질병관리본부_학술연구용역사업_최종결과보고서_최종_pdf.hwp

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정철 구
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1 학술연구용역사업 최종결과보고서

2 주 의 1. 이보고서는질병관리본부에서시행한학술연구용역사업의최종결 과보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시질병관리본부에서시행한 학술연구용역사업의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개 하여서는아니됩니다.

4 질병관리본부학술연구용역사업최종결과보고서 과제명 결핵및주요비결핵항산균의혈청학적감별진단검사키트개발 수행기관 / 연구책임자 충남대학교산학협력단 / 김화중 발주부서 결핵 호흡기세균과 - 4 -

5 210 mm 297 mm ( 일반용지 60g/ m2 ( 재활용품 )) 목 차 Ⅰ. 연구개발결과요약문 ( 한글 ) ( 영문 ) Ⅱ. 학술연구용역사업연구결과 제 1 장최종연구개발목표 제 2 장최종연구개발내용및방법 제 3 장최종연구개발결과 제 4 장연구결과고찰및결론 제 5 장연구성과및활용계획 제 6 장기타중요변경사항 제 7 장연구비사용내역 제 8 장첨부서류

6 과제명 중심단어 결핵및주요비결핵항산균의혈청학적감별진단검사키트개발 결핵, 결핵균, 비결핵항산균, 면역진단, 단백체분석, 진단항원 주관연구기관충남대학교산학협력단주관연구책임자김화중 연구기간 선별된결핵균및 MAC 항원과기타유의성이있다고생각되는단백항원에대한재조합단백질을대장균발현하고대량정제하였다. 38 kda와 HspX와유사한진단적인유의성을나타내는 5종 ( 117명의혈청을이용하여 19종의항원에대한 chip-based microarray와 경재적인측면과결과판독의용이성측면을고려하면가장적합한진단시스템은 ELISA방법이라고판단하였다. 개개인의항체반응분석을통해 5가지경우의조합항원을선별할수있었다

7 Title of Project Key Words Tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, Nontuberculous Mycobacteria, Immunodiagnosis, Proteomics, Diagnostic antigens Institute Chungnam National University Project Leader Hwa-Jung Kim Project Period

8 학술연구용역사업연구결과 제1장최종연구개발목표 1.1 목표 ( 가 ) 국내결핵발생현황 전세계적으로결핵은연간 800만명의신환자가발생하고매년 200만이사망함. 1993년 WHO 는결핵을 global emergency" 로선포하였음. 최근 HIV 감염의증가와결부되어결핵과 NTM 질환이증가되고있음. 국내결핵사망률과발생률은 OECD 가입 30개국가중에서 1위임 2009 년주요 OECD 가입국결핵발생률및사망률 국가명발생률 (10 만명당 ) 사망률 (10 만명당 ) 한국 일본 미국 캐나다 멕시코 그리스 헝가리 프랑스 포르투칼 스페인 스위스 영국 터키 뉴질렌드 우리나라는지난 50 여년간국가결핵관리사업으로결핵이 2000 년이전까지급격히감소하 였지만최근들어신환자발생률이최근 5 년동안매년 35,000 명정도로더이상감소하지 않고있음 ,010 30,687 31,503 35,269 35,361 34,710 34,157 34,845 28,039 26,940 27,947 30,098 30,371 29,705 28,344 28,922 11,345 10,976 11,501 11,638 11,513 10,927 11,048 11,285 3,971 9,747 3,556 5,171 5,044 5,005 5,813 6,

또한결핵환자연령별분포를보면 60세이상에서가장높고 20대에서 2번째로높은 3차함수적모형으로후진국형분포양상을나타내고있음. 외국인노동자의증가, 고령화사회로의전환은우리나라결핵문제가더욱심각해질수있음. 최근다제내성결핵 (MDR-TB) 과광범위내성결핵 (XDR-TB) 이증가되고있어결핵문제가더욱심각해지고있음.

( 나 ) NTM (nontuberculous mycobacteria) 감염질환의증가 국내에서는 1980년대초반까지는임상적으로분리된마이코박테리아의 98% 가결핵균이었으나, 1990 년대이후 NTM이분리되는비율이증가하여현재 NTM이차지하는비율은약 10% 임.

결핵과 NTM 질환은서로치료방향과약제가다르기때문에항산균도말양성, 배양양성이라도결핵균과 NTM의감별이반드시필요함. NTM으로인한질환은폐질환, 림프절염, 피부질환, 파종성질환등 4가지특징적인임상증후군으로분류됨. 이중폐질환은 NTM으로인한질환의 90% 이상을차지하는가장흔한형태임.

9 또한결핵환자연령별분포를보면 60세이상에서가장높고 20대에서 2번째로높은 3차함수적모형으로후진국형분포양상을나타내고있음. 외국인노동자의증가, 고령화사회로의전환은우리나라결핵문제가더욱심각해질수있음. 최근다제내성결핵 (MDR-TB) 과광범위내성결핵 (XDR-TB) 이증가되고있어결핵문제가더욱심각해지고있음. 결핵발병문제의이같은심각성에도불구하고진단율이매우낮다는데문제가심각함. 현재전세계적으로결핵환자의 50% 는진단되지못하여적절한치료가되지않고있다고추정됨. ( 나 ) NTM (nontuberculous mycobacteria) 감염질환의증가 국내에서는 1980년대초반까지는임상적으로분리된마이코박테리아의 98% 가결핵균이었으나, 1990 년대이후 NTM이분리되는비율이증가하여현재 NTM이차지하는비율은약 10% 임. 따라서과거에는항산균도말양성은모두결핵으로간주되었었지만최근 NTM 폐질환의빈도가증가하면서항산균도말양성을모두결핵으로간주할수없게되었음. 미국의경우, 특정지역에서는항산균도말양성의 50% 이상이 NTM인곳도보고되고있음. 우리나라도최근 NTM 질환이계속증가추세이고향후더증가할것으로예상되고있음. 결핵과 NTM 질환은서로치료방향과약제가다르기때문에항산균도말양성, 배양양성이라도결핵균과 NTM의감별이반드시필요함. NTM으로인한질환은폐질환, 림프절염, 피부질환, 파종성질환등 4가지특징적인임상증후군으로분류됨. 이중폐질환은 NTM으로인한질환의 90% 이상을차지하는가장흔한형태임. NTM 폐질환을일으키는원인균의분포는국가에따라그리고국가내에서도지역에따라다양함. 미국과일본에서 NTM 폐질환의가장흔한원인균은 Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC) 로 60-80% 를차지하며, M. kansasii가두번째로흔한원인균으로 15-20% 를차지함. M. abscessus, M. fortuitum, M. chelonae 등 rapidly growing mycobacteria는폐질환원인균의 5% 미만을차지하는상대적으로드문원인균임. 국내에서도 MAC이가장흔하고, 외국과달리 M. abscessus 가두번째로흔한원인균이며, 미국과일본에서두번째로흔한 M. kansasii 폐질환은국내에서는 - 5 -

10 매우드물게발생하고있음. NTM에의한폐질환은임상증상이복잡하고치료도감염균종에따라다양하며다제병합요법으로 18-24개월간의치료가필요함. 따라서결핵과 NTM 폐질환의신속한감별진단은감염의차단뿐만아니라치료제선택을위해서도중요한관건이되고있음. ( 다 ) 결핵의효율적인퇴치전략 결핵의근본적인퇴치를위해서는 BCG를대체할수있는백신개발이나새로운항결핵제개발이지만연구하기가어렵고, 기간도오래걸리며, 많은연구비를필요로함. 일차결핵은적합한화학요법제로 6개월간치료하면잘치유되는감염질환임을감안하면현재의결핵관리전략은활동성결핵환자를조기에발견하여치료함으로써결핵의전파를차단하는것임. 현재다수를대상으로하는결핵검진은흉부방사선촬영에의존하고있음. 촬영기기의필요성과비용적인측면에서효율성이떨어짐. 가장이상적인진단방법 : 신속하고경제적이며, 복잡한기구나시설이필요없고누구나쉽게할수있어야함. 이러한조건을가장잘충족하는방법은혈청학적방법과같은면역학적인방법임. 그러나세균학적방법을대체할수있는특이도와민감도를만족시키는결핵의면역학적진단방법이없음. 결핵의효율적인퇴치전략 : 조기진단법개발 ( 라 ) 결핵진단법의종류와제한점 결핵의진단방법은 1 결핵균검출, 2 DNA 나항원같은균체성분검출, 3 결핵균에대한체 액성면역반응과세포매개면역반응검사로분류할수있음

현재결핵의확진법은세균학적인방법이지만도말검사는민감도가낮고 (40-60%), 배양검사는 4-8주가필요하기때문에조기진단에적합하지않음 ( 아래표참고 ) PCR과같은분자생물학적인방법은신속하게진단할수있는방법이지만폐외결핵이나도말음성인가검물의경우는민감도가떨어지고가격이비싸다수를대상으로하는건강검진에는적용할수없음.

11 현재결핵의확진법은세균학적인방법이지만도말검사는민감도가낮고 (40-60%), 배양검사는 4-8주가필요하기때문에조기진단에적합하지않음 ( 아래표참고 ) PCR과같은분자생물학적인방법은신속하게진단할수있는방법이지만폐외결핵이나도말음성인가검물의경우는민감도가떨어지고가격이비싸다수를대상으로하는건강검진에는적용할수없음. 최근개발된 IFN-γ 검사는결핵피부반응검사보다특이도가높다고알려져있지만아직민감도측면에서다양한결과가보고되고있어국내에서는그유용성이명확히입증되지않았음. 결핵의혈청학적진단법은간편하고경제적이지만임상에적용하기위해서는다양한진단항원개발이선행되어야함. 결핵진단법의장 단점 ( 마 ) 결핵의면역혈청학적진단법개발의새로운접근전략 면역혈청학적진단법은쉽고간편하고경제적이기때문에가장기대가되는진단법중의하나임. 그러나몇개의혈청학적인진단법이개발되어있지만임상에서사용할수있을정도의민감도와특이도를만족시키는방법은없음. 혈청학적인진단법개발의가장큰장벽은개인간의면역반응의다양성임. 이로인해 1-2개 - 7 -

이에본연구자는복잡한결핵균항원을다단계분획화로 200여개의분획으로나눈후에 dot-blot array를통해유의항원을탐색하여다수의항원을확보하였음.

12 의항원으로는민감도를충족시킬수없음. 따라서진단적인유의성이있는다양한특성인자발굴이필수적임. 그러나결핵항원계의복잡성즉조건에따라차등발현되는결핵항원의다양성, 특수성으로단순한 2-DE와같은단편적인분석만으로는유의성있는많은항원을동정할수없음. 이에본연구자는복잡한결핵균항원을다단계분획화로 200여개의분획으로나눈후에 dot-blot array를통해유의항원을탐색하여다수의항원을확보하였음. 발굴된항원의유전자재조합단백질을확보하고진단적인유의성을파악하고최종적으로는가장적합한진단시스템을도입 / 평가분석을통해진단키트를개발하는전략이가장중요한핵심임. 보다확실한키트개발을위해서는새로운항원을탐색하고진단시스템에사용된항원을교체하거나추가하는지속적인노력또한필요함. ( 바 ) 면역혈청학적진단법개발을위한적합한시스템. 민감도측면에서 20 여종의항원을사용한다고전제하면개발가능한진단시스템은 3 가지로 생각해볼수있음

ELISA - 20여종개개항원에대한항체가를측정하거나 3-4개의항원을조합하여항체가를측정하는방법이있음. - 항체가측정은비교적간편하고 cut-off value를이용하여양성또는음성으로판정할수있음. - 그러나다수의항원에대한반응패턴을분석하고유의성을평가하기가쉽지않음. Rapid strip - 20여종항원모두에대한 rapid strip을개발하는것은제한점이있음.

13 ELISA - 20여종개개항원에대한항체가를측정하거나 3-4개의항원을조합하여항체가를측정하는방법이있음. - 항체가측정은비교적간편하고 cut-off value를이용하여양성또는음성으로판정할수있음. - 그러나다수의항원에대한반응패턴을분석하고유의성을평가하기가쉽지않음. Rapid strip - 20여종항원모두에대한 rapid strip을개발하는것은제한점이있음. - 진단적인유의성이가장높은항원 5종을선택하여개발할필요성은있다고생각됨 개의항원을조합하여하나의 strip으로제작하는것은항원간또는항체반응을서로간섭할우려가있음. Protein chip based microarray - 면역혈청학적인진단은개개항원에대한양성또는음성판정보다는반응유형을분석하여진단하는것이보다타당할것으로생각됨. - 측정항원이많아도항체반응을한번에측정하는것이가능함. - 따라서 microarray 기법은이러한반응유형을분석하는데가장큰장점이있음. - 그러나 cut-off 값을정하기가어렵고가격이높아질수있다는단점이있음. 결핵및 NTM 폐질환의진단을위해발굴된지표물질을생산하고이를활용한면역혈청학적인 진단법개발 새로운진단법개발을위해서각발굴항원의진단적유의성평가가필수적임. 이를위해서는다양한유형의결핵및 NTM 폐질환환자의임상검체와임상자료확보가가장중요함. 검체수집과임상정보 DB구축을위한임상연구팀은결핵과 NTM 폐질환을 10여년이상치료해온경험이있는호흡기내과교수가참여할예정임

14 단백체분석을통한지표물질발굴팀은본연구책임자가담당하고결핵균과 NTM 중에서 MAC 의단백체분석 / 분획, dot blot microarray 기법을이용하여 2년간발굴된새로운항원과기존항원들을이용하여최적의진단후보항원을선별할예정임. 최종적으로는신속진단시범키트를개발하여일차적인유용성평가를수행할예정임. Protein-chip microarray는본연구팀의박사과정생이한국생명공학연구소의전문가팀에합류하여수행할예정임. 개발된키트의임상적인유용성은모든연구원이참여하여결정할예정임. 결핵과 NTM 폐질환의임상정보및질병유형과임상단계별검체확보와 DB 구축 - 검체수집대상 : 활동성결핵, NTM 폐질환 (MAC 폐질환, M. abscessus 폐질환 ), 잠복결핵, 결핵비감염대조혈청, 완치결핵 - 연구기간내검체수집예정건수 : 각각 30건씩총 150건 - 환자임상정보 : 인구학적자료, 결핵발병력, BCG 접종력, 결핵의진단법, 질병의중증도, 면역억제상태여부, 치료반응평가 결핵과주요 NTM 폐질환을진단할수있는지표물질의선정과생산 : 5종의항원선정 - NTM 폐질환진단용단백항원의대량생산과평가 - 선별된결핵항원의대량생산과평가 결핵균과 NTM 항원을이용한진단시스템개발 - Protein chip과칵테일 ELISA의비교평가 개발된키트의평가와최적화 - 키트의임상적인유용성평가 : 블라인드시험병행 - 항원을빼거나추가선정을통해최적의조합

15 1.2 목표달성도및관련분야에대한기여도 (1) 목표달성도

16 (2) 관련분야에대한기여도 본연구과제를통해확립한진단지표물질발굴기법은다른감염질환의면역학적진단법개발분야에핵심적인기술임. 본과제를통해개발된항원은결핵과 NTM 폐질환의면역학적진단을위한항원으로활용 확보된임상검체는새로운항원발굴시평가용검체로활용 개발된항원과진단기법은결핵의혈청학적진단을위한상업화된키트개발에활용 1.3 국내 외기술개발현황 (1) 결핵관련국내외정책현황 결핵의진단법개발은 WHO에서추진하는역점사업이며, 2006년부터 2015년까지결핵퇴치를위한 Global Stop TB plan의핵심사업중의하나임 (Stop TB partnership, WHO. The global plan to stop TB WHO, Geneva, Switzerland, 2006). 우리나라결핵은매년 35,000여명의신환자발생과 3,000여명이결핵으로사망하고있음. OECD 국가중가장심각한수준임. 이에국가에서는결핵문제를주요선진국수준으로낮추기위하여결핵퇴치 2030계획을수립하였고최근에목표를수정하였음. 정책목표는전염성결핵환자의연간발생률을 100만명당현재의 322명에서 2030년까지 10명으로감소시키는것임. 이러한목적을달성하기위한가장중요한점은환자를조기에색출하여치료함으로써전파를차단하는방법임. 결핵및 NTM 폐질환의신속진단은적절한조기치료를위해서필수적이기때문에기존의세균학적방법보다신속하고어디서쉽게할수있으며민감도와특이도가높은새로운면역진단법개발을위한정부차원의연구지원이필요함. (2) 결핵진단법의수요증대 노인인구의증가, 면역억제요법과같은적극적인치료증가등으로잠복결핵의재활성화또는 NTM 균종의기회감염의증가와같은결핵관련보건문제가앞으로증가되리라생각됨. 이에따라결핵진단법수요는급증할것으로생각됨. 최근국내결핵발병률및약제내성률이증가하는경향임. 또한학교, 군대, 등에서결핵집단발병이자주보고되고있으나기존의결핵관리지침으로는이를조절하기가역부족임. 궁국적으로는전염성활동성결핵환자의조기진단및신속치료뿐만이아니라접촉자에서의결핵감염자의정확한진단및예방치료도중요함. 그러나국내에서이를대비한기반연구는매우미흡한실정임. WHO보고에의하면결핵진단시장 (market) 은치료시장보다 2배많음. 전세계적으로결핵진단을위해매년 10억달러를소비한반면항결핵약제시장은 400백만달러로추정됨. (3) 결핵의면역진단법 결핵은결핵균노출 -> 감염 -> 발병의단계를거치기때문에발병자의대부분은잠복결핵상태에서발생하며국내잠복결핵은전국민의약 1/3을차지하는것으로알려져있음. 그러나결핵비감염자, 잠복결핵, 활동성결핵, 결핵완치자등을만족하게구분할수있는면역

