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주승 기
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1 한국산학기술학회논문지 Vol. 10, No. 7, pp , 2009 강경희 1,3, 남진식 2, 진익렬 3* 1 건양대학교치위생학과, 2 수원여자대학식품영양과, 3 경북대학교대학원미생물학과 Expression of Acid Stress-Induced Proteins of Streptococcus mutans Isolated from Korean Children with Caries Kyung-hee Kang 1,3, Jin-Sik Nam 2 and Ingnyol Jin 3* 1 Department of Dental Hygiene, Konyang University 2 Department of Food&Nutrition, Suwon Women's College 3 Department of Microbiology, Graduate School, Kyungpook National University 요약본연구에서는한국인아동의우식치아로부터 S. mutans를분리하고, acid stress하에서분리한 S. mutans의내산성능력과관련된단백질을규명하고자하였다. 2D gel electrophoresis를수행한결과, acid stress동안 elongation factor Ts, hypothetical protein, putative amino acid ABC transporter, adenylate kinase, fructokinase, Putative 40K cell well protein precursor, peptide deformylase, shikimate 5-dehydrogenase, mannose-6-phosphate isomerase, threonine synthase, putative dtdp-glucose-4,6-dehydratase의발현량이뚜렷이증가하였으며이들단백질은 acid stress에관여하는단백질들로추정된다. Abstract In this study, we are interested in comparing the protein profiles of acid-shocked and control cells of S. mutans isolated from Korean children with caries. The results of 2D gel electrophoresis showed that twelve proteins are up-regulated when the cells were grown under 20 mm lactic acid stress in the exponential phase. Up-proteins under acid stress were estimated a major key of the survival and proliferation of S. mutans in low ph environments. These proteins are estimated generally associated with three biochemical pathways: glycolysis, alternative acid production and branched-chain amino acid biosynthesis. Key Words : Acid, Korean, Stress, Streptococcus mutans 1. 서론 치아우식증의주요원인균주로써 Streptococcus mutans가밝혀진이래로관련된많은연구가진행되어왔다 [1,2]. S. mutans는구강내에상재하는통성혐기성균으로치면의피막에부착후 sucrose를기질로하여 glycolysis 의 end-product로서 lactic acid를생산하며, glucosyl transferase를분비하여 glucose 중합체인불용성 glucan을형성한다. 이러한 glucan은불용성의점액성물질로서치 아표면에부착하여치면에세균부착을도우며생성된유기산을국소적으로체류시킴으로치질의탈회를가속화시키는역할을한다. 결과적으로 S. mutans는치면에부착하여당질대사를통하여고농도의산을생산하고법랑질을탈회시킴으로써치아우식을유발시킨다 [3]. 많은연구들은 S. mutans가탄수화물분해에의해서생성되는산에의해형성되는낮은 ph에서도당질대사를수행하며생존할수있는산에대하여가장잘견디는균주로보고해왔으며 [4,5], S. mutans의이러한능력은다른구강내세균과구분되는특성으로서충치의진행 * 교신저자 : 진익렬 (jinin@knu.ac.kr) 접수일 09 년 07 월 06 일수정일 09 년 07 월 17 일게재확정일 09 년 07 월 22 일 1766

2 에있어서결정적인영향을미치는것으로알려져있다 [6]. 내산성세균의산저항기작에대한많은연구들을통하여산에대한적응및방어기작은병원성을나타내는데중요한요소로작용한다는결과가보고되고있으며 [7], S. mutans의경우도특유의 acid stress와관련된기작들이치아우식증유발에주요한병독성으로작용하는것으로생각된다. 지금까지치아우식에관여하는 S. mutans의내산성과관련된생리적, 기능적및유전적특성에관한연구는대부분백인을대상으로해서보고되어졌으며 [8], 현재국내에서진행되는 S. mutans 관련연구는항균및유기산억제효과를지니는천연물질의탐색에관한것이대부분이다 [9]. 국내에서도한국인의치면으로부터 S. mutans의분리에관한연구는이루어지고있으나 [10], 치아우식의발생과관계있는단백질및이와관련된유전자에관하여는 glucosyltransferase와 fructosyltransferase를 coding하는 glucosyltransferase gene와 fructosyltransferase gene외에는거의보고된바가없다 [11]. 치아우식증에대한근본적인원인해결을위해서는 S. mutans에의한치아우식증발병과정의분자생물학적기작과 S. mutans가구강내부환경에노출시겪는다양한 stress에저항하는능력등을분석하는연구가필요하며, 특히 S. mutans의산에대한 stress에저항하는방어기작에관한연구는치아우식증에대한주요한해결책을제시할수있을것으로생각된다. 따라서, 본연구에서는한국인 12세미만아동의우식치아를대상으로세균을채취하여 S. mutans를분리하고, acid stress하에서분리한 S. mutans의내산성능력과관련된단백질을규명하고자하였다. 2. 재료및방법 2.1 사용균주 우식이진행되고있는 12세미만아동의치아우식부위로부터분리한 S. mutans K7을 [12] 다음의실험에사용하였으며대조균주는한국유전자은행 (KCTC, Daejeon, Korea) 으로부터분양받은 S. mutans KCTC 3065를사용하였다. 2.2 균주배양순수배양된각각의균주를 BHI 액체배지에 one loop 접종하고 37 에서 12시간배양하여전배양한균주로사용하였다. 고압멸균한 BHI 액체배지에전배양한균주를 1% 접종하여 37 에서배양하면서실험에이용하였다. 2.3 DNA염기서열분석 Genomic DNA의분리는 genomic DNA isolation kit (Nucleogen, Korea) 를이용하였다. 구조유전자의 DNA를증폭하기위하여 S. mutans UA159의 genomic sequence 를기초로 primer를설계하였다 [ 표 1]. PCR 반응은분리한 genomic DNA 50 ng에 25 μm forward 및 reverse primer (Bioneer, Korea) 를각각 4 μl, 10x PCR reaction buffer를 5 μl, 2.5 mm dntp를 2 μl, 2.5 units Taq DNA polymerase (Bioneer, Korea) 를 0.5 μl첨가하였으며나머지는증류수를이용하여최종 50 μl로맞추었다. 이를 PCR 반응 tube에넣고다음조건에따라 PCR 반응을실시하였다. 먼저 94 에서 5분간반응한다음 denaturation 을 94 에서 45초, annealing을 55 에서 1분, extention을 72 에서 1분을 30회반복하고, final extention을 72 에서 10분실시하였다. [ 표 1] PCR 및 sequencing primers No Primers Nucleotide sequences(5 3') Target gene product 1 1F ATG CCA GAT AAT CGC ATG AAC 689R AAA CGA CCA CAA CAG GAT GTC CC Hypothetical protein 2 33F ACA TAA ACA TTT TGG TAA AAA TGA GG 732R CCC TAA AGG AAC CTT TTC ACA AT Putative amino acid ABC transporter 3 4F AAT CTT TTA ATC ATG GGA TTG CC 597R AAC TTC CTT TAG TTC TAT AGT TAA TA Adenlate kinase 4 5F TGC TAT TAA AAC TAT TAC TAA AGC CAG 596R TTT AGG AAA ACT TTA TTT TCT TCC Peptide deformylase 5 22F CGT TTA GCA GCT GTT GTC GC 834R CTT TAC GGC TCA GTC CTT TAG Shikimate 5-dehydrogenase 1767

한국산학기술학회논문지제 10 권제 7 호, 2009 Thermal cycler는 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA) 을이용하였다. PCR 반응물은 1.0% agarose gel에서전기영동하여 DNA의증폭유무와농도를확인하였다.

3 한국산학기술학회논문지제 10 권제 7 호, 2009 Thermal cycler는 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA) 을이용하였다. PCR 반응물은 1.0% agarose gel에서전기영동하여 DNA의증폭유무와농도를확인하였다. PCR product는 QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Germany) 를이용하여정제하였으며, 정제된 PCR products은염기서열분석에이용되었다. 염기서열분석은 PCR primer를 sequencing primer로하여수행하였으며, Macrogen (Seoul, Korea) service를이용하여결정하였다. 2.4 단백질추출균체를세척한후 10배부피의 7 M urea, 2 M Thiourea, 4% (w/v) 3-[(3- cholamidopropy) -dimethyammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS), 1% (w/v) dithiothreitol (DTT), 2% (v/v) pharmalyte, 1 mm benzamidine로구성된시료용액과혼합하여 homogenizer (PowerGen125, Fisher Scientific, USA) 로분해하였다. 그리고단백질추출을위해서 1시간동안 vortexing 하였으며, 15 에서 15,000 rpm으로 1시간동안원심분리하여상등액을이차원전기영동의시료로사용하였다. 단백질의농도측정은 Bradford법 [13] 으로수행하였다 D gel electrophoresis 일차 isoelectric focusing (IEF) 을위하여 IPG strips은 7 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 1% DTT, 1% pharmalyte로구성된 reswelling 용액으로상온에서 시간정도 reswelling 되었다. Strip 당시료는각각 200 ug씩을사용하였다. IEF 조건은 150 V에서 3,500 V까지 의도달시간을 3시간되게하였으며, 3,500 V에서 26시간지속되도록하여최종적으로 96 kvh 가되도록설정하였다. 이차적으로 SDS-PAGE를수행하기전에 IPG strip을 1% DTT를함유한 equilibration buffer (50 mm Tris-Cl, ph6.8, 6 M urea, 2% SDS, 30% glycerol) 로 10분간 incubation 하였으며, 곧바로 2.5% iodoacetamide를함유한 equilibration buffer로 10분간더 incubation 하였다. Equilibration이완료된 strips을 SDS-PAGE gels (20x24 cm, 10-16%) 위에배열시키고전기영동을수행하였다. 이차원전기영동이완료된이차원젤의단백질은은염색으로시각화되었다. 단백질 spots의발현변화확인을위한정량적인분석및질량분석기에의한단백질동정은 Genomine (Pohang, Korea) service를이용하였다. 3. 결과및고찰 3.1 내산성에관련된단백질발현분석 S. mutans KCTC 3065와한국인아동의치아우식부위로부터분리한균주인 S. mutans K7을대수증식기까지배양시켜 40-50% 정도성장이저해되는 20 mm의 lactic acid를본실험의 mild-shock으로결정하고 1시간동안처리한후, 2D gel electrophoresis를수행하였다. PDQuest를통해 image analysis결과, acid stress동안 S. mutans K7에서 12개의단백질이 S. mutans KCTC 3065에서보다발현량이현저히증가한것을관찰할수있었다 [ 그림 1]. MALDI-TOF를이용하여 12개의단백질을동정한결과, 1개를제외한 11개의단백질이동정되었으며, 이들 [ 그림 1] 2D gel 이미지분석을이용한 20 mm 의 lactic acid stress 동안단백질발현분석. A, S. mutans K7 의 2D gel 이미지모식도 ; B, S. mutans K7; C, S. mutans KCTC

4 [ 표 2] MALDI-TOF를이용한 peptide mass fingerprinting에의한단백질동정 Spot No Accession No. a Score Coverage MW(kDa) pi Protein name Change elongation factor TS up hypothetical protein up putative amino acid ABC transporter up adenylate kinase up fructokinase up putative 40K cell wall protein precursor up peptide deformylase up shikimate 5-dehydrogenase up mannose-6-phosphate isomerase up no identification up threonine synthase up putative dtdp-glucose-4,6-dehydratase up a Number of protein sequence database hosted by the NCBI, USA. 단백질은 elongation factor Ts, hypothetical protein, putative amino acid ABC transporter, adenylate kinase, fructokinase, Putative 40K cell well protein precursor, peptide deformylase, shikimate 5-dehydrogenase, mannose-6-phosphate isomerase, threonine synthase, putative dtdp-glucose-4,6-dehydratase으로판명되었다 [ 표 2]. S. mutans K7에서현저하게발현량이증가된결과를보인 12개의단백질은 K7에서 acid stress에관여하는특이적단백질들로이들단백질은 glycolysis, alternative acid production 및 branched-chain amino acid biosynthesis에관여하는것으로추정된다. 스트레스노출은 transcription과 translation의오류에기인한비정상적인구조의단백질의축적을유발한다. 이와관련하여분자샤페론과 protease는단백질의안정성을조절하고 misfolded protein의축적을방지함으로생리적항상성유지에기여한다. acid stress동안몇몇의분자샤페론과 protease 및 DNA repair enzyme의발현이증가됨이보고되어졌다. GroEL과 DnaK는 protein folding, renaturation 및 degradation에관여하는분자샤페론으로 DnaK는 biofilm형성및 acid, heat, H 2O 2 스트레스에관여하며 F-ATPase 복합체의안정화에관여하고, GroEL은 biofilm형성및 heat 스트레스에관여하는것으로보고되었다 [14]. 또한 HtrA peptidase, ribosome-associated peptidyl- prolyl isomerase (RopA) 와 ClpP peptidase은 S. mutans의다양한 stress와 biofilm형성에관여하는것으로 보고되고있다 [15]. 이러한연구결과를볼때 acid stress protein은 heat shock stress, oxidative stress 등과같은 stress response와도밀접한상관관계를형성하고있는것으로보여진다. 또한, Ssb (single-stranded DNA-binding protein), GreA (transcription elongation factor), PnpA (polyribonucleotide nucleotidyltransferase), PepD 등의단백질도낮은 ph 환경에서 S. mutans의생존과증식에주요한생리적인역할을담당하는것으로알려져있다 [16]. 3.2 DNA 염기서열분석 Acid stress 동안 S. mutans K7에서현저하게발현량이증가된 12개의단백질중 hypothetical protein, putative amino acid ABC transporter, adenylate kinase, peptide deformylase, shikimate 5-dehydrogenase를 coding하는유전자를각각 PCR 증폭하여 S. mutans KCTC 3065의유전자와비교분석하였다. PCR 클론들의염기서열을분석하였으며, 염기서열비교시 primer 부분은제외하였다. 염기서열해석을위해 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 의 BLASTN algorithm을이용한 GenBank database에의해구조유전자를확인하였다. S. mutans K7과 S. mutans KCTC 3065의유전자염기서열은 CLUSTAL X program (Thomsonetal., 1997) 으로 Multiple Sequence Alignment에의해비교분석하였다. 1769

