미노 - 말단기, 이를테면 NH 2 또 는아세틸에대한또는카르복시 - 말단기, 이를테면 COOH 에대한공유결합을의미한다. 항체 : 다양한문법적인형태에서의항체란용어는여기에서면역글로불린분자와본발명의조성물의면역글로불린분자, 즉항체결합부위또는파라토프를함유하는분자의면역학적활성부위를언급하는것으로사용된다. 예시적인항체분자들은 Fab, Fab', F(ab') 2 및 Fv 로당업계에알려진부위를포함하는완전한면역글로불린분자, 실질적으로완전한면역 글로불린분자및면역글로불린분자의부분이다. Fab 의도식도는도 1 에서보여진다. 여기에서사용되는 " 항체 " 용어는또한인간, 단사슬, 인간화된항체, 뿐만아니라그런항체의결합단편또는그런항체의변형체, 이를테면항체분자로부터유래된적어도하나의항원결합결정소를갖고있는다중특성 (multispecific), 이중특성 (bispecific) 및키메릭분자를포함하는것으로의도된다. 항체분류 : 그들의헤비체인의불변도메인의아미노산서열에따라, 면역글로불린은다른부류로분류될수있다. 면역글로불린은적어도 5 개의주요부류가있다 : IgA, IgG, IgE, IgG 및 IgM, 그리고이들의몇몇은다시하위부류 ( 이소타입 ) 으로분류될수있는데, 예를들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4; IgA-1 및 IgA-2 이다. 면역글로불린의다른부류에대응하는헤비체인불변도메인은각각알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 및뮤 (μ) 로불리운다. 항체의라이트체인은그들의불변도메인의아미노산서열에기초하여카파 (κ) 와람다 (λ) 로불리는두개의분명한구별타입중하나로지정될수있다. 면역글로불린의다양한분류의하위유닛구조및 3 차원배열은잘알려져있다. 항체결합부위 : 항체결합부위는항원이특이적으로결합 ( 면역반응 ) 하는헤비및라이트체인가변및초가변부위로구성된항체분자의구조적부분이다. 그것의다양한형태에있어서면역반응이란용어는항원결정소 - 함유분자및전체항체분자또는그것의부분과같은항체결합부위를포함하는분자사이의특이적결합을의미한다. 대안으로, 항체결합부위는항원결합부위로알려져있다. 항 - 용혈 : 용혈현상을억제하는능력. 여기에서적혈구상에서뉴몰리신의용혈활성의억제를의미한다

11 염기쌍 (bp): 이중나선 DNA 분자에있어서아데닌 (A) 과티민 (T) 또는시토신 (C) 과구아닌 (G) 과의엽합. RNA 에있어서, 우라실 (U) 은티민을대신한다. 결합원 : 스트렙토코커스뉴모니애단백질상의에피토프에결합할수있는폴리펩타이드로서, 특히뉴몰리신에결합할수있다. 결합도메인 : 항원에특이적으로결합하는항원결합부위. 결합원은다중특성이며, 두개의면역학적으로구별되는항원에특이적으로결합하는두개이상의결합도메인을포함한다. 키메라항체 : 가변부위는한종의동물로부터유래하고, 불변부위는다른종의동물로부터유래된항체. 예를들어, 키메라항체는쥐모노클로날항체로부터유래한가변부위와인간의불변부위를갖는항체가될수있다. 상보적염기 : DNA 또는 RNA 가이중나선배열을형성할때정상적으로쌍을이루는뉴클레오타이드. 상보성결정부위또는 CDR: 함께항체인식및결합도메인을형성하는항체의 V- 도메인에서의부위. 상보적뉴클레오타이드서열 : 결국수소결합을갖도록특이적으로혼성화되기위해다른단일가닥에충분히상보적인 DNA 또는 RNA 의단일가닥분자에서의뉴클레오티드의서열 보존된 : 미리선택된서열의정확한보완을위해비 - 임의적으로혼성하된다면, 미리선택된 ( 참고자료 ) 서열에비하여보전된뉴클레오타이드서열. 보존적치환 (Conservative Substitution): 여기에서사용된보존적치환이라는용어는다른, 생물학적으로유사한잔기에의해아미노산잔기가대체되는것을지시한다. 보존적치환의예로는다른잔기를소수성잔기, 이를테면이소루이신, 발린, 루이신또는메티오닌으로의치환, 다른잔기를하나의극성잔기로의치환, 이를테면라이신을아르기닌으로의치환, 아스파르산을글루탐산으로의치환, 또는아스파라긴을글루타민으로의치환등이있다. 보존적치환의용어는또한치환된폴리펩타이드를갖는분자가동일한기능을갖는다는것을조건으로하여, 비치환된모아미노산을대신하여치환된아미노산의용도를포함한다. 불변부위또는불변도메인또는 C- 도메인 : 불변부위는그것에보존적치환을포함할수있는주어진이소타입내의아미노산잔기서열을포함하는항체분자의구조적부분을의미한다. 대표적인헤비체인면역글로불린불변부위는 CH1, CH2, CH3, CH4 및 CH5 으로당업계에잘알려진면역글로불린의부분이다. 대표적인라이트체인면역글로불린불변부위는 CL 로서당업계에알려진면역글로불린분자의부분이다. 이체 (Diabodies): 이용어는두개의항원 - 결합부위를갖는작은항체단편을의미하는것으로서, 그단편은같은폴리펩타이드체인 (V H -V L ) 에서라이트체인가변도메인 (V L ) 에연결된헤비체인가변도메인 (V H ) 을포함한다. 동일한체인에 서두개의도메인사이에는쌍을형성하기에는너무짧은링커를이용하여, 도메인들은다른체인의상보적인도메인과쌍이되어두개의항원 - 결합부위를형성하게된다. 이체는예를들어유럽특허제 EP 404,097 호 ; 국제공개공보제 WO 93/11161 호 ; 및홀링거등 (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: , 1993) 에서더욱자세하게기재되어있다. 분리상수, Kd: 수용체와그들의리간드사이, 예를들어항체와그것의항원사이의결합 ( 또는친화또는항원항체결합력 ) 강도를나타내는측정. Kd 가작을수록결합력이강하다. 하류 (Downstream): 서열전사또는해독방향에있어서 DNA 서열을따라, DNA 의비 - 코딩가닥을따라 3'- 에서 5'- 방향또는 RNA 전사체를따라 5'- 에서 3'- 방향으로이루어진다. 듀플렉스 DNA(Duplex DNA): 이중가닥의염기쌍에존재하는각각의상보적인염기들사이에하나이상의수소결합에의해서로결합되어있는실질적으로상보적인폴리뉴클레오티드두가닥을포함하는이중가닥핵산분자. 염기쌍을형성하는뉴클레오티드는리보뉴클레오티드염기또는데옥시뉴클레오티드염기일수있으며, " 듀플렉스 DNA" 란용어는두개의 DNA 가닥 (ds DNA) 를포함하는 DNA-DNA 이중가닥또는하나의 DNA 와하나의 RNA 가닥을포함하는 RNA-DNA 이중가닥을의미한다

12 융합폴리펩타이드 : 적어도두개의폴리펩타이드및그두개의폴리펩타이드가하나의연속된폴리펩타이드로작동가능하게연결되도록하는연결서열로구성된폴리펩타이드. 융합폴리펩타이드에서연결된두개의폴리펩타이드는통상적으로두개의독립된소스로부터유래되고, 그러므로융합폴리펩타이드는보통자연에서연결된형태로발견되지않는두개의연결된폴리펩타이드를포함한다. Fv: V H 과 V L 을포함하는이중체인항체단편 유전자 : 뉴클레오타이드서열이 RNA 또는폴리펩타이드를코딩하는것인핵산. 유전자는 RNA 또는 DNA 가될수있다. 인간항체프레임워크 : 항원결합부위와인간면역글로불린으로부터유래된분자의필수적으로모든잔여면역글로불린 - 유래부분을갖는분자. 인간화항체프레임워크 : 비 - 인간종들의면역글로불린으로부터유래된항원결합부위를갖는분자로서, 그분자의몇몇또는모든잔여면역글로불린 - 유래부분은인간면역글로불린으로부터유래된것이다. 항원결합부위는다음을포함한다 : 하나이상의인간불변도메인상에융합된비 - 인간면역글로불린의완전가변도메인 ; 또는가변도메인에서적절한인간프레임워크부위로이식된하나이상의상보성결정부위 (CDRs). 인간화항체에있어서, CDRs 는쥐모노클로날항체로부터유래될수있으며, 그항체의다른부위는인간으로부터유래된것일수있다. 혼성화 : 상보적인염기쌍들사이에수소결합의형성에의해이중가닥또는헤테로이중가닥을형성하기위해실질적으로상보적인뉴클로에티드서열 ( 핵산가닥 ) 의접합. 그것은경쟁적으로억제될수있는두개의상보적인폴리뉴클레오티드사이의특이적, 즉, 비 - 임의적상호작용이다. 면역글로불린 : IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 를포함하는혈청항체. 면역글로불린이소타입 : 다른 H 체인을갖는 Ig 에주어진이름, 그이름들은 IgG (IgG 1,2,3,4 ), IgM, IgA (IgA 1,2 ), siga, IgE, IgD 이다. 면역학적구별 : 면역학적구별이란용어는항체가폴리펩타이드중하나에특이적으로결합하고다른폴리펩타이드에는특이적으로결합하지않는능력에있어서, 두개의폴리펩타이드들사이에서구별하는능력을의미한다. 개체 : 질병, 특히하기에서정의되는감염질환에감염되기쉬운살아있는동물또는인간. 주체는항원자극및성장인자자극에반응할수있는백혈구를가지고있는개체이다. 바람직한구체예에서, 그주체는포유동물이며, 인간및비 - 인간포유동물, 이를테면개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 쥐및생쥐를포함한다. 가장바람직한구체예에있어서, 그주체는인간이다. 감염질환 : 하나이상의스트렙토코커스, 특히스트렙토코커스뉴모니애에의해감염되는질병. 분리된 : 그것의자연적인환경의성분으로부터동정되고, 분리되고 / 되거나회수된, 여기에개시된다양한결합원들, 폴리펩타이드들및뉴클레오타이드를설명하는데이용된다. 그것의자연적환경의오염물질성분들은통상적으로폴리펩타이드의진단또는치료적용도를방해하는물질이고, 효소, 호르몬, 및다른단백질성 (proteinaceous) 또는비 - 단백질성용질을포함할것이다. 바람직한구체예에서, 폴리펩타이드는정제될것이다. 표지및지시의의미 : 다양한문법적인형태에서, 복합체의존재를지시하는측정가능한시그널을생산하는데직접적또는간접적으로관련되어있는단일원자및분자를형성하는것을의미한다. 모노클로날항체 : 모노클로날항체란용어는다양한문법적인형태로특정항원과면역반응을할수있는오직한종의항체결합부위를포함하는항체분자의집단을의미한다. 그러므로모노클로날항체는통상적으로그것과면역반응을하는임의의항원에대하여단일결합친화도를나타낸다. 모노클로날항체는다른항원에대하여각각면역특이적인다수의항체결합부위를갖는항체분자, 예를들어이중특성모노클로날항체를포함할수있다

13 다중결합 (Multimeric): 하나이상의폴리펩타이드를포함하는폴리펩타이드분자. 중합체는이량체이고두개의폴리펩타이드를포함하고중합체는삼량체이고세개의폴리펩타이드를포함한다. 중합체는동형 (homomeric) 이고두개이상의동일한폴리펩타이드를포함하거나중합체는이형 (heteromeric) 이고두개이상의비 - 동일한폴리펩타이드를포함한다. 핵산 : 뉴클레오타이드의폴리머, 단일또는이중가닥임. 뉴클레오타이드 : 당일부 ( 펜토스 ), 인산염및질소함유헤테로시클릭염기로구성되는 DNA 또는 RNA 의단량체유니트. 염기는글리코시드탄소 ( 펜토스의 1' 탄소 ) 를통해당부분에연결되고그염기와당의조합이뉴클레오시드이다. 뉴클레오시드가펜토스의 3' 또는 5' 위치에결합된인산염그룹을포함할때, 뉴클레오타이드로서언급된다. 뉴클레오타이드가작동가능하게연결된서열은통상적으로 " 염기서열 " 또는 " 뉴클레오타이드서열 ", 및그들의문법적등가물로서여기에서언급되고, 일반식의좌에서우측의오리엔테이션이 5'- 말단에서 3'- 말단의통상적인방향인것에의해대표된다. 뉴클레오타이드유사체 : 구조적으로 A, T, G, C, 또는 U 와다른퓨린또는피리미딘뉴클레오타이드이지만, 핵산분자에있어서정상뉴클레오타이드를대신할정도로충분히유사하다. 뉴모코커스 (Pneumococcus): 스트렙토코커스뉴모니애와동의어로사용된다. 폴리클로날항체 : 폴리클로날항체는특정의주어진항원을인식하는항체혼합물로서, 폴리클로날항체들은상기항원내의다른에피토프를인식할수있다. 폴리뉴클레오타이드 : 단일또는이중가닥뉴클레오타이드의폴리머. 여기에서사용된것처럼, " 폴리뉴클레오타이드 " 및그것의문법적등가물은핵산의모든범위를포함한다. 폴리뉴클레오타이드는통상적으로두개이상의데옥시리보뉴클레오타이드및 / 또는리보뉴클레오타이드의선형가닥을구성하는핵산분자를언급한다. 정확한크기는많은요인들에따를것이고, 당업계에서잘알려진것처럼그것을사용하는최상의조건에따라달라질것이다. 본발명의폴리뉴클레오타이드는프라이머, 프로브, RNA/DNA 단편, 올리고뉴클레오타이드또는 " 올리고 "( 상대적으로짧은폴리뉴클레오타이드 ), 유전자, 벡터, 플라스미드등을포함한다. 폴리펩타이드 : 폴리펩타이드는다름이아니라인접아미노산잔기들사이의아미드결합인결합을포함하는아미노산잔기를포함하는분자를의미한다. 수용체 : 수용체는단백질, 글리코단백질등과같은분자로서, 다른분자에특이적으로 ( 비 - 임의적으로 ) 결합할수있다. 재조합 DNA(rDNA) 분자 : 작동가능하게연결된두개의 DNA 단편에의해생산된 DNA 분자. 그러므로재조합 DNA 분자는자연에서는보통함께발견되지않는적어도두개의뉴클레오타이드서열을포함하는하이브리드 DNA 분자이다. rdna 는일반적인생물학적기원, 즉, 진화론적인차이점을가지고있지않으며 " 이종기원 (heterologous)" 으로불리워진다. 특이성 : 특이성이란용어는폴리펩타이드에있어서일정항원과면역반응 ( 특이적으로결합하는 ) 잠재적인항원결합부위의수를의미한다. 폴리펩타이드는단일폴리펩타이드일수있거나이황화결합 (disulfide bond) 에의해결합된두개이상의폴리펩타이드일수있다. 폴리펩타이드는단특이성일수있고하나의항원에특이적으로결합할수있는하나이상의항원결합부위를포함하거나, 폴리펩타이드는이중특이성일수있으며두개의면역학적으로구별되는항원에특이적으로결합하는두개이상의항원결합부위를포함할수있다. 그러므로, 폴리펩타이드는동일또는다른항원에특이적으로결합할수있는다수의항원결합부위를포함할수있다. 혈청형 : 많은균주로구성된스트렙토코커스의종들중에서다양한특징들에있어서다른것과구분되는박테리아의동정. 보통혈청형으로정의되는특징은특정항원분자에이용된다. 단일사슬항체또는 scfv: 단일사슬항체란용어는하나이상의항원결합부위를포함하는단일폴리펩타이드를의미한다. 게다가, 비록 Fv 단편의 H 및 L 사슬은분리된유전자에의해코딩되고, 그들은펩타이드와직접적으로또는펩타이드를통해연결될수있고, 예를들어합성링커는재조합방법에의해그들을단일단백질사슬 (known as single chain anti-body, sab; Bird et al Science 242: ; and Huston et al PNAS 85: ) 로만들수있다. 그런단일사슬항체들은또한 " 항체 " 용어내에포함되고, 다중특성결합분자의설계및처리에있어서결합결정소로서이용될수있다

14 상류 (Upstream): DNA 전사의방향과반대방향으로, 그러므로비 - 코딩가닥상에서 5' 에서 3' 또는 mrna 상에서 3' 에서 5' 의방향. 수가 (Valency): 수가란용어는폴리펩타이드에있어서잠재적인항원결합부위, 즉결합도메인의수를의미한다. 폴리펩타이드는단가일수있고하나의항원결합부위를포함할수있거나폴리펩타이드는이가일수있고두개의항원결합부위를포함할수있다. 추가적으로, 폴리펩타이드는사가일수있으며네개의항원결합부위를포함할수있다. 각항원결합부위는하나의항원과특이적으로결합한다. 폴리펩타이드가하나이상의항원결합부위를포함할때, 각항원결합부위는동일또는다른항원과특이적으로결합할수있다. 그러므로, 폴리펩타이드는다수의항원결합부위를포함할수있고, 그러므로다가 (multivalent) 이며폴리펩타이드는동일한또는다른항원에특이적으로결합할수있다. V- 도메인 : 가변도메인은항원결합부위를형성하는아미노산잔기서열을포함하는항체분자의구조적부분이다. 대표적인라이트체인면역글로불린가변부위는당업계에서 V L 로알려진면역글로불린분자의부분이다. V L : 라이트체인의가변도메인. V H : 헤비체인의가변도메인. 벡터 : 세포에서자가복제가가능하고 DNA 단편, 예를들어유전자또는폴리뉴클레오타이드가부착단편의복제를유발하도록작동가능하게연결될수있는 rdna 분자. 하나이상의폴리펩타이드를코딩하는유전자의발현을지시할수있는벡터는여기에서 " 발현벡터 " 로서언급된다. 특히중요한벡터들은역전사효소를이용하여생산된 mrnas 로부터의 cdna( 상보적인 DNA) 의클리닝을가능하게한다. 설명 상기기재된것처럼, 본발명은결합원, 특히스트렙토코커스뉴모니에단백질, 더욱특이하게는뉴몰리신을특이적으로인식하고결합할수있는항체또는그들의단편에대한것이다. 본발명에따른결합원은특히스트렙토코커스뉴모니애에의해발병되는질병의치료에특히유용하고, 뿐만아니라진단방법및박테리아측정을위한키트에서도사용될수있다. 뉴몰리신은바람직하게는도 2 에서보여진아미노산서열을갖는폴리펩타이드이다 ( 서열번호 11). 그러므로, 본발명에따른결합원은바람직하게는면역학적으로활성화되어야만하고, 예를들어항체로서, 이를테면항원에결합할수있고면역활성화된 (immunoactive) 세포에그항원을제시할수있어서상기항원의식균작용을용이하게할수있다. 특히, 결합원은항체, 이를테면당업계에서알려진임의의적절한항체로서, 특히여기에서정의된항체는항체또는항체의면역학적으로활성화단편또는단일사슬항체이다. 항체분자들은통상적으로 Y- 형태의분자로서그기본유닛은네개의폴리펩타이드, 두개의동일한헤비체인과두개의동일한라이트체인으로구성되고, 이들은이황화결합에의해서로공유적으로연결되어있다. 이들체인의각각은분리된도메인으로포개어져있다. 헤비체인과라이트체인모두의 C- 말단부위는서열에있어보존되어있고, 이것은 C- 도메인으로서, 불변부위로불리워진다. V- 도메인으로알려진 N- 말단부위는서열이가변적이어서항체특이성을결정한다. 항체는그들의 V- 도메인에위치한 6 개의짧은상보성 - 결정부위를통해주로항원을특이적으로인식하고결합한다 ( 도 1 참조 ). 본발명에따른항체들은뉴몰리신에대한강한친화도를가지고있기때문에특별히유용하다. 따라서, 본발명에따른결합원은뉴몰리신에대해분리상수 Kd를 M 미만으로가지는결합도메인을갖는다. 더욱바람직하게, 뉴몰리신에대한분리상수 Kd는 M 미만이고, 더욱바람직하게는 M 미만이고, 더욱바람직하게는 M 미만이고, 더욱바람직학는 M 미만이고, 더욱바람직하게는 M 미만이고, 더욱바람직하게는 M 미만이다. 뉴몰리신에대한결합원의친화도는바람직하게는실시예 4에기재된것처럼측정하는것이바람직하다

