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5 목 차 I. 서론 1 II. 나노물질의물리화학적특성분석방법 9 1. 나노입자의크기및입도분포도시험 나노입자의응집및엉김상태시험 나노입자의결정특성파악 나노입자의투과전자현미경분석 나노입자의제타전위측정을통한표면전하측정시험 나노입자의표면화학특성 나노입자의광활성 나노입자의물분산안전성 나노입자의수화정도측정시험 나노입자의산화환원전위측정시험 나노입자에의한라디칼형성가능성 용액내나노입자의개별거동과집단거동 나노입자의제타전하에대한입자크기의민감도측정시험 나노입자의가역및비가역응집현상 토양 / 액상계면에서나노입자분포측정시험 토양매질에서나노입자의이동성평가를위한침출시험 나노입자에대한옥탄올-물분배계수시험 123

6 III. 나노물질의독성시험방법 나노물질의지렁이급성독성시험 나노물질의육생식물생장시험 나노물질 90일반복흡입독성시험 나노물질의독성동태시험 나노물질의발생독성시험 175 IV. 나노물질전과정평가 (LCA) 방법 개요 185 제1장나노물질전과정평가의목적 187 제2장적용범위 188 제3장용어정의 나노물질전과정평가절차 195 제1장목적정의및범위설정 197 제2장목록조사 205 제3장영향평가 217 제4장개선평가 244 참고문헌 251

7 제조나노물질안전성시험방법해설서 I. 서론 - 1 -

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9 제조나노물질안전성시험방법해설서 제조나노물질은동일성분의일반화학물질과는달리나노수준의미세입자로인하여새로운특성을갖는화학물질입자이고, 이러한특성으로여러가지새로운상업적목적으로활용될가능성을가진다. 반면, 나노입자가갖는미세입자로서의특성으로인해사람의건강과환경에의도하지않는위해를미칠가능성이제기되었고, 이러한위험가능성으로인해소비자에대한노출은신중하게평가되고관리할필요가있다. 특히, 2013년 9월 OECD 이사회에서 OECD 제조나노물질안전성시험및평가권고안이채택되어각회원국에서 3년이내에권고안을이행하고, 기술적측면을면밀히모니터링하여이사회에보고할예정이다. 2007년부터환경부와국립환경과학원에서는다양한나노물질안전성시험연구를수행하였다. 그결과를바탕으로작성된본해설서는제조나노물질의위해성평가에필요한 나노물질의물리화학적특성 (Physico-Chemical Properties of Nanomaterials, PChem) 에관한기초자료를생산하는방법론을예시하는것에목적이있다. 아울러나노물질의환경및인체위해성에관한주요물리화학적특성인자가무엇인지를밝히고, 이를통해안전하게나노물질을제조 사용할수있는기반을마련하고자한다. 1. 적용범위및대상나노물질의물리화학적특성은 OECD에서권고한 17개분석항목이며본해설서에서는 10개의물리화학적특성과 5개의환경거동특성에관한분석방법을제시하고자한다. 여기서적용가능한물리화학적특성은응집, 결정성, 투과전자이미지, 표면전하, 표면화학, 광활성, 물분산성, 비생물학적분해 / 수화, 산화환원전위, 라디칼형성등이다. 이중에서물분산성과비생물학적분해 / 수화는환경거동에관한정보로도활용된다. 환경과관련한물리화학적특성은개별거동 / 집단거동, 제타전위의입자크기민감도, 가역 / 비가역응집, 토양 / 액상계면내입자분포, 토양매질내이동성등이있다. 그리고본해설서는재료공학목적의물리화학적특성자료생산이아닌위해성평가를위한유해성시험목적의나노물질의정량, 정성적특성을파악하는것에 - 3 -

10 목적을두고있다. 따라서나노물질위해성에관한시험을수행하는연구자, 대상나노물질을제공 ( 제조, 분석 ) 하는작업자등이사용할수있다. 단, 스모그, 자동차배기가스, 연소가스, 용접흄, 산불, 비산먼지등에함유된자연적, 비의도적발생나노물질과동일성분이지만크기가마이크로미터이상의물질에는적용되지않는다. 2. 대상나노물질정의 2.1 나노물질나노 (nano) 는일반적으로 10억분의 1(10-9 ) 미터 (m) 에해당하는길이를의미하며, 크기차원에서는최소한 1개차원의길이가 100 nm 미만인물질이나노물질에해당한다. 우리나라 ( 환경부 ) 는 나노물질 을 3차원의외형치수중최소 1차원이상이나노크기 (1~100 nm) 인 1차입자또는비표면적이 60 m 2 /cm 3 이상인의도적으로제조된것으로정의하고있다. 나노물질환경노출도평가의대상이되는성상은대기중으로노출되는분말 ( 고체 ) 상나노물질, 수계로노출되는액상내나노물질 ( 콜로이드포함 ), 액상반응중에대기중으로노출되는에어로졸형태의나노물질등이다. 나노물질은금속계 ( 은, 금, 철, 양자점등 ), 산화물계 ( 실리카, 타이타니아, 알루미나, 세리아등 ), 탄소계 ( 플러렌, 탄소나노튜브등 ), 고분자계 ( 폴리스티렌등 ) 로구성되며, 제조공정에따라서액상내분산상또는기상내분말상의형태를지닌다. 대상나노물질은순수한균일상이나다른물질 ( 안정제, 분산제, 기능기등 ) 과혼합된비균일상으로존재한다. 2.2 은은 (Ag) 나노물질은제조방법에따라, 염 (AgNO 3 ) 의환원을통해액상에분산된형태나은와이어 (silver wire) 에플라즈마처리를통해얻어지는분말형태를지닌다. 은나노물질은제조방법에따라서 1~100 nm 크기로제조가능하며, 분 - 4 -

11 제조나노물질안전성시험방법해설서 산제의종류에따라표면의유기물층의변화가발생한다. 은나노물질은액상의 ph 조건에따라쉽게이온화가잘되는특성이있어서, 낮은 ph 조건에서는 Ag + 이온을용출하여은나노물질과이온이함께존재하게된다. 또한액상내염이존재하는경우에는쉽게응집하려는경향이있으며, 대기중노출시용액의증발과함께잔류물질의응집이촉진된다. 분말상은나노물질은그대로사용하거나액상에분산하여사용하는데, 분산시에는분산제 ( 계면활성제, 안정제, 고분자등 ) 를첨가하여분산을돕거나 10 khz 이상의강도를지닌초음파처리기 (homogenizer, ultra-sonifier) 를이용하여분산시킨다. 은자체의항균, 살균기능으로인해젖병, 화장지, 포장지, 살균기, 정수기, 의복, 양말등에사용되며, 치약및비누에도미량포함시켜제조판매한다. 산업적으로는은나노잉크와전자제품의도선을연결하는데사용된다. 2.3 이산화티타늄이산화티타늄 (TiO 2 ) 나노물질은 TiCl 4 전구체를수열합성법, 초임계유체법등을통해제조한다. 제조된물질은제조방법에따라콜로이드나분말로만들어진다. 분말상으로제조시에는나노크기의 1차입자들의응집으로수십마이크로미터크기까지커지기도하지만, 적절한분산법을이용하면나노크기를유지하게할수있다. 부르는명칭은이산화티탄, 타이타니아, 타이타늄옥사이드로도불린다. 이산화티타늄은수계에잘분산되며, 기능성물질에따라서친수성과소수성제어가용이하다. 이산화티타늄은 50 nm 미만의크기를지닐때는 UV에서활성을지닌광촉매로서유기물분해특성이있고, 이를이용한새집증후군예방제품으로사용되고있다. 특히 200 nm 이상의이산화티타늄은 ZnO와함께 UV 차단제의구성성분으로활용되고있다. 또한나노분말을혼합한페인트를건물외벽에칠했을때는반영구적으로깨끗한외벽을유지하게도해준다

12 2.4 탄소나노튜브탄소나노튜브 (CNT) 는탄소로구성된결정형물질로다양한탄소전구체를아크방전법, 플라즈마화학증착법, 열분해법등으로건식제조한다. 아크방전법으로제조시에는철, 코발트, 니켈과같은촉매점을이용할경우는대체로단일벽나노튜브 (SWCNT) 가형성되며, 촉매가없을경우는다층벽나노튜브 (MWCNT) 가생성된다. 화학증착법은온도조건에따라서단일벽또는다층벽이형성된다. 제조방법에따라서불순물이포함되거나결정내결함이있는나노튜브가제조되기도하며, SWCNT 는결정에따라반도체성과도체성으로구분된다. 탄소나노튜브는직경이 1~3 nm(swcnt) 에서수십 nm(mwcnt) 이상으로성장시킬수있으며, 단일체나다발형태로도만들어지며길이는수 mm 이상도성장시킬수있다. 모양자체가창 (spear) 형태를보이기때문에석면과유사한생물체위해특성을지닐수있다. 탄소나노튜브는전기전도성및열전도성이우수하고기계적강도가철보다 100 배이상높아서다양한복합소재로활용된다. 테니스라켓이나골프채를만드는소재로사용되거나반도체소자, 차세대연료전지및수소저장매체, 전자기차폐물등을구성하는데사용된다. 2.5 기타나노물질금나노입자 (Au) 이나백금나노입자 (Pt) 는촉매로사용되어다양한지지체에고정된복합체형태를지니며, 금속나노입자는고유한색상을지녀다양한안료물질로도활용된다. 수열합성법으로제조되는실리카나폴리스티렌, 열분해방법으로제조되는카본블랙도나노물질에해당되며, 그성상은제조방법에따라서구형, 선형, 삼각형, 응집형등다양한모양을지닌다. 이밖에도단일결정구조를지닌나노와이어도제조되고있으며, 센서제조에사용되고있다

13 제조나노물질안전성시험방법해설서 3. 나노물질의물리화학적분석및안전성시험현황 OECD는나노물질의위해성평가에가장기초가되는자료인응집, 용해도, 결정성, 입도분포, 입자크기, 비표면적, 표면특성, 표면화학, 광학특성등 17가지를주요물리화학적특성으로지정하고있다. 대상물질에따라서광학특성이나타나지않을수있고, 용해도가없을수도있다. 크기와입도분포는 TG 110, 광촉매활성도는 TG 316, 물분산성 TG 112, 가수분해 TG 111, 물 / 옥탄올분배계수 TG 107에등재되어있다. 등재된표준분석법자체가나노물질이산업적으로활성화되기이전인 2000년이전에작성된것이다. 입자형태 나노입자종류 물리화학적 특성 (PChem) 고체분말 액체콜로이드 금속계 AgNP 산화물계 TiO 2 탄소계 CNT 고분자계 PS 1 Agglo mer a tio n/ a ggr ega tion state O O O O O 2 Crystalline phase/crystallite size O O O O X 3 R epr esentativ e TE M O O O O O O 4 Size/size distribution O O O O O O 5 Zeta potential/surface charge O O O O O O 6 Surface chemistry O O O O O O 7 Photocatalytic activity X* O** X* X* 8 Dispersion stab ility in water O O O X*** 9 Abiotic degradability, hydr ol ysis O O O O O O 10 Octanol-water partition coefficient O O X*** O 11 Redox potential O O O O O O 12 Radical formation potential O O O O O O * 광촉매활성은없지만광분해 ( 광산화등 ) 시험은가능 **TiO 2 는광촉매활성평가가가능하나, SiO 2 는광촉매활성평가불가능 *** 표면처리하지않은 CNT 는물분산이되지않음 - 7 -

14 그리고금속계나노입자는낮은 ph에서쉽게이온화되어화학물질로서의특성 ( 화학독성 DNA 복제교란, 세포괴사등 ) 과나노입자라는물리적특성 ( 물리독성 세포막흡착및파괴등 ) 을동시에나타낸다. 따라서유기화학물질에대한 TG는무기물질에대한분석에용이하지않을수있다. 나노물질의성상 ( 고체분말, 액체콜로이드 ) 에따라서해당물리화학적특성을파악하기어려울수있다. 또한나노물질의종류 ( 금속계, 산화물계, 탄소계, 고분자계 ) 에따라서도분석조건이달라질수있다. 고체입자의경우, 응집성평가를위해서는용액에분산시켜서시험을해야하며, 물분산도가떨어질경우물분산성, 옥탄올-물분배계수등을평가하기어렵다. 콜로이드형태의액체내나노입자의경우, XRD를이용한결정성분석시에시료를건조하여분석하거나무정형의실리카분말에혼합하여분석해야해서분석결과에노이즈가많이발생한다. 또한수계로제조한나노입자의경우, 옥탄올-물분배계수측정시수계로만물분산이되거나계면에모이게되는현상으로분석상의오차를발생시킨다. 또한광촉매활성시험시에이산화티타늄과같은광촉매특성이나타나는물질은해당물성평가가용이하지만, 은나노물질과같은광촉매활성은없고광분해와같은광활성만나타날경우광촉매분석이어렵다. 이경우는광활성정도를평가하는것이바람직하다. 표면처리하지않은탄소계나노입자는소수성강하여물분산도가상당히좋지않은편이다. 따라서해당물질의물분산도, 옥탄올-물분배계수측정이불가능할수있다. OECD 제조나노물질작업반회의 (Working Party on Manufactured Nanomaterials) 의최근자료에의하면 OECD 시험지침중에나노물질분석에적용가능한시험지침은몇항목에불과하다. 또한일부시험지침은고분자계나노입자에만적용가능한경우도있다. 따라서 OECD 는기존의시험지침을나노물질분석에적용가능한지를조사하여새롭게변형하거나대체방법을제안하는작업을하고있다. 이해설서는그동안수행된국립환경과학원의나노안전성평가사업결과와 OECD 의권고사항을바탕으로나노물질에적용할수있는물리화학적특성및독성시험방법을제안하였다

15 제조나노물질안전성시험방법해설서 II. 나노물질의물리화학적특성 분석방법 - 9 -

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17 제조나노물질안전성시험방법해설서 1. 나노입자의크기및입도분포시험 I. 개요 1. 목적 본시험은물과공기중에서불용성인나노입자의크기및입도분포분석에 관한표준화된방법론을제시하고자한다. 2. 정의 2.1. 크기 (size) 분석대상나노입자의외형적경계를말하는것으로, 구형일경우는직경이 입자의크기가되지만여타모양일경우는길이방향과축방향의크기가다를 수있다. 입자크기분포시험에서주요파라미터는유효유체역학반경 (effective hydrodynamic diameter) 혹은 Stoke 유효반경인 R s 다. 점성을지닌유체에서 중력의영향으로낙하하는작은구의최종속도는다음과같다. ν = 2gR s 2 여기에서, ν = 속도 (m/sec) g = 중력상수 (m/sec 2 ) R s = Stoke 반경 (m)

18 d 1 = 구밀도 (kg/m 3 ) d 2 = 유체밀도 (kg/m 3 ) η = 유체의역학점도 (Nsec/m 2 =Pa s) 다른상황에서유사한관계가적용되기도하며입자크기는보통 μm 로측정된다 분산 나노입자가동일한크기또는유사한크기로분포하는상태를단분산 (monodispersity) 상태라고한다. 만약, 다양한크기의입자로구성되었다면입자크기별분포도 (size distribution) 를측정해분산도를확인해야한다. 입도분포도가하나의중심점 (mode) 을중심으로넓게분포되어있는상태를다분산 (polydispersity) 상태라고한다. 만약, mode 값이두개이상이라면원하는입자의크기만선별하는분별법 ( 필터링, 침전법, 원심분리법등 ) 을사용하여분산도를확인해야한다 표준물질 자연적인특성변화가낮고입자의크기가잘보고된구형의나노입자 ( 예. 라텍스표준물질 ) 는측정대상물질의크기및입도분포측정을위한표준물질로사용할수있다. 전자현미경을이용해사진상의입자크기분포를해석할경우, 구형의나노입자 ( 예. 15 nm 금나노입자 ) 를먼저분석하여입도분포도를파악해볼수있다. 입자의모양이구형이아니면, 장축과단축의정보를동시에제공해야한다

19 제조나노물질안전성시험방법해설서 II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질 전자현미경분석법은직접적인입자크기를분석할수있는방법으로, 촬영된 이미지를분석해입도분포도를구할수있다. 고체상태의나노입자는표면을전도성원소 (Au, Pt) 로코팅한다음주사전자현미경 (SEM, scanning electron microscopy) 을이용하여입자크기를측정할수있다. 투과전자현미경 (TEM, transmission electron microscopy) 을이용하여분석할시에는휘발성용매에분산시켜 grid(cu 등 ) 에고정 건조시킨후실제분석을수행한다. 결정성나노입자의경우, X-선회절계 (XRD, x-ray diffractometer) 분석과쉐러 (Scherrer) 식으로결정크기가파악된다. 이때분석되는크기는입자의가장작은결정상의크기 (crystalline size) 이므로, 전자현미경에서보이는크기와다를수있다. 동적광산란기 (DLS, dynamic light scattering) 를이용할경우원하는매질 ( 물, 에탄올등 ) 에분산시켜서분석한다 콜로이드형액체나노물질 액상시료는건조과정을거쳐분말상으로 SEM을찍거나 grid에고정시켜 TEM을찍는방법으로입자의크기를분석한다. 그러나이방법은모두입자의응집을초래할수있으므로, DLS 분석을수행하여입자의응집여부를파악하는것이바람직하다

20 DLS 를이용하여분석할때에는, 대상입자가분산된용액의광 - 투과성이일정 수준이상확보된상태이어야한다. 탁도가높을경우, 투과광의세기가낮아 입도분포측정이어려울수있다 시험조건 입자의크기와입도분포는나노특성발현의기준이되므로, 다양한환경에노출되었거나생체용매질에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. 물을포함한염의종류가다른버퍼 (buffer) 를사용하여시료의물리적특징변화를관찰한다. 온도는상온 (23 ), 체온 (37 ), 저온 (4 ) 등의조건을결정하여나노입자물리적변화를파악한다. 나노입자는표면전하의크기에따라서정전기적반발력 (electro-repulsion) 을이용한안정화, 표면코팅물질을이용한구조적 (steric hindrance) 안정화기법을사용한다. 시험용배지종류및특성에따라서대상나노입자의안정성에영향을주게된다. 가능한입자의응집이발생되지않도록초기분산안정성을유지하는것이중요하다. 입자의응집을초래하는외부조건 ( 온도, 광조사, 교반, 염, 보관시간등 ) 을 사전에파악하여, 적절한조건에서대상물질을보관해야한다. 대체로액상나노 입자는저온, 암조건, 단기간보관을권장한다. 대상나노입자가시험배지내에서응집이유발될경우는 1차입자 (primary particle) 와입자의응집으로인한 2차입자 (secondary particle) 의크기를개별적으로파악해야한다. 이때는 TEM, SEM, XRD를이용한 1차입자크기분포와 DLS를이용한 2차입자크기분포를비교한다

21 제조나노물질안전성시험방법해설서 1.4. 장치조건 TEM 분석을위해나노물질을 grid 에고정시키는양은극미량이어도무관하다. 분석하고자하는영역에따라서입자의크기및분포도가달라질수있으므로, 가능한다양한영역을관찰한다음대표성있는지점을측정한다. SEM 분석을위한시료의전도성코팅은스퍼터 (sputter), CVD (Chemical Vapor Deposition) 장치를사용한다. 용매가완벽하게건조되지않은경우, 장비의오염을초래할수있다. TEM과동일하게대표성이있는지점을측정하는것이중요하다. DLS 의종류에따라서나노입자가분산된용액 (3~5 ml) 을큐벳 (cuvette) 에 넣어서찍거나흘려주면서분석한다. 나노입자의농도가낮거나용매상에이 물질이포함되어있을경우, 입자의측정에영향을준다. 2. 시험방법 2.1. 고상시료준비 SEM, XRD 분석시에는분말상태의시료를전처리없이그대로분석한다. TEM, DLS 분석시에는응집및침전이발생되지않는조건으로액상에분산시켜 시료를준비하는것이중요하다 액상시료준비 분석하고자하는나노입자는특성에따른조건 (ph 2, 7.5, 9, PBS, HepG2 등 ) 을 맞추어최종농도 10 mg/l 수준으로나노입자용액을준비한다. 이경우 ph

22 조절에따른입자의응집이유발되는지를지속적으로관찰해야한다. 또한나노입자의표면전하및표면특성을고려해입자의분산안정성이높은 용매를선정하는것이적합하다. 입자가응집될경우, 봉타입의초음파분쇄기 (ultra-sonifier) 를이용하여가능한입자의침전이발생되지않도록해야한다 입자크기측정 DLS, TEM, SEM, XRD 등분석방치를이용하여입자의크기정보를획득한다. 입도분포도는 DLS 를이용하여측정직후에확인가능하다. 전자현미경의사진 결과를이용하여입도분포도해석시에는 ImageJ (freeware) 프로그램을활용한다. III. 시험결과및보고 1. 분석결과의처리 입자크기를분석하는데, 3 회 1 세트로총 3 세트의측정으로데이터의신뢰도를 높인다. 전자현미경을이용한분석시에는다양한지점을반복촬영하여결과의 대표성을높이는것이중요하다. 전자현미경결과를이용한입도분포도해석시에는이미지처리및분석소프트 웨어인 ImageJ ( 미국 NIH 개발 ) 프로그램을활용하는것이용의하다. 사용법은 에상세히수록되어있다. XRD 를이용한 1 차입자의결정상크기는쉐러 (Scherrer) 식을사용한다. XRD 결과 에서가장큰피크를대상으로식을적용하여규칙적인결정상도메인을확인한다

23 제조나노물질안전성시험방법해설서 여기에서, τ = 결정상도메인크기 (Å) K = 형태인자, 보통 0.9 λ = x선파장, 보통 CuKα를사용하므로 nm β = 최대피크의반가폭 (FWHM, full width at half maximum), 라디안값으로변경 θ = 최대피크의각도 2. 분석시주의사항 입자크기분석을위한 TEM 사용시, 시료를 grid에고정시켜야한다. 이때유기용매가남지않도록가능한완벽하게건조를시킨다. 건조과정에서휘발성용매의급격한증발은입자간의응집을발생시키므로, 이를주의해야한다. 분산용매내나노입자는가능한충분히희석한상태로사용한다. SEM 사용시에는전도성을갖도록금, 백금등으로코팅을실시하며, 액체 시료는건조하여분석한다. 휘발성용매를사용하여건조에따른입자의변형을 최소화한다. 입도분포확인시에는주로 DLS를사용하는데, 큐벳에지문이나이물질이묻지않도록주의한다. 대상나노물질이매질내에서침전된다면정확한확인이어렵다. 따라서이러한경우는 TEM, SEM 등을이용하여이미지를얻은뒤, 이미지분석을통해입도분포도를얻는다. XRD 분석시에는고체분말이많을경우는그대로측정한다. 시료가적을 경우는실리카등에혼합하여측정할수있지만결과상의노이즈가심할수있다

24 3. 시험결과의보고 결과보고서에는다음과같은사항을기재한다. 3.1 시험실시기관의명칭및소재지 3.2 시험책임자및담당자성명, 소속 3.3 시험개시일및종료일, 시험기간 3.4 시험물질 : (1) 나노물질의명칭 ( 일반명, 상품명등명기 ) (2) 입수처, 입수일 (3) 순도또는불순물 3.5 시험결과 입자크기시험 (1) 보고된수치의예상백분율변화값 ( 예 : 제품군간편차 ) (2) 시료제조방법 (3) 분석방법 (4) 입자형태에대한대략적정보 ( 예 : 구형, 판형, 침상형등 ) (5) 제품번호, 시료번호 (6) 현탁매질, 온도, ph (7) 농도

25 제조나노물질안전성시험방법해설서 (8) DLS 결과에서보이는평균입경크기 ( 세기, 수, 부피평균여부 ) (9) 전자현미경의결과 (10) XRD 와 Scherrer 식을이용한결정상의크기 입자의분포시험 (1) 시료및시험방법에대한설명 : 형태학적정보포함 (2) 전자현미경의경우반복하여측정한이미지수 (3) DLS결과를이용한입도분포표기 : 분포도의반가폭표기 ( 분산도 ) (4) 전자현미경결과를 ImageJ로해석하여입도분포표기

26 2. 나노입자의응집및엉김상태시험 I. 개요 1. 목적 나노입자의응집특성 (agglomeration/aggregation state) 분석에관한표준화된방 법론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의 2.1. 엉김 Agglomeration, 물리적결합이나약한 van der Waals 힘으로결합된입자들의모임 2.2. 응집 Aggregation, 공유결합과같은화학결합, 소성에의한결과, 물리적으로복합 적인뒤얽힌상태를말하며, 입자간의강한결합력을지닌응집체 II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질

27 제조나노물질안전성시험방법해설서 고체상태로응집을관찰할때는투과전자현미경 (TEM, transmission electron microscopy), 주사전자현미경 (SEM, scanning electron microscopy) 으로분석한다. 액상에분산된상태에서고형나노물질의응집여부를파악하기위해서는우선분산매질에균일하게분산될수있도록한다. 가능하면초기분산상태의전자현미경이미지, 입도분포도를확보한다 콜로이드형액체나노물질액상에존재하는나노물질은원하는적정농도로희석한상태로시료를준비한다. 가능하면초기분산상태의전자현미경이미지, 입도분포도를확보한다 시험조건환경에노출되었거나생체용버퍼에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. 따라서매질은물을포함한염의종류가다른버퍼를사용하여응집정도를실시간으로분석한다. 온도는상온 (23 ), 체온 (37 ), 저온 (4 ) 등의조건을결정하여나노입자응집의온도영향을파악한다. 동적광산란기 (DLS, dynamic light scattering) 장치내항온시스템이없다면, 항온시스템에서해당시험을진행하다가샘플링하여즉시시료를분석한다. 또한입자의농도에따라서응집여부가변할수있으므로다양한농도에서응집가능성을평가한다. 단, 시료의침전이과하게발생하면분석이어려울수있다. 반대로나노입자의분산안정성이매우우수하면, 실시간분석보다는일단위로분석하는것이바람직하다

28 1.4. 장치조건 DLS 종류에따라서나노입자가분산된용액 (3~5 ml) 을큐벳 (cuvette) 에넣어서찍거나흘려주면서분석한다. 응집이매우빠르게일어나는경우, 실시간분석시측정시간간격을짧게줄여야하는데이를위해장비의세팅을최적화할필요가있다. 단분산되어있는샘플의경우 pre-size test 횟수를줄이거나 cut off dust 기능을사용하지않는것이그예이다. 2. 시험방법 2.1. 시료준비응집을분석하려는농도 ( 예, 10 mg/l) 보다높은농도 ( 예, 1000 mg/l) 의샘플을준비한다. 시험용매질을준비할때첨가될액상은나노입자용액의부피를고려하여농축하여준비한다. 예를들어 PBS는 1X로준비하면이후은나노용액을첨가할때농도가낮아지기때문에 1X, 2X 정도로준비한다. 나노시료와혼합했을때의농도가의도한것과일치하기위해서는미리계산하여준비한다 온도제어 온도조건을고려할경우준비한매질과나노시료을함께항온장치에서미리 온도를조절해둔다. 이때나노시료이조절할온도에대해불안정하다면제외한다. III. 시험결과및보고 1. 분석결과의처리

29 제조나노물질안전성시험방법해설서 DLS 측정용큐벳에해당매질을넣고나노시료를첨가한다. 이때첨가한은나노샘플의농도가높다면빠르게 2~3번피펫팅하여고르게분산시킨다. 그러나나노시료의농도가크게높지않다면측정시간의단축을위해큐벳벽면을따라천천히흘려준다. 왜냐하면샘플에요동이있다면측정값이부정확하고분석하기전에필요한 pre-test 시간이길어지기때문이다. < 응집분석흐름도 > 2. 분석시주의사항 대상나노물질이매질내에서침전된다면정확한입도분포를확인하기어려워 응집속도해석에오차를가져오게된다. 또한입자의분산안정성이너무우수하면

30 해당분석에따른응집속도해석이무의미해진다. 따라서이러한경우는응집상태만을관찰하는 TEM, SEM 등과같은전자현미경을이용하는것이바람직하다. DLS 장비는입자의브라운운동성을바탕으로입경을계산하는원리이다. 여러가지온도조건에서실험을진행할경우, 온도에의해서브라운운동성이달라질가능성을고려해야한다. 예를들어낮은온도조건에서는브라운운동성이낮기때문에입경이실제보다크게측정될수있다. 온도를조절해야하는경우를제외하고, 가능한샘플이들어있는큐벳을움직이지않는것이좋다. 즉 DLS 장비에샘플큐벳을로딩한후측정이끝날때까지큐벳을빼지않는것이다른변수를줄일수있다. 온도를조절할때샘플도함께항온조에넣을지는신중하게판단해야한다. 나노입자의콜로이드안정성이주위온도에의해쉽게변한다면응집실험을수행하기이전에입자가응집될염려가있다. 만약주위온도에민감하다면항온조과정을배제하고매우고농도의샘플을준비하여적은부피를실험에사용한다. IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Citrate capped AgNP, 평균 50 nm 2. 시험조건 PBS 버퍼내 AgNP 분산, ELS 를이용한 flow type 분석

31 제조나노물질안전성시험방법해설서 3. 분석결과초기 10분간의온도에따른응집속도변화는크게없었지만, 그이후에는응집속도의차이가발생하였다. 전체적인경향은초기에는급격히 HDD(hydrodynamic diameter) 값이증가하다가점점완만히증가하는경향을보였다. 두구간에대한응집속도상수는, 초기 10분은 m 3 /sec이고, 후반에는 m 3 /sec 이었다. 초기 10분이후반 50분보다 5배이상응집이빠르게진행되었다. 4. 의미파악 PBS 버퍼내에존재하는다양한염 ( 염소, 인 ) 에의해 AgNP 주변의주요기능기인 COO-가 charge interaction에의해결합하고, 입자간의간격이가까워지면서응집이발생하였다. 따라서 charge repulsion에의한안정화된콜로이드나노입자는염에의한응집에주의해야한다. <PBS 에서의온도에따른응집경향 > ( 국립환경과학원, )

32 3. 나노입자의결정특성파악 I. 개요 1. 목적 나노입자의결정학적특성 (crystalline phase/crystallite size) 분석에관한표준화 된방법론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의 2.1. 결정상 (crystalline phase) 주어진결정구조에대한 specific face group 을의미한다. 해당정보는각원소가존재하는원소배열이나혹은정성적으로다른결정형태와구별하기에정보가충분한지결정하는것이다 결정체 (crystallite) 동일한결정구조와배열을가지고있는물질의좀더큰조각의부분이다. 전통적으로결정성물질은수많은미세결정들이함께조화를이루고있다. 만약그렇지않다면그것은 single crystal 혹은 monocrystal 이다. 이물리화학적특성은잘정의된결정구조를가진나노물질에만적용된다

33 제조나노물질안전성시험방법해설서 II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질고체상태의결정질나노입자는별다른처리없이엑스선산란기 (XRD, x-ray diffractometer) 분석이가능하다. XRD 결과와쉐러 (Scherrer) 식을이용하여결정크기를계산할수있다. 결정상의확인은 JCPDS(Joint Committee on Powder Diffraction Standards) 자료와비교를하여확인한다. 전자현미경을이용한전자회절 (electron diffraction) 패턴분석을실시할경우는 TEM 분석용시료준비과정과동일하게휘발성용매에고상나노물질을분산시켜 TEM grid에고정시킨다음분석을실시한다 콜로이드형액체나노물질액상시료의 XRD 분석은용이하지않다. 액상시료를건조하여분말형으로만들어분석하거나, 무정형의 SiO 2 분말에시료를혼합하여분석하는방법이있다. 전자는입자의응집이우려되며, 후자는무정형분말로인한 XRD 결과내노이즈가발생할수있다. 따라서콜로이드형액상나노물질은 ED 분석이나고분해능투과전자현미경 (HR-TEM, high resolution transmission electron microscopy) 을통한결정면분석이선호된다. XRD 결과와 Scherrer 식을이용하여결정크기를계산할수있다. 결정상의확인은 JCPDS 자료와비교를하여확인한다 시험조건 대상나노물질이노출하고있는결정면, 결정상태, 결정크기가무엇인지를파악

34 하기위하여시험을수행한다. 나노입자의결정상태는매질이나적은온도변화, 염 의종류에영향을받지않는다. 따라서반복분석을통하여 XRD 결과의재연성을 확보한다 장치조건 XRD 종류에따라서분말형나노입자가 1~5 g 정도필요로하며, 분석각도회 전속도는 1~10 o /min 으로조정한다. 2. 시험방법 2.1. 시료준비고체상나노물질의경우앞서설명한대로바로 XRD 분석을수행할수있다. 그러나액체상나노물질의경우는샘플준비과정이필요하다. 먼저액체나노물질의농도가아주높을경우는바로샘플을유리접시에 10 ml 정도뿌린뒤건조기에서건조시키면된다. 건조된나노물질은덩어리를막자사발에서충분히갈아주어균일한가루를만든다. 액체나노물질의농도가약간높을경우는무정형실리카파우더 (aerosil) 를이용해시료를준비한다. 무정형실리카파우더에직접나노용액을뿌린뒤잘섞어준뒤건조한다. 이경우파우더내나노입자의질량이 1 wt% 이상이어야 XRD 분석에적합하다. 그이하의비율은노이즈에피크가묻혀버릴가능성이있다. 액체나노물질의농도가낮을경우는슬라이드글라스위에용액을직접뿌려건조시키는방법을취한다. 예를들어 50 ppm의나노용액의경우, 무정형실리카파우더를이용한두번째방법을취하면 XRD 분석에필요한시료량 (1 wt%) 을확보하기위해수리터가필요하게된다. 슬라이드글래스가운데부분에샘플을 200 μl 정도씩뿌리고건조한다. 여러번뿌리고건조하는과정을반복하여농축건조

35 제조나노물질안전성시험방법해설서 되게끔한다. 약 5~6 번정도반복하면글래스에얇은필름이형성되고이글래스 자체를 XRD 장비로분석한다. < 결정성분석흐름도 > III. 시험결과및보고 1. 결과분석장비는일반적인세팅을따르고분석각도회전속도를설정시결정면을확인하기위해먼저 10 o /min 의속도로측정한다. 최대의세기를보이는주요피크의위치를확인하고그영역에서 1 o /min 의속도로다시분석을수행한다. 이는쉐러식에대입하여결정크기를구할데이터로쓰인다

36 2. 분석시주의사항결정상분석은 XRD, TEM을이용하여상호보완적으로분석이가능하다. 고체시료의경우는 XRD 분석에별다른어려움이없으나, 액체시료는분말 XRD로분석이용이하지않다. 콜로이드를건조시켜서찍거나실리카와혼합하여분석할수는있다. 건조시에는입자의응집과변형이발생할수있으며, 실리카혼합시에는 XRD 결과내에노이즈가많이발생할수있다. 또한대상나노입자가너무작으면 XRD 분석에서나타나지않을수있다. 따라서콜로이드는 HR-TEM과 ED를이용하여결정면해석하는것이바람직하다. 결정크기는 XRD 피크와쉐러식으로계산하는데, 피크의반가폭 (FWHM, full width at half maximum) 이라디안 (radian) 으로환산해야함에주의한다. 반가폭계산시에는가우시안커브를이용하여 FWHM을구해야만피크의대칭성을확보할수있다. 그러나 20 nm 이하의결정크기를갖는샘플의경우는 peak broadening에의해쉐러식을계산하여얻은결정크기값이부정확함을염두해두어야한다. 그러므로 20 nm이하의샘플의경우 TEM 분석도함께요구될것이다. IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Citrate capped AgNP, 평균 50 nm 2. 시험조건 시료건조후분석, XRD 이용한분석

37 제조나노물질안전성시험방법해설서 3. 분석결과 XRD 반복분석결과, 응집에무관하게모두동일한특성피크를보였으며 JCPDS# 인 metal silver로확인되었다. 즉, 입자가응집하더라도고유의금속특성은유지되는것으로파악되었다. 주요특성피크는 2θ가 40 o 전후에서 (111), (200), 65 o 에서 (220), 78 o 에서 (311) 을나타냈다. 4. 의미파악특성피크의 (hkl) 값이모두짝수이거나모두홀수인값을나타내고있다. 이는알루미늄, 구리와같은 FCC(face-centered cubic) 구조를나타낸다. 주요피크는 Ag(111) 로나타났으며, 이는 HR-TEM 의 ED 분석의결과와도일치했다. ED 분석결과면간거리 (d-spacing) 은 0.23 nm로나타났다. 주요특성피크가 (111) 로액상내나노입자가대표적으로갖는면이결정된다. 해당면을고분자로노출을억제하면해당면에의한생물학적 affinity를제어할수있다. < 반복분석을통한 AgNP 의 XRD 패턴 > ( 국립환경과학원, )

38 4. 나노입자의투과전자현미경분석 I. 개요 1. 목적 나노입자의대표적인투과전자이미지 (representative TEM) 분석에관한표준화된 방법론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의투과전자현미경 (TEM, transmission electron microscopy) 은나노입자의궁극적인크기, 모양, 응집정도등을분석할수있는장치이다. 대표적인 TEM 결과란, 원하는시험조건에서나노입자자체의외형적특성을보일수있는이미지를말한다. 따라서 TEM 결과를제대로얻기위해서는콜로이드형태의나노입자와분말상고체입자는알콜에희석분산시켜건조과정을거쳐야한다. II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질고체상태의나노입자는 Cu grid에고정시키기위해휘발성용매 ( 알코올 ) 에분산시켜시료를준비한다. 피펫으로용액을 Cu grid에몇방울뿌린뒤자연건조시키고 TEM 분석을실시한다. 입자들이서로뭉쳐있으면제대로된이미지를얻을수없기때문에가능한희석시키고초음파를이용한분산을실시한다

39 제조나노물질안전성시험방법해설서 1.2. 콜로이드형액체나노물질액상시료는별다른전처리없이농도만희석시켜 Cu grid에시료를고정시킨다. 액상시료가건조되면서용액내나노입자들이서로뭉치지않도록가능한희석시켜서분산시킨다. 액체나노물질의경우초음파처리에콜로이드안정성이깨질수있는시표가있으므로초음파처리는신중히고려한다 시험조건 TEM 분석을통해서는입자의응집, 크기, 모양, 결정면등다양한정보를얻게된다. 따라서다양한시험환경에노출되었거나생체용버퍼에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. Cu grid에고정시키기전에, 물을포함한염의종류가다른버퍼를사용하여시료의물리적특징변화를관찰한다. TEM 분석시에는여러지점을측정하여대표성이확인된이미지를해당나노물질의 TEM 이미지로결정한다 장치조건 Cu grid에고정시키는나노입자의양은극미량이어도무관하다. 용매가완벽하게마르지않을경우, 장치내오염을초래할수있다. 용액상태그대로찍고자할때는 cryo-tem, bio-tem 등을이용한다. 2. 시험방법 2.1. TEM grid 준비시료를준비할때는위에서설명한방법을따르고입자가뭉치지않게유의한다. 먼저 TEM Cu grid를필터페이터위에앞뒤를구별해앞면이위를향하도록

40 올린다. Tweezer 로 grid를집을때되도록가장자리부분을이용한다. 준비된시료를한방울 (10 μl) 을 grid위에정확히떨어뜨린다. 이때시료의농도는 100~1000 mg/l가적당하고만약이보다저농도의샘플일경우시료를건조시킨뒤여러번샘플을떨어뜨려는과정을반복한다. 약 10 mg/l의샘플일경우 10번정도반복한다. 이과정이끝나면샘플을충분히 (12시간이상 ) 건조시킨다. III. 시험결과및보고 1. 장비작동 TEM 장비를작동시에 brightness, focus 를적절히조절하며이미지를얻는다. 이미지는항상저배율과고배율을함께찍어서대표성을확보하도록한다. 2. 분석시주의사항 TEM 분석을위한 Cu grid내시료고정시, 유기용매가남지않도록가능한완벽하게건조를시킨다. 건조과정에서휘발성용매의급격한증발은입자간의응집을발생시키므로, 이를주의해야한다. 분산용매내나노입자는가능한충분히희석한상태로사용한다. Grid 위샘플에수분이남아있을경우진공상태로전환할때장비가손상될가능성이있으므로항상 grid를충분히건조시킨다. 하나의 Grid에서적어도 5 군데이상의장소에서저배율과고배율이미지를얻어서대표성을확보한다

41 제조나노물질안전성시험방법해설서 <TEM 분석흐름도 > IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Citrate capped AgNP, 평균 20 nm 2. 시험조건 PBS 버퍼노출, Cu grid 에 drop 후건조, TEM 을이용한분석 3. 분석결과 PBS 상에서는시간이지날수록응집이심하게발생하여최종적으로는나노수준

42 이아닌마이크로크기의응집체가나타난다고하였다. TEM 분석결과, 저배율에서관찰되듯이 500 nm이상의응집체가나타났으며, 고배율에서는나노입자들이하나의커다란덩어리에불규칙적으로부착되어있음을확인할수있다. 형태또한무정형으로 bulk silver의특성을지니는쪽으로변형된다. 4. 의미파악 TEM은시각적으로나노입자의크기와모양, 입도분포, 응집성여부를확인하게해준다. 입자의대표성있는 TEM 이미지를얻기위하여반복적으로다양한표본을이용하여분석을수행해야한다. <PBS 에서의저배율 ( 좌 ) 및고배율 TEM 이미지 > ( 국립환경과학원, )

43 제조나노물질안전성시험방법해설서 5. 나노입자의제타전위측정을통한표면전하측정시험 I. 개요 1. 목적나노입자의대표적인제타전위 / 표면전하 (zeta potential/surface charge) 분석을통한 PZC(point of zero charge) 를측정하고 PZC 근처에서입자크기변화의민감도를분석할수있는표준화된방법론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의제타전위 (zeta potential) 은콜로이드나노입자의표면전하 (surface charge) 를나타내는전압값으로, 전기이중층 (electrical double layer) 이론에근거하고있다. 이는분산매질과분산입자간의전위차를말한다. 표면전하값은음과양의 mv로표현되는데, 이값이한쪽으로크게치우칠수록입자의분산안정성이높다는것을나타낸다. 또한표면전하정보는생물체 ( 세포 ) 에하전된나노입자가노출되었을때대상체와의친화력을판단하는기준이되기도한다. 제타전위또는표면전하는벌크용액의 ph, 염으로제어되는이온강도등의함수가된다. II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질

44 고체상태의나노입자의제타전위를알기위해서는원하는매질내분산을시켜야한다. 이를위해서는우선분산매질에균일하게분산될수있도록한다. 전기영동광산란기 (ELS, electrophoretic light scattering) 장비에함께장착된제타전위측정모드를이용하여분석한다. 액상에서침전이발생하는나노입자는산염기적정법을이용하여교반하면서분석을실시한다 콜로이드형액체나노물질액상에존재하는나노물질은원하는적정농도로희석한상태로시료를준비한다. 분석시에침전이발생하는나노입자는산염기적정법을이용하여교반하면서분석을실시한다 시험조건환경에노출되었거나생체용버퍼에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. 따라서매질은물을포함한염의종류가다른버퍼를사용하여응집정도를실시간으로분석한다. ELS 장치내항온시스템이없다면, 항온시스템에서해당시험을진행하다가샘플링하여즉시시료를분석한다. 시료의침전이과하게발생하면분석이어려울수있다. 반대로나노입자의분산안정성이매우우수하면, 실시간분석보다는일단위로분석하는것이바람직하다 장치조건 ELS 종류에따라서나노입자가분산된용액 (3~5 ml) 을큐벳 (cuvette) 에넣어서찍거나흘려주면서분석한다. 산염기적정법으로계산한표면전하의절대값은정확하지않을수있으므로양과음의값여부를확인하는것이바람직하다

45 제조나노물질안전성시험방법해설서 2. 시험방법 2.1. 시료준비각각의용액조건 (ph 2, 7.5, 9, PBS, HepG2) 을맞추어최종농도 10 mg/l의나노용액을준비한다. ph 조절은다른영향을배제하기위하여버퍼용액을사용하지않고질산과수산화나트륨을이용한다. 또한, 나노입자의표면전하및특성을고려하여입자의분산안정성이높은용매를선정하는것이적합하다 표면전하측정준비한시험용액을 4, 22, 37 o C 암조건에서 24시간충분히반응시킨다. 온도조절장치를사용하여온도를유지하며입자크기를측정한다. 단, 온도조절장치를사용하지못할시, 냉 / 열원제거후 1시간이내에입자의크기분석을실시한다. III. 시험결과및보고 1. 분석결과의처리 입자표면전하를분석하는데, 3 회 1 세트로 3 세트의측정을통해데이터의신뢰도 를높인다. 2. 분석시주의사항제타전위는 ELS 장치내제타전위측정모드를사용한다. 시료를큐벳에넣어측정하거나장치에흘려보내며측정때는기포가생기지않도록주의한다. 또한, 큐벳에지문이나이물질이묻지않도록주의한다. 대상나노물질이매질내에서침전된

46 다면정확한제타전위측정이어렵게된다. 따라서가능한침전이발생하지않아야하며, 장시간분산이잘되는경우만제대로된분석결과를얻을수있다. 그렇지않을경우는교반을실시하면서질산과수산화나트륨을이용한산염기적정법으로표면전하를계산해야한다. < 제타전위분석흐름도 > IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Citrate capped AgNP, 평균 50 nm 2. 시험조건 ph 9 버퍼에 AgNP 노출, ELS 의제타전위기능으로분석

47 제조나노물질안전성시험방법해설서 3. 분석결과 ph 9에분산된경우, 4 o C에서 mv로 ph 7.5의 mv와차이를보인다. 이는주변에존재하는음이온들로인한 AgNP의 uncovered surface에음이온들이고정되는현상으로판단된다. Citrate에의해서음이온을갖던 AgNP가주변에존재하는음이온들이입자표면에간섭현상을주게되고이로인해표면전하가크게나타나는것이다. 4. 의미파악온도가높아질수록표면전하는점점약해지는결과를얻을수있다. 따라서온도가높아지고 ph가낮아질수록표면전하는낮아지게되고, AgNP의안정성또한떨어진다는결론을얻을수있다. <ph 9 에서의 AgNP 의제타전위값 > ( 국립환경과학원, )

48 6. 나노입자의표면화학특성 I. 개요 1. 목적 나노입자의대표적인표면화학 (surface chemistry) 분석에관한표준화된방법론 을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의 2.1. 표면화학나노물질이다양하게기능화되었을경우수많은잠재적인상호작용이일어날수있으며, 콜로이드나노입자의분산안정성과환경중노출시자발적인소멸 ( 응집에의한나노특성상실 ) 등에영향을주게된다. 나노입자의안정성을향상시키기위하여표면처리된유기물의존재와양은다른물리화학적특성인응집, 제타전위, 물분산성등에영향을준다. 또한표면처리된유기물의종류에따라서나노입자의생물학적위해성존재여부가달라질수있다. II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질 고체상태의나노입자는분말상태그대로 FT-IR(Fourier transform infrared

49 제조나노물질안전성시험방법해설서 spectroscopy) 분석이가능하며, 시료양이적을경우는 KBr에미량의나노입자를혼합한다음막자사발로곱게갈아서펠렛 (pellet) 을만들어분석한다. 이때펠렛은 IR이투과할정도로얇고투명하게만든다. 분석한다음 IR 핸드북을이용하여분석피크에해당하는유기물을할당한다 콜로이드형액체나노물질액상내나노물질은용액및나노물질표면에존재하는유기화합물을동시에분석하게된다. 건조시켜고체상으로찍을수도있으며, 액상 FT-IR을이용하여그대로분석할수도있다. 고체시료분석과동일하게 KBr을만든다음미량을뿌려서분석하는방법도있다. KBr은물에쉽게녹기때문에후자의방법은선호되지않는다. 분석한다음 IR 핸드북을이용하여분석피크에해당하는유기물을할당한다 시험조건입자의응집이나크기변화가아닌매질과매질내존재하는다양한염의효과에의해표면화학특성이변하게된다. 따라서, 용매변화를통한시험일경우, 매질은물을포함한염의종류가다른버퍼를사용하여시료를제조한다 장치조건수분의영향을최소화하기위해 Ar, N 2 가스를지속적으로공급시킨상태에서시료를분석한다. 그렇지않으면공기중수분에의한 OH 피크가과도하게나타난다. 또한분석시많은양의원액을사용하면 IR 결과에서노이즈를발생시킬수있다

50 2. 시험방법 2.1. 시료준비 FT-IR을이용할경우고체시료와액체시료모두시료의균일성이중요하다. 액체시료는슬라이드글래스위에가능한높은농도를뿌려건조시킨다. 글래스위에서건조된샘플을약수저로약하게긁어낸다. 긁어낸덩어리형태의시료를 KBr에혼합한뒤막자사발로곱게갈고혼합한다 수분제거공기중수분은결과값에 OH 피크를나타내기때문에가능하다면 Ar gas 조건의 glove box내에서펠렛을제조하는것이적절하다. 제조된펠렛을 IR장비에로딩하고 transmittance와 absorbance를측정한다. < 표면화학분석흐름도 >

51 제조나노물질안전성시험방법해설서 III. 시험결과및보고 1. 분석결과의처리 FT-IR로시료분석시에 KBr과혼합할경우, 가능한곱게갈아서사용하며제조한펠렛은가능한투명해야한다. KBr에대비해분석대상시료가 5 wt% 이상이되면 IR 결과값에노이즈가많이발생하게된다. 분석당시상대습도가높다면분석결과에서수분피크가크게나타날수있다. 따라서 IR 분석시에는장치내로 N 2 나 Ar 가스를흘려주는것이바람직하다. 액상 FT-IR도있지만, 고체용분석기만있다면 KBr 펠렛에액상시료를미량뿌려서분석하게된다. 그러나 KBr은수분에약하기때문에가능한빨리분석을마쳐야한다. 해당결과값은신뢰도가떨어지므로참고용으로만사용한다. Petridish와같은플라스틱계열용기에서건조시킬경우용기를구성하는유기물에의해샘플이오염될가능성이있다. IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Citrate capped AgNP, 평균 50 nm 2. 시험조건 KBr 에극미량의 AgNP 을혼합하여 pellet 제조, FT-IR 을이용한분석

52 <PVP-AgNP 에대한 FT-IR 결과 > ( 국립환경과학원, )

53 제조나노물질안전성시험방법해설서 3. 분석결과입자표면에코팅되어있는 citrate를검출하는방법으로서 FT-IR을이용하여쉽게분석할수있다. 정량분석은어렵지만, citrate를구성하는화학결합에특이적인 peak의위치를확인하여표면에노출된화학물질을분석한다. 4. 의미파악 IR은온도의영향, 농도의영향에대한변화는없었으며, 매질변화시, 매질내에포함되어있는다양한화학종때문에 IR 결과에심한노이즈가발생한다. 이방법은분말시료나화학종이많지않은액상시료에대하여분석이가능한방법이라판단된다

54 7. 나노입자의광활성 I. 개요 1. 목적나노입자의대표적인광 ( 촉매 ) 활성 (photo-catalytic activity) 분석에관한표준화된방법론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. OECD TG UV-VIS Absorption Spectra - (Spectrophotometric Method) 2. 정의광촉매활성 (photocatalytic activity) 은자연계에노출된빛에의해대상나노입자의광촉매로서활성을보이는지를파악하는것으로, TiO 2, CdS와같은광촉매나노입자에해당하는분석법이다. 이항목을측정한다는것은자연계에서전이가능성을보고자할때로 LCA(life-cycle assessment) 와관련이있다. 그외에광촉매활성을보이지않는나노물질은광활성 (photo activity) 또는광분해대한시험을평가한다. 나노입자분산제의광산화로제거된다면나노입자의분산안정성이감소하여응집을초래할수있다. 따라서다양한시험조건에서광활성시험은자연계에노출시입자가보일수있는다양한변화를예측할수있게한다. II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질

55 제조나노물질안전성시험방법해설서 광촉매활성을시험하기위해서는분해대상인프로판올용액에혼합하여 500 W의수은아크램프를이용하여광분해시험을수행한다. 나노입자는가능한고르게분산되도록하거나, 유리판이나전도성 ITO판위에고정시켜분해실험을실시한다. 분해산물은액체크로마토그래피 (LC, liquid chromatography) 를이용한정량분석을한다. 만약광촉매활성이없다면, 매질내에서광조사에따른광분해, 광산화반응이발생하는지평가하도록시료를준비한다. 광분해산물은 LC, 유도분광플라즈마 (ICP, induced coupled plasma) 등을이용하여성분을정량분석한다 콜로이드형액체나노물질콜로이드상태로만들어진광촉매는외부또는내부에원통형관을만들어 500 W의수은아크램프를이용한빛을조사하여프로판올분해실험을실시한다. 만약광촉매활성이없다면, 매질내에서광조사에따른광분해, 광산화반응이발생하는지평가하도록시료를준비한다. 광분해산물은 LC, ICP 등을이용하여성분을정량분석한다 시험조건광촉매또는광활성실험은대상나노물질이환경에노출되어자연광에반응하는정도를파악하는것으로, 환경에노출되었거나생체용버퍼에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. 따라서매질은물을포함한염의종류가다른버퍼를사용하여광분해정도를시험한다. 적당한시간간격으로시료를채취하여정량분석한다. 또한온도는상온 (23 ), 체온 (37 ), 저온 (4 ) 등의조건을결정하여광분해에대한온도영향을파악한다

56 1.4. 장치조건광활성실험시에는자외선을제거하여실험을진행하고, 다양한가시광선영역의광원 (400~700 nm) 을활용하여해당파장별로광반응이나타나는범위를파악한다. 가능하면광원에서발생되는열효과를배제시키기위하여 LED 광원을사용하는것이바람직하다. 2. 시험방법 2.1. 시험장치준비외부의빛을차단하기위해암조건을만들어실험을진행한다. 측정하고자하는파장의광원준비하고, 실내적정조도인 500 lux가되도록조절하여실험을한다. < 광활성시험을위한분석흐름도 >

57 제조나노물질안전성시험방법해설서 2.2. 시험용액준비각각의용액조건 (ph 2, 7.5, 9, PBS) 을맞추어최종농도 10 mg/l의나노용액을준비한다. ph 조절은다른영향을배제하기위하여버퍼용액을사용하지않고질산과수산화나트륨을이용한다. 나노입자의표면전하및특성을고려하여입자의분산안정성이높은용매를선정하는것이적합하다. 또한, 광에의해변하거나분해되지않는안정한용매를선정한다. HepG2 세포배양액과같이단백질이포함된매질은광에의해분해되기때문에본실험에서는적합한용매가아니다 광활성변화측정준비한시험용액을광실험장치에놓고광을연속적으로조사한다. 실험은상온에서진행하며, 반응속도가느릴경우일단위로샘플링하여입자의특성변화를측정하며, 광활성변화를관찰한다. 본실험에서는광원으로일반형광등과 455, 630 nm의 LED 램프를사용하였다. 만약, 온도조절장치를사용한다면온도에따른광활성변화를측정할수있다. III. 시험결과및보고 1. 분석결과의처리빛에노출되지않은시료를대조군으로사용하고시간의흐름에따른입자의특성변화를통해광활성도를변화량을계산한다. 그리고입자의광활성도변화는, UV 분광기를사용하여형태학적 / 광학적특성파악을 ELS를사용하여형태학적 / 화학적특성을확인한다

58 2. 분석시주의사항광조사에따른온도변화를최소로하기위해열발생이적은 LED 램프등의광원을사용하는것이바람직하다. 암실험을대조군으로하여선행실험을수행해야한다. 광촉매활성이아닌광분해와같은광활성분석의경우는, 실험전과후의대상물질의존재량편차를분석해야한다. 색깔이있는콜로이드물질은 UV 분광기로쉽게농도측정이가능하지만, ICP 분석을통해검증하는것이바람직하다. 용매가광에의해활성및변화를보일경우, 용매에대한광활성실험을수행하여편자를보정하거나다른용매를재선정하는것이바람직하다. 나노입자의용액상분산성이떨어질경우광활성시험및분석이어려울수있음으로, 나노입자의분산도가높은용매를선정하는것이바람직하다. IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Citrate capped AgNP, 평균 50 nm 2. 시험조건 455 nm LED 광원을이용, ph 7.5 버퍼, UV 를이용한농도변화분석 3. 분석결과 특정파장의빛에의한 AgNP 의상태변화를확인하기위하여 455 nm 파장의빛 에노출시켜그변화를관찰하였다. 흡광도세기는 78% 줄었으며 500 nm 이상의

59 제조나노물질안전성시험방법해설서 파장에서흡광도가증가하는현상을확인하였다. 이와함께입자평균크기도 42 nm에서 3670 nm로급격하게증가하였다. 이런결과는다른광원에비해큰진동수를가지고있는 455 nm 파장의빛으로인해은나노입자의광산화가많이일어났기때문에나타나는결과라볼수있다. 산화작용으로인해입자표면의 citrate가분해되면서입자의정전기적안정성이줄어들게되고, 결과적으로작은 AgNP가서로응집되며큰입자의형성되었기때문이다. 큰진동수를가지는 455 nm 파장의빛에서광산화가가장크게일어났으며, 비교적작은진동수를보이는 630 nm에서는변화속도가상대적으로느림을알수있다. 4. 의미파악 광촉매활성은동일한방법으로 TiO2 등을대상으로분석하고, 광촉매활성이 없는경우는입자의응집, 크기변화를이용하여광활성정도를파악한다. <455 nm 조사조건에서의 ph 7.5 의광반응결과 > ( 국립환경과학원, )

60 8. 나노입자의물분산안정성 I. 개요 1. 목적 나노입자의대표적인물분산성 (dispersion stability in water) 분석에관한표준 화된방법론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의 2.1. 물분산안정성 (dispersion stability in water) 고체상나노물질이나콜로이드나노입자는자연계중수계로의노출이가장크게발생할수있으며, 수계로노출되면수서생물들이영향을받을수있다. 물분산안정성 (dispersion stability in water) 이높을수록수계에서응집되지않고나노크기가유지되며그로인한나노의독특한물리화학적특성이그대로발현된다는것을말한다. 탄소계나노물질은물분산성이떨어지지만다양한표면처리방법에의해분산성이개선되기도한다. 따라서장시간수계노출에따른영향을파악하기위한시험도진행되어야한다. II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질 고체시료의경우물분산성을측정하기위하여시료를물에분산시켜야한다

61 제조나노물질안전성시험방법해설서 수계내분산이잘되지않는시료는물분산성이떨어진다고판단한다 콜로이드형액체나노물질 수계를기반으로제조된콜로이드는이미물분산성이우수한상태이다. 따라서 다양한시험조건을달리하여분산안정도를평가한다 시험조건물분산성은환경매질중수계로의노출가능성을평가하는것으로, 환경에노출되었거나생체용버퍼에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. 따라서매질은물을포함한염의종류가다른버퍼를사용하여분산도를실시간으로평가한다. 분산이잘안되는시료는장기간교반분산을실시한뒤일정기간마다다중광산란기 (MLS, multiple light scattering) 를이용하여분석한다. 또한온도는상온 (23 ), 체온 (37 ), 저온 (4 ) 등의조건을결정하여온도영향을파악하며, 농도에따른분산안정성도파악한다 장치조건 MLS는 10~30 ml의용액내나노입자의분산안정성를임의의시간간격으로측정이가능하다. 측정용기의상부에서바닥까지투과도를측정하고, 투과도변화를통해입자의침강속도를평가하여수계분산안정성을해석할수있다. 비수계에서도동일한분석이가능하다. 하지만용매가시간에따라색변화를보일경우분석이불가하다. UV 분광계는흡광피크의세기감소를측정하여입자의농도변화를확인하지만, 정량적침전속도를구하기는어렵다

62 2. 시험방법 2.1. 시험용액준비각각의조건 (ph 2, 7.5, 9, PBS 등 ) 에따른용매를준비하고, 용매에분산시켰을때최종농도가 50 mg/l가되도록나노용액을준비한다. ph 조절은다른영향을배제하기위하여버퍼용액을사용하지않고질산과수산화나트륨을이용한다. 실험직전각각의용매에나노입자를분산시킨뒤바로실험을진행한다 물분산성측정나노입자가 50 mg/l인시험용액을시험직전바로제조하고, 입자의용액상안정성확보를위해 30분간정치시킨뒤, 측정을시작한다. 실험은상온에서 5분간격으로 90분을측정하고, 용액에대한투과도변화를통해입자의분산안정성을측정한다. III. 시험결과및보고 1. 분석결과의처리 MLS로시험용액의측정한투과도변화를통해입자의분산안정성을계산한다. 투과도변화가없는경우, 분산안정성이우수한상태로해석할수있다. 투과도가상승하는경우는입자간응집에따른결과로해석할수있고, 일정한기울기를가지며변할경우입자의침전으로인한결과로해석할수있다. 변화량을토대로침전속도를구할수있다

63 제조나노물질안전성시험방법해설서 2. 분석시주의사항기본적으로는 UV를이용하여시험용액의시간에따른특성피크의감소여부를파악하고, 분산상층액을 ICP로분석하여침전되지않고남은잔류량을조사하게된다. 특성피크와잔류량변화를측정하고분석하면분산안정성파악이가능하다. 단시간에응집이나침전이발생하는시료는 MLS를이용한실시간분석이바람직하다. 물분산이어려운나노물질은해당분석기법을사용하기어렵다. 그러나분산이가능한용액상에서의분산성측정은가능하다. < 물분산성분석흐름도 > IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Citrate capped AgNP, 평균 50 nm

64 2. 시험조건 ph 2, 7.5, 9, PBS 버퍼이용, Turbiscan 을이용한실시간분석 3. 분석결과시간에따른시료의투과도를측정한결과, buffer에따라다양한결과를얻을수있었다. 그래프의오른쪽이시료의상층부이고왼쪽으로갈수록바닥부분을측정한값으로, 이결과를토대로입자의침강속도를계산하였다. ph 2와 PBS의그래프는시간에따라변하는모습이확연하게나타나고, 그침강속도는각각 0.20와 0.40%/min 이었다. 이는염과양이온의영향으로 AgNP가침전되고분산안정성이매우떨어진다는것을의미한다. 이와반대로 ph 7.5와 9는투과도의변화가전혀나타나지않았고침전속도또한 0%/min이기때문에, 분산안정성이높다고볼수있다. 또한이런결과를통해양이온보다염이 AgNP의분산안정성에영향을더크게미친다는것을알수있다. 4. 의미파악주로고분자의분산도를측정하는 Turbscan(stability analyzer) 을이용하여 AgNP의용액내분산도와침전속도를측정하였다. 침전속도가 0%/min이면분산도가우수하다는의미가되며침전속도가증가할수록분산도가낮다는의미로해석된다

65 제조나노물질안전성시험방법해설서 <MLS 를이용한매질조건별침강속도변화 > ( 국립환경과학원, )

66 9. 나노입자의수화정도측정시험 I. 개요 1. 목적나노입자의대표적인수화 (hydrolysis) 분석에관한표준화된방법론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. OECD TG Water Solubility, OECD TG Hydrolysis as a function of ph, OECD TG Dissociation Constants in Water 2. 정의 2.1. 수화비생물학적분해의일종인수화 (hydrolysis) 는액상의양성자 (H + ) 에영향을받아전자교환을일으켜해리되는것을말한다. 즉액상에서물에의해해리되는현상을말한다. 수화되지않는나노입자는이온화를통한해리로파악해도된다. 수화 / 해리되는정도는수계에노출된나노입자의용해정도를파악하는것으로이온화상태로존재할나노입자의구성원소를파악하는데도움이된다. 이는온도, ph, 매질의종류등에영향을받는다

67 제조나노물질안전성시험방법해설서 II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질고체시료를수계에분산시킨뒤분석을시작한다. 고체시료속포함된이온은나노물질의수화로보기어렵기때문이다. 따라서나노물질을물에잘분산시킨후이온등해리산물로간주되는물질들을측정하고, 이를시작점으로각각의조건을처리하여일정시간뒤해리의변화량을측정하여변화된양을각조건의결과값으로계산한다 콜로이드형액체나노물질콜로이드형액체나노물질은물에잘분산되어있는형태이기때문에물에분산시키는등의전처리가필요하지않다. 따라서원액의이온등해리산물로간주되는물질들의농도를파악하고, 각각의조건을처리하여해리된양을측정하여변화량을구한다 시험조건수화정도는환경매질중수계로의노출가능성을평가하는것으로, 환경에노출되었거나생체용버퍼에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. 따라서매질은물을포함한염의종류가다른버퍼를사용하여분산도를실시간으로평가한다. ph 조절시, 버퍼를이용할경우나노입자의응집등을유발할가능성이높고, 해리산물과결합되어측정값의오차를가져올수있기때문에이에영향을미치지않는질산과수산화나트륨을이용하여 ph를조절한다. 분산이잘되지않는시료는장기간교반분산을실시한뒤시험을시작하지만, 자발적해리반응을관찰하기위하여시험시간동안은교반을하지않는다

68 1.4. 장치조건액상에수화 ( 해리, 이온화 ) 된상태의화학종농도를분석할때, LC의경우나노물질과해리, 이온화된물질의구분이가능하지만금속계나노물질에사용되는 ICP의경우원소의총량을정량하기때문에나노물질도함께측정되어해리된양을알수없다. 따라서반응시간후나노필터를이용하여나노입자와해리된물질을분리하고, ICP를이용하여해리된양을측정한다. 금속이온의경우이온선택전극 (ISE, ion selective electrode) 를이용하여이론적으로는실시간분석이가능하지만, 분석시용액에 ISA(ion strength adjustor, 약 100 mm의 NaNO 3 ) 를첨가하여야하는데, 이는나노물질의크기와표면전하의변화를유도하는것으로밝혀져있다 (ES&T 2010, 44, ). 이는이온의해리에영향을미칠수있고해리된양측정값의오차발생또한배제할수없다. 따라서 ISE 이용시에도분석전필터작업을수행한뒤 ISA를첨가하여이온의양을측정한다. 그러나나노필터는 ph 3~10 에서만사용가능하기때문에 ph 2는 ISE를사용하여측정한다. 2. 시험방법 2.1. 시험용액준비각각의용액조건 (ph 2, 7.5, 9, PBS, HepG2) 을맞추어최종농도 10 mg/l의나노물질이포함된용액을준비한다. ph 조절은앞서언급하였듯이다른영향을배제하기위하여버퍼용액을사용하지않고질산과수산화나트륨을이용한다. 준비된용액은 5분동안질소가스공급하여용액내포함되어있는산소를제거한다 초기이온농도측정 ph 등을조절하지않은 10 mg/l 의나노물질원액속에포함되어있는이온 의농도를정량하여초기값으로사용한다

69 제조나노물질안전성시험방법해설서 III. 시험결과및보고 1. 분석결과의처리 5일동안각각의용액을상온 (22 ), 체온 (37 ), 저온 (4 ) 의항온기에보관한뒤, 해리되어나오는양을정량한다. OECD TG에서는 5일동안 10% 이하가해리될경우안정하다고정의하고더이상의실험은수행하지않는다. 그러나나노물질의경우 10% 정도의해리도중요하게작용할수있고각각의물질의해리정도를비교하기위하여 5일동안의최종값을측정하여제시한다. 10% 이하의적은농도가해리될경우 1일, 3일, 5일차에시료를채취하여분석하고, 10% 이상의많은농도의해리가관찰될경우 5일동안매일시료를채취하여분석한다. 2. 분해산물측정채취한시료는나노여과막 (Woongjin NE Membrane) 을이용하여은이온과나노입자를분리한다. Stirred cell에나노여과막을장착한뒤 5 bar정도의질소가스를이용하고 100 rpm정도로교반하여 50 ml의증류수를통과시켜나노여과막내포함되어있는불순물을제거한다. 다음으로채취한 2 ml의나노용액을주입하여금속이온을여과하고, 2배부피에해당하는 4 ml의증류수를더여과시켜잔존하는금속이온을여과해낸다. 여과액은 ISE 또는 ICP-MS 로분석하여나노입자로부터해리된이온의양을정량하고, 나노물질원액속에포함되어있던초기값과빼주어실제반응시간동안해리된양을산출한다. ICP-MS 의경우 5 μg/l의농도까지정확히측정가능하므로금속이온이낮은농도로해리될경우가급적 ICP-MS 을이용하여농도를측정한다. ph 2의경우나노여과막을이용할수없으므로채취한샘플에최종농도 100 mm의 ISA를첨가하여 ISE로측정한다. 3. 분석시주의사항 OECD TG 에의하면 5 일간 10% 미만해리시에 hydrolytically stable 하다고판정

70 하고있다. 따라서최소 5 일간수화또는해리여부를분석해야한다. 해리되는구간 의속도상수는전체입자의 20~70% 가해리되어야분석이가능하지만, 이온화를발 생되지않는경우는최종농도값만을제시한다. < 비생물학적분해정도분석흐름도 > 필터작업중나노여과막이교반막대로인하여손상될수있으므로수평을유지할수있도록잘고정시킨다. 여과액은 2 ml 의채취한시료에 4 ml의증류수가더포함되어있으므로농도계산시유의한다. 유색의콜로이드나노입자의경우, 가시광선영역의빛을흡수하기때문에실험시빛을차단하여수행하고, 반응동안에도빛에노출되지않도록갈색의반응기를이용하거나호일등을이용하여빛을차단한다. IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Citrate capped AgNP, 평균 50 nm

71 제조나노물질안전성시험방법해설서 2. 시험조건 ph 2, 7.5, 9 버퍼이용한온도변화, ICP 를이용한이온농도분석 3. 분석결과수화반응은비생물학적분해의일정이다. ph 2는다른 ph에서보다날짜에따른수화경향이크게는 10~15배이상으로나타났다. 0일차의온도에따른결과값은거의동일 (1.08~1.14) 하지만, 하루만지나도온도증가에따른이온해리증가현상이커졌다. 이는열에너지 (thermal energy) 유입으로인해 AgNP 주변에해리되어고정되어있던 Ag+ 가탈착되면서지속적인은이온화를돕고있는것으로파악된다. 4. 의미파악은이온의비생물학적분해에는 proton을필요로하므로, 낮은 ph에서더빨리해리가발생하게된다. 이는 ph 2의결과값과일치한다. 수계내에서생물체의도움없이자발적으로분해되어수계에노출되는이온의양을파악하는데도움이된다 Ag ( s ) + O H ( ) ( aq ) 2 Ag aq ( aq ) + H 2 O ( l ) < 온도와 ph 에따른 hydrolysis 결과 > ( 국립환경과학원, )

72 10. 나노입자의산화환원전위측정시험 I. 개요 1. 목적 나노입자의대표적인산화환원전위 (redox potential) 분석에관한표준화된방법 론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의 2.1. 산화환원전위 (redox potential) 나노입자표면의전하분포나전기화학적정보를제공한다. ORP(oxidationeduction potential) 라고도하며, 어떤물질이전자를읽고산화되거나전자를받고환원되려는경향을나타내는척도가된다. 전위값이클수록용액내나노입자가산화되려는경향이강해진다. 만약금속입자라면산화되어이온화경향이강해진다. II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질고체형나노물질은해당매질에분산이가능하면 ORP 측정기, CV(cyclic voltametry) 를이용하여쉽게분석가능하다. 침전없이분산안정성이높도록유지한다. 또다른방법으로는해당고체나노물질을전극에고정시켜작동전극으로

73 제조나노물질안전성시험방법해설서 활용하여 CV 분석을실시하는방법이있다. 이분석을통해최소, 최대피크를 얻으며각각은산화, 환원전위를나타내게된다 콜로이드형액체나노물질 콜로이드나노입자는 ORP 측정기, CV 를이용하여쉽게분석된다. 다양한매 질변화에따른침전이발생되면 ORP 값에오차가발생할수있다 시험조건산화환원전위는대상나노물질의산화또는환원되려는경향을파악하는것으로전자전달과관련되므로, 세포와의전자교환이발생될수있다고간주하면서시험을수행한다. 물을포함한다양한매질과염의농도를조절하면서산화, 환원전위를측정한다. 온도는상온 (23 ), 체온 (37 o ), 저온 (4 ) 등의조건을결정하여온도영향을파악하며, 농도에따른전위값변화도파악한다. 해당전위값이안정화될때까지반복하여측정한다 장치조건 CV 분석시전해질을사용하여전류가흐를수있도록해야하며, 전압인가하는동안 CV 그래프개형이안정적으로나올때까지반복수행한다. ORP 측정기는표준용매과시험용액간산화환원전위차이를통해측정하며, 시험결과의신뢰도를높이기위해반복수행한다. 산화환원전위는온도변화에민감하기때문에온도변화에주의해야한다

74 2. 시험방법 2.1. 시험장치준비 CV 측정을위해장치를세팅한다. 작동전극과상대전극으로는 ITO 전극과 Pt 전극을사용하고표준전극으로는 AgCl/1M KCl 전극을사용한다. 작동전극으로사용되는 ITO 전극은절연테이프 1cm 1cm를사용하여일정한반응면을만들어준다. 전해질로는 0.1M KCl, 1mM K 3 Fe(CN) 6 를사용한다 시험용액준비각각의용액조건 (ph 2, 7.5, 9, PBS, HepG2) 을맞추어최종농도 10 mg/l의나노용액을준비한다. ph 조절은다른영향을배제하기위하여버퍼용액을사용하지않고질산과수산화나트륨을이용한다. 또한, 나노입자의표면전하및특성을고려하여입자의분산안정성이높은용매를선정하는것이적합하다. <CV 를이용한산화환원전위분석흐름도 >

75 제조나노물질안전성시험방법해설서 2.3. 산화환원전위측정준비한시험용액을 4, 22, 37 암조건에서 24시간충분히반응시킨다. 온도조절장치를사용하여온도를유지하며입자크기를측정한다. 단, 온도조절장치를사용하지못할시, 냉 / 열원제거후 1시간이내에입자의크기분석을실시한다. III. 시험결과및보고 1. 분석결과의처리 ORP 측정기를사용할경우, 3회 1세트로 3세트의측정을통해서, 그리고 CV로측정할경우, 그래프개형이안정적으로나올때까지반복수행을통해서결과의신뢰도를높인다. ORP 측정기와 CV로측정한결과를서로비교하여, 조건에따른산화환원전위를해석한다. <ORP meter 를이용한산화환원전위분석흐름도 >

76 2. 분석시주의사항분석시침전상이강하게발생할경우는용액내입자의농도국지화현상이발생하여전체 ORP 값을반영하지못하게된다. 따라서입자의분산안정성이높은경우에측정가능하다. CV 분석에서작동전극으로사용되는 ITO 전극은 CV 분석을반복실시하는동안용액내분산된이온에의해표면변화가일어날수있다. 따라서실험시마다충분한세척과초음파처리를한다. ITO 전극표면에코팅이일어날경우같은표면적을가진새 ITO 전극으로교체하여시험을진행한다. 측정하기전, 측정시료를충분한교반을실시하여전해질에잘분산시킨다. CV 그래프는전압을수차례반복하여안정된값이나올때까지시험을실시한다. IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Citrate capped AgNP, 평균 50 nm 2. 시험조건 ph 7.5, 9 버퍼이용한온도변화, ORP meter 를이용한분석 3. 분석결과 ph 7.5에분산된 AgNP의경우, 온도에따라 ORP 값이 18 mv에서 39 mv로커짐을볼수있다. 이런결과는낮은온도에서는 ORP가낮기때문에입자의상태변화가그만큼적지만, 온도가올라갈수록 ORP 값도증가하면서입자의형태학적

77 제조나노물질안전성시험방법해설서 안정성이떨어지게될가능성을가지게된다. ph 9에분산된경우도 ph 7.5에서와마찬가지로온도에따라 ORP 값이증가함을확인할수있다. 9.1 mv에서 84.8 mv 로증가하였다. ph 9에서보다높은값을보이는것은음전하를지닌용매조건이기때문에 Ag+ 에서 Ag 금속으로환원하는데더높은산화환원전위값을갖는다는것을나타낸다. <ph 7.5( 위 ) 와 ph 9( 아래 ) 에서의온도에따른 ORP 변화 > ( 국립환경과학원, )

78 4. 의미파악산화환원전위분석은용액내에서산화나환원되려는경향을파악하는것으로금속나노입자의경우, 이온상태로존재하는지금속상태로존재하는지를판단할수있는지표가된다. 이온들이발생하여세포와반응하여독성을발현하는지를해석할수있는자료가된다

79 제조나노물질안전성시험방법해설서 11. 나노입자에의한라디칼형성가능성 I. 개요 1. 목적 나노입자의대표적인라디칼형성 (radical formation potential) 분석에관한표준 화된방법론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의생물체가나노물질에노출되면과도한활성산소종을형성하여나노독성을발휘한다고보고있다. 해당세포독성은라디칼형성가능성 (ROS, radical formation potential) 을평가하여판단할수있다. 라디칼은짝짓지않은전자를가지는원자단이고대개반응성이커서, 세포의괴사를유발하기도한다. 이들에대한형성가능성평가는세포독성을판단하는가장기초적인물리화학적특성이라하겠다. II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질분석대상매질내에나노입자를분산시켜 ROS 발생여부를형광검지체를이용하여분석한다. 따라서고체나노물질을매질내균일하게분산되도록초음파분산, 교반등을수행한다. 안정제를사용하여분산시라디칼생성에영향을미칠수있으므로가급적사용하지않는다

80 1.2. 콜로이드형액체나노물질 콜로이드나노입자는분산안정성이보장된다면대상매질내에서바로형광 검지체를이용한 ROS 분석이가능하다 형광검지체수계내에서생성될수있는라디칼은 H 2 O 2, O 2 -, OH, 1 O 2 이므로각각을선택적으로검지할수있는형광검지체를이용한다. 본시험에서는상업적으로판매하고그성능이많이알려진 amplex ultrared reagent/hrp(horseradish peroxidase)(h 2 O 2 ), hydroethidine(o 2 - ), APF( OH), singlet oxygen sensor green reagent( 1 O 2 ) 를사용하였다. < 라디칼측정용형광 probe 구조 > 1.4. 시험조건라디칼형성은생물체의주요독성기작인 ROS 형성과관련되므로, 다양한자연환경및세포내나노물질이노출되었다고간주하고시험을수행한다. 나노물질이없는매질내에서대조군의형광세기를파악한뒤, 나노물질이포함된상태에서형광세기를측정하여그편차를라디칼생성량으로해석한다. 라디칼은해당환경노출시바로발생되고빠르게사라질수있으므로시험환경에노출된나

81 제조나노물질안전성시험방법해설서 노입자를바로검지체와만나게하여 1 시간동안반응시킨뒤그동안생성된라 디칼을측정한다 장치조건검지대상라디칼에맞는형광검지체를선택해야하며, 검지체를인식할수있는형광파장을선택하여형광분석을실시한다. Microplate를이용하여빠른시간에적은양의시료로반복적인측정을할수있다. 형광분석기분석시형광세기값의비교가쉽도록적절한게인 (gain) 값을설정하여측정한다. 2. 시험방법 2.1. 형광검지체준비각각의형광검지체를아래와같은농도로준비하여 microplate 에주입한다. a. Amplex ultrared reagent/hrp(h 2 O 2 ) Amplex ultrared 는최종농도가 50 μm 되도록희석하고, HRP는 0.1 U/mL 이상의농도가되도록준비한다. b. Hydroethidine(O 2 - ) 최종농도가 2 μm이되도록희석한다. c. APF( OH), singlet oxygen sensor green reagent( 1 O 2 ) 최종농도가 1 μm이되도록희석한다

82 2.2. 시험용액준비각각의용액조건 (ph 2, 7.5, 9, PBS, HepG2) 을맞추어최종농도 10 mg/l의나노용액을준비한다. ph 조절은다른영향을배제하기위하여버퍼용액을사용하지않고질산과수산화나트륨을이용한다 라디칼생성측정준비된시험용액은미리준비되어있는형광검지체가포함된 microplate 에넣어반응을시작한다. 같은부피의증류수도각각의형광검지체에처리하여대조군시험을수행하고, 나노용액, 용액조건등의각각의대조군또한함께수행하여결과값을비교할수있도록한다. 1시간동안암조건에서반응후각각의형광검지체에맞는필터를사용한형광검출기를이용하여형광세기값을읽는다. H 2 O 2, O 2 - 측정시 510 nm(ex : Excitation)/590 nm(em : Emission) 의파장대를, OH와 1 O 2 측정시에는 485 nm(ex)/535 nm(em) 파장의필터를사용하였다. 형광세기값의비교가쉽도록적절한게인 (gain) 값을설정하여결과값의비교가쉽도록한다. III. 시험결과및보고 1. 분석결과의처리시료물질의결과값을시료물질을처리하지않은, 형광검지체만포함된대조군의결과값으로나누어증가된형광세기의비율을계산한다. 형광검지체에의한형광세기가아닌, 시료또는시료용액에의해증가된값을배제하기위해이또한대조시험을수행하고, 결과값과비교하여실제생성된라디칼의양을추산한다

83 제조나노물질안전성시험방법해설서 < 라디칼형성가능성분석흐름도 > 2. 분석시주의사항주로 in vivo, in vitro 실험과정에서발생하는활성산소종을파악하는데본방법을사용한다. 제공받은나노입자를대상버퍼용액에혼합한뒤, 적당한형광검지체를이용하여활성산소종의해당농도를정성, 정량분석한다. 사전에형광검지체만의형광세기를파악하여시험후의형광세기편차를해석해야한다. 형광세기의크기가중요한것이아닌시험전과후의세기편차변화여부를해석하는것이중요하다. 은나노의경우가시광선영역의빛을흡수하기때문에실험시빛을차단하여수행하고, 반응동안에도빛에노출되지않도록암조건에서실험을수행하거나호일등을이용하여빛을차단한다. IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Citrate capped AgNP, 평균 50 nm

84 2. 시험조건 ph 2, 7.5, 9, PBS, HepG2 이용, 라디칼 probe 사용, 형광분석기를이용한분석 3. 분석결과다양한매질에따라생성되는라디칼생성량을형광세기상대값측정을통하여분석하였다. 대조군과의비교없이위의결과만생각하였을때는 PBS에분산된 AgNP는상당량의 O 2 - 을발생하고, HepG2 에분산된 AgNP는 O 2 - 와 H 2 O 2 를상당량발생시키는것으로확인된다. 그러나위의대조군실험결과와비교하였을때, HepG2에서는 AgNP 존재시오히려낮은농도의라디칼이발생되었다. < 매질에따른라디칼측정결과 > ( 국립환경과학원, )

85 제조나노물질안전성시험방법해설서 4. 의미파악 물속에서생성될수있는라디칼은 4 가지활성산소종인 H 2 O 2, O 2 -, OH, 가있다. 해당라디칼을검출하기위해각라디칼에특정적으로반응하는 probe를이용하여 AgNP로생성되는라디칼을측정한다. 대조군과비교하여얼마나형광세기가달라졌는지를통하여라디칼생성정도를확인하는것이므로각각의시험조건에대한대조군실험이필요하다. 해당결과값은세포독성발현기작중의하나인 ROS 생성과관련된내용으로, 나노독성이해에대한중요한자료가된다. 1 O

86 12. 용액내나노입자의개별거동과집단거동 I. 개요 1. 목적나노입자의 1차입자로서의개별거동과응집으로인한이차입자의집단거동을측정할수있는표준화된방법론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의 2.1. 엉김 Agglomeration, 물리적결합이나약한 van der Waals 힘으로결합된입자들의모임 2.2. 응집 Aggregation, 공유결합과같은화학결합, 소성에의한결과, 물리적으로복합적인뒤얽힌상태를말하며, 입자간의강한결합력을지닌응집체 II. 시험 1.. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질 a. 개별거동파악고체상태의나노입자는 Cu grid에고정시키기위해휘발성용매 ( 알코올 ) 에

87 제조나노물질안전성시험방법해설서 분산시켜시료를준비한다. 피펫으로용액을 Cu grid에몇방울뿌린뒤자연건조시키고 TEM 분석을실시한다. 입자들이서로뭉쳐있으면제대로된이미지를얻을수없기때문에가능한희석시키고초음파를이용한분산을실시한다. b. 집단거동파악액상에분산된상태에서고형나노물질의응집여부를파악하기위해서는우선분산매질에균일하게분산될수있도록한다. 가능하면초기분산상태의전자현미경이미지, 입도분포도를확보한다 콜로이드형액체나노물질 a. 개별거동파악액상시료는별다른전처리없이농도만희석시켜 Cu grid에시료를고정시킨다. 액상시료가건조되면서용액내나노입자들이서로뭉치지않도록가능한희석시켜서분산시킨다. 액체나노물질의경우초음파처리에콜로이드안정성이깨질수있는시표가있으므로초음파처리는신중히고려한다. b. 집단거동파악액상에존재하는나노물질은원하는적정농도로희석한상태로시료를준비한다. 가능하면초기분산상태의전자현미경이미지, 입도분포도를확보한다. 1.3 시험조건 a. 개별거동파악 TEM 분석을통해서는입자의응집, 크기, 모양, 결정면등다양한정보를얻게된다. 따라서다양한시험환경에노출되었거나생체용버퍼에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. Cu grid에고정시키기전에, 물을포함한

88 염의종류가다른버퍼를사용하여시료의물리적특징변화를관찰한다. 온도는상온 (23 ), 체온 (37 ), 저온 (4 ) 등의조건을결정하여나노입자물리적변화를파악한다. TEM 분석시에는여러지점을측정하여대표성이확인된이미지를해당나노물질의 TEM 이미지로결정한다. b. 집단거동파악환경에노출되었거나생체용버퍼에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. 따라서매질은물을포함한염의종류가다른버퍼를사용하여응집정도를실시간으로분석한다. 온도는상온 (23 ), 체온 (37 ), 저온 (4 ) 등의조건을결정하여나노입자응집의온도영향을파악한다. DLS 장치내항온시스템이없다면, 항온시스템에서해당시험을진행하다가샘플링하여즉시시료를분석한다. 또한입자의농도에따라서응집여부가변할수있으므로다양한농도에서응집가능성을평가한다. 1.4 장치조건 a. 개별거동파악 Cu grid에고정시키는나노입자의양은극미량이어도무관하다. 용매가완벽하게마르지않을경우, 장치내오염을초래할수있다. 용액상태그대로찍고자할때는 cryo-tem, bio-tem 등을이용한다. b. 집단거동파악 DLS 종류에따라서나노입자가분산된용액 (3~5 ml) 을큐벳 (cuvette) 에넣어서찍거나흘려주면서분석한다. 응집이매우빠르게일어나는경우, 실시간분석시측정시간간격을짧게줄여야하는데이를위해장비의세팅을최적화할필요가있다. 단분산되어있는샘플의경우 pre-size test 횟수를줄이거나 cut off dust 기능을사용하지않는것이그예이다

89 제조나노물질안전성시험방법해설서 2. 시험방법 2.1. 시료준비 a. 개별거동파악시료를준비할때는위에서설명한방법을따르고입자가뭉치지않게유의한다. 먼저 TEM Cu grid를필터페이터위에앞뒤를구별해앞면이위를향하도록올린다. Tweezer 로 grid를집을때되도록가장자리부분을이용한다. 준비된시료를한방울 (10 μl) 을 grid위에정확히떨어뜨린다. 이때시료의농도는 100~1000 mg/l가적당하고만약이보다저농도의샘플일경우시료를건조시킨뒤여러번샘플을떨어뜨려는과정을반복한다. 약 10 mg/l 의샘플일경우 10번정도반복한다. 이과정이끝나면샘플을충분히건조시킨다. b. 집단거동파악응집을분석하려는농도 (e.g. 10 mg/l) 보다높은농도 (e.g mg/l) 의샘플을준비한다. medium 을준비할때첨가될액상은나노입자용액의부피를고려하여농축하여준비한다. 예를들어 PBS는 1X로준비하면이후은나노용액을첨가할때농도가낮아지기때문에 1X, 2X 정도로준비한다. 나노시료와혼합했을때의농도가의도한것과일치하기위해서는미리계산하여준비한다 온도제어온도조건을고려할경우준비한 medium과나노시료을함께항온장치에서미리온도를조절해둔다. 이때나노시료이조절할온도에대해불안정하다면제외한다

90 III. 시험결과및보고 1. 분석결과의처리 a. 개별거동파악 TEM 장비를작동시에 brightness, focus 를적절히조절하며이미지를얻는다. 이미지는항상저배율과고배율을함께찍어서대표성을확보하도록한다. TEM 분석결과는 ImageJ 공용프로그램을이용하여일차입자에대한입도분포도를분석할수있다. 이를 DLS 결과와비교하여개별거동과집단거동의차이를살핀다. b. 집단거동파악 DLS 측정용큐벳에매질을넣고나노시료을첨가한다. 이때첨가한은나노샘플의농도가높다면빠르게 2~3번피펫팅하여고르게분산시킨다. 그러나나노시료의농도가크게높지않다면측정시간의단축을위해큐벳벽면을따라천천히흘려준다. 왜냐하면샘플에요동이있다면측정값이부정확하고분석하기전에필요한 pre-test 시간이길어지기때문이다. < 개별거동분석을위한 TEM 분석흐름도 >

91 제조나노물질안전성시험방법해설서 < 집단거동파악을위한 DLS 분석흐름도 > 2. 분석시주의사항대상나노물질이매질내에서침전된다면정확한입도분포를확인하기어려워응집속도해석에오차를가져오게된다. 또한입자의분산안정성이너무우수하면해당분석에따른응집속도해석이무의미해진다. 따라서이러한경우는응집상태만을관찰하는 TEM, SEM 등과같은전자현미경을이용하는것이바람직하다. TEM 분석을위한 Cu grid내시료고정시, 유기용매가남지않도록가능한완벽하게건조를시킨다. 건조과정에서휘발성용매의급격한증발은입자간의응집을발생시키므로, 이를주의해야한다. 분산용매내나노입자는가능한충분히희석한상태로사용한다. Grid 위샘플에수분이남아있을경우진공상태로전환할때장비가손상될가능성이있으므로항상 grid를충분히건조시킨다. 하나의 Grid에서적어도 5 군데이상의장소에서저배율과고배율이미지를얻어서대표성을확보한다. DLS 장비는입자의브라운운동성을바탕으로입경을계산하는원리이다. 여러

92 가지온도조건에서실험을진행할경우, 온도에의해서브라운운동성이달라질가능성을고려해야한다. 예를들어낮은온도조건에서는브라운운동성이낮기때문에입경이실제보다크게측정될수있다. 온도를조절해야하는경우를제외하고, 가능한샘플이들어있는큐벳을움직이지않는것이좋다. 즉 DLS 장비에샘플큐벳을로딩한후측정이끝날때까지큐벳을빼지않는것이다른변수를줄일수있다. 온도를조절할때샘플도함께항온조에넣을지는신중하게판단해야한다. 나노입자의콜로이드안정성이주위온도에의해쉽게변한다면응집실험을수행하기이전에입자가응집될염려가있다. 만약주위온도에민감하다면항온조과정을배제하고매우고농도의샘플을준비하여적은부피를실험에사용한다. IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Evonik TiO 2 (27 nm), 석경 AT SiO 2 (50 nm), 표면처리안된분말상물질 2. 시험조건 DW 용액에해당시료를 100 ppm 분산, TEM 분석및 ImageJ 프로그램을이용 한입도분포도 ( 개별거동크기 ) 작성, DLS 를이용한 HDD 값측정 ( 집단거동크기 ) 3. 분석결과 TiO 2 에대한 TEM 결과에의하면, 개별입자 (primary particle) 의크기는업체측에

93 제조나노물질안전성시험방법해설서 서제공한 27 nm 미만을보이지만, 대부분의입자가가지상이나서로엉겨있는응집 (agglomerate, aggregate) 된형상을보인다. 입자가용액내분산시개별입자로존재하지않고 secondary particle 형태를유지하는것으로보아집단거동 (group movement) 을취하는것으로판단된다. SiO 2 의개별입자 (primary particle) 는구형이며업체에서제시한 10~20 nm가아닌 47 nm인것으로파악되었다. 입자는개별거동을보일것으로예견되었으나 TEM에서처럼가역적응집 (agglomerate) 을형성하는것으로판단되었다. 가역적응집의경우는강한교반이나농도의희석을통해재분산이가능한상태이다. 4. 의미파악 TiO 2 의 TEM 상에서 2차입자의장축회전직경이 DLS 분석시 HDD가되며, 실제 DLS 결과에서는 200 nm의입자크기를보였다. 따라서대상나노물질은액상에서개별입자로서거동하기보다는 2차입자를형성하는집단거동특성을나타낸다. 일부가역성응집 (agglomerate) 입자들의가지상 1차입자는보다강한분산법으로분산을시킬수있으나, 또다시쉽게응집되는특성을보인다. SiO2 입자는강한교반을통해분산이이루어져서가역적응집상에서보다작아진 HDD를나타내기도하였다. 그렇지만용액내거동은 TEM상의 1차입자의크기와는현저히다른크기를보이고있다. TEM 상에서 2차입자의장축회전직경이 DLS 분석시 HDD가되며, 실제 DLS 결과에서는 170 nm의입자크기를보였다. 따라서대상나노물질은액상에서개별입자간의가역적응집이나타나고, 개별입자로서거동하기보다는 2차입자를형성하는집단거동특성을나타낸다. 분산제를사용할경우, 가역성응집은쉽게개별입자로재분산되는특성을지닌다. 개별거동 / 집단거동크기의비를산출했을때, 크기비가 1에가까울수록개별입자가단독으로거동함을나타내고 0에가까울수록집단거동의크기가커지며응집이지배적이게된다. Evonik TiO 2 는 27/200=0.135, 대주정밀 TiO 2 는 15/175=0.086, Sigma-Aldrich SiO 2 는 11/176=0.063, 석경AT SiO 2 는 47/170=0.276를보인다. 따라

94 서석경 AT SiO 2 가 DW 상에서그나마작은크기의집단거동을보이게되며, Sigma-Aldrich SiO 2 가가장큰집단거동크기를보인다. <TiO 2 : ImageJ 로계산한개별입자 ( 좌측 ) 와 DLS 로분석한집단거동입자의입도분포도 >

95 제조나노물질안전성시험방법해설서 <SiO 2 : ImageJ 로계산한개별입자 ( 좌측 ) 와 DLS 로분석한집단거동입자의입도분포도 >

96 13. 나노입자의제타전하에대한입자크기의민감도측정시험 I. 개요 1. 목적나노입자의대표적인제타전위 / 표면전하 (zeta potential/surface charge) 분석을통한 PZC(point of zero charge) 를측정하고 PZC 근처에서입자크기변화의민감도를분석할수있는표준화된방법론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의 2.1. 제타전위제타전위 (zeta potential) 은콜로이드나노입자의표면전하 (surface charge) 를나타내는전압값으로, 전기이중층 (electrical double layer) 이론에근거하고있다. 이는분산매질과분산입자간의전위차를말한다. 표면전하값은음과양의 mv로표현되는데, 이값이한쪽으로크게치우칠수록입자의분산안정성이높다는것을나타낸다. 또한표면전하정보는생물체 ( 세포 ) 에하전된나노입자가노출되었을때대상체와의친화력을판단하는기준이되기도한다. 제타전위또는표면전하는벌크용액의 ph, 염으로제어되는이온강도등의함수가된다 제타전위와안정성제타전위값이 0 mv 에가까워지면입자의정전기적반발력에의한안정화기작이무너지고입자의응집이발생된다. 이러한지점을 PZC 라고하며 ph 조절에따른제타전위측정을통해확인할수있다. 해당 ph 근처에서입자의크기가얼마나민감하게응집되어커지는지를파악하는것은액상내노출된나노입자의응집특성과 ( 집단 ) 거동특성파악에도움이된다

97 제조나노물질안전성시험방법해설서 II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 분말형고체나노물질고체상태의나노입자의제타전위를알기위해서는원하는매질내분산을시켜야한다. 이를위해서는우선분산매질에균일하게분산될수있도록한다. ELS 장비에함께장착된제타전위측정모드를이용하여분석한다. 액상에서침전이발생하는나노입자는산염기적정법을이용하여교반하면서분석을실시한다 콜로이드형액체나노물질 액상에존재하는나노물질은원하는적정농도로희석한상태로시료를준비한다. 분석 시에침전이발생하는나노입자는산염기적정법을이용하여교반하면서분석을실시한다 시험조건환경에노출되었거나생체용버퍼에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. 따라서매질은물을포함한염의종류가다른버퍼를사용하여응집정도를실시간으로분석한다. 온도는상온 (23 ), 체온 (37 ), 저온 (4 ) 등의조건을결정하여나노입자응집의온도영향을파악한다. ELS 장치내항온시스템이없다면, 항온시스템에서해당시험을진행하다가샘플링하여즉시시료를분석한다. 시료의침전이과하게발생하면분석이어려울수있다. 반대로나노입자의분산안정성이매우우수하면, 실시간분석보다는일단위로분석하는것이바람직하다 장치조건 ELS 종류에따라서나노입자가분산된용액 (3~5 ml) 을큐벳 (cuvette) 에넣어

98 서찍거나흘려주면서분석한다. 산염기적정법으로계산한표면전하의절대값은 정확하지않을수있으므로양과음의값여부를확인하는것이바람직하다. 2. 시험방법 2.1. 시험용액준비각각의용액조건 (ph 2, 7.5, 9, PBS, HepG2 등 ) 을맞추어원하는시험농도의나노용액을준비한다. ph 조절은다른영향을배제하기위하여버퍼용액을사용하지않고질산과수산화나트륨을이용한다. ph를 1~13까지조절하면서제타전위를측정하고, 동시에 DLS를이용한입도크기를확인한다. DLS 분석에관한사항은 용액내나노입자의개별거동과집단거동의측정법 에제시된방법을따른다. < 제타전위및 PZC 분석흐름도 >

99 제조나노물질안전성시험방법해설서 2.2. 표면전하측정준비한시험용액을 4, 22, 37 암조건에서 24시간충분히반응시킨다. 온도조절장치를사용하여온도를유지하며입자크기를측정한다. 단, 온도조절장치를사용하지못할시, 냉 / 열원제거후 1시간이내에입자의크기분석을실시한다. ph에따른제타전위와입도분포를측정한다. PZC를확인한다음, 시료를다시준비하여 PZC 근처에서미세하게 ph를조절하면서 DLS, ELS를재분석한다. III. 시험결과및보고 1. 결과분석입자표면전하를분석하는데, 3회 1세트로 3세트의측정을통해데이터의신뢰도를높인다. 제타전위에따른입도크기에대한그래프를그리면가우시안분포도처럼그려진다. 다시제타전위값을절대값을취한다음지수함수 (e -ax ) 로추세선을그으면민감도상수 a를구할수있다. 해당값이클수록 PZC 근처에서제타전위의미세한변화에따른입자응집이크게발생한다는것을나타낸다. 2. 분석시주의사항제타전위는 ELS 장치내제타전위측정모드를사용한다. 시료를큐벳에넣어측정하거나장치에흘려보내며측정때는기포가생기지않도록주의한다. 또한, 큐벳에지문이나이물질이묻지않도록주의한다. 대상나노물질이매질내에서침전된다면정확한제타전위측정이어렵게된다. 따라서가능한침전이발생하지않아야하며, 장시간분산이잘되는경우만제대로된분석결과를얻을수있다. 그렇지않을경우는교반을실시하면서질산과수산화나트륨을이용한산염기적정법으로표면전하를계산해야한다

100 IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Evonik TiO 2 (27 nm), 표면처리안된분말상물질 2. 시험조건ㆍPZC 확인 : ph 1~13 용액에 100 ppm의시료를분산, 해당시료에대한제타전위 (ELS) 및입자크기 (DLS) 측정ㆍ민감도확인 : PZC 근처의 ph 용액에입자를재분산, HNO 3 나 NaOH 용액을주입하면서미세하게 ph 제어, ph 및제타전위 / 입자크기측정 3. 분석결과 TiO 2 를 DI water에분산시키고 ph를 HNO 3, NaOH 수용액으로제어하면서용액의 ph에따른제타전위값의변화를분석하였다. 용액의 ph 6.7 근처를중심으로낮은 ph에서는양의전하값을보였고, 높은 ph에서는음의전하값을보였다. ph 6~7 근처에서급격한제타전위변화를보이고있으며, 0 mv를보이는지점에서입자의응집이초래될것으로예상되었다. 해당 ph에대한 HDD를분석한결과, 입자는최대 9 μm까지응집되는것으로파악되었다. +40 mv, -40 mv를보이는낮은 ph 영역과높은 ph 영역에서는제타전위값이안정적이며입도크기변화도크게나타나지않고있다. 제타전위가 0 근처가되는지점에대한 ph를미세하게조절하면최대로성장하는입자의 HDD를측정할수있다. 이를통해제타전위가 0 mv 근처로감에따른입자의집단거동크기의민감도를계산할수있다. 제타전위가양과음의값이클때는입자의크기가대체로일정하고집단거동 (HDD) 의크기도크지않지만, 0 mv 근처로가면서 HDD는값은 ph의미세한변화에게민감하게변하는것을확인할

101 제조나노물질안전성시험방법해설서 수있다. 제타전위의부호가중요한것이아닌그크기가중요하므로이를절대값 으로표현하여다시그리면민감도에대한정량적인해석이가능하다. 지수함수 (e -ax ) 로표현하였을때, 민감도지수는 0.06 로나타났다. <ph 변화에따른제타전위와 HDD 변화 >

102 < 제타전위에대한 HDD 의민감도 >

103 제조나노물질안전성시험방법해설서 14. 나노입자의가역및비가역응집현상 I. 개요 1. 목적 나노입자의응집특성중가역응집과비가역응집을구분할수있는표준화된방 법론을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의 차및 2차입자나노입자는대기중이나액상에노출되면최초의 1차입자크기를유지하지못하고응집 (agglomeration/aggregation) 하여 2차입자를형성한다. Agglomeration 은물리적결합이나약한 van der Waals 힘으로결합된입자들의모임을말한다. Aggregation 은공유결합과같은화학결합, 소성에의한결과, 물리적으로복합적인뒤얽힌상태를말하며, 입자간의강한결합력을지닌응집체를말한다. Agglomerate 는 1차입자 (primary particle) 로서이들의응집은외부온도, 압력, 화학적변화등의요인으로입자간의소결, 결합으로 2차입자 (secondary particle) 를형성하면 aggregate로변하게된다. < 용액내나노입자의가역및비가역응집현상 >

104 II. 시험 1. 시험의준비 1.1 분말형고체나노물질고체나노물질을원하는용매에분산시킨다. MLS는고농도분석도가능하므로농도에따른입자응집성평가에도활용가능하다. 가능한개별입자의크기를확인할수있는 TEM 자료를확보한다 콜로이드형액체나노물질 액상에존재하는나노물질은원하는적정농도로희석하거나원액그대로를 분석한다. 가능한개별입자의크기를확인할수있는 TEM 자료를확보한다 시험조건환경에노출되었거나생체용버퍼에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. 따라서매질은물을포함한염의종류가다른버퍼를사용하여 MLS를이용한광산란정도를실시간으로분석한다. 온도제어도가능하므로나노입자응집의온도영향을파악한다. MLS 장치내항온시스템이없다면, 항온시스템에서해당시험을진행하다가샘플링하여즉시시료를분석한다. 또한입자의농도에따라서응집여부가변할수있으므로다양한농도에서응집가능성을평가한다 장치조건 MLS는 10~30 ml의용액내나노입자의분산안정성를임의의시간간격으로측정이가능하다. 측정용기의상부에서바닥까지투과도를측정하고, 투과도변화를통해입자의침강속도를평가하여수계분산안정성을해석할수있다. 비수

105 제조나노물질안전성시험방법해설서 계에서도동일한분석이가능하다. 그러나용매가시간에따라색변화를보일경 우분석이불가하다. UV 분광계는흡광피크의세기감소를측정하여입자의농 도변화를확인하지만, 정량적침전속도를구하기는어렵다. 2. 시험방법 2.1. 시료준비각각의조건 (ph 2, 7.5, 9, PBS 등 ) 에따른용매를준비하고, 용매에분산시켰을때원하는농도가되도록나노용액을준비한다. ph 조절은다른영향을배제하기위하여버퍼용액을사용하지않고질산과수산화나트륨을이용한다. 실험직전각각의용매에나노입자를분산시킨뒤바로실험을진행한다. 용액을담는용기는깨끗한유리병을사용하여 NIR의투과에영향이없도록한다 분석과정원하는농도의나노입자시험용액을시험직전바로제조하고, 시간에따른 MLS의투과광과후방산란광의 % 를측정한다. 그래프의개형을통해침전이발생하지않고전반적으로증가또는감소하는결과가보이면입자의가역또는비가역응집이발생된다고판단한다. III. 시험결과및보고 1. 결과분석 MLS 는시험용액의측정한투과도변화를통해입자의분산안정성을계산한다. 투과도변화가없는경우, 분산안정성이우수한상태로해석할수있다. 투과도가

106 상승또는하강하는경우는입자간응집에따른결과로해석할수있다. 1 차분석 한시료를 10~1000 배희석시켜재분석시켰을때투과도가상승또는하강하지않 는다면비가역성응집으로판단한다. <MLS 를이용한비가역및가역응집의구분법 > 2. 분석시주의사항입자크기가 600 nm 보다작으면레일리 (Rayleigh) 산란이발생하고보다크면미 (Mie) 산란이발생한다. 두경우후방산란광의상승및하강변화양상이정확히반대가되므로, 사전에초기입자에대한 TEM 결과값을확보해야한다. 이를바탕으로입자의응집이레일리산란영역에들어가는지를판단해야한다

107 제조나노물질안전성시험방법해설서 IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Evonik TiO 2 (27 nm), 표면처리안된분말상물질 2. 시험조건 50, 100, 1000 ppm 의 TiO2 를 DW 상에서제조, 깨끗한바이얼병사용, 6 시간동 안 MLS 분석 3. 분석결과 DLS는입사레이저의투과된산란광을해석한다면, MLS는적외선을사용하여투과와후방산란광을해석하여입자의응집 (agglomerate, aggregate), 침전 (sediment) 여부를구분해낼수있는장치이다. 시간에따라투과산란광과후방산란광의증가 / 감소여부를파악하고그래프모양에따라서입자의분산성을평가하게된다. 입자의응집이비가역적인지가역적인지를확인하기위해서는분석한시료를희석하여재분석하였을때, 더이상의입자성장이나타나지않으면비가역응집 (aggregate 또는 coalescence) 로판단한다. MLS 분석결과에서시작부분은시료용액이담긴병의아래부분을측정하게되고, 상층부분은 MLS 그래프의가장오른쪽에서측정된다. MLS의후방산란값이시간에따라증가하는경향을보이고있으며, 이는입자의응집 (flocculation, coalescence) 가발생하고있다는증거가된다. 농도가높으면중간영역에서의그래프증가폭이줄어드는데이는입자의침전이나타났음을뜻한다. 그래프의시작부분에서시간에따른후방산란값이점차증가하고있으며, 입자의침전으로인한후방산란이많이발생하고있음을나타낸다. 특히 1000 ppm의고농도에서는농도가높아서전방투과보다는후방산란이주로발생되고있다. 용액내

108 TiO 2 의침전속도는 50 ppm 의경우는 7.60%/hr 를보이며, 100 과 1000 ppm 은각각 1.27, 2.57%/hr 를보인다. < 입자의농도에따른 MLS 분석결과 : 50( 상 ), 100( 중간 ), 1000( 아래 ) ppm>

109 제조나노물질안전성시험방법해설서 15. 토양 / 액상계면에서나노입자분포측정시험 I. 개요 1. 목적 액상의형태로토양환경에노출된나노입자의분포를파악하는방법론으로서배 치조건흡착법을제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의 2.1. 흡착액상에분산된나노입자가환경매질중에토양에노출되고여러가지원인에의해고체상과액체상에분포평형에도달하게된다. 여러가지원인중에흡착 (adsorption) 은나노입자가고체표면에접촉하여부착되는현상을말하며흡착제인토양의비표적면, 나노물질에대한친화력이중요한변수로작용한다 증착증착 (deposition) 은이미흡착된나노입자위에다른나노입자가결합하는것으로토양과나노입자사이에결합력이아닌나노입자간의상호결합력이작용에의해나노입자가 쌓이는 과정이다 퇴적 퇴적 (sedimentation) 은액상에서나노입자간의결합력에의해큰응집체로성

110 장하고중력에의해가라앉아토양표면에머무르게되는현상이다. 증착 (deposition) 과퇴적 (sedimentation) 은토양주변에형성된액상계가나노입자의 분산안정성에어떤영향을줄수있는지가중요한역할을한다. II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 토양시료토양시료는입자의크기에따라 sand, silt, clay로분류된다. Sand는입자크기가 0.05~2.0 mm, silt는 0.002~0.05 mm, clay는 mm 이하에해당한다. 다양한토성을가진토양으로선정한다. 예를들어, Quartz sand는입경이 0.05 mm 이상인 sand로구성되어있고, Kaolinite는 model clay로서 mm 이하의입자로구성된다. 이후모든토양의전처리과정은 OECD TG 106에준하여수행한다. 채취된 field soil은시험을수행하기전에상온보관하고, 환기가되는곳에위치하여풍건된상태를유지한다. 미생물에의한토양특성의변화를막고자한다면동결건조도가능하다. 시료의보관기한에대해서정해진제한은없지만 3년이상보관된시료에대해서는유기탄소함량, ph, CEC에대해재분석할필요가있다. 상온보관은 20~25 가적절하며최소한의힘으로분쇄 (disaggregation) 하여시료의본래토성 (soil texture) 이변하지않도록해야한다. 분쇄된토양은 2 mm 체에걸러 2 mm 이하의토양시료만시험에사용한다. OECD TG에서요구하는토양시료의물리화학적특성은 ph, total organic carbon, soil texture, total nitrogen content, cation exchange capacity를포함하고전처리가완료된토양시료의특성을분석한다

111 제조나노물질안전성시험방법해설서 1.2. 분말형고체나노물질고체상태의나노입자는원하는액체용매 (de-ionized water 등 ) 에원하는농도로분산시킨다. 이때입자들이서로뭉쳐있으면재현성있는거동파악이어려우므로초음파를이용하여분산하거나목적에따라분산제를첨가한다. 재현성있는결과를위해가능하면초기분산상태의전자현미경이미지, 입도분포도를확보한다 콜로이드형액체나노물질액상나노물질은별다른전처리없이농도만희석시켜시료를준비한다. 액체나노물질의경우초음파저리에콜로이드안정성이깨질수있는시표가있으므로초음파처리는신중히고려한다. 가능하면초기분산상태의전자현미경이미지, 입도분포도를확보한다 시험조건 a. 흡착준비나노용액과토양의비율은예비시험을통해알아낸다. 분석을통하여토양에 60~80% 정도로흡착되는비율을찾는다. 평형시간은 24시간이면충분하지만예비시험에서 4, 8, 24, 48시간지점에서어느정도의흡착량을갖는지분석한다. b. 흡착적당한비율로준비된나노용액과토양을평형에도달할때까지교반시킨다. Orbital shaker 를이용하여교반후, 튜브에가라앉아있는토양은 vortex 를이용하여나노용액과잘섞어준다. c. 흡착후대상나노물질의성질에따라직접분석혹은간접분석을수행한다. 직접

112 분석을하기위해 filtration을수행한다. 여과지에흡착된나노용액을담기전에먼저증류수로여과지를적신다. 나노용액을붓고여과지에걸러지는고체만건져분석에이용한다. d. 간접분석원심분리기를이용하여원하는 rpm과시간동안용액을분리한다. 상층액중일부를취하여분석에이용한다 장치조건ㆍ교반기 : 배치조건에적합한교반기는 orbital shaker 이다. 일정한속도로유지하며토양과나노용액을잘섞어줄수있는기계면적당하다. ㆍ원심분리기 : 빠른속도와 3000g 이상의원심력, 온도조절이필요하고 0.2 μm 이상의입자를가라앉힐수있어야한다. ㆍ오븐 : 의온도를유지할수있어야한다. 2. 시험방법 2.1. 시료준비각각의조건 ( 농도, ph, ionic strength, 인공강우, NOM 등 ) 에따른용매를준비하고용매에분산시켰을때원하는농도가되도록나노용액을준비한다. ph 적정은질산과수산화나트륨을이용하여 ph 2에서부터 11까지조절한다. 인공강우조건은 0.01M CaCl 2 로맞춘다. 실험직전각각의용매에나노입자를분산시킨뒤바로실험을진행한다

113 제조나노물질안전성시험방법해설서 2.2. 분석방법의선정대상나노물질에대하여적합한분석방법을결정하기위해먼저예비실험을진행한다. 토양과용액간의적절한비율과평형시간을결정하고표면의흡착정도등을조사하여흡착평형상태에도달하였는지흡착 kinetics를분석한다. 분석을통하여직접분석방법혹은간접분석방법을선택하고흡착과탈착의 isotherm을분석한다. a. 직접분석방법 (direct method) 토양에흡착된나노물질을직접분석하는방법으로, 흡착반응후에필터링을통해걸러낸토양을건조시켜소량의나노입자가흡착된토양을강산과고온조건에서 digestion 시켜서토양에흡착된나노입자의농도를 ICP로측정한다. b. 간접분석방법 (indirect method) 토양에나노입자를흡착시키고원심분리법을이용하여상층액을분리해낸다. 토양에흡착되지않고상층액에남아있는나노입자의농도를 ICP 분석을통해측정한다. III. 시험결과및보고 1. 분석과정대상나노물질에적합한방법을선정하고예비실험을통해평형시간을정한후준비된나노용액을토양에노출시켜흡착반응을진행한다. 나노용액은토양에노출시키기직전에분산시켜입자끼리의응집을최소로줄인다. 나노용액과토양은평형상태에도달할때까지교반시켜준다

114 a. 직접분석방법앞서흡착시켜놓은토양과나노입자의혼합물을필터링을수행하여걸러낸다. 여과지에걸러진흡착물질 ( 토양에흡착된나노입자와토양의혼합물 ) 을 3 시간이상건조시켜소량의흡착물질을강산과고온조건에서 digestion 시켜분석을진행한다. Digestion 방법은질산과염산을 1:3 비율로섞은왕수용액에불산을섞어고온 (250 ) 에서적당한시간 (3시간이상 ) 동안반응시키는데, 토양과대부분의나노입자를녹일수있어직접적인농도분석이가능하다. b. 간접분석방법토양에흡착된나노입자가아닌상층액에남아있는나노입자의농도를측정하는데이는원심분리법을이용하여상층액의나노입자를분리한다. 물질마다적당한 rpm과시간을정하여수행한다. 상층액의농도를측정하여흡착량을계산하는데사용한다. 직접, 간접분석후, 흡착된나노입자혹은상층액에있는나노입자의농도를 ICP로측정한다. 측정된값은계산을통해실험조건에맞는 isotherm 식에대입하고이론적으로해석해본다. 2. 분석시주의사항나노용액을준비할때, 실험직전에입자를분산시켜주는것이중요하다. 나노물질에따라분석방법을선정할때, K d (distribution coefficient)*m soil (mass of soil)/v 0 (Volume) 값이 0.3 보다크면액상농도를측정하는간접분석방법을, 0.1 보다크면액상과토양농도를모두측정하는직접분석방법을선택하여진행한다. 예비실험을수행할때나노입자와토양의흡착반응후흡착된나노입자의토양층과흡착되지않은나노입자의상층액을원심분리법으로분리할수있다면간접분석방법을선택하고, 나노입자의크기가크거나응집이잘되어원심분리법을통한분리가부정확한경우에는직접분석방법을수행해야한다

115 제조나노물질안전성시험방법해설서 직접분석방법수행시, 나노입자의농도분석전처리과정으로강산과고온을이용하여토양과나노입자를 digestion 시키는데, ICP 분석전에용액을충분히희석시켜주어야한다. 그이유는전처리시사용되는강산중불산 (HF) 이남아있으면 ICP의토치 (torch) 를손상시킬수있기때문이다. < 배치조건시험흐름도 >

116 IV. 분석실시사례 1. 대상물질 Evonik TiO 2 (27 nm), 표면처리안된분말상물질 2. 시험조건 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, ppm의 TiO 2 를 DW상에서제조, 깨끗한코니칼튜브사용, 토양과 TiO 2 용액의비율 1:15, 교반시간 24시간, 직접분석방법사용 ( 왕수 : HF = 5 : 2), 직접분석후희석 3회 3. 분석결과 TiO 2 나노입자를 10~10000 ppm의농도별로토양내의흡착량이어떻게다른지실험한결과이다. 토양에따라성질이다르기때문에, TiO 2 나노입자의거동도다르게보여진다. 직접분석방법을이용하여흡착된 TiO 2 나노입자의농도를측정하였고, 이를계산하여 Freundlich isotherm 에적용하였다. 다음의그래프와같이각토양마다서로다른기울기를나타내며이것이곧토양과나노입자사이의결합정도를나타낸다. 기울기가작을수록토양과나노입자사이의결합이강한것을의미한다. 하지만전반적으로 TiO 2 나노입자는토양에매우낮은흡착특성을나타내는것으로판단된다. 또한, 입자의응집성향이강하고 polydispersity가높기때문에신뢰도 (R 2 ) 가크게떨어지는것으로보인다

117 제조나노물질안전성시험방법해설서 < 농도에따른 TiO 2 흡착량의 Frendlich isotherm 적용 > <Frendlich isotherm equation 의계산값 >

118 16. 토양매질에서나노입자의이동성평가를위한침출시험 I. 개요 1. 목적 토양환경에노출된나노입자의이동성을파악하는방법론으로서컬럼침출법을 제시하고, 구체적인실시예를보이고자한다. 2. 정의 2.1. 환경거동액상에분포된나노입자는자연계에존재하는다공성매체인토양을통과하면서이동하게된다. 다양한 colloid 중하나로서제조나노입자의이동성은토양환경독성평가뿐만아니라지하수오염가능성을파악하는데도기준이되기도한다. 나노입자는토양주변에조성된다양한환경변수에의해응집, 침전등의물리화학적특성변화 (transformation) 를겪으면서흡착 (adsorption), 침착 (deposition), 여과 (filter) 되고이는나노입자의이동성을제한하는요소가된다. II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 토양시료 토양시료는입자의크기에따라 sand, silt, clay 로분류된다. Sand 는입자크

119 제조나노물질안전성시험방법해설서 기가 0.05~2.0 mm, silt는 0.002~0.05 mm, clay는 mm 이하에해당한다. 다양한토성을가진토양으로선정한다. 예를들어, Quartz sand는입경이 0.05 mm 이상인 sand로구성되어있고, Kaolinite는 model clay로서 mm 이하의입자로구성된다. < 토양환경에노출된나노입자의거동 > 이후모든토양의전처리과정은 OECD TG 106에준하여수행한다. 채취된 field soil은시험을수행하기전에상온보관하고, 환기가되는곳에위치하여풍건된상태를유지한다. 미생물에의한토양특성의변화를막고자한다면동결건조도가능하다. 시료의보관기한에대해서정해진제한은없지만 3년이상보관된시료에대해서는유기탄소함량, ph, CEC에대해재분석할필요가있다. 상온보관은 20~25 가적절하며최소한의힘으로분쇄 (disaggregation) 하여시료의본래토성 (soil texture) 이변하지않도록해야한다. 분쇄된토양은 2 mm 체에걸러 2 mm 이하의토양시료만시험에사용한다. OECD TG에서요구하는토양시료의물리화학적특성은 ph, total organic carbon, soil texture, total nitrogen content, cation exchange capacity를포함하고전처리가완료된토양시료의특성을분석한다

120 1.2. 분말형고체나노물질고체상태의나노입자는원하는액체용매 (de-ionized water 등 ) 에원하는농도로분산시킨다. 이때입자들이서로뭉쳐있으면재연성있는거동파악이어려우므로초음파를이용한분산하거나목적에따라분산제를첨가한다. 재연성있는결과를위해가능하면초기분산상태의전자현미경이미지, 입도분포도를확보한다 콜로이드형액체나노물질액상시료는별다른전처리없이농도만희석시켜시료를준비한다. 액체나노물질의경우초음파처리에콜로이드안정성이깨질수있는시표가있으므로초음파처리는신중히고려한다. 가능하면초기분산상태의전자현미경이미지, 입도분포도를확보한다 시험조건 a. 컬럼준비시험전에토양을컬럼내에 packing 하고구조적 pore 사이의공기가제거된 saturation 된상태를유지한다. Pore 내공기를제거하는방법은컬럼아래쪽의 outlet에증류수를주입하여토양이 packing 된높이까지차오르게한다. 이과정에서 pore 내공기는위쪽을통해제거되고 pore 구조는증류수가채워진 saturation 상태가된다. 이는 air 를배제한토양-용액계면에서의분포만을고려한이동성파악에중요한조건이된다. 온도는 25~30 의상온을유지하는것을기본으로하지만원하는조건을결정하여조절한다. 컬럼의넓이및길이는목적에따라조절할수있고 packing 된토양의표면에나노용액이골고루노출될수있도록 inlet의개수를늘리거나 showering 시스템을도입한다

121 제조나노물질안전성시험방법해설서 b. 침출시험나노입자가포함된용액을침출시킬때는원하는 Darcy velocity 를확보하기위해유속을조절한다. 유속을조절하기위해서는 peristaltic pump를이용하는것이적절하다. 침출하기위한나노용액을제조할시에물을포함한염의종류가다른버퍼를사용하여시료의물리적특징변화를관찰 ( 침전, 응집등 ) 한다. 매질조건에따라나노입자가침전할수있기때문에 magnetic 교반기를이용하여지속적으로교반한다. 또한온도에민감한분산성을지닌나노입자의경우항온장치를결합해온도를유지시켜준다 장치조건 Peristaltic pump를이용해 Darcy velocity 를조절할경우에컬럼장치는 air-sealing 되어있어야한다. 컬럼내에서공기가새어나올경우 Darcy velocity 가조절되지않고나노용액이토양을통과하지못하고침출되지않을수있다. 컬럼및장치구성에사용되는 tubing은나노입자가침착되지않는소재를사용해야한다. 폴리우레탄, 아크릴, 실리콘소재가적당하다. 컬럼내부는테플론코팅하여나노입자의침착을최소화한다. 2. 시험방법 2.1. 토양컬럼준비컬럼을준비할때먼저 glass wool을컬럼의밑부분, 즉 outlet 위에지지체로서적당한크기로잘라깔아준후토양을 packing 하여야한다. 압력을가하거나압착하는등의물리적인힘을가하지않고컬럼을흔들거나두드리며토양이 packing 되도록한다. 그후위에서설명한방법에따라 saturation 시키고용액에분산된나노입자가뭉치지않게교반또는온도를유지시킨다

122 2.2. 침출준비선정한 Darcy velocity 를 flow rate로산출하기위해서는먼저 packing 된토양의 porosity 를구하여야한다. Porosity를실험적으로계산하는방법은위의토양컬럼준비중 saturation 과정에서증류수를 outlet에서거꾸로투입시키며투입된증류수의부피를정량한다. 토양의윗표면에수면이드러날때까지투입시킨증류수의부피를컬럼의용적으로나누어주면 porosity 를산출할수있다. Peristaltic pump에 flow rate를설정할때에 inlet의개수만큼나누어준다. 예를들어 inlet 이 4개인경우 Darcy velocity 를통해구한 flow rate를 4로나누어침출을시작한다. 나노용액의농도는 10~100 mg/l 가적당하다. 침출이시작되면 tubing 이막힌부분이없는지나노입자가 tubing 내에서침착되는지반드시확인한다. 정상적으로 saturation 된토양은나노용액이노출됨과동시에, inlet 으로부터나노용액이투입됨과동시에침출이시작된다. Outlet 으로부터나오는침출수를일정한부피로지속적으로샘플링한다. 침출수는불규칙적으로떨어지기때문에항시준비하며일정부피가샘플링되었을때다음 fraction으로교체가될수있도록한다 온도제어온도조건을고려할경우준비한 medium과나노시료을함께항온장치에서미리온도를조절해둔다. 침출시험이진행되는동안온도를유지한다. 나노시료가조절할온도에대해불안정하다면제외한다. III. 시험결과및보고 1. 분석과정 일정부피별로샘플링한 fraction 에번호를매겨즉시분석한다. 분석은 ICP-AES,

123 제조나노물질안전성시험방법해설서 ICP-MS, UV/Vis 분광기등해당나노입자에적합한분석장비를선정하여분석한다. 예를들어은나노입자의경우 ICP-AES 또는 ICP-MS 가가능하고, TiO 2 의경우 UV/Vis spectrophotometer가가능하다. 해당분석장비의검출한계점 (Limit of detection, LOD) 과신뢰구간을정확히파악하고최적의분석장비를선정해야한다. 신뢰구간을벗어난고농도의샘플을분석해야하는경우에는희석하여분석을수행한다. 나노입자가분산성을잃고침전될경우데이터의신뢰도가떨어지기때문에반드시초음파를이용하거나물리적교반을통하여재분산후분석한다. 2. 분석시주의사항초기농도를분석할시에제조된시료용액의농도를즉시직접분석하지않는다. 왜냐하면튜빙에흡착되는나노입자가일부존재하고시료보관중에보관용기에흡착될가능성이있기때문이다. 컬럼침출을위한 pump를작동시킨뒤 inlet으로부터나오는나노용액을받아분석하는것이토양에노출되는정확한초기농도라고할수있다. Glass wool과토양 packing 작업을정교하게하지않거나 saturation하는과정에서지나치게빠른속도로증류수를 outlet으로부터주입할경우침출시험과정에서침출액에토양입자가섞여나올수있다. 이경우토양과나노입자의정확한분리가어렵고토양에흡착된나노입자도함께침출된농도에포함될수있기때문에주의해야한다. Peristaltic pump를이용해침출할경우설정한 flow rate가정확한지미리확인해야한다. 또한연동운동을유발해물리적인힘으로나노용액을이동시키기때문에 tubing의상태도확인해야한다. Tubing 이손상되거나탄력을잃고압착되어제대로작동하지않을경우정확한 flow rate를기대하기어렵다

124 < 컬럼침출시험흐름도 > IV. 분석실시사례 1. 대상물질 ABC Nanotech. AgNPs (<20 nm), citrate capping 된액상콜로이드물질

125 제조나노물질안전성시험방법해설서 2. 시험조건 DW, ph 5.5, ph 2, ph 11, 0.01 M NaCl, 1 mg/l humic acid 조건에해당시료를 100 ppm 분산, 컬럼침출시험을수행하였다. 컬럼조건은아래표와같고침출시험에사용된토양은 quartz sand, field soil 2종이다. < 침출시험조건 > 3. 분석결과 AgNPs에대한 breakthrough curve를얻은결과토양의특성에따라상이한침출특성을보이는것으로파악되었다. 대체로높은 ionic strength와낮은 ph 조건에노출되었을경우에는침출량이급격히감소하는경향을보였고, 높은 ph와낮은 ionic strength 조건에서는높은침출특성을유지하는것을확인할수있었다. 이는입자가특정조건내버퍼로노출되었을때분산안정성이토양컬럼내거동에있어서중요한역할을하는것으로판단된다. 분산안정성이떨어져서로엉겨있는응집 (agglomerate, aggregate) 된형상을취할경우토양에침착 (deposition) 및필터 (filter) 되는양이많아져이동성이떨어지기때문이다. 1 mg/l의 humic acid 조건에분산된은나노입자의경우증류수의경우보다높은이동성을나타내는것을확인할수있었다. C/C O 값이거의 1에가까워지고이는노출된거의모든은나노입자가침출된다는것을의미한다

126 <3 종의토양샘플에노출된은나노입자의 breakthrough curve> <3 종의토양샘플에노출된은나노입자의 attachment efficiency 와 maximum distance 의계산 >

127 제조나노물질안전성시험방법해설서 4. 의미파악 AgNPs의토양침출특성, 즉이동성은먼저 attachment efficiency로정량화가가능하다. 그리고산출된 attachment efficiency를바탕으로 maximum distance 를계산할수있다. 나노입자의 99.9% 가제거되는깊이인 maximum distance 는일반적으로콜로이드입자가이동할수있는깊이를의미한다고이해할수있다. 증류수, ionic strength, ph, NOMs 조건을조절해가며시험한결과높은 ionic strength, 낮은 ph 조건에서이동성이크게저하되는것을확인할수있었다. 특히 artificial rain 조건인 0.01M CaCl 2 에서는노출됨과동시에은나노입자가응집, 침전되면서전혀침출되지않았다. 반대로높은 ph, 낮은 ionic strength 조건에서는상대적으로높은침출성을보이는것을확인할수있다. 이는자연계의토양에의해형성되는 liquid/soild interface 주변의 ionic strength와 ph에의해이동성이큰영향을받는다는것을의미한다. 또한 1 mg/l의 humic acid 조건에서는눈에띠게이동성이증가하는것을확인할수있는데자연계의유기물이은나노입자의이동성을강화시키는결과를초래할수도있다고판단된다. <3 종의토양샘플에노출된은나노입자의각조건에서의 maximum distance>

128 < 침출된은나노입자의 hydrodynamic diameter 와 zeta potential>

129 제조나노물질안전성시험방법해설서 17. 나노입자에대한옥탄올 - 물분배계수시험 I. 개요 1. 목적본시험은나노입자의환경중거동을예측하기위해 n-옥탄올과물사이의분배정도를측정하는데목적이있다. 용기진탕법 (shaking method) 에의한측정범위는분배계수의대수치 (logp ow ) 가 -2에서 5 사이의물질에적용된다. 2. 정의옥탄올-물분배계수 (octanol-water partition coefficient, P ow ) (1) 분배계수 (P) 란서로섞이지않는두용매에녹아있는화학물질의평형농도비를말한다. n-옥탄올 / 물분배계수 (P ow ) 는수포화 n-옥탄올과 n-옥탄올포화수에서화학물질의평형농도비율로정의한다. 여기에서, C n-octanol = 수포화 n-옥탄올에서화학물질의농도 C water = n-옥탄올포화수에서화학물질의농도 (2) 분배계수는단위가없으며일반적으로 log 10의형태로표현한다. P ow 값은온도에따라달라지므로측정온도를함께표시한다. (3) 대체로나노물질에대해서해당분석을수행하지못할수도있다. 나노입자는선택적으로수계또는유기계로제조되며, 상당수의나노물질제조에계면활성제를사용하기때문에옥탄올층과물층사이인계면 (interface) 에입자들

130 이머무를수있다. 입자가얼마나수계에서분산이된만큼유기계 ( 옥탄올 ) 에서분산된정도를보여줌으로써지질이풍부한상에서세포벽이나지방조직 혹은생물계에서어떠한역할을하는지밝힐수있다. II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 장치및기구ㆍ항온조, 항온수조또는항온실 : 시험온도조절이가능한것ㆍ원심분리기 : 온도제어장치를갖추어시험온도조절이가능한것ㆍ진탕기 : 평형용기를수직으로 180도회전 ( 회전수 =20회 / 분 ) 가능한것ㆍ시험용기 : 유리, 불소수지또는테프론재질의마개달린원심분리용시험관또는플라스크 1.2. 용매의조제및시험물질용액의조제 수포화 n-옥탄올 (1) n-옥탄올의정제 n-옥탄올 (98% 이상 ) 에 0.1 N 황산을가하여진탕한후, 정치하여분리된황산층을제거한다. 계속해서 0.1 N 수산화나트륨용액을가하여진탕한후, 정치하여분리된수산화나트륨층을제거한다. 중성으로될때까지물을가하여반복한다. 무수황산마그네슘으로탈수하고, 감압증류장치를이용하여 2회증류한다. 증기압이유사한유기불순물에대해서는적절한방법으로제거한다

131 제조나노물질안전성시험방법해설서 정제된 n-옥탄올의순도는 99.9% 이상이어야한다. 순도 99.9% 이상의특급 n-옥탄올에대해서는정제하지않고사용할수있다. (2) 물과의혼합정제한 n-옥탄올을유리용기에넣고 n-옥탄올에물이포화될수있도록포화량이상의물을가하여 24시간이상서서히교반또는진탕한후두층이분리되도록충분한시간동안정치하고분리한다 n-옥탄올포화수 (1) 물의정제이온교환수또는증류수를유리제또는석영제의증류장치에서재증류하여정제한다. (2) n-옥탄올과의혼합정제한물을유리용기에넣고물에 n-옥탄올이포화될수있도록포화량이상의 n-옥탄올을가하여 24시간이상서서히교반또는진탕한후두층이분리되도록충분한시간동안정치하고분리한다 시료용액의조제 (1) 시료의순도가능한한순도가높은것을사용한다. (2) 시료용액의조제수포화 n-옥탄올에녹여 1~100 mg/ml 범위의농도로조제하여이를시험용저장원액으로하여냉장고에보관한다. 시료일정량을정밀히칭량하여시험농도를정확하게측정할수있어야한다

132 1.3. 나노물질준비 분말형고체나노물질고체형나노물질을수계및비수계의혼합상에교반하거나초음파분산기등을이용하여분산시킨다. 표면의성질을변화시키는안정제등의사용을통한분산은결과값을달라지게할수있으므로가급적사용하지않는다. 입자가침전되어튜브 ( 유리관 ) 바닥에가라앉게되면정확한분산을측정이어려우므로가능한안정적으로분산이잘되도록유지하여야한다 콜로이드형액체나노물질콜로이드나노입자가수계나비수계로선택적으로제조되었다면, 교반을실시하더라도둘중하나의계를선택하도록한다. 또한콜로이드제조시사용된분산제의친수성과소수성여부에따라서한쪽계로이동한다. 계면활성제를사용한물질일경우옥탄올과수층사이 ( 계면 ) 에입자가모이게되어양층에분산된농도측정에오차가심하게발생할수있다 시험조건시험온도는 20~25 의범위에서 ±1 를유지해야한다. 분배계수는유기물과나노입자의친화력을측정할수있는도구로, 환경에노출되었거나생체용버퍼 (buffer) 에노출되었다고간주하면서시험을수행한다. 분산이잘안되는시료는장기간교반하여분산후시험을실시한다. 물과옥탄올이포함된시험용액은 180 o 회전이가능한로터 (rotator) 로혼합하여골고루섞이게한다. 장시간혼합시나노입자의변화를초래할수있으므로시험시작및시료분석전에만각각 5분씩교반한다

133 제조나노물질안전성시험방법해설서 1.5. 장치조건 Rotator는 OECD TG 107을따라서 5분당 100회의속도로운전한다. 원심분리기로옥탄올층과물층의분리시에는시험온도를설정하여운전하고, 두층의완전분리가되는최소한의시간과속도로운전한다. 비수계에존재하는화학종의농도를직접분석하지못하므로, 초기농도에서수계내분산된농도와의편차로계산한다. 수층의농도는해리되어나오는이온과나노입자를구분하지않고 ICP-MS를이용하여총량을정량한다. 시료농도및유기용매의비율은다음의양을참고하여설정한다. (1) 분배계수의예비계산으로얻은분배계수의추정치 (2) 수층및 n-옥탄올층의분석에서분석방법의한계치이상의농도에해당하는시료의양 (3) 수층및 n-옥탄올층중시료의최대농도한계는 0.01 mol/l로할것 (4) 시험용기내에서차지하는용매의전체부피는용기의 90% 이상일것다음에서정하는유기용매양을사용하여각각의 log P ow 를구한다. (1) 초기에산정된용량비로용매를가한다. (2) 수포화 n-옥탄올의양을 (1) 의 2배로가한다. (3) 수포화 n-옥탄올의양을 (1) 의 배로가한다. 측정회수및허용편차 : 측정조건마다 2 회측정하여모두 6 회측정하며허용 편차는 ±0.3 log P ow 이내로한다. 2. 시험방법 2.1 원리 분배계수를결정하기위해서는시험계에작용하는모든요소사이에평형이

134 이루어져야하며두층에녹아있는물질의농도를결정해야한다. 분석하고자 하는평형농도를결정하기위해서는두층을충분히혼합하고정치시킨후두층이 완전히분리되었을때각층을취해야한다 시험용액준비각각의용액조건 (ph 2, 7.5, 9, PBS, HepG2 등 ) 을맞추어최종농도 10 mg/l 의나노용액을준비한다. 옥탄올과물서로에포화된용액을각각준비한다. 24시간동안교반한뒤충분한시간동안정치하여각층이완전히분리되도록한다 분배계수시험 (1) 시험용기에설정한양의시료원액을정확히취한다. (2) 이시험용기에수포화 n-옥탄올과 n-옥탄올포화수를정확하게가한다. (3) 시험온도를유지하면서진탕기를이용해서시험용기를 5분간진탕 ( 회전수 20회 / 분 ) 한다. 또한진탕기를이용하지않는경우에는시험용기를재빨리 180도회전 ( 회전수 20회 / 분 ) 시켜시험용기의공기가두층을통과하도록진탕한다. (4) 시험온도를유지하면서시험용기를두층의분리에필요한속도로 20분간원심분리한다. 원심분리시온도조절이불가능할경우에는시료채취전에원심분리관을시험온도에서 1시간이상방치한다. (5) n- 옥탄올층의중앙부로피펫의선단을넣어 n- 옥탄올층의약 용량에 해당하는 n- 옥탄올을취한다

135 제조나노물질안전성시험방법해설서 (6) 피펫의외벽을여지등으로닦고 n-옥탄올을다른용기로옮긴다. (7) 수층의시료채취는주사바늘이분리되는주사기를이용한다. 주사기의일부에공기를넣고, 주사바늘이옥탄올층을통과때공기가천천히나가면서수층에도달하도록한다. 적당량의시료를주사기에흡입한후신속하게주사바늘을분리시키고수층을다른용기로옮긴다. (8) 시료에가장적당한분석방법을선택하여 n-옥탄올층및수층중의시료를정량한다 수층의시험물질측정시주의사항완전한상분리가이루어진시험용액은아래층에는물이, 윗층에는옥탄올이 자리하게된다. 옥탄올층의중앙부로피펫의선단을넣어옥탄올층의약 용량에해당하는옥탄올을취한다. 수층의시료채취는주사바늘이분리되는주사기를이용한다. 주사기의일부에공기를넣고, 주사바늘이옥탄올층을통과할때공기가천천히나가면서수층에도달하도록한뒤수층의시료를채취한다. 이렇게채취한옥탄올층및수층의시료는 HPLC, ICP-MS등을이용하여정량한다. 나노의경우 ICP-MS를이용하여야하는데, ICP의경우유기용매가포함된시료는분석이불가능하다. 따라서옥탄올층의농도는총농도에서수층의농도를빼주어계산한다

136 III. 시험결과및보고 1. 결과의처리 분배계수는다음식으로산출한다. P = log P ow P ow : C o /C w C o : n-옥탄올중의시료농도 (mol/l) C w : 수층중의시료농도 (mol/l) 2. 시험결과의보고 결과보고서에는다음과같은사항을기재한다. 2.1 시험실시기관의명칭및소재지 2.2 시험책임자및담당자성명, 소속 2.3 시험개시일및종료일, 시험기간 2.4 시험물질 : (1) 나노물질의명칭 ( 일반명, 상품명등명기 ) (2) 입수처, 입수일 (3) 순도또는불순물 (4) 나노입자의표면처리, 분산용매

137 제조나노물질안전성시험방법해설서 2.5 시험결과 : (1) 시험물질의순도 (2) 시험온도 (3) 계산에의해구한분배계수치와계산방법 (4) 분석방법 (5) 옥탄올과물층에서의시료의농도 (6) 각시험조건에서의분배계수시험치, 평균치및전체평균치 (7) 분배계수평균치에대한표준편차 (8) log치로표시한시험물질의분배계수치 3. 분석시주의사항일반적으로수계로제조된콜로이드나노물질은분산계수값이크지않다. 물에분산이잘되지않는탄소계나노물질은 1~3주간의장시간혼합하여분산을유도하여시험한다. 계면활성제가처리되거나반응시간동안응집이발생된나노물질은옥탄올과수층사이인계면에집중될수있으며, 침전이발생되는시료는해당계수값계산시큰오차를가져올수있다. 따라서침전이안되며, 용액에분산이잘되는시료일경우만정확하고의미있는자료를얻을수있다. 주사기를이용하여수층의시료를채취할때에는많은주의가요구된다. 앞서언급하였듯공기를미리주입하고옥탄올층통과시빼주어옥탄올또는경계면의시험물질이포함되지않도록유의한다. 일부나노입자의경우가시광선영역의빛을흡수하기때문에실험시빛을차단하여수행하고, 반응동안에도빛에노출되지않도록갈색의반응기를이용하거나호일등을이용하여빛을차단한다

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139 제조나노물질안전성시험방법해설서 III. 나노물질의독성시험방법

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141 제조나노물질안전성시험방법해설서 1. 나노물질의지렁이급성독성시험 I. 개요 1. 목적본시험은토양을수송매체로하는육생생물의기초단계시험으로서토양을이용한지렁이의단기간노출을통하여나노물질의유해성을평가하는데목적이있다. (1) 시험용지렁이로사용한다. (2) 본시험법의적용대상은나노물질이포함되어있는토양이다. (3) 본시험법에는 여과지를이용한독성시험 과 인공토양을이용한독성시험 을수록하였다. 전자는나노물질의독성스크리닝을위한시험이며, 후자는나노물질의유해성심사, 위해성평가등평가를목적으로한독성값을얻고자할때사용한다. 2. 정의 2.1 반수치사농도 (LC 50 ) 시험생물의 50% 를사망하게할것으로추정되는시험물질의농도를말하며, 표기시에는시험기간을함께명기한다 ( 예 : 14d-LC 50 ) 2.2 양성대조물질 시험에사용하는생물이일정하게화학물질에반응하는지여부를확인할때

142 사용하며, 주로염화아세트아미드 (CH 2 ClCONH 2 ) 를사용한다. 2.3 농도단위 농도는토양건조중량에대한시험물질의무게 ( 예 : mg/kg) 로표기한다. II. 시험 1. 시험의준비 1.1 장치및기구 시험용기 : 화학적으로불활성인용기로나노물질이흡착되는것을방지하기위한재질 ( 예 : 유리, 테플론 ) 의것을사용하며, 실험에따라적절한용량을선택한다 온도제어가능한배양장치 : 20±2 의온도범위에서설정한온도가 ±2 이내로유지되며, 400~800 룩스 (Lux) 수준의조도조정이가능한배양기또는실험실을준비한다 ph 측정기 수분측정기 소형교반기 여과지 : 80~85 g/m 2, 두께약 0.2 mm 규격으로중급이상의재질의것을사용한다

143 제조나노물질안전성시험방법해설서 소형바이알 : 납작한바닥의기둥 ( 원 ) 형의것을사용하며최소높이 8 cm, 지름 3 cm 가량되는것을사용한다 유리메스실린더 ( 예 : 1000 ml) 굵은유리막대 1.2 인공토양의준비줄지렁이가생육하기에적합하고나노물질과잘혼화될수있도록다음의비율로된토양을사용하여인공토양을만들어사용한다 풍건시킨물이끼토탄 (Sphagnum peat) : 10% ( 건중량, ph 5.5~6.0의범위를나타내며, 잔류식물이존재하지않도록한다. 또한전처리를거쳐분말로준비한다.) 카올리나이트가 30% 이상포함되어있는카올리점토 : 20% 석영모래 : 70% ( 잔모래인경우 50~200 μm의입자경인것이 50% 이상함유할것 ) 탄산칼슘 : 0.3~1% ( 인공토양이 ph 6.0±0.5 범위를유지하도록탄산칼슘을사용하여조절한다.) 위의건조성분을정확한비율로혼화하여대형실험용교반기또는소형전기시멘트교반기로완전히혼합한다. 소량의시료를 105 에서건조하여재칭량하고수분함량을측정한다. 전체의수분함량이건조중량의약 35% 가되도록이온교환수를가해완전히혼합한다. 제조한인공토양에압력을가해도물이나와서는안된다. 실제시험에사용하는인공토양은

144 상기조건을만족하도록제조하여사용하면된다. 1.3 여과지의준비독성스크리닝등을목적으로인공토양대신에여과지를사용하여독성시험을할수있다 여과지를이용한시험은실험법이간단하여토양시험전의예비시험을하기에적당하다 여과지를바이알의바닥크기로잘라바이알안바닥에깔아준다. 1.4 시험용지렁이권장하는시험종은 Eisenia foetida (Michaelsen) 이다. 이종은유기물이풍부한토양에살며, 화학물질에대한감수성은실제토양에살고있는종과비슷한것으로보고되어있다. 3~4주안에부화하고 20 조건에서 7~8주정도사육되면성숙된다. 성숙한지렁이는 1주일에 2~5개의난포 (cocoon) 를낳고각난포에서수마리의지렁이가태어난다. 이지렁이는시중에서시판되며손쉽게구할수있으나, 시험에사용할것은가급적전문사육장에서보급받아, 그계통이유지되도록한다. Eisenia foetida에는두아종있으며 E. foetida foetida는환절부위에특징적인선 (stripping) 모양이있으나, E. foetida andrei는선모양이없고붉은색을띤얼룩무늬가있다. OECD, ISO 등국제기관에서는가능한 E. foetida foetida를사용하도록권고하고있으나, 자국내서식여부를확인하여시험종을선정하는것이좋다. 시험에사용하는지렁이는다음조건을만족해야한다. (1) 지렁이는생후 2개월이상된성숙한것으로체중이 300~600 mg이되어야한다. (2) 시험개시전 1일이상인공토양에서사육하되먹이는주지않는다. 여과지로

145 제조나노물질안전성시험방법해설서 시험을할경우, 시험전 3 시간동안증류수로적신여과지에지렁이를 두어장내잔존물을배출시킨후, 지렁이를세척후물기를말려시험에 사용한다. 2. 시험방법 2.1 원리시험조건하에서여러농도의시험물질에일정기간지렁이를노출하여그사망수를측정하여반수치사농도를산출하며, 그외의독성영향도관찰한다. 인공토양을이용한시험이주로사용되며여과지를이용한시험은나노물질의독성을스크리닝하는데적용할수있다. 시험물질의적당한농도범위를설정하기위해농도설정시험을실시하고그결과에기초하여농도단계를설정하여본시험을한다. 2.2 농도설정시험 인공토양을이용한독성시험 농도설정시험을위한시험물질의농도는 1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01 mg/kg을기본으로하여단계적으로정한다 시험용지렁이는 1개의시험용기에 10마리를사용한다 각농도당처리군및대조군마다 1개의시험용기를사용한다 인공토양과나노분산용액을합하여묽은죽상태 (watery condition) 로만들어야되기때문에, 1 L의비커안의토양 750 g에 600 ml의나노분산용액이들어가도록계산하여각농도의나노분산용액을만든다 ph는조정하지않고시험을한다

146 묽은죽상태의토양을건조중량의 35%(w/w) 수분함량이될때까지건조를시켜야한다. 건조시작 3일째되는날에인공토양을꺼내어섞어준후, 다시 2~3일동안건조한다. 무게를측정하여 35% 수분함량이될때까지매일무게를확인한다. 35% 보다낮은수분함량을가진비커의토양은부족한무게만큼이온교환수를보충하여 35% 수분함량을맞춰준다. 이수분함량이맞춰지면인공토양에압력을가해도물이나와서는안된다 시험용기마다습중량 750 g의시험토양 ( 나노물질 + 인공토양 ) 을유리용기에넣고, 인공토양에 1일이상순화시킨지렁이를빠른속도로증류수에씻은후시험농도당 10마리지렁이를토양표면에놓는다. 주변토양으로지렁이를살짝덥고파라필름으로시험용기를밀봉한후에몇개의구멍을뚫어통기성을갖도록한다 ±2 범위로온도를설정하고, 각처리군및대조군의온도를설정온도의 ±2 이내로유지한다 조명은시험기간중점등한다 노출실험종료후 Φ150 mm 크기이상의유리재질의페트리디쉬 3개를준비하여 1 L 비커안에있는토양을모두꺼내어페트리디쉬에옮긴후줄지렁이에스트레스를가하지않도록토양을꺼내어시험용지렁이를찾는다 그밖에노출기간및관찰방법은본시험의방법과동일하게한다 여과지를이용한독성시험 여과지가깔려있는각각의바이알에농도별로 1 ml의시험용액을첨가한다. 시험용액의 ph는사전에측정해기록한다 대조군의경우 1 ml의증류수를첨가하거나보조제를일정량첨가한다

147 제조나노물질안전성시험방법해설서 바이알을수평으로천천히회전시키면서시험용액이첨가된여과지를건조시킨다 바이알내의여과지가건조된후, 1 ml의증류수를첨가하여적신다 ~1.0 mg/cm 2 의범위에서농도를선택하여지렁이를투입 (1 개체 /1바이알) 하여농도설정시험을한다. 반복구의유무또는그수는적절히판단하여정한다 각각의바이알은캡또는플라스틱필름을이용하여밀봉한다 그밖에노출기간및관찰방법은본시험에서의방법과동일하게한다. 2.3 본시험 인공토양을이용한독성시험 농도설정시험결과, 즉 3, 7, 14일간대부분의지렁이가생존한최고농도및 3, 7, 14일간대부분의지렁이가사망한최저농도를고려하여 5개이상의농도를대수등간격으로설정한다 각시험농도군및대조군마다 4개이상의반복구를둔다. 시험기간은 3, 7, 14일로한다 시험지렁이의생사및그상태 ( 토양내이동상태, 건드릴때의반응, 채색등 ) 를시험개시후 3, 7, 14일째에관찰하여기록한다. 시험지렁이의머리부분에기계적자극을주어도반응이없을때를사망으로간주한다. 사망한지렁이는즉시제거한다 시험개시전과시험종료후에시험농도군및대조군의토양의 ph와수분을측정한다 시험개시및시험종료시생존한지렁이의체중을측정한다

148 기타사항은농도설정시험과동일한방법으로한다 여과지를이용한독성시험 농도설정시험결과를바탕으로 5개이상의농도를대수등간격으로정한다 농도당 10 반복구이상을두며, 20 반복구까지둘수있다 한바이알에 1개체이상을넘지않도록한다 시험기간은 48시간이며, 필요한경우 72시간까지연장할수있다 시험기간동안 20±2 범위로온도를설정하고, 각처리군및대조군의온도를설정온도의 ±2 이내로유지한다 시험은조명을두지않고어둠속에서진행한다 시험지렁이의머리부분에기계적자극을주어도반응이없을때를사망으로간주한다 기타사항은농도설정시험과동일한방법으로한다. 2.4 시험상의유의사항 대조군의사망률은시험종료시 10% 를넘지않아야한다. III. 시험결과및보고 1. 결과의처리

149 제조나노물질안전성시험방법해설서 본시험종료후사용한지렁이의사망률 ( 시험물질농도당 ) 을계산하여얻은값을 적당한통계적방법 (pribit 법등 ) 을이용하여반수치사농도 (LC 50 ) 와이의 95% 신 뢰한계를산출한다. 2. 시험결과의보고 시험결과를보고할때는아래의내용이포함되어야한다. 2.1 시험실시기관의명칭및소재지 2.2 시험책임자및담당자성명, 소속 2.3 시험물질 : (1) 화학물질의명칭 ( 일반명, 상품명등명기 ) (2) 구조식 ( 시성식, 분자식명기 ) (3) 입수경위, 제조년월일 (4) 순도또는불순물 (5) 물에대한용해도 (6) 휘발성또는증기압 (7) 기타물성에관한자료 2.4 시험지렁이 : (1) 시험용지렁이의종명, 계통및입수경위 (2) 적응결과, 사육방법 ( 먹이종류, 섭식량, 급식빈도등 ) (3) 평균길이, 평균체중 2.5 시험조건 : (1) 시험개시일, 시험종료일및시험기간 (2) 시험온도, 조도및광원의종류

150 (3) 바이알의규격및재질 (4) 여과지의규격, 재질 (5) 인공토양의성상 ( 공급원또는강열감량, 유기탄소, 총질소, 등 ) (6) 시험토양의상태, 보관방법, 인공토양에대한시험물질첨가방법 (7) 시험용기당시험토양의양, 시험지렁이수 (8) 시험농도군설정근거및각시험농도군시험물질의농도 ( 설정치및실측치 ) (9) 시험용액의 ph 2.6 시험결과 : (1) 각시험농도군및대조군의각관찰기간에있어서의사망개체수와누적사망률 (2) 시험기간중의각시험농도군및대조군의 ph, 수분의측정치 ( 인공토양시험의경우 ) (3) 시험개시및종료시생존한지렁이의체중 (4) 시험종료시농도-사망곡선그래프 (5) 각관측시의 LC 50 치와그산출방법및 95% 신뢰구간 (6) 사망률 0% 의최고농도및사망률 100% 의최저농도 (7) 기타관찰된영향및그영향이인정된농도

151 제조나노물질안전성시험방법해설서 2. 나노물질의육생식물생장시험 I. 개요 1. 목적이시험은토양에 1회처리한고형또는액상의시험물질에의한식물의발아및초기성장영향을평가하는데목적이있다. (1) 많은육생식물에대해적용된다. (2) 본시험법의적용대상은침전이잘일어나는나노물질을대상으로확대적용할수있다. 2. 정의 2.1 반수영향농도 (Median Effective Concentrations, EC 50 ) 시험생물의생장변화가대조군의생장에비해 50% 가되는시험물질의농도이다. 2.2 무영향농도 (No Observed Effective Concentration, NOEC) 노출되었을때생물에부작용이발생하지않는것으로예측되는농도 II. 시험 1. 시험의준비

152 1.1 장치및기구 온실, 식물생장상, 식물배양상자와같은적절한설비 식물용기 : 구멍이없는플라스틱또는유리재질의것을사용한다. 1.2 토양무균토양을사용할필요는없다. 토양은굵은파편을제거하기위해체 (0.5 cm) 로쳐야한다. 탄소함량은 1.5% ( 유기물로서 3 %) 를넘어서는안된다. 세립자 (20 μm이하 ) 함유율은 10~20% 범위여야한다. 시험물질을토양전체에균일하게분산할수있다면어떤방법을사용하더라도관계없다. 계면활성제는사용하지않도록한다. OECD 인공토양을사용할수있다. 1.3 시험식물 시험에는다음의 3 부문중적어도하나씩선택하여최저 3 종을사용하여야 한다. 시험종선택에있어이론적근거가정당화되면다른종을사용해도좋다. 호밀풀벼귀리밀옥수수겨자서양유채무우순무우중국배추 부문 ryegrass rice oat wheat sorghum mustard rape radish turnip chinense cabbage 시험종 Lolium perenne Oryza sativa Avena sativa Triticum aestivum Sorghum bicolor Brassica alba Brassica napus Raphanus sativus Brassica rapa Brassica campestris var.chinensis

153 제조나노물질안전성시험방법해설서 살갈퀴녹두붉은토끼풀호로파레타스 ( 양상치 ) 갓 부문 vetch mung bean red clover fenugreek lettuce cress 시험종 Vicia sativa Phaseolus aureus Trifolium pratense Trifolium ornithopodioides Lactuca sativa Lepidium sativum 2. 시험방법 2.1 원리 여러농도의나노물질을혼입한매질에종자를심는다. 발아한싹의수를기록하고대조군싹이 50% 가발아하고나서적어도 2주후에식물을잘라중량을측정한다. 생장률을산정하기위하여매체로부터식물체를분리하여뿌리와줄기의길이를 1 mm 단위로측정한다. 2.2 시험 온도, 습도, 광조건은시험기간중각식물중의정상생육유지에적절하여야한다 무작위로블럭을나눠 1개의대조군과 3개의농도군으로시험한다. 시험물질을토양에혼입하고 24시간내에각군당적어도 5개의종자를뿌린다. 각시험에사용하는종자는동일한크기여야하며종자를물을담가팽윤 (swelling) 화시켜서는안된다. 시험물질은다음의방법으로토양에혼입한다. (1) 나노입자와슬러리상태의토양은반죽기를이용하여골고루혼합한다. (2) 24시간동안동결건조한다

154 (3) 건조된토양 70 g을유리광구병 (ID= m, volume= L) 으로옮겨수분함량 40% 로조정한다 처리농도는건조토양 1 kg에대해시험물질을 0.0( 대조군 ), 100, 300, 500, 1000, 2000 mg으로한다 종자는 5% 차아염소산나트륨 (NaOCl) 으로 5~10분간소독후증류수로수차례세척한다 세척한종자를토양에심어 25±1 의지속적인광조건하에서진행한다 시험에사용하는포트나용기는선택한종의생장을억제하지않도록충분히클필요가있다 필요에따라식물에물을주며시험은대조군의싹이 50% 발아할때부터 14일후에종료한다. 2.3 시험상의유의사항 대조군의최저 80% 의종자가정상적으로싹이발아하여야한다 대조군의싹은시험기간동안정상적으로생장해야한다 나노물질이매체내에서균질분포되어야한다. III. 시험결과및보고 1. 결과의처리 군당발아한식물의수를기록하고, 1 군당평균중량을측정 ( 수확직후의습중량

155 제조나노물질안전성시험방법해설서 또는 70 에서건조한후의건중량 ) 하여식물당평균중량을표기한다. 시험물질의 발아에대한영향을 LC 50 로나타내고생장에대한영향은 EC 50 으로표시한다. 2. 시험결과의보고 2.1 시험실시기관의명칭및소재지 2.2 시험책임자및담당자성명, 소속 2.3 시험물질 : (1) 화학물질의명칭 ( 일반명, 상품명등명기 ) (2) 구조식 ( 시성식, 분자식명기 ) (3) 입수경위, 제조년월일 (4) 순도또는불순물 (5) 물에대한용해도 (6) 휘발성또는증기압 (7) 기타물성에관한자료 2.4 시험생물 : (1) 시험에사용한식물의종 / 아종명 (2) 종자의입수경위 (3) 종자의중량과발아능력 2.5 시험조건 : (1) 시험개시일, 시험종료일및시험기간 (2) 포트나용기의크기및토양의양 (3) 나노물질의토양혼입방법

156 (4) 생장조건 ( 조도, 광주기, 주야의온도, 산수기록 ) (5) 시험설비의타입 ( 화이트트론, 온실, 육성상자 ) (6) 토양의성질 (ph, 유기물함량, 20 μm 이하의입자비율, 멸균여부 ) 2.6 시험결과 : (1) 농도-영향상관관계그래프로표기 (2) 발아에대한 LC 50 치 (3) 생장에대한 EC 50 치 (4) 시험종료후대조군및시험군의사진등 (5) 시험지침에이탈한사항

157 제조나노물질안전성시험방법해설서 3. 나노물질 90 일반복흡입독성시험 I. 개요 1. 목적이시험은나노물질의 90일반복흡입노출에의해서나타날수있는건강장해를평가하는데그목적이있다. 이시험방법은나노물질의위해성평가에필요한최대무영향농도값을설정하는데이용된다. 2. 정의 2.1 무영향관찰농도 (No Observed Adverse Effect Level, NOAEL) 시험동물에나노물질을여러농도로반복노출시켰을때시험물질의유해한영향이관찰되지않는최대농도 2.5 단위 NOAEL의단위는공기의표준부피당나노물질물질의무게 (mg/m 3 등 ) 로표현한다. 나노물질의특성에따라공기의표준부피당나노입자의수또는표면적등적절한단위를사용할수있다. II. 시험 1. 시험의준비

158 1.1 예비사항건강하고성숙한동물을골라시험전에적어도 5일간시험환경에순화시킨후시험시작전에무작위로나눈다. 챔버내공기중의나노물질농도를조정하기위하여필요한경우적당한용매를가해도좋다. 1.2 장치 9% 의산소농도와균일하게분포되는노출환경을확보하며시간당 12~15회의환기가유지되도록고안된적절한흡입장치에서시험한다. 이산화탄소농도는 1% 를초과해서는안된다. 쳄버내를약간음압으로유지시켜시험물질이누출되지않도록한다. 쳄버내시험동물의밀집을최소한으로하고나노물질의노출은최대한으로되도록시험조건을고려하여야한다. 쳄버내환경의안정성을유지하기위해사용동물의총용적을쳄버용적의 5% 이내로한다. 흡입노출이외의다른방법으로는두부노출, 전신개별쳄버노출법등이있다. 흡입챔버는적절한농도분석장치를부착시킨흡입장치를사용해야한다. 장치내전체의조건이본질적으로동일하게유지되도록공기의유량을조정해야한다. 1.3 나노물질노출기간동안같은롯트 (Lot) 의나노물질을사용하여야한다. 나노물질의보관은시험물질의순도, 균질성, 안정성이유지되는조건에서보관하여야한다. 시험전에나노물질의물리화학적특성, 순도, 오염물질, 불순물등에대한정보를확인하여야한다. 1.4 시험동물 동물종의선택

159 제조나노물질안전성시험방법해설서 여러종류의포유동물을사용할수있으며바람직한종은랫드이다. 실험실에서일반적으로사용되는계통을사용하도록한다. 시험에사용하는동물개체간또는군간의체중변동은평균체중의 ±20% 를초과하지않아야하며 7~9주령의랫드가적절하다 동물수및성별각용량군마다적어도 10마리를사용한다. 암컷은출산의경험이없거나임신하지않은동물을사용해야한다 사육및급이조건동물실의온도는 22±3, 상대습도는 30~70% 가유지되어야한다. 인공조명으로할경우매 12시간간격으로점멸한다. 사료는일반적으로널리쓰는것을사용하며, 음료수는자유로이섭취시킨다. 동물은성별군으로사육해야하며, 케이지당동물수는개개의동물을충분하게관찰할수있는범위로한다. 1.5 시험조건 한계시험급성흡입독성시험처럼한계농도에대해정해진것은없다. 그러나최대시험농도는 1흡입장치내에서시험가능한최대농도 2인체노출시나리오를고려할때최악의경우에해당하는농도 3흡입챔버내에서충분한산소농도를유지하는데필요한조건 4동물복지관련사항등을고려하여결정하여야한다. 기존의정보가없을때에는급성흡입독성시험에서제시된한계농도를적용할수있다. 나노물질의경우에어로졸의한계농도인 5 mg/l를적용하는것이고려된다. 한계농도이상을시험할경우그사유에대한명확한근거나논리를제시하도록한다. 최고농도는수명에영향을미치지않는범위또는견딜수없는스트레스를주지않는범위에서시

160 험동물에명확한독성을나타내는농도라야한다 예비시험본시험전에적절한노출농도의범위를선정하기위한예비시험이필요하다. 예비시험에서의농도설정과정을통해본시험의분석방법, 입자의크기, 독성기전, 임상병리및조직병리, NOAEL추정등에필요한기술적인정보를얻을수있다. 예비시험은하나또는하나이상의농도단계를둘수있으며독성종말점에농도별로따라 3~6마리의암수군을둘수있다. 투여기간은최소 5일에서최장 28일로한다. 최종보고서에는본시험에서사용한시험농도를기술하여야한다. 최소농도는 NOAEL값을포함하고최고농도는사망이나견딜수없는스트레스를유발하지않는수준에서명확한독성을발현하는농도가포함되도록하는것이가장이상적이다. 2. 시험방법 2.1 원리몇개의군으로나눈시험동물에 1군 1농도로나노물질을일정기간노출하는데, 이때노출환경중에서의적절하나농도를유지하기위하여용매를사용하는경우에는용매노출군을설정해야한다. 그후시험물질에의한영향및사망여부에대한관찰을하며, 시험중에사망한동물은부검하고시험종료시까지생존한동물은도살하여부검한다. 2.2 나노물질투여나노물질은보통 3개농도로투여하며필요시음성대조군및 / 또는용매대조군을둔다. 각시험군은보통암수각각 10마리를사용하며 1일 6시간주당 5 일간으로총 13주간 (90일반복 ) 투여한다. ( 나노물질을의약품용으로시험하고

161 제조나노물질안전성시험방법해설서 자할경우는주당 7일을투여한다 ). 노출기간을하루 6시간이내로하거나, 22 시간이상으로투여할필요가있을경우그타당한논리를기술한다. ㆍ최고농도 : 독성영향을나타내는농도 ( 사망을유발하지않는농도 ) ㆍ중간농도 : 저농도와최고농도의중간정도의반응을나타내는농도ㆍ저농도 : 독성영향이거의나타나지않거나없는농도 2.3. 노출조건측정항목다음의사항에관하여측정또는모니터링을행한다 공기의유량 ( 연속적이바람직함 ) 나노물질의농도시험물질의투여농도 (nominal concentration) 과실제농도 (actual concentration) 로구분한다. 농도는투입한나노물질의질량을흡입챔버를통과하는공기의총량으로나눈노출농도값으로서시험동물의독성을평가하는데사용하기보다는실제농도와의차이를비교함으로써챔버의효율성등을비교하는데사용한다. 실제농도는동물의호흡구역내에서측정하며, 노출중의농도변동은가능한일정하게해야한다. 최소하루 3 회이상측정하여야한다 나노물질의입경분포발생장치의작동에있어서는나노입자크기의분석을실시해야한다. 노출중입도분포의항상성을측정하고자필요에따라반복분석한다 온도와습도는연속적인측정이바람직하다

162 2.4 관찰사항 임상증상관찰노출전, 노출중및노출후시험동물을관찰하여야한다. 노출과정중동물의반응에따라더자주관찰할필요가있는경우는그렇게한다. 노출중동물을자세히관찰할수없을때에는노출후에하며, 다음날의노출이시작되기전에반드시시험동물을관찰하여독성반응이회복되는지, 더악화되는지등을평가하여야한다. 동물을인도적목적으로치사시켜야하거나사망한동물이발견된경우, 사망시간을가능한정확히기록한다. 사망동물은발견한즉시부검또는냉장보존하며, 쇠약또는빈사상태의동물은격리또는도살등적절히처치한다. 관찰은특별히제한하지않으나아래항목을포함해야한다. 피부, 눈, 점막, 호흡계, 순환계, 자율신경및중추신경계, 전신운동과행동패턴의변화, 진전, 경련, 유연, 설사, 졸림, 수면및혼수의관찰에는특히주의해야한다 체중동물의체중은개별적으로측정한다. 첫노출이시작되기직전에우선측정하며그후에는주당 2회씩측정한다. 인도적차원에서치사시키거나사망시에도측정하며, 4주동안대조군에비해체중의변화가없으면나머지시험기간동안은주당 1회측정한다. 시험종료시에는치사후바로측정한다 사료섭취량및음용수소비량사료섭취량과음용수소비량은주당 1회측정한다 임상병리나노물질노출후대조군을포함하여모든동물에대해임상병리검사를

163 제조나노물질안전성시험방법해설서 수행한다. 노출종료시간과혈액채취시간의간격이얼마나되는지기록되어야하며특히, 혈액시료가시간경과에따라민감한경우 ( 예, COHb, CHE, MetHb 등 ) 은시료의변화에주의하여야한다. 적혈구수, 망상적혈구수, 헤모글로빈, 헤마토크릿트, 백혈구수, 백혈구백분율, 혈소판등혈액학적검사를수행한다. 총단백, 알부민 / 글로부린비율, 혈당, 트리글리세라이드, 인지질, 총콜레스테롤, 뇨소질소, 크레아티닌, 뇨산, Na, K, Cl, P, AST, ALT, LDH, ALP, creatininphosphokinase, r-gtp, 오르니틴디카복시라제등혈청학적검사를수행한다. 필요시뇨의외관, 뇨량, 삼투압, ph, 총단백질, 뇨당, 잠혈등뇨검사를실시한다. 필요시나노물질의독성학적특성에따라독성지표에대한추가검사를수행한다 ( 예, 콜린에스터라제, 지질, 호르몬, 산 / 염기평형, 트로포닌등 ) 나노물질이폐포등하기도에침착될우려가있는경우, 폐삼출물 (Bronchoalvderolar lavage, BAL) 에대한검사가필요하며, BAL fluid (BALF) 분석에는총백혈구수, 백혈구분율, 총단백질, LDH 등을비롯하여염증성사이토카인등이포함된다 안검사검안경을이용하여안저, 굴절매체, 홍채및결막망등에대한검사를나노물질노출전과노출후에대조군과고농도투여군의모든동물에대해실시한다. 이상이발견될경우, 다른농도투여군에대해서도실시한다 일반병리및장기중량모든시험동물에대해육안적관찰과부검을실시하며간, 신장, 폐. 심장, 비장, 뇌, 고환, 난소, 흉선, 갑상선, 자궁등주요장기에대해장기중

164 량을측정한다. 비인두도 (nasopharyngeal duct) 를포함한 4 단계의비인두조직 (nasopharyngeal tissue) 에대한검사가필요하며 3단계의후두조직에대한검사가필요하다. 아울러 2단계의기관지에대한검사가필요하다. 각장기에대한조직병리학적관찰을위해 10% 중성포르말린등에장기일부를고정한다 조직병리대조군과고농도군의시험동물의일반병리에서언급된주요장기에대한조직병리학적검사를실시한다. 특히, 폐조직에대해서는상세한조직병리학적관찰이필요하다. III. 시험결과및보고 1. 결과의처리개별동물에대한체중, 사료섭취량, 임상병리, 일반병리, 장기중량, 조직병리등에대한정보가기술되어야한다. 임상병리결과는테이블로정리하여제시한다. 시험에사용한동물수, 독성반응을나타내는동물수, 독성반응, 사망수 ( 윤리적목적으로치사시킨경우도표시 ), 사망시간, 독성반응의경과및회복상태, 부검결과등을표로정리한다. 2. 시험결과의보고시험보고는다음의항목을포함해야한다. 2.1 시험동물관리동물사육관련 ; 케이지당동물수, 깔짚상태, 온도및상대습도, 광주기, 사료,

165 제조나노물질안전성시험방법해설서 종 / 계통, 랫드이외의시험동물인경우선정근거, 구입처, 동물수, 절식조건, 동물군분리방법, 검역, 질병이력등 2.2 나노물질의물리화학적특성및용매 ㆍ제조방법 ( 구입처 ), 물리적상태, 순도, 재료, 입경분포, 표면전하, 표면화학등 ㆍ사용한용매및선정근거, 용매에서나노물질의물성변화여부등 2.3 흡입장치 디자인, 형태, 크기, 공기원, 유량, 유속, 나노입자발생계, 환경공기조정의방 법, 배기의처리, 온도, 습도, 에어로졸입자의농도와크기를측정하는장치등 2.4 노출데이터ㆍ농도설정에관한논리적근거 ( 농도단위는 mg/l, mg/m 3 등질량단위로표기 ) ㆍ이론농도 ( 흡입장치내에투여된시험물질의총량을공기량으로나눈값 ) ㆍ호흡구역에서의실측농도ㆍ입경분포, 중앙값, 편차, ( 중앙치경분포 ) 2.5 결과 ㆍ챔버내온도, 흡도, 유속관련사항 ㆍ챔버내이론농도와실제농도

166 ㆍ나노입자의입경분포, 중앙값, 편차등에대한사항ㆍ독성반응및해당나노입자의농도ㆍ동물의개별체중ㆍ사료섭취량ㆍ임상병리데이터ㆍ부검및조직병리분석결과 2.6 해석ㆍ본시험에사용한방법이시험지침에부합한지의여부 ( 예, 한계농도 ) ㆍ노출과정중나노입자의입경이기준에적합하지않을경우흡입성입자로서의적정성등에관한해석ㆍ이론농도와실제농도측정에사용한방법이일관성, 두농도의관계성ㆍ추정사망원인, 주요독성작용양식ㆍ통증또는심각한스트레스등을이유로인도적차원에서동물을희생시킨경우그관련사항에대해기술ㆍ독성목표장기ㆍ무영향관찰농도 (NOAEL) 또는영향관찰최소농도 (LOAEL)

167 제조나노물질안전성시험방법해설서 4. 나노물질의독성동태시험 I. 개요 1. 목적이시험은나노물질의흡수, 분포, 배설및대사에관한독성동태학 (Toxicokinetics) 적연구로부터얻은정보를토대로나노물질의독성을평가하고해석하는것을목적으로한다. 2. 정의 2.1 나노물질독성동태학 (Toxicokinetics) 나노물질의흡수, 분포, 배설및대사에관한연구 2.2 흡수 (Absorption) 투여한나노물질이체내에들어오는과정 2.3 분포 (Distribution) 흡수된나노물질및그대사체가체내에서순환하고분산하는과정 2.4 대사 (Metabolims) 투여나노물질이효소및비효소반응을통해체내에서구조적으로변화하는과정

168 2.5 축적 (Accumulation) 시간경과에따라조직내나노물질의양이증가되는되는과정 2.6 배설 (Excretion) 나노물질및그대사체가체외로제거되는과정 2.7 담즙배설 (Biliary ecretion) 담관을통해나노물질이배설되는과정 2.8 생체이용율 ( 흡수율, Bioavailability) 투여나노물질의양에대해전신순환또는생리작용부위에이르는나노물질의 양의비율 2.9 최고농도 (Cmax) 나노물질투여후혈중 ( 혈청 / 혈장 ) 에서의최고농도또는뇨중으로배설되는 최고농도 2.10 청소율 (Clearance rate) 혈액 ( 혈청 / 혈장 ) 또는조직으로부터시간당제거되는나노물질의측정량

169 제조나노물질안전성시험방법해설서 2.11 반감기 (Half-life, t 1/2 ) 체내또는혈액 ( 혈청 / 혈장 ) 중에서해당나노물질의농도가반으로감소하는데 걸리는시간 2.12 Tmax Cmax 에이르는데필요한시간 2.13 AUC 시간경과에따른나노물질의혈중 ( 혈청 / 혈장 ) 농도를그래프로나타낸후그곡 선아래의면적을계산한값. 일정기간동안체내흡수된나노물질의총량을나타냄 II. 시험 1. 시험의준비 1.1. 시험동물 일반사항건강한동물성체를시험전 5일이상시험조건에서순화시킨다. 시험에사용되는동물은무작위로선정한다. 미성숙개체또는임신한개체를사용할경우에는시험의목적과특별한사유를제시하여야한다 시험동물의정보시험에사용할동물정보로서종및계통, 생산자및공급원, 선정사유,

170 성별, 동물수, 주령, 투여시체중범위, 잔여동물의처리방법등을확보하고상세히기록한다 순화입수후 5 일간시험을실시하는동물실에서순화시키고, 매일 1회이상일반증상을관찰한다 개체식별개체식별은순화기간에는적색, 투여및관찰기간에는흑색매직을이용한미부표시법을사용하고, 개체별로다른색상의개체식별카드를부착하며, 사육상자대에는고유번호를부착한다. 사육실입구에는동물실사용기록지를부착한다 동물윤리시험동물사육관리를담당하는기관은해당기관의동물윤리위원회에시험계획을제출하고승인받아야한다. 1.2 사육환경 환경조건및측정동물은온도 23±3, 상대습도 55±15%, 환기횟수 10~20 회 /hr, 조명시간 12 시간 ( 오전 8시점등-오후 8시소등 ) 및조도 150~300 Lux로유지되는사육실에서사육되어야한다. 온도와상대습도는매시간컴퓨터시스템을이용하여측정하고, 환기횟수및조도는정기적으로측정한다. 실험기간동안동물실의온도는 21.5~22.4, 상대습도는 58.0~60.9% 범위이어야하며매일기록하고시험결과에영향을줄만한이상은없는지확인한다 사료및물오염물질검사

171 제조나노물질안전성시험방법해설서 사료는단백질등영양소가충분한멸균사료를구입하여자유롭게섭취하도록한다. 사료성분분석성적서를검토하여사료조성및오염물질등에서시험에악영향을줄만한요인은없는지확인한다. 물은자외선살균기및미세여과장치로소독한지하수를폴리카보네이트제음수병에넣고자유섭취하도록한다. 수질검사는지정된기관에서정기적으로실시하여먹는물수질기준에적합한지확인한다 사육상자및사육밀도동물은적절한케이지에사육한다. 채뇨및채변용동물은대사케이지에서사육하며사육상자당 1 마리를수용하도록한다 군분리순화기간중건강한것으로판정한동물의체중을순위화하고, 각군의평균체중이균일하게분포하도록무작위로분배한다. 1.3 시험종의선택 동물종하나또는그이상의동물종을시험에사용할수있으며동일한나노물질에대해다른독성연구에서사용되거나사용이권유되는시험종을선택하는것이바람직하다. 설치류를시험에사용하는경우, 개체별체중이평균체중의 ±20% 를초과하지않도록한다 수량및성별흡수및배설연구를위해서는대조군및각처리군에대해군당 4마리이상을사용한다. 시험에사용되는성별은정해져있지않으나, 성별을구분해서시험해야할특별한경우에는한쪽성만을구분해서노출할수있다. 성별에따른반응의차이가인정될때는암수모두를사용하여야한다. 이때각성별로

172 처리군당 4마리이상을사용한다. 비설치류의경우에는처리군당 4마리이하로할수있다. 조직내분포를연구하는경우, 대조군및처리군에서의최초시험개체수는시험과정에서관찰하는시점의횟수와각시점에관찰하는동물의수를고려하여결정한다. 대사를연구하는경우, 개체수는실험의목적에따라시험자가적절하게결정한다. 나노물질을반복적으로노출시키거나여러시점에서관찰하는시험의경우, 관찰시점의횟수및관찰을계획한동물의수등을고려하여처리군의개체수를결정한다. 그러나최소한 2마리이상사용하도록한다. 2. 시험방법 2.1. 원리나노물질은적절한경로를통하여체내에투여하며, 목적에따라처리군에일회또는반복적으로투여한다. 물질투여후, 체액, 조직및 / 또는배설물에서의해당나노물질및 / 또는대사체를분석한다 시험물질나노물질에대한독성동태연구는투여경로에따른각각의환경에서나노입자의안정성을시험하고그정보를제공하여야한다. 나노물질이식별되도록표지하거나표지하지않는방식으로노출시킬수있다. 표지하는경우표지물질에의해나노물질의표면화학이원래나노물질의물질화학적특성을손상시키지않아야한다 경구투여의경우, 투여용매와인공위액에서입경분포, 응집및침전여부등에관한정보를제공하여야한다. 육안으로응집및침전이

173 제조나노물질안전성시험방법해설서 발생하지않았다고판단될경우입경과표면전하등물리화학적성질을평가한다 정맥주사의경우, 나노물질을적절한주사용등장액에분산시킨후입경분포, 응집및침전여부등에관한정보를제공하여야한다. 분산시킨나노물질의농도는정맥주사시예측되는혈중농도와유사한범위내에서조정한다. 혈액중으로직접노출시킬경우, 혈액에서의나노물질분산성에관한사전정보를얻기위해나노물질을적절한혈청성분과혼화한후입경분포등안정성에관한정보를제공하여야한다 흡입, 경피등기타경로에의한투여방법을적용할경우나노물질의안정성은흡입독성또는경피독성등해당시험법에서요구하는내용을충족하여야한다 투여방법 투여경로는해당나노물질을대상으로한다른독성시험에서와동일한경로를선택하고, 또한다른시험에서와동일한용제를사용하는것이가장적절하다 경구로투여하는경우에는흡수율차이를고려하여투여한다. 투여되는나노물질의양을정확히계산하도록한다 경구투여외에도나노물질의노출시나리오에따라일정기간동안피부또는흡입을통한노출을통해나노물질을투여할수있다 나노물질투여직후의흡수및분포양상을확인하기위해서해당나노물질을정맥으로주사하는방법을사용할수있다 나노물질을현탁하는데사용한용매는나노물질의물리화학적성질을방해하지않도록고려하여선정한다

174 경구투여의경우, 투여전하룻밤절식시켜위내용물을비운후, 경구투여용존데를장착한주사관을이용하여위내에직접투여한다. 투여후 3~4 시간째에사료를다시급여한다. 사료에혼화하여투여하는경우에는사료중에서의나노물질의안정성에관한정보가있어야한다 정맥투여의경우, 고정틀을이용하여랫드를고정한후, 좌측또는우측의미정맥내에 1 회용주사기를이용하여약 2 ml/min의속도로투여한다. 투여전에는 70% 소독용알코올을이용하여투여부위를소독한다 용량단회투여를실시하는경우, 최소한두개이상의처리군농도를두도록한다. 이때독성영향이나타나지않는농도를저용량으로하고, 독성동태학매개변수에변화를가져오거나독성영향이나타날수있는용량을고용량으로설정하도록한다. 반복투여를실시하는경우에는저용량만을설정하여수행할수있으나, 필요한경우고용량을추가로설정하여시험한다 시험의실시동물의무게를측정한후, 다음의흡수, 분포, 배설및대사등의시험목적에맞게나노물질을투여하고분석한다. 나노물질의분석은나노물질의특성에따라검증된다양한분석방법을적용하여야한다 질량평형배설량 ( 뇨, 대변, 호기 ) 및체내잔존량의합과투여한총량의비율을바탕으로질량평형값을구한다. 일반적으로회수율은방사성동위원소를지표물질로사용한나노물질을바탕으로할때 90% 이상이면충분하다

175 제조나노물질안전성시험방법해설서 흡수투여한나노물질의흡수율과흡수량을다음과같이다양한방법으로결정할수있다. 이때투여경로, 흡수율및흡수량이검증된물질을대상으로한대조군을설정, 이와비교하여결정할수있다. (1) 배설물 ( 소변, 담즙, 대변, 호기 ) 또는사체에잔류하는나노물질및 / 또는대사체량측정 (2) 처리군및대조군 ( 필요시양성대조군포함 ) 간의생물학적반응 ( 예, 급성독성시험 ) 비교 (3) 처리군과대조군에서의신장을통한나노물질및대사체의배출량비교 (4) 처리군과대조군에서의나노물질및 / 또는대사체의혈장치와시간곡선내의면적계산값 (AUC) 에대한상호비교 생체이용율 나노물질을정맥주사하였을때의혈액 / 혈장농도수준과경구투여하였을 때의혈액 / 혈장농도로부터생체이용율을구한다. 생체이용율 F 는아래와같다 F= (AUC exp /AUC iv ) (Dose iv /Dose exp ), exp 는투여경로 분포나노물질의분포양상을분석하기위해다음의두가지모두또는두가지중하나의접근방법을사용한다. (1) 전신방사선촬영술을이용하여유용한정량적정보를획득 (2) 나노물질노출후, 시간별로동물을부검하여각장기및조직에서의나노물질및 / 또는대사체의농도와양을확인함으로써정량적정보를획득 배설

176 (1) 배설연구에서는소변, 대변및담즙, 경우에따라호기를채취한다. 이러한배설물에서의나노물질및 / 또는대사체의양은노출후수차례측정하도록한다. 측정횟수는나노물질노출후투여된물질의약 95% 가배출될때까지또는투여후일정기간동안수차례측정한다. (2) 수유기의실험동물을사용하는것과같은특별한경우, 실험동물의모유에서배출되는나노물질의배출량을측정할수있다 대사 (1) 대사연구를통한대사체구조의확인시험은대사경로및과거시험에서의의문점에대한해답을구하기위하여수행한다. (2) 대사경로에대한정보를얻기위해서는시험관내시험 (In vitro test) 을추가로실시할수있으며, 보다정확한대사정보를습득하기위하여독성및생화학적연구를수행할수있다 ( 예를들어, 대사효소시스템에대한효과, 내인성비단백질성 - SH 화합물의고갈및고분자와의결합등 ) 혈중 / 혈장농도의경시변화 Cmax, Tmax, T1/2, AUC 등독성동태지표를구하기위해나노물질을투여후각동물개체로부터일정기간정해진시간간격에따라혈액시료를채취한다. 혈액의량과채취횟수는동물의건강 / 생리또는분석방법의민감도에따라결정한다. 혈액채취는 1마리로부터채취하는게원칙이나혈액량이부족할경우각각의동물로부터채취한혈액을합쳐서분석할수있다 독성나노물질독성동태에사용된시험동물로부터나노물질에의한독성관련기본정보를얻기위해서일반혈액검사, 혈액생화학검사및조직병리검사등을수행한다. 시험동물로부터채혈하기위해서는하룻밤동안 (16~24시간) 절식 ( 물은제공 ) 시킨다

177 제조나노물질안전성시험방법해설서 III. 시험결과및보고 1. 결과의처리및평가 1.1. 결과의처리대조군및각처리군에대해시간, 농도, 조직, 기관 ( 장기 ) 등과관련된측정치의평균및통계적변이값을산출하여표시한다. 가능한경우, 데이터를표로작성하고, 필요하면그래프를추가한다. 흡수정도및배설량, 배설속도는적절한방법을통하여계산한다. 대사연구의경우, 대사체의구조를확인하고대사경로를표시한다 결과의평가 흡수나노물질의흡수에대한연구결과는급성독성을평가하거나반복투여독성연구를위한시험계획에도움을줄수있다. 나노물질이흡수되지않거나급성독성을나타내지않는다면 ( 예, 위장관내응집현상등의원인 ), 더이상반복투여연구가필요하지않음을제안할수있다 분포조직및기관 ( 장기 ) 에대한나노물질의분포양상을확인함으로써반복투여독성에대한연구및평가에도움을제공할수있다. 임신동물에대한분포조사를통해기관형성기의임신모체에노출된시험물질이태반을어느시점에서어느정도통과하는지측정할수있다. 또한분포연구의시험데이터를통하여나노물질이신체의어느조직또는기관 ( 장기 ) 에축적되는지를확인할수있다 배설

178 나노물질의배설양상을확인함으로써반복투여연구및평가에도움을제공할수있다. 배설량및배설속도를평가함으로써나노물질및 / 또는대사체가체내에잔류하는지여부를조사할수있다. 나노물질및 / 또는대사체의잔류여부는독성반응의변화와관련을보일수있다 대사 나노물질의대사양상및대사속도를확인함으로써, 해당물질의만성독성연구결과를해석하는데도움을줄수있다. 이와같은연구를통해투여량범위에서독성대사매개변수에어떠한변화가나타나는지에대한확인이가능하다. 만성독성시험을위한나노물질의용량결정은용량의존적대사반응에대한정보를토대로이루어질수있다 반복투여조건의독성반응에서확인된변화들은대사효소의유도와관련가능성이있다 동위원소표지를통해식별가능한시험물질의투여후, 고분자물질과결합한동위원소량을검출함으로써중간대사체또는반응중간산물에대한정보를확인할수있다 시험물질이체내 -SH 화합물을고갈시키는지여부가확인되는경우, 독성영향이체내에서활성화된대사체에의한것인지여부를평가하는데도움을제공할수있다. 또한이는반복투여연구를위한용량설정에활용될수있다. 2. 시험결과의보고 수행된독성동태시험의종류에따라결과보고서는다음과같은정보를포함 하도록한다

179 제조나노물질안전성시험방법해설서 2.1. 시험에사용된동물의종과계통및개체수 2.2. 방사능동위원소로표지한경우표지된나노물질특성또는대조물질의특성 2.3. 용량및투여간격 2.4. 투여경로및사용된용제 2.5. 사용된사료 2.6. 생물학적시료 ( 호흡으로배출된공기포함 ) 에서나노물질또는대사체확인방법 2.7. 실험동물의성별, 용량투여계획, 시간, 조직, 기관 ( 장기 ) 에대한측정치를 포함한도표 2.8. 시간별흡수속도및배설속도 2.9. 생물학적시료에서의대사체확인방법 대사와관련된생화학적분석방법

180 2.11. 제안된대사경로 다음의정보또는과정을토대로시험결과에대한해석과고찰을실시한다. (1) 나노물질의흡수에관한정보를토대로경구, 피부, 흡입및기타경로를통해실험동물체내로도입되는물질의양및속도를평가한다. (2) 나노물질의분포에관한정보를토대로실험동물의각종조직및장기에서흡수된나노물질또는대사체가순환하고분포하는양상을평가한다. (3) 나노물질의배설에관한정보를토대로동물체내에서투여된나노물질또는대사체가제거되는속도와양을평가한다. (4) 나노물질의대사에관한정보를토대로투여된나노물질또는대사체가효소및비효소반응을거쳐구조적으로어떻게변하는가를평가한다

181 제조나노물질안전성시험방법해설서 5. 나노물질의발생독성시험 I. 개요 1. 목적이시험은착상후부터출산전까지배자및태자의기관형성기상태에있는임신동물에나노물질을투여하였을때배자및태자의발생에미치는장해, 특히최기형성을밝히는데그목적이있다. 2. 정의 2.1 배자다세포동물의개체발생초기의것으로난막으로싸여있거나또는모체내에위치해독립적으로먹이를취하기이전의개체 2.2 태자 태아란임신초기부터출생시까지의임신된개체 2.3 발생독성 배자의발생과정에영향을미쳐기능적또는구조적이변이를초래하는것

182 2.4 최기형성 태자발생기동안구조적으로나기능적으로영구적이상을초래하는화학 물질의성질 2.5 나노물질 일반적으로그입경이 1~100 nm 범위에존재하는입자상물질 II. 시험 1. 시험의준비 1.1 시험동물 동물종설치류는랫드, 비설치류는토끼를사용하며계통은실험실에서일반적으로발생독성시험에사용하는것을선택한다. 다른동물을사용할경우정당한사유를첨부한다 동물수랫드, 마우스에서는임신이성립된개체의수가각용량군마다 20마리이상, 토끼는 12마리이상으로한다 사육환경 (1) 환경조건온도 22±3, 상대습도 50±10%, 환기횟수 10~20회 /hr, 조명시간 12시간

183 제조나노물질안전성시험방법해설서 (08:00 점등 ~20:00 소등 ), 조도 150~300 Lux 등 GLP기준에적합한환경조건에서실험하며해당환경조건을기술한다. 실험동물의관리및사용에적용할수있는모든규정을준수하여실시하였다는내용을기술하도록한다. (2) 사육환경모니터링시험기간의사육기간중동물실의온 습도는자동온습도측정기등에의하여매시간마다측정되도록하며환기횟수및조도등의환경조건은정기적으로측정한다. 환경측정의결과, 시험에영향을미칠것으로사료되는변동의유무를기록한다. (3) 사육상자및시험계의식별시험기간중임신동물을사육한사육상자및시험계의식별방법에대해기술한다. 2. 시험방법 2.1 원리시험물질을태자의기관형성기에투여한후분만직전에부검하여임신성립여부, 황체수, 착상수를조사하고, 내부기관을육안적으로관찰한다. 2.2 시험물질나노물질의제법, 제조사, 안정성, 불순물, 부형제, 보관조건, 유효기간, 입수일, 입수량등물질정보를최대한확보하여야하며제조환경에서의물리화학적특성과시험환경에서의물리화학적특성을비교할수있는자료를확보한다. 나노물질을현탁하는시험용매의특성과현탁액중의나노물질물성에대해서도기술한다

184 2.3 용량용량반응관계를파악하고최대무작용량을결정하기위해원칙적으로 3단계이상용량의시험군을설정한다. 최고용량은원칙적으로모동물에섭이량의저하나체중증가의억제등약간의독성증상을나타내지만 10% 이상의사망까지는가지않는양으로한다. 투여가능한최대량 (1,000 mg/kg을한도로한다 ) 을투여한경우에도어미동물에독성증상이나타나지않을때는그양을최고용량으로한다. 최저용량은태자의발생에독성영향이나타나지않는양으로한다. 별도로용매만을투여하는대조군을둔다. 2.4 투여기간태자의기관형성기간은매일투여한다. 보통교미확인된날을임신 0일로했을경우, 마우스와랫드에서는임신 6일부터 16일까지, 토끼에서는임신 6일에서 18일까지로한다. 2.5 나노물질의투여나노물질투여에필요한조제과정에대해상세히기술한다. 시험동물에투여하기위해조제된현탁액중에서의나노물질의안정성, 균질성및함량에대해기술한다. 기술하지않을경우그사유를기록한다. 대조물질또는나노물질의투여과정및투여경로의선택이유에대해기술한다. 2.6 관찰사항 모동물 (1) 전시험기간동안에일반상태를관찰하고, 체중및섭이량을측정한다

185 제조나노물질안전성시험방법해설서 (2) 출산예정일의바로전날에계획도살되는모든동물은체중을측정하고부검을실시한다. 부검시외관상비정상유무를상세히관찰하고흉강, 복강및두개강의모든장기에대하여비정상유무를관찰한다. (3) 육안으로관찰하여비임신동물로판단되거나, 한쪽자궁이비어있는것이관찰되는경우에는암모니움설파이드로자궁을염색한후자궁의착상흔유무를관찰하여임신여부를판단한다. (4) 사망동물의경우발견즉시부검을실시하여외관상비정상유무를상세히관찰하고흉강, 복강및두개강의모든장기에대하여비정상유무를관찰한다. 임신동물에대하여육안소견이관찰된조직은적출하여 10% 중성완충포르말린액에고정한다. 사망동물의임신여부는자궁의착상흔의유무를기준으로판단하며, 임신동물에대해서는자궁검사를실시한다. (5) 임신동물은난소와함께자궁을적출하고가능한경우임신황체, 착상흔, 생존 / 사망태자및흡수 ( 초기및후기 ) 수등을관찰하고기록한다. 측정한결과들을바탕으로, 다음의항목들을계산한다. 착상전배자손실률 (%) = [( 임신황체수 착상수 ) / 임신황체수 ] 100 착상후태자사망률 (%) = [( 착상수 생존태자수 ) / 착상수 ] 100 태자사망수 = 흡수태자수 + 사망태자수 성비 (%) = ( 수컷생존태자수 / 생존태자수 ) 100 생존태자의암수별평균체중및태반중량등 태자 (1) 태자의생사를판정하고, 사망새끼에대해서는사망시기를추정한다. 살아 있는새끼에대해서는체중을측정하고성을판정한다

186 (2) 생존태자는외형및내부장기검사를실시하며 1/3이상의새끼에대하여골격검사를한다 분포및이행 (1) 임신 21일째군당 4-5마리정도모동물의주요조직을체취한다. 태자의경우는각모동물별로다수의태자로부터주요조직을채취하여나노물질의분석에적정한분량이되도록합친다. 채취한조직은적절한측정분석방법과필요시전자현미경을활용하여나노물질의분포및태자로의이행을확인한다. III. 시험결과및보고 1. 결과의처리관찰된이상상태나독성증상과시험물질의투여량과의관계에대해서는적절한통계학적수법을이용하여고찰하고, 최대무작용량에대한견해를밝힌다. 이때, 한배에서나온새끼들을표본단위로한다. 2. 시험결과의보고 시험보고서는다음의항목을포함한다. 2.1 시험기관의명칭및소재지 2.2 시험책임자및담당자성명

187 제조나노물질안전성시험방법해설서 2.3 시험동물 : 종, 계통, 체중, 주령, 성및사용수 2.4 나노물질조제물에대한물리화학적특성 ; 입경분포, 표면화학등 2.5 나노물질에대한독성반응자료 2.6 각시험동물의이상증후를발견한시간및이상증후 2.7 사료및체중관련자료 2.8 모동물에대한나노물질의영향 2.9 태자에대한나노물질의영향

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189 제조나노물질안전성시험방법해설서 IV. 나노물질전과정평가 (LCA) 방법 (Guide for Life Cycle Assessment of Nanomaterials)

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191 제조나노물질안전성시험방법해설서 1. 개요

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193 제조나노물질안전성시험방법해설서 제 1 장나노물질전과정평가의목적 전과정평가는제품의전과정에걸쳐제품 ( 서비스포함 ) 에서야기된환경부하를계산하고환경에미치는영향을평가하는도구이다. 나노기술, 나노제품및나노물질은큰잠재적영향력을가지고있고급속하게발전할혁신적인분야이다. 그러나환경과인체건강에대하여서는수많은불확실성이존재한다. 그러므로전과정평가와같은포괄적인평가도구를이용하여나노기술이환경과건강에미치는영향을분석, 평가, 이해그리고관리하는것이필수적이다. 이에본지침서는나노물질에대한전과정평가를실행하는일반적인절차를제시하여나노물질을사용하거나제조하는사업장및나노물질의위해성을관리하는정책입안자들의사업진행에편리성을제고하고자한다. < 제품전과정의단계들 >

194 제 2 장적용범위 본지침서는나노물질이포함된소비제품이나중간재의전과정동안환경과 인체건강에미치는영향을분석하고평가하는데적용된다

195 제조나노물질안전성시험방법해설서 제 3 장용어정의 3.1 기능단위 전과정평가에서기준단위로사용하기위한제품시스템의정량화된성과 3.2 기본흐름 연구대상이되는제품시스템에들어가는물질또는에너지로서인간에의한 사전변형없이환경으로부터추출된것. 연구대상이되는제품시스템으로부터 나가는물질또는에너지로서인간에의한사후변형없이환경속으로버려지는것 3.3 기준흐름 기능단위에서설정한기능을수행하는데필요한제품시스템의공정에서나오는 산출물의척도 3.4 나노기술 나노물질의모양과크기를조절하거나정렬시키고조합하여유용한성질의소재나시스템을생산하는기술 3.5 단위공정 전과정평가수행시데이터수집을위한제품시스템의최소단위

196 3.6 데이터품질 정해진요구사항을만족시킬수있는능력이있느냐하는데이터의특성 3.7 보조물질 제품을생산하는단위공정에서사용되는투입물질이지만제품의부분을구 성하지는않음 3.8 부산물 같은단위공정에서나온둘이상의제품중어느하나 3.9 산출물 단위공정에서나가는물질또는에너지 3.10 시스템경계 제품시스템과주변환경또는다른제품시스템과의경계 3.11 영향범주 전과정목록분석결과가배분될수있는관심있는환경적인이슈를대표하는분류

197 제조나노물질안전성시험방법해설서 3.12 원료물질 제품을생산하는데사용되는제 1 차또는제 2 차물질 3.13 전과정 원료물질채취또는천영자원의생성부터최종처리에이르는제품시스템 상의연속적이고상호연관된단계들 3.14 전과정목록분석 주어진제품시스템의전과정에걸쳐투입물과산출물을종합하여정량화하 는전과정평가의안단계 3.15 전과정영향평가 제품시스템의잠재적환경영향의크기와중요성을이해하고평가하는것을 목적으로하는전과정평가의한단계 3.16 전과정평가 제품시스템의전과정에걸쳐투입물과산출물및잠재적환경영향을종합, 평가하는기법 3.17 전과정해석 결론및권고에이르기위해전과정목록분석이나전과정영향평가중의한

198 가지연구결과또는두가지모두의연구결과를정의된목적및범위와일관성 있게통합시키는전과정평가의한단계 3.18 제품 모든제품혹은서비스 3.19 제품시스템 하나또는그이상의정의된기능을수행하는물질또는에너지로연결된 단위공정의집합체 3.20 투입물 단위공정으로들어가는물질또는에너지 3.21 특성화인자 배분된전과정목록분석결과를범주지표의일반적인단위로전환시키기위 하여적용되는특성화모델로부터유도된인자 3.22 폐기물 제품시스템으로부터폐기된모든산출물

199 제조나노물질안전성시험방법해설서 전과정평가 (life cycle assessment) 전과정평가는목적정의및범위설정, 전과정목록분석 (LCI), 전과정영향평가 (LCIA), 전과정해석의 4단계로구성된다. 아래의그림은 ISO 14040을인용한그림으로이들 4단계사이의관계를보여준다. < 전과정평가단계 > 전과정평가의목적, 목적대상및대상제품을설정하는것이목적정의이다. 범위설정은제품시스템경계, 기능단위, 자료기준등을설정하는것이다. 목록분석결과를통해제품시스템내의각단위공정에서제품까지의투입물과산출물이기여도에따라계산되고, 이를통해제품전과정에서발생하는환경부하정보를정량적으로산출한다. 영향평가단계에서는제품시스템의환경부하를토대로환경영향이평가된다. 해당영향범주에상응인자를적용하여환경영향을정량화한다. 이과정을특성화라고한다. 정규화및가중치부여를수행하여환경영향에대한정보를더체계적으로정리한다. 개선평가는서로간의완전성, 민감도및일관성같은다양한측면에서전과정목록분석과영향평가결과를분석한다. 또한제품시스템에서환경적으로큰기여도를갖고있는주요인자를규명한다

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201 제조나노물질안전성시험방법해설서 2. 나노물질전과정평가절차

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203 제조나노물질안전성시험방법해설서 제 1 장목적정의및범위설정 (Goal and scope definition) 이단계에서전과정평가수행의목적을설정한다. 사용목적에따라필요한자료, 분석방법및결과가달라지기때문에목적정의가명확하게기술되어야한다. 또한환경부하에대한범주의범위를설정하기위한가정, 제한요건및기능단위를설정한다. 1.1 목적정의 (goal definition) 목적정의와범위설정에서첫번째단계는전과정평가의목적을정의하고연구의개시자, 실행자, 관계자및연구결과의사용자들을명확하게제시하는것이다. 연구의목적을명확하게정의한다. 연구방법 ( 예 : 시스템의비교, 요람에서 입구까지및요람에서무덤까지분석법등 ) 뿐만아니라연구가수행되는이유 를명확하게기술한다. 다음의관계자들을목록화한다. ㆍ연구를수행하는사람들 ( 주로연구자 ) ㆍ전과정평가책임자 ( 고객이나투자자 ) ㆍ목표대상 ( 혹은사용자 ) 그리고다른이해관계자ㆍ조정위원회나다른관리위원회의멤버

204 ㆍ전문검토자와전문가패널 연구목적을달성하는데전과정평가가가장적절한방법인지더적절한다른 방법이있는지확인한다. 전과정평가방법의장단점과다른방법을사용했을 때발생할수있는이점을설명한다. 전과정평가의모든단계에서시작점이어디인지확인한다. 예시 ( 가정 ) 이전과정평가의목적은은나노입자가포함된일회용빵봉지속의은나노입자가환경에미치는영향을평가하는것이다. 전과정평가의결과는제품과공정개발을위해사용될것이다. 플라스틱봉지제조업자는제조공정에서의기술, 투입물및제품성분의변화가주는효과를분석하길요구했다. 이러한정보들은환경에미치는영향을평가하는데사용될것이다. 이전과정평가는비교주장 (comparative assertion) 방법을사용하지않는다. 이연구는일반엔지니어링회사인 ( 주 )EMPL에의해실행됐다. 평가위원은일회용플라스틱봉지의최대생산자인 ( 주 ) 플라스틱이고, 관심지역은주로플라스틱산업장및상점이다. 생산자를대표로하는조정위원회는환경부와학자들로구성될것이다. 마지막으로전문적검토는전과정평가국가연구소에서진행될것이다

205 제조나노물질안전성시험방법해설서 1.2 범위설정 (scope definition) 시간적, 지역적, 기술적적용범위를설정함으로서전과성평가연구의특성을결정한다. ㆍ연구목적과관련하여시간적범위를설정한다. 이것은자료수집에소요되는기간과표준화를위한기준점이될것이다. ㆍ연구목적과관련하여지역적범위를설정한다. 이것은비교연구에서대안시스템이나기준지역을설정하기위한기준점이될것이다. ㆍ연구목적과관련하여기술적범위를설정한다. 특정지역기술의평균수준을기준점으로선택하는것이체계적이고변화지향적인결정이다. ㆍ연구목적 (= 초기시스템경계 ) 과관련하여경제적범위를설정한다. ㆍ연구목적과관련하여환경간섭 (environmental intervention) 범위를설정한다. ㆍ연구목적과관련하여환경영향 (environmental impact) 범위를설정한다. 예시 ( 가정 ) 전과정평가는대한민국에서공정개발을위한 hot spot을확인하기위해실행되었다. 따라서자료는대한민국의현재기술상태를대표한다. 이연구는가장최근 ( 주로 1999년 ) 데이터를사용하였다. 이연구의목적은체계적이고변화지향적인전과정평가의범위와일치한다. 연구는 8명에의해진행된다. 연구중가장중요한생산, 재활용및품질개선공정에서의자료수집을위해대부분의시간이할애될것이다

206 1.3 기능, 기능단위, 대안및기준흐름 (function, functional unit, alternatives and reference flows) 기능단위는사용자가정의한기능을정량적으로나타내는단위이다. 기준흐름은기능을수행하는데필요한제품의총량이다. ㆍ분석할기능들을확인한다. ㆍ분석할주요기능을결정한다. ㆍ주요기능과다른기능사이의경제적흐름과환경적간섭들을할당한다. ㆍ다른기능들은제외하고이기능들을문서화한다. ㆍ기능단위를정의한다. ㆍ시스템의기능에대한주요변수를정의한다. ㆍ표현단위는항상 SI 단위를사용한다. ㆍ분석된기능의정량화를위해임의의양을설정한다. ㆍ기능단위를충족시키는대안시스템을결정한다. ㆍ제품혹은시스템이연구목적과일치하는지를확인한다. ㆍ왜특정제품혹은시스템이같은기능과서비스를제공하는다른시스템보다우선시되어평가되는지설명한다. ㆍ기능을충족시키는기준흐름을결정한다. 모든대안시스템의기준흐름이다른대안들에도적용될수있는지확인한다. 매우새로운기능을갖는나노제품의경우기능적대안물을찾는것은어려운일이다. 예를들어얼룩방지나노코팅바지의경우, 기존바지와의비교분석

207 제조나노물질안전성시험방법해설서 을통해착복과세척의상태에대한주의깊은관찰을할수있지만, 의약품에 나노물질을사용할경우에는기능적으로동등한의약품이존재하지않을수있 기때문에기능적대안물과의비교평가가어렵다. ㆍ기능, 기능단위, 대안시스템및기준흐름을확인한다. ㆍ기능은연구목적에따라적절하게선정됐는가? ㆍ기능과양은기능단위혹은연구목적과일치하는가? ㆍ기능적동일함 : 기능단위를기반으로선택된시스템이비교가가능한가? ㆍ모든단계가적절하고정확하게진행되는지보고한다. ㆍ연구가진행되는제품과서비스에대해짧게기술한다. ㆍ선택된기능을명확하게기술한다. ㆍ제외된기능들에대해기술한다. ㆍ특정시스템의선정이유와주된특성 ( 가동률, 수명 ) 을기술한다. ㆍ기준흐름을명확하게기술한다

208 전과정평가에서나노기술과관련된주요사항 < 전과성평가를적용하기위한나노기술과관련된주요사항들 > 물질- 물질은나노물질의화학적조성과구조적물성으로나뉜다. - 구조적물성은다양한형태 ( 구형, 막대형, 튜브형, 고리형등 ) 로구분되고, 이는제조방법에따라달라진다. - 기본적인나노물질의조성은유기물 ( 덴드리머, 고분자등 ), 무기물 ( 금속, 금속산화물, 금속수산화물등 ), 탄소류 ( 탄소나노튜브, 버키볼등 ) 혹은이들물질의혼합물로구성된다. 만약표면전하의조절과다른화학반응의유도를목적으로표면이개질되었다면더복잡한분류가가능하다. - 궁극적으로, 환경으로나노물질들이방출되면위에서언급된다양한물리화학적특성들이나노물질의이동과다른물질과의상호작용에영향을미치기때문에독성효과에기여하는바가클것이다

209 제조나노물질안전성시험방법해설서 제조-제조기술은하향식 (top down) 혹은상향식 (bottom up) 접근법으로분류된다. - 하향식제조는나노물질의생성개시물 (starting block) 로서큰물질을사용한다. 컴퓨터칩의생산에서사용되는리쏘그래피, 정밀한표면을생성하기위한에칭그리고금속나노입자를만들기위한분쇄공정이예이다. - 상향식제조는분자수준에서부터나노물질을제조하는접근법이다. 이들은화장품, 연료첨가제의제조반응, 자가조립디스플레이화면혹은필터카트리지의제조등에사용되는최신기술이다. - 액상공정은용매나액체시약을사용한다. 화학침전법이나리쏘그래피에서사용된다. - 건조반응은분쇄 (attrition), 레이져삭마 (ablation), 증기증착 (vapor depositon), 열분해 (pyrolsis) 그리고플라즈마아크방전법 (plasma arc discharge) 이있다. - 여러가지공정은각각전체환경이나독성에관하여임팩트를가질수있다. 에칭이나화학적침전법같은액상공정의경우방출되기전에처리돼야하는추가적인폐흐름 (waste stream) 이생성된다. 이러한추가공정은만약전기가화석연료로생산이된다면지구온난화를유발할수있는전력소비의증가를야기할수있다. 추가적인폐처리장비를위해서는토지사용과관련된비용또한증가될것이다. 또한반도체제조공정에서는에칭을위한화학약품들이일반적인화학약품과비교하여작업자들에게큰독성을제공할수있다. 사용- 나노물질은환경, 의료용, 소비재및다른활용 ( 건축자재, 전자제품등 ) 범위내에서분산된형태와혼합물형태로사용된다. - 분산된형태는이것의나노크기의물성을유지한다. 방출되었을때이동성과반응성은크다. 분산된형태의영가 (zerovalent) 금속을이용한지하수의정화작용이다. - 합성물속에채워진나노물질은혼합체가파괴되지않는이상은

210 인간이나환경에영향을미치지않을것이다. 그러나이것은처리후에문제가발생할것이다. 폐기-직접적인폐기는매립, 소각혹은수처리를거친다. - 화장품, 페인트, 코팅제등에사용된나노입자가사용하는동안방출되면이중 95% 가수처리공장에서이동을마친다고보고된바있다. - 탄소나노튜브의경우플라스틱, 스포츠용품그리고전자제품을위한구성물질로서사용된다. 매립과소각의폐기과정까지탄소나노튜브는제품속에남아있다. 소각과수처리동안제거되지않거나, 매립이발생하면극단적으로환경으로출시되고, 생물축적이일어날수있다. - 이러한잠재적노출이나노물질독성과관련한큰우려를낳고있다. 사용이끝난나노물질의재활용은원료사용의절감과환경영향을감소시키는데도움이된다. 그러나이러한재활용은현실적으로제약이많다

211 제조나노물질안전성시험방법해설서 제 2 장목록조사 (Inventory analysis) 목록조사는평가대상이되는시스템과관련된자원과에너지의사용및환경배출물항목들의양을기능단위생산에따른투입물및산출물의양으로환산하는단계이다. 2.1 경제 - 환경시스템경계 (economy-environmental system boundary) 전과정평가에서의흐름은시스템투입물과산출물이환경간섭으로전환될때까지를말한다. 환경간섭은경제 (= 생산시스템 ) 와환경사이의경계를가로지르는흐름이다. 생산시스템과환경사이및기본흐름과기타흐름을구분하기위해경제- 환경시스템경계는명확하게정의돼야한다. 생산시스템과환경사이의경계에대해정의한다. 관리가이뤄지는매립은배출이일어나는경제공정으로간주한다. 그러나관리가이뤄지지않는매립은환경시스템의일부로간주한다. 부분적으로관리되는매립은이양극끼리의혼합으로간주한다. 폐수처리는경제공정으로간주한다. 폐수처리시스템으로배출되는것은환경으로배출되는것이아니고, 폐수처리시스템에서처리되어배출되는것을환경으로배출되는것으로간주한다. 폐수처리에대한공정자료가구하기가쉽지않기때문에, 때때로폐수처리는순서도에서제외된다. 그러나이후에시스템경계를따르지않는흐름으로기술해야한다. 시스템경계의특징적이고표준적인항목들에대해서일관되게정의한다

212 비교연구의경우에, 경제-환경시스템경계가비교되는다른생산시스템과일관되게다뤄지는지확인한다. ㆍ다음사항들에대해기술한다. ㆍ생산시스템의모든단계에서의시스템과시스템경계ㆍ최종시스템경계설정의타당성ㆍ기본적흐름으로서시스템의투입물과산출물 < 환경간섭과경제흐름 > 2.2 순서도 (Flow diagram) 순서도는모든주단위공정의개요와그들의상호관계를보여준다. 공정순서도를사용하여시스템을기술하는것은시스템을이해하는데도움이된다. 전과정의각단계의통합과정에서초기순서도의초안을작성한다. 기준흐름

213 제조나노물질안전성시험방법해설서 을생성하는공정, 인접한공정, 주요물질을생산하는공정및주요폐기흐름을관리하는공정부터시작한다. 초기순서도부터시작하여자료수집단계에따라계속해서자료를보충하여작성한다. 단위공정들을나타내는박스와생산흐름을나타내는화살표를사용하는것이편리하다. 순서도의주기능은생산시스템의구조와단위공정사이의관계를도해하는것이기때문에환경간섭은종종순서도로부터생략된다. 박스안에글자들은명확하게단위공정의이름을나타내야하고생산흐름의이름은화살표에붙여져야한다. 순서속자료가연구목적과범위에일관되게수집되었는지확인한다. 2.3 양식과자료범주 목록조사에서공정자료를모으는것은매우중요하다. 많은양의자료들은전자양식으로되어있다. 다른이들이작성한데이터베이스에서부분참조하는것도가능하다. 다른생산투입물과산출물처럼에너지의투입물과산출물을다룬다. 자료범주를상세히하기위해기준목록으로영향평가자료에사용할수있는기본흐름목록을사용한다. ㆍ대기ㆍ담수ㆍ해수ㆍ농업용토양

214 ㆍ산업용토양 관련성이깊은목록항목들에대해서는위에제공된기준목록외에다른목록항목들을추가한다. 연구목적, 범위및영향범주에의거한추가목록항목들은다음과같다. ㆍ토지점유ㆍ토지변경ㆍ폐열의방출ㆍ인적손실ㆍ소음 예시 ( 가정 ) 은나노일회용봉지의전과정평가연구를위한순서도는다음에도식화되 었다. 환경투입물과산출물은생략되었다

215 제조나노물질안전성시험방법해설서

216 2.4 자료의품질 (Data quality) 전과정평가모델링은다른모델링과마찬가지로 쓰레기투입 = 쓰레기배출 이다. 자료의품질은결과에중요한영향을미친다. 자료의품질에대한적절한평가는전과정평가에서중요하다. 자료의품질과관련하여다음의항목들은상세히기술돼야한다. ㆍ자료의정확성ㆍ자료의대표성ㆍ자료의일관성ㆍ자료의재현성ㆍ자료소스선정의타당성ㆍ자료의완전성ㆍ물질과에너지수지의정확성 기준자료의최대품질요구사항을결정한다. 모든자료소소와기준들은정확히확인해야한다. 다음과같은자료품질의 주요지표들은보고해야한다. ㆍ자료의시기

217 제조나노물질안전성시험방법해설서 ㆍ수집의빈도수 ㆍ시공간의고려 ㆍ추가적인관련요인들 2.5 자료의수집과단위공정과관련된자료 이단계에서단위공정과관련된모든자료들을수집하고양식에따라단위공정과연결된모든흐름을정량화한다. 주요자료들이수집될전경 (Foreground) 공정을결정한다. 나머지공정들은일반적인데이터베이스, 문헌및 IOA자료로사용될배경 (background) 공정으로취급한다. ㆍ전경공정을위한자료수집은다음사항에따라실행한다. ㆍ시간의흐름에따라공정자료를수집한다. ㆍ모든경제및환경흐름자료들은 SI 단위로나타낸다. ㆍ자료수집에사용된절차를문서화한다. C x H y, PAH, 중금속, AOX 같은그룹변수 (Group parameter) 의사용을가급적줄인다. 공정배출이그룹변수로서표현된다면, ㆍ그룹변수들을개별화학조성물로분해시킨다. ㆍ그룹변수들을일반적환산계수를사용하여전환시킨다

218 예시 ( 가정 ) 은나노입자생산의단위공정을위한가상의공정자료는아래표에기술되었다. 항목일반적정보이름코드저자날짜소스상태정확성시대적대표성지역적대표성경제적산출물은나노입자경제적투입물질산 (HNO3) 은 (Ag) 분산제 (citrate) 수산화나트륨 (NaOH) 포름알데히드대기로의배출수소가스 (H 2 ) 은나노입자수계로의배출질산염구연산수산화나트륨 값 은나노입자생산 Z-23-4f CML 2009년 8월 1일은나노입자생산중기업의생산기록 중기업공장일일생산의측정값을기초로함 일일이열거하지는않았지만, 큰차이는없는것으로보임 2000년대중반대한민국의평균 질량 : 10 kg 입자크기 : 50±10 nm 형태 : 구형입자표면적 : 7.85±0.314 μm L 15 kg 0.5 kg 0.7 kg 0.3 kg 50 L 0.02kg 0.01 kg 0.05 kg 0.02 kg

219 제조나노물질안전성시험방법해설서 2.6 자료의유효성 (Data validation) 수집된자료의유효성은물질, 에너지수지및다른소스자료와의비교등다양한방법으로확인된다. 유효성검사가진행되는동안부절적하다고판단된자료들은교체되어야한다. 또한자료의공백이확인되면이자료를어떻게메워야하는지도결정해야한다. 물질, 에너지수지를계산하고사용된다른소스자료와의비교분석을통해수집된자료의유효성을검사한다. 정확한자료값을결정하기위해사용된기준을기술한다. 전경자료속에중요하지않은자료와배경자료속에중요한자료가존재한다면문서화한다. 2.7 컷오프와자료평가 (Cut-off and estimation) 이론상전과정평가는주어진생산시스템의전과정에걸쳐모든공정들을추적해야한다. 그러나실제적으로이것은불가능하고흐름의다수는사용되는자금과노력의절약을위해개략적으로평가하거나생략해야한다. 나노물질의경우질량만을기준으로한컷오프방법은적용될수없다. 기존 의목록이질량을기준으로하는반면나노물질과나노제품의경우에는추가적 인정보 ( 예, 화학적조성, 입자크기, 모양, 결정구조, 표면적 ) 가필요하다

220 공정에대하여상세한자료를수집함으로써가능한많은생략을피해야한다. 이것이가능하지않다면, 조사되지않는공정들에대한평가는다음의방법으로진행한다. ㆍ유사한공정에의한공정의근사값흐름에대한자료의공백과유사한흐름에대한자료를비교하여제외시켜야하는공정자료에대해평가한다. 다음사항들을보고한다. ㆍ초기투입물과산출물의기준ㆍ손실된흐름을평가하거나제외하기위해사용된가정과기준ㆍ결과에대한평가혹은제외하는것이주는효과ㆍ시스템경계를다듬기위한민감도분석ㆍ전과정단계의생략, 공정혹은경제그리고 / 혹은환경흐름ㆍ주요공정자료와보조공정자료에따라평가된공정자료 2.8 다기능과할당 (Multifunctionality and allocation) 대부분의산업공정은다기능이다. 산출물은일반적으로단일제품보다더많은것들로이루어져있고, 원료투입물은종종중간물혹은폐기물을포함한다. 게다가어떤기능단위를조사하다보면더많은기능들을포함하는시스템과직면하는문제점이발생한다. 할당방법은다음과같다

221 제조나노물질안전성시험방법해설서 ㆍ모든기능값들을기반으로한경제할당 ㆍ이전에할당된요람에서공장문까지데이터베이스자료의대용 ㆍ질량, 부피혹은에너지같은경제값의지표에의한할당 다음사항들을확인하고개선평가에서정밀분석을위한권고사항으로사용한다. ㆍ단순한다른할당요소들이사용가능한가? ㆍ비교연구의경우비교된시스템사이에서할당의큰차이점이존재하는가? 예시 ( 가정 ) 6 개의단일기능단위들은아래에표로나타내었다. 폴리에틸질산은은나노입자은나노봉지폐화학물질렌생산생산생산소각생산 경제적산출물 (kg) 질산은 은나노입자 폐기물 경제적투입물 (kg) 질산 은 대기로의배출 (g) 수소가스 은나노입자 수계로의배출 (g) 질산염 구연산 수산화나트륨

222 2.9 계산방법 공정자료의수집은공정들의데이터베이스를야기한다. 이들공정들과다른것들이정량적으로관계를맺는것을계산방법이라고표현한다. 대안생산시스템을위해생산시스템의기준흐름과관련된모든공정들을축소시킴으로서목록표를계산한다. 생산시스템안에서각단위공정은기준흐름을위해필요한제품혹은서비스를정량화하는방식으로축소돼야한다. 역행렬을기초로한소프트웨어를사용한다. 다른소프트웨어를사용한다면계산방식에대해문서화한다. 예시 ( 가정 ) " 은나노봉지의예에서모든공정들은알고리즘에기반한행렬을사용하여 축소되어진다. 축소상수는표에기술되었다. 단위공정 축소상수 은의채취 6.1E-8 질산의생산 1.3E-6 질산은생산 1.3E-6 분산제생산 8.1 은나노입자생산 폴리에틸렌생산 0.01 은나노봉지생산 0.01 빵포장 2.4E-5 폐화학물질소각

223 제조나노물질안전성시험방법해설서 제 3 장영향평가 (Impact assessment) 영향평가는해석범주를선정하고, 각범주별로투입물과산출물을분류하여각공정에서발생하는환경부하를정량적으로표현한다. 3.1 영향범주의선정 영향평가단계에서목록조사의결과는무생물원료의고갈, 기후변화, 산성화같은영향범주로변형된다. 중간지점에서영향범주를선정하기위해문제접근법 (problem-oriented approach) 을사용한다. 민감한분석의경우에 Eco-indicator 99 나 EPS같은종말점접근법 (endpoint-oriented approach) 의활용도추천된다. 기준영향범주 ( 그룹 A), 자세한영향범주 ( 그룹 B) 및다른영향범주 ( 그룹 C) 가영향범주에포함된다 ( 표 3.1). 연구목적과관련되어범주선정의타당성을입증해야한다. 영향범주를없는채로놔두는것이생략하는것보다좋다. 예를들면, 오존친화적 제품에서성층권오존고갈의영향범주를삭제하지않고, 분류와특징부분이단지영 (0) 임을보이면된다. 연구목적과범위에따라추가적인영향범주를포함시켜야한다면이에대한사항이쉽게이뤄져야한다

224 환경으로부터채취된에너지담체 ( 석탄, 석유및가스 ) 는 MJ 의단위로채취 된에너지의총량으로전환될수있다. 표 3.1 기준특성화방법의이용과관련된기 영향범주 단일기준특징을특징을결정짓는다른결정짓는방법을이용할방법이있는가? 수있는가? A. 기준영향범주무생물자원의고갈 예 예 사용한토지의영향토지경쟁 예 예 기후변화 예 예 성층권오존고갈 예 예 인체독성 예 예 생태독성담수생태독성 예 예 해수생태독성 예 예 육상생태독성 예 예 광산화물형성 예 예 산성화 예 예 부영양화 예 예 B. 자세한영향범주사용한토지의영향생명유지기능의상실 아니요 예 생물다양성의상실 아니요 예 생태독성 예 예 담수토양생태독성 예 예 해양토양생태독성 예 예 전리방사선효과 예 예 악취악취를풍기는공기 예 아니요 소음 예 아니요 폐열 예 아니요 인명손실 예 아니요 C. 다른영향범주무생물자원의고갈 아니요 예 가뭄 아니요 아니요 악취악취를풍기는물 아니요 아니요

225 제조나노물질안전성시험방법해설서 예시 ( 가정 ) 이전과정평가에서는제품의주요문제점중하나인독성배출에의한기준영향범주 ( 그룹 A) 뿐만아니라담수토양과해수토양의생태독성에대해서도평가를실시하였다 3.2 특성화방법의선정 : 범주지표, 특성화모델과요소 목록표에기록된간섭들은일반범주지표에관해정량화된다. 이후에특성화모델이사용된다. 선택된영향범주각각의특징을결정짓는기준방법을사용한다. 특정영향범주를위해대안방법의하나를사용하는것을고려한다. 영향평가에서사용된방법론은보고서에명확하게기술한다 무생물자원의고갈 무생물자원 은생명력이없는것으로간주되는철광석, 크루드오일및풍력에너지같은천연자원이다. 무생물자원의고갈은가장빈번하게논의되는영향범주중하나이다. 무생물자원의종류는퇴적물 (Deposit), 축적물 (Funds), 순환물 (Flows) 3가지로나뉜다. 퇴적물은인간생애에재생산되지않는석탄, 석유, 광물, 진흙같은자원이고, 축적물은인간생애에재생산되는지하수, 토양같은자원이다. 순환물은바람, 강, 물및태양에너지같이지속적으로재생산되는자원을

226 말한다. 무생물자원의고갈 ADP i= 무생물자원 i의고갈잠재성 (Abiotic Depletion Potential) m i = 채취된자원i의질량 (kg) R i = 자원 i의최대비축량 (kg) DR i= 자원의채취율 (kg/yr) 예시 ( 가정 ) 영향범주목록조사결과특성화모델범주지표특성화인자지표단위 무생물자원고갈광물과화석연료의채취 (kg) 농도기반보유량과재축적률을기반으로한접근법연사용량과관련된최대보유량의소모광물과화석연료의채취에의한무생물자원고갈의잠재성 kg 생물자원의고갈 생물자원 은생명력이있는열대우림, 코끼리같은물질자원이다. 생물자원의고갈

227 제조나노물질안전성시험방법해설서 BDP i = 생물자원 i의고갈잠재성 (Biotic Depletion Potential) m i= 채취된자원i의질량 (kg) R i = 자원 i의최대비축량 (kg) DR i = 자원의채취율 (kg/yr) 토지사용의영향 토지사용의영향 은토지를사용하여나타나는영향을나타낸다. 토지의사용은자원으로서의영향과생물의다양성, 생명유지기능에미치는영향으로구별된다. SETEC WIA-2 형식에의해정의하면, 토지사용은점유 (Occupation) 와변형 (Transformation) 의두가지측면으로구분된다 ( 그림3-1). 토지변형은생물다양성과생명유지기능의변화가발생되는것이다. -변형된상태 면적토지점유는토지의다른사용이가능하지않은기간을말한다. -변형된상태 면적 시간

228 그림 3.1 토지가사용된시간 t1 과 t2 사이에토지의품질 토지경쟁 토지경쟁 은자원으로서의토지의손실과연관되어있다. 토지경쟁 U s 는기능단위에기여할수있는토지사용이다. m 2 년으로표현된다. 예시 ( 가정 ) 영향범주 토지경쟁 목록조사결과 토지사용 (m 2 년 ) 특성화모델 감소된양 범주지표 토지점유 특성화인자 토지사용의모든경우 지표단위 m 2 년

229 제조나노물질안전성시험방법해설서 생물다양성의상실, 생명유지능력의상실 생물다양성의손실 은생물자원의추수혹은땅의파괴및변질과같은간섭의결과로서나타나는효과이다. Lindeijer 형식에의해정의하면, ( 그림 3-2) 생태계변형의경우 생물다양성의상실 생명유지기능의상실 생태계점유의경우 생물다양성의상실 생명유지기능의상실 A= 사용토지의면적 t= 점유시간 fnpp= free Net Primary Production ɑ= m 2 당식물종의수 ini= 간섭전상태 fin= 간섭이끝나고회복기간후최종상태 act= 간섭동안의상태 ref= 토지사용지역의가장자연에가까운기준상태

230 그림 3.2 Lindeijer 의방법에따른토지사용면적의변형및점유효과 가뭄 가뭄 은지하수고갈, 확장된배수로로인한물부족현상때문에야기되는환경문제이다 기후변화 기후변화 는인위적인배출이대기중복사강제력에미치는영향이다. 이배출의대부분은복사강제력을확대시키고지구표면의온도를상승시킨다. 이것은온실효과라고도부른다. 많은전과정평가방법론에서잠재적지구온난화혹은온실효과는복사열의