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수나 한
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1 J. Biomed. Lab. Sci. 10 (2004) A Study on DNA Sequences and Mutation of Integrase Region of Korean-type Bovine Leukemia Virus (BLV) pol Gene Oh-Sik Kwon 1, Jung-Soon Kang 2, Hyun-Jin Park 3 and Min Yoo 4 1 Department of Microbiology, Keimyung University, Daegu , Korea 2 Molecular Structure Unit, KRIBB, Daejeon, , Korea 3 Radiation Cytogenetics Team, Radiological & Medical Sciences Research Center Korea Insititute of Radiological & Medical Sciences, Seoul, Korea, 4 Department of Biology, Keimyung University, Daegu , Korea Bovine leukemia virus (BLV) is a causative agent for lymphoma disease in cattle including cows worldwide. BLV shares similar virion structure and characteristics with other retroviruses. The pol gene of the BLV genome produced reverse transcriptase (RT) and integrase (IN) for important roles for BLV genome integration into host cell chromosomes that is known to be coded in the 3' side of the BLV pol gene (one third portion). In this study, we have sequenced 978 bp in the 3' side of the BLV pol gene from BLV 10C3 in order to determine the BLV IN region of it. And we compared it to the nucleotide sequences of an Australian BLV isolate. As a result, nucleotide sequences of the IN region of the Korean-type BLV pol gene were mutated at a rate of 3.7%. We can confirm that the typical mutations are such as Arg (AGG) Lys (AAG), Thr (ACG) Met (ATG), Ile (ATT) Val (GTT), Asn (ACC) His (CAC), Phe (TTT) Leu (TTG) and Asn (ACC) Asp (GAC). From the analysis of the sequencing data, we were able to determine the zinc-finger-like "HHCC" motif in the amino terminus of BLV IN, that was H-X 3 -H-X 25 -C-X 2 -C. It was also found the DD35E motif in the IN catalytic domain as D-X 56 -D-X 35 -E. It fits very well to the consensus sequences of retroviral IN as well as HHCC motif. Key Words: BLV, pol gene, Integrase, IN, Mutation, HHCC, DD35E 서 소백혈병은젖소를포함한소에서가장흔히발생하는임파구종양성질병이다. 이는성우의대표적인전염성질병으로 retrovirus인소백혈병바이러스 (bovine leukemia virus, BLV) 에의해야기되며 18) 전세계적으로발생하고있으나이의발생률은지역적으로차이가심한것으로알려져있다 11). BLV는구조적특성으로인하여 C-형 Oncornavirinae로분류되고있으나전형적인암유전자를가지고있지않으며인간의임파종역전사효소바이러스인 HTLV-I/II와분자적성격, 게놈의구조및형태가유사하다 15). BLV 는비리온내에 2개의동일한단쇄선형인약 8.4 kb 뉴클레오티드의 (+) * 논문접수 : 2004년 1월 20일수정재접수 : 2004년 2월 9일 별책요청저자 : 권오식, ( 우 ) 대구광역시달서구신당동 1000번지, 계명대학교자연과학대학미생물학과 Tel: , Fax: biv@kmu.ac.kr 론 sense RNA를갖지만, 이것이숙주세포내에서는염색체에통합되어 provirus 상태인복쇄 DNA로존재한다 1). BLV 게놈은 5'-LTR-gag-pol-env-LTR-3' 구성을갖는데 pol gene은 2,599 bp로역전사효소 (RT) 와통합효소 (IN) 를암호화하고있다. 역전사효소와통합효소는바이러스 mrna를 DNA로바꾸어주며바이러스감염후숙주세포에 provirus DNA 상태로통합할수있게하여지속적감염을가능케하는가장중요한 retroviral 효소들이다 6,17,19). 특히 RT는 primer를이용하여데옥시뉴클레오시드 5'-삼인산을연결시켜서이중가닥의 DNA- RNA를생성하기위해 RNA 분자를복사하며, DNA-RNA 혼성체에서 RNA를분해시켜서상보적인 DNA 가닥의합성을개시하는 RNA 내부핵산가수분해효소활성 (e.g., RNase H) 을가진다 19). 한편 pol gene의 3' 영역에는이유전자의 3분의 1의크기를점유하는 integrase (IN) 유전자가존재하는데 2,6), 이의산물은 viral ds DNA를세포의염색체 DNA에공유결합으로연결하여통합시킨다. 이것은 viral DNA의 3' 에대한내부핵산가수분해효소활성을포함하는것으로표적 DNA의절

2 단과세포성 DNA에바이러스를연결하는연결효소기능을갖고있다 4). 그리고, 숙주세포의 DNA에통합된바이러스는세포를파괴시키지않고증식형감염을나타내는데 virus DNA가숙주세포의 RNA 중합효소 II에의해서바이러스 RNA와 mrna로전사되어증식하게된다. 통합된바이러스의 DNA는 5' TG와 3' CA 말단을가지는것으로보아공통적인통합기작이있음을나타낸다 19). 바이러스유전자가숙주세포에통합되고나면 provirus DNA는세포분열에영향을끼치지않고딸세포로전달되며완전한바이러스입자를생산하게된다. 이렇듯 pol gene의산물은바이러스복제에있어서중심적인역할을하기때문에많은 retrovirus의 pol gene 염기서열이비교연구되어왔다. 특히 pol gene은아주보존적인불변부염기서열을갖고있으며이부분의 RT와 IN의아미노산서열은바이러스복제기전에중요한역할을하고있음 9,10) 이알려져있다. 본연구에서는한국형 BLV의정체를밝혀내는일환으로 pol gene의 3' 영역에위치하고있는 BLV IN 유전자의염기서열을결정하고그성질을규명하고자하였다. 특히 BLV 게놈의염기서열에대한연구는미국과호주를비롯한선진국에서만이루어지고국내에서는없기때문에, 우리나라에전파되고있는한국형 BLV의 IN에서의돌연변이정도를호주형 BLV의 IN과비교조사하였다. 재료및방법 1. PBMC 분리및 DNA extraction 본연구를위하여 BLV 에감염된것으로추정된 12마리의젖소에서혈액을채취해혈청과 peripheral blood mononuclear cells (PBMC) 를분리하였다. BLV 를포함한 Oncornavirinae는숙주세포에 provirus 상태로존재하기때문에 BLV 의감염여부를확인하는첫번째방법으로채취한혈액에서혈청과 PBMC를분리하였다. 먼저, sodium heparin 튜브에담긴 10 ml의 fresh blood에동량의 1X HBSS를넣고 50 ml 원심분리관에서잘섞은후, 이중 7 ml를 3 ml의 Histopaque-1077 (Sigma) 용액이든 15 ml 원심분리관에파스퇴르피펫을이용하여조심스럽게중층하였다. 이를냉장원심분리 (2,500 rpm/20 min) 하여튜브중간에있는 PBMC 층을 2 ml 걷어내고 1X HBSS로두번세척한후다시원심분리하여 PBMC 를침전시켰다. 2. PBMC chromosomal DNA 추출 Phenol/chloroform 추출방법 16) 을이용하여분리한 PBMC 에서 genomic DNA를추출하였다. 먼저, PBMC가들어있는 15 ml 원심분리관에 DNA lysis buffer (20 mm Tris-HCl, ph 7.6; 10 mm EDTA; 100 mm NaCl; 0.5% SDS; 200 µg/ml pro- teinase K) 를첨가하여실온에서밤새배양하였다. 다음날, 세포가용해된튜브에 phenol/chloroform (50:50) 용액을동량으로넣어잘섞은후 2,500 rpm에서 30분간냉장원심분리하여상청액을새 15 ml 튜브에모았다. 이상청액은다시 phenol/chloroform으로처리하고 chloroform (100%) 과혼합용액을만들어원심분리하였다. 얻어진상청액은 RNase (10 mg/ml) 로처리하고최종적으로얻어진 PBMC genomic DNA 의순도를 spectrophotometer로확인하였다. 각각의 genomic DNA는 T 10 E 1 buffer (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 8.3) 에 500 µg/ml의농도로준비해 -20 에저장하여사용하였다. 3. Polymerase chain reaction PCR 반응에사용된 primer들은알려진일본형및서구형 BLV pol gene 불변부영역의염기서열로합성된일련의 primers (Table 1) 로서 100 pmol/µl 농도로사용하였다. 사용된 PCR 반응용액의구성성분은 10X Taq DNA polymerase buffer, 40 mm dntp, oligonucleotide primers (200 pmol씩 ), 2 unit Taq DNA polymerase, 25 mm MgCl 2, dh 2 O 및 DNA 용액를포함하여전체반응액을 50 µl로만든후 mineral oil (Sigma) 을더했다. PBMC genomic DNA는실험목적에따라그양을 1.0~4.0 µg/reaction으로조절하여준비된 PCR 반응용액과잘혼합하여 thermal cycler (Perkin-Elmer Model 480) 로반응시켰다. 반응 cycle은반응최적화를위해 95 에서 7분간 denaturation 시킨후 95 에서 30초, 55 에서 30초, 72 에서 1분으로모두 45회반복하였으며, PCR DNA의완성을돕기위해 72 에서 10분간반응을연장시켰다. Denaturation 과정은 Taq DNA polymerase를제외한나머지 PCR 반응액을넣고진행하였는데 5분이경과한후 PCR-tube를얼음에재빨리냉각시켜 renaturation을방지한후 Taq DNA polymerase를 2 unit을첨가하여 3분간 pre-denaturation을실행하였다. 반응이끝난 PCR product는 50 µl 중 10 µl를사용해 6X loading buffer를더한다음 2% Sigma (3:1) agarose gel에서전기영동하여 PCR product의크기를확인하였다. 전기영동은 100 ml agarose gel에 ethidium bromide (10 mg/ml) 5 µl를염색하였고 UV transilluminator에서밴드를확인한후폴라로이드필름 (667) 으로사진을찍었다. 4. DNA purification DNA를정제하는방법은 QIAEX II 젤추출 kit (Qiagen) 를이용하였고전반적인과정은 kit의설명서에따라실시하였다. Agarose 젤상에서얻어진 DNA 밴드는사무용칼을이용해조각내어얻었다. 이 DNA 밴드의무게를측정하여 250 mg 내의범위에서젤무게의 3배가되는 QIAEX I을넣었다. 여기에 QIAEX II suspension을 10 µl 첨가하고 50 heat block에서 20분간배양시켰다. 이때 2분간격으로 vortex

를실시하였다. 이를원심분리하여 (12,000 rpm/3 min) bead 와결합된 DNA를침전시키고, 얻어진침전물에 500 µl QIAEX I을넣어원심분리하고 pellet에 500 µl PE buffer를넣어 washing을반복하여수행하였다. 최종적으로얻어진침전물은공기건조하여일정량의 dh 2 O를넣어실온에서배양시켜 elution하였다. 5. DNA sequencing Automatic sequencer의사용을위한 labelling reaction은 thermal cycle 반응을이용하였다.

3 를실시하였다. 이를원심분리하여 (12,000 rpm/3 min) bead 와결합된 DNA를침전시키고, 얻어진침전물에 500 µl QIAEX I을넣어원심분리하고 pellet에 500 µl PE buffer를넣어 washing을반복하여수행하였다. 최종적으로얻어진침전물은공기건조하여일정량의 dh 2 O를넣어실온에서배양시켜 elution하였다. 5. DNA sequencing Automatic sequencer의사용을위한 labelling reaction은 thermal cycle 반응을이용하였다. 먼저 reaction pre-mix에 template DNA, dh 2 O, Big dye, buffer, primer (PCR 반응과동일한 primer, 4 pmol/µl) 를넣어 denaturation 을 94 /10초, annealing 을 50 /5초, extension을 60 /4분으로 25회반복하였으며 pre-denaturation을 96 /30초에서추가로처리하였다. 이방법은 unincorporated된 dye-dntp/ddntp를제거하는방법으로 sequencing ladder DNA만모아전기영동에사용하였다. 먼저, Sephadex G-50 (DNA grade) 을 dh 2 O에서정치하였고상온에 3시간둔후 15,000 rpm에서 3분간원심분리하였다. Sample은 column을사용해 DNA만 Sephadex를통과시켜 collection tube에모았다. Sequencing fragment 는 Speed Vac 으로건조하여 dh 2 O로농축하였다. 회수된 template DNA에비이온성계면활성제인 formamide를첨가하였고 95 에서 2분간 denaturation시켰다. 염기서열의해독과정은자동 DNA sequencer (Perkin-Elmer ABI Prism 3700 DNA analyzer) 를이용 Table 1. List of PCR primers used in this study Primers Sequences Length WBLV01 WBLV02 WBLV03 WBLV04 WBLV05 WBLV06 WBLV07 WBLV08 WBLV09 WBLV10 WBLV11 WBLV12 WBLV14S 5'- CCCGAGCCACATTGGATTAGAAC -3' 5'- CTGAAACCCTAGGTCCCGGAGG -3' 5'- CCCAGTCTCTTCTGGTGTCCTATATGG -3' 5'- CTGAACTCGAGGGTCCTCAGATG -3' 5'- CTTCTCCTGCTGGGATGCCAATA -3' 5'- GATTGCTGGATGTCGGAGGAGGC -3' 5'- AGCTTGGCTTCAACCTGACCC -3' 5'- GAAGGTGGGGTTCGTCTAAGTGAT -3' 5'- CCCTACAACCCCACAAGTTCGG -3' 5'- AGCATCTCCAAGTCTGGATGGGC -3' 5'- ACCCCCTTGACTGACAACC -3' 5'- CATGACCAACAACGATTGC -3' 5'- TTACCCATCTGATGATCGG -3' 22 mer 27 mer 21 mer 24 mer 22 mer 19 mer 19 mer 19 mer Fig. 1. Map of the BLV pol gene and the site of PCR for sequencing of Korean- type BLV integrase region. The diagram was made on a basis of the complete BLV nucleotide sequences reported by Sagata et al. (15)

Fig. 2. Preliminary PCR results with various primers for Korean-type BLV pol gene detection. The used primers were WBLV 01~02, WBLV 03~04, WBLV 07~08, WBLV 09~10, WBLV 11~12.

Lane 3 represents the PCR product using FLK-BLV DNA as a positive control. A 해실시하였다. 결과및고찰 1. 한국형 BLV 의 pol gene 검출을위한 PCR 최적화 Primer의염기서열은 BLV pol gene 전체영역 (2,559 bp, Fig.

BLV 가감염된 PBMC 의 DNA를 PCR할때사용된각각의 primer와얻어진밴드의크기는 WBLV 01~02 ( 밴드크기 618 bp), WBLV 03~04 (716 bp), WBLV 05~06 (555 bp), WBLV 07~08 (698 bp), WBLV 09~10 (529 bp) 등이며, 이중 WBLV 05~06은 WBLV 11~12 (607 bp)

4 Fig. 2. Preliminary PCR results with various primers for Korean-type BLV pol gene detection. The used primers were WBLV 01~02, WBLV 03~04, WBLV 07~08, WBLV 09~10, WBLV 11~12. Lane M represents DNA size marker (ΦX174 HaeIII digested). Lane 1 represents the PCR product using BLV 10C3 DNA sample. Lane 2 represents the PCR product using BLV 10C5 DNA sample. Lane 3 represents the PCR product using FLK-BLV DNA as a positive control. A 해실시하였다. 결과및고찰 1. 한국형 BLV 의 pol gene 검출을위한 PCR 최적화 Primer의염기서열은 BLV pol gene 전체영역 (2,559 bp, Fig. 1) 을대상으로 DNA 분석프로그램인 OMIGA 2.0 (Oxford Molecular, UK) 을이용하여결정하였다. 이로부터얻어진 primers들은 Table 1에나타난바와같다. BLV 가감염된 PBMC 의 DNA를 PCR할때사용된각각의 primer와얻어진밴드의크기는 WBLV 01~02 ( 밴드크기 618 bp), WBLV 03~04 (716 bp), WBLV 05~06 (555 bp), WBLV 07~08 (698 bp), WBLV 09~10 (529 bp) 등이며, 이중 WBLV 05~06은 WBLV 11~12 (607 bp) 로대체하였다. 또한실험이진행되는중 primer WBLV 10은 WBLV 14S로대체하였는데 primer WBLV 09와조합하여사용할시만들어지는 PCR DNA 밴드의크기는 435 bp가되었다 (Fig. 1). 본연구에서사용된한국형 BLV 는감염된젖소 PBMC sample 10C3의 BLV provirus ( 이하 BLV 10C3) 로서, IN 영역을포함하는 BLV pol gene은이 PBMC의 chromosomal DNA 에존재한다. 따라서한국형 BLV pol gene의존재여부는상기한 primer set을사용한 PCR로확인할수있었다 (Fig. 2). 한편한국형 BLV pol gene의 3' 영역에존재하며전체 pol gene의 3분의 1의크기를점유하는 IN 유전자를 PCR로검출하였다 (Fig. 3). 이를위해사용한 PCR primers는 WBLV Fig. 3. PCR results for Korean-type BLV integrase gene by applying primers WBLV 07~08 and WBLV 09~10. The band size of the target DNA were 698 bp and 529 bp, respectively (A). Reamplification results of the PCR DNA showed a single DNA band (B). Lane descriptions: M represents DNA size marker (ΦX- 174 HaeIII digested). Lanes 1~6 represent BLV 10C2, BLV 10C3, BLV 10C5, BLV 10C6, BLV 10C7 and BLV 10C8, respectively. 07~08과 WBLV 09~10으로, 이들이만들어내는 DNA 밴드의크기는각각 698 bp 및 529 bp이며 BLV pol gene 내의 IN 영역을충분히커버하고있다. Fig. 3A는여러가지 PