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채홍 순
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1 한국환경분석학회지제 11 권 ( 제 2 호 ) 119~129, 2008 J. of the Korean Society for Environmental Analysis 고체상미량추출법 (SPME-GC/FID) 에서실험계획법을이용한 NDMA(N-Nitrosodimethylamine) 미량분석의최적조건 이시진 경기대학교환경공학과 Optimization Condition of Trace Analysis of NDMA(N- Nitrosodimethylamine) Using the Design of Experiment (DOE) in Solid-Phase Microextraction with GC/FID Si-Jin Lee Dept. of Environmental Engineering, Kyonggi University, Suwon City, Korea Chlorine disinfection of secondary wastewater effluent and drinking water can result in the production of the potent carcinogen N-Nitrosodimethylamine(NDMA) at the lower concentration ranges. Because of increasing concern of presence of NDMA in water, effective analytical method to determine NDMA should be developed. In this study, we have investigated to determine optimal condition for the analysis of NDMA using a statistical methodology. The existing single-dimentional search is laborious, time consuming, and incapable of reaching the true optimum due to neglecting of the interaction among variables. to resolve this problem, RSM(Response Surface Method) has been proposed to determine the individual factors and their interactive influence. RSM is a statistical technique for designing experiment, building models, evaluating the effects of several factors and searching optimum conditions for desirable responses and reducing number of experiments. The analysis of NDMA and by-products using SPME(Solid Phase Micro-extraction) technique with GC-FID. Key words: SPME, GC/FID, NDMA, DMA, RSM(Response Surface Method) 1. 서론 NDMA(N-Nitrosodimethylamine) 는인체에매우위해한발암물질로분류되고있으며, 최근상수원에서도검출되고있으며, 인체의위해도는 trihalomethane (THM) 보다훨씬심각한것으로알려지고있다. 이에따라미국에서는 NDMA가지하수및기존먹는물인상수원에서의검출로인한대책마련을하고있으며, 인체의위해성을감안하여수질기준을 ppt(ng/l) 로매우엄격하게규제하기시작하고있다. 우리나라에서는아직규제대상물질이아니나, 이에대한규제대책이필요한시점에서 NDMA의분석기술개발이시급하다. 1,2) 본연구에서는 NDMA 분석의최적조건을 연구하기위하여통계적기법을사용하였다. 기존의일차원적연구는시간소요및상호작용등을고려하는진정한최적값으로의접근에어려움이있다. 이러한문제점을해결하기위하여, 반응표면분석법 (RSM; Response Surface Method) 을사용하여독립인자들의영향과상호영향을규명하였다. RSM은실험계획에사용되는통계적기법으로모델을설계하고각각의인자들에의한영향을평가하며바람직한반응을위한최적조건도출이가능하다. 또한실험의수를줄이는경제적인방법이다. 3,4) 본연구에서의 NDMA 및 NDMA 부산물에대한분석은 SPME(Solid Phase Microextraction) 를사용하여 GC-FID에서이루어졌다. To whom correspondence should be addressed.

2 120 이시진 2. 이론및실험방법 2.1. SPME의기본이론반휘발성물질은 liquid-liquid 추출법과고체상추출법을사용한다. 하지만이러한추출법은효과적이지만어떤물질들은대상물질의분석에서는분석물질의손실등의제한적인요인들이발생하게된다. 예를들어 Headspace법은 liquid-liquid 추출법에비하여추출률이낮으므로분석을위해서는시료의농도가높고휘발성이높아야한다. 또한, purge and trap법은시료분석시오염이쉽게되며경제적으로고가라는단점을가지고있으며, liquid-liquid 추출법은많은양의시료와다량의용매를소모하므로환경오염을유발시키는역효과를초래할수있다. 고체상추출법또한시료매질과분석물에따른상호반응의영향으로추출률이낮고시료속에있는고체와기름성분은고체상표면에막을형성하게되므로흡착을방해하게된다. 이러한단점을보완하기위한새로운분석방법으로조작이용이하고값이저렴하며, 용매를사용하지않으면서쉽게자동화할수있는것으로알려진방법이바로 1990 년 Pawliszyn 등이개발한 SPME(Solid-Phase Microextraction) 기법으로, 이는기체나액체시료에서의분배계수에의한평형분배에의한추출방법이다. 5) SPME 의추출기법은시료와수착섬유사이에서분석물의분배과정과수착섬유에농축된분석물을분석기기 (GC나 HPLC) 에서탈착하는과정으로되어있다. SPME의경우분석시시료의전처리가매우중요하며이과정이 경제성과효율성및선택성, 시료에대한적응성을가질수있는방법을선정해야한다. 6,7) SPME를사용한기본적인흡착방법은 Direct extraction, Headspace configuration, 그리고 Membrane protection approach 가있다. 이방법들을적용함에있어서는물질의헨리상수에따른휘발성에영향을받는다. NDMA의경우헨리상수가 Table 1에서보는바와같이 atm m 3 /mol으로반휘발성물질로분류되기때문에본연구에서는 Direct extraction을적용하기로하였다. Direct extraction은 Fiber를시료에직접넣어서분석물이흡착되는방법으로빠른분석에용이한방법이다. 최적의추출율을얻기위하여 Agitation 의적용시에는빠른샘플유입이나, Fiber 나 Vial의빠른움직임, 또는보통 Agitation이나 Sonication을통해이를만족시킬수있다. Agitation에의해빠른평형을유지하는것은 Depletion zone 에의한영향을감소시키는데필수적인사항이다 표준물제조및전처리방법 NDMA의분석을위해가장중요한것중의하나가시료의전처리이다. 본연구에서는 direct extraction기법을사용하기위하여 120 ml amber serum bottle을이용하여 bottle내에수용액 100 ml를 0.05 ppm의농도로제작하였다 분석방법본연구에서는 Agilent사의 Agilent 6890N Plus Table 1. Physicochemical properties of NDMA, DMA, and DMF property NDMA DMA DMF Molecular weight Vapor pressure 2.7 mmhg 1520 mmhg 3.87 mmhg Solubility mg/l mg/l mg/l Henry's constant atm m 3/ mole atm m 3/ mole atm m 3/ mole Table 2. GC/FID operating parameters Class Condition Gas Chromatograph system Agilent 6890N Gas Chromatograph Detector FID (flame ionization detector) Column HP-5 (5% Phenyl Methyl Siloxane, Capillary, 50.0 m 200 µm 0.33 µm film) Carrier gas Nitrogen 1 ml/min Injection port system splitless mode Injector Temp. 280 o C Detector Temp. 300 o C Oven Temp. 40 o C for 1 min, 5 o C/min to 120 o C, held 3 min

