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우제 은
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1 대한생식의학회지 : 제 37 권제 3 호 2010 미세술기를이용한정계정맥류절제술이정자핵내 DNA Integrity 에미치는효과 미즈메디병원비뇨기과 1, 미즈메디병원불임의과학연구소 2 김기영 1 이재석 1 지희준 2 김종현 1 * Effect of Microsurgical Varicocelectomy on Human Sperm Nucleus DNA Integrity Gi Young Kim 1, Jae Seok Lee 1, Hee Jun Chi 2, Jong Hyun Kim 1 * 1 Department of Urology, 2 ART Research Center, Mizmedi Hospital, Seoul, Korea Objective: Human sperm nucleus DNA damage may negatively affect pregnancy outcome, and the spermatozoa of infertile men have more DNA damage than that of fertile men. The aim of this study was to evaluate the effect of microsurgical varicocelectomy on human sperm nucleus DNA integrity. Methods: We reviewed the medical records of 18 subfertile male patients who underwent microsurgical varicocelectomy at our hospital from April 2006 to April Varicocele was diagnosed by physical examination and Doppler ultrasound. Standard semen analysis was performed in 18 patients before and 4 months after microsurgical varicoceletcomy using a computer assisted semen analyzer. Sperm nucleus DNA integrity was assessed by a single-cell gel electrophoresis (comet assay). Results: No recurrence of varicocele was observed after 4 months later. The DNA fragmentation index improved after varicocelectomy compared with pre-operatively (19.3 versus 13.7%, respectively, p<0.05). Semen analysis parameters (total count, concentration, motile sperm, viability, strict morphology) increased after varicocelectomy, but the difference did not reach statistical significance. Conclusion: Our data suggest that microsurgical varicocelectomy can improve semen analysis parameters and human sperm nucleus DNA integrity in infertile men with varicocele. [Korean. J. Reprod. Med. 2010; 37(3): ] Key Words: Varicocele, Infertility, DNA fragmentation, Comet assay 인간정자핵내의 DNA integrity는배아발달및임신유지에중요한역할을하여 DNA integrity가손상된경우불임과유산의원인이된다고하며, 정계정맥류는 DNA 손상을일으키는대표적인원인중하나이다. 정계정맥류는고환으로가는정계의정맥총이확장된상태를말하여정맥판막의기능부전으로 접수일 : 2010 년 8 월 26 일, 수정일 : 2010 년 9 월 10 일게재확정일 : 2010 년 9 월 15 일주관책임자 : 김종현, 우 ) 서울특별시강서구내발산동 701-4, 미즈메디병원비뇨기과 Tel: (02) , Fax: (02) jhandro@mizmedi.net 혈액의역류가일어나는질환이다. 1 전체남성인구의약 10~15% 에서발견되고불임남성에서는일차성불임의경우 30~35%, 이차성불임의경우 70~80% 에서발견되며, 2 수술로치료될수있는가장흔한남성불임의원인이다. 정계정맥류가불임을일으키는원인에대해서명확하게알려진바는없다. 정계정맥류는호르몬의기능장애, 고환온도증가, 부신또는신장의독성대사물질의역류및고환의저산소증을유발하여남성불임을유발할수있으며, 3 최근여러연구에서보면정맥류는활성화산

2 미세술기를이용한정계정맥류절제술이정자핵내 DNA Integrity 에미치는효과 대한생식의학회지 소의증가및항산화기능의감소로정자핵내 DNA 손상을유발하여불임을유발한다고밝혀지고있다. 정계정맥류절제수술은수정능력이감소되어있는환자의치료를위해널리사용되는방법이다. Perimenis 등 4 은정계정맥류절제술을받은환자의 83.2% 에서정액검사결과의향상및성공적인임신율의증가를보고하였다. 정액검사는남성생식계통에대한일차정보를제공해주는가장기본적이면서도중요한검사이다. 그러나, 남성불임환자의약 15% 에서는정액검사에서정상소견을보이며, 정액검사만으로는정자의기능을포함한모든부분을알려주지는못한다. 최근들어인간정자핵내의 DNA 손상과남성불임과의연관성을찾기위해많은연구가진행중이다. 정계정맥류절제수술이정계정맥류를가진불임환자들에서정자핵내 DNA integrity를호전시키며, 5 정계정맥류수술은정자핵내 DNA의산화손상을줄이고정액내의항산화능력을증가시킨다고한다. 6 본연구에서는미세술기를이용한정계정맥류절제술로교정을하였을때정자핵내 DNA integrity 가어떠한영향을받는지에대하여알아보고자하였다. 연구대상및방법 1. 대상 2006년 4월부터 2007년 4월까지불임을주소로내원하여신체검사또는초음파검사상정계정맥류로진단받고미세술기를이용한정계정맥류절제술을받았던 18명의환자를대상으로하였다. 정계정맥류는환자들이서있는자세에서신체검사후세단계로나누었는데 Grade I은 Valsalva 법시행시만져지는경우, Grade II는 Valsalva 법을시행하지않고도만져지는경우, Grade III은눈으로도보이는경우로분류하였다. 정액검사는 3~4일의금욕기간을거친후에자위를통해수술전최소 2회 이상, 수술후 4개월에채취하였으며컴퓨터정액분석 (computer-assited semen analysis) 를이용하여분석하였다. 수술전후에정액검사의다른지표들과함께정자핵내 DNA integrity의변화를같이조사하였다. 정자핵내 DNA integrity를측정하는방법으로 comet assay를시행하였고, comet assay를통한 DNA 손상정도는 DNA fragmentation index (DFI) 로나타내었다. DFI 수치가높다는것은정자핵내 DNA 손상빈도가많다는것을의미하며, DFI가 10 이상을비정상으로간주하였다. 2. 미세술기를이용한정계정맥류절제술 Marmar와 Kim 7 에의해변형된외서혜륜직하방에서정삭을들어올려정맥을결찰하는수술방법으로수술현미경을이용하였다. 즉, 저위서혜부로접근하여수술현미경하에하나또는그이상의고환동맥, 정관및정관동맥, 하나의정관정맥과림프관을보존하고확장되어있는모든내정계정맥을비롯한외정계정맥, 고환도대정맥을제거하였다. 3. Comet assay 채취된정액을세척한후정액 5 μl를 45 μl의 low melting agarose 와혼합하고샘플을 comet용 slide glass (Trevigen, Gaithersburg, MD, USA) 에올려놓고 cover glass로덮은후 4 냉장고에서 10분간보관한다. Cover glass를조심스럽게제거한후 slide를 4 냉장고에서미리 cooling된 lysis solution (2.5 M NaCl, 100 mm EDTA, 10 mm Tris, 1% Triton X-100, 10 mm DL-dithyothreitol; Sigma, St. Louis, MO, USA) 에 2시간동안침지시킨다. 수평형전기영동기 (horizontal electrophoretic unit, BioRad, Hercules, CA, USA) 에 slide를올려놓고 electrophoresis buffer (500 mm NaCl, 100 mm Tris, 1 mm EDTA, 0.2% DMSO, Sigma) 을채운후 20분동안침지시키고전기영동을 10 V, 250 ma에서 60분동안 running 시킨다. 전기영동후 slide를세척하여 neutralizing solution (50% ethanol, 20 mm Tris, 1 mg/ml spermine, Sigma) 에

제 37 권제 3 호, 2010 김기영 이재석 지희준 김종현 Fragmenation 0% Fragmentation

Sperm DNA integrity assessed by neutral comet assay.

DNA dose not mobilze well and high levels of DNA strand breaks

DNA Integrity. Korean J Reprod Med 2010. 5분동안침지시키고이러한과정을 3회반복한다.

01% SYBR Green, Trevigen) 으로염색하고증류수로 slide로세척한후 vectashield

부위를피복하고형광이부착된 inverted microscope로 400배의배율하에서정자의 DNA 손상을관찰한다.

DNA 손상이있는정자들은저분자량의 DNA를가지므 로끌려서이동하게되어혜성모양의꼬리가관찰된다 (Figure 1).

3 제 37 권제 3 호, 2010 김기영 이재석 지희준 김종현 Fragmenation 0% Fragmentation 10% Fragmentation 20% Fragmentation 30% Figure 1. Sperm DNA integrity assessed by neutral comet assay. Intact sperm will not create comets because highmolecular weight DNA dose not mobilze well and high levels of DNA strand breaks show increased comet tail fluorescent intensity and length ( 400). Gi Young Kim. Effect of Microsurgical Varicocelectomy on Human Sperm Nucleus DNA Integrity. Korean J Reprod Med 분동안침지시키고이러한과정을 3회반복한다. Slide를세척한후 SYBR staining solution (10 mm Tris, 1 mm EDTA, 0.01% SYBR Green, Trevigen) 으로염색하고증류수로 slide로세척한후 vectashield mounting solution (Vector Labs, Burlingame, CA, USA) 으로관찰할 slide 부위를피복하고형광이부착된 inverted microscope로 400배의배율하에서정자의 DNA 손상을관찰한다. DNA 손상을받지않은정상정자의핵내 DNA 는고분자량이므로 DNA가이동하지않기때문에꼬리가달린혜성모양이나타나지않지만, DNA 손상이있는정자들은저분자량의 DNA를가지므 로끌려서이동하게되어혜성모양의꼬리가관찰된다 (Figure 1). 즉, 각세포내의 DNA fragmentation 과관련된단일혹은이중사슬의파손양을측정하여 DNA 손상정도를알아보는방법이다. 4. 통계처리통계학적비교는 paired T-test와 Wilcoxon signed ranks test를이용하였으며 p-value가 0.05 미만인경우에의미가있는것으로판단하였다

4 미세술기를이용한정계정맥류절제술이정자핵내 DNA Integrity 에미치는효과 대한생식의학회지 Table 1. Semen analysis parameters before and after microsurgical varicocelectomy Pre-operative Post-operative p-value DFI 19.3± ± Sperm concentration ( 10 6 /ml) 43.1± ± Motile sperm (%) 26.5± ± Viability (%) 77.8± ± Strict morphology (%) 4.3± ± Total count ( 10 6 ) 128.6± ± Total motile sperm counts ( 10 6 ) 40.4± ± Motile sperm concentration ( 10 6 /ml) 13.7± ± DFI, DNA fragmentation index. Gi Young Kim. Effect of Microsurgical Varicocelectomy on Human Sperm Nucleus DNA Integrity. Korean J Reprod Med 결과 1. 대상환자들의연령은 28~38세로평균 32.7세였고, 불임기간은 5개월에서 6년으로평균 2년 6개월이었다. 정계정맥류는일측성의경우모두좌측에서관찰되어 12명에서 Grade I은 3명, Grade II는 8명, Grade III는 1명이었고, 양측성정계정맥류를가진 6 명의환자들중좌측에서 Grade I은 1명, Grade II는 3명, Grade III는 2명이었고우측에서는 subclinical 은 1명, Grade I은 1명, Grade II는 4명이었다. 2. 정액검사수술전정자의밀도는평균 , 운동성은평균 26.5%, 정자의생존성은평균 77.8%, 엄격한기준에의한정자모양은평균 4.3% 였고, 수술후각각 , 32.1%, 83.8%, 4.4% 로호전양상을보였으나통계적으로는유의한차이는없었다 (Table 1). 전체정자수, 전체운동성정자수 (total motile sperm counts) 와운동정자밀도에서도수술후호전되었는데운동성정자밀도에서통계적으로유의한차이가있었지만전체정자수와전체운동성정자 Table 2. The change of DFI in the patients with normal versus abnormal DNA integrity Pre-operative Post-operative p-value DFI<10 7.7± ± DFI> ± ±11.4 >0.01 DFI, DNA fragmentation index. Gi Young Kim. Effect of Microsurgical Varicocelectomy on Human Sperm Nucleus DNA Integrity. Korean J Reprod Med 수에서는유의한차이가없었다 (Table 1). 3. Comet assay 결과 정자핵내 DNA 손상정도를나타내는평균 DFI는수술전에 19.3%, 수술후에 13.7% 로통계적으로유의한차이를보였다 (Table 1). 수술전 DFI가 10 이상으로비정상인 14명의환자들중 12 명 (85%) 에서개선소견을보였으나, 수술전 DFI 가 10 미만인정상환자 4명에서는 1명 (25%) 만이개선소견을보였다 (Table 2). 고 찰 남성불임환자들중에서많은빈도로정계정맥

5 제 37 권제 3 호, 2010 김기영 이재석 지희준 김종현 류가관찰이되지만현재까지어떤기전에의하여정액에나쁜영향을미치며수정및배아발달에어떻게영향을주는지에대한명확한기전은알지못한다. 세계보건기구에서시행한다기관연구에서정계정맥류와고환기능변화의중요한상관관계가관찰되었다. 정액의변화가있는 25% 의환자에서정계정맥류가관찰되었으나, 정상인환자들에서는 12% 에서만관찰되었다. 더구나정계정맥류와같은쪽에위치한고환크기의감소는강한연관관계를보였다. 3,8 정계정맥류를가진환자들에서신장또는부신에서발생된독성대사물질의역류, 정맥순환의정체에의한고환의저산소증, 호르몬의기능장애내정계정맥의고혈압과고환온도의증가등의원인으로정자형성과정의변화가일어난다. 3 그리고이런환자들의정액에서활성화산소 (reactive oxygen species) 의증가및항산화기능의감소가관찰이된다. 2,9 그리하여정자는과다한활성화산소에노출이되고충분하지않는세포질및불충분한항산화제로인하여활성화산소로부터의보호작용이감소되어결과적으로정자 DNA 손상이발생하게된다. 활성화산소에의해정상정자가손상을받는정확한기전에대해서는확실하게밝혀지지는않았지만 hyperactivation, 정자의수정능획득 (capacitation), 투명대에결합그리고첨체반응의과정들이산화및환원에의해조절되기때문이라고생각되어지고있다. 10 아울러활성화산소가정자 DNA integrity에나쁜영향을주어서 fragmentation과 denaturation과같은손상을유발시킨다고한다. 정계정맥류를가진불임환자들에게서 interleukin- 6 및활성화산소의증가및항산화기능의감소가관찰이되어정자기능부전에산화스트레스가중심이되며, 11 정계정맥류환자에서고환온도의증가및활성화산소의증가로인해정자기능이상및 DNA 손상을유발한다. 12 여러연구에서보면정자핵내 DNA 손상은 자연임신에영향을미친다고알려지고있는데, Evenson 등 13 과 Spano 등 14 은 sperm chromatin structure assay (SCSA) 로 DNA 손상정도를파악하였고정자 DNA integrity와남성의임신가능성과의상관관계를알아보았는데손상이 30% 이상이면자연임신이힘든것으로보여원인불명의불임부부들에게서임신성공여부를예측할수있다고하였고, Zini 등 15 은 DNA denaturation과 DNA fragmentation이정상에서는 10%, 13% 인데반하여불임남성에서는 25%, 28% 로증가하였다고하였다. 그러므로, 정자 DNA 손상은남성의가임능력과연관이있는것으로생각되며불임의원인이명확하지않는환자들에게도유용하게적용할수있다. Bungum 등 16 과 Saleh 등 17 은 SCSA 검사에서 DNA 손상이 30% 이상이면인공수정시임신가능성이제로에가깝다고발표하였고, Duran 등 18 은 TUNEL 검사상 DNA 손상이 12% 이상이면임신이어렵다고하였다. 그러므로, 남성불임환자들에서정자 DNA 손상을측정하는것은자궁강내정액주입 (intrauterine insemination) 시그결과를예측하는데있어많은도움이되고 DNA 손상이심한경우자궁강내정액주입법을시행하면성공가능성이적기때문에비교적 DNA 손상의영향을적게받는시험관수정 (In vitro fertilization) 또는세포질내정자주입법 (Intracytoplasmic sperm injection) 를시행하도록권할수있는기본자료로도활용할수있다. Zini 등 5 은미세술기를이용한정계정맥류절제술후정액지표및 DNA 손상이 27.7% 에서 24.6% 개선되었다고보고하였는데, 본원의연구결과에서도 comet assay 결과 DFI가 19.3% 에서 13.7% 로호전되었으며특히, DFI가 10 이상으로 DNA 손상이심한환자들에서수술전 22.6% 에서수술후 14.9% 로개선이관찰되었다. 이상과같은연구결과로미세술기를이용한정계정맥류절제술을통한수술적교정은정액검사상의다른지표의개선뿐아니라, 정자핵내 DNA 손상을감소시킬수있다. 이상에서정계정맥류의

6 미세술기를이용한정계정맥류절제술이정자핵내 DNA Integrity 에미치는효과 대한생식의학회지 수술적교정으로정자핵내 DNA integrity의개선을기대할수있으며, 이는보다양호한정자를많이얻을수있어자연임신이나보조생식술의성공가능성을높일수있다는점을제시한다. 참고문헌 1. Gat Y, Bachar GN, Zukerman Z, Belenky A, Gornish M. Varicocele: a bilateral disease. Fertil Steril 2004; 81: Smith R, Kaune H, Parodi D, Madariaga M, Rios R, Morales I, et al. Increased sperm DNA damage in patients with varicocele: relationship with seminal oxidative stress. Hum Reprod 2006; 21: Naughton CK, Nangia AK, Agarwal A. Pathophysiology of varicoceles in male infertility. Hum Reprod Update 2001; 7: Perimenis P, Markou S, Gyftopoulos K, Athanasopoulos A, Barbalias G. Effect of subinguinal varicocelectomy on sperm parameters and pregnancy rate: a two-group study. Eur Urol 2001; 39: Zini A, Blumenfeld A, Libman J, Willis J. Beneficial effect of microsurgical varicocelectomy on human sperm DNA integrity. Hum Reprod 2005; 20: Chen SS, Huang WJ, Chang LS, Wei YH. Attenuation of oxidative stress after varicocelectomy in subfertile patients with varicocele. J Urol 2008; 179: Marmar JL, Kim Y. Subinguinal microsurgical varicocelectomy: a technical critique and statistical analysis of semen and pregnancy data. J Urol 1994; 152: World Health Organization. The influence of varicocele on parameters of fertility in a large group of men presenting to infertility clinics. Fertil Steril 1992; 57: Hendin BN, Kolettis PN, Sharma RK, Thomas AJ Jr, Agarwal A. Varicocele is associated with elevated spermatozoal reactive oxygen species production and diminished seminal plasma antioxidant capacity. J Urol 1999; 161: de Lamirande E, Jiang H, Zini A, Kodama H, Gagnon C. Reactive oxygen species and sperm physiology. Rev Reprod 1997; 2: Nallella KP, Allamaneni SS, Pasqualotto FF, Sharma RK, Thomas AJ Jr, Agarwal A. Relationship of interleukin-6 with semen characteristics and oxidative stress in patients with varicocele. Urology 2004; 64: Saleh RA, Agarwal A, Sharma RK, Said TM, Sikka SC, Thomas AJ Jr. Evaluation of nuclear DNA damage in spermatozoa from infertile men with varicocele. Fertil Steril 2003; 80: Evenson DP, Jost LK, Marshall D, Zinaman MJ, Clegg E, Purvis K, et al. Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Hum Reprod 1999; 14: Spano M, Bonde JP, Hjollund HI, Kolstad HA, Cordelli E, Leter G. Sperm chromatin damage impairs human fertility. The Danish First Pregnancy Planner Study Team. Fertil Steril 2000; 73: Zini A, Bielecki R, Phang D, Zenzes MT. Correlations between two markers of sperm DNA integrity, DNA denaturation and DNA fragmentation, in fertile and infertile men. Fertil Steril 2001; 75: Bungum M, Humaidan P, Spano M, Jepson K, Bungum L, Giwercman A. The predictive value of sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters for the outcome of intrauterine insemination, IVF and ICSI. Hum Reprod 2004; 19: Saleh RA, Agarwal A, Nada EA, El-Tonsy MH, Sharma RK, Meyer A, et al. Negative effects of increased sperm DNA damage in relation to seminal oxidative stress in men with idiopathic and male factor infertility. Fertil Steril 2003; 79(Suppl 3): Duran EH, Morshedi M, Taylor S, Oehninger S. Sperm DNA quality predicts intrauterine insemination outcome: a prospective cohort study. Hum Reprod 2002; 17:

7 제 37 권제 3 호, 2010 김기영 이재석 지희준 김종현 = 국문초록 = 목적 : 인간정자핵내의 DNA integrity는배아의발달및임신유지에중요한역할을하여 DNA integrity가손상된경우불임과유산의원인이된다고하며, 정계정맥류는 DNA 손상을일으키는대표적인원인중하나이다. 본연구에서는미세술기를이용한정계정맥류절제술로정계정맥류를교정을하였을때정자핵내 DNA integrity가어떠한영향을받는지에대하여알아보았다. 연구방법 : 2006년 4월부터 2007년 4월까지불임을주소로미세술기를이용한정계정맥류절제술을받았던 18명의환자에서수술전후에정액검사의다른지표들과함께정자핵내 DNA integrity가어떻게변화하였는지조사하였다. 정자핵내 DNA integrity를측정하는방법으로 comet assay를시행하였고, comet assay를통한 DNA 손상정도는 DNA fragmentation index (DFI) 로나타내었다. 결과 : 수술후 4개월에모든환자에서재발의소견은보이지않았으며, DNA 손상정도를나타내는평균 DFI는수술전에 19.3%, 수술후에 13.7% 로유의한변화를보였다. 수술전 DFI가 10 이상으로비정상인 14명의환자들중 12명 (85%) 에서개선소견을보였으나, 수술전 DFI가 10 미만인정상환자 4명에서는 1명 (25%) 만이개선소견을보였다. 수술후정자의밀도, 운동성, 생존성에서호전양상을보였으나유의한차이는없었다. 결론 : 미세술기를이용한정계정맥류절제술을통한수술적교정은정액검사상의다른지표의개선뿐아니라, 정자핵내 DNA 손상을감소시킬수있다. 이상에서정계정맥류의수술적교정으로정자핵내 DNA integrity의개선을기대할수있으며, 이는보다양호한정자를많이얻을수있어자연임신이나보조생식술의성공가능성을높일수있다는점을제시한다. 중심단어 : 정계정맥류, 불임, DNA 손상, Comet 검사

012임수진

012임수진 Received : 2012. 11. 27 Reviewed : 2012. 12. 10 Accepted : 2012. 12. 12 A Clinical Study on Effect of Electro-acupuncture Treatment for Low Back Pain and Radicular Pain in Patients Diagnosed with Lumbar