15 결합원은상기에서정의된것처럼분리된결합원이바람직하고, 더욱바람직하게는분리된, 순수결합원이다. 항 - 용혈활성 항용혈활성을갖는결합원은특히스트렙토코커스뉴모니애에의해유발된질병의치료에적절한것으로고려된다. 이론에결부되지않아도, 항 - 용혈적결합원의뉴몰리신에대한결합은뉴몰리신의표적세포의멤브레인에의부착을방해하는것으로믿어진다. 시험관내 (In vitro) 기능적분석은실험예 2 및 3 에기재된것처럼수행되는것이바람직하다. 본발명에따른결합원은실시예 3 에서기재된것과같은분석에있어서 4000 ng/ml 의농도에서적어도 50% 로용혈을억제할수있다. 더욱바람직하게결합원은실시예 3 에서기재된것과같은분석에있어서 4000 ng/ml 의농도에서적어도 60%, 이를테면 80, 이를테면 85, 가장바람직하게는 90% 의용혈을억제한다. 본발멸에따른가장바람직한결합원은실시예 3 에서기재된것과같은분석에있어서 160 ng/ml 의농도에서적어도 50% 의용혈을억제할수있다. 더욱바람직하게, 결합원은실시예 3 에서기재된것과같은분석에있어서 160 ng/ml 의농도에서적어도 60%, 이를테면 80, 이를테면 85, 가장바람직하게는 90% 의용혈을억제한다. 상보성 - 결정부위 이론을결부시키지않아도, 고결합강도및 / 또는항 - 용혈활성은하기에서보여지는서열의하나이상의다음모티브를갖는결합도메인아미노산서열으로통합시킴으로써유발되는것으로믿어진다. 구체예엥서, 결합도메인은다음군에서선택된적어도하나의아미노산서열세트를포함한다 : - 아미노산서열세트서열번호 5 또는그들의상동체 (homologue), 서열번호 6 또는그것의상동체, 및서열번호 7 또는그것의상동체, 또는 - 아미노산서열세트서열번호 14 또는그것의상동체, 서열번호 15 또는그것의상동체, 및서열번호 16 또는그것의상동체, 또는 바람직하게, 결합원은다음군에서선택되는적어도하나의아미노산서열세트를포함한다 : - 아미노산서열세트서열번호 8 또는그것의상동체, 서열번호 9 또는그것의상동체, 및서열번호 10 또는그것의상동체. - 아미노산서열세트서열번호 17 또는그것의상동체, 서열번호 18 또는그것의상동체, 및서열번호 10. 상기아미노산서열세트에있어서, 아미노산서열은바람직하게는 CDR1, CDR2 및 CDR3 로서결합도메인에서, 즉, 다른아미노산서열에의해떨어지게배열된다. 더욱바람직하게, 결합도메인은서열번호 5 와서열번호 8 또는그들의ㅅ상동체로부터선택된서열을포함하는 CDR1 부위를포함하고 / 포함하거나결합도메인은서열번호 6 및서열번호 9 또는그들의상동체로부터선택되는서열을포함하는 CDR2 부위를포함하고 / 포함하거나결합도메인은서열번호 7 및서열번호 10 또는그들의상동체로부터선택된서열을포함하는 CDR3 부위를포함한다. 부가적으로, 결합도메인은바람직하게서열번호 14 와서열번호 17 또는그들의ㅅ상동체로부터선택된서열을포함하는 CDR1 부위를포함하고 / 포함하거나결합도메인은서열번호 15 및서열번호 18 또는그들의상동체로부터선택되는서열을포함하는 CDR2 부위를포함하고 / 포함하거나결합도메인은서열번호 16 및서열번호 10 또는그들의상동체로부터선택된서열을포함하는 CDR3 부위를포함한다. 여기에기재된출원인의발견은가변적인헤비체인의서열이용혈활성에중요한것임을암시한다. 그러므로바람직한구체예는다음군에서선택되는하나이상의서열을포함하는결합도메인을포함한다 ; 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 17, 서열번호 18 및서열번호 10 또는그들의상동체. 특히바람직하게는서열번호 9 또는서열번호 18 또는그들의상동체를포함하는결합도메인이다. 가장바람직하게는서열번호 10 또는그들의상동체를포함하는결합도메인이다

16 그러므로, 결합도메인의가변부분은서열번호 3 및서열번호 4 또는그들의상동체로부터선택되는서열을포함하는것이특히바람직하고, 여기에서상동체는여기의다른곳에서정의된것과같다. 부가적으로, 결합도메인의가별부분은서열번호 12 및서열번호 13 또는그들의상동체로부터선택되는서열을포함하는것이바람직하고, 상동체는여기다른곳에서정의된것과같다. 바람직한특정구체예에서, 결합도메인의가변라이트체인은서열번호 3 및서열번호 12 로부터선택되는서열을포함하거나 / 포함하고더욱바람직하게결합도메인의가변헤비체인은서열번호 4 및서열번호 13 으로부터선택되는서열을포함한다. 여기기재된상동체들중임의의하나의상동성은상기정의된것처럼뉴몰리신에대한분리상수 Kd 를갖는하나이상의상동체를포함하는결합도메인을부여한다. 동일성및상동성 " 동일성 (Identity)" 용어는서열을정렬시키고갭을도입한후에, 후보서열들중에서그것과비교되는상동서열의잔기와동일한아미노산잔기의퍼센트를의미하는것으로해석될것으로서, 만약전체서열에대한최대퍼센트동일성을성취하는것이필요하다면, 서열동일성의부분으로서임의의보존적인치환은고려되지않는다. N- 또는 C- 말단신장또는삽입어느것도동일성또는상동성을감소시키는것으로해석될수없을것이다. 배열을위한방법및컴퓨터프로그램은당업계에잘알려져있다. 서열동일성은서열분석소프트웨어 ( 예, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, Wis ) 을이용하여측정될수있다. 이소프트웨어는상동성의정도를다양한치환, 삽입및다른변형에지정함으로써유사한서열을매치시킨다. 여기에서특정된하나이상의서열의상동체는정의된서열에비교하여하나이상의아미노산에있어서다양할것이나, 동일한기능을수행할수있고, 즉, 상동체가미리결정된서열의기능적인등가물로서관찰될것이다. 상기기재된것처럼, 여기에서미리결정된서열의임의의상동체는다음으로정의될수있다 : i) 미리결정된아미노산에의해인식될수있는항원을인식할수있는아미노산을포함하는상동체, 및 / 또는 ii) 항원에선택적으로결합할수있는아미노산서열을포함하는상동체로서, 여기에서상기항원은또는미리 - 결정된서열에의해선택적으로결합될수있는것이고, 및 / 또는 iii) 미리결정된서열, 이를테면서열번호 3, 4, 12 및 13 을포함하는결합도메인으로서뉴몰리신에대한실질적으로유사한또는더높은결합친화도를갖는상동체. 상동체의예는미리결정된아미노산의동일한군내에서하나이상의보존적인아미노산치환을포함하는하나이상의보존적인아미노산치환을포함하거나, 또는다수의보존적인아미노산치환을포함하고, 여기에서각보존적인치환은미리결정된아미노산의다른군내의치환에의해생성된다. 그러므로상동체는다른것과독립적으로보존적치환을포함하고, 여기에서상기상동체의적어도하나의글라이신 (Gly) 은 Ala, Val, Leu, 및 Ile 으로구성되는아미노산군으로부터선택되는아미노산으로치환되고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기그것의상동체의적어도하나의알라닌 (Ala) 은 Gly, Val, Leu, 및 Ile 으로구성된아미노산군에서선택되는아미노산으로치환되고, 그것과독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기상동체의적어도하나의발린 (Val) 은 Gly, Ala, Leu, 및 Ile 으로구성된아미노산군으로부터선택되는아미노산으로치환외고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기상동체의적어도하나의루이신 (Leu) 은 Gly, Ala, Val, 및 Ile 으로구성되는아미노산의군에서선택되는아미노산으로치환되고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기상동체의적어도하나의이소루이신 (Ile) 은 Gly, Ala, Val 및 Leu 으로구성되는아미노산군에서선택되는아미노산으로치환되고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기상동체의적어도하나의아스파르트산 (Asp) 은 Glu, Asn, 및 Gln 으로구성되는아미노산군으로부터선택되는아미노산으로치환되고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기상동체의적어도하나의페닐알라닌 (Phe) 은 Tyr, Trp, His, Pro 으로구성되는아미노산군으로부터선택되는아미노산, 바람직하게는 Tyr 및 Trp 으로구성되는아미노산군으로부터선택되는아미노산으로치환되고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기상동체의

17 적어도하나의상기티로신 (Tyr) 은 Phe, Trp, His, Pro 으로구성된아미노산군으로부터선택되는아미노산, 바람직하게 Phe 및 Trp 으로구성된아미노산군으로부터선택되는아미노산으로치환되고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기단편의적어도하나의상기아르기닌 (Arg) 은 Lys 및 His 으로구성된아미노산군으로부터선택되는아미노산으로치환되고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기그것의상동체의적어도하나의라이신 (Lys) 은 Arg 및 His 으로구성된아미노산군으로부터선택되는아미노산으로치환되고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기그것의상동체의적어도하나의상기아스파라긴 (Asn) 은 Asp, Glu, 및 Gln 으로구성된아미노산군에서선택되는아미노산으로치환되고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기그것의상동체의적어도하나의글루타민 (Gln) 은 Asp, Glu, 및 Asn 으로구성되는아미노산군에서선택되는아미노산으로치환되고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기그것의상동체의적어도하나의프롤린 (Pro) 은 Phe, Tyr, Trp, 및 His 으로구성되는아미노산군에서선택되는아미노산으로치환되고, 그것에독립적으로, 그것의상동체, 여기에서상기그것의상동체의적어도하나의시스테인 (Cys) 은 Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn, Gln, Ser, Thr, 및 Tyr 으로구성되는아미노산군에서선택되는아미노산으로치환된다. 보존적치환은바람직하게미리결정된서열의임의의위치에도입될수있다. 그러나비 - 보전적치환을도입, 특히, 여기에제한되지않지만, 하나이상의임의의위치에비 - 보존적치환을도입하는것이바람직하다. 여기에서서열의기능적으로동등한상동체의형성을이끄는비 - 보존적치환은예를들어 i) 실질적으로극성에있어서다르고, 예를들어 Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, 또는 Gln 과같은극성부사슬을갖는잔기, 또는 Asp, Glu, Arg, 또는 Lys 과같은전하를띄는아미노산을가진잔기, 또는비 - 극성아미노산이전하를띄거나극성잔기로치환된것인잔기가비 - 극성부사슬 (Ala, Leu, Pro, Trp, Val, Ile, Leu, Phe 또는 Met) 로치환된잔기 ; 및 / 또는 ii) Pro 또는 Gly 의치환또는 Pro 또는 Gly 의다른잔기에의한치환과같은폴리펩타이드골격오리엔테이션에대한그것의효과에있어서실질적으로다르고 ; 및 / 또는 iii) 실질적으로전기적전하에있어서다르고, 예를들어, Lys, His 또는 Arg 과같이양전하를띄는잔기가 Glu 또는 Asp 와같이음전하를띄는잔기로의치환 ( 또는그역의경우 ); 및 / 또는 iv) 실질적으로입체부피에있어서다른데, 예를들어음성부사슬, 예를들어 Ala, Gly 또는 Ser 을갖는잔기를 His, Trp, Phe 또는 Tyr 와같은거대한잔기로의치환이있다. 아미노산의치환은하나의구체예에서그들의소수성및친수성수치와전하, 크기등을포함하는아미노산부 - 사슬치환체의상대적인유사성에기초하여만들어진다. 상기다양한특징들을고려한대표적인아미노산치환체는당업자에게잘알려져있으며, 다음을포함한다 : 아르기닌과라이신 : 글루타민산염 (glutamate) 과아스파레이트 ; 세린과트레오닌 ; 글루타민과아스파라긴 ; 및발린, 루이신및이소루이신. 하나의구체예에서, 결합도메인은서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17 및 18 로부터선택되는서열과적어도 60% 동일성을갖는아미노산서열을갖는상동체를포함한다. 바람직한구체예에서, 결합도메인은서열번호 3, 4 12 및 13 으로부터선택되는서열과적어도 60% 동일성을갖는아미노산서열을가지는상동체를포함한다. 더욱바람직하게상동체는서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17 및 18, 또는바람직하게서열번호 3, 4 12 및 13 으로부터선택되는서열과적어도 65%, 이를테면적어도 70% 동일성, 이를테면적어도 75% 동일성, 이를테면적어도 80% 동일성, 이를테면적어도 85% 동일성, 이를테면적어도 90% 동일성, 이를테면적어도 95% 동일성, 이를테면적어도 98% 동일성을갖는것이다. 더욱바람직한구체예에서, 상기언급한퍼센트는서열번호 3, 4 12 및 13 으로부터선택된서열과비교하여상동체서열의동일성과관련된다. 에피토프 (Epitopes) 본발명에따른항 - 용혈결합원은서열번호 3, 4, 12 또는 13 의군에서선택되는서열을포함하는가변부분을갖는항체에의해인식되는에피토프를인식하고결합한다. 하나의구체예에서, 항 - 용혈결합원의결합도메인은뉴몰리신의 N- 말단부분에있는에피토프를인식한다. 바람직하게는서열번호 11 에의해동정된뉴몰리신의아미노산 에대응하는 N- 말단부분내인것이다. 결합도메인에의해인

18 식되는에피토프는서열번호 11 에의해동정된뉴몰리신의아미노산 , 또는바람직하게는아미노산 이더욱바람직하다. 특정구체예에있어서, 결합원에의해인식되는에피토프는서열번호 11 에의해동정된뉴몰리신의아미노산 또는 이내인것이다. 본발명의결합원의결합도메인은서열번호 27 에의해동정된아미노산서열에의해포함되는에피토프를인식한다. 바람직한구체예에서, 결합도메인은서열번호 28, 29, 30 및 31 에의해포함되는에피토프, 더욱바람직하게는서열번호 29 와 30 에의해포함되는에피토프를인식한다. 결합도메인에의해인식되는에피토프는서열번호 11 에의해동정되는뉴몰리신의아미노산 , 바람직하게는아미노산 이내이다. 특정구체예에있어서, 결합원에의해인식되는에피토프는서열번호 11 에의해동정된뉴몰리신의아미노산 또는 이내이다. 혈청형 (Serotypes) 상기에서설명한것처럼, 스트렙토코커스뉴모니애의 90 여가지의다른혈청형이동정되었다. 본발명에따른결합원은두개이상의다른뉴모코커스혈청형, 이를테면세개이상의다른뉴모코커스혈청형, 이를테면네개이상의뉴모코커스혈청형, 이를테면다섯개이상의뉴모코커스혈청형으로부터의뉴몰리신에결합할수있다. 가장바람직하게, 본발명에따른결합원은필수적으로모든혈청형으로부터의뉴모코커스를인식하고결합할수있다. 모노클로날 / 폴리클로날항체 (Monoclonal/polyclonal antibodies) 본발명의하나의구체예에서, 결합원은항체이고, 여기에서그항체는포유동물로부터유래된폴리클로날또는모노클로날항체또는모노클로날항체의혼합물이다. 바람직한구체예에서, 결합원은모노클로날항체또는그들의단편이다. 항체는임의의종류의항체이다 ; 그러나 IgG 항체가바람직하다. 더욱바람직하게항체는 IgG1 항체또는그들의단편이다. 모노클로날항체 (Mab s) 는항체이며, 여기에서모든항체분자가유사하여, 동일한에피토프를인식한다. 모노클로날항체는일반적으로하이브리도마세포주에의해생산된다. 모노클로날항체및항체 - 합성하이브리도마세포를제조하는방법은당업자에게잘알려져있다. 항체 - 생산하이브리도마는예를들어항체 - 생산 B 림프구와불사화세포주 (immortalized cell line) 의융합에의해생산될수있다. 모노클로날항체는다음단계에의해생산될수있다. 모든과정에있어서, 동물은폴리클로날항체의생산을위해상기에서기재된것과같은항원, 이를테면단백질 ( 또는그것의펩타이드 ) 로면역화된다. 면역화는통상적으로면역학적으로유능한포유동물에게면역원을면역학적유효량으로, 즉, 면역반응을생산하는데충분한양을투여함으로써성취된다. 바람직하게, 포유동물은설취동물, 이를테면토끼, 쥐또는생쥐이다. 포유동물은기재된것처럼고친화도의항체분자를생성하기에충분한기간동안부스터스케쥴로사육된다. 항체 - 생산세포의현탁액은목적항체를분비하는면역화된각각의포유동물로부터제거된다. 고친화도의항체를생성하기에충분한시간이후에, 동물 ( 예, 생쥐 ) 를죽이고항체 - 생산임파구를림프절, 비장및말초혈액중하나이상으로부터수득한다. 비장세포가바람직하고, 당업자에게잘알려진방법을이용하여생리적배지에서개별세포들을기계적으로분리할수있다. 항체 - 생산세포는생쥐골수종라인의세포와융합시켜불사화시킨다. 생쥐임파구는생쥐의상동골수종과안정하게융합할수있게해준다. 그러나쥐, 토끼및개구리의체세포세포는사용될수있다. 목적항체 - 생산동물의비장세포는골수종세포와융합시킴으로써불사화시키고, 일반적으로융합제, 이를테면폴리에틸렌글리콜의존재하에서융합시킨다. 융합파트너로서안정한수많은골수종세포주의어느것이라도표준기술로이용되고, 예를들어 ATCC(American Type Culture Collection), Rockville, Md 로부터입수가능한 P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종라인이있다. 모노클로날항체는또한당업자에게잘알려진재조합 DNA 기술에의해생성될수있다. " 조합항체디스플레이 (combinatorial antibody display)" 방법으로언급되는부가적인방법이특정항원특이성을갖는항체단편을동정하고분리하는데기여하였으며, 모노클로날항체를생산하는데이용될수있다. 폴리클로날항체는특정한일정항원을인식할수있는항체분자의혼합물이고, 그러므로폴리클로날항체는상기항원내의다른에피토프를인식할수있다. 일반적으로폴리클로날항체는포유동물의혈청에서정제되고, 그전에항원으로면역화된다. 폴리클로날항체는예를들어항체에서언급된임의의방법에의해생산될수있다 (A Labora-tory Manual, By Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). 폴리클로날항체는임의의적절한포유동물종, 이를테면생쥐, 쥐, 토끼, 원숭이, 염소및양으로부터유래된다

19 특이성 (Specificity) 결합원은뉴몰리신에대한단일특이적이며, 여기에서뉴몰리신에대한특이성은결합원이뉴몰리신과면역반응을한다는것을의미한다. 다른구체예에서, 결합원은뉴몰리신에대해적어도하나의특이적부분을갖는이중특이적또는다중특이적이다. 단가항체 (Monovalent antibodies) 단일특이적결합원은단가일것이고, 즉, 하나의결합도메인만을가지고있을것이다. 단가항체의경우, 면역글로불린불변도메인아미노산잔기서열은당업계에서 CH1, CH2, CH3 및 CH4 로알려진항체분자의구조적부분을포함한다. 바람직하게는당업계에서 C L 로알려진결합원이다. 바람직한 C L 폴리펩타이드는 C κ 및 C λ 로구성된군에서선택된다. 게다가, 불변도메인이헤비또는라이트체인불변도메인 ( 각각, C H 또는 C L ) 이될수있는한, 단가결합원조성물의다양 성은본발명에의한것으로해석된다. 예를들어, 라이트체인불변도메인은다른라이트체인불변도메인과, 또는헤비체인의불변도메인과이황화결합을형성할수있다. 반대로, 헤비체인불변도메인은두개의독립적인이황화브릿지를형성할수있어다른헤비체인과라이트체인모두와연결될수있도록하거나헤비체인의폴리머를형성할수있다. 그러므로, 다른구체예에서, 본발명은단가폴리펩타이드를포함하는조성물을고려하는데, 여기에서불변체인도메인 C 는적어도하나의이황화다리를형성할수있는시스테인잔기를가지고있고, 여기에서그조성물은상기이황화다리에의해공유적으로연결된적어도두개의단가폴리펩타이드를포함한다. 바람직한구체예에서, 불변체인도메인 C 는 C L 또는 C H 일수있다. C 가 C L 일때, CL 폴리펩타이드는바람직하게 C κ 와 C λ 로구성되는군에서선택된다. 다른구체예에서, 본발명은상기에서처럼단가폴리펩타이드를포함하는결합원조성물을고려하는데, 여기에서 C 가이황화다리를형성할수있는시스테인잔기를갖는 C L 은제외되고, 그런조성물은상기이황화다리에의해공유적으로연 결된두개의단가폴리펩타이드를포함한다. 다가 (Multivalent) 본발명의또다른구체예에서, 결합원은적어도두개의결합도메인을갖는다가결합원이다. 결합도메인은동일한리간드또는다른리간드에대하여특이성을가질수있다. 이중특이성을포함한다중특이성 바람직한구체예에서, 본발명은다중특이적결합원대한것으로서, 적어도두개의다른존재에대한친화도를가지고결합할수있다. 다중특이적결합원은이중특이적결합원을포함할수있다. 하나의구체예에서, 다중특이적분자는이중특이적항체 (BsAb) 로서, 적어도두개의다른결합원, 적어도하나는항체기원의결합원을담지한다. 본발명의이중특이적분자는또한단일사슬이중특이적분자가될수있으며, 이를테면단일사슬이중특이적항체, 하나의단일사슬항체와결합도메인을포함하는단일사슬이중특이적분자, 또는두개의결합도메인을포함하는단일사슬이중특이적분자이다. 다중특이적분자는또한단일사슬분자가될수있거나적어도두개의단일사슬분자를포함할수있다. 이중특이적을포함하는다중특이적항체는당업자에게잘알려진적절한임의의방법에의해생산될수있다

20 이중특이적전체항체를생성시키는전통적인접근은목적특이성을갖는항체를각각생산하는두개의하이브리도마세포주를융합시키는것이었다. 면역글로불린헤비및라이트체인의임의적연합때문에, 이들혼성하이브리도마는최고 10 개의다른헤비및라이트체인조합의혼합물을생산하고, 이중오직하나만이이중특이적항체이다. 그러므로, 이들이중특이적항체는정교한과정으로정제되어야만하고, 그로인하여목적생산물의수율이감소될수도있다. 대안적인접근은경첩에서또는상기에서기재된것처럼일반적으로유도된 C- 말단 Cys 을통해서시스테인잔기의화학적교차 - 연결에의해두개의항원특이성을시험관내 (in vitro) 연결을포함한다. 그럼시험관내연합의향상은 Fab's 를헤테로다이머의형성을촉진시키는펩타이드와의재조합융합을이용함으로써성취되었다. 그러나, 이방법에있어서의이중특이적생산물의수율이 100% 보다훨씬미만이었다. 시험관내화학적연합단계를포함시키지않고, 이가또는이중특이적항체단편을생산하기위한좀더효율적인접근은홀리거등 (Holliger et al., 1993) 에의해설명되었다. 이접근은박테리아로부터분리된 scfv's 가종종모노머와다이머모두로서존재함을관찰하는이점을갖는다. 이관찰은다른사슬의 V H 와 V L 이쌍을이룰수있어, 다이머와좀더큰복합 체를형성할수있음을암시하였다. 홀링거등에의해 " 디아바디 (diabodies)" 로이름지어진다이머항체단편은사실생체내 (in vivo) 에서연합되는작은이가항체단편이다. " 교차 (crossover)" 사슬 V H 1-V L 2 와 V H 2-V L 1 을형성하기위한두 개의다른항체 1 및 2 의 V H 와 V L 연결에의해이량체화 (dimerisation) 과정이양항체 - 결합부위를재연합에서보여졌 다. 두개의결합부위의친화도는출발 scfv's 와동일한것을보여졌고, 또는 V H 와 V L 의공유적으로연결시키는폴리펩 타이드링커가제거되었을때 10 배증가된것으로보여졌고, 그러므로 V H 와쌍을이룬것이아닌, 직접적으로, 공유적으로 V L 에연결된 V H 로각각구성된두개의단백질을생성시킨다. 이중특이적항체단편을생산하는이런전략은또한몇몇 특허출원에도기재되었었다. 특허출원 WO 94/09131(SCOTGEN LTD; priority date Oct. 15, 1992) 은이중특이적결합단백질로서, 그결합도메인이두개의사슬에서존재하거나 scfv 에서연결되는 V H 와 V L 부위모두로부터유래된것이며, 반면에다른융합된항체도메인, 예를들어 C- 말단불변도메인이다이머구조를안정화시키기위해사용되었다. 특허출원 94/13804 (CAM-BRIDGE ANTIBODY TECHNOLOGY/MEDICAL RESEARCH COUNCIL; first priority date Dec. 4, 1992) 은서로서로연합할수없는 V H 와 V L 을포함하는폴리펩타이드에대한것으로서, 그것에의해 V- 도메인은링커 로, 또는링커없이연결될수있다. 말렌더및보스 (Mallender and Voss, 1994, ( 또한특허출원 WO 94/13806 에서도기재됨 ; DOW CHEMICAL CO; priority date Dec. 11, 1992)) 은 E. coli 에서의단일 - 사슬이중특잊거항체의생체내생산을보고하였다. 이가단백질의이중특이성은구별되는특이성을갖고있고, 유연한폴리펩타이드링커에의해유전적수준에서서로연결되는두개의미리생산된단가 scfv 분자에기초하였다. 통상적으로, 단일 - 사슬항체단편이언급될때는언제나, 폴리펩타이드링커가존재하거나부재일때하나의 ( 대응되는 ) 라이트체인에연결된하나의헤비체인으로구성되는단일분자가관련된다. " 디아바디 " 접근 (Holliger et al., (1993) 및특허출원 WO 94/09131) 을통해또는 " 이중 scfv" 접근 Mallender and Voss, 1994 및특허출원 WO 94/13806) 에의해이가또는이중특이적항체단편을제조할때, 다시 V H 가 ( 대응하는 ) V L 에연결 된다. 상기에서기재된다중특이적분자는수많은방법에의해제조될수있다. 예를들어, 모든특이성은동일한벡터에서코딩되거나동일한숙주세포에서발현및조합될수있다. 다중 - 특이적분자가 mab mab, mab Fab, Fab F(ab') 2 또 는리간드 Fab 융합단백질일경우에, 이방법이특히유용하다. 이가또는다가항체를제조하는다양한방법들이예를들어, 미국특허번호 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; 및 5,482,858 에기재되어있다. 본발명에따른이중특이적또는다중특이적결합원을이용함으로써본발명은단일특이적 / 단가결합원과비교하여몇몇잇점을제공한다. 이중특이적 / 다중특이적결합원은스트렙토코커스단백질, 특히뉴몰리신을특이적으로인식하고결합할수있는첫번째결합도메인을가지고, 여기에서다른결합도메인 ( 들 ) 은다른목적으로이용될수있다 : 하나의구체예에서, 적어도하나의다른결합도메인은스트렙토코커스단백질에결합하기위해이용되고, 이를테면첫번째결합도메인과비교하여동일한스트렙토코커스단백질상의다른에피토프에결합하는데이용된다. 그것에의해스트렙토코커스종에대한특이성이증가될뿐만아니라결합원의항원항체결합력 (avidity) 이증가될수있다

21 다른구체예에서, 적어도하나의다른결합도메인은포유동물세포, 이를테면인간세포에특이적으로결합하기위해이용될수있다. 적어도다른결합도메인은치료방법에있어서결합원의효과를증가시키기위하여, 면역활성화된세포, 이를테면백혈구, 대식세포, 임파구, 호염기세포 (basophilic cell), 및 / 또는호산세포 (eosinophilic cell) 에결합할수있다. 이는적어도하나의다른결합도메인이포유동물의단백질, 이를테면인간단백질, 이를테면임의의클러스터분화단백질 (cluster differentiation protein, CD), 특히 CD64 및 / 또는 CD89 로부터선택되는단백질에특이적으로결합할수있는것을확립함으로써성취될수있다. CD64 특이성을갖는이중특이적항체를생산하는방법은 Medarex, Inc. 의 US 6,071,517 에기재되어있다. 여기에서사용된 " 작용세포 (effector cell)" 는백혈구또는임파구인면역세포를의미한다. 특정작용세포는특정 Fc 수용체를발현하고특정면역기능을수행한다. 예를들어, 단핵세포 (monocyte), 대식세포 (macrophages), 중성구 (neutrophils), 호산구 (eosinophils) 및 CD89 수용체를발현하는임파구는표적세포의특이적죽임, 항원을면역계의다른구성성분에제시하거나항원을제시하는세포에결합하는데관련한다. 인간화항체프레임워크 (Humanised antibody framework) 비 - 인간 " 외래 " 에피토프는치료받는개체에서면역반응을도출할수있기때문에, 인간을치료함에비 - 인간항체를사용하는것이항상바람직한것은아니다. 비 - 인간항체와관련된문제를제거하거나최소하기위하여, 키메라항체유도체, 즉, 결정소를결합하는비 - 인간 Fab 가변부위가인간불변부위 (Fc) 와결합되는 " 인간화 " 항체분자를설계하는것이바람직하다. 그런항체들은상기기재된모노클로날및폴리클로날항체의균등한항원특이성과친화도를특징으로가지고, 인간에게투여되었을때덜면역원성이어서, 치료받는개체에의해더관용적이된다. 따라서, 하나의구체예에서결합원은인간화항체라불리우는인간화항체프레임워크를수행하는결합도메인을갖는다. 인간화항체는일반적인키메라항체에서인간항체로부터유래된부위및비 - 인간항체로부터유래된부위, 이를테면설치동물의항체로부터유래된부위를포함하고있다. 인간화 ( 또한 Reshaping 또는 CDR-grafting 으로불리워진다 ) 는이종소스 ( 보통설치동물 ) 로부터의모노클로날항체 (mabs) 의면역성을감소시키고, 인간면역글로불린과의상동성을증가시키고, 인간면역계의활성화를개선시키는기술로서잘확립되어있다. 그러므로, 인간화항체는통상적으로인간항체로서, 몇몇 CDR 잔기및가능하게몇몇프레임워크잔기들이설치동물항체에서유사한부위로부터의잔기에의해치환된다. 인간화항체는항체및다른우세한생물학적성질에대한높은친화도를보유하고있다는것이더중요하다. 이목표를성취하기위하여, 바람직한방법에따라, 인간화항체는모서열 (parental sequence) 과인간화서열의삼차원모델을이용하여모서열과다양한개념적인간화생산물의분석과정에의해제조된다. 삼차원면역글로불린모델은보통입수가능하고당업자가에게는친숙한것이다. 컴퓨터프로그램은선택된후보면역글로불린서열의예상삼차원배열구조를그리고도시하는것이가능하다. 이디스플레이를관찰하는것으로인하여후보면역글로불린서열의작용에있어서확실한잔기의역할분석이가능하고, 즉그것의항원에결합하는후보면역글로불린의능력에영향을주는잔기의분석이가능하게한다. 이런방법으로, FR 잔기들이선택될수있고수혜자와수입 (import) 서열로결합될수있어, 비록그것이항원결합에직접적으로그리고가장실질적으로영향을미치는 CDR 잔기이긴하지만, 목적항체의특징, 이를테면표적항원 ( 들 ) 에대한증가된친화도가최대화가된다. 하나의항체의완전한가변도메인을포함하는항원결합부위가있는키메라항체를생산하는것과관련된인간화 MAbs 를위한하나의방법은두번째항체로부터유래된불변도메인, 바람직하게인간항체에융합시키는것이다. 그런키메라화과정을수행하는방법은예를들어유럽특허 EP-A (Celltech Limited), EP-A (Genen-tech Inc.), EP-A (Res. Dev. Corp. Japan), EP-A (Stanford Uni-versity) 및 EP-A (Celltech Limited) 에기재되어있다. 항체인간화의좀더복잡한형태는가변부위도메인을재 - 디자인하는것과관련있어비 - 인간항체결합부위를구성하는아미노산이인간항체가변부위의프레임워크로통합된다 (Jones et al., 1986). 본발명의인간화항체는인간항체의 CDR 의임의의부위를비 - 인간항체로부터유래된 CDR 로치환시킬수있는임의의방법에의해제조될수있다. 윈터 (Winter) 는본발명의인간화항체제조에이용될수있는방법을설명하고있고 ( 영국특허출원번호 GB A, 출원일 1987 년 3 월 26 일 ), 이는참고자료로서특별히통합되어있다. 인간 CDRs 는하기실시예에서기재된것처럼올리고뉴클레오타이드자리 - 지정돌연변이유발 (site-directed mutagenesis) 을이용하여비 - 인간 CDRs 로치환시킬수있다

22 실시예에서처럼, 본발명의인간화항체는하기간단한설명에서기재된것과같은방법에의해제조될수있다. 본발명의인간화항체는다음공정에의해제조될수있다 : (a) 통상적인기술에의해 CDRs 과항체결합특이성을보유하는데필요한가변도메인프레임워크부위의최소부분이비 - 인간면역글로불린으로부터유래된것을갖는항체헤비체인을코딩하는 DNA 서열을갖는오페론을포함하는발현벡터를작제하고, 항체체인의잔여부분은인간면역글로불린으로부터유래된것이며, 그것에의해본발명의벡터를생산하고 ; (b) 통상적인기술에의해, CDRs 와수여자의항체결합특이성을보유하는데필요되는가변도메인프레임워크부위의최소부분이비 - 인간면역글로불린으로부터유래된것을갖는상보적인항체라이트체인을코딩하는 DNA 서열을갖는오페론을포함하는발현벡터를작제하고, 항체체인의잔여부분은인간면역글로부터유래도니것이고, 그것에의해본발명의벡터를생산하고 ; (c) 통상적인기술에의해그발현벡터들을숙주세포로트랜스펙트시켜본발명의트랜스펙트된숙주세포를생산하고 ; 및 (d) 통상적인기술에의해그트랜스펙트된세포를배양하여본발명의인간화항체를생산한다. 숙주세포는본발명의두개의벡터, 라이트체인유래폴리펩타이드를코딩하는오페론을포함하는첫번째벡터와헤비체인유래폴리펩타이드를코딩하는오페론을포함하는두번째벡터들로공동트랜스펙트될수있다. 두개의벡터는다른선별마커를포함하고, 그러나만약그렇지않으면, 항체헤비와라이트체인코딩서열로분리되고, 가능한한헤비와라이트체인폴리펩타이드의동일한발현을하게한다. 부가적으로, 라이트및헤비체인폴리펩타이드모두를코딩하는서열을포함하는벡터인단일벡터가이용될수있다. 라이트및헤비체인을위한코딩서열은 cdna 또는게놈 DNA 또는양자모두를포함할수있다. 본발명의변형된항체를발현시키기위해사용되는숙주세포는박테리아세포, 이를테면 E.coli, 또는진핵생물세포가될수있다. 특히본목적에잘맞는포유동물세포, 이를테면골수종세포 (myeloma cell) 또는중국햄스터난소세포가사용될수있다. 본발명의벡터들을작제하는일반적인방법들, 본발명의숙주세포를생산하는데필요한트래스펙션방법들및숙주세포로부터본발명의항체를생산하는데요구되는배양방법들은모두통상적인기술이다. 또한, 한번생산되면, 본발명의인간화항체는하기기재된표준과정에따라정제될수있다. 인간항체프레임워크 (Human antibody framework) 좀더바람직한구체예에서, 본발명은결합원에대한것으로, 여기에서결합원은인간항체프레임워크에의해수행된다. 즉, 여기에서항체는인간화항체보다더인간펩타이드서열의좀더큰정도를갖는다. 인간단백질에대한직접적인인간 mab 항체는쥐면역계보다완전한인간면역계를수반하는트랜스제닉마우스를이용하여생산될수있다. 목적항원으로면역화된이들트랜스제닉마우스로부터의스플레노사이트 (Splenocyte) 는인간단백질로부터의에피토프를위한특이적친화도를갖는인간 mabs 를분비하는하이브리도마를생산하는데이용된다 (see, e.g., Wood et al. International Application WO 91/00906, Kucherlapati et al. PCT publication WO 91/10741; Lonberg et al. International Application WO 92/03918; Kay et al. International Application 92/03917; Lonberg, N. et al Nature 368: ; Green, L. L. et al Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S. L. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: ; Bruggeman et al Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al PNAS 90: ; Bruggeman et al Eur J Immunol 21: ). 그런트랜스제닉마우스는 Abgenix, Inc., Fremont, Calif., 및 Medarex, Inc., Annandale, N.J 으로부터입수할수있다. 키메라및생식 - 계열돌연변이마우스에있어서항체헤비 - 체인결합부위 (IH) 유전자의동종접합 (homozygous) 결실이내인성항체생산의완전한억제를초래한다. 그런생식 - 계열돌연변이마우스에있어서인간생식 - 계열면역글로불린유전자배열의이전이항원이있을때인간항체의생산을유발할것이다 (see, e.g., Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol

23 7:33 (1993); and Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Human antibodies can also be derived from phagedisplay libraries (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: (1991); Vaughan, et al., Nature Biotech 14:309 (1996)). 단편 (Fragments) 본발명의하나의구체예에서, 결합원은항체의단편이고, 바람직하게항원결합단편또는가변부위이다. 본발명에유용한대표적인항체단편은 Fab, Fab', F(ab') 2 및 Fv 단편을포함한다. 항체의파파인소화 (Papain digestion) 가 Fab 단편이 라불리우는, 각각단일항원결합부위를가지는두개의동일한항원결합단편과잔기 "Fc" 단편을생산하는데, 소위그것의결정화능력을위한것이다. 펩신처리가교차 - 연결항원이가능한두개의항원결합단편과나머지다른단편 (pfc' 로불리워짐 ) 을갖는 F(ab') 2 단편을생산한다. 추가적인단편은디아바디, 선형항체, 단 - 사슬항체분자및항체단편으로부 터형성된다중특이적항체를포함할수있다. 항체단편 Fab, Fv 및 scfv 은항체단편이오직단일항원 - 결합부위를담지한다는점에있어서전체항체와는다르다. 두개의결합부위를가진재조합단편들은여러가지방법으로제조되는데, 예를들어, Fv 의 V H 의 C- 말단 Cumber et al., 1992), 또는 scfv 의 V L 의 C- 말단에서 (Pack and Pluckthun, 1992), 또는 Fab's 의힌지시스테인잔기를통해 (Carter et al., 1992) 도입된시스테인잔기의화학적교차 - 연결에의해제조된다. 바람직한항체단편은그것의항원또는수용체에선택적으로결합하는항체의몇가지또는필수적으로모든능력을보유한다. 몇몇바람직한단편들은다음과같이정의된다 : (1) Fab 는항체분자의단가항원 - 결합단편을포함하는단편이다. Fab 단편은파파인효소로전체항체를완전한라이트체인과하나의헤비체인의부분으로소화시켜생산될수있다. (2)Fab 는항체분자의단편이며, 완전한라이트체인과헤비체인부분을수득하도록전체항체를펩신으로처리한후환원시켜수득될수있다. 두개의 Fab 단편은항체분자마다수득된다. Fab 단편은항체힌지부위로부터의한개이상의시스테인을포함하는헤비체인 CH1 도메인의카르복실말단에서의몇몇잔기의첨가에의해 Fab 단편과는구별된다. (3)(Fab ) 2 는연속적인환원없이펩신효소로전체항체를처리함으로써수득될수있다. (Fab ) 2 는두개의이황화결합에 의해서로연결된두개의 Fab' 단편의다이머이다. (4) Fv 는완전한항원인식및결합부위를포함하는최소항체단편이다. 이부위는하나의헤비및하나의라이트체인가변도메인이타이트하게, 비 - 공유적연합 (V H -V L 다이머 ) 으로구성되어있다. 이구성에있어서각가변도메인의세개의 CDRs 는 V H -V L 다이머의표면상에서항원결합부위를정하기위해상호작용한다. 총괄적으로, 6 개의 CDRs 는항체에항 원결합특이성을부여한다. 그러나, 비록전체결합부위에비해친화도낮더라도단일가변도메인조차도항원을인식하고결합한다. 본발명의하나의구체예에서, 항체는라이트체인의가변부위, 헤비체인의가변부위를포함하는일반적으로설계되는분자로정의되고, 유전학적으로융합된단일사슬분자로서적절한폴리펩타이드링커에의해연결된단일사슬항체 ("SCA") 이다. 그런단일사슬항체는또한 " 단일 - 사슬 Fv" 또는 "sfv" 항체단편으로서언급된다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 sfv 가항원결합을위한목적구조를형성하도록하는 V H 및 V L 도메인사이의폴리펩타이드링커를더포함한 다. 본발명에따른항체단편은당업자에게잘알려진적절한임의의방버에의해생산될수있다. 몇가지미생물발현계가활성항체단편을생산하기위해이미계발되었다. 예를들어, 다양한숙주, 이를테면 E. coli(better et al., 1988, Skerra and Pluckthun, 1988, Carter et al., 1992), 효모 (Horwitz et al., 1988), 및사상진균트리코데르마러세이 (Nyyssonen et al., 1993) 에서의 Fab 생산이기재되어있다. 이들대체적인시스템에서획득되는재조합단백질은상대적으로높거나 ( 고밀도세포발효에서의 E. coli 의원형질막주위공간으로분비되는 Fab 는 1-2 g/l 이다, Carter et al., 1992), 또는더낮은수준, 예를들어발효조의효모에서 Fab 가약 0.1 mg/l 이거나 (Horwitz et al., 1988), 발효조에서트리코데르마에있어서융합단백질 CBHI-Fab 의경우 150 mg/l 이고 Fab 의경우 1 mg/l 이고 (Nyyssonen et al., 1993), 그런생산은포유동물세포 ( 하이브리도마, 골수종, CHO) 에서의전체항체생산에비교하여매우값싸다

24 단편은 Fab's 또는 Fv's 로생산로서생산될수있으나, 추가적으로 V H 와 V L 가유연한폴리펩타이드링커에의해서로서로 유전학적으로연결될수있음이보여지고, 그런조합은 scfv 로서알려져있다. 분리된핵산분자 / 벡터 / 숙주세포 한측면에서, 본발명은상기정의된결합원의적어도일부분을코딩하는분리된핵산분자에대한것이다. 하나의구체예에서, 핵산분자는라이트체인을코딩하고, 다른핵산은헤비체인을코딩한다. 두개의핵산분자는분리될수있거나그들은하나의핵산분자로융합될수있으며, 임의적으로링커서열에의해떨어져있을수있다. 특히, 항체단편과의관계에있어서, 핵산분자는전체결합원을코딩할수있다 ; 그러나결합원의디자인에의존하여이들은몇몇좀더큰결합원에적절하다. 핵산분자는바람직하게 DNA 서열이고, 더욱바람직하게그것의상류와핵산분자가숙주세포에서배열될때결합원의발현을촉진시키는조절요소를포함하는 DNA 서열이다. 따라서, 하나의구체예에서, 본발명은다음으로구성된군에서선택되는폴리뉴클레오타이드에대한것이다 : i) 실시예 6 의뉴클레오타이드서열로부터선택되는서열을포함하는폴리뉴클레오타이드, 서열번호 3, 4, 12 또는 13 의군에서선택되는하나이상의아미노산서열을포함하는결합원을포함하는폴리뉴클레오타이드, ii) 폴리뉴클레오타이드 i) 에의해코딩되는폴리펩타이드단편을코딩하는폴리뉴클레오타이드로서, 여기에서상기단편은 a) ii) 의결합원에의해인식될수있는항원을인식할수있고 / 있거나, b) 항원에선택적으로결합할수있는것으로서, 여기에서상기항원은 ii) 의결합원에의해선택적으로결합될수있고 / 있거나, c) 서열번호 3, 4, 12 또는 13 과같은미리결정된서열을포함하는결합도메인으로서뉴몰리신에대하여실질적으로동일하거나더높은결합친화도를갖는것이고, iii) 상기 i), ii), iii) 중어느하나에서정의된폴리뉴클레오타이드와엄격한조건하에서혼성화되고, 상기 iii) 에서정의된폴리펩타이드를코딩하는상보적인가닥인폴리뉴클레오타이드, iv) i) 내지 iv) 중어느하나에서정의된뉴클레오타이드서열로변성되는뉴클레오타이드서열을포함하는폴리뉴클레오타이드, 및그런폴리뉴클레오타이드의상보적인가닥. 본발명은상기정의된핵산분자를포함하는벡터에대한것으로서, 하나의핵산당하나의벡터이거나동일한벡터내에두개이상의핵산이포함된다. 벡터는바람직하게핵산분자에의해코딩되는항체발현을조절하는뉴클레오타이드서열을포함한다. 다른측면에서, 본발명은상기에서정의된핵산분자를포함하는숙주세포에대한것이다. 또한, 본발명은상기정의된결합원을발현하도록설계된세포주에대한것으로서, 예를들어쥐의임파구의하이브리도마인세포주및불사화된세포주이다. 세포주는임의의적절한세포주일수있으나, 세포주 P3 가바람직하다. 다른구체예에서, CHO 세포주가바람직하다. 결합원의정제

25 본발명에따른결합원을생산한후에는바람직하게정제된다. 사용되는정제방법은필수적순도, 항체의소스, 항체를위한목적용도, 항체가생산되는종, 항체의부류를포함하는몇가지인자들에의존하며, 항체가모노클로날항체일경우에는항체의서브클레스이다. 항체를포함하는폴리펩타이드를정제하는임의의적절한통상적인방법은침전및컬럼크로마토그래피를포함하고, 이는교차 - 흐름여과 (cross-flow filtration), 암모늄설페이트침전, 친화컬럼크로마토그래피, 겔전기영동등을포함하는정제분야에서당업자에게잘알려진방법들이이용될수있다. 항 - 면역글로불린항체로항체를정제하는방법은단일정제공정또는연속정제공정이될수있다. 단일및연속정제방법은정제분야에서잘알려져있다. 단일 - 단계정제공정에있어서, 항체는단일항 - 면역글로불린항체에의해특이적으로결합된다. 비 - 특이적으로결합된분자들은세척단계에서제거되고특이적으로결합된분자들은특이적으로용리된다. 연속정제공정에있어서, 항체는첫번째항 - 면역글로불린항체에특이적으로결합되고, 비 - 특이적으로결합된분자들은세척단계에서제거되고, 특이적으로결합된분자들은특이적으로용리된다. 첫번째항 - 면역글로불린항체로부터의용리액은그때두번째항 - 면역글로불린항체에특이적으로결합된다. 비 - 특이적으로결합된분자는세척단계에서제거되고, 특이적으로결합된분자들은특이적으로용리된다. 바람직한구체예에서, 항체는헤비및라이트체인불변부위에특이적으로결합할수있는항체로구성된군에서선택되는첫번째및두번째항 - 면역글로불린항체에의해연속적으로정제된다. 보통사용되는정제방법은친화크로마토그래피로서, 정제되는항체는단백질 A, 단백질 G 또는항 - 면역글로불린항체에의해결합된다. 또다른친화크로마토그래피방법은당업자에게잘알려진것으로서그것의각각의항원에항체의특이적결합이다. 특히, 이중특이적항체를포함하여다중특이적항체의경우, 연속정제공정이이용될수있으며, 여기에서두개이상의가변도메인을포함하는이중특이적항체는첫번째항원에특이적으로결합하고, 그이후에두번째항체에특이적으로결합한다. 부가적인구체예에있어서, 두개이상의가변부위를포함하는이중특이적항체는첫번째정제단계에서항체가첫번째항원에특이적으로결합하고, 두번째정제단계에서두번째항체에특이적으로결합함으로써연속정제에의해정제된다. 항 - 면역글로불린항체로항체를정제하는방법은단일정제공정이거나연속정제공정일수있다. 단일및연속정제방법은정제분야의당업자에게잘알려져있다. 단일 - 단계정제공정에있어서, 항체는단일항 - 면역글로불린항체에의해특이적으로결합된다. 비 - 특이적으로결합된분자들은세척단계엣제거되고특이적으로결합된분자들은특이적으로용리된다. 연속정제공정에있어서, 항체는첫번째항 - 면역글로불린항체에특이적으로결합되고, 비 - 특이적으로결합된분자들은세척단계에서제거되고, 특이적으로결합된분자들은특이적으로용리된다. 첫번째항 - 면역글로불린항체로부터의용리액은그때두번째항 - 면역글로불린항체에특이적으로결합된다. 비 - 특이적으로결합된분자들은세척단계에서제거되고, 특이적으로결합된분자들은특이적으로용리된다. 바람직한구체예에있어서, 항체는헤비및라이트체인불변부위에특이적으로결합하는항체로구성된군에서선택되는첫번째및두번재항 - 면역글로불린항체에의해연속적으로정제된다. 더욱바람직한구체예에있어서, 항체는 IgG 의헤비체인불변부위및카파및람다의라이트체인불변부위에특이적으로결합하는항체로구성되는군에서선택되는첫번째및두번째항 - 면역글로불린항체에의해연속적으로정제된다. 좀더바람직한구체예에있어서, 항 - 면역글로불린항체는카파및람다의라이트체인불변부위에특이적으로결합하는항체로구성된군에서선택된다. 진단방법 본발명은또한진단시스템, 특히키트형태로기재하는데, 이는여기에서기재된진단방법에따라박테리아의존재, 바람직하게는측정하는것이바람직한것인생물학적샘플에서의스트렙토코커스의존재, 특히스트렙토코커스뉴모니애의존재여부를분석하기위한것이다. 진단시스템은적어도한번의분석에서수행되기에충분한양으로본발명에따른결합원조성물을포함하고, 바람직하게분리되게포장된시약으로서, 더욱바람직하게사용을위한지시도또한포함한다. 생물학적샘플은조직, 조직추출물, 수액샘플또는체액샘플, 이를테면피, 혈장또는혈청이될수있다

26 패키지는본발명의결합원을고정시킬수있는고체매트릭스또는물질, 이를테면유리, 플라스틱 ( 예, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌또는폴리카르보네이트 ), 종이, 호일등의사용을의미힌다. 그러므로, 예를들어, 패키지는계획되어표지된결합원제조물의밀리그램정량을포함하기위해사용되는유리병 (glass vial) 이될수있거나, 그것은계획되어표지된결합원의미생물정량이효과적으로첨부된, 즉리간드를결합할수있도록연결된마이크로티터플레이트웰이될수있다. " 사용을위한지시 " 는통상적으로시약농도를나타내는실재적인표현또는적어도하나의분석방법변수, 이를테면시약, 첨부된샘플의상대적인양, 시약 / 샘플첨가물을위한유지시간, 온도, 버퍼조건등을포함한다. 본발명의진단시스템은바람직하게또한미리선택된리간드와복합체를이루는결합원을포함하는결합반응복합체의형성을신호할수있는표지또는지시수단을포함한다. 임의의표지또는지시수단은발현된폴리펩타이드, 또는진단방법에서사용되는파아지입자에연결되거나통합될수있다. 그런표지는임상진단화학에서잘알려진것이다. 표지수단은면역형광추적에유용한플루오로크롬 ( 염색 ) 을형성하기위해그것을변성시키지않고항체또는항원에화학적으로결합하는형광표지제가될수있다. 적절한형광표지제는플루오로크롬, 이를테면 FIC(fluorescein isocyanate), FITC(fluorescein isothiocyante), DANSC(5-dimethylamine-1-naphthalenesulfonyl chloride), TRITC (tetramethylrhodamine isothiocyanate), 리사민 (lissamine), RB 200 SC(rhodamine 8200 sulphonyl chloride) 등이있다. 면역형광분석기술의기재는여기에참고자료로서통합된델루카 (DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", in Antibody As a Tool, Marchalonis, et al., eds., John Wiley & Sons, Ltd., pp , 1982) 에서발견된다. 바람직한구체예에서, 지시그룹은효소, 이를테면, HRP(horseradish peroxidase), 글루코오스산화제등이있다. 주된지시그룹이 HRP 또는글루코오스산화제인경우에, 추가시약이수용체 - 리간드복합체 ( 면역반응체 ) 가형성되는사실을시각화하기위해요구된다. 그런 HRP 를위한추가시약은과산화수소및산화염색전구체, 이를테면디아미노벤지딘 (diaminobenzidine) 을포함한다. 글루코오스산화제에유용한추가시약은 ABTS(2,2'-amino-di-(3-ethylbenzthiazoline-G-sulfonic acid) 이다. 방사성요소가또한유용한표지시약이되고, 여기에서사용된다. 대표적인방사능표지제는감마선방사를생산하는방사 성요소이다. 그자체로감마선을방사하는요소, 이를테면 124 I, 125 I, 128 I, 132 I 및 51 Cr 은감마선방사 - 생산방사능요소 지시그룹의한클래스를대표한다. 특히 125 I 이바람직하다. 유용한표지수단의다른그룹은그자체로양전자를방사하 는 11 C, 18 F, 15 O 및 13 N 와같은요소이다. 그렇게방사된양전자는동물의몸에서존재하는전자와마주칠때감마선을생 산한다. 또한베타방사체, 이를테면 111 인듐또는 3 H 이유용하다. 표지의연결, 즉, 폴리펩타이드및단백질또는파아지의표지는당분야에잘알려져있다. 예를들어, 단백질은배양배지에있는성분으로제공되는방사성동위원소 - 함유아미노산의물질대사적통합에의해표지될수있다. 예를들어갈프레등 (Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46, 1981) 을참조하라. 단백질접합또는활성화된기능기를통한커플링기술을특히적용할수있다. 예를들어, 우라메스등 (Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., Vol. 8 Suppl. 7:7-23, 1978), 로드웰등 (Rodwell et al., Biotech., 3: , 1984), 및미국특허번호 4,493,795 을참조하라. 진단시스템은또한특정결합제, 바람직하게는분리된패키지로서포함할수있다. " 특정결합제 " 는본발명의결합원종에선택적으로결합할수있는분자또는그런종을함유하는복합체이지만, 본발명의결합원그자체는아니다. 대표적인특정결합제는항체물질, 보체단백질또는그들의단편, S. 아우레우스단백질 A 등이다. 바람직하게특정결합제는그종이복합체의일부로서존재할때결합원종에결합한다. 바람직한구체예에서, 특정결합제는표지되었다. 그러나, 진단시스템이표지되지않은특정결합제를포함할대, 그결합제는통상적으로증폭수단또는시약으로서이용된다. 이들구체예에서, 표지된특정결합제는증폭수단이시약종 - 함유복합체에결합될때증폭수단에특이적으로결합할수있다. 본발명의진단키트는수액샘플에서미리선별된리간의정량측정을위해 "ELISA" 형식으로이용될수있다. "ELISA" 는고체상에결합된항체또는항원과샘플에존재하는항원의양을측정하고정량하기위한효소 - 항원또는효소 - 항체접합체를이용하는효소면역측정분석을의미하고, 본방법에도쉽게이용될수있다

27 그러므로, 몇몇구체예에서, 본발명의결합원은대상진단시스템에서패키지를포함하는고체지지체를형성하기위한고체매트릭스에첨가될수있다. 시약은통상적으로단백질에적용할수있는첨부의다른모드일지라도수성배지로부터흡착에의해고체매트릭스에부착되고, 폴리펩타이드가사용될수있으며이는당업자에게잘알려져있다. 대표적인흡착방법은여기에기재되었다. 유용한고체매트릭스는또한당업계에잘알려져있다. 그런물질은물에불용성이고, Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, N.J.) 의세파덱스상표로서입수할수있는교차 - 연결된덱스트란 ; 아가로스 ; 북시카고 III. 의 Abbott Laboratories 로부터입수할수있는직경약 1 마이크론에서 5 밀리미터인폴리스틸렌비즈의비즈 ; 폴리비닐클로라이드, 폴리스티렌, 교차 - 연결된폴리아크릴아미드, 니트로셀룰로오즈 - 또는나일론 - 기초편물, 이를테면시트, 스트립또는패틀 ; 또는튜브, 플레이트또는마이크로티터플레이트의웰, 이를테면폴리스틸렌또는폴리비닐클로라이드로부터제조된것들을포함한다. 여기기재된임의의진단시스템의결합원종, 표지된특정결합제또는증폭시약은액체분산또는실질적으로건조분말, 예를들어동결건조된형태로서용액으로제공될수있다. 지시수단이효소일때, 효소의기질은또한시스템의분리된패키지에서제공될수있다. 고체지지체, 이를테면그전에설명한마이크로티터플레이트및하나이상의버퍼가이진단분석시스템에서분리된패키지요소로포함될수있다. 진단방법 본발명은또한통상적으로생물학적샘플에존재하는스트렙토코커스, 특히스트렙토코커스뉴모니애의존재, 바람직하게는양을측정하기위한다양한분석방법을고려한다. 따라서, 본발명은다음을포함하는개체에서뉴모코커스와연관된질병또는장애를측정또는진단하는방법에대한것이다 : - 상기개체로부터의생물학적샘플을제공하고, - 상기생물학적샘플에상기정의된적어도하나의결합원을첨가하고, - 상기생물학적샘플에결합된결합원을측정하여질병또는장애를측정또는진단하는것. 결합된결합원은샘플에서스트렙토코커스의양으로직접적으로또는간접적으로측정될수있다. 당업자는본발명의결합시약이그것의양이샘플에서의리간의양과관련이있는결합반응생산물을형성하는데이용될수있음이임상진단화학과정에서는잘알려져있는것임을이해할것이다. 그러므로, 대표적인분석방법이여기에기재되어있지만, 본발명이여기에제한받지않는다. 경쟁적또는비경쟁적인다양한이종및동종프로토콜이본발명의분석방법을수행함에이용될수있다. 결합조건은수용체의리간 - 결합활성을유지한다. 그러한조건은약 4 내지 50 의온도범위, 약 5 내지 9 의 ph 값범위, 및증류수의이온세기부터이온세기약 1 몰랄의염화나트륨의이온세기까지다양한이온세기를포함한다. 측정단계는면역학분야에잘알려진것처럼, 복합체또는결하시약 ( 복합체의수용체성분 ) 에대한것이다. 그러므로, 2 차결합시약, 이를테면수용체에대한특이적인항체가이용될수있다. 부가적으로, 복합체는표지된수용체분자를사용하여측정될수있으며, 그로인하여표지된복합체가제조될수있다. 이경우의측정은복합체에존재하는표지를측정하는것을포함한다. 또진단방법은리간드에교차연결되는본발명의일구체예에의결합원조성물의다가를이용할수있으며, 그것에의해다중리간드및폴리펩타이드의응집을형성하고, 침전성의응집체를생산한다. 이구체예는면역침전의잘알려진방법

28 과비교된다. 이구체예는결합조건하에서결합첨부물을형성하기위하여본발명의결합원조성물을샘플에첨부시키는단계, 형성된결합복합체를분리하는분리단계로구성된다. 통상적으로, 분리는첨부물로부터응집체를제거하기위하여원심분리또는여과에의해성취된다. 결합복합체의존재는측정되는미리선별된리간드의존재를의미한다. 약학조성물 바람직한측면에서, 본발명은여기기재된치료방법을실천하기에유용한약학조성물을고려한다. 본발명의약학조성물은여기기재된, 활성성분으로서거기에용해되거나분산되는적어도한종의결합원과함께생리학적으로관용적인캐리어를포함한다. 바람직한구체예에서, 약학조성물은치료목적이면역반응을유발하는것이아닌한, 치료목적으로인간개체에투여될때에는면역원성이아니다. 하나의측면에서, 본발명은상기기재된적어도하나의결합원을포함하는약학조성물에대한것이다. 바람직한구체예에서, 약학조성물은치료효과를증진시키기위하여상기정의된적어도두개의다른결합원을포함한다. 여기사용된것처럼, 조성물, 캐리어, 희석제및시약으로언급되는 " 약학적으로허용가능한 ", " 생리학적으로관용적인 " 및그들의문법적변형의용어는교환적으로이용되고, 목적하지않는생리적인효과의생산, 이를테면구역질 (nausea), 어지럼증 (dizziness), 급성위연동이상항진 (gastric upset) 등없이인간에게투여될수있는물질을대표한다. 거기에용해되거나분산되는활성성분을포함하는약학조성물의제조는당업계에잘이해되어있다. 통상적으로그런조성물은멸균주입가능물질로서, 액체용액또는현탁액, 수성또는비 - 수성용액으로서제조된다 ; 그런, 사용하기전에액체로서, 용액또는현탁액을위해적절한고체형태또한제조될수있다. 제조는또한유화될수있다. 활성성분은활성성분과약학적으로허용가능하고융화될수있는부형제와여기에기재된치료방법에서사용되기위한적절한양으로혼합될수있다. 적절한부형제는, 예를들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올등및그들의조합이다. 추가로, 만약필요하다면, 조성물은보조물질, 이를테면습윤제또는유화제, ph 버퍼제등, 활성성분의효과를증강시키는보조물질극소량을포함할수있는다. 본발명의약학조성물은그들의성분의약학적으로허용가능한염을포함할수있다. 약학적으로허용가능한염은무기산, 이를테면염산또는인산, 또는아세트산, 타르타르산, 만델린산등과같은유기산과함께형성되는산부가염 ( 폴리펩타이드의유리아미노기와형성됨 ) 을포함한다. 유리카르복실기와함께형성되는염또한무기염기, 이를테면예를들어나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘또는철수산화물 (ferric hydroxides), 및유기염기, 이를테면이소프로필아민, 트리메틸아민, 2- 에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인등으로부터유래될수있다. 생리학적으로관용적인캐리어는당업계에잘알려져있다. 대표적인액체캐리어는활성성분과물외에어떤물질도포함하지않는멸균수용액이거나, 생리학적 ph 수치에서의소듐포스페이트, 생리적식염수또는양자모두, 이를테면인산염 - 완충된식염수를포함하는멸균수용액이다. 또한수성캐리어는하나이상의버퍼염, 뿐만아니라나트륨및칼륨클로라이드, 덱스트로즈, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜및다른용질을포함할수있다. 액체조성물은또한물이배제된액상을포함한다. 그런추가적인액상의대표적인예를글라이세린, 면실유와같은식물성오일, 에틸올에이트와같은유기에스테르, 및물 - 오일에멀젼이다. 약학조성물은본발명의결합원을통상적으로전체약학조성물중량당항체의적어도 0.1 중량퍼세트의양을포함한다. 중량퍼세트는전체조성물에대한항체무게의비율이다. 그러므로, 예를들어, 0.1 중량퍼세트는전체조성물 100g 당항체 0.1g 이다. 본발명은또한본발명의항체를포함하는약제또는약학조성물의제조방법에대한것으로서, 스트렙토코커스, 특히스트렙토코커스뉴모니애와관련된질환또는장애, 이를테면폐렴 (pneumonia), 수막염 (meningitis) 및패혈증 (sepsis) 에사용되는약제으로서, 생리학적으로허용가능한캐리어와함께상기기재된적어도하나의결합원을첨부하는것을포함한다. 게다가, 본발명은스트렙토코커스, 특히스트렙토코커스뉴모니애와관련된질병또는장애, 이를테면폐렴, 수막염및패혈증의치료를위한약학조성물의생산을위한상기정의된결합원의용도에대한것이다

29 약학조성물은항생제, 이를테면 β- 락탐, 세팔로스폴린 (cephalosporin), 페니실린및아미노글리코시드 (aminoglycosides) 로부터선택되는항생제를더포함하고 / 하거나면역자극제, 이를테면사이토카인, 인터페론, 성장인자, 예를들어 GCSF 또는 GM-CSF 를더포함하는키트 - 인 - 파트가될수있다. 그키트 - 인 - 파트는동시에, 연속적으로또는분리하여투여되기위해사용될수있다. 게다가, 약학조성물은스트렙토코커스단백질뉴몰리신과조합하여본발명에따른결합원을, 특히백신으로서포함할수있다. 본발명에따른결합원과뉴몰리신단백질과의결합에의해, 조성물제품의면역성성질이뉴몰리신단백질그자체에비하여더탁월한것이밝혀졌다. 이는뉴몰리신단백질이결합원에의해면역계에제시된다는사실때문일것이다. 다른구체예에서, 본발명에따른항체는스트렙토코커스뉴모니애에대한다른항체, 이를테면다른항 - 뉴몰리신항체, 예를들어비 - 용혈항 - 뉴몰리신항체와결합된다. 본발명에따른항체는또한국제특허출원번호 PCT/DK2004/ 에서기재된항 -PsaA 항체일수있다. 치료방법 본발명에따른결합원은그들의높은친화도및특이성으로인하여특히치료방법에유용하다. 따라서, 결합원은스트렙토코커스, 특히스트렙토코커스뉴모니애로인한질병또는장애, 이를테면폐렴, 수막염및패혈증에대한면역치료법적으로사용될수있다. 본발명의결합원과연결하여여기에서이용되는 " 면역치료법적으로 (immunotherapeutically)" 또는 " 면역치료 (immunotherapy)" 용어는치료적투여뿐만아니라예방적투여모두를의미한다. 그러므로, 결합원은질병의가능성및 / 또는심각성을완화시키기위하여위험성이높은환자에게투여될수있고, 이미감염된것으로밝혀진환자에게투여되거나감염의위험에노출된환자에게투여될수있다. 본발명의결합원의투여를위한 1 회량의범위는그질병의징후가완화되거나감염의가능성이낮아지는정도의목적효과를나타내기에충분히큰량이다. 일반적으로, 1 회투여량은환자의나이, 상태, 성별및질병의정도에따라다양할것이고, 당업자에의해결정될수있다. 1 회투여량은임의의합병증이있는경우각의사에의해조정될수있다. 본발명의치료적유효량은통상적으로항체의양으로서, 생리적으로관용적인조성물로투여될때약밀리리터 ( ml ) 당 0.1 마이크로그램 ( μg ) 내지약 100 μg / ml, 바람직하게는약 1 μg / ml내지약 5 μg / ml, 보통은약 5 μg / ml의혈장농도가되기에충분한양이다. 달리말하면, 1 회투여량은 0.1 mg/kg 에서약 300mg/kg, 바람직하게약 0.2mg/kg 내지 200mg/kg, 가장바람직하게는약 0.5mg/kg 내지약 20mg/kg 으로다양할수있으며, 매일한번이상투여되거나하루또는몇일동안투여될수있다. 본발명의결합원은주사또는점진적인주입에의해비경구적으로투여될수있다. 비록감염이국북적이서, 약학조성물의정맥내투여에의해종종치료되고, 다른조직및전달수단이조직을치료하는것이질병을완화시킬가능성이있다면고려된다. 그러므로, 본발명의항체는비경구적으로, 이를테면정맥내로, 복막내로, 근육내료, 피하조직으로, 강내로 (intracavity), 경피적으로 (transdermally) 으로투여될수있고, 연동수단에의해전달될수있다. 본발명의결합원을포함하는약학조성물은통상적으로정맥내로투여되고, 예를들면단위투여량의주사에의해서이다. 본발명의약학조성물에참고적으로사용될때 " 단위투여량 (unit dose)" 용어는대상에단일투여량으로서적절한, 신체적으로분리된단위를의미하고, 각단위는필요적희석제, 즉, 캐리어또는베히클과관련하여목적치료효과를나타내도록계산된활성물질의미리결정된정량을포함한다. 치료방법은또한상기정의된키트 - 인 - 파트의용도를포함할수있다. 수동면역보호 (Passive immune protection) 결합원은특히수동면역보호에유용한데, 결합원은뉴몰리신의활동을무력화시킨다. 결합원은실시예 1 에기재된분석에서평가될수있다. 그분석의결과는뉴몰리신에대한결합원의투여가쥐에있어서 S. 뉴모니애감염시에생존을연장시킬수있으며, 수동면역보호를유도함을증명한다. 능동면역보호 (Active immune protection)

30 본발명의항원에피토프는뉴몰리신에대해유도된포유동물에있어서면역학적반응을자극하기위한백신으로이용될수있으며, 포유동물은예를들어쥐, 개, 고양이, 백조, 말, 소태아등이며, 바람직하게는인간이다. 그런반응은뉴몰리신특이적항체의유도를포함한다. 본발명의항원적에피토프에대해유도된항체는상기기재된것처럼뉴몰리신의기능을억제할수있고, S. 뉴모니애에의해유발된감염을치료및예방하는데이용될수있다. 뉴몰리신펩타이드 한측면에서, 본발명은본발명에따른결합원에의해인식되는에피토프를포함하는뉴몰리신펩타이드에대한것이다. 바람직하게, 뉴몰리신펩타이드, 단편또는유사체는서열번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36 에의해동정된아미노산서열을포함한다. 본발명에따른뉴몰리신펩타이드는서열번호 11 의아미노산 으로구성되는펩타이드이다. 또서열번호 11 의아미노산 으로구성되는뉴몰리신펩타이드의단편또는유사체가포함되고, 이는서열번호 11 에의해동정된뉴몰리신의아미노산 , 또는더바람직하게아미노산 을포함하는단편을포함한다. 특정구체예에서, 뉴몰리신펩타이드는서열번호 11 에의해동정된뉴몰리신의아미노산 또는 을포함한다. 뉴몰리신펩타이드의유사체또는상동체는상기기재된결합원에대하여상동적인것으로서정의될수있다. 뉴몰리신펩타이드, 단편또는유사체는서열번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36 에의해동정된아미노산서열을포함하는것이바람직하다. 뉴몰리신펩타이드는최고 100, 이를테면 80, 60, 40, 30, 25, 20, 15 또는이를테면 12 아미노산으로구성되는것이바람직하다. 뉴몰리신펩타이드는적어도 12, 이를테면 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 이를테면적어도 100 아미노산에의해구성되는것이바람직하다. 특정구체예에서, 뉴몰리신펩타이드단편은서열번호 27, 29, 30, 31 또는 32 에의해동정된다. 뉴몰리신펩타이드는면역계를자극할수있는항원에피토프로서사용될수있다. 백신조성물 본발명에따른백신조성물은활성제와함께하나이상의약학적으로허용가능한부형제또는캐리어, 바람직하게인간에게투여하기에허용가능한것의부가물에의해, 잘알려진방법에따라제제화될수있다. 그런부형제, 캐리어및제제화방법의예로는예를들어레밍턴의약학과학 (Maack Publishing Co, Easton, PA) 에서찾아볼수있다. 효과적투여에적절한약학적으로허용가능한조성물을제제화하기위해, 그런조성물은본발명에따라유효량의뉴몰리신펩타이드또는그것의유사체를포함할것이다. 본발명에따른백신조성물은치료적유효량으로개체에투여될수있다. 유효량은개체의상태, 몸무게, 성별및나이등의요인의다양성에따라달라질것이다. 다른요인으로는투여형태를포함한다. 다음으로, 백신조성물은면역반응을자극하는것을포함하는치료적용도를위해유용한조성물을포함하는것을의미한다. 백신또는면역원성조성물을획득하기위하여, 뉴몰리신펩타이드또는유사체분자를어쥬번트, 면역자극성분및 / 또는캐리어와같은다양한물질과결합하는것이필요될것이다. 어쥬번트는특정면역반응을강화시키는백신조성물에포함된다. 그런어쥬번트는당업자에게잘알려진어쥬번트효과를포함하는임의의조성물일것이다. 예를들어그런어쥬번트는미네랄, 박테리아, 식물, 합성또는숙주기원일수있으며, 또는워터에멀젼에서의오일이될수있다. 어쥬번트는다음군에서선택될수있다 : AlK(SO 4 ) 2, AlNa(SO 4 ) 2, AlNH 4 (SO 4 ), 실리카 (silica), 알룸 (alum), Al(OH) 3, Ca 3 (PO 4 ) 2, 카올린 (kaolin), 탄소 ( carbon), 수산화알루미늄 (aluminum hydroxide), 뮤라밀디펩타이드 (muramyl dipeptides), N- 아세틸 - 뮤라밀 -L- 트레오닐 -D- 이소글루타민 (thr-dmp), N- 아세틸 - 노르누라밀 -L- 알라닐 -D- 이소글루타민 (CGP 11687, 또한 nor-mdp 으로언급됨 ), N- 아세틸뮤라미울 -L- 알라닐 -D- 이소글라투미닐 -L- 알라닌 -2-(1'2'- 디팔미토일 -sn- 글리세로 -3- 히드록시포스포릴옥시 )- 에틸아민 (CGP 19835A, 또한 MTP-PE 으로언급됨 ), 2% 식염수 / 트윈 -80.RTM. 에멀젼에서의 RIBI(MPL+TDM+CWS), 리포포일 - 사카로이드 (lipopoly-saccharides) 및그것의다양한유도체이고, 지질 A, 프로인드완전어쥬번트 (FCA), 프로인드불완전어쥬번트, 머크어쥬번트 65, 폴리뉴클레오타이드 ( 예

31 를들어, 폴리 IC 및폴리 AU 산 ), 마이코박테리움으로부터의왁스 D, 결핵 (tuberculosis), 코리네박테리움파르붐에서발견되는물질, 보데텔라펄투스시스 (Bordetella pertussis) 및브루셀라속의일원들, 리포솜또는다른지질에멀젼, Titermax, ISCOMS, Quil A, ALUN (US 및 5,554,372 을참조 ), 지질 A 유도체, 콜레라톡신유도체, HSP 유도체, LPS 유도체, 합성펩타이드매트릭스또는 GMDP, 인터루킨 1 및인터루킨 2 를포함한다. 수많은어쥬번트들이기재되었고실험실동물, 이를테면생쥐, 쥐및토끼들에서항체생성을위해사용될수있다. 그런세팅에있어서, 부작용의관용이주목적이강한항체반응을획득하는것보다훨씬더크다. 약학에서의용도및그용도를위한접근을위해, 필수적으로인간에서사용되기위하여, 어쥬번트를포함하는백신조성물의성분들이잘특징지어질것이필요하다. 그조성물은임의의역반응, 이를테면육아종 (granuloma), 고름집 (abscesse) 또는열의위험이최소일것이또한요구된다. 더바람직한구체에에서, 백신조성물은인간주체를위해투여되는것이적절하고, 그러므로바람직한어쥬번트는인간주체에투여되는것이적절하다. 치료적백신에있어서유용한어쥬번트는미네랄염, 이를테면수산화알루미늄 (aluminium hydroxide) 및알루미늄또는칼슘포스페이트겔, 오일에멀젼, 및 MF59 ( 워터에멀젼에서오일을안정화시키는마이크로유동체화된세정제 ), QS21 ( 정제된사포닌 ), AS02 (SBAS2, 오일 - 내 - 워터에멀젼 + 모노 - 포스포릴지질 A(MPL) + QS21), 몬타나이드 ISA 51 및 ISA-720 ( 오일에멀젼에서물을안정화시킴 ), 어쥬번트 65 ( 피넛오일, 만나이드모노올레이트및알루미늄모노스테아레이트를포함 ), RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Utah) 과같은제형에기초한계면활성제, 미립자어쥬번트, 이를테면비로솜 (virosomes, 인플루엔자햄마글루티닌을통합시키는단층리포솜베히클 (unilamellar liposomal cehicles incorporating influenza haemagglutinin), AS04 (MPL 을갖는 Al 염 ), ISCOMS ( 사포닌과지질 ( 이를테면콜레스테롤 ) 의복합체로구조됨 ), 폴리애타이드코 - 글라이코라이드 (PLG), 미생물유도체 ( 천연및합성 ), 이를테면모노포스포릴지질 A (MPL), 데톡스 (MPL + M. Phlei 세포벽스켈레톤 ), AGP (RC-529 ( 합성아실화된모노사카라이드 ), DC_ chol ( 리포솜으로스스로조직가능한리포이드성면역자극제 ), OM-174 ( 지질 A 유도체 ), CpG 모티프 ( 면역자극적인 CpG 모티프를함유하는합성올리고뉴클레오타이드 ), 비 - 톡신어쥬번트효과를갖는변형된박테리아톡신, LT 및 CT, 내생적인간면역조절제, 예를들어, hgm-csf 또는 hil-12 또는이뮤 - 댑틴 (C3d 직렬분석 ), 금입자와같은활성이없는베히클이있다. 몇몇구체예에서, 백신조성물은하나이상의추가적인면역자극성분을더포함한다. 이들은여기에제한되지않고, 뮤라밀디펩타이드 (muramyldipeptide, MDP); 예를들어, N- 아세틸 - 뮤라밀 -L- 알라닐 -D- 이소글루타민 (ala-mdp), N- 아세틸 - 뮤라밀 -L- 트레오닐 -D- 이소글루타민 (thr-mdp), N- 아세틸 - 노르 - 뮤라밀 -L- 알라닐 -D- 이소글루타민 (CGP 11637, nor-mdp) 및 N- 아세틸 - 뮤라밀 -L- 알라닐 -D- 이소글루타미닐 -L- 알라닌 -2-(1'-2'- 디팔미토일 -sn- 글라이세로 -3- 히드록시포스포릴옥시 )- 에틸아민 (CGP 19835A, MTP-PE), 디메틸글라이신, 터프트신 (tuftsin), 및트레할로스디마이코레이트, 모노포스포릴 - 지질 A (MPL), 및 N- 포르밀 -Met-Leu-Phe 와같은트리펩타이드를함유하는포르밀 - 메티오닌을포함한다. 그런화합물은시그마화학회사 (St. Louis, MO) 및 RIBI ImmunoChem Research, Inc. (Hamil-ton, MT) 로부터상업적으로입수할수있다. 캐리어는어쥬번트와독립적으로존재할수있다. 캐리어의기능은예를들어그들의활성또는면역원성을증가시키기위해, 안정성을부여하기위해, 생물학적활성을증가시키기위해, 또는혈청반감기를증가시키기위해특히설비빈단편의분자량을증가시키는것일수있다. 캐리어는당업자에게잘알려진임의의적절한캐리어가될수있다. 캐리어단백질은여기에제한되지는않지만키홀림펫해모시아닌 (keyhole limpet haemocyanin), 혈청단백질, 이를테면트랜스페린, 소혈청알부민, 인간혈청알부민, 티로글루불린또는오브알부민, 면역글로불린또는호르몬, 이를테면인슐린또는팔미트산이될수있다. 인간의면역화를위하여, 캐리어는인간에게안전하게받아들일수있는생리학적으로허용가능한캐리어이어야만한다. 그러나, 파상풍톡소이드및 / 또는디프테리아톡소이드는본발명의일구체예에서적절한캐리어이다. 부가로, 캐리어는세파로스와같은덱스트란이다. 일구체예에서, 백신조성물은서열번호 27, 28, 29, 30, 31 또는 32 로동정된아미노산서열을포함하는뉴몰리신펩타이드를포함한다. 서열번호 29, 30 또는 31 에의해동정된아미노산서열을포함하는펩타이드를포함하는백신이바람직하다. 특히바람직한것은서열번호 11 에의해동정된뉴몰리신의 , 또는 아미노산을포함하는펩타이드이다. 뉴몰리신펩타이드는최고 100, 이를테면 80, 60, 40, 20, 15, 12, 10, 8 또는이를테면 6 개의아미노산에의해구성되는것이바람직하다. 뉴몰리신펩타이드는적어도 6 개, 이를테면 8, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 60, 80, 또는이를테면적어

32 도 100 아미노산에의해구성되는것이더바람직하다. 일구체예에서, 백신조성물은서열번호 27, 28, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36 에의해동정된적어도하나의뉴몰리신펩타이드를포함한다. 서열번호 28, 29, 30 또는 31 에의해동정된펩타이드를포함하는백신이바람직하다. 특히바람직한것은서열번호 11 에의해동정된뉴몰리신의 , , 또는 의아미노산으로동정된아미노산서열을포함하는펩타이드이다. 면역반응을자극할수있는백신조성물이바람직하다. 백신조성물은투여될때항체반응을유도할수있는것이특히적절하다. 가장바람직한것은뉴몰리신의용해활성을억제할수있는항체생산을유도함으로써, 뉴몰리신억제반응을유도할수있는백신이다. 다른바람직한구체예는뉴몰리신의식균작용을강화시킬수있는항체를유도한다. 그런항체는여기기재된결합원으로서가변부위를포함함으로써특징될수있다. 도면의상세한설명 도 1. Fab 단편의도식도 V L, CDR1, CDR2, CDR3 과 V H, CDR1, CDR2, CDR3 로구성된항원포켓을나타낸다. 도 2. 서열번호 11 을갖는뉴몰리신아미노산서열. 진뱅크번호 X52474 의서열에대응하는뉴몰리신의아미노산서열을나타낸다. 도 3. 항 - 뉴몰리신의라이트체인및헤비체인가변단편. 도 3A 는가변라이트및헤비체인의일치서열과항체 26-5F12.1 의상보성결정부위를포함한다. 도 3B 는가변라이트및헤비체인의일치서열과항체 26-23C 2.2 의상보성결정부위를포함한다. 도 3C 는가변라이트및헤비체인의일치서열과항체 22-1C11 의상보성결정부위를포함한다. 서열은실시예 6 에기재된것과같이수득하였다. 도 4. 뉴모코커스및항체로접종시킨마우스의생존다이아그램. 뉴모코커스 D39 단독으로주사또는페니실린및 / 또는뉴몰리신항체 (26-5F12) 의조합으로주사된마우스의생존을실시예 1 에기재된것처럼접종후 24 시간동안평가하였다. 도 5. 뉴몰리신항체의항 - 용혈활성 뉴몰리신항체의항 - 용혈활성을실시예 3 에서기재된것처럼적혈구의뉴몰리신매개용해에대한억제효과를평가함으로써분석하였다. 3 개의항체들 (26-5F12, 26-23C 2 및 22-6E6) 이특히효과적이다. 도 6. 에피토프맵핑을위한펩타이드. 에피토프맵핑을위한뉴몰리신의아미노산서열 과다양한펩타이드서열의개관. 도 7. 뉴몰리신항체에피토프. 도 7A 및도 7B 는항체에피토프의동정과관련된실시예 7 에기재된것과같이수득된결과를그래프로그린것이다. 도 F12 클론의분리 도 8A 는 26-5F12 하이브리도마세포로부터분리한전체 RNA 를나타낸다. 그 RNA 는헤비체인과라이트체인가변부위의 cdna 합성을위해이용되었다. PCR 산물은도 8B 에서나타낸다. 양성변형체를클로닝한후에는콜로니 PCR 을이용하여동정하였다 ( 도 8C). 도 C2 클론의분리

33 도 9A 는 C2 하이브리도마세포로부터분리한전체 RNA 를나타낸다. RNA 는헤비체인과라이트체인가변부위의 cdna 합성을위해사용하였다. PCR 산물은도 9B 에서나타내었다. 양성변형체를클로닝한후에는콜로니 PCR 을이용하여동정하였다 ( 도 9C). 도 C11 클론의분리 22 1C11 하이브리도마세포로부터분리한전체 RNA 는헤비체인과라이트체인가변부위의 cdna 합성을위해사용하였다. PCR 산물은도 10BA 에서보여진다. 양성변형체를클로닝한후에는콜로니 PCR 을이용하여동정하였다 ( 도 10B). 도 F12, 26-23C2 및 22 1C11 의 CDR 서열 26-5F12, C2 및 22 1C11 의라이트및헤비체인 CDR's 의서열을정렬하였다. 22 1C11 헤비체인의 CDR 2 및 CDR3 이 6-5F12 과 의서열로부터갈라지는반면에, C2 26-5F12 및 26-23C2 의헤비체인은거의동일하다. 실시예 본발명은하기실시예를통해더자세히설명된다 ; 그실시예들은본발명을제한하는것으로서해석되지는않는다. 실시예 1 뉴모코커스 D39( 타입 2) 로접종된트랜스제닉암컷마우스의생존에있어서항체와페니실린의효과연구 물질 82 마리의트랜스제닉암컷마우스 (M-B 프로젝트번호 #249, 프로젝트이름 CD64, 약 8-12 주된마우스 ) 0.9% 식염수 (AAS) PBS ph 7.4 시린지 (Syringes) 바늘 5% 블러드플레이트 (blood plates) 여과된소태아브루스 페니실린이첨가된용매 페니실린 1 밀리온 IU (Løven D6726), 10 mg/ 마우스 ~40 mg/ml 균주 : 뉴모코커스 D39 ( 타입 2) (F1/S1/Æ2) 항체 : PdB26-5F12.1, 1.0 mg/ml OmpA6-4B6.1, 1.38 mg/ml 방법 :

34 -24 시간 : 뉴모코커스균주는 3 5% 블러드플레이트상에씨딩하고 35 /CO 2 에서배양하였다. 0 시간 : 뉴모코커스균주는여과된브루스로 108 CFU/ml (cf. MU/F074-01) 이되도록현탁시키고 CFU/ml (59.88 ml 의 PBS 에서 120 μl 10 8 CFU/ml) 이되도록희석하였다. 항체는 200 μg/ml 로희석하였다 : 3.00 ml 의 PdB26-5F ml 의 PBS 2.17 ml 의 OmpA6-4B ml 의 PBS 마우스는박테리아 (0.5 ml i.p.) 와항체 (0.5 ml i.p.) 로처리하였다. 18 시간 : 페니실린 : 1 앰플은페니실린 ~200 mg/ml 이첨가된 3ml 용매에서희석하였다 ; 또희석 : 3 ml 200 mg/ml ml 의식염수 ~40 mg/ml. 항체는 200 μg/ml 로희석하였다 : 3.00 ml 의 PdB26-5F ml 의 PBS 2.17 ml 의 OmpA6-4B ml 의 PBS 마우스는페니실린 (0.25 ml s.c.) 및항체 (0.5 ml i.p.) 로처리하였다. 48 시간 : 페니실린 : 1 앰플은페니실린 ~200 mg/ml 가첨가된 3ml 의용매로희석하였다 ; 또희석 : 3 ml 200 mg/ml ml 의식염수 ~40 mg/ml. 마우스는페니실린 (0.25 ml s.c.) 으로처리되었다. 실험을지속시키기위해다음날의오전및오후 : 마우스들은스케일 1-4 에따라점수를매겼다

35 결과 마우스의생존은 24 시간에평가되었다. 26-5F12.1 을이용하여수행한실험의결과는도 4 에서요약되었으며, 24 시간에생존이증가함을보여준다. 실시예 2 배양상청액의항체에서의항 - 용혈성질의측정 설명 : 뉴몰리신에대한항체는뉴몰리신의용해효과를억제할수있다. 용해효과는혈청의존재하에서파괴되어, 항체에결합하고항 - 용혈분석수행전에세척에의해혈청을제거하는것이필수적이다. 장비 : 배양기 37 피펫 원심분리사 ELISA 리더, BIO-TEK EL 800 디지털카메라, Canon Powershot S20 물질 : 팁스 (Tips) 시약접시 (Reagent tray) 플레이트커버 96- 웰마이크로웰플레이트 (Nunc 플랫바닥 ) 리액티 - 결합단백질 G 코팅된마이크로웰스트립 (Reacti-Bind Protein G coated microwell strips), Pierce no 시약 : Rec. PdB, PBS w.10 mm DTT 에서 4 μg/ml 로희석 DTT(Dithiothreitol) PBS, ph 7.4 Dem. H 2 O Alsever s Fluid 에서의양적혈구 50%, SSI no 버퍼 :

36 PBS ph % 트윈 20 을갖는 PBS ph 7.4 대조구 : 캐칭 : 음성 : 0.05% 트윈 20 을갖는 PBS ph 7.4 용혈 : 0.05% 트윈 20 을갖는 PBS ph 7.4 높은양성 : PBS 에서 10 μg/ml 으로희석시킨 PdB22-6E6 낮은양성 : PBS 에서 2 μg/ml 으로희석시킨 PdB22-6E6 샘플 : 샘플들은 1-5 μg/ml 로예상되는항체농도를갖는희석되지않는배양상청액이다. 과정 : 스트립은 PBS/0.05% 트윈에서 3 회세척하였다. PBS/0.05%Tw20 의 50 μl/well 을첨가하고, 희석되지않은배양상청액 50 μl/well 또는대조구 50 μl/well 을첨가하였다. 실온에서 1 시간배양하였다. PBS( 트윈 20 불포함 ) 으로 4 회세척하였다. 50 μl 의 PBS 가각웰에첨가되고, A1-B1 는 100 μl/well 첨가되었다. 재조합 PdB 는미리 - 가열된 PBS 에서 4 μg/ml 로희석하고, 10 mm DTT 로 37 에서 15 분동안활성화시켰다. 활성화된 PdB 의 50 μl/well 첨가하고, A1-B1 의경우엔제외하였다. 37 에서 30 분동안배양하였다. 양적혈구는 PBS 로 3 회세척하고, PBS 에서 2% vol/vol 으로재현탁시켰다. 각웰에 50 μl 을첨가하고 37 에서 30 분동안배양하였다. 플레이트를 1000 g 에서 5 분동안원심분리하였다. 그플레이트의디지털이미지를수득하였다. 플랫 - 바닥의마이크로웰에 100μl 의상청액을조심스럽게트랜스퍼하고 OD 를 405 nm 에서읽었다. 스트립번호 A 음성 샘플 1 샘플 5 샘플 9 B 음성 샘플 1 샘플 5 샘플 9 C 용혈 샘플 2 샘플 6 샘플 10 D 용혈 샘플 2 샘플 6 샘플 10 E 높은양성 샘플 3 샘플 7 샘플 11 F 높은양성 샘플 3 샘플 7 샘플 11 G 낮은양성 샘플 4 샘플 8 샘플 12 H 낮은양성 샘플 4 샘플 8 샘플 12 실시예 3 뉴몰리신의용혈활성을억제하는항체능력의측정 설명 : 뉴몰리신에대한정제된항체는적혈구에서보여지는용해효과를억제할수있고, 이는항체스크리닝을위한기능적분석을대표한다. 장비 :

37 배양기 37 피펫 원심분리기 엘리사리더, BIO-TEK EL 800 디지털카메라, Canon Powershot S20 물질 : 팁스 시약접시 플레이트커버 96- 웰마이크로웰플레이트 (Nunc U-shaped) 96- 웰마이크로웰플레이트 (Nunc flat bottom) 시약 : Rec. 뉴몰리신 (PLY) 또는 Rec. 뉴몰리소이드 (PdB) PBS 에서 10 μg/ml 으로희석된 PdB Lot #P mg/ml DTT(Dithiothreitol) PBS, ph 7.4 Dem. H 2 O Alsever s Fluid 에서양적혈구 50%, SSI no 버퍼 : PBS ph mM DTT 을갖는 PBS 샘플 : 정제된항체샘플들은 PBS 에서희석되었다. 과정 : 용혈종점결정 : PLY 또는 PdB 의각새로운배치에서결정된다. 모든샘플들은 3 배로수행되었다. 대조군들은 :

38 공백 (Blank): 100 μl 버퍼 (0% 용혈 ) 전체 : 100 μl Dem. H 2 O (100% 용혈 ) PLY/PdB 의희석시리즈는 PBS w. 10 mm DTT 에서준비하였다 : ,5-1,25-0,625-0,3125 μg/ml. 각웰에 100μl 을첨가하고 37 에서 15 분동안배양하였다. 양적혈구 (50%) 는 PBS 로세번세척되고 2% vol/vol 으로복구하였다. 각웰에 50μl 을첨가하고 37 에서 30 분동안배양하였다 g 에서 5 분동안원심분리하였다. 그플레이트의디지털이미지를수득하였다. 100 μl 상청액을플랫바닥마이크로웰플레이트로트랜스퍼하고 405nm 에서읽었다. 90% 의용혈을발생하는뉴몰리신농도의두배가억제분석에서표준농도로이용되었다. 억제분석 : 모든테스트들은두번라운드 - 바텀마이크로웰플레이트에서수행되었다. 대조구들은 : 공백 (Blank)= 100 μl PBS 총용혈 = 100 μl dem. H 2 O 음성 = 50 μl 뉴몰리신 + 50 μl PBS 뉴몰리신 : 20 μg/ml = 1 μg/well 으로희석시킨 PdB mg/ml 을채웠다. PLY/PdB 는미리가열된 PBF 로희석되고 10mM DTT( 최종농도 ) 로 37 에서 15 분동안활성화시켰다. 50 μl 항체희석액이각웰에첨가되고활성화된 PLY/PdB 의 50 μl 을첨가하였다. 그플레이트는 37 에서 30 분동안배양시켰다. 양피는 PBS 로세번세척하고 2% vol/vol 으로복구되었다. 각웰에 50μl 을첨가하고 37 에서 30 분동안배양하였다 g 에서 5 분동안원심분리하였다. 그플레이트의디지털이미지를수득하였다. 상청액의 100μl 을두번째플렛바텀마이크로웰플레이트 ( 플레이트 2) 에트랜스퍼하고 405 nm( 예는표 1 에서보여진것이다 ) 에서읽었다. 역가는 50% 용혈을억제하는항체희석액으로결정하고하기표 4 에포함되었다. 샘플 : 모든정제된항체들은 PBS 에서 500 μg/ml 로희석시켰다. S1= Ra-a- 뉴몰리신 S2= OmpA17-10C S3= 22-6E S4= 26-5F S5= 26-23C S6= 26-18G S7= 26-30H S8= 28-10E

39 S9= 26-14G S10= 13-2E S11= 22-1C 플레이트구성 플레이트 1: 플레이트 2: 샘플 1 내지 11 과관련된데이터는하기표에서보여진다

40 [ 표 1] 용혈 % 는수득된데이터 ( 표 1) 로부터계산되고그결과는하기표 2 에서보여진다. [ 표 2] 억제 % 는수득된데이터 ( 표 2) 로부터계산되고그결과는하기표 3 에서보여진다

41 [ 표 3] 그결과의그래픽도해는도 5 에서나타난다. 항체의역가는상기나타난데이터에기초하여결정되었고이는하기표 4 에서요약하였다. [ 표 4] 실시예 4 항 - 뉴몰리신 HuMabs 의친화도특징 항체항원결합력측정은항원이코팅된표면에서 mabs 의한농도를흘림으로써수행하였다. 방법및물질 : 칩상에코딩된물질 : 단백질 -G 칩타입 : CM5. 칩은 2003 년 9 월 16 일자에준비하였다. 코팅밀도 : FC1 & 3 = blank, FC2= 6286 RUs, FC4 = 6700RUs 코팅농도 : 단백질농도 = 5 μg /ml, 희석버퍼 = 소듐아세테이트, ph = 4.5 런닝버퍼 : HBS-EP

42 시약 : 항체 ( 정제됨 ): 1. 4E mg/ml E mg/ml C mg/ml F mg/ml C mg/ml E mg/ml G mg/ml G mg/ml A mg/ml G mg/ml 항원 : 0.6 mg/ml, 57kDa ( 전장 w/ His-tag) 실험조건 : 캡쳐 (Ab) 농도 : 20ug/mL 농도, ul/min 흐름속도 결합시간 : 4 분. 분리시간 : 20 분. 칩의재생성 : 50mM NaOH uL/min 흐름속도의 17uL 의한번적용량 결과 : 이실험으로부터최적친화도및속도상수는하기표 1 에목록되었다. 결합과분리의첫번째몇초는친화도와속도상수를획득하기위해 1:1 랑그뮈르모델 (Langmuir model) 로맞추어졌다

43 표 1. 뉴몰리신항체의친호도와속도상수 실시예 5 항 -CD64 항 - 뉴몰리신 5-9A7 이중특이적항체의생성 HuMAbs, 항 -CD64 (88.53), 및항 - 뉴몰리신의각각의 F(ab ) 2 단편을펩신소화에의해생성하고슈퍼덱스 200 겔여과 크로마토그래피에의해균질하게정제하였다. 크기배제 HPLC 를수행하고, F(ab ) 2 단편모두의분석타입은 >95% 순수 하다 의 Fab' 단편은 MEA(mercaptoethanolamine) 로 F(ab ) 2 단편의헤피체인사이의이황화결합을조심스럽게환원 시켜생성하였다. 정확한환원조건은소규모실험에서의접합전에결정하였다. 크기배제 HPLC 를수행하고, Fab 의이타입분석은 >90% 이순수하다 의 Fab' 단편은 G-25 컬럼크로마토그래피에의해유리 MEA 로부터분리하였다. Fab' 단편은 DTNB 로배양하여 Fab-TNB 접합체를생성하였다. 항 - 뉴몰리신항체의 Fab' 단편은 MEA(mercaptoethanolamine) 로 F(ab ) 2 단편의헤피체인사이의이황화결합을조심 스럽게환원시켜생성하였다. 정확한환원조건은소규모실험에서의접합전에결정하였다. 크기배제 HPLC 를수행하고, Fab' 단편의이타입분석은 >90% 순수하다. Fab' 단편은 G-25 컬럼크로마토그래피에의해유리 MEA 로부터분리하고 Fab-TNB 와 1:1 몰랄비율로실온에서하룻밤동안혼합하였다. 이중특이적항체는슈퍼덱스 200 크리배제크로마토그래피에의해 Fab' 분자를오염시키는것으로부터정제하고, 정제된분자는 HPLC 로분석하였다

44 대조구로서, 항 -CD64 항 -CD89 이중특이적항체를생성하였다. HuMAbs, 항 -CD64 (88.53), 및항 -CD89 (14A8) 의각각의 F(ab ) 2 단편들은펩신소화로생성하고, 슈퍼덱스 200 겔여과크로마토그래피에의해균질하게정제하였다. 크기 배제 HPLC 를수행하고, F(ab ) 2 단편들의모두의이타입분석은 >95% 순수하다 의 Fab' 단편은 MEA(mercaptoethanolamine) 로 F(ab ) 2 단편의헤피체인사이의이황화결합을조심스럽게환원 시켜생성하였다. 정확한환원조건은소규모실험에서의접합전에결정하였다. 크기배제 HPLC 를수행하고, Fab 분석의이타입은 >90% 순수이다 의 Fba' 단편은 G-25 컬럼크로마토그래피에의해유리 MEA 로부터분리하였다. Fab' 단편은 DTNB 16a 및 16b 로배양하여 Fab-TNB 접합체를생성하였다. 14A8 의 Fab' 단편은 MEA(mercaptoethanolamine) 로 F(ab ) 2 단편의헤피체인사이의이황화결합을조심스럽게환원 시켜생성하였다. 정확한환원조건은소규모실험에서의접합전에결정하였다. 크기배제 HPLC 를수행하고, 14A8 Fab 분석의이타입은 >90% 순수이다. 14A8 의 Fab' 단편은 G-25 컬럼크로마토그래피에의해유리 MEA 로부터분리하고, Fab-TNB 과 1:1 몰랄비율로실온에서하룻밤동안혼합하였다. 이중특이적항체는슈퍼덱스 200 크기배제크로마토그래피에의해 Fab' 분자를오염시키는것으로부터정제하고, 정제된분자는 HPLC 분석하였다 x 14A8 이중특이적항체는거의균질하게정제되었다. 항 -CD64 항 - 뉴몰리신이중특이적항체의결합특이성의특징 - 이중특이적 ELISA 1. 엘리사플레이트는재조합뉴몰리신, 50 μl / ml, 5 μl / ml으로코딩하고, 4 에서하룻밤동안배양하였다. 2. 그플레이트는 PBS 에서 5% BSA 로차단하였다. 3. 이중특이적항체의적정을플레이트에첨가하였다. 대조구는항 -CD64 항 -CD89 이중특이적 ( 대조구이중특이적 ) 과항 -CD64 Ab, 또는항 - 뉴몰리신항체의 F(ab ) 2 단편을포함한다. 4. 그플레이트는그때인간 IgM 의 Fc 부분에연결된용해성 CD64 로구성되는융합단백질을포함하는상청액으로배양하였다. 5. 그플레이트는최종적으로알칼린포스페이트표지도니염소항 - 인간 IgM 항체로배양하였다. 양성웰은알칼린포스페이트기질로측정되었다. 항 -CD64 항 - 뉴몰리신이중특이적항체의결합특이성특징 - 인간 CD64- 트랜스제닉마우스상의 CD64 에의결합 CD64 트랜스제닉마우스또는비 - 트랜스제닉리터메이트 (littermate) 로부터혈액을취하여 항 - 뉴몰리신이중특이적항체로 30 μl / ml의농도로 30 분동안실온에서배양하였다. 그혈액은세척하여 FITC 표지된항 - 인간 IgG 항체로 30 분동안실온에서배양하였다. 적혈구는용해되고잔여백혈구는플로우사이토미트리에의해염색으로분석하였다. 임파구, 단핵세포및중성구집단에대응하는부위는게이트되고각각분석되었다. 인간 CD64 는단핵세포상에서발현되고, 더좁은범위에서, CD64 트랜스제닉마우스의중성구에서발현되었다. 인간에서처럼, CD64 는트랜스제닉마우스의임파구에의해발현되지않는다. 이중특이적항체는 CD64 트랜스제닉단핵세포및중성구에결합하지만, 비 - 트랜스제닉마우스로부터유래된임의의세포에는결합하지않는다. 실시예 6 모노클로날항체의시퀀싱

45 본발명에따른 DNA 코딩항체는항체 26-5F12.1 를위해하기기재된것처럼시퀀싱된다. 총 RNA 는 STAT60 시약 (BioGenesis) 을이용하여하이브리도마세포로부터분리되고, PCR 에서의주형으로서이용되기위해 cdna 로전환된다. 아가로스겔분석은펠릿으로부터추출된 RNA 의고수율을보여주었다 ( 도 8A). cdna 는 RNA 로부터만들어졌다. 헤비체인과라이트체인가변부위는 Amersham Biosciences 로부터의헤비프라이머및라이트프라이머믹스를이용하여증폭되었다. PCR 산물은트리스 - 아세테이트 -EDTA 아가로스겔상에서분석되었다. cdna 상의이들프라이머를이용한 PCR 은도 8B 에서보여지는밴드를주었다. PCR 산물의직접적인클로닝은약학형질전환효율성을주어, PCR 산물은겔정제되고클론되었다. PCRs 에서의양성샘플들은 TOPO TA 클로닝키트 (Invitrogen) 에서의 pcr4-topo 벡터로클로닝되었다. 정제된 V L 및 V H PCR 산물들은시퀀싱벡터로클론되고, 양성형질전환체는콜로니 PCR 에의해측정되었다 ( 도 8C). 모든양성클론들을각체인을위해수집하고 ( 보통 3 개 ) 모든순방향및역방향시퀀싱프라이머로시퀀싱되었다. 그클론들은 BigDye V3.1 DNA 시퀀싱키트 (Applied Biosystems) 로디데옥시법 (dideoxy method) 에의해시퀀싱되었다. 모노클로날항체 26-5F 12.1 의가변헤비체인을위한 5 개의정확한클론및가변라이트체인을위한 7 개의클론을동정한시퀀싱분석. 이들클론각각의 DNA 와단백질서열은하기에서보여진다. 모노클로날항체 26-5F 12.1 시퀀싱결과 26-5F 12.1 V H 클론 4 DNA 서열 AGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCACGGCTTCTGGATA 26-5F 12.1 V H 클론 4 단백질서열 V Q L Q E S G A E V K K P G A S V K V S C T A S G Y I F T S Y A I H W V R Q A P G Q R L E W Met G W I N A G Y G N T K Y S Q K F Q G R V S I T R D K S A S T A Y Met E L S S L R S E D T A V Y Y C A R R G Q Q L A F D Y W G Q G T T V T V S S 26-5F 12.1 V H 클론 3 DNA 서열 AGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCACGGCTTCTGGATA 26-5F 12.1 V H 클론 3 단백질서열 V K L Q E S G A E V K K P G A S V K V S C T A S G Y I F T S Y A I H W V R Q A P G Q R L E W Met G W I N A G Y G N T K Y S Q K F Q G R V S I T R D K S A S T A Y Met E L S S L R S E D T A V Y Y C A R R G Q Q L A F D Y W G Q G T T V T V S S 26-5F 12.1 V H 클론 6 DNA 서열 AGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCACGGCTTCTGGATA 26-5F 12.1 V H 클론 6 단백질서열 V K L Q Q S G A E V K K P G A S V K V S C T A S G Y I F T S Y A I H W V R Q A P G Q R L E W Met G W I N A G Y G N T K Y S Q K F Q G R V S I T R D K S A S T A Y Met E L S S L R S E D T A V Y Y C A R R G Q Q L A F D Y W G Q G T T V T V S

46 26-5F 12.1 V H 클론 15 DNA 서열 AGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCACGGCTTCTGGATA 26-5F 12.1 V H 클론 15 단백질서열 V K L Q Q S G A E V K K P G A S V K V S C T A S G Y I F T S Y A I H W V R Q A P G Q R L E W Met G W I N A G Y G N T K Y S Q K F Q G R V S I T R D K S A S T A Y Met E L S S L R S E D T A V Y Y C A R R G Q Q L A F D Y W G Q G T T V T V S 26-5F 12.1 V H 클론 10 DNA 서열 AGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCACGGCTTCTGGATA 26-5F 12.1 V H 클론 10 단백질서열 V K L Q E S G A E V K K P G A S V K V S C T A S G Y I F T S Y A I H W V R Q A P G Q R L E W Met G W I N A G Y G N T K Y S Q K F Q G R V S I T R D K S A S T A Y Met E L S S L R S E D T A V Y Y C A R R G Q Q L A F D Y W G Q G T T V T V S S 26-5F 12.1 V L 클론 2 DNA 서열 GACATCCAGATGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC 26-5F 12.1 V L 클론 2 단백질서열 D I Q Met T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L E P E D F A V Y Y C Q Q Y G S S P F T F G P G T K L E I K R 26-5F 12.1 V L 클론 3 DNA 서열 GACATCCAGATGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC 26-5F 12.1 V L 클론 3 단백질서열 D I Q Met T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L E P E D F A V Y Y C Q Q Y G S S P F T F G P G T K L E I K R 26-5F 12.1 V L 클론 4 DNA 서열 GACATCCAGATGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC 26-5F 12.1 V L 클론 4 단백질서열 D I Q Met T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L E P E D F A V Y Y C Q Q Y G S S P F T F G P G T K L E I K R

47 26-5F 12.1 V L 클론 5 DNA 서열 GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC 26-5F 12.1 V L 클론 5 단백질서열 D I Q Met T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L E P E D F A V Y Y C Q Q Y G S S P F T F G P G T K L E I K R 26-5F 12.1 V L 클론 6 DNA 서열 GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC 26-5F 12.1 V L 클론 6 단백질서열 D I Q Met T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L E P E D F A V Y Y C Q Q Y G S S P F T F G P G T K L E I K R 26-5F 12.1 V L 클론 10 DNA 서열 GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC 26-5F 12.1 V L 클론 10 단백질서열 D I Q Met T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L E P E D F A V Y Y C Q Q Y G S S P F T F G P G T K L E I K R 26-5F 12.1 V L 클론 12 DNA 서열 GACATCCAGATGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC 26-5F 12.1 V L 클론 12 단백질서열 D I Q Met T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L E P E D F A V Y Y C Q Q Y G S S P F T F G P G T K L E I K R 모노클로날항체 26-5F 12.1 일치서열 V H 일치단백질서열 V K L Q E S G A E V K K P G A S V K V S C T A S G Y I F T S Y A I H W V R Q A P G Q R L E W Met G W I N A G Y G N T K Y S Q K F Q G R V S I T R D K S A S T A Y Met E L S S L R S E D T A V Y Y C A R R G Q Q L A F D Y W G Q G T T V T V S S V L 일치단백질서열

48 D I Q Met T Q S P G T L S L S P G E R A T L S C R A S Q S V S S S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D R F S G S G S G T D F T L T I S R L E P E D F A V Y Y C Q Q Y G S S P F T F G P G T K L E I K R 26-5F 12.1 의가변라이트및헤비체인의서열은도 3A 에서보여지고, CDRs 의서열또한포함되어있다. 모노클로날항체 C2.2 시퀀싱분석 RNA 는상기기재된거처럼고수율로추출되었다 ( 도 9A). cdna 는 RNA 로부터생성되었다. V L 부위를증폭시키기위해준비하였던초기 PCR 반응은성공적이지못했다. 새로운프 라이머를분리된반응에서 V H 및 V L 을증폭하기위해주문하였다. 오리지널 cdna 상에서이들프라이머를이용한 PCR 은 도 9B 에서보여진 V H 및 V L 밴드를보여주었다. 정제된 V H 및 V L PCR 산물은시퀀싱벡터로클론되었고양성형질전환체는콜로니 PCR 에의해측정되었다 ( 도 9C). V H 및 V L 클론은선택하고시퀀싱하였다. 5 개의 V H 클론과 3 개의 V L 클론의서열은하기에서보여진다. 모노클로날항체 C2.2 시퀀싱결과 C2.2 V H 클론 1 DNA 서열 AGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCACGGCTTCTGGATA C2.2 V H 클론 1 아미노산서열 VKLQESGAEVKKPGASVKVSCTASGYIFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGYGNTKYSQKFQGRVSITRDKSASTAY GQGTTVTVSS C2.2 V H 클론 2 DNA 서열 AGGTGAAACTGCAGCTGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCACGGCTTCTGGATA C2.2 V H 클론 2 아미노산서열 VKLQLSGAEVKKPGASVKVSCTASGYIFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGYGNTKYSQKFQGRVSITRDKSASTAY GQGTTVNVSS C2.2 V H 클론 3 DNA 서열 AGGTCAAACTGCAGGAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCACGGCTTCTGGATA C2.2 V H 클론 3 아미노산서열 VKLQESGAEVKKPGASVKVSCTASGYIFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGYGNTKYSQKFQGRVSITRDKSASTAY GQGTTVTVSS C2.2 V H 클론 4 DNA 서열

49 AGCTCAAGCTGCAGGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCACGGCTTCTGGATA C2.2 V H 클론 4 아미노산서열 LKLQESGAEVKKPGASVKVSCTASGYIFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGYGNTKYSQKFQGRVSITRDKSASTAY GQGTTVTVSS C2.2 V H 클론 5 DNA 서열 AGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCACGGCTTCTGGATA C2.2 V H 클론 5 아미노산서열 VQLQESGAEVKKPGASVKVSCTASGYIFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGYGNTKYSQKFQGRVSITRDKSASTAY 26-23C 2.2 V L 클론 2 DNA 서열 GACATCCGGGTGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCA 26-23C 2.2 V L 클론 2 단백질서열 DIRVTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYTHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEE 26-23C 2.2 V L 클론 3 DNA 서열 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCA 26-23C 2.2 V L 클론 3 단백질서열 DIQMTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEE 26-23C 2.2 V L 클론 4 DNA 서열 GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCA 26-23C2.2 V L 클론 4 단백질서열 DIQLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEE 모노클로날항체 26-23C2.2 일치서열 V H 일치 DNA 서열 AGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCACGGCTTCTGGATA V H 일치아미노산서열 VKLQESGAEVKKPGASVKVSCTASGYIFTSYAMHWVRQAPGQRLEWMGWINAGYGNTKYSQKFQGRVSITRDKSASTAY GQGTTVTVSS

50 V L 일치 DNA 서열 GACATCCAGDTGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCA V L 일치아미노산서열 DIQLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEE 26-23C2 의가변라이트및헤비체인의서열은도 3B 에서보여지며, 여기에서 CDRs 의서열또한포함된다. 모노클로날항체 22 1C 11 시퀀싱분석 cdna 는 RNA 로부터생성된다. 모노클로날항체 DNA 의 V H 및 V L 부위를증폭시키기위한 PCR 반응은도 10A 에서보여 준밴드를보여주었다. 정제된 V H 및 V L PCR 산물은시퀀싱벡터로클론되었고, 양성형질전환체는콜로니 PCR 에의해측정되었다 ( 도 10B): 7 개의 V H 및 6 개의 V L 클론들을각체인을위해선택하고정방및역방시퀀싱프라이머모두로시퀀싱하였다. 모노클로 날항체 22-1C11 의 V H 체인을위한 5 개의정확한클론을동정한시퀀싱분석. V L 시퀀싱은퀄러티가낮았다. 또다른 6 개의클론들이선택되고총 6 개의클론들로부터일치서열을수득하기위해시퀀 싱하였다. 양성 V H 및 V L 클론을위한 DNA 및단백질서열은하기에서보여진다. 모노클로날항체 22-1C 11 시퀀싱결과 22-1C 11 V H 클론 1 DNA 서열 AGGTGCAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTAAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATT TCTCCTCA 22-1C 11 V H 클론 1 아미노산서열 : VQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQ 22-1C 11 V H 클론 2 DNA 서열 AGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGCCCAGCCTGGGAGGTCCCTAAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATT 22-1C 11 V H 클론 2 아미노산서열 : VKLQESGGGVAQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQ 22-1C 11 V H 클론 3 DNA 서열 AGGTCCAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTAAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATT TCTCCTC

51 22-1C 11 V H 클론 3 아미노산서열 VQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQ 22-1C 11 V H 클론 4 DNA 서열 AGGTCAAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTAAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATT TCTCCTCA 22-1C 11 V H 클론 4 아미노산서열 VKLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQ 22-1C 11 V H 클론 8 DNA 서열 AGGTGAAGCTGCAGGAGTCAGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTAAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATT TCTCCTCA 22-1C 11 V H 클론 8 아미노산서열 VKLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQ 22-1C 11 V L 클론 3 DNA 서열 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC GAAATCAAACGG 22-1C 11 V L 클론 3 아미노산서열 DIQMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGPGTDFTLTISSLEPEDFAV 22-1C 11 V L 클론 6 DNA 서열 ACACAGTNTCCNGCCNCCCTGTNTTNGTCTNCAGNGGAAAGANCCACCCTNTCCNGCAGGNCCAGTCANAGTGTTNGCA 낮은퀄러티의서열. 22-1C 11 V L 클론 7 DNA 서열 GACATCCAGATGACCCAGTTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCA 22-1C 11 V L 클론 7 아미노산서열 DIQMTQFQPPCLCLQGKEPPSPAGPVRVLAAT * PGTNRNLARLPGSSSMMHPTGPLASQPGSVAVGLGQTSLSPSAA * SLKILQF 22-1C 11 V L 클론 11 DNA 서열 GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTNCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCNGCAGGNCCAGTC

52 낮은퀄러티의서열. 22-1C 11 V L 클론 12 DNA 서열 GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC 22-1C 11 V L 클론 12 아미노산서열 DIQMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV 22-1C 11 V L 클론 14 DNA 서열 GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC 22-1C 11 V L 클론 14 아미노산서열 DIQMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV 모노클로날항체 22-1C 11 일치서열 V H 일치 DNA 서열 AGGTGAAACTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTAAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATT V H 일치아미노산서열 VKLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADFVKGRFTISRDNSKNTLYLQM V L 일치 DNA 서열 GACATCCAGATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTC V L 일치아미노산서열 DIQMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV 22-1C11 의가변라이트및헤비체인의서열은도 3C 에서보여지며, CDRs 의서열또한포함되어있다. 26-5F12, C2 및 22 1C11 의 CDR 서열의배열은도 11 에서보여진다. 실시예 7 에피토프의위치측정의동정 뉴몰리신의 28 아미노산잔기를대표하는 12 아미노산의뉴몰리신의합성펩타이드단편을생산하였다. 그펩타이드는적어도 8 개의아미노산잔기가이웃단편과오버랩된다. 그펩타이드는도 6 에서보여진다. 단편에결합된항체는하기기재된것처럼표준엘리사분석으로테스트되었다. 사용된모든단편은이중특이적펩타이드이다. 장비 :

53 37 에서의배양기 피펫 엘리사리더 물질 : 팁스 시약접시 플레이트커버 리액티 - 결합스트렙타비딘 HBC 코팅된 96- 웰마이크로 - 웰플레이트 (Pierce) 시약 : 토끼 -α- 인간 IgG HRP (DAKO P0214) OPD (o- 페닐렌디아민 ) 버퍼 : 세척및희석버퍼 : 0.05% 트윈 20 갖는 PBS 차단버퍼 : 2 % SMP (skimmed milk powder) 이첨가된세척버퍼 대조구 음성 : 공백 (blank) 음성 : PsaA 펩타이드 9144 비오틴 -KDPNNKEFYEKNLKEYTDKLDKLDK-NH2, 1 mg/ml 양성 : PLY 펩타이드 비오틴 -ECTGLAWEWWRT-OH, 5 mg/ml 펩타이드 : Peptide "GNT-01" 비오틴 -RECTGLAWEWWR-OH, 5 mg/ml Peptide "GNT-02" 비오틴 -IRECTGLAWEWW-OH, 5 mg/ml Peptide "GNT-03" 비오틴 -KIRECTGLAWEW-OH, 50 μg/ml Peptide "GNT-04" 비오틴 -VKIRECTGLAWE-OH, 50 μg/ml Peptide "GNT-05" 비오틴 -SVKIRECTGLAW-OH, 50 μg/ml Peptide "GNT-06" 비오틴 -LSVKIRECTGLA-OH, 50 μg/ml Peptide "GNT-061" 비오틴 -NLSVKIRECTGL-OH, 50 μg/ml Peptide "GNT-062" 비오틴 -RNLSVKIRECTG-OH, 50 μg/ml

54 Peptide "GNT-07" 비오틴 -CTGLAWEWWRTV-OH, 50 μg/ml Peptide "GNT-08" 비오틴 -TGLAWEWWRTVY-OH, 50 μg/ml Peptide "GNT-09" 비오틴 -GLAWEWWRTVYE-OH, 50 μg/ml Peptide "GNT-10" 비오틴 -LAWEWWRTVYEK-OH, 50 μg/ml Peptide "GNT-13" 비오틴 -EWWRTVYEKTDL-OH, 50 μg/ml Peptide "GNT-14" 비오틴 -WWRTVYEKTDLP-OH, 50 μg/ml 과정 코팅된플레이트는웰당세척버퍼 3 x 300μl 으로린스되었다. 모든펩타이드는 PBS 에서 2,5 μg/ml 로희석되었다. 100 μl 가웰당첨가되고, 플레이트들은실온에서 1 시간동안배양되었다. 구성은하기에서보여진다. 플레이트는웰당 3 x 200 μl 의세척버퍼로흐르듯이린스되었고, 2 % SMP 을포함하는세척버퍼로실온에서 30 분동안차단하였다. 연속적으로각웰은세척버퍼 3 x 200 μl 로린스되었다. 모든 Mabs 는 0.5 μg/ml 으로희석되고, 100 μl 이웰당첨가되고, 플레이트는 37 에서 1 시간동안배양되었다. 항체는하기에서보여지는것처럼적용되었다. 플레이트는웰당세척버퍼 2 x 200μl 을이용하여린스하였다. 두번째항체토끼 -α- 인간 IgG HRP (DAKO P0214) 은차단버퍼로 1:2000 로희석되었고, 100 μl 이각웰당첨가되었고, 그플레이트는 37 에서 30 분동안배양되었다. 각웰은세척버퍼 3 x 200 μl 로린스되고, 30 분동안 OPD 로발전하였다. 이들실험은독립적으로수행되고그결과는하기에서요약하였다. 플레이트 1 의결과의개관은도 7A 에서보여지고, 플레이트 2 의결과는도 7B 에서보여진다. 플레이트구성 ( 플레이트 1) 플레이트구성 ( 플레이트 2)

55 플레이트구성 ( 계속된플레이트 2) 양플레이트를위한항체구성

56 엘리사리딩 ( 플레이트 1) 플레이트 1 의엘리사리딩으로부터의결과개관 :

57 플레이트 2 의엘리사리딩 : 계속된플레이트 2 의엘리사리딩 : 플레이트 2 의엘리사리딩으로부터의결과개관 :

58 계속된플레이트 2: 그결과의그래픽도식은도 7A 및 7B 에서보여진다. 참고자료

59 Alexander, J.E., R.A. Lock, C.A.M. Peeter, J.T. Poolman, P.W. Andrew, T.J. Mitchell, D. Hansman, and J.C. Paton Immunization of mice with pneu molysin toxoid confers a significant degree of protection against at least nine sero-types of Streptococcus pneumoniae. Infect.Immun. 62:5683 AlonsoDeVelasco, E. Streptococcus pneumoniae: virulence factors, pathogenesis, and vaccines. Microbiol.Rev.1995.Dec. 59: Anonymous Acute respiratory infections in under fives: 15 million deaths a year. Lancet 2: Barry, A.M., R.A. Lock, D. Hansman, and J.C. Paton Contribution of autolysin to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect.Immun. 57: Benton et al Differences in virulence for mice among Streptococcus pneumoniae strains of capsular types 2, 3, 4, 5 and 6 are not attributable to differences in Pneumolysin production. Infect. Immun. 65: Bonev, B.B., Gilbert, R.J.C., Andrew, P.W. et al Structural analysis of the pro-tein/lipid complexes associated with pore formation by the bacterial toxin pneu mo lysin. J. Biol. Chem. 276(8): Camara, M., G.J. Boulnois, P.W. Andrew, and T.J. Mitchell A neuraminidase from Streptococ-cus pneumoniae has the features of a surface protein. Infect.Immun. 62: Crain MJ, et al. Pneumococcal surface protein A (PspA) is serologically highly variable and is expressed by all clinically important capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae. Infect.Immun.1990.Oct. 58: de los Toyos JR, et al. Functional analysis of pneumolysin by use of monoclonal antibodies. Infect.Immun.1996.Feb. 64: Kuo, J., M. Douglas, H.K. Ree, and A.A. Lindberg Characterization of a recombi-nant pneumolysin and its use as a protein carrier for pneumococcal type 18C conjugate vaccines. Infect.Immun. 63: Lee CJ, et al. Immunologic epitope, gene, and immunity involved in pneumococcal glyco-conjugate. Crit.Rev.Microbiol : Lock, R.A., J.C. Paton, and D. Hansman Comparative efficacy of pneumococcal neuraminidase and pneumolysin as immunogens protective against Strepto-coccus pneumoniae. Microb.Pathog. 5: Lomholdt, H Evidence of recombination and an antigenically diverse immunoglobulin A1 protease among strains of Streptococcus pneumoniae. Infect.Immun. 63: McDaniel LS, et al. Monoclonal antibodies against protease-sensitive pneumococcal anti-gens can protect mice from fatal infection with Streptococcus pneumoniae. J.Exp.Med.1984.Aug : McDaniel LS, et al. PspA, a surface protein of Streptococcus pneumoniae, is capable of eliciting protection against pneumococci of more than one capsular type. In-fect.Immun.1991.Jan. 59: Mitchell, T.J., F. Mendez, J.C. Paton, P.W. Andrew, and G.J. Boulnois Compari-son of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae type 1 and 2. Nuclei.Acids.Res. 18:4010 Musher, D.M., Mediwala, R., Phan, H.M. et al Nonspecificity of assaying for IgG antibody to pneumolysin in circulating immune complexes as a means to di-agnose pneumococcal pneumonia. Clin. Infect. Dis. 32: Paton, J.C., R.A. Lock, and D. Hansman Effect of immunization with pneumolysin on survival time of mice challenged with Streptococcus pneumoniae. In-fect.Immun. 40:

60 Paton, J.C., R.A. Lock, C.J. Lee, J.P. Li, A.M. Barry, T.J. Mitchell, P.W. Andrew, D. Hansman, and G.J. Boulnois Purification and immunogenicity of genetically obtained pneumolysin toxoids and their conjugation to Strepto-coccus pneumoniae type 19F polysaccharide. Infect.Immun. 59: Rapola, S., Jannti,V., Haikala,R., Carlone,G.M., Sampson,J.S., Briles,D.E., Paton,J.C., Takala,A.K., Kilpi,T.M., and Kayhty,H Natural development of anti-bodies to pneumococcal surface protein A, pneumococcal surface adhesin A, and pneumolysin in relation to pneumococcal carriage and acute otitis media. J.Infect.Dis. 182: Simell, B., Korkeila,M., Pursiainen,H., Kilpi,T.M., and Kayhty,H Pneumococcal carriage and otitis media induce salivary antibodies to pneumococcal sur-face adhesin A, pneumolysin, and pneumococcal surface protein A in chil-dren. J.Infect.Dis. 183: Sorensen, U.B. Pneumococcal polysaccharide antigens: capsules and C-polysaccharide. An immunochemical study. Dan.Med.Bull.1995.Feb. 42: Swiatlo, E., M.J. Crain, L.S. McDaniel, A. Brooks-Walter, T.J. Coffey, B.G. Spratt, D.A. Morrison, and D.E. Briles DNA polymorphisms and variants penicil-lin-binding proteins as evidence that relatively penicillin-resistant pneumo-cocci in Western Canada are clonally related. J.Infect.Dis. 174: Tai, S.S., T.R. Wang, and C.J. Lee Characterization of hemin binding activity of Streptococcus pneumoniae. Infect.Immun. 65:1083 Talkington DF, et al. A 43-kilodalton pneumococcal surface protein, PspA: isolation, protec-tive abilities, and structural analysis of the amino-terminal sequence. In-fect.Immun.1991.Apr. 59: 도면의간단한설명 도 1 은 Fab 단편의개략도이다. 도 2 는서열번호 11 을갖는뉴몰리신아미노산서열이다. 도 3 은항 - 뉴몰리신의라이트체인과가변단편인헤비체인이다. 도 4 는뉴모코커스 ( 폐렴연쇄구균 ) 및항체로접종된쥐를위한생존도식도이다. 도 5 는뉴몰리신항체의항용혈활성이다. 도 6 은에피토프맵핑을위한펩타이드이다. 도 7 은뉴몰리신항체에피토프의결정을위한그래픽일러스트레이션이다. 도 8 은 26-5F12 클론의분리이다. 도 9 는 C2 클론의분리이다. 도 10 은 22 1C11 의분리이다. 도 11 은 26-5F12, 26-23C2 및 22-1C11 의 CDR 서열이다. 서열목록

61 서열번호 1: 뉴몰리신의 아미노산 서열번호 2: 뉴몰리신의 아미노산 서열번호 3: 26-5F12.1 의가변라이트체인 서열번호 4: 26-5F12.1 의가변헤비체인 서열번호 5: 26-5F12.1 의 CDR 1 라이트체인 서열번호 6: 26-5F12.1 의 CDR 2 라이트체인 서열번호 7: CDR 3 light chain 26-5F12.1 서열번호 8: 26-5F12.1 의 CDR 1 헤비체인 서열번호 9: 26-5F12.1 의 CDR 2 헤비체인 서열번호 10: 26-5F12.1 및 26-23C2.2 의 CDR 3 헤비체인 서열번호 11: 뉴몰리신서열 서열번호 12: 26-23C2.2 의가변라이트체인 서열번호 13: 26-23C2.2 의가변헤비체인 서열번호 14: 26-23C2.2 의 CDR 1 라이트체인 서열번호 15: 26-23C2.2 의 CDR 2 라이트체인 서열번호 16: 26-23C2.2 의 CDR 3 라이트체인 서열번호 17: 26-23C2.2 의 CDR 1 헤비체인 서열번호 18: 26-23C2.2 의 CDR 2 헤비체인 서열번호 19: 22-1C11 의가변라이트체인 서열번호 20: 22-1C11 의가변헤비체인 서열번호 21: 22-1C11 의 CDR 1 라이트체인 서열번호 22: 22-1C11 의 CDR 2 라이트체인 서열번호 23: 22-1C11 의 CDR 3 라이트체인 서열번호 24: 22-1C11 의 CDR 1 헤비체인 서열번호 25: 22-1C11 의 CDR 2 헤비체인 서열번호 26: 22-1C11 의 CDR 3 헤비체인 도면

62 도면 1 도면

63 도면 3A

64 도면 3B

65 도면 3C 도면

66 도면

67 도면

68 도면 7A 도면 7B

69 도면

70 도면