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1 Journal of the Korean Chemical Society 2005, Vol. 49, No. 2 Printed in the Republic of Korea 간암치료를위한 P-32 Tri-n-alkyl[ 32 P]phosphine Oxide 의합성에관한연구 최강혁 Á 윤관식 Á 유국현 * 동국대학교화학과 ( 접수 ) Preparation of Tri-n-alkyl[ 32 P]phosphine Oxide for latent Treatment of Hepatic Tumors Kang-Hyuk Choi, Kwan-Sik Youn, and Kook-Hyun Yu* Department of Chemistry, Dongguk University, Seoul , Korea (Received January 4, 2005) 요약. 생체내저분자의중간체와핵산의구성원소인인 (P) 은인체내대사에서중요한역할을하고있으며 P-32는 β선방출핵종으로그표지화합물은주로생화학, 유전학분야에서이용되고있다. 그러나이와같은표지화합물은주로추적자로이용되어있을뿐치료의약품으로서연구가미흡한실정이다. 본연구는 P-32를이용하여림프관조영제및색전물질로이용되는 LUF(Lipiodol Ultra-Fluid) 대체물질인 tri-n-alkyl[32p]phosphine oxide를합성하는데그목적을두고있다. Grignard 반응을이용하여비교물질인 tri-n-alkylphosphine oxide를합성하였으며이들의수득율은 butyl의경우 17%, octyl의경우 29%, dodecyl의경우 52% 를얻었다. P-32교환반응을통해 [ 32 P] POCl3를얻었으며그교환수율은 96% 이상이었다. [ 32 P] POCl3를이용한 tri-n-alkyl[ 32 P]phosphine oxide 의표지수율은 butyl의경우 91%, octyl의경우 60%, dodecyl의경우 96% 이었다. 주제어 : LUF, 오일형혈관조영의약품, 리피오돌, [ 32 P]-인산, 트리알킬포스핀옥사이드 ABSTRACT. The element phosphorus, a component of low molecular intermediate and nucleic acid, plays an important role in metabolism in body. And so P-32 and its labeled compounds have been studied in the fields of biology, genetic engineering and so forth. However, P-32 labeling compounds have been insufficiently studied in part of treatment despite many researches on tracers. In line of application research of the [ 32 P] H3PO4, we have focused on the LUF (Lipiodol Ultra-Fluid), an oily lymphographic, which have been used in hepatography and have prepared LUF alternatives(tri-n-alkyl[ 32 P]phosphine oxide). Comparative materials, Tri-n-alkylphosphine Oxide, have been synthesized with Grignard reaction and yields are 17% for butyl, 29% for octyl and 52% for dodecyl. P-32 exchange reactions take precedence of Grignard reaction for preparation of precursor [ 32 P] POCl3 of tri-n-alkyl[ 32 P]phosphine oxide. Exchanging yield is over 96% confirmed of Radio TLC scanner. The labeling yields of tri-n-alkyl[ 32 P]phosphine oxide are 91%, 60%, and 96% respectively for butyl, octyl and dodecyl Keywords: LUF, Oily Lymphographic Agent, Lipiodol, [ 32 P] H3PO4, Tri-n-alkyl[ 32 P]Phosphine Oxide 서 원소인 (P) 은생체내의저분자의중간체나핵산등의구성원소로서존재하며유전현상및에너지중개 론 의중요한역할을하고있어 P-32, P-33 을이용한다양한연구가가능하다. 특히, β 방사핵종인 P-32 의이용화합물은 [ 32 P] ATP(Adenosin 5'-[γ- 32 P]triphosphate), [ 32 P] dctp(deocycytidine 5'-[α- 32 P]triphosphate) 등이 161

2 162 최강혁 Á 윤관식 Á 유국현 있으며, 생화학적반응경로를알기위한추적자로서응용되고있다. 그밖에방사성동위원소 1,2 P-32는세포조직괴사작용에이용될수있다. 166 Ho-Chitosan의암조직괴사작용을나타내는 3,4 Ho-166는 β-선방출핵종으로 βmax에너지는 1.9 MeV이다. P-32는 βmax에너지가 1.72 MeV로 Ho-166과유사한특징을가지며, 생체내구성원소서 P-32 응용연구의지표가될수있다. 5 본연구는 [ 32 P] H3PO4에대한응용연구개발의일환으로색전현상및방사성치료효과를갖는 P-32가표지된오일형혈관조영의약품 (oily lymphographic agent) 의유도체를합성하는데목적을두고있다. 오일형혈관조영의약품은대표적으로 LUF(Lipiodol Ultra-Fluid) 가있으며리피오돌 6,7 (Lipiodol) 이라일컫기도한다. 리피오돌은요오드가치환된양귀비씨오일 (Iodinate poppyseed oil) 로서긴탄화수소를가지고있으며, 간암과같은종양조직에대한장기집적특성을가지고있다. 또한점도가높아동맥의말초혈 8 관부위특히, 암조직에영양을공급하는혈관을막아서암조직을괴사시키는색전현상을나타내기도한다. 그원인은동맥의각분지에서표면장력에의해많은혈류가간동맥에선택적으로유입되는현상인혈류역학적현상에기인한다. 현재 9, 색전현상을응용한암치료방법으로는항암제와같이투여하여암조직을괴사시키는경동맥화학색전요법 (Transarterial Chemoembolization) 이있으며방사능동위원소를표지시킨리피오돌을이용한간암의비절제치료가능성과안정성검사의판단의연구사례가있다. 이러 10 한리피오돌유사체는주로 Iodine-131, Yttrium-90을표지하여사용하고있으나투과성이높은 γ선과에너지가높은 β선으로정상세포에도영향을미치므로이에대한보완연구가필요하다고할수있다 (Table 1). 방사성동위원소 P-32는암세포괴사에필요한적당한에너지를갖는 β-붕괴를하며최대비정이 780 mg/ cm 로액체인물상태에서약 cm까지만영향력을미치고있다. 색전현상을나타내는의약품을제조하 Table 1. Radioisotopers for nuclear medical treatment Radioisotope Half-Life Decay Mode Energy(MeV) I d β, γ β (0.606), γ Y d β 2.28 Ho d β, γ β (1.9), γ(0.081) P d β 1.71 기위해서는먼저혈류역학적성질에근거한점도성이있는물질의제조가필요하다. 이러한점에서리피오돌과유사성질을갖는긴사슬체를갖는화합물의제조와이화합물에동위원소 P-32 를도입한리피오돌유사체를합성을하였다. 리피오돌유사체로서긴사슬체인을갖는화합물은 tri-n-alkylphosphine oxide 11,12,13 이있으며, 방사성동위원소 P-32 에긴탄화수소를도입한 tri-n-alkyl [ 32 P]phosphine oxide 를합성하였다. 실 시약및재료방사성동위원소 P-32는한국원자력연구소에서생산된 [ 32 P] H3PO4를이용하였으며, phosphorus oxychloride (POCl3) 는 Fluka제품을, HPLC용메탄올과에탄올은 Aldrich제품을사용하였다. 그외의시약들은분석용특급시약을구입하여사용하였다. 방사성동위원소를이용한실험을위해반응초자기구는 Aldrich사의 KONTES MICROSCALE GLASSWARE KIT를이용하여간이반자동합성장치를제작하여사용하였다. 합성확인에사용한 TLC는 Merck사의 Silica gel 60 F254를이용하였으며발색기구및시약으로는 UV-램프, 닌히드린 (Ninhydrin) 시약및 I2를이용하였다. IR은 Bomen 100 FT-IR Spectrophotometer를, NMR은 Varian사의 Gemini 200을이용하였으며질량분석은서울대학교기초과학공동기기기연구원의고성능액체크로마토그래피 / 질량분석기 (EI, FAB) 를이용하였다. 라디오크로마토그램은 Bioscan사의 System 200 imaging scanner와 AC-3000 을이용하였다. 양이온분석을위해 GBC Scientific Equipment Pty Ltd사 (GBC Integra XMZ-Australia) 의 ICP-AES를사용했다. 비교물질 Tri-n-alkylphosphine Oxide의합성동위원소도입가능성및표지화합물합성의비교자료를얻기위해방사성핵종이아닌안정한동위원소 P-31를이용하여비교물질을합성하였다. 질소기체분위기하에서다이에틸에테르 (Diethyl ether) 용매에브롬화알킬 (Alkyl bromide) 3당량 (0.03 mol) 과 Mg 4 당량 (0.04 mol, 0.97 g) 을넣고 0 o C에서약 40분동안교반을시켜 Grignard 시약을제조하였다. 그후 1 당량 (0.01 mol, 0.93 ml) 에해당하는 POCl3를소량씩첨가하고 0 o C, 질소분위기하에서 2 h 동안반응시킨 험 Journal of the Korean Chemical Society

간암치료를위한 P-32 Tri-n-alkyl[ 32 P]phosphine Oxide 의합성에관한연구 163 R=butyl(C 4H 9), hexyl(c 6H 13), heptyl(c 7H 15), octyl(c 8H 17), dodecyl(c 12H 25) 다. 메탄올로반응을중지시킨후감압증류하였다.

3 간암치료를위한 P-32 Tri-n-alkyl[ 32 P]phosphine Oxide 의합성에관한연구 163 R=butyl(C 4H 9), hexyl(c 6H 13), heptyl(c 7H 15), octyl(c 8H 17), dodecyl(c 12H 25) 다. 메탄올로반응을중지시킨후감압증류하였다. 잔유물에 50 ml 의 6 M HCl 용액으로세척을하고 100 ml 의염화메틸렌 (Methylene chloride) 를넣어유기층을추출하였다. 10 ml 의 0.5 M KMnO4 를이용하여 1 회, 40 ml 의 12 M H2SO4 로 1 회, 40 ml 의증류수로 3 회세척하였다. 0.1 M NaOH 로 ph 7 로만든후 20 ml 의염화나트륨포화용액으로 2 회세척하였다. 무수 MgSO4 를이용하여건조시켰으며감압증류한후컬럼크로마토그래피를이용하여정제된 tri-n-alkylphosphine oxide 를얻었다. 이때수득율은아래와같다. -Tri-n-butylphosphine oxide: yield 16.8%. TLC(THF: Chloroform=1:1): R f = H NMR(CDCl3); δ 1.60 (m, 18H), 0.94(t, 9H). MS(EI, M + ); C12H27OP, cald for , found Tri-n-hexylphosphine oxide: yield 26.5%. TLC (Chloroform: MeOH=20:1): R f = H NMR(CDCl3); δ 1.62(t, 6H) 1.27(m, 24H), 0.90(t, 9H). MS(EI, M + ); C18H39OP, cald for , found Tri-n-heptylphosphine oxide: yield 29.9%. TLC(Chloroform: MeOH=20:1): R f = H NMR(CDCl3); δ 1.63(t, 6H) 1.26(m, 30H), 0.91(t, 9H). MS(EI, M + ); C21H45OP, cald for , found Tri-n-octylphosphine oxide: yield 29.1%. TLC(EA: Hexane=3:1): R f = H NMR(CDCl3); δ 1.65(t, 6H) 1.27(m, 36H), 0.88(t, 9H). MS(EI, M + ); C24H51OP, cald for found Tri-n-dodecylphosphine oxide: yield 52.1%. TLC(EA: Hexane=1:5): R f = H NMR(CDCl3); δ 1.58(t, 6H) 1.28(m, 60H), 0.90(t, 9H). MS(FAB, M + +1): C36H76OP, cald for found [ 32 P] POCl 3 의제조 [ 32 P] POCl3 의제조는 Keenan 14,15 에의해제시된평형상태교환방법을이용하였다. 차폐제로서는 10 mm 아크릴판을이용하였으며제작된 Microscale vial 에 0.1 mci[ 32 P] H3PO4 를넣고 70 o C 조건에서질소가스를투입시켜건조시켰다 ml 의 POCl3 를 Microscale vial 에넣고 30 분간교반후 105 o C 에서 24 시간교환반응을하여 [ 32 P] POCl3 를 96% 의수율로제조하였다. 표지화합물 Tri-n-alkyl[ 32 P]-phosphine Oxide 의합성교환반응에의해 [ 32 P] POCl3 를합성을한후실온조건과질소분위기하에서다이에틸에테르용매에브롬화알킬 0.85 ml 를녹인후 Mg 0.1 g 을첨가하여 Grignard 시약을생성하였다. Mg 이완전히녹은것을확인한후 1mCi 의 [ 32 P] POCl3 0.5 ml 를넣고 0 o C, Ar 조건에서 2 h 동안반응시킨후메탄올로반응을중지시켰다. 대기압하에서 60 o C 조건에서질소가스를이용하여용매를제거하고 1 ml 의 6 M HCl 로세정하였다. 염화메틸렌을소량넣은후 0.5 ml 의 0.6 M KMnO4 와 1ml 의 12 M H2SO4 로 1 회, 1 ml 의증류수 R=butyl(C 4H 9), octyl(c 8H 17), dodecyl(c 12H 25) 2005, Vol. 49, No. 2

4 164 최강혁 Á 윤관식 Á 유국현 로 3회세척하였다. 0.5 ml의 0.1 M NaOH로세척후 2 ml의염화나트륨포화용액으로 2회세척하였다. 유기층에남아있는수분과용매를제거하기위해 Microscale vial용증류장치를이용하여용매를제거하였다. 합성의확인은라디오크로마토그램을이용하였으며, 방사화학적표지수율은 tri-n-butyl[ 32 P]phosphine oxide의경우 91.0%, tri-n-octyl[ 32 P]phosphine oxide의경우 60.0%, tri-n-dodecyl[ 32 P]phosphine oxide의경우 96.0% 이었다. 결과및고찰 비교물질의합성점도에따른혈류역학적장기집적특성을가진물질을합성하기위해알킬사슬길이가다른화합물을합성해야한다. 사슬길이는부틸 (butyl), 옥틸 (octyl), 도데실 (Dodecyl) 의 4 단위탄소수를변화시켜리피오돌유사체인 tri-n-alkylphosphine oxide 의합성하였다. 모든반응은단일용기반응으로진행하였으며, 비교물질의합성확인은 1 H-NMR, Mass, IR, TLC 를통해확인하였다. Grignard 반응을통해 tri-n-alkylphosphine oxide 을합성하는데반응수율의변화는시작물질인할로겐화알킬의종류, 반응용기의밀봉상태, 수분및반응온도에기인한다. 할로겐화알킬선택에있어염소화알킬 (R-Cl) 은온도변화 (20 o C, 40 o C, 50 o C) 를주어도 Grignard 반응이진행되지않았다. 브롬화알킬의경우낮은온도에서도반응이진행되었으며, 발열반응으로 0 o C 조건에서실험을진행하였다. 또한, 충분한불활성기체로수분접촉을막지못하는경우반응수율이아주낮았다. POCl3 의알킬화반응도격렬한발열반응이므로 0 o C 조건에서소량씩첨가하여반응을진행하였다. 반응시간에따르는합성수율 (Table 2) 을비교하면 2 h 일때가장좋은합성수율을확인할수있었다. 반응시간이길어지면반응물사이에서고형화가진행되는것이관찰되었다. 알킬사슬의길이의변화에따른합성수율을비교하면사슬길이가길어질수록수율의증가를확인할수있었다. 이는사 Table 2. Synthetic yield depending on reaction time Time 2 h 5 h 12 h Tri-n-butylphosphine oxide Yield 16.8 % 4.1 % 굳어짐 Tri-n-octylphosphine oxide Yield 29.1 % 21 % 굳어짐 Tri-n-dodecylphosphine oxide Yield 52.1 % 29 % 굳어짐 슬의길이가길어질수록극성의정도가더작아짐에기인한것인데, 이것은합성된화합물을추출하는과정에서세척용매에생성된화합물의일부가용해되는현상에기인한다고할수있다. 이를억제하기위해서증류수세척시포화 NaCl 수용액을이용하는염석효과 (salting out) 를이용하여손실되는양을줄일수있었다. 리피오돌의비중은 1.28이며 25 o C에서오스트발트 (Ostwald) 점도계를이용하여물에대한상대점성도 [η25 C] 를확인한결과 mpa s이었다. Tri-nalkylphosphine Oxide의비교분석을한결과부틸의 o 경우비중이약 1.03을나타내었으며상대점성도 [η25 C] 는약 o 14 mpa s로액상의점액성을확인하였다. 옥틸의경우상대비중이약 1.2로상대점성도 [η25 C] 가 43 o mpa s이었으며점액성이큰액체였으며도데실의경우고체상태이었다. [ 32 P] H 3PO 4 용액분석방사능동위원소 P-32는 32 S(n,p) 32 P 핵반응에의해생산되며최종생산물은 [ 32 P] H3PO4이다. 생산과정 에서존재할수있는다른이온들은주로생산에이용되는표적물질, 표적용기및첨가된화학물질에의해나타날수있으며표지화합물을제작하는과정에서방해요인으로작용할수있다. 따라서표지화합물의합성시 [ 32 P] H3PO4의화학적순도를확인해야한다. 확인방법은습식분석에의한음이온분석과 ICP- AES를이용한양이온분석하였다. 원자력연구소에서생산되는 [ 32 P] H3PO4는완전히감퇴된후음이온과양이온을분석하였다. 음이온분석결과 Cl, CN 2, ClO4 가존재하였으며가장많이포함하는이온은 Cl 이온 임이확인되었다. 양이온의확인은방사성붕괴가검출되지않은 [ 32 P] H3PO4 용액 1 ml을 20배로묽혀서분석을하였다. 그결과 Na이약 10 ppm, Ca이 4 ppm, Al이 4 ppm 그리고 Si 4 ppm으로나타났다. 분석결과나타난용액속에주로존재하는이온은 Cl 이온 및 Na 이온이며 + Cl 이온은친핵치환반응을방해하 지않는이탈기로작용하므로표지화합물합성시문제가되지않는다. 원자력연구소에서생산되는 [ 32 P] H3PO4는정제없이사용이가능하다는것이확인되었다. Tri-n-alkyl[ 32 P]-phosphine Oxide 의합성 P-32 에서방출되는 β 선원을차폐하기위하여 10 mm Journal of the Korean Chemical Society

5 간암치료를위한 P-32 Tri-n-alkyl[ 32 P]phosphine Oxide 의합성에관한연구 165 Fig. 1. Radio TLC chromatogram of prepared [ 32 P] POCl 3 Eluents: CH 3OH: C 2H 5OH=1:1, R f = Table 3. Exchanging condition and its yield of 32-phosphorous POCl 3 [ 32 P]H 3PO 4 Temp( o C) Rx Time(h) yield (%) 0.3 ml 0.1 mci % 0.3 ml 0.1 mci % 0.3 ml 0.25 mci % 0.3 ml 0.5 mci hard 의아크릴판을설치하였으며실험실주변의오염을막기위해 1회용실험기구를이용하였다. 교환반응을이용한 [ 32 P] POCl3의합성은반응시간및온도가가장중요한요소로작용한다. 온도가높거나반응시간이길경우고형화가진행되고, 온도가낮을경우교환반응이진행되지않았다. 교환여부확인은에탄올로반응을중지시킨후방사능라디오크로마토그램 (Fig. 1) 을이용하였으며에탄올 : 메탄올 =1:1 전개용매로확인한결과 R f 값은 0.59였다. 최대교환수율은 Table 3에서 0.3 ml POCl3, 0.1 mci [ 32 P] H3PO4을 105 o C에서 24 h 반응시 96% 이었다. 표지화합물제작시표지수율의변화는주로방사성동위원소의비방사능의양과사용용매의초순수성등여러환경에따라변화된다. 사용방사능동위원소의한반감기가진행된후합성하였을경우상대적으로표지수율이낮았으며, 용매의순도또한큰 영향을받았다. 표지수율을높이기위해한반감기가지나기전의 [ 32 P] H3PO4와재정제한다이에틸에테르를사용하였다. 이와같은합성조건에서시간에따르는표지수율은 2h일때최대값이나왔으며 Fig. 2에서보는바와같이 tri-n-butyl[ 32 P]phosphine oxide의경우 91.0%, tri-n-octyl[ 32 P]phosphine oxide의경우 60.0%, tri-n-dodecyl[ 32 P]phosphine oxide의경우 96.0% 이었다. 사슬길이의변화에따르는규칙적수득율이관찰되지않았다. 결 치료용 P-32 표지화합물 tri-n-alkyl[ 32 P]phosphine oxide 를합성한결과그표지수율은 60% 이상이었으며이에대한기초적자료를제시하였다. 이 P- 32 표지화합물은혈류역학적현상에의한간암축척물질로서알킬사슬의변화를주어점도변화를주었으며색전현상과방사능치료를병행한방사색전요법 (Transarterial Radioembolization) 이라는새로운분야의도입에그의의를두고있다. 더나아가 in vivo 및 in vitro 연구가진행되면새로운방사성의약품으로서의가치를갖는표지의약품이되리라사료된다. 론 2005, Vol. 49, No. 2

6 166 최강혁 Á 윤관식 Á 유국현 에도움을준원자력의학원싸이크로트론응용연구실에감사의글을드립니다. 인용문헌 Fig. 2. TLC Scanning chromatograms of tri-n-alkyl[ 32 P]- phosphine oxide (a) tri-n-butyl[ 32 P]-phosphine oxide, (b) tri-noctyl[ 32 P]-phosphine oxide, (c) tri-n-dodecylphosphine oxide 본연구는원자력연구개발과제중하나로이용연구지원사업의지원에의해수행되었으며, 연구수행 1. Seiichiro, H.; Chitose, K.; Koichiro, F.; Fuminori, S.; Tsujiaki, H. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1996, 6, Tsujiaki, H.; Iwao, N.; Kunitada, S. Chemistry Letters, 1976, Brunke, Karen, J.; Wartchow, Charles, A.; Cleland, Jeffrey, L.Targeted therapeutic lipid constructs. U. S. Pat. Appl. Publ. 2004, 24, Breitz, Hazel.; Wendt, Richard.; Stabin, Michael.; Bouchet, Lionel.; Wessels, Barry. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 2003, 18, Robert, B. E. and Smith, A. H. Blood Reviews, 1997, 11, Han, J. G. J. Korean Soc. Hosp. Pharm. 1992, 9, Novell, J. R.; Hilson, A.; Hobbs, K. E. British Journal of Surgery, 1992, 4, Kan, Z.; Ivancev, K.; Hagerstrand, I.; Chuang, V. and Lunderguist A. Acta Radiol. 1989, 30, Nakakuma K, Tashiro S, Hiraoka T, et al Cancer, 1983, 52, Sylvaine, durand-fontanier.; Alain, simon.; Jean, l. duroux.; Bernard descottes.; Christiane delage. Anticancer Research, 1999, 19, Iwai, K.; Maesa, H.; Konno, T. Cancer research, 1984, 44, Keenan, R. W.; Martinez, R. A.; Williams, R. F. Journal of Biological Chemistry, 1982, 257, Anne-Dominique, Fortineau.; Franck, Brichory.; Pascal Pellen. et al J. Labelled Cpd. Radiopharm. 1999, 42, Keenan, R. W.; Martinez, R. A.; Williams, R. F. Journal of Biological Chemistry, 1982, 257, H, N. Gan.; M. B.; M. R. C. P.; F. R. C. R. British Journal of Radiology, 1978, 51, Rafii, H.; Zavar, H. Arbab.; Moghadam, S. Avaz. Scientific Bulletin of the Atomic Energy Organization of Iran, 1999, 19, Verzilov, Yuriy. M.; Maekawa, Fujio.; Oyama, Yukio.; Ikeda, Yujiro. Fusion Engineering and Design, 1997, 37, Pleyewski, R.; Kucharski, M.; Rybakov, Z. Isotopenpraxis, 1970, 6, 12. Journal of the Korean Chemical Society

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