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수진 여
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1 대한요로생식기감염학회지: 제 7 권 제 2 호 2012년 10월 Korean J UTII Vol. 7, No. 2, October 2012 원 저 성매개성 병원균 검출에서 임상 검체를 사용한 다중 PCR 평가 중앙대학교 의과대학 비뇨기과학교실, 1 진단검사의학교실 김태형 이미경 1 [Abstract] Evaluationof Multiplex PCR for the Detection of Sexually Transmitted Pathogens using Clinical Specimens Tae Hyoung Kim, Mi Kyung Lee 1 From the Departments of Urology, 1 Laboratory Medicine, Chung-Ang University College of Medicine, Seoul, Korea Purpose: Multiplex PCR can allow multiple pathogens to be detected in the same reaction tube, saving time and reagents. The aim of this study was to evaluate the multiplex PCR kit (Seegene, Korea) for detection of fastidious microorganisms such as six sexually transmitted pathogens. Materials and Methods: Using clinical specimens, multiplex PCR and single PCR were used to test for Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis and Ureaplasma urealyticum. Results: Multiplex PCR had an overall sensitivity of 97.2% and specificity of 100% compared to the single PCR. The limits of detection for the multiplex PCR and single PCR were from to µg/ml and from to µg/ml, respectively. Conclusions: The multiplex PCR kit has considerable potential to use as a routine method in clinical laboratories. Before introducing the new multiplex PCR method in the laboratory, thorough evaluation and validation of multiplex PCR is essential. To achieve reliable results from multiplex PCR, feasible guidelines, standardization and quality control are of major importance. (Korean J UTII 2012;7: ) Key Words: Polymerase chain reaction, Sexually transmitted diseases 교신저자:이미경, 중앙대학교병원 진단검사의학과 서울 동작구 흑석로 102 우 Tel: , Fax: , cpworld@cau.ac.kr Received: September 14, 2012 Revised: September 26, 2012 Accepted: October 2,

2 130 대한요로생식기감염학회지: 제7권 제2호 2012년 10월 서 론 대상 및 방법 중합효소연쇄반응 (Polymerase chain reaction; PCR) 은 매우 예민하고 특이한 기법으로 실험실뿐 아니라 일상 검사를 위한 진단검사의학과의 검사실에서도 널리 사용되고 있다. 그러나 일상 검사를 위한 검사 실에서 PCR의 사용은 검출하고자 하는 표적유전자 의 종류나 수에 따라 시간과 노력이 많이 필요하거 나 비교적 비용이 많이 드는 문제가 있어 왔다. 이 러한 단점을 극복하고 병원 검사실에서 PCR의 활용 을 증가시키기 위하여 다중 (multiplex) PCR과 같은 변형된 방법들이 시도되고 있다. 다중 PCR은 검체 에 있는 두 가지 이상의 표적 DNA를 동시에 증폭 할 수 있도록 둘 이상의 시동체 (primer)를 동일 반 응액에 넣어 단일 시험관에서 동시에 증폭하여 검출 하는 방법으로, 검사실에서 검사에 소요되는 시간과 노력을 줄일 수 있을 것으로 기대되고 있다. 1-3 지금 까지 다중 PCR은 유전자결손 분석, 4 돌연변이와 다 형증 검사, 5 정량검사 6 및 RNA 검출 4 등의 다양한 영역에 성공적으로 시도되었다. 또한 다중 PCR은 여러 가지의 다른 미생물을 동시에 검사할 수 있고 배양이 까다로운 미생물의 검출에도 사용될 수 있으 므로 세균, 진균, 바이러스, 기생충 등의 미생물 검 출과 동정에도 많이 시도되고 있다. 1-3 그러나 다중 PCR은 신속하고 편리한 검색 방법임에도 불구하고 한 시험관에서 여러 종류의 표적 DNA를 검출하기 위하여 여러 쌍의 시동체를 첨가하여야 하므로, 단 일 PCR보다 위음성 또는 일부 표적 염기서열의 불 균등한 증폭의 가능성이 있고 일부 결과에서는 재현 성이 낮을 수 있는 문제점을 갖고 있다. 1 그러므로 새로운 다중 PCR을 시도할 경우 적합한 반응조건을 개발하기 위하여 수많은 반복 실험이 필요하기도 하 고, 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위하여 철저한 평 가와 확인이 필요하다. 이에 본 연구에서는 병원 검사실에서 사용이 증 가하고 있는 다중 PCR을 검증하기 위하여, 배양이 까다로운 6종류의 성병 관련 미생물 검출이 가능하 도록 개발된 상품화된 다중 PCR 키트를 임상 검체 를 사용하여 평가하여 보았다. 1. 대상, 핵산 추출 및 PCR 전립선 증상을 주소로 내원한 환자의 전립선 마사 지전 첫 소변 (first voided urine; FVU) 또는 전립선 마사지 후 분비액 (expressed prostatic secretions; EPS) 과 질염 환자의 질 면봉 검체에서 6종류의 성병 관 련 미생물 검출을 위하여 개발된 Seeplex STD Detection kit (씨젠, 서울, 대한민국)로 검사를 시행한 후 보관 중인 DNA 중 필요한 검체를 선택하여 사용 하였다. 즉 음성 검체와 1종류에서 4종류의 미생물이 검출된 검체 중 일부를 사용하였다. DNA는 proteinase K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)와 phenol-chloroform을 사용하여 추출하였다. 다중 PCR과 단일 PCR 반응은 모두 자동온도조 절기 (96 well GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)를 사용하여 94 에서 15분간 전 변성시킨 후, 94 에서 30초, 63 에서 1분 30초 및 72 에서 1분 30초씩 40회 증폭 하고 마지막으로 72 에서 10분 동안 연장반응 시 켰다. 각 균종별로 시동체 제작에 사용된 유전자는 Chlamydia trachomatis (CT)는 pctt1, Mycoplasma genitalium (MG)은 gyra, Mycoplasma hominis (MH) 는 gap, Neisseria gonorrhoeae (NG)는 pora pseudogene, Trichomonas vaginalis (TV)는 btub 1, Ureaplasma urealyticum (UU)은 ureg-d였으며, PCR 반응을 확인하기 위한 내부 대조물질은 Arabidopsis 의 CesA3 유전자를 사용하였다. 각각의 증폭산물은 2% 아가로오스 겔에서 100V로 40분간 전기영동한 후 브롬화에티듐 (ethidium bromide)으로 염색하여 Image system (ChemiDoc XRS system, Bio-Rad Laboratories, Hercules, USA)으로 분절의 유무와 크 기를 확인하였다. 2. 다중 PCR의 재현성 평가 6종류의 성병 관련 미생물이 모두 검출되지 않은 음성 DNA 4개, 1종류의 세균이 검출된 DNA 3개, 2

