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응수 강
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1 한국영양학회지 (Koren J Nutr) 29; 42(6): 55~ 515 DOI /kjn 피부섬유아세포에서비타민 C, Silion, 철분처리가콜라겐합성및분해관련효소의발현에미치는효과비교 * 김정은 이진아 김현애 김정민 조윤희 경희대학교동서의학대학원의학영양학과 Effet of Vitmin C, Silion nd Iron on Collgen Synthesis nd Brek-Down Enzyme Expression in the Humn Derml Firolst Cell (HS27) * Kim, Jeong Eun Lee, Jinh Kim, Hyune Kim, Jungmin Cho, Yunhi Deprtment of Medil Nutrition, Grdute Shool of Est-West Medil Siene, Kyung Hee University, Yongin , Kore ABSTRACT Collgen is the mjor mtrix protein in dermis nd onsists of proline nd lysine, whih re hydroxylted y prolyl hydroxylse () nd lysyl hydroxylse (LH) with oftors suh s vitmin C, oxygen, iron (Fe 2+ ), ketoglutrte nd silion. The ollgen degrdtion is regulted y mtrix metlloproteinse-1 (MMP-1), of whih is the mjor ollgendegrding proteinse wheres tissue inhiitors of metlloproteinse-1 (TIMP-1) ind to MMP-1 therey inhiiting MMP-1 tivity. In this study, we investigted the effets of vitmin C, silion nd iron on mrna, protein expressions of, LH, MMP-1 nd TIMP-1. The physiologil onentrtions of vitmin C (-1 μm), silion (-5 μm) nd iron (Fe 2+ :-5 μm) were treted to humn derml firolst ells (HS27 ells) for 3 or 5dys. The expression level of mrna nd protein ws inresed in not only ut lso LH when ells were inuted with vitmin C. A similr inrese in LH mrna or protein expression ourred when ells were inuted with silion. Our results suggest tht tretment of vitmin C nd silion inresed mrna nd protein expression of nd LH in humn derml firolst. (Koren J Nutr 29; 42(6): 55 ~ 515) KEY WORDS : vitmin C, silion, iron, prolyl hydroxylse, lysyl hydroxylse. 서 피부는표피, 진피, 피하조직으로구성되어이중표피는외부자극으로부터신체를보호하고, 체온조절, 보습유지작용을한다. 진피는섬유성분, 기질성분으로구성되어있으며섬유성분으로존재하는콜라겐은진피층의 9% 를차지하는주요단백질로써피부연결조직을유지하여, 피부에강도와장력을준다. 진피층은피부의물리, 화학적성질을결정하고, 진피층의모세혈관과신경이표피에영양분을보충해주어피부건강과노화에밀접한관련이있 접수일 :29 년 7 월 6 일 / 수정일 :29 년 8 월 26 일채택일 :29 년 9 월 4 일 * This reserh ws supported y grnts from Kore reserh foundtion (26-KRF-531-C63). To whom orrespondene should e ddressed. E-mil:hoyunhi@khu..kr 론 다. 일반적으로피부노화는나이의증가와외부인자들이주요원인인것으로알려져있으나, 나이가증가하면주로섬유아세포의작용과세포수가감소하여섬유성분의합성량이줄어들어피부세포내수분이손실되며, 각질층의구조가변화된다. 또한, ollgense 의작용이증가하여콜라겐의가교된형태가감소함으로써매끄러움, 보습, 팽팽함이감소된다. 1,2) 이는진피의콜라겐함량및합성증가는피부의보습과탄력의증가를의미한다. 3) 콜라겐은비타민 C, oxygen, Fe 2+, α-ketoglutrte, silion 이조효소로작용하여 proline 과 lysine 이각각 hydroxylse 의작용으로전구콜라겐 (proollgen) 으로합성된다. Hydroxylse 는 2가상태의철분과느슨하게결합함으로써활성화되고, 3가의철분으로산화가되면효소의활성을잃는다. 이과정에서비타민 C는산화된철분을다시환원시켜효소를활성화시키며, silion은이들 hydroxylse 최대활성유지를위해필요하다. 4-7) Hydroxyproline 은콜라 29 The Koren Nutrition Soiety

2 56 / 비타민 C, Silion, 철분이콜라겐합성및분해효소에미치는영향 겐의 triple helix 구조에많은부분을차지하며그구조를안정화시키고, 5) hydroxylysine은 hydroxyproline 에비해양적으로적으나콜라겐특유의아미노산으로콜라겐합성의최종단계인 ross-linking 의형성에중요한역할을한다. 8,9) 이와같이콜라겐의 posttrnsltionl modifition 과정은비타민 C, silion, 철분등의영양소와주요구성아미노산인 proline 과 lysine 이함께사용된다. 또한, 생체내에서의콜라겐합성과분해는콜라겐분해에관련된기질단백질분해효소 (mtrix metlloproteinse, MMP) 및 MMPs 작용을저해하는 tissue inhiitor of metlloproteinse (TIMPs) 에의해조절된다. 1) 기질단백질분해효소는여러효소의집합으로구조와기능적특성에따라여러개의집단으로나누어지는데, 11) 이중피부의대표적인콜라겐인콜라겐 Type 1은 MMP-1 에의해분해되고 MMP-1 의작용은세포의항상성을유지하기위해분비되는 2-mrrogloulin이나 TIMP-1 과같은저해제에의해활성이조절된다. 이러한 MMPs 및 TIMPs 등의효소들은섬유아세포를포함한대다수의많은세포들에서분비된다. 12,13) 피부건강과미용을위해콜라겐에대한관심이증가되면서콜라겐함유제품과건강기능식품및향장품등이개발되고, 콜라겐합성과정에서의비타민 C의중요성은여러연구에서입증되고있다. 7) 그러나, 콜라겐합성과정에서조효소로작용하는 silion, 철분등의콜라겐합성및콜라겐의분해효소에미치는영향에관한연구는미비한실정이다. 이에본연구에서는비타민 C, silion, 철분을 HS27 피부섬유아세포에농도별로처리하여콜라겐의합성에관여하는효소인 proline hydroxylse (), lysyl hydroxylse (LH) 와분해에관여하는효소인 MMP-1과저해제인 TIMP-1 의 mrna와단백질발현에미치는영향을알아보고자하였다. 재료및방법재료및시약 본연구에사용한 HS27 피부섬유아세포는한국세포주은행에서분양받아본연구실에서계대배양하여사용하였다. 비타민 C (sori id: A4544), silion (sodium silite solution: ) 및철분 (ferri itrte: F6129) 은 Sigm (Sigm, USA) 에서구입하였다. 1% fetl ovine serum (FBS), Duleo s modified Egle s medium (DMEM), trizol regent는 Gio사 (CA, USA) 에서구입하였고, M-MLV RT, RNse inhiitor는 Promeg (CA, USA) 에서, PCR-premix tue는 ( 주 ) 바이오니아에서구입 하였다., LH, MMP-1 및 TIMP-1 의 1 차항체는 CH- EMICON Interntionl Co (Temeul, CA, USA) 에서구입하여사용하였다. HS27 피부섬유아세포배양 HS27 피부섬유아세포 (Humn derml firolst ell) 는 Polystyrene 세포배양접시에부착시키고 1% FBS (Gio, USA) 를첨가한 DMEM (Gio, USA) 을사용하여배양하였다. 배양시습도는 95%, 온도는 37 를유지하면서 5% CO 2 를계속공급하였다. 14) 비타민 C, 철분, Silion, proline, lysine 표준물질준비 ~1 μm 농도의비타민 C, 5~5 μm 의 silion (sodium silite solution), ~5 μm 의철분 (ferri itrte) 표준물질을 dimethylsulfoxide (DMSO, 최종농도 <.5%, v/v) 에녹여사용하였다. 각표준물질의농도는각영양소의혈청및피부내농도를기준으로하였다. 구체적으로본실험에사용한 sori id 농도는혈청내 sori id 농도 45 μm 7) 및피부내농도인 7.6 μm 을기준으로하여 ~1 μm 범위로정하였다. 9) Silion 과철분은 Silion 의혈청내농도 5~2 μm 15) 과, 철분의혈청내농도 6.27~32.23 μm 16) 를기준으로하여 ~5 μm 을처리농도로정하였다. Reverse trnsriptse PCR 을이용한효소의 mrna 발현측정 각농도의비타민 C, silion, 철분을 3일또는 5일간처리한세포에서 Trizol regent 를이용하여 RNA를분리하고파장 26 nm에서정량하였다. Totl RNA 1 μl (.5 μg/μl) 를 65 에서 1분간가열하고 4 에서 1분동안방치한후 1 μl oligo (dt)15 primer (.5 μg/μl), 1 μl M-MLV RT (1 unit/μl; promeg, USA), 1 μl RNse inhiitor (2~4 unit/μl; promeg, USA), 1 μl 5X RT uffer (25 mm Tris-HCl, ph8.3, 375 mm KCl, 15 mm MgCl 2), 5 μl 2.5 mmol/l dntp mixture,.1% diethylpyroronte (DEPC) 증류수를첨가하고 37 에서 1시간동안가열하여 DNA 를합성하였다. Prolyl hydroxylse (), Lysyl hydroxylse (LH), MMP-1, TIMP-1 의 mrna 발현량을측정하기위하여합성된 DNA 로 RT-PCR 을실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyerldehyde-3-phosphte dehydrogense),, LH, MMP-1, TIMP- 1의 primer sequene는 Tle 1과같다. 의 primer 를각각 1 μl (.5 μg/μl) 씩가하고합성된 DNA 에.1% DEPC-Wter와함께 PCR-premix tue (( 주 ) 바이오니아 )

3 한국영양학회지 (Koren J Nutr) 29; 42(6): 55~515 / 57 Tle 1. Primer sequenes used in RT-PCR Gene GAPDH Prolyl hydroxylse 17,31) Lysyl hydroxylse 32) MMP-1 3) TIMP-1 3) Sense; Anti-sense; Sense; Anti-sense; Sense; Anti-sense; Sense; Anti-sense; Sense; Anti-sense; Primer sequene 5 -TTG TCA AGC TCA TTT CCT GGT ATG-3 5 -GCC ATG TAG GCC ATG AGG TC-3 5 -CCA CAG CAG AGG AAT TAC AG-3 3 -ACA CTA GCT CCA ACT TCA GG-5 5 -GGA ACC TGG CCT ATG ACA CCC T-3 5 -TGC CAT GCT GTG CCA GGA ACT-3 5 -AAG GTT AGC TTA CTG TCA CAC GCT T-3 3 -CGA CTC TAG AAA CAC AAG AGC AAG A-5 5 -TGC TGG GTG GTA ACT CTT TAT TTC A-3 3 -ATC CTG TTG TTG CTG TGG CTG ATA G-5 에첨가하여 Denturtion은 95 에서 3초, nneling은 72 에서 3초, extension 은 72 에서 2분동안 3yle 로진행하였다. 17) LH는 denturtion 94 3초, nneling 52 에서 45초, extention 72 3초간총 4yle 로진행하였다. 18) MMP-1, TIMP-1 는 denturtion 94 3 초, nneling 5 에서 3초, extention 72 1분동안 28yle 로진행하였다. 19) PCR 생성물은 2% grose gel 에서 non-speifi PCR produt 나 primer dimer 등이없는지를확인하였고, 생성물의양을 imging densitometer [Lworks ver.4.6. (imge quisition nd nlysis softwre), UVP, CA] 를사용하여측정하였다. Western lotting 을이용한효소의단백질발현측정, LH, MMP-1, TIMP-1 의단백질발현을 western lotting 으로측정하였다. 각농도의비타민 C, 철분, silion 을 3일또는 5일간처리한세포를 RIPA uffer (2 mm Tris-HCl, ph 8, 15 mm NCl, 1 mm NPO, 1% glyerol, 1 μm NVO, 1 μm mmonium molydte, 1% NP-4,.1% SDS) 에 4 상태로풀어놓고원심분리하여상층액을단백질추출액으로준비하였다. 단백질양은 ovine serum lumin 을표준으로하여 Brdford ssy (Bio Rd) 를이용하여 595 nm에서흡광도를측정하여결정하였다. 준비된단백질을 4x smple uffer 에혼합하고 95 에서 5분간가열한다음 1% SDS-PAGE (polyrylmide gel eletrophoresis) 에서전기영동시킨후 Hyond ECL nitroellulose memrne 에흡착시켰다., LH, MMP- 1 및 TIMP-1 의 1차항체는 5% skim milk,.1% Tween- 2을함유한 PBS에희석시켜서 4 에서 16시간동안반응시킨후,.1% Tween-2 을함유한 PBS로 15분씩 3 차례세척하였다. Bloking solution 으로 1 :5, 배로희석시킨 peroxidse-onjugted nti-igg 2차항체와실 온에서 1시간동안반응시킨후.1% Tween-2을함유한 PBS로 3차례세척하고발색은 ECL hyperfilm 으로확인하였다. 각 Bnd 의 intensity 는 imging densitometer (model GS-7, BIO-RAD, USA) 를사용하여정량화하였다. 통계분석 실험결과는 SPSS ver.13 (SPSS In, Illinois, USA) 통계프로그램을이용하여분석하였으며그결과는평균 ± 표준오차 (men ± SEM) 로표시하였다. 대조군과처리군간의평균에대한유의성은 generl liner model (GLM) 의 Dunn s multiple rnge test를이용하여 p <.5 에서검증하였다. 결 HS27 피부섬유아세포에서비타민 C, silion 및철분이 prolyl hydroxylse와 lysyl hydroxylse의 mrna발현에미치는효과 HS27 섬유아세포에서비타민 C, silion, 철분을혈청및피부내농도범위로 3일또는 5일처리후 RT-PCR로살펴본 prolyl hydroxylse () 의 mrna 발현을 house keeping gene 인 GAPDH 및대조군의발현을기준으로수치화한결과 (Fig. 1), 3일간의 5~1 μm 비타민 C 처리는 의 mrna 발현을현저히증가시켰는데, 특히 5 μm 및 5 μm 의비타민 C 처리군에서 mrna의발현이대조군에비해유의적으로증가하였다 (p =.26). 반면 silion 및철분의 3일간의처리군에서는농도와무관하게 mrna 발현에변화가없었다. 5 μm 비타민 C 의 5일간의처리군에서 3% 까지 의 mrna 발현이현저히증가하였으나, 그증가정도는 3일간의처리에비해서낮았다. Silion 및철분의 5일간의처리는농도와무관하게 mrna 발현에영향을미치지않거나또는억 과

4 58 / 비타민 C, Silion, 철분이콜라겐합성및분해효소에미치는영향 제시켰다. 각영양소의 3일또는 5일간의처리후 Lysyl hydroxylse (LH) 의 mrna 발현을수치화한결과 (Fig. 2), 3일간의 5~5 μm silion 처리군에서 LH의 mrna 발현이대조군에비해유의적으로증가하였다 (p =.12). 2~5 μm 의철분처리군에서도 LH의 mrna 발현이증가하였으나, 비타민 C의 3일간의처리는농도와무관하게발현에영향을미치지않거나또는억제시켰다. 1 μm silion 의 5일간처리는 LH의 mrna 발현을 4% 까지증가시켰으나 (p =.38), 비타민 C 및철분의 5일간의처리군에서농도와무관하게 LH mrna 발현에변화가없었다. 즉, mrna의발현은 3일간의 5~1 μm 비타민 C 에의해가장현저히증가한반면 LH mrna의발현은 3 일간의 5~5 μm silion 처리에의해증가하였다. 5일간의비타민 C 처리는 mrna 발현을증가시켰고 5일간의 silion 처리는 LH mrna 발현을다소증가시켰으나, GAPDH 2,5 2, 1,5 1, A s s5 s1 s25 s5 f f5 f1 f2 f3 f5 GAPDH B s s5 s1 s25 s5 f f5 f1 f2 f3 f5 Fig. 1. Effets of sori id, silion nd iron on prolyl hydroxylse () mrna expressions of ultured humn derml firolsts. Humn derml firolst ultures were treted with sori id (, 5, 1, 5, 1 μm), silion (, 5, 1, 25, 5 μm) nd Fe (, 5, 1, 2, 3, 5, 1 μm) for 3 dys (A) nd 5 dys (B). The expression levels of mrna ws nlyzed y RT-PCR. The signl intensity were quntified the integrted re were perentized to the signl oserved in ontrol ells (). Results shown re mens ± SEM (n = 3)(p <.5).

5 한국영양학회지 (Koren J Nutr) 29; 42(6): 55~515 / 59 그증가정도는 3일간의처리에비해낮았다. 그이외의영양소를처리한군에서는 및 LH의 mrna 발현에변화가없었다. HS27 피부섬유아세포에서비타민 C, silion, 철분이 prolyl hdroxylse () 및 lysyl hydroxylse (LH) 의단백질발현에미치는효과 및 LH 단백질의발현변화를비타민 C, silion 및철 분의 3일및 5일처리후 western lotting 으로살펴보았다 (Fig. 3, 4). 단백질의발현을단백질 loding ontrol 인 β-tin 및대조군을기준으로수치화한결과 (Fig. 3), 비타민 C 처리에의한 mrna의현저한발현증가에도불구하고 (Fig. 1), 3일동안의비타민 C는처리농도및처리기간과무관하게 단백질의발현에영향을미치지않았으나 5 μm 비타민 C의 5일처리군에서 단백질의발현이유의적으로증가하였다 (p =.37). Silion 및철 GAPDH d d 1 A s s5 s1 s25 s5 f f5 f1 f2 f3 f5 GAPDH 5 4 B s s5 s1 s25 s5 f f5 f1 f2 f3 f5 Fig. 2. Effets of sori id, silion nd iron on lysyl hydroxylse (LH) mrna expressions of ultured humn derml firolsts. Humn derml firolst ultures were treted with sori id (, 5, 1, 5, 1 μm), silion (, 5, 1, 25, 5 μm) nd Fe (, 5, 1, 2, 3, 5, 1 μm) for 3 dys (A) nd 5 dys (B). The expression levels of LH mrna ws nlyzed y RT-PCR. The signl intensity were quntified the integrted re were perentized to the signl oserved in ontrol ells (). Results shown re mens ± SEM (n = 3)(p <.5).

