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민 소봉
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1 1) 대한한방부인과학회지 THE JOURNAL OF ORIENTAL OBSTETRICS & GYNECOLOGY VOL.25 NO.3 : (2012) 1 대전대학교한의과대학부인과교실, 2 가천대학교한의과대학예방의학교실최경희 1, 유정은 1, 황귀서 2, 유동열 1 ABSTRACT Effects of Cordyceps militaris() on Osteoclastogenesis and Gene Expression Kyung-Hee Choi 1, Jeong-Eun Yoo 1, Gwi-Seo Hwang 2, Dong-Youl Yoo 1 1 Dept. of Oriental Gynecology, College of Oriental Medicine, Dae-Jeon University 2 Dept. of Preventive Medicine, College of Oriental Medicine, Ga-Chon University Objectives: This study was performed to evaluate effects of Cordyceps militaris() on osteoclast differentiation and its related gene expression. Methods: We used mouse myeloid cells RAW stimulated by receptor activator of nuclear factor kappa-b ligand(rankl) to induce osteoclast differentiation. There are four groups of which RAW cells are not stimulated by RANKL (Normal), stimulated by RANKL without (Control), stimulated by RANKL with 0.1 μg / ml of ( 0.1), stimulated by RANKL with 1 μg / ml of ( 1). Osteoclastogenesis was measured by counting Tartrate-resistant acid phosphatase-positive multinucleated cells [TRAP(+) MNC]. RT-PCR was performed to evaluate the inhibitory effect of on gene expression(trap, AKT1, JNK1, NFATc1, c-fos, MITF). Results: 1. decreased the number of TRAP(+) osteoclast in RANKL-stimulated RAW cell at the concentration of 0.1 μg / ml and 1 μg / ml. 2. decreased the expression of TRAP in osteoclast at the concentration of 1 μg / ml. 3. decreased the expression of AKT1, JNK1 in osteoclast at the concentration of 1 μg / ml. 4. didn t affect the expression of NFATc1, c-fos, MITF in osteoclast. Conclusions: Cordyceps militaris has inhibitory effects on osteoclast differentiation and its related gene expression. These results suggest that Cordyceps militaris has a potential as a treatment of osteoporosis. Key Words: Cordyceps militaris, Osteoclast, Osteoporosis, Osteoclastogenesis 교신저자 ( 유동열 ) : 대전시서구둔산2동 1136번지대전대둔산한방병원여성의학과전화 : 이메일 : ydy1010@dju.kr 16

2 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.25 No.3 August 2012 Ⅰ. 서론 골다공증은골형성보다골흡수가증가되어발생하는대사성골질환으로 1) 증상이없이뼈의강도를약화시켜골절의위험성을증가시키므로고령의인구가증가할수록예방과치료에대한사회적인관심이증가하고있다 2). 뼈는지속적으로조골세포에의해생성되고파골세포에의해파괴되는과정을겪게되며이과정의불균형은골질환을야기하게된다 3). 특히골파괴의중요한역할을담당하는파골세포의분화는조골세포에서발현되는파골세포분화유도인자인 Receptor activator of nuclear factor-κb ligand(rankl) 와파골전구세포에서발현되는그수용체 Receptor activator of nuclear factor-κ B(RANK) 의결합에의해시작되며이는파골세포분화에중요한전사인자인 Nuclear factor κb(nf-κb), c-fos, Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 1(NFATc1) 등의발현을증가시켜파골세포의성숙을야기한다 4). 임상적으로파골세포의분화를억제하고파골세포의기능을억제하여골흡수를줄이는치료에대표적인약물이 Bisphosphonate 계열의약물이다 5). Bisphosphonate 계열약물의주된작용은파골세포가작용하는지점에서파골세포의기능을기계적으로저해하며파골세포의세포사멸을유도하는것이다 6). 또한파골세포의분화를억제하기도한다 7). 그러나 Bisphosphonate 계열의약물은주로골다공증을가지는고령의환자에서치과적인문제를야기하는것으 로알려져최근주의가요구되고있는데하악골의괴사가가장심각한부작용이다 8). 따라서임상적사용에주의가필요하여보다안전하고효과적인골다공증치료제의개발이필요한상황으로부작용이없는천연물을통한새로운골다공증치료제를개발하기위한노력이필요할것으로사료된다. 기존에국내에서는녹용 9), 두충 10), 오미자 11), 백출 12), 목향 13), 복분자 14) 추출물이골다공증을야기하는파골세포의분화를억제한다고보고된바있다. 동충하초 (Cordyceps militaris) 는곤충의시체에자실체를내리는소형버섯류로性味가溫甘하고肺腎二經에들어가補虛損, 益精氣, 止咳化痰하는효능이있다. 또한補腎陽하는효능으로腎氣不足으로인한陽痿遺精, 腰膝痠痛을치료한다 15). 주성분은 Cordycepin 으로알려져있으며항암작용, 면역증강작용등에대한연구는보고된바있으나 16) 뼈에대한효능이나골다공증치료제로서의가능성에대해서는연구된바가없다. 이에저자는동충하초추출물의파골세포분화와파골세포기능활성화에관여하는인자들에대한효과를평가하고자 RANKL로자극한 RAW cell 이파골세포로분화하는과정에미치는영향과관련유전자인 Tartrate-resistant acid phosphatase(trap), NFATc1, c-fos, Microphthalmia-associated transcription factor(mitf), RAC-alpha serine/threonine -protein kinase(akt1), c-jun N-terminal kinase(jnk1) 의발현을측정한결과유의한성적을얻었기에이를보고하는바이다. 17