3 김태형 외: Evaluation of Multiplex PCR 131 종류의 세균이 동시에 검출된 DNA 3개, 그리고 3 종류의 세균이 동시에 검출된 DNA 1개 등 총 11개 의 DNA를 대상으로, 동일 검사자가 3일간 매일 검 사하였고 동시에 3명의 검사자가 각각 검사하였다. 결 과 1. 다중 PCR의 재현성 평가 3. 다중 PCR과 단일 PCR의 결과 비교 6종류의 성병 관련 미생물이 모두 검출되지 않은 음성 DNA 7개, 1종류의 세균이 검출된 DNA 4개, 2종류의 미생물이 동시에 검출된 DNA 3개, 3종류 의 미생물이 동시에 검출된 DNA 3개, 그리고 4종 류의 미생물이 동시에 검출된 DNA 1개 등 총 18 개의 DNA 검체를 대상으로 하였다. 동일 검사자가 6종류의 시동체 쌍을 이용한 다중 PCR을 시행하였 고, 동시에 1종류의 시동체 쌍을 이용한 단일 PCR 을 각각 시행하였다. 즉 1개의 DNA검체 당 다중 PCR 1회와 단일 PCR 6회를 시행하여, 총 126회의 PCR을 시행하였다. 4. 다중 PCR과 단일 PCR의 검출한계 비교 검출한계 비교를 위한 충분한 농도의 DNA를 준 비하기 위하여, 6종류의 균종이 단일 양성으로 검 출된 검체를 선택하여 단일 PCR을 각각 시행하고 PCR 산물을 주형 DNA로 하여 단일 PCR을 한 번 더 시행하였으며, 최종 PCR 산물을 정제한 후 전 기영동으로 확인하고 DNA 농도를 측정하였다. 다 중 PCR의 검출 한계를 확인하기 위한 주형 DNA는 준비된 6종류의 단일 양성 PCR 산물을 동량으로 섞은 후, 소독된 증류수로 10배씩 희석하여 준비하 였다. 단일 PCR의 검출 한계를 확인하기 위한 주 형 DNA는 다중 PCR에 사용한 주형 DNA 농도와 동일하게 하기 위하여 소독된 증류수로 1:5로 희석 한 후, 다시 10배씩 희석하여 준비하였다. 다중 PCR과 단일 PCR은 동일 검사자가 준비된 주형 DNA를 이용하여 희석하지 않은 농도부터 10-7 까지 희석한 농도까지 PCR을 시행하였으며, 10-7 농도에 서도 PCR 산물이 확인되는 경우 추가로 10배씩 희 석한 주형 DNA로 PCR 산물이 검출되지 않는 농도 까지 각각 PCR을 시행하였다. 6종류의 성병 관련 미생물이 모두 검출되지 않은 음성 DNA 4개, 1종류의 세균이 검출된 DNA 3개 (CT, MH, UU 각각 양성 검체), 2종류의 세균이 동 시에 검출된 DNA 3개 (CT와 UU, MH와 TV, MH 와 UU가 각각 동시에 검출된 검체), 그리고 3종류 의 세균이 동시에 검출된 DNA 1개 (CT, MH, UU 가 동시에 검출된 검체)를 대상으로 동일 검사자가 3일간 매일 검사하고 동시에 3명의 검사자가 각각 검사한 결과, 동일 검사자의 검사간 결과는 모두 일치하였으며, 3명의 검사자간 결과는 3종류의 세 균이 동시에 검출된 DNA를 제외하고는 모두 일치 하는 결과를 보여주었다. 즉 검사자간 불일치를 보 인 경우는 CT, MH, UU가 동시에 검출된 검체에 대한 다중 PCR 결과, 2명의 검사자에 의한 결과는 모두 일치하였으나 1명의 검사자에 의한 결과는 UU 음성으로 나타났다. 2. 다중 PCR과 단일 PCR의 결과 비교 음성 DNA 7개, 1종류의 미생물이 검출된 DNA 4 개 (CT, NG, MH, UU 각각 양성 검체), 2종류의 미 생물이 동시에 검출된 DNA 3개 (CT와 MH, MH와 TV, MH와 UU가 각각 동시에 검출된 검체), 3종류 의 미생물이 동시에 검출된 DNA 3개 (CT/MG/MH, CT/MH/UU, MH/TV/UU가 동시에 검출된 검체) (Fig. 1), 그리고 4종류의 미생물이 동시에 검출된 DNA 1개 (CT/MG/MH/UU가 동시에 검출된 검체) 를 대상으로 동일 검사자가 다중 PCR과 6균종에 대한 단일 PCR을 각각 시행한 결과, 음성 검체 1개 를 제외하고는 모두 검출 결과가 일치하였다. 즉 불일치를 보인 검체는 다중 PCR에서는 모두 음성 이었으나 단일 PCR에서 CT가 약한 띠 (band)로 검 출되었다 (Table 1). 본 연구에서 단일 PCR과 비교 한 다중 PCR의 예민도는 83.3% (CT)에서 100%였 으며, 특이도는 모든 균종에서 100%였다.

4 132 대한요로생식기감염학회지: 제7권 제2호 2012년 10월 719 bp 580 bp 502 bp 435 bp 348 bp 256 bp 214 bp M M Fig. 1. Species-specific DNA amplifications by single and multiplex PCR. Lane M, Molecular size marker; Lane 1, Single PCR for Trichomonas vaginalis (negative); Lane 2, Single PCR for Mycoplasma hominis (502 bp); Lane 3, Single PCR for Ureaplasma urealyticum (435 bp); Lane 4, Single PCR for Chlamydia trachomatis (348 bp); Lane 5, Mycoplasma genitalium (negative); Lane 6, Single PCR for Neisseria gonorrhoeae (negative), Lane 7, Multiplex PCR for C. trachomatis, M. genitalium, M. hominis, N. gonorrhoeae, T. vaginalis and U. urealyticum (502, 435 and 348 bp). Lane 8, Negative control. Internal control bands are indicated by arrow (719 bp). 3. 다중 PCR과 단일 PCR의 검출한계 비교 6균종에 대한 검출한계는 다중 PCR은 에 서 µg/ml였고, 단일 PCR은 에서 µg/ml 였다. 균종별로는 TV를 제외하고는 모두 단일 PCR에서 다중 PCR에 비해 검출한계가 낮아 더 예민하게 검출이 가능한 것으로 나타났으 며, 다중 PCR과 단일 PCR의 검출한계 차이는 CT와 NG를 제외하고는 모두 2희석배수 이내 (10 2 이내)의 차이를 보였다. 반면 단일 PCR의 CT와 NG에 대한 검출한계는 각각 µg/ml와 µg/ml로 다중 PCR의 검출한계인 µg/ml보 다 매우 낮았다 (Table 2). 고 찰 성공적인 다중 PCR을 수행하기 위해서는 예민도 와 특이도가 높고 비특이 반응의 가능성이 없는 시 동체 고안과 확인이 우선적으로 이루어져야 하며, Table 1. Comparison of results of multiplex PCR and single PCR in detection of Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Neisseria gonorrhoeae, and Ureaplasma urealyticum Sample No. Multiplex PCR Single PCR CT MG MH NG TV UU CT MG MH NG TV UU CT; Chlamydia trachomatis, MG; Mycoplasma genitalium, MH; Mycoplasma hominis, HG; Neisseria gonorrhoeae, TV; Trichomonas vaginalis, UU; Ureaplasma urealyticum

5 김태형 외: Evaluation of Multiplex PCR 133 Table 2. Comparison of limit of detection between multiplex PCR and single PCR Limit of detection (µ/ml) Organism Multiplex PCR Single PCR C. trachomatis M. genitalium M. hominis N. gonorrhoeae T. vaginalis U. urealyticum 시동체의 상대 농도, PCR buffer의 농도, 염화마그 네슘과 dntp 농도의 균형, annealing 온도, 주형 DNA와 DNA 중합효소의 양, 연장반응시간 (extension time) 등 PCR의 최적 조건을 찾는 것이 중요하다. 7,8 본 연구에서 평가한 다중 PCR 키트는 PCR의 최적 조건이 제조사에 의해 제공되었으며, 시동체 고안에 dual priming oligonuckeotide (DPO, 씨젠) 기법이 시용되었다. 이 기법은 시동체들이 35 염기 이상으로 길게 제작되었지만 긴 염기로 인한 높은 융해온도를 시동체의 중간에 삽입한 polydeoxyinosine linker가 만드는 기포와 유사한 구조에 의해 시동체를 두 부분으로 나눔으로써 융해온도를 낮추어 교차반응 없이 균종 특이 PCR이 가능한 것 으로 보고되었다. 9 즉 뉴클레오티드로 이루어 진 시동체의 5'부위는 표적 DNA에 쉽게 결합하고 안정적인 반면, 6-12 뉴클레오티드로 구성된 시동체 의 3'부위는 원하는 표적 DNA에 보다 선택적으로 결합하여 비특이적 결합을 줄임으로 민감도와 특이 도를 향상시킨 것으로 보고되었다. 9 일반적으로 병원균 검출을 위한 PCR 방법의 평 가는 배양이나 혈청학적 검사와 같은 전통적인 확 진 검사와 비교하여 평가하게 되지만, 배양이 까다 로운 일부 균종의 경우 전통적인 확진방법으로 비 교하기가 어려울 수 있으며 여러 균종을 동시에 검 출하는 다중 PCR의 경우 더욱 어렵다. 따라서 본 연구에서는 병원 내 검사실에서 사용이 증가하고 있는 다중 PCR 평가를 위하여, 임상 검체에서 검 출된 DNA를 사용하여 다중 PCR의 재현성과 다중 PCR에 사용된 것과 동일한 시동체를 각각 한 쌍씩 사용한 단일 PCR과 비교하여 보았다. 다중 PCR의 재현성은 음성과 1균종에서 3균종의 미생물이 각 각 검출된 11개의 DNA를 대상으로 하여 동일 검 사자가 3일간 매일 검사하고 동시에 3명의 검사자 가 각각 검사하였다. 동일 검사자의 검사간 결과는 모두 일치하였으나, 3명의 검사자간 결과에서는 CT, MH, UU 3균종이 동시에 검출된 DNA에서 1명 의 검사자에 의한 결과가 UU 음성으로 나타나 검 사자간 불일치를 보였으며, 불일치를 보인 UU는 2 명의 검사자에서 매우 약한 띠로 검출되었다. 또한 본 연구에서 음성과 1균종에서 4균종의 세균이 각 각 검출된 18개의 DNA를 대상으로 다중 PCR과 단 일 PCR을 비교한 결과, 음성 검체 1개를 제외하고 는17검체에서 모두 두 검사간 검출 결과가 일치하 였으며, 불일치를 보인 검체는 다중 PCR에서는 6 균종 모두 음성이었으나 단일 PCR에서 CT가 약한 띠로 검출되었다. 즉 본 연구에서 단일 PCR에 비 교한 다중 PCR의 예민도는 83.3% (CT)에서 100% 였으며, 특이도는 모든 균종에서 100%였다. 최근 본 연구와 동일한 다중 PCR 키트를 평가한 연구에 서도 자체 검사실의 단일 PCR과의 비교에서 CT와 UU의 경우 위양성은 없었으나 낮은 농도 (1-2 µ/ml)의 양성 검체 중 CT의 16% (8/50검체)와 UU 의 35.7% (5/14검체)에서 위음성이 있음을 보고하 였으며, 10 다중 PCR의 특이도는 매우 높으나 증폭 산물의 양이 적을 경우 전기영동으로 확인되지 않 아 위음성의 가능성이 있으며 검체의 DNA 농도가 예민도에 영향을 주는 것으로 평가되었다. 10,11 따라 서 본 연구에서 검사자간 불일치와 단일 PCR과의 불일치를 보인 검체의 경우 DNA 농도가 낮았기 때문으로 판단되었다. 6균종에 대한 다중 PCR과 단일 PCR의 검출한계 차이는 TV를 제외하고는 모두 단일 PCR에서 다중 PCR에 비해 검출한계가 낮아 더 예민하게 검출이 가능한 것으로 나타났다. 본 연구에서 평가한 다중 PCR 키트의 검출한계는 동시에 검출하는 6균종 모 두 µg/ml로 균종 간 비슷한 검 출한계를 보이고 있는 반면, 단일 PCR의 검출한계 는 균종에 따라 차이를 보이고 있고 특히 CT와 NG 에 대한 검출한계는 각각 µg/ml와

6 134 대한요로생식기감염학회지: 제7권 제2호 2012년 10월 µg/ml로 매우 낮은 수준까지 검출 가능하 였다 (Table 2). 따라서 동시에 한 가지 이상의 표적 을 증폭하게 되는 다중 PCR에서는 다른 표적에 비 하여 특정 표적 염기순서를 선택적으로 증폭하게 되는 현상이 나타날 수 있는 것으로 알려져 있는 데, 1,12 본 PCR 키트는 비교적 각각의 표적 DNA에 대하여 비슷한 증폭 효율을 가지는 것으로 평가되 었다. 또한 CT와 NG의 경우 다중 PCR에서는 PCR 반응액의 소모로 인하여 더 이상의 증폭이 불가능 하였을 것으로 추측되며, 반대로 단일 PCR에서는 충분한 PCR 반응액의 존재로 인해 검출한계가 매 우 낮아진 것으로 판단하였다. 따라서 본 연구에서 평가한 다중 PCR 키트는 낮은 농도의 DNA 검출 시 위음성의 위험은 있지만 검사실에서 일상 검사 로 사용하기에 가능한 방법으로 생각되었다. 이전 보고들에서도 다중 PCR이 단일 PCR에 비해서는 예 민도가 낮았지만 비교적 높은 예민도와 특이도를 보여, 다중 PCR이 검사실의 자원과 비용을 줄이고 보다 신속하고 편리한 검사가 가능한 방향으로 발 전할 것으로 평가하였다 그러나 다중 PCR이 신 속하고 경제적인 장점을 가지고 있지만, 여전히 특 정 표적 염기순서의 선택적 증폭 가능성, 1,12 시동체 간에 형성될 수 있는 이차 구조로 인한 예민도 감 소나 증폭산물에 의한 억제 가능성 17 등이 검사 결 과에 영향을 줄 수 있음을 주의하여야 한다. 결 론 임상 검체를 사용하여 다중 PCR과 단일 PCR을 비교한 본 연구를 통하여 성매개성 병원균 검출을 위한 다중 PCR은 검사실에서 일상 검사로 사용하 기에 가능한 방법으로 생각되었다. 그러나 다중 PCR이 검사실의 일상 검사를 위한 방법으로 도입 되려면 철저한 평가가 이루어져야 하며, 이러한 평 가를 위한 객관적이고 실현 가능한 지침 개발이 필 요할 것으로 사료되었다. 또한 이러한 지침에는 평 가를 위한 표준물질의 개발, 임상 검체를 시용한 검사 방법 평가 및 핵산 추출에서부터 증폭산물 확 인에 이르는 전 과정에서 시행하여야 할 정도관리 부분도 포함되어야 할 것으로 생각되었다. REFERENCES 1. Elnifro EM, Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. Clin Microbiol Rev 2000; 13(4): Higgins RR, Beniprashad M, Cardona M, Masney S, Low DE, Gubbay JB. Evaluation and verification of the seeplex diarrhea-v ACE assay for simultaneous detection of adenovirus, rotavirus, and norovirus genogroups I and II in clinical stool specimens. J Clin Microbiol 2011;49(9): Kulkarni S, Singh P, Memon A, Nataraj G, Kanade S, Kelkar R, et al. An in-house multiplex PCR test for the detection of Mycobacterium tuberculosis, its validation & comparison with a single target TB-PCR kit. Indian J Med Res 2012;135(5): Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT. Deletion screening of the duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res 1988;16(23): Rithidech KN, Dunn JJ, Gordon CR. Combining multiplex and touchdown PCR to screen murine microsatellite polymorphisms. Biotechniques 1997; 23(1):36,40,42,44 6. Zimmermann K, Schogl D, Plaimauer B, Mannhalter JW. Quantitative multiple competitive PCR of HIV-1 DNAin a single reaction tube. Biotechniques 1996;21(3): Markoulatos P, Siafakas N, Moncany M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. J Clin Lab Anal 2002;16(1): Markoulatos P, Siafakas N, Katsorchis T, Moncany M. Multiplex PCR: rapid DNA cycling in a conventional thermal cycler. J Clin Lab Anal 2003;17(4): Chun JY, Kim KJ, Hwang IT, Kim YJ, Lee DH, Lee IK, et al. Dual priming oligonucleotide sys-

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