3 고체상미량추출법 (SPME-GC/FID) 에서실험계획법을이용한 NDMA(N-Nitrosodimethylamine) 미량분석의최적조건 Gas Chromatograph system을사용하였으며, 검출기는 FID(Flame ionization detector) 를사용하였다. 분석에사용된 column은 Agilent 사의 HP-5를사용하였고, 컬럼의길이는 50 m이며내경은 0.2 mm이고 column의두께는 0.33를사용하였다. 운반기체로 (carrier gas) 는초고순도 (99.999%) 의질소를사용하였다. SPME 장치는 Supelco사의 SPME manual holder를사용했으며, fiber 역시 Supelco 사의 fiber를사용하였다. GC의분석조건은 Table 2에나타낸것과같이운반기체로는질소를유속 1 ml/min로조절하여사용하였고 makeup 기체는 30 ml/min으로조절하고컬럼의온도는초기 40 o C에서 1 min을유지하다가 5 o C/min으로승온하여 120 o C에서다시 3 min간유지하였다. 시료주입구와검출부의온도는 280 o C와 300 o C로하였다. NDMA, DMA, DMF 시약은 Sigma-Aldrich사의제품을사용하였다. amber serum bottle은 aluminium cap과 silicone/ptff septum를사용하여밀봉한후상온에서혼합하여실험하였다. 교반기는 Changsin scientific co. 사의 model number C-SK-6 Shaker를사용하여상온에서 110 rpm으로조절하여실험하였다. 또한모든시료의 ph는 7로고정하여사용하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 측정자료에대한기술통계량분석 Table 4의결과를이용하여기술통계량분석을 Fig. 1에제시하였다. 총 20번의실험이수행된결과로부터실측데이터에대한분포의중심을나타내는중심경향성, 분포의퍼진정도를나타내는산포도, 분포의모양을나타내는분포등으로나누어분석하였다. 우선 Fig. 2(a) 에서분석측정된실측데이터들의분포가정규분포를따르는지여부를판단하기위해히스토그램에서각측정자료의결과에대한빈도수와관계를정규분포곡선 (Anderson-Darling 정규성검정 ) 을통해얻은결과 4개물질모두의 p-value값이유의수준 (a) 보다커정규분포를따랐다 (p-value>0.05). 또한제3사분위수 (Q 3 ) 에서제1사분위수 (Q 1 ) 를뺀값사분위수 (IQR : Inter-Quaetile Range) 를이용하여측정된데이터가어떠한분포를이루고있는지를판단하기위해상자도표 (boxplot) 을제시하였다. 그결과 Y 3 (DMF) 에서특이치를나타내는극단값 ( 이상값 ) 이나타난것을제외한모든자료들이비교적대칭적으로중위수 (median) 선이 IQR상자의중간에위치하고있는것을확인할수있었다. 마지막으로 95% 신뢰구간을사용하여중위수와평균의데이터에대한위치와변동을제시하였다. 데이터가대칭이면중심위치의측도 ( 평균및중위수 ) 는거의같게되는게보통인데본연구결과상자도표에서제시되었던관측치로인하여중위수와평균의신뢰구간이차이가있음이확인되었다. Fig. 1(b) 는 4가지요인에대한각요인별수준범위에대한각물질의분석특성을파악하고각요인별실험결과들의추세가선형인지비선형인지를 2차원적으로제시하였다. Fig. 1(b) 의결과로부터 Y 1 (NDMA) 의경우요인 X 1 (time), X 2 (temp.) 은선형 (linear) 적패턴을보여주고있으며, 나머지요인들은비선형적 (non-linear) 패턴을보여주고있다. Y 2 (DMA), Y 3 (DMF) 의경우는모든요인들이비선형적 (non-linear) 패턴을보여주고있는것을확인할수있었다 요인분석각물질 (Y 1 (NDMA), Y 2 (DMA), Y 3 (DMF)) 에대한요인들에대한영향들을조사하기위해정규확률및 Pareto plot을분석한결과를다음 Fig. 3에제시하였다. Fig. 2(a) 에서보여지는것과같이 Y 1 (NDMA) 은 A(X 1 : Adsorption time), B(X 2 : Temp.), D(X 4 : Sonication time), AB(X 1 *X 2 ), AC(X 1 *X 3 ), CD(X 3 *X 4 ), ABD(X 1 *X 2 *X 4 ), ABCD(X 1 *X 2 *X 3 *X 4 ) 등의작용이 p-value값이 0.05보다작아유의한것으로나타났고, 나머지요인들은유의하지않은것으로나타났다. 유의하지않은요인들은중앙의직선과멀리떨어져있지않고몰려있어요인의수준이변해도반응값이별로변하지않는다는의미이다. 따라서 Y 1 (NDMA) 에서는 A(X 1 : Adsorption time), B(X 2 : Temp.) 에의한영향이가장큰기여를하는것으로판단할수있다. 이것은 Pareto plot에서도확인할수있듯이막대그림이가장긴것이가장큰기여를한다고판단할수있다. 이는분배계수를변화시킴으로서시료가 fiber에수착되는양을증가시킬수있는실험인자로서추출시추출시간과온도가크게작용을한다고볼수있다. Y 2 (DMA), Y 3 (DMF) 도 Y 1 (NDMA) 에대한요인분석결과와같이분석할수있다 반응표면분석에의해수행된반응모델추정완전요인설계에따라각물질의분석특성에대한반응모델을나타내면다음식 (1)~(6) 과같다. 식 (1), (3), (5) 은변수를코드화시켜추정된모델이며, 식 (2),

4 122 이시진 Fig. 1. Descriptive statistics and comparison of measured data based on from the Table 4. (a) Normality distribution test of NDMA, DMA and DMF, (b) The effect of detecting NDMA, DMA and DMF by each factor.

5 고체상미량추출법 (SPME-GC/FID) 에서실험계획법을이용한 NDMA(N-Nitrosodimethylamine) 미량분석의최적조건 Table 3. Design of experiment (DOE) on the SPME/GC analysis Run Block Coded factor Uncoded factor Response(Y 1 ) Comment X 1 X 2 X 3 X 4 X 1 X 2 X 3 X 4 Measured Predicted Center-full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Center-full factorial Full factorial Center-full factorial Full factorial Full factorial Center-full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Run Block Coded factor Uncoded factor Response(Y 2 ) Comment X 1 X 2 X 3 X 4 X 1 X 2 X 3 X 4 Measured Predicted Center-full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Center-full factorial Full factorial Center-full factorial Full factorial Full factorial Center-full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial

6 124 이시진 Table 3. Contined Run Block Coded factor Uncoded factor Response(Y 3 ) Comment X 1 X 2 X 3 X 4 X 1 X 2 X 3 X 4 Measured Predicted Center-full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Center-full factorial Full factorial Center-full factorial Full factorial Full factorial Center-full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial Full factorial (4), (6) 는원래변수대로코드화시키지않은모델식이다. Parameter estimate from coded data Y = X X X X X 1 X X 1 X X 1 X X 2 X X 2 X X 3 X X 1 X 2 X X 1 X 2 X X 1 X 3 X X 2 X 3 X 4-4.0X 1 X 2 X 3 X 4 (1) Y = X X X X X 1 X X 1 X X 1 X X 2 X X 2 X X 3 X X 1 X 2 X X 1 X 2 X X 1 X 3 X X 2 X 3 X X 1 X 2 X 3 X 4 (3) Y = X 1 +3X X X X 1 X X 1 X X 1 X X 2 X 3-2.0X 2 X X 3 X X 1 X 2 X X 1 X 2 X X 1 X 3 X X 2 X 3 X X 1 X 2 X 3 X 4 (5) Parameter estimate from uncoded data Y = X X X X X 1 X X 1 X X 1 X X 2 X X 2 X X 3 X X 1 X 2 X X 1 X 2 X X 1 X 3 X X 2 X 3 X E - 5X 1 X 2 X 3 X 4 (2) Y = X X X X X 1 X X 1 X X 1 X X 2 X X 2 X X 3 X X 1 X 2 X X 1 X 2 X X 2 X 3 X E -5X 1 X 2 X 3 X 4 (4) Y = X X X X X 1 X X 1 X X 1 X X 2 X X 2 X X 3 X E -4X 1 X 2 X E - 4X 1 X 2 X X 1 X 3 X X 2 X 3 X E - 5X 1 X 2 X 3 X 4 (6) 상기반응분석법에의해도출된 Model의 ANOVA 결과를보면 Table 3과같다. Table 3에서의수치는각각의요인이측정치에어떻게영향을주는가를의미한다. 회귀모형을설명할수있는결정계수 R 2 값은 Y 1 ~Y 3 각각 0.99, 0.98, 0.97으로종속변수의 99%, 98%, 97% 를설명이가능한매우높은상관관계를보였다. 또한 Y 1 (NDMA) 의주효과 (main effect) 를나타

7 고체상미량추출법(SPME-GC/FID)에서 실험계획법을 이용한 NDMA(N-Nitrosodimethylamine) 미량분석의 최적조건 Fig. 2. Normal probability plot of the standardized effects and pareto chart of the standardized effects for Y1(NDMA). Y2(DMA), Y3(DMF). (a) Normal probability plot, (b) Pareto chart.

8 126 이시진 Table 4. Analysis of variance for Y 1 (NDMA). Y 2 (DMA), Y 3 (DMF) (coded units) Source DF a) Seq SS b) Adj SS Adj MS F c) P d) Main Effects Way Way Way Residual Error Lack of Fit Pure Error Total Source DF a) Seq SS b) Adj SS Adj MS F c) P d) Main Effects Way Way Way Residual Error Lack of Fit Pure Error Total Source DF a) Seq SS b) Adj SS Adj MS F c) P d) Main Effects Way Way Way Residual Error Lack of Fit Pure Error Total a) DF : Degree of freedom Seq SS : Sum of squares F Value : MSR/MSE d) The p-value defined as the smallest level of significance leading to rejection of the null hypothesis 내는항과 2원, 3원, 4원상호작용을나타내는항모두유의수준 (a) 5% 보다낮아유의하고, Y 2 (DMA) 는주효과 (main effect) 를나타내는항만유의수준 (a) 5% 보다낮아유의하고, Y 3 (DMF) 은주효과 (main effect) 를나타내는항과 2원, 4원상호작용을나타내는항만이유의수준 (a) 5% 보다낮아유의하였다. 따라서이와같이유의한인자들이위의식에유의하게기여하는것으로나타났다 반응모델의인자들의주효과및교호작용해석 Table 5는측정치에대한각각의인자들이주는효과및인자들의교호작용효과를제시하였다. Table 5에서보여주는효과 (effect) 는인자의각수준 (high level, low level) 에서얻어진측정치평균의차이를보여주며 특히, effect에대한음 (-) 의값은인자의수준이높아질수록측정치가낮은값을보여주고있음을의미한다. 또한가설검정을통해각각인자의통계적유의성을통해전체주효과항, 2원, 3원, 4원상호작용의항등이모델에어떤기여를하는지를확인할수있다. Table 4에서는각항별로전체에대한해석을제시하였고, Table 5는해당항별인자에대한유의성및효과를분석하여제시하였다. 일단주효과 (main effect) 를나타내는요인의효과에서 Y 1 (NDMA). Y 2 (DMA) 는 X 1 (Adsorption time), X 2 (Temp.) 와 X 4 (Sonication time) 가유의하였고 (p<0.05), Y 3 (DMF) 는 X 1 (Adsorption time), X 2 (Temp.) 가통계적으로유의하였고나머지요인은유의하지않았다. Table 5에서 Factor effect의값이클수록주효과 (main effect) 에큰영향을주는

9 고체상미량추출법 (SPME-GC/FID) 에서실험계획법을이용한 NDMA(N-Nitrosodimethylamine) 미량분석의최적조건 Table 5. Estimated Factor effects for Y 1 (NDMA). Y 2 (DMA), Y 3 (DMF) (coded units) Source Term Factor Effect P Significance a) Effect b) Main Effect 2-Way 3-Way X (+)S X (+)S X (-)A X (+)S X 1 X (+)S X 1 X (+)S X 1 X (-)A X 2 X (-)A X 2 X (-)A X 3 X (+)S X 1 X 2 X (-)A X 1 X 2 X (+)S X 1 X 3 X (-)A X 2 X 3 X (-)A 4-Way X 1 X 2 X 3 X (+)S Source Term Factor Effect P Significance a) Effect b) Main Effect 2-Way 3-Way X (+)S X (+)S X (-)A X (+)S X 1 X (-)A X 1 X (-)A X 1 X (-)A X 2 X (-)A X 2 X (-)A X 3 X (-)A X 1 X 2 X (-)A X 1 X 2 X (-)A X 1 X 3 X (-)A X 2 X 3 X (-)A 4-Way X 1 X 2 X 3 X (-)A Source Term Factor Effect P Significance a) Effect b) Main Effect 2-Way 3-Way X (+)S X (+)S X (-)A X (-)A X 1 X (-)A X 1 X (-)A X 1 X (-)A X 2 X (+)S X 2 X (-)A X 3 X (+)S X 1 X 2 X (-)A X 1 X 2 X (-)A X 1 X 3 X (-)A X 2 X 3 X (-)A 4-Way X 1 X 2 X 3 X (+)S a) Indicates that the term was significant at 5% (p-value) b) (+) : Synergistic effect in factor effect (-) : Antagonistic effect in factor effect

10 128 이시진 Fig. 3. Main effect (a) and interaction (b) plot for Y 1 (NDMA). Y 2 (DMA), Y 3 (DMF).