3 Ⅱ. 실험 1. 재료 1) 한약재추출및검액제조대전대학교둔산한방병원에서구입하여정선한동충하초 (Cordyceps militaris) 100 g을분말로만들어플라스크에넣은후, Methanol 500 ml를가하고 6시간이상가열하여환류추출하였다. 여과지를이용하여여과한다음, 여액을 evaporator (EYELA, Japan) 을이용하여감압농축한다음농축액을동결건조하여실험시까지냉동보관하였다. 실험시에는동충하초추출물 ( 이하 이라함 ) 을 DMSO 를이용하여배지에녹인후, pore size 0.45 μm의여과지를통과시킨후사용하였다. 2) 세포한국세포주은행에서구입한 mouse myeloid 세포주인 RAW cell 에 RANKL을처리하여유도된세포모델을사용하여실험하였다. 2. 방법 1) RAW Cell 배양 RAW cell 은 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)/10% FBS(Fetal bovine serum)/pc-sm 배지를이용하여 CO 2 세포배양기에서배양하였으며, 세포수는 cells/well 로 96 well plate를이용하여배양하였다. 24시간배양하여배양액을버린후, 10% FBS, 50 ng/ ml RANKL, 1 ng/ ml TGFβ가첨가된 a-mem 으로교환하여세포를배양하였다. 배양액에여러농도의 을첨가하였다. 2 일에한번씩동일한배지로교환해주 면서 6일간배양하였다. 2) 약물처리실험군은 RANKL 미처리군 (Normal), RANKL 처리군 (Control), RANKL 처리후 0.1 μg / ml의추출물을투여한군 ( 0.1) 과 RANKL 처리후 1 μg / ml의추출물을투여한군 ( 1) 으로구분하였다. 3) 파골세포생성측정 RANKL로 RAW cell 을파골세포로유도한후, 성숙한파골세포의발현 marker 로알려진 TRAP 17) 를염색하여 TRAP-positive 세포를확인하였다. 분화시킨세포를 PBS(Phosphate buffered saline) 로 2회세척하고, 3.7% formaldehyde -citrate-acetone 용액으로 10분고정시키고증류수로 2회세척하였다. 2% TRAP fast garnet GBC base 용액과 NaNO 3 용액을같은비율로섞어만든용액과 5% naphtha AS-BI phosphoric acid, 4% acetic acid, 2% tartaric acid를포함한용액을고정시킨세포에처리하고상온에 30분이상방치하였다. 광학현미경으로관찰하여핵이 3개이상인 TRAP-positive 한다핵세포 (TRAP(+) MNCs) 를계수하여파골세포의생성지표로하였다. 4) 파골세포유전자발현측정 (1) Total RNA 분리 RNA를분리하기위하여배양세포의배지를제거한다음, 4 PBS로 3회 washing 하였다. 세포를모은다음, 750 g 에서 10분간원심분리한후 ice cold PBS로 2회씻었다. 침전된세포에 lysis buffer를가하여용해시킨다음, 12,000 g 에서 10분간원심분리하여상층을취하였다. 다시 1M sucrose 가함유된 tris buffer 위에 loading한다음, 36,000rpm에 18

4 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.25 No.3 August 2012 서 160분간원심분리하였다. Polysome pellet을취하여 SDS buffer에녹인후, 37 에서 30분간 incubation 시켰다. Sod. Acetate buffer를가한다음, phenol/cskl 3 용액으로추출하였다. NaCl 을 0.2M이되도록가한다음, EtOH를가한후 -20 에서 12시간보관하였다. 침전물을 75% Ethanol 로 2회 washing 한다음건조시켰다. 유전자발현에필요한 RNA양을대조군과시험군에서 mrna 양이같도록조정한다음, 전기영동으로확인하여사용하였다. (2) cdna 제조대조군및시험군에서각각분리한 total RNA액 10 μl (10 μg RNA 함유 ) 에 oligo dt 1 μl (2 μg / μl ) 를넣은후조심스럽게혼합한다음, 90 o C에서 5분간 incubation하였다. Primer가 annealing 하도록실온에서약 10분간방치한후 4 o C 로유지하며다음시약을가하였다. 5 cyscript buffer 4 μl, 0.1M DTT 2 μl, dutp nucleotide mix 1 μl, dutp Cydye-labelled nucleotide 0.1 μl, Cyscript reverse transcriptase 1 μl, H 2 O 0.9 μl를첨가하여 20 μl로한후, 아주조심스럽게손으로 tipping 혼합하였다. 이후, 42 o C에서 90분간 incubation 한후, 얼음상에방치하였다. 여기에 2.5M NaOH을 2 μl씩가한후 37 o C에서 15분간 incubation 하였으며, 2M HEPES buffer(free acid) 를 10 μl가하여중화시켰다. 각각의시 약은 Amersham Bioscience에서구입하였다. (3) Real time PCR 각각의 optical tube (MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode and Optical Adhesive Films, Applied Biosystems, Cat.No ) 에 3배의 SybrGreen Mix 2.5 μl (Sigma -Aldrich, Cat.No. S9430), (2) 에서합성한 cdna 1 μl, 10 pmol / μl primer pair mix 1 μl, 각각 2.5 mm의 dntp 2 μl, 10 Tag polymerase buffer 2.5 μl, Tag Polymerase 0.3 μl와 14.7 μl H 2O를넣고, 95 o C 5 min 1 cycle, sec, 45 o C 30 sec, 72 o C 60 sec 40 cycles, 95 o C 20 min 1 cycle 로증폭시켰다. Primer는 RT-PCR에사용한것을이용하였다. PCR을마친후 tube를꺼낸다음, 반응액 5 μl를사용하여 3% agarose gel 에서 PCR specificity 를측정하고, ABI PRISM 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems, Cat.No ) 를사용하여 Real time PCR 결과를분석하였다. PCR에사용한 primer 는아래 Table 1에표시하였다. 3. 통계처리각결과는평균 ±SEM으로표시하였다. 결과에대한유의성검증은 student s t-test 를이용하였으며, 유의성은 p < 0.05 로규정하였다. 19

5 Table 1. Primer Target gene Forward (5'-3') Reverse (3'-5') TRAP ACACAGTGATGCTGTGTGGCAACTC CCAGAGGCTTCCACATATATGATGG Cathepsin K AGGCGGCTATATGACCACTG CCGAGCCAAGAGAGCATATC MMP-9 CGTCGTGATCCCCACTTACT AGAGTACTGCTTGCCCAGGA JNK1 GCCATTCTGGTAGAGGAAGTTTCTC CGCCAGTCCAAAATCAAGAATC c-fos CCAGTCAAGAGCATCAGCAA AAGTAGTGCAGCCCGGAGTA NFATc1 GGGTCAGTGTGACCGAAGAT GGAAGTCAGAAGTGGGTGGA inos CCTTGTTCAGCTACGCCTTC AAGGCCAAACACAGCATACC MITF GGAACAGCAACGAGCTAAGG TGATGATCCGATTCACCAGA b-actin TCACCCACACTCTGCCCAT TCCTTAATGTCACGCACCATTT AKT1 CCTGGACTACTTGCACTCCGAG GATCAGGCGGCGTGATGGTGATC Ⅲ. 결과 1. 파골세포생성에미치는영향실험결과 RANKL을처리하지않은정상군의세포분화는거의일어나지않았으며, RANKL을처리한대조군은 TRAP(+) MNC의생성이정상군에비해유의성있게증가하여파골세포로의분화가확인되었다. 동충하초추출물 ( 이하 ) 은 0.1 μg / ml의농도에서대조군에비해 TRAP(+) MNC가유의성 (p<0.05) 있게감소 ( 약 35.4%) 하였고, 1 μg / ml의농도에서도대조군에비해유의성 (p<0.01) 있게감소 ( 약 42.1%) 하였다 (Fig. 1). 1 : RANKL(50 ng/ ml ) + 1 μg / ml of # : p<0.05 vs Control ## : p<0.01 vs Control 2. TRAP 유전자발현에미치는영향 실험결과, 은 1 μg / ml농도에서대조군에비해 TRAP 유전자발현을유의성 (p<0.01) 있게억제하였다 (Fig. 2). Fig. 1. Effects of on the Formation of TRAP(+) MNCs in RANKL Stimulated Osteoclast. Fig. 2. Effects of on the Expression of TRAP in RANKL Stimulated Osteoclast. 1 : RANKL(50 ng/ ml ) + 1 μg / ml of ## : p<0.01 vs Control 20

The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.25 No.3 August 2012 3. NFATc1 발현에미치는영향실험결과, 을처리한경우대조군에비해 NFATc1 발현에영향을주지못하였다 (Fig. 3). 1 : RANKL(50 ng/ ml ) + 1 μg / ml of 5.

1 : RANKL(50 ng/ ml ) + 1 μg / ml of 4. c-fos 발현에미치는영향 실험결과, 은 1 μg / ml의농도에서대조군에비해 c-fos의발현을감소시켰으나유의성은없었다 (Fig. 4). Fig. 5.

6 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.25 No.3 August NFATc1 발현에미치는영향실험결과, 을처리한경우대조군에비해 NFATc1 발현에영향을주지못하였다 (Fig. 3). 1 : RANKL(50 ng/ ml ) + 1 μg / ml of 5. AKT1 발현에미치는영향 실험결과, 은 1 μg / ml의농도에서대조군에비해 AKT1 유전자발현을유의성 (p<0.05) 있게억제하였다 (Fig. 5). Fig. 3. Effects of on the Expression of NFATc1 in RANKL Stimulated Osteoclast. 1 : RANKL(50 ng/ ml ) + 1 μg / ml of 4. c-fos 발현에미치는영향 실험결과, 은 1 μg / ml의농도에서대조군에비해 c-fos의발현을감소시켰으나유의성은없었다 (Fig. 4). Fig. 5. Effects of on the Expression of AKT1 in RANKL stimulated Osteoclast. 1 : RANKL(50 ng/ ml ) + 1 μg / ml of # : p<0.05 vs Control 6. JNK1 발현에미치는영향 실험결과, 은 1 μg / ml의농도에서대조군에비해 JNK1의발현을유의성 (p<0.05) 있게억제하였다 (Fig. 6). Fig. 4. Effects of on the Expression of c-fos in RANKL Stimulated Osteoclast. 21

7 Ⅳ. 고찰 Fig. 6. Effects of on the Expression of JNK1 in RANKL Stimulated Osteoclast. 1 : RANKL(50 ng/ ml ) + 1 μg / ml of # : p<0.05 vs Control 7. MITF 발현에미치는영향 실험결과, 을처리한경우대조군에비해 MITF 발현을감소시켰으나유의성은없었다 (Fig. 7). Fig. 7. Effects of on the Expression of MITF in RANKL Stimulated Osteoclast. 1 : RANKL(50 ng/ ml ) + 1 μg / ml of 골다공증은골형성보다골흡수가증가되어발생하는대사성골질환으로 1) 그주된증상은요부동통, 척추기형, 身長의감소, 골절등이며원인으로는내분비, 영양, 물리및유전학적인자들이관여하고있다 18-20). 특히폐경기이후여성은호르몬결핍으로인해빠른골소실이발생하여 30% 정도에서적어도한번이상의골다공증에의한골절을경험한다고보고된바있고, 그빈도는나이가들수록증가된다고한다 21). 임상적으로골다공증을치료하는약물인 Bisphosphonate 계열의약물은주로파골세포로의분화를억제하고이미성숙한파골세포의기능을억제하는작용을한다 6). 그러나이약물은환자의치료에가장많이사용되는약물임에도불구하고식도염이나하악골의무혈성괴사로인한부작용등이있어사용시제한이있으며 22), 이로인해골다공증치료에효과있는천연물의발견이필요할것으로사료된다. 동충하초 (Cordyceps militaris) 란겨울기간동안곤충의체내에서식하면서양분을흡수하여숙주를파괴시킨후, 여름이되면곤충의몸밖으로식물체가자라나는모습에서그명칭이유래되었다. 즉, 동충하초균의포자또는균사가곤충또는균핵에침입하여기주안에내생균핵을만든다음, 밖으로자실체를형성하는것이바로동충하초버섯이다. 식물분류체계상동충하초는자낭균강 (Ascomycota), 맥각균목 (Clavicipitales), 맥각균과 (Clavicipitaceae) 에속하며 22

8 The Journal of Oriental Obstetrics & Gynecology Vol.25 No.3 August 2012 Cordyceps, Podonectria, Torrubiella 등의세가지종이있는데, 그중대표적인것이 Cordyceps 종이다 23). 예로부터약용으로알려진동충하초는 Cordyceps sinensis이며, 그외에도 C. militaris, C. sobolifera, C. ophioglossoides, C. martilis, C. hawkesii, C. beauveria, C. bassiana, C. cicade 등이알려져있다 24). 이중 Cordyceps militaris는 Cordyceps 속균특유의생리활성물질인 Cordycepin 성분을다량함유하고, 항균, 항암, 면역기능증강등의효능을나타내는것으로알려져있다 16). 동충하초는性味가溫甘하고肺腎二經에들어가補虛損, 益精氣, 止咳化痰하는효능이있으며腎陽을補하여腎氣不足으로인한陽痿遺精, 腰膝痠痛을치료한다 15) 고하였다. 동충하초가항균, 항암, 면역기능증강에효능을나타내는것으로보고된바있으나 25), 골다공증치료에대한연구는아직접하지못하였다. 이에저자는 Cordyceps militaris 추출물을사용하여파골세포의분화와기능활성화에관여하는인자들에대한효과를연구하였다. 골다공증은조골세포의골생성과파골세포의골흡수작용의항상성이깨져파골세포에의한골흡수가많아져서유발된다 5). 파골세포는조혈모세포에서유래되는다핵형세포이며대식세포계의세포로파골세포의분화는병적인골소실의주된원인이된다 26). 파골세포의분화는여러가지자극인자를통한 RANKL의발현및작용이매우중요한데 RANKL 은 Tumor necrosis factor(tnf) 계열의싸이토카인으로, 전 구세포에서발현되는 RANK와 RANKL 의결합은파골세포의분화에필수적인인자이다 27). RANK는 Tumor necrosis factor receptor(tnfr) superfamily의일종으로파골전구세포에서발현되며 RANKL의신호에의해활성화된다 28). RANK와 RANKL 의결합으로 JNK, p38, Extracellular signal-regulated kinase(erk) 등을포함한 Mitogen-activated protein kinase(mapk) 신호전달경로가활성화되며파골세포분화에필수적인 NF-κB, c-fos, NFATc1, MITF, AKT1와같은전사인자가유도된다 29). TRAP는성숙한파골세포에서발현하는것으로 TRAP 양성세포는파골세포로의분화여부를판단하는기준으로이용될수있다 17). 이를이용하여본연구에서는 TRAP 양성인다핵세포를계수하여동충하초추출물이 0.1 μg / ml와 1 μg / ml의농도에서모두파골세포의생성을억제시키는것을확인하였다 (Fig. 1). TRAP는골의흡수에관여하고있어파골세포의활성화로인한골흡수과정은세포에서발현되는 TRAP의 mrna 유전자발현을지표로삼아측정하였다 17). 실험결과동충하초추출물은 1 μg / ml의농도에서 TRAP 발현을유의성 (p<0.01) 있게억제하여동충하초추출물이파골세포기능에관여하는유전자에억제효과가있음을확인하였다 (Fig. 2). 파골세포의분화를유도하는핵심전사인자는 c-fos와 NFATc1이다. c-fos와 Calmodulin activated kinases (CaMKs) 신호전달체계에의해 NFATc1 발현이증가하게되며이는파골세포분화의주된기전이다 30). 실험결과, 동충하초추출물은 NFATc1 발현에는영향을주지 23

9 못하였다 (Fig. 3). 또한 1 μg / ml의농도에서 c-fos의발현을감소시켰으나유의성은없었다 (Fig. 4). AKT1은 c-src, PI3K 활성화를통해발현되는인자로동충하초추출물 1 μg / ml처리시 AKT1 유전자발현이유의성 (p<0.05) 있게억제되었으며, 0.1 μg / ml처리시에는유의한효과를나타내지못하였다 (Fig. 5). MAPK 신호전달경로는 p38, JNK, ERK 등을포함하는데 p38 활성화가파골세포분화에있어서중요한중간단계임이알려져있으며이외에 JNK도파골세포의분화와생존에중요한역할을하는것으로밝혀져있다 31). 실험결과, 동충하초추출물 1 μg / ml처리시 JNK1 의발현이유의성 (p<0.05) 있게억제되었으며 0.1 μg / ml처리시에는유의한효과를나타내지못하였다 (Fig. 6). TNF receptor associated factors(traf), TAK1, MKK6, p38의활성화등일련의신호전달과정을거쳐활성화되는인자인 MITF는파골세포의분화를촉진하는작용이있다 32). 실험결과, 동충하초추출물은 MITF 발현을감소시켰으나유의성은없었다 (Fig. 7). 이상의실험결과동충하초추출물이파골세포분화를억제하는효과가있었으나, NFATc1, c-fos, MITF와같은전사인자들에는영향을주지못하였으며 1 μg / ml의농도에서 TRAP, AKT1 인자의발현을억제하였음을확인할수있었고, JNK1 발현을농도의존적으로억제하여 MAPK 신호전달경로를억제하는효과가있음을알수있었다. 즉, 동충하초추출물은파골세포의분화를억제하는데있어세포분화기전중전사인자 인 NFATc1, c-fos는억제하지못하였으나세포의성장과분화에또다른중요한역할을하는 MAPK 신호전달경로를억제하였다. 따라서동충하초는파골세포의분화와분화를촉진하는신호전달경로를억제하는기능이있어골다공증의치료약물로사용할수있을것으로사료된다. V. 결론 동충하초추출물 () 이파골세포의분화및활성을억제하여골의재흡수를억제하는지를평가하기위하여 RANKL 유도파골세포분화에미치는영향을측정하였으며, 관련인자들의유전자발현에미치는영향을측정하여다음과같은결과를얻었다. 1. 동충하초추출물은 TRAP(+) MNCs 생성을억제하였다. 2. 동충하초추출물은파골세포에서 TRAP 의발현을억제하였다. 3. 동충하초추출물은파골세포에서 AKT1, JNK1의발현을억제하였다. 4. 동충하초추출물은파골세포에서 NFATc1, c-fos, MITF 발현에영향을주지못하였다. 투고일 : 2012년 07월 23일 심사일 : 2012년 08월 08일 게재확정일 : 2012년 08월 16일 참고문헌 1. 해리슨번역편찬위원회. Harrison's 내 24

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를