5 한국산학기술학회논문지제 10 권제 7 호, 2009 유전자염기서열은분석한 5가지유전자모두에서차이를나타내었다. Hypothetical protein gene은 99.4% 의 identity 그림 2를나타내었으며, putative amino acid ABC transporter gene은 99.7% 그림 3, adenylate kinase gene은 99.8% 그림 4, peptide deformylase gene은 98.9% 그림 5, shikimate 5-dehydrogenase gene은 99.1% 그림 6의 identity를각각나타내었다. [ 그림 5] S. mutans KCTC 3065 와비교한 S. mutans K7 의 Peptide deformylase gene sequences. [ 그림 2] S. mutans KCTC 3065 와비교한 S. mutans K7 의 Hypothetical protein gene sequences. [ 그림 6] S. mutans KCTC 3065 와비교한 S. mutans K7 의 Shikimate 5-dehydrogenase gene sequences. 4. 결론 [ 그림 3] S. mutans KCTC 3065 와비교한 S. mutans K7 의 Putative amino acid ABC transporter gene sequences. [ 그림 4] S. mutans KCTC 3065 와비교한 S. mutans K7 의 Adenylate kinase gene sequences 한국인아동우식치아로부터분리한 S. mutans K7에서 acid stress동안 12개의단백질이 S. mutans KCTC 3065에서보다발현량이현저히증가하였다. 이들중 1 개를제외한 11개의단백질이동정되었으며 elongation factor Ts, hypothetical protein, putative amino acid ABC transporter, adenylate kinase, fructokinase, putative 40K cell well protein precursor, peptide deformylase, shikimate 5-dehydrogenase, mannose-6-phosphate isomerase, threonine synthase, putative dtdp-glucose-4,6-dehydratase 으로판명되었다. 12개의단백질중 hypothetical protein, putative amino acid ABC transporter, adenylate kinase, peptide deformylase, shikimate 5-dehydrogenase를 coding하는유전자를각각 PCR 증폭하여 S. mutans KCTC 3065의유전자와비교분석한결과는평균 99.4% identity를보였다. 1770

앞으로산성환경에서특정단백질의발현과함께 S. mutans의내산성을결정하는또다른중요한요인인세포질막의물리적성질, 그와관련되는지방산조성의변화및 H + -ATPase를비롯한세포질막에발현되는다양한효소의양과활성등과의상관관계를밝히는통합적인연구들도수행되어져야할것으로생각된다. S. mutans가다른구강내미생물들과는달리내산성을가질수있는이러한생리적인원인의규명은치아우식증예방에지대한기여를할수있을것이라기대되어진다.

6 앞으로산성환경에서특정단백질의발현과함께 S. mutans의내산성을결정하는또다른중요한요인인세포질막의물리적성질, 그와관련되는지방산조성의변화및 H + -ATPase를비롯한세포질막에발현되는다양한효소의양과활성등과의상관관계를밝히는통합적인연구들도수행되어져야할것으로생각된다. S. mutans가다른구강내미생물들과는달리내산성을가질수있는이러한생리적인원인의규명은치아우식증예방에지대한기여를할수있을것이라기대되어진다. 참고문헌 [1] Marsh PD. Microbiological aspects of the chemical control of plaque and gingivitis. J Dent Res, Vol 71(7), pp , [2] Li YH, Lau PCY, Tang N, Svensater G, Ellen RP, Cvitkovitc DG. "Novel two-component regulatory system involved in biofilm formation and acid resistance in Streptococcus mutans.". J Bacteriol, Vol 184(22), pp , [3] Trahan L. "Xylital : a review of its action on Mutans streptococci and dental plaque-its clinical significance." Int Dent J, Vol 45(1), pp.77-92, [4] Belli WA, Marquis RE. "Adaptation of Streptococcus mutans and Enterococcus hirae to acid stress in continuous culture." Appl Environ Microbiol, Vol 57(4), pp , [5] Mcneill K, Hamilton IR. "Acid tolerance response of biofilm cells of Streptococcus mutans." FEMS Microbiol lett, Vol 221(1), pp.25-30, [6] Inoue M, Koga T. "Fractionation and properties of glucans produced by Streptococcus mutans." Infect Immun, Vol 25(3), pp , [7] Lee IS, Slonczwski JL, Foster JW. "A low-ph-inducible, stationary phase acid tolerance response in Salmonella typhimurium." J Bacteriol, Vol 176(5), pp , [8] Zhu I, Kreth J, Cross SE, Gimzewski JK, Shi W, Oi F. "Functional characterization of cell-wall-associated protein WapA in Streptococcus mutans." Micobiology, Vol 152(Pt 8), pp , [9] 박윤미, 김선재, 조광호, 양은정, 정순택. " 생약재의항충치및항산화효과탐색." J Korean Soc Food Sci Nutr, Vol 35(3), pp , [10] 국중기, 박종휘, 유소영, 김화숙이난영. " 소아의치면세균막에존재하는 Mutans Streptoocci의분포." 대한소 아치과학회지, Vol 1(3), pp , [11] 송요한, 김동섭, 정승룡, 서경석, 장기완. "Streptococcus mutans 균주들의성장과 glucosyltransferase 활성에미치는 caffeic acid phenethyl ester의억제효과." 대한구강보건학회지, Vol 25(3), pp , [12] 강경희, 남진식, 진익렬. "Isolaion and characterization of the Streptococcus mutans from Korean children with caries." 대한의생명과학회지, Vol 13(4), pp , [13] Bardford MM. "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding." Anal Biochem, Vol 72, pp , [14] Lemos JA, Luzardo Y, Burne RA. "Physiologic effect of forced down-regulation of dnak and GroEL expression in Streptococcus mutans." J Bacteriol, Vol 189, pp , [15] Lemos JA, Burne RA. "A model of efficiency: stress tolerance by Streptococcus mutans." Microbiology, Vol 154(Pt 11), pp , [16] Len AC, Harty DW, Jacques NA. "Sress-responsive proteins are upregulated in Streptococcus mutans during acid tolerance." Microbiology, Vol 150(Pt 5), pp , 강경희 (Kyung-hee Kang) [ 정회원 ] < 관심분야 > 미생물학 2001 년 8 월 : 경북대학교대학원미생물학과 ( 박사수료 ) 2005 년 3 월 ~ 현재 : 건양대학교치위생학과전임강사 1771

(Ingnyol Jin) [ 정회원 ] 1986 년 3 월 : University of Tokyo( 농학박사 )

7 한국산학기술학회논문지제 10 권제 7 호, 2009 남진식 (Jin-Sik Nam) [ 정회원 ] 2001 년 8 월 : 충남대학교미생물학과 ( 박사수료 ) 2004 년 3 월 ~ 현재 : 수원여자대학식품영양과조교수 진익렬 (Ingnyol Jin) [ 정회원 ] 1986 년 3 월 : University of Tokyo( 농학박사 ) 1986 년 4 월 ~ 현재 : 경북대학교생명공학부교수 < 관심분야 > 미생물학 < 관심분야 > 미생물학 1772

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence