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서균 음
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1 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 1 KNUmbl 경북대학교미생물공학연구실 12 장. 효소

2 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 효소의생산, 추출및정제 * 효소 (nzyme) : 생체반응을촉매하는단백질 - 추출하여산업적으로이용 * 효소의분류 1. 산화환원효소 (Oxidoreductase) : 물질의산화환원촉매 2. 전이효소 (Transferase) : 기의전이촉매 3. 가수분해효소 (Hydrolase) : 물질의가수분해촉매 4. 이탈효소 (Lyase) : 기의이탈촉매 5. 이성화효소 (Isomerase) : 물질의이성화촉매 6. 합성효소 (Ligase) : 물질의연결, 합성을촉매 * 미생물효소의이용 - 다양한효소함유, 취급용이, 배양용이 - 미생물을배양하여효소생산 - 산업적으로이용

3 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 3 Utilization of microbial enzymes nzyme Uses Lipase Lactase Protease -amylase Glucose isomerase Pectinase Microbial rennet nhances flavor in cheese making Breaks down lactose to glucose and galactose; lactose-free milk products Detergent additive; hydrolyzes suspended proteins in beer that form during brewing for a less cloudy chilled beer Used in production of glucose from starch along with glucoamylase Used in production of high-fructose corn syrup Degrades pectin to soluble components, reduces cloudiness in chilled wine, fruit juice Used in production of cheese

$효소생산수율 : 배지와배양조건 ( 온도, 습도, ph, 산소, 배양시간 ) 에의해결정 - 배양시간 : 최대활성시기, 자기소화후세포외유출등 *** 유전공학에의한효소증폭의예 :..\ 공통 \ 단백질대량생산예.ppt 3. 유도물질의첨가 : 유도효소의경우 ( 구성효소경우는필요무 ) 4.$

4 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 4 1. 미생물효소의생산 1. 효소의활성과성질 : 미생물종류에의해결정 미생물 : 세균, 방선균 -- 빠른생육속도 곰팡이, 효모 균체분리용이, 주로세포외효소생산 ( 고초균도동일 ) 2. 효소생산수율 : 배지와배양조건 ( 온도, 습도, ph, 산소, 배양시간 ) 에의해결정 - 배양시간 : 최대활성시기, 자기소화후세포외유출등 *** 유전공학에의한효소증폭의예 :..\ 공통 \ 단백질대량생산예.ppt 3. 유도물질의첨가 : 유도효소의경우 ( 구성효소경우는필요무 ) 4. 배양방식액체배양 : 통기교반배양고체배양 : 국개법, 자동제국기이용 * 어떤효소고체배양에서만생성 ( 예, glucoamylase)

5 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 5 2. 효소의추출및정제 * 효소제제 : 액상 ( 수송불편, 실활 ) 또는분말 ( 안정제첨가하여건조 - 주로사용 ) 효소의미생물세포내존재부위 A : 세포질에존재하는수용성단백질 B : 막표면에존재하는수용성단백질 C : 소수성부분은막, 친수성부위는막외에존재하는단백질 D : 막내부에존재하는소수성단백질 가. 효소의추출 1) 균체내효소 (intracellular enzyme) : 마쇄, 세포벽용해효소처리, 자기소화, 건조, 용제처리, 동결용해, 초음파등 2) 균체외효소 (extracellular enzyme) : 액체배양의경우균체제거후그대로정제고체배양의경우 : 묽은염 (NaCl) 또는묽은산 ( 초산, 젖산 ) 등으로추출

2016-11-08 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 6 나.

6 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 6 나. 단백질의정제 1) 유안 ( 암모늄설페이트 ) 염석 : 용해도 761g/L H2O 100%, satd - 효소용액에첨가하여단백질의석출유도 분별석출가능 2) 유기용매침전법 : 아세톤, 에탄올, 이소프로판올 -유기용매회수가능, 건조용이-공업적유리 3) 투석 (dialysis) : cellophane, nitrocellulose 막등사용하여탈염

7 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 7 4) 시료의농축및탈염 : 한외여과법 (ultrafilteration) - 한외여과막이용 가 ) 여과 : amicon 이용 압력을가하여한외여과막여과 나 ) 원심분리 : centricon 이용 원심분리하여한외여과막여과 Amicon Centricon

2016-11-08 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 8 5) 크로마토그라피

8 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 8 5) 크로마토그라피 : 두상사이의분배계수의차이에따라분리 : 흡착, 이온, 크기, 친화성등이용을이용하여분획 (fractionation)

2016-11-08 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 9 가 ) 흡착 : 알루미나겔등흡착제에흡착 - 약산성흡착후중성또는알칼리성용출 나 ) 이온교환 : 하전을가진물질에이온결합후용출 - 이온교환수지 (Amberlite:

9 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 9 가 ) 흡착 : 알루미나겔등흡착제에흡착 - 약산성흡착후중성또는알칼리성용출 나 ) 이온교환 : 하전을가진물질에이온결합후용출 - 이온교환수지 (Amberlite: 양이온교환수지, Dowex 2: 음이온교환수지 ) 이온교환 cellulose, sephadex, sepharose : DA-, CM- 다 ) 겔여과법 : 다공성폴리머를이용하여여과 - dextran(sephadex), polyacrylamide(bio-gel)

2016-11-08 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 10 라 ) 친화성크로마토그래피 : 기질, 저해제, 항체등담체에결합사용 다.

10 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 10 라 ) 친화성크로마토그래피 : 기질, 저해제, 항체등담체에결합사용 다. 효소제제의형태 : 공업용경우순도가낮아도무관 1) 액상농축효소 2) 분말제제 : 효소를건조 ( 동결건조, 저온분무건조 ) 후안정제 ( 당, 식염등 ) 첨가 3) 결정 : 충분히정제된효소--결정화 ( 염석, 유기용매, 농축, 염류제거등 ) 4) 고정화효소

11 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 고정화효소 (immobilized enzyme) 1. 고정화효소및고정화미생물균체 기질 고정화효소 효소의형태는일부변화 : 수식효소 (modified ) -- 기질특이성, 최적 ph, 최적온도, 안정성등변화 -- 새로조건을잡아사용 산물 불용성물질 1) 효소의안정화 : 효소장기간사용가능 단위효소당생산성증가 2) 효소와반응산물분리 : 수율증가, 정제공정간단, 효소회수및재사용가능 3) 연속작업및자동화가능 가. 고정화효소 : 효소의성질을개선하여고정화한효소 -- 수용액과같이이동되는것방지 -- 대부분이불용성 불용성효소, 어떤경우 soluble immobilized 나. 고정화균체 : 미생물자체를고정화하여그효소를그대로이용 - 균체로부터효소분리필요무, 추출에따른효소손실방지, 복합적효소이용

12 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 효소및균체의고정화 : 3 가지방법 - 담체결합법, 가교법, 포괄법 가. 담체결합법 = 지지체결합법 : 불용성의담체에효소또는미생물균체를결합시키는방법 1) 공유결합법 : 불용성담체와효소를공유결합시켜고정 - 담체 : 다당류유도체--cellulose, dextran, agarose 등 - 효소 : amino기, carboxyl기, SH기, OH기, phenyl기, imidazole기가 ) Diazo 법 : 담체와효소사이의 N=N(diazo coupling) 결합 R--NH2 R--N=N- 나 ) Peptide 법 : 담체와효소사이 CO-NH 결합이용 R-COOHR-CO-NH- 다 ) Alkyl화법 : halogen 원소를가진담체로 alkyl화하여고정화 R-OOCCH2-Br R-OOCCH2-

13 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 13 2) 이온결합법 : 하전을띠고있는불용성담체와효소를이온결합으로고정화 - 담체 : 이온교환기를가진다당류또는수지 - 이온교환수지, cellulose, sephadex 등 양이온교환체 : CM-(carboxy methyl-) R-O-CH2-COO NH3 + - C2H5 음이온교환체 : DA-(diethylaminoethyl-) R-O-CH2CH2-N + H COO - - C2H5 장점 : 고정화조작이간단, 지지체의재생용이, 온화한처리조건단점 : 결합력약-pH, 이온강도, 온도에의해효소유리위험 3) 물리적흡착법 : 유기, 무기의불용성흡착제에효소를흡착시켜고정화 -유기흡착제 : cellulose, starch, gluten, ester, polymethacrylate 무기흡착제 : 활성탄, 규조토, 알루미나, 유리 -장점: 고정화조작간단, 지지체재생용이, 고차구조변화가이온결합보다약단점 : 효소의유리위험이이온결합보다도더약

14 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 14 나. 가교법 : 둘이상의관능기를가진시약으로효소와효소를가교시켜고정화 N -N=CH(CH2)3CH=N- N 장점 : 담체나지지체필요무, 고정화조작간단단점 : 1) 시약에의한효소실활우려 2) 고정된효소의형태가부정형 3) 다량의효소필요 4) 칼럼충진에부적합한경우가있음 다. 포괄법 : 반투과성피막내에효소를고정 -- 결합반응무 -- 응용가능성큼 -- 물에 soluble, immobilized-- 격자법과 microcapsule 법

15 1) 격자법 : 고분자 gel 격자내효소고정화하는방법 - 효소와격자형성 monomer 를혼합후중합효소 : 격자내존재, 기질과산물 : 격자출입가능기질 : 격자내에들어가효소반응으로산물로변환후밖으로용출 * 대표적시약 : acrylamide & bis-acrylamide--polyacrylamide gel 형성가 ) 아크릴아미아드 : CH2=CH-CO-NH2 - acrylamide chain 나 ) bis 아크릴아미이드 : CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 --acrylamide chain 의 cross linkage 다 ) 중합개시제 : TMD(N,N,N',N'-tetramethylenediamine) 라 ) 중합촉진제 : K2S2O8(potassiumpersulfate), riboflavin -CH2-CH- CO NH CH2 NH CO -CH2-CHbis -CH2-CH- CO NH2 acrylamide KNU Microbial Biotechnology Laboratory 15

16 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 16 2) microcapsule 법 : 반투과성중합체로효소를피복시키는방법 가 ) 상분리법 : 중합체를유기용매에용해후효소첨가하여분산 - 비용매첨가하여중합체를재침전하면서효소피복 * 상분리유기성분의조합 나 ) 액중건조법 : 중합체를유기용매에용해후효소첨가하여분산 - 수용액에첨가하여중합체를재침전하면서효소피복

17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 17 다 ) 계면중합법 : 친수성 monomer, 효소용액을유기용매에분산 - 소수성 monomer 첨가하여계면에서중합되면서효소피복 라 ) 리포솜 (liposome) 고정화법 : 인지질을사용하여인지질의이중층을만들어효소피복 - 인지질을클로로포름에유화하고효소용액을첨가하여혼합 -인지질의용해도가감소하여리포솜형성하면서효소피복

2016-11-08 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 18 12-3. 바이오센서 (Biosensor) * 바이오센서 : 특이적반응의변화를 sensor로계측하여물질의분석에응용 - 효소반응, 항원항체반응등 1.

18 KNU Microbial Biotechnology Laboratory 바이오센서 (Biosensor) * 바이오센서 : 특이적반응의변화를 sensor로계측하여물질의분석에응용 - 효소반응, 항원항체반응등 1. Biosensor 의구성과특징 1) 식별부위 (receptor): 생물적기능이용하여목적물질을변화 - 효소, 항체, 미생물, 동물조직및세포, organelle 고정막등 - 막또는각종지지체에고정화하여사용 2) 검출부위 (transducer) -물리적, 화학적변화를전극으로감지 -전기신호로변환 -컴퓨터에전달

19 KNU Microbial Biotechnology Laboratory Biosensor의종류와응용 : 효소, 미생물, organelle, 면역 sensor 등가. 효소센서 : 효소기질의반응특이성이용--선택성강 - 효소막의안정성이가장큰문제 - 당 (glucose, sucrose, lactose 등 ), lactic acid, 요소, 유기인센서등예 ) Glucose oxidase 고정화막 : 반응중산소소비 - 용존산소감소량측정하여 glucose 정량나. 미생물센서 : 복합효소, 조효소, 에너지생성등모든미생물기능이용가능 -호흡활성계측형센서 : 미생물의호흡활성을감지대사물질계측형센서 : 미생물의대사산물을전극으로감지 -glucose, alcohol, acetic acid, glutamic acid, 항생물질, BOD 센서등다. organelle 센서 : 세포소기관특히미토콘드리아이용하여 NADH 감지라. 면역센서 (immunosensor): 항원또는항체를고정하여사용 -항원고정막 : 혈액형측정, 항체의양정량항체고정막 : 항체의항원정량

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PowerPoint 프레젠테이션 효소 (Enzyme) 생명에적용되는에너지 자유에너지 : 어떤시스템의내부에너지중에서실제로일로변환가능한에너지 자유에너지증가반응 : 에너지투입으로, 고에너지화합물생성 자유에너지감소반응 : 에너지방출로, 저에너지화합물생성 자유에너지증가반응 ( 흡열반응 ) G = +686 kcal/mole 자유에너지감소반응 ( 발열반응 ) G = -686 kcal/mole ATP 생물촉매