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경순 승
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1 Korean Chem. Eng. Res., 53(6), (2015) PISSN X, EISSN 다양한용매에서 Soxhlet 추출기를이용한감귤껍질에서 d-limonene 추출의최적조건연구 박상민 고관영 김인호 충남대학교화학공학과 대전광역시유성구대학로 99 (2015 년 3 월 10 일접수, 2015 년 4 월 17 일수정본접수, 2015 년 4 월 21 일채택 ) Optimization of d-limonene Extraction from Tangerine Peel in Various Solvents by Using Soxhlet Extractor Sang Min Park, Kwan Young Ko and In Ho Kim Department of Chemical Engineering, Chungnam National University, 99 Daehak-ro, Yuseong-gu, Daejeon 34134, Korea (Received 10 March 2015; Received in revised form 17 April 2015; accepted 21 April 2015) 요 약 감귤류의과일내에포함된것으로알려진 d-limonene 성분은정유성분을추출하여분리하는방법으로얻을수있다. 연속증류추출법중하나인 Soxhlet 추출법을사용하여감귤껍질의정유성분을추출한후, 역상 HPLC 를통해정량분석을하였다. 추출용매의끓는점과극성도가수율에주는영향을알아보기위해에탄올, n- 헥산, 석유에테르 3 가지용매를추출용매로사용하였다. 120 o C 에서각각의용매를 1, 2, 4 시간동안추출했을때의시료를얻어총 9 가지시료를분석하였다. 역상 HPLC 에서정량분석을한결과, 세가지용매모두 2 시간동안추출했을때 d-limonene 의함유량이가장많았으며, 이때감귤껍질 1 g 당함유량은 7.77 mg( 에탄올 ), 0.49 mg(n- 헥산 ), 0.28 mg( 석유에테르 ) 였다. 에탄올을사용했을때수율이가장높은것으로보아용매의극성도가끓는점보다추출효율에더큰영향을미치는것을알수있었다. Abstract D-limonene included in citrus fruits is obtainable to extract essential oil as well as separate the oil ingredient. Soxhlet extraction, a type of SDE (Simultaneous steam Distillation and solvent Extraction), was used to extract limonene from tangerine peel. HPLC analysis was performed to quantify extracted d-limonene by using reversed-phase HPLC column. Results of HPLC analysis showed that the optimal extraction time was 2 hours in any solvent, and the extracted amounts of d-limonene in tangerine peel (per g tangerine peel) were 7.77 mg, 0.49 mg, and 0.28 mg in ethyl alcohol, n- hexane, and ether. Because yield was the highest in using ethyl alcohol as a solvent, polarity is stronger factor to effect on yield of extraction than boiling point. Key words: Tangerine Peel, d-limonene, Soxhlet Extraction, HPLC 1. 서론 우리가섭취하는감귤류의과일들은서로비슷한특유의향을가지고있다. 이는과일껍질속에존재하는 limonene 성분때문이다. Limonene은무색투명한천연성분으로, 방향성을갖는비극성분자이다. 대표적인모노테르펜탄화수소이고, d-limonene 및 l-limonene 두가지의광학이성질체가존재한다 [1,2]. 특히두이성질체중 d- limonene은상쾌한향과인체에대한무독성때문에향수, 방향제, To whom correspondence should be addressed. ihkim@cnu.ac.kr 이논문은공주대학교박균영교수님의정년을기념하여투고되었습니다. This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 비누등의화장품과식품산업등에널리사용되고있고, 최근에는중추신경의흥분을진정시켜주고항암작용이있는것으로밝혀졌다 [3,4]. d-limonene은감귤류의과일내에포함된정유성분을추출후분리하여얻을수있다. 정유성분은특히과일의껍질에다량함유되어있어감귤껍질에서정유성분을추출하는것이효율적이며, 감귤껍질에포함된정유성분의 70~90% 가 d-limonene에해당된다. 실제로정유성분추출과 d-limonene의분리에대한연구와이들의생리기능활성에대한평가및연구가활발히진행되고있다 [5]. 일반적으로원료에서정유성분을추출하는방법은침지법, 용매추출법, 연속증류추출법, 초임계추출법등이있다 [6]. 그중연속증류추출법을사용하면정유성분이적게함유된식품이라도짧은시간에높은수율로정유성분을얻을수있다. 연속증류추출법을사용하였을때다른추출방법들에비해 d-limonene 함량이평균적 717

2 718 박상민 고관영 김인호 Fig. 1. Diagram of soxhlet extractor. 으로 65.31% 로가장많다는연구결과도있다 [7]. 연속증류추출법중하나로, Soxhlet 추출기를이용한추출법은소량의용매를반복적으로증류-액화시키면서고체원료에서지방성분을추출할수있도록고안된방법이며추출용매, 추출시간에따라추출정도가달라진다. 일반적인 Soxhlet 추출기의모식도를 Fig. 1에나타내었다. HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) 는 d-limonene과같은비극성물질을분석하게용이한장치이다. 용매에녹일수있는물질이라면비휘발성이거나열적안정성에무관하게분석이가능하고, 고압을극복하여높은용매유속을이용할수있는분석기기이다 [8,9]. 그중역상 (reversed-phase) HPLC는극성을띠는이동상과비극성을띠는고정상컬럼을사용하는 HPLC 분석방법으로, 분리하고자하는물질이포함된혼합물구성성분들의극성도의차이를이용해고정상에흡착되는시간을다르게하여분석한다 [7]. 본연구에서는 Soxhlet 추출기에서극성도가서로다른에탄올, 헥산, 석유에테르 3가지용매를사용하여 1시간, 2시간, 4시간동안각각추출시간을바꾸며일정량의감귤껍질을추출하였다. 그리고 d- limonene 추출의효율성및경제성을비교하기위한역상 HPLC의최적의분석조건을찾고, 감귤껍질로부터추출한시료들을 HPLC 에서정량분석하여가장효율적으로 d-limonene을추출할수있는최적의용매와추출시간을알아보았다. 하였다. 표준용액제작에사용된표준시약은순도 97% 의액상 (R)- (+)-Limonene (Sigma, USA) 이다. d-limonene이비극성물질이므로, 이를희석하기위한비극성용매는 n-헥산 (Duksan Chemistry, Korea) 을사용하였다. d-limonene 표준시약을 0.006, 0.032, 0.064, ml 만큼각각측정한후 n-헥산 40 ml에희석하여 1 mm, 5 mm, 10 mm, 15 mm의표준용액을만들었다. 표준용액및시료을분석하기위한 HPLC 장치를구성하였다. 이동상을컬럼에흘려보내는펌프로 110B Solvent Delivery Module (Beckman, Germany) 을사용했다. Automated Switching Valve (Millipore, USA) 를이용하여 ULTRAMEX-C18 ( cm, 5 μm) 컬럼에시료를주입하였다. 이때컬럼의온도를일정하게유지시키기위해 BAS LC-22C Temperature Controller (SpectraLab Scientific Inc., Canada) 을사용하였다. 컬럼을통과한시료를 UV-detector 장치인 783A Programmable Absorbance Detector (Applied Biosystem, USA) 를통해전기적신호를받고, Autochro Data Module (Younglin Instrument, Korea) 과 Autochro 2000 (Younglin Instrument, Korea) 프로그램을사용하여전기신호를디지털신호로바꾸어 PC 화면으로크로마토그램을확인하였다. d-limonene을분석하기용이한이동상을찾기위해 4번에걸쳐용매종류와부피비를변경하였다. 첫번째로 n-헥산과에탄올 (Duksan Chemistry, Korea) 의 90:10[10], 두번째는메탄올 (Samchun Chemical, Korea) 과증류수 75:25로섞은용매 [11], 세번째와네번째는메탄올과증류수를각각 85:15 및 80:20으로혼합한용매를사용하였다. 펌프의유량은 1.0 ml/min, 컬럼온도는 25 o C, 시료용량은 20 μl, UV 파장은 200 nm로일정하게유지시켰다. 적합한용매를결정한후 1 mm, 5 mm, 10 mm, 15 mm 표준용액을분석하여표준 d-limonene 을정량분석할수있는검량선을얻었다. 2. 실험방법 2-1. HPLC를이용한표준 d-limonene 분석표준 d-limonene의정량분석을위해 d-limonene 표준용액을제작 Fig. 2. Scheme of obtaining samples from tangerine peel by soxhlet extraction.

3 다양한용매에서 Soxhlet 추출기를이용한감귤껍질에서 d-limonene 추출의최적조건연구 감귤껍질추출조건과방법및분석감귤껍질로부터 d-limonene을추출하기위해국내제주도산감귤을사용하였다. 보관온도를약 4 o C로유지시켜냉장보관했으며, 최대한오염이되지않은상태로유수분이있는원래의상태를유지시킨상태에서과육으로부터껍질을분리하고즉시실험에이용하였다. 환류냉각장치와 heating mantle (Taisite, China), Soxhlet 추출기 (Duran group, Germany) 를추출장비로구성하였다. 감귤껍질추출과정을 Fig. 2에모식도를나타냈다. 감귤껍질 40 g을표면적을크게하기위해약 1 1 cm 크기로자르고, filter paper (Whatman, UK) 를 Soxhlet 추출기의추출관내부에펴서넣어그위에감귤껍질을채웠다. d-limonene을추출하기위한용매는유기용매가주로사용되었다 [6]. 본연구에서는극성도 (polarity) 와끓는점의차이에의한추출정도알아보기위해추출용매를에탄올 (Duksan Chemistry, Korea), n-헥산 (Duksan Chemistry, Korea), 석유에테르 (J. T. Baker, USA), 세가지를사용했다. 각용매의극성도와끓는점을 Table 1에정리하였다 [12]. Table 1. The polarity and boiling point of three solvents Solvent Polarity Boiling point ( o C) ethyl alcohol n-hexane petroleum ether 에탄올과나머지두용매의결과를비교하여극성도에대한효율차이를알수있고, 극성도가같은 n-헥산과석유에테르를비교함으로써끓는점에대한차이를알수있다. 세가지용매모두 200 ml를측정하여 Soxhlet 추출기의둥근플라스크에담아추출용매로사용하였고, 추출온도는 heating mantle을이용해플라스크를가열하여 120 o C로일정하게유지시켰다. 2시간동안추출한선행연구를바탕으로 [6] 추출시간에따라수율의차이를알아보기위해추출시간을 1시간, 2시간, 4시간으로하였다. 각용매당 3회에걸쳐총 9가지의추출시료를얻었다. 그이후엔앞서결정된 HPLC 분석조건을이용하여 9가지의추출시료에대해각각정량분석하였다. 3. 결과및고찰 3-1. d-limonene 표준용액분석이동상조건을변경하며 d-limonene을분석한결과를 Fig. 3에나타내었다. 용매를결정하는과정에서모두 5 mm 표준용액을사용하였다. 또한이동상조건변경에따른용매의극성도를계산하여 Table 2에나타내었다 [12]. Fig. 3A는극성도 0.61의 n-헥산-에탄올 (90:10, v/v) 이동상, UV 파장 200 nm에서 d-limonene 표준용액을분석한결과이다. 하나의단일피크가발생했고, 머무름시간은 2~3분으로짧은시간내에 d-limonene이용출되었다. 그러나분석에사용된 Fig. 3. Chromatograms of standard d-limonene solutions according to different HPLC mobile phases; (A) 90% n-hexane, (B) 75% methyl alcohol, (C) 85% methyl alcohol, and (D) 80% methyl alcohol.

4 720 박상민 고관영 김인호 Table 2. The polarity of each mobile phase composition Solvent composition Polarity (1) n-hexane-ethyl alcohol (90:10, v/v) 0.61 (2) methanol-water (75:25, v/v) 7.20 (3) methanol-water (85:15, v/v) 6.96 (4) methanol-water (80:20, v/v) 7.08 d-limonene 표준시약의순도가 97% 임에도불구하고나머지 3% 의불순물피크와 d-limonene 피크가분리되지않아분석하기어렵다고판단하였다. Fig. 3B는극성도 7.20의메탄올- 증류수 (75:25, v/v) 이동상조건으로 d-limonene 표준용액을분석한결과이다. 머무름시간 10분이전에불순물피크가검출되었고, 머무름시간 32분에서 d- limonene의단일피크가검출되었다. 이동상의극성도에따른검출시간차이는이동상의극성도가높을수록비극성인고정상과비극성인시료의결합력이이동상과시료의결합력보다강하기때문에검출이늦어지는원리이다. 이조건에서는 d-limonene을분리하기에는용이하나불순물피크와의시간차가크기때문에분석시간이길어지는단점이있다. 메탄올- 증류수이동상의조성을 (85:15, v/v) ( 극성도 6.96) 으로변경하여 1mM d-limonene 표준용액을분석한결과를 Fig. 3C에나타내었다. 이경우 d-limonene 피크가머무름시간 12분이지만여러개의작은불순물피크와명확하게분리가안된것을확인할수있다. Fig. 3D는극성도 7.08의메탄올 -증류수 (80:20, v/v) 이동상, 그외의조건은변경하지않은상태에서 5 mm d-limonene 표준용액을분석한결과이다. d-limonene 피크의머무름시간은 19 분으로나와 Fig. 3B의조건보다분석시간이단축되었고, 불순물과의분리도명확하기때문에추출시료를분석하는위한 HPLC 이동상은메탄올과증류수를 80:20으로혼합한용매를선택하였다. 이용매조건에서 d-limonene 농도에따라피크면적을나타내는검량선을얻은결과, 수식은 y(mv s)=6858.4x 이었고, 상관계수 R 2 값은 이었다 용매별추출시료분석 Soxhlet 추출기에서에탄올, n-헥산, 석유에테르를용매로하여귤껍질 40 g을 120 o C에서각각 1시간, 2시간, 4시간동안추출한시료를 HPLC에서정량분석하였다. Fig. 4는에탄올을용매로사용하여 1, 2, 4시간동안추출한시료를 HPLC에서분석한결과이다. 초기에추출시료를분석했을때, d- limonene으로추정되는피크가신호출력범위를초과해서 HPLC 시료를 2배희석한후, 다시분석한결과를나타냈다. 머무름시간을보았을때 2~8분사이에불순물로추정되는많은피크들이나타났고, 표준용액분석결과 (Fig. 3D) 와마찬가지로 19분에단일피크가검출되었다. 세피크를비교했을때피크의폭은모두비슷했으나 1 시간추출시료의피크높이가가장낮게나타났고 2시간추출시료의피크가가장높았다. 4시간추출시료의피크는 2시간의경우보다조금작은피크가검출되었다. 시간별 d-limonene 피크면적을적분한결과, 1시간추출시료의피크면적은 mv s, 2시간추출시료는 mv s, 4시간추출시료는 mv s 이었다. 검량선을통해 d-limonene 농도를추정한결과 7.72, 14.72, mm 이었고, 추출후남은용매의부피를고려하여실제추출량을계산한결과각각 , , mg의 d-limonene이검출되었다. Fig. 5는 n-헥산을용매로하여 120 o C에서각각 1, 2, 4시간동안추출한시료를 HPLC에주입한결과를나타내는크로마토그램이다. 에탄올추출물의시료보다다양한불순물피크가발생했고, 머무름시간 19분에단일피크가검출되었다. 에탄올의경우와마찬가지로 1시간추출시료의피크높이가가장낮았으며, 2시간추출시료와 4 시간추출시료의피크높이는비슷하게나타났다. 하지만에탄올추출결과와비교했을때폭은 2배가량늘어났으나높이는 1/12 정도로비교적작은피크가발생했다. 시간별 d-limonene 피크면적을적분한결과, 1시간추출시료의피크면적은 mv s, 2시간추출시료는 mv s, 4시간추출시료는 mv s 이었다. 검량선을통해 d-limonene 농도를추정한결과 0.57, 0.89, 0.86 mm이었고, 추출후남은용매의부피를고려하여실제추출량을계산한결과각각 12.80, 19.48, mg의 d-limonene이검출되었다. 마지막으로석유에테르를이용해 120 o C에서 1, 2, 4시간동안추출한시료를 HPLC 분석한결과를종합하여 Fig. 6에나타내었다. 불순물의피크들은같은비극성용매인 n-헥산에서의피크들과비슷했으며, 머무름시간 19분에리모넨이검출되었다. 전체적인피크의높이는세가지용매추출결과중가장작은피크높이가발생했다. 에탄올, n-헥산의경우와마찬가지로 1시간추출시료의피크높이가가장낮게나타났고, 2시간추출시료의피크가가장높게나타났 Fig. 4. The chromatogram of extraction samples in ethyl alcohol. Fig. 5. The chromatogram of extraction samples in n-hexane.

5 다양한용매에서 Soxhlet 추출기를이용한감귤껍질에서 d-limonene 추출의최적조건연구 721 Fig. 6. The chromatogram of extraction samples in petroleum ether. 다. 4시간추출시료의피크는 1시간, 2시간의경우보다도작은피크가검출되었음을알수있다. 시간별 d-limonene 피크면적을적분한결과, 1시간추출시료의피크면적은 mv s, 2시간추출시료는 mv s, 4시간추출시료는 mv s 이었다. 검량선을통해 d-limonene 농도를추정한결과 0.31, 0.53, 0.24 mm이었고, 추출후남은용매의부피를고려하여실제추출량을계산한결과각각 6.88, 11.18, 5.06 mg의 d-limonene이검출되었다. 40 g의감귤껍질로부터세가지용매를이용해 d-limonene을추출한결과를 Table 3과 Fig. 7에정리하였다. d-limonene을분리하는최적의조건은에탄올에서 2시간동안추출하는방법이며, 이때감귤껍질 1g당 d-limonene 함량은 7.77 mg/g 이었다. 즉, 에탄올을이용해추출할경우나머지두용매를이용해추출하는경우에비해더많은 d-limonene을얻을수있었다. 끓는점이크게차이가나지않는세용매에서 d-limonene 추출량을비교했을때, 에탄올내에서의 d- limonene 함유량이 n-헥산및에테르의함유량보다현저하게많은것으로보아용매의끓는점보다는극성도가더욱중요한인자라는것을알수있었다. 에탄올에비해상대적으로비극성용매인 n-헥산과석유에테르용매에서 d-limonene의용해도가높기때문에, 증류와냉각을반복한추출과정에서용매와함께 d-limonene 성분이증발한것으로보인다. 상대적으로 d-limonene에대한용해도가작은에탄올용매로추출할때 d-limonene이증발되지않고둥근플라스크에남아있어더욱효과적으로추출이가능했던걸로보인다. 에탄올과석유에테르의경우 4시간동안추출한시료의 d- limonene 함유량이오히려 2시간동안추출한시료보다줄어들었음 Fig. 7. Comparison of amounts of d-limonene according to extraction time in three solvents. 을확인할수있었다. 이는 2시간까지귤껍질내에서 d-limonene이지속적으로추출되면서함유량이증가하면서최대치에도달한후, 증발량이추출량보다많아지는시간때가있어양이감소하는것으로보인다. n-헥산의경우 4시간동안추출한시료의 d-limonene 함유량이 2시간동안추출한시료와거의비슷한양을함유하고있었다. 이는아직증발량이추출량보다더큰시간을지나지않은것으로보인다. 하지만, d-limonene 함유량이에탄올추출물에비해낮은농도이므로극성도가높은에탄올에서의추출이가장효율적인방법이라는것을알수있었다. 추출조건의최적화는천연물추출과크로마토그래피분석에서필요한실험방법으로반응표면분석법이자주사용된다 [13,14]. 4. 결론 본연구에서는 Soxhlet 추출을이용하여감귤껍질을추출할때용매의종류와추출시간이 d-limonene 추출량에미치는영향을알아보고, 그에따른최적의추출조건을조사하였다. 추출용매로에탄올, n-헥산, 석유에테르를사용했고, 각용매마다추출시간을 1시간, 2시간, 4시간으로두었다. 추출시료를 HPLC에서분석한결과, Table 3. Results of d-limonene extraction using three solvents Solvent Extraction time (h) d-limonene concentration (mm) d-limonene weight (mg) d-limonene yield (mg/g tangerine peel) Ethyl alcohol n-hexane Petroleum ether

6 722 박상민 고관영 김인호 세용매중극성도가가장높은에탄올을추출용매로하여 2시간동안추출했을때 7.77 mg/g의수율로 d-limonene이가장많이추출된것으로나타났다. 이를통해 Soxhlet 추출기와같은연속증류추출방법을사용하여감귤껍질로부터 d-limonene을추출할때는껍질에서추출되는양과증발로인한손실되는양을모두고려한최적시간인 2시간에근접한시간을선택하고, 용매는 n-헥산이나석유에테르와같은무극성용매보다는에탄올과같은극성유기용매를선택하는것이효과적이다. 감 본연구는 2014년충남대학교자체연구비에의해수행되었으며이에감사드립니다. 사 References 1. Morse, M. A. and Toburen, A. L., Inhibition of Metabolic Activation of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone by Limonene, Cancer Lett., 104(2), (1996). 2. Budavari, S., The Merck Index, 7th ed., Merck, New Jersey(1989). 3. Langer, R. S. and Wise, D. L., Medical Applications of Controlled Release, 2nd ed., CRC Press, Florida(2004). 4. Rosen, H. B., Chang, J., Wnek. G. E., Linhardt, R. J. and Langer, R., Bioerodible Polyanhydrides for Controlled Drug Delivery, Biomaterials, 4(2), (1983). 5. Oh, E. H., Im, H. S. and Yoon, C. H., A Study on the Antibiotic Effect Using the d-limonene Oil Extracted to Wasted Mandarin Peels in Cheju, Journal of the Korean Oil Chemists' Society, 26(3), (2009). 6. Im, H. H., Studies on Extraction of Limonene from Citron and Immunomodulation Activity of Limonene, M.S. Thesis, Hankyong National University, Ansung, Korea(2005). 7. Beak, J. I., Jin, S. Y. and Kim, I. H., Separation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin by Using HPLC, B. S. Thesis, Chungnam National University, Daejeon, Korea(2009). 8. Wixom, R. L., Chromatography, Wiley Press, New York(2011). 9. Jung, I. K., Choi, D. Y. and Row, K. H., Separation of Whey Proteins by Anion-exchange Membranes, Korean J. Chem. Eng., 20(3), (2003). 10. Nilsson, U., Bergh, M., Shao, L. P. and Karlberg, A-T., Analysis of Contact Allergenic Compounds in Oxidized d-limonene, Chromatographia, 42(3-4), (1996). 11. Zhang, R. L. Zhang, Q. and Xu, S. A., Determination of Limonene in Spearmint Oil by HPLC Method, Journal of Anhui Agricultural Sciences, 13(2), (2012) Yoon, C. W., Bok, H. S., Choi, D. K. and Row, K. H., Optimization Condition of Astaxanthin Extract from Shrimp Waste Using Response Surface Methodology, Korean Chem. Eng. Res., 50(3), (2012). 14. Lee, K. J., Choi, D. Y. and Row K. H., Extraction and Purification of Isoflavones from Korean Soybean and Soybean Paste, Korean Chem. Eng. Res., 41(5), (2003).

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