11 고체상미량추출법 (SPME-GC/FID) 에서실험계획법을이용한 NDMA(N-Nitrosodimethylamine) 미량분석의최적조건 것으로확인할수있었다. 2원, 3원, 4원상호작용의효과 (2-way interaction, 3-way interaction, 4-way interaction) 를나타내는각요인의기여도및유의성검정을분석하면, Table 5의 p-value값에서볼수있듯이 p-value값이 0.05보다작으면그요인은통계적으로유의하고각효과에영향을주는것으로확인할수있었다. Table 5의결과를토대로데이터의평균또는다수의요인을가질때의최소제곱평균을 Fig. 3(a) 처럼그려주효과 (main effect) 의수준 (level) 변경에따른선형효과의기여도판단을제시하였다. 각물질모두에대한요인의수준을낮은값에서높은값으로변경했을때상승, 하강하는것을확인할수있었다. 그리고각직선의기울기가클수록반응인자 (Y 1 (NDMA). Y 2 (DMA), Y 3 (DMF)) 에더큰영향을주는것을확인할수있었다. 실험요인의상호작용에의한반응모델에어떤영향을주는지를확인하기위해 Fig. 3(b) 를그려기여도판단을제시하였다. 즉상호작용 ( 교호작용 ) 은인자의수준에있어서의반응치가다른인자의수준에달려있음을말하며그림에서 2개의인자에서각각의수준이평행선인경우인자간에상호작용이없는것으로판단할수있다. 1) 시료검출의위한여러가지변수들간의요인분석결과정규확률및 Pareto plot을통해 NDMA, DMA, DMF의경우공통적으로 Adsorption time과 Temperature의주효과 (main. effect) 가 p-valur < 0.05로유의하여반응모델결과에가장기여율이큰것으로확인되었다. 2) NDMA, DMA, DMF에대한 SPME법에의한 GC/ FID 조건에서시료검출에있어서반응표면분석을적용하여얻은중회귀식에서모델예측식을도출한결과 R 2 값이각각 0.99, 0.98, 0.97로높은상관성을나타내 Model을잘설명할수있었다. 3) NDMA, DMA, DMF에대한 SPME법시료검출영향은공통적으로추출시간 (Adsorption time) 과온도 (Temp.) 에의한주효과 (main effect) 가가장크게나타났다. 감사의글본연구는 2006년도경기대학교학술연구비 ( 일반연구과제 ) 지원에의하여수행되었음. 참고문헌 4. 결론본연구는 NDMA, DMA, DMF를동시분석함으로써, GC/FID를이용하여미량정량할수있는방법을도출하고여러가지분석조건을위한변수들간에주효과및교호작용의해석, 기술통계량분석, 반응표면분석에의해수행된반응모델추정, 분산분석등을제시하여각물질의미량분석의특성을평가하고자하였다. 1. 김택제, 분석과학회지 ( 별책 ), 2000, 김승현, 유이존, 대한환경공학회지, 2002, 24(4), 조일형, 이내현, 장순웅, 안상우, 윤영한, 조경덕, 대한환경공학회지, 2006, 28(9), 조일형, 이내현, 장순웅, 안상우, 윤영한, 조경덕, 2007, 한국물환경학회지, 23(1), J. Pawliszyn, 1997, Wiley-VCH, J. Dron, R. Garcia and E. Millan, J. Chromatography A, 2002, 963, 안상우, 장순웅, 환경분석학회, 2004, 7(2),

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