17 학적지표들이충분치않은실정임. 과거약 100년간결핵감염을진단하는방법이었던결핵피부반응검사 (tuberculin skin test) 는 BCG 접종에의한위양성, 면역억제에의한위음성등제한점이많으며, 완치된결핵및잠복결핵등을구분할수없는단점이있음. 최근개발된체외인터페론감마검사들은결핵피부반응검사보다특이도가높다고알려져있지만아직민감도에대해서는다양한결과가보고되고있는실정임. 일부국가에서는인터페론감마검사를결핵피부반응검사에대체하여사용하도록권고하기도하지만아직그유용성은명확하게입증되지않았음 (Kang 등, 2005; Lee 등, 2006). 결핵의병태생리를고려할때비감염자, 잠복결핵, 활동성결핵, 완치된결핵등을올바르게구분하는것은결핵을근절하기위해매우중요할것으로생각되나이환자군들을구분하기위한검사법이개발된적이전혀없는실정임. (4) 결핵의면역혈청학적진단법개발현황 임상검체에서항체를측정하는방법은간단하고경제적이며어디서나실시할수있는장점이있음. 또한폐외결핵이나객담을잘얻을수없는소아결핵진단에적합함. 그러나많은노력에도불구하고임상에서적용될수있는특이도와민감도를가진혈청학적결핵진단법이개발되어있지않음. 따라서최근에도진단과관련된많은연구결과가보고되고있음. 그러나 NTM 질환의혈청학적진단과관련된연구보고는전무한편으로본연구주제인결핵과 NTM 폐질환의진단표지발굴에관한연구는경쟁력있는연구로생각됨. WHO/TDR는상품화된키트를평가하였음. 355개의혈청을이용하여 19개 rapid TB test 키트의진단능력을하나의실험실에서측정한결과키트에따라민감도는 1-60%, 특이도는 53-99% 로, 특이도는높지만민감도가낮았음. 특이객담도말음성및 HIV 양성환자에서민감도가낮았음.(WHO, 2008). 상용화된대표적인혈청학적진단키트가아래표와같이개발되어있지만세균학적진단방법을대체할수있을정도의민감도와특이도를만족시키는방법은없음. 전체적으로상품화된 kit의민감도는 15~89%, 특이도는 50~100% 로연구자에따라다양함 (Steingart, 2007; Abebe, 2007)

18 발표된논문을근거로혈청학적진단법의유형과특성을정리하면아래표와같다 (Lange, 2010) 38 kda 항원은균체표면에존재하는당지질단백으로상업화된여러키트에서사용된대표적인항원임 38 kda 항원을사용한 ELISA 검사의감수성은인구집단, 환자의상태에따라 16~80% 임 (Lyashchenko 등, 1996). 특히도말음성인샘플에서민간도낮았음. 상기표의 ICT TB kit의민감도도국가나환자조건에따라다양하여 35~80%. 이들키트를이용하여우리나라결핵환자를대상으로검사한결과는민감도가 73~87% 였음 (Chang 등, 2000). 본연구자가 38 kda항원을사용하여 ELISA로검사한결과도감수성이약 50% 수준이였음. 이와같이민감도가다양한주된이유는 38 kda 항원에대한항체반응이인종간의차이도있지만감염균주에따라 38 kda 항원을발현하는정도에차이가있기때문으로생각됨. 38 kda항원이외에도 30 kda 항원, antigen 60, lipoarabinomannan 과 antigen 90과같은진단용항원이보고되었음. 최근기존에보고된 35개의항원에대한유전자재조합단백을제조하여혈청학적유용성평가를통해몇종의가능성이있는항원을보고하였음 (Chan 등, 2000; Weldingh 등, 2000). 민감도와특이도가높은새로운진단법개발을위해현재에도혈청학적진단법개발에대한연구는기반연구인항원탐색부터키트개발에이르기까지활발히수행되고있음. 세포매개면역반응을이용한진단 marker발굴은항원자극에의한 IFN-γ 생산능을측정하여평가하고있음. 현재 CFP-10과 ESAT-6 항원을사용한제품이개발되어있음. 잠복결핵과활동성결핵을구분할수없고결핵발병률이적은선진국에서잠복결핵을진단하기위해이용되고있음. 따라서다양한종류의면역활성이높은결핵균특이항원발굴이필요함 (Mazurek 등, 2005). (5) 결핵항원의단백체분석과진단 marker 발굴의연구동향 면역학적인진단 kit 개발의핵심은결핵단백의체계적인분석을통한다수의유효항원의발굴임. 진단용특이항원발굴을위해 2-DE나유전자정보분석등을사용하였지만유의성있는항원은소수에불과함. 또한질병의단계에따라특이적인항원발굴에대한연구는미미한상태임. 최근나환자와결핵환자에서 protein microarray를통해혈청학적인 marker 4종류를동정하여보고한바있음 (Groathouse 등, 2006; Sartain 등, 2006). 그러나본연구팀에서는이와유사한방

19 법과보다상세한방법을추가하여 10개이상의새로운항원을동정할수있었음. 62종의결핵단백항원으로부터유래한 7446개의 peptide를사용하여 chip-based microarray를실시한결과유의성이높은 peptide를동정한바있음. 그러나측정한활동성결핵환자 34명, 건강인 35명만을대상으로하였기때문에더많은 case를실시해야확실한결과를얻을수있다고생각됨 (Gaseitsiwe, 2008). 그러나현재까지잠복결핵, 활동성결핵등을감별할수있는 marker가없는상태임

20 제 2 장최종연구개발내용및방법 2.1 결핵과 NTM 폐질환의임상정보, 임상단계별검체확보및 DB 구축 증례기록지증례번호 : 이름 : 병록번호 : 나이 :, 성별 : 진단명 : ( 활동성결핵, NTM 폐질환, 잠복결핵감염, 결핵비감염, 완치결핵 ) * 결핵감염은 TST 10mm 기준 (BCG, 면역억제상태와무관 ). 과거결핵치료력 ( 유, 무 ) " 유 " 인경우간략히기술 : 기저질환 : 면역억제상태 ( 예, 아니오 ), " 예 " 인경우기술 BCG 접종력 ( 예, 아니오, 모름 ), BCG scar ( 있음, 없음, 확인못함 ) 치료시작일시 :, 치료종료일 : 치료결과 ( 활동성결핵의경우만해당 ): 진단방법 : ( 균배양, TB-PCR, 조직, 임상 ) 폐결핵인경우 : 객담항산균도말 ( 양성, 음성 ), 공동 ( 있음, 없음 ) 방사선학적중증도 (Min, MA, FA) 비결핵항산균폐질환인경우 Fibrocavitary type vs nodular bronchiectatic type 원인균 ( ) TST: ( )mm, 시행일시 ( ) LTBI, 결핵비감염의경우는필수시행. 인터페론감마검사 ( ) 결과 ( 양성, 음성 ), 시행일시 ( )

21 2.2 결핵과 NTM 폐질환을진단할수있는지표물질의선정과생산 μ

22 2.3 결핵균과 NTM 항원을이용한진단시스템개발 μ μ μ μ μ

23 2.4 개발된키트의평가와최적화

24 제 3 장최종연구개발결과 3.1 결핵과 NTM 폐질환의임상정보와임상단계별검체확보및 DB 구축

25 Figure 1. Computer screen for DB construction of clinical information of study subjects

26 3.2 결핵과 NTM 폐질환을진단할수있는지표물질의선정과생산 No Gene name Protein MW(kDa) 1 Rv2031c HspX Rv0934 PstS Rv0815c CysA2: thiosulfate sulfurtransferase Rv2220 Glutamine synthase GlnA Rv S ribosomal protein S Rv2005c Hypothetical protein Rv3292 Hypothetical protein Rv1605 Imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisF Rv3593 Lipoprotein LpqF Rv0244c Acyl-CoA dehydrogenase Rv0753c mmsa MAV4300 sdhb MAV1683 Hypothetical protein MAV0892 Peptidase, M24 family protein Rv2156c MurX

27 Figure 2. SDS-PAGE analysis of purified recombinant proteins * Cutoff vale = (Mean + 2SD of control value)

28 Figure 3. Purified recombinant proteins

29 Figure 4. Comparison of CFPs from M. avium (lane 1), M. bovis BCG Tokyo (lane 2), M. tuberculosis K-strain (lane 3), and M. tuberculosis H37Rv (lane 4)

$IgG antibody titers to each fractionated fraction Active TB (n=24) MAC pts (n=32) Non-infected Control (n=36) Mean±SD Sensitivity (Positive No) Mean±SD Sensitivity (Positive No) Mean±SD Specificity$

30 Figure 5. Partially purified major proteins of M. avium from CFP. Table 5. IgG antibody titers to each fractionated fraction Active TB (n=24) MAC pts (n=32) Non-infected Control (n=36) Mean±SD Sensitivity (Positive No) Mean±SD Sensitivity (Positive No) Mean±SD Specificity (positive No) F1 0.24± (6) 0.42± (20) 0.12± (2) F2 0.28± (5) 0.27± (6) 0.17± (2) F3 0.19± (9) 0.27± (16) 0.08± (2) F4 0.28± (6) 0.34± (11) 0.13± (3) F5 0.29± (8) 0.39± (13) 0.12± (2) Cutoff vale = Mean + 2SD of control value F1:0.270, F2:0.373, F3:0.178, F4:0.334, F5:

31 Figure 6. SDS-PAGE analysis of purified recombinant proteins

32 Active TB (n=24) Sensitivity Mean±SD (Positive No) MAC pts (n=32) Sensitivity Mean±SD (Positive No) Non-infected Control (n=38) Specificity Mean±SD (positive No) MAV_ ± (6) 0.65± (18) 0.16± (3) MAV_ ± (6) 0.24± (7) 0.15± (3) Cutoff vale = Mean + 2SD of control value, MAV_2054: 0.332, MAV_2052: 결핵균과 NTM 항원을이용한진단시스템개발 질병유형분류에필요한환자임상정보모집단수분류방법 활동성결핵 (168명) 도말양성 / 배양양성도말음성 / 배양양성도말음성 / 배양음성도말음성 / 배양시행안함도말및배양시행안함 42명 92명 29명 1명 4명 1. 도말또는배양양성 (134명) 2. 도말및배양음성 (29명) NTM폐질환 (134명) 잠복결핵 (52명) 비감염자 (83명) 치료종결환자 TST 양성 (27명) TST 음성 (43명) TST시행안함 (64명) TST 양성 TST 음성 IGRA 양성 IGRA 음성시행안함 IGRA 양성 IGRA 음성시행안함 IGRA 양성 IGRA 음성시행안함 IGRA 양성 IGRA 음성기타 IGRA 양성 IGRA 음성 IGRA 중간시행안함 11명 12명 4명 9명 26명 8명 1명 5명 58명 19명 24명 9명 8명 68명 3명 4명 1. TST 양성 (27명) 2. TST 음성 (43명) TST 또는 IGRA 양성 (37명) 2. TST 및 IGRA 음성 (26명) 1. IGRA 양성 (19명) 2. IGRA 음성 (24명) 1. IGRA 양성 (8명) 2. IGRA 음성 (68명) 1. 치료전 (60 명 ) 2. 치료후

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35 Turky's Multiple comaprison test) *p<0.05, ** P<0.01, ***P<

36 * * * *p<0.05, ** P<0.01, ***P<

37 * * *p<0.05, ** P<0.01, ***P<

38 - 34 -

39 ** ** * ** ** ** * *p<0.05, ** P<0.01, ***P<

40 *** * ** * *** *** * * *p<0.05, ** P<0.01, ***P<

41 Figure 7. Location of antigens spotted on microslide

42 Table 16. Sera used for chip-based microarray Group Classification Subjects No tested 활동성결핵 NTM 폐질환잠복결핵결핵비감염 도말양성 / 배양양성 18 도말음성 / 배양양성 14 TST양성 /IGRA양성 9 TST만양성 9 TST음성 /IGRA음성 13 TST양성 /IGRA양성 15 TST만양성 12 TST음성 /IGRA음성 22 IGRA만양성

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46 Figure 10. Pattern of antibody response to each antigen before and after treatment in same subjects

47 Table 17. Sera used for dot-blot array Group Classification Subjects No tested 활동성결핵 NTM 폐질환잠복결핵결핵비감염 도말양성 / 배양양성 19 도말음성 / 배양양성 14 도말음성 / 배양음성 13 TST양성 /IGRA양성 9 TST만양성 8 TST음성 /IGRA음성 13 TST양성 /IGRA양성 14 TST만양성 12 TST음성 /IGRA음성 15 IGRA만양성 치료종결

48 Figure 12. Results of dot-blot array

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50 Figure 13. Pattern of antibody response to each antigen before and after treatment in same subjects

51 3.4 개발된키트의평가와최적화 Figure 14. Comparison between chip based microarray and dot blot array

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65 제 4 장연구결과고찰및결론

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67 제 5 장연구성과및활용계획 5.1 활용성과 과제명결핵및주요비결핵항산균의혈청학적감별진단검사키트개발 과제책임자 김화중 / 충남대학교산학협력단 / 미생물학전공 번호논문제목저자명저널명집 ( 권 ) 페이지 Impact factor 1 국내 / 국외 SCI여부 번호발표제목발표형태발표자학회명연월일발표지 1 국내 / 국제 번호출원 / 등록 1 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국출원 ( 등록 ) 번호 IPC 분류 기타관련정책에활용예를구체적으로기술함. 타연구및차기연구에활용된예를구체적으로기술함. 언론홍보및대국민교육내용, 일자등을간략히기술함. 임상시험, 관련 DB 구축, 워크샾또는심포지움개최등의경우구체적으로기술함

68 5.2 활용계획 1 대상자들의 DB를구축하여임상자료와함께타연구자료로활용. 2 투베르쿨린검사뿐만이아니라인터페론감마검사를동시에시행하여결핵감염여부에따라대상자를구분하는데더유리. 3 NTM 질환자도결핵감염자와비감염자로구분하여분석할수있는장점. 4 결핵, 잠복결핵, NTM 질환을구분할수있는임상진단법의유용성평가시활용가능. 1 칵테일키트개발을위한항원으로사용 2 세포매개면역반응분석에활용하여새로운진단항원으로서의가능성을평가 제 6 장기타중요변경사항 처음선정시와비교하여변경된내용을명시

69 제 7 장연구비사용내역 단위 원 구 분 비 목 금액구성비비고 인건비소계 22,700, % 책 임 연 구 원 연 구 원 연 구 보 조 원 보 조 원 2,000,000 20,700, % 25.9% 경비소계 53,500, % 여 비 220, % 유 인 물 비 전 산 처 리 비 시약및연구용재료비 회 의 비 임 차 료 교 통 통 신 비 감 가 상 각 비 위 탁 정 산 수 수 료 80,000 52,693, ,320 7, , % 65.9% 0.1% 0.0% 0.5% 일반관리비 이윤 3,800, % 계 80,000, % 질병관리본부학술및전산용역사업편람에따라구체적으로작성하시기바랍니다

70 제 8 장참고문헌 Lee KS et al, Identification of proteins induced at hypoxic and low ph conditions in Mycobacterium tuberculosis H37Rv. J Bacteriol Virol 2006;36: Kitada S et al., Serodiagnosis of pulmonary disease due to Mycobacterium avium complex with an enzyme immunoassay that uses a mixture of glycopeptidolipid antigens. Clin Infect Dis 35: , 제 9 장첨부서류 본학술연구용역사업의성과로기술된게재된학술지논문전체사본 ( 게재허가를받은경우게재 증명서 ) 과산업재산권등록증 ( 또는출원서 ) 사본을반드시첨부할것

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- 1 - - 1 - 목 차 - 2 - 과제명 중심단어 β 주관연구기관 연구기간 β β β β β - 1 - Title of Project Key Words Prion, Neurodegenerative disease, biomarker, β-amyloid, albumin Institute Kyungwon University Project Leader Seong Soo