6 51 / 비타민 C, Silion, 철분이콜라겐합성및분해효소에미치는영향 분또한처리농도및처리기간과무관하게 단백질의발현에변화가없었다. 반면에 β-tin 및대조군을기준으로수치화한 LH 단백질의발현결과 (Fig. 4), 3일간의 5~5 μm silion 처리군에서 LH의단백질발현은농도의존적으로현저히증가하였다 (p =.11). 3일간의 5 μm 비타민 C 처리가 LH 단백질의발현을증가시킨반면그이외농도의비타민 C 및철분은 LH 단백질의발현에변화를초래하지않았 다. 5일간의비타민 C, silion 및철분의처리는농도와무관하게 LH 단백질의발현에변화가없었다. HS27 피부섬유아세포에서비타민 C, silion, 철분이 mtrix metlloproteinse-1 (MMP-1) 과 tissue inhiitors of metlloproteinse-1 (TIMP-1) 의 mrna 발현에미치는효과비타민 C, silion, 철분의각농도별처리가콜라겐을 β-tin A s s5 s1 s25 s5 f f5 f1 f2 f3 f5 β-tin B s s5 s1 s25 s5 f f5 f1 f2 f3 f5 Fig. 3. Effets of sori id, silion nd iron on prolyl hydroxylse () protein expressions of ultured humn derml firolsts. Humn derml firolst ultures were treted with sori id (, 5, 1, 5, 1 μm), silion (, 5, 1, 25, 5 μm) nd Fe (, 5, 1, 2, 3, 5, 1 μm) for 3 dys (A) nd 5 dys (B). The expression levels of proteins ws nlyzed y western lotting. The signl intensity were quntified the integrted re were perentized to the signl oserved in ontrol ells (). Results shown re mens ± SEM (n = 3)(p <.5).

7 한국영양학회지 (Koren J Nutr) 29; 42(6): 55~515 / 511 분해하는대표적인효소로알려져있는 MMP-1과 MMP- 1의저해제인 TIMP-1 의 mrna 발현에미치는영향에대해알아보았다. HS27 섬유아세포에서비타민 C, silion, 철분을혈청및피부내농도범위로 3일또는 5일처리후 RT-PCR로살펴본 MMP-1의 mrna 발현을 house keeping gene 인 GAPDH 및대조군의발현을기준으로수치화한결과, 3일간의 5 μm 비타민 C를처리한군에서대조군에비해 MMP-1 의 mrna 발현이 2% 증가한반면 (p =.37), TIMP-1 의 mrna 발현은농도와는상관없이대조군보다낮은발현량을나타내었다. 3일, 5일간의 silion 및철분처리군및 5일간의비타민 C 처리군에서 MMP-1 및 TIMP-1 의 mrna 발현은대조군과차이가없었다. 이결과, 각영양소의 3일또는 5일처리후 MMP-1 및 TIMP-1의 mrna 발현은 3일간의비타민 C를 5 μm 처리한군에서 MMP-1 의 mrna 발현이대조군에비해증가한반면 silion, 철분의처리및각군의 5일간의처리에 β-tin A s s5 s1 s25 s5 f f5 f1 f2 f3 f5 β-tin B s s5 s1 s25 s5 f f5 f1 f2 f3 f5 Fig. 4. Effets of sori id, silion nd iron on Lysyl hydroxylse (LH) protein expressions of ultured humn derml firolsts. Humn derml firolst ultures were treted with sori id (, 5, 1, 5, 1 μm), silion (, 5, 1, 25, 5 μm) nd Fe (, 5, 1, 2, 3, 5, 1 μm) for 3 dys (A) nd 5 dys (B). The expression levels of LH proteins ws nlyzed y western lotting. The signl intensity were quntified the integrted re were perentized to the signl oserved in ontrol ells (). Results shown re mens ± SEM (n = 3)(p <.5).

8 512 / 비타민 C, Silion, 철분이콜라겐합성및분해효소에미치는영향 A s s5 s1 s25 s5 f f5 f1 f2 f3 f q 5 B s s5 s1 s25 s5 f f5 f1 f2 f3 f5 Fig. 5. Effets of sori id, silion nd iron on MMP-1 nd TIMP-1 expressions of ultured humn derml firolsts. Humn derml firolst ultures were treted with sori id (, 5, 1, 5, 1 μm), silion (, 5, 1, 25, 5 μm) nd Fe (, 5, 1, 2, 3, 5 μm) for 3 dys. A: The expressions of MMP-1 protein ws nlysis y western lotting. B: The expressions of TIMP-1 ws nlyzed y western lotting. Results shown re mens ± SEM. 서는 MMP-1 및 TIMP-1의 mrna 발현은대조군과차이가없었다. (dt not shown) HS27 피부섬유아세포에서비타민 C, silion, 철분이 mtrix metlloproteinse-1 (MMP-1) 과 tissue inhiitors of metlloproteinse-1 (TIMP-1) 의단백질발현에미치는효과 MMP-1, TIMP-1 단백질의발현변화는비타민 C, silion 및철분의 3가지관련영양소의 3일및 5일처리후 western lotting 을이용하여알아보았다. MMP-1 단백질의발현을단백질 loding ontrol 인 β-tin 및대조군을기준으로수치화한결과 (Fig. 5), 비타민 C 처리군에서농도및기간과무관하게 MMP-1 및 TIMP-1 의단백질발현에변화가없었다. 반면, 5 μm, 5 μm 의 silion 처리군에서각각 MMP-1 및 TIMP-1 의단백질발현이대조군에비해 2% 증가하였다 (p =.11). 철분처리군에서 MMP-1, TIMP-1 의단백질변화는없었다. 각영양소를 5일동안처 리한결과각군에서의유의적인차이는없었다 (dt not shown). 고찰 콜라겐은피부의진피에존재하는섬유아세포에서세포자극을통해합성된다. 콜라겐의전구체인프로콜라겐은주요구성아미노산인 proline 과 lysine 이 prolyl hydroxylse () 와 lysyl hydroxylse (LH) 의영향을받아 hydoxyltion 되면서합성된다. 2) 이 와 LH의활성화에비타민 C와 silion 및철분이 o-ftor 로작용한다. 비타민 C는레몬, 브로콜리등의과일과야채에다량함유되어있는영양소로식이섭취또는국소부위처리시피부의항산화능력을향상시키는것으로알려져있다. 21) 또한, 비타민 C의처리가콜라겐합성에관여하는효소의연구에따르면비타민 C의처리가 와 LH의활성을증가

9 한국영양학회지 (Koren J Nutr) 29; 42(6): 55~515 / 513 시킨다고알려져있다. 2,22) Murd, Sivrjh 등 2) 의연구결과와비교하여, 25 μm 의비타민 C를처리하여효소의활성화를나타냄에있어서는다소차이가있으나본연구결과에서는 3일동안의 5 μm 비타민 C의처리에있어서 의 mrna의현저한증가에도불구하고단백질발현에는대조군과차이가없었다. 그러나, 5일동안의비타민 C 처리에서는다른실험군보다 단백질발현이유의적으로증가하여콜라겐합성과정에서비타민 C가콜라겐의합성효소인 에긍정적인영향을미치는것으로나타났다. 또한, 본연구결과에서비타민 C의 5 μm 농도처리에서 LH의발현이현저하게증가하는것으로보아, 이는 4일동안비타민 C를 1 mm, 1 μm 농도처리하여콜라겐의합성을알아본 Boyer, Gley 등 23) 의연구와비교하여, 본연구에서비타민 C의혈청과피부내의농도범위인 5~5 μm 농도를처리한군에서콜라겐합성효소인 및 LH의단백질발현을증가시킴으로써비타민 C의적은농도로 firolst 의자극을통해콜라겐의합성효소의발현을증가시킬것으로여겨진다. 이와병행하여 3~5 일사이의비타민 C의농도별처리기간은, 5일이상비타민 C를처리는세포배양액내의 H 2O 2 의농도를증가시켜세포의독성을유발한다는 Durte, Almeid 등 24) 의연구와비교하여, 세포독성및비타민 C의안정성에영향을미치지않는기간으로향후콜라겐관련연구에적정수준임을제안한다. 이와는대조적으로비타민 C의처리는 MMP-1, TIMP- 1의발현에는영향을미치지않았다. 이결과는비타민 C 와철분을 firolst 에처리하였을때 MMP-1이증가하였다는 Cmpo, Avenoso 등 25) 의보고와는상이한결과이나, MMP-1이콜라겐을분해하는효소인만큼비타민 C가콜라겐의효소적인분해작용보다는콜라겐의합성에관여하는것으로여겨진다. Silion은곡류와근채류에함유된미량원소로인체의피부, 혈관등에존재하며, 노화가진행될수록체내 silion의함량이감소하게된다. 선행연구에서 Seorn, Nielsen 9) 과 Brel 등 26) 은 silion 이 의활성을증가시킨다고보고하였으나, 본실험의결과에서는모든 silion 처리군에서 의단백질발현을증가시키지못했다. Silion 이 LH의발현또는활성에영향을미치는연구는거의없었으나본연구에서는 5~5 μm silion 을처리한군에서 LH의 mrna 및단백질발현을현저히증가시키는것으로나타났다. 이결과는 silion 을처리한군에서의 LH mrna 발현증가결과와병행하여, 혈청내농도의 silion이피부콜라겐의 posttrnsltionl modifition 관련효소중 lysyl hydroxylse mrna의발현증가를초래하여궁극적으로 LH 단백질의발현을증가시킴과동시에 LH의최대활성을유지시켜콜라겐의 ross-link 구조를유지하는것이라여겨진다. 또한, 본연구에서 silion 의 5 μm를처리한군에서 TIMP- 1의단백질발현이현저히증가하였고, 5 μm 의처리군에서는 MMP-1 의단백질발현이대조군에비해증가하였다. 이는 M, Sun 등 27) 의연구에서 silion 이사람폐의 firolst 에서 MMP-1, TIMP-1 의발현이증가한다는보고와일치하는결과로 silion의처리가콜라겐분해효소에영향을미치는것을의미한다. 그러나콜라겐의분해효소저해제인 TIMP-1 의단백질발현이증가한 5 μm 의 silion 처리시 MMP-1 의단백질발현에는변화가없었음에도불구하고, TIMP-1 의발현이증가함에따라 silion 의저농도처리는콜라겐의효소적인분해를저해하는효과를나타내었음을의미한다. 철분은고기등의육류및내장류등에함유된미량무기질이다. 철분은콜라겐합성과정에서 Fe 2+ 의형태로 와 LH와결합하여효소의활성에관여한다고보고되어있고, 28) 또한 Switzer, Summer 등 29) 의보고에서.25 μm 의철분이비타민 C와작용하여 proline hydroxyltion 을증가시킨다고하였으나, 본실험의결과에서 와 LH의단백질발현에영향을미치지않았다. 이는합성효소와결합한 Fe 2+ 의형태인철분의산화와비타민 C의환원작용이동시에일어남으로써효소의활성이이루어지는것이나, 본실험에서의철분의단독처리만으로는효소의활성이지속되지않은것으로여겨진다. 또한본실험에서사용된철분의농도는사전연구의농도에반해높은수준으로처리되어추후의연구에서는보다낮은농도를이용한연구가진행되어야할것이다. 이와병행하여 MMP-1과 TIMP-1 의발현에도변화가없었다. 이는철분이비타민 C 와같이처리되었을때 MMP-1 의발현이증가한다는 Cmpo, Avenoso 등 25) 의보고와는상이한결과이나, 본연구에서철분이콜라겐의합성효소와결합하여효소의활성을나타내는조효소인만큼분해효소에는영향을미치지않았다. 이와같은 5~5 μm 의비타민 C 및 silion 의처리에의한피부섬유아세포에서의콜라겐합성을유도하는효소에미치는긍정적인변화가최종적으로콜라겐합성량에관여하는지 in vitro에서의연구가이루어져야할것이며, 콜라겐합성효소및콜라겐합성에긍정적인효과가있는농도를찾아내어추후동물실험을통한연구가진행되어야할것이나, 본연구에서제시된비타민 C 및 silion 의처리후콜라겐합성효소의발현증가는피부탄력증진을

10 514 / 비타민 C, Silion, 철분이콜라겐합성및분해효소에미치는영향 위한건강기능식품소재로의개발가능성을제안한다. 요 본연구에서는비타민 C, silion, 철분을농도별로피부섬유아세포에처리후콜라겐합성효소인, LH의 mrna 와 protein 발현및분해효소인 MMP-1 와저해제인 TIMP- 1의 mrna, protein 발현의변화를대조군과비교 분석하였으며그결과를요약하면다음과같다. 1) 피부섬유아세포에서비타민 C의처리는콜라겐합성효소인 의 mrna 발현을대조군에비해현저하게증가시켰고이와병행하여, 의 protein 발현도대조군에비해유의적으로증가하였다. 그러나다른콜라겐합성효소인 LH의 mrna 발현에는영향을미치지않았으나 protein 의발현을증가시켰다. 또한, 콜라겐분해효소인 MMP-1 의 mrna 발현은대조군에비해유의적으로증가시켰으나 protein 발현에서는대조군과차이가없었다. 2) 피부섬유아세포에서 silion 의혈중내농도처리는 LH의 mrna 발현의현저한증가와더불어 protein 발현에도긍정적인영향을미치는것으로나타났다. 콜라겐분해효소인 MMP-1 과저해제인 TIMP-1 의단백질발현을대조군에비해증가시켰다. 3) 피부섬유아세포에서철분의혈중내농도처리는콜라겐합성및분해관련효소의 mrna 및 protein 발현에영향을미치지않았다. 결론적으로, 피부섬유아세포에서비타민 C 및 silion 의처리는콜라겐의 posttrnsltionl modifition 관련효소의 mrna의발현및단백질의발현을증가시켜궁극적으로콜라겐합성에긍정적인영향을나타내었다. 약 Literture ited 1) Kim NM, Koo BS, Lee SK, Hwng EI, So SH, Do JH. Effet of Koren red ginseng on ollgen iosynthesis nd MMP-Ⅰtivity in humn derml firolst. J Ginseng Res 27; 31(2): ) Mtsumur Y, Annthswmy HN. Toxi effets of ultrviolet rdition on the skin. Toxiol Appl Phrmol 24; 195: ) Fisher GJ, Kng S, Vrni J, Bt-Csorgo Z, Wn Y, Dtt S, Bpprjees JJ. Mehnisms of photoging nd hronologil skin ging. Arh Dermtol 22; 138: ) Elsner P, Wilhelm D, Mih HI. Mehnil properties of humn forerm nd vulvr skin. Br J Dermtol 199; 122: ) Prokop DJ, Berg RA, Kivirikko KI, Uitto J. Intrellulr steps in the iosynthesis of ollgen, Biohemistry of Collgen. In: Rmhndrn GN, Reddi AH, editor. Plenum Press, New York; p ) Jeme G, Jeme B, Jeme BIE. The effet of superfiil hydrtion the mehnil properties of humn skin in vivo. Plst Reonstr Surg 199; 85: ) Pinnell SR, Murd S, Drr D. Indution of ollgen synthesis y sori id. A possile Mehnism. Arh Dermtol 1987; 123: ) Pssoj K, Rutvuom K, Al-Kokko L, Kosonen T, Kivirikko KI. Cloning nd hrteriztion of third humn lysyl hydroxylse isoform. Pro Ntl Ad Si USA 1998; 95(18): ) Seorn CD, Nielsen FH. Silion deprivtion dereses ollgen formtion in wounds nd one, nd ornithine trnsminse enzyme tivity in liver. Biol Tre Elem 22; 89(3): ) Wlshek M, Tnthev-Poór I, Nderi L, M W, Shneider LA, Rzi-Wolf Z, Shüller J, Shrffetter-Kohnek K. Solr UV irrdition nd derml photoging. J Photohem Photoio 21; 63(1-3): ) Fisher GJ, Kng SW, Voorhees JJ. Retinoi id inhiits indution of -Jun protein y ultrviolet rdition tht our susequent to tivtion of mitogen-tivted protein kinse pthwys in humn skin in vivo. J Clin Invest 1998; 11(6): ) Enjoji M, Kotoh K, Iwmoto H, Nkmut M, Nwt H. Selfregultion of TypeⅠollgen degrdtion y ollgen-indued prodution of mtrix metlloproteinse-1 on holngiorinom nd heptoellulr rinom ells. In vitro Cell Dev Biol Anim 2; 36: ) Fisher GJ, Voorhees JJ. Moleulr mehnism of photoging in humn skin in vivo nd their prevention y ll-trns retinoi id. Photohem Photoiol 1999; 69(2): ) Tjim S, Pinnel SR. Asori id preferentilly enhnes type I nd III ollgen gene trnsription in humn skin firolsts. J Dermtol Si 1996; 11: ) Crlisle EM. Silion: requirement in one formtion independent of vitmin D. Clif Tissue Int 1981; 33: ) Che P, Xu J, Shi H, M Y. Quntittive determintion of serum iron in humn lood y high-performne pillry eletrophoresis. J Chromtogr B Biomed Si Appl 1995; 669: ) Fähling M, Perlewitz A, Doller A, Thiele BJ. Thiele. Regultion of ollgen prolyl 4-hydroxylse nd mtrix metlloproteinses in firosrom ells y hypoxi. Comp Biohem Physiol Prt C 24; 139: ) Uzw K, Grzesik WJ, Nishiur T, Kuznetsov SA, Roey PG, Brenner DA, Ymuhi M. Differentil expression of humn lysyl hydroxylse genes, lysine hydroxyltion, nd ross-linking of type I ollgen during osteolsti differentition in vitro. J Bone Miner Res 1999; 14(8): ) Sim GS, Kim JH, Lee DH, Prk SM. Pyo HB, Zhng YH, Lee BC. Effets of the Sptholoi Culis extrt on Antioxidtion nd inhiition of Mtrix Metlloproteinse in Humn Skin Firolsts. Koren J Biohnol Bioeng 25; 2(1): ) Murd S, Sivrjh A, Pinnell SR. Prolyl nd lysyl hydroxylse tivities of humn skin firolst: effet of donor ge nd sorte. J Invest Dermtol 198; 75: 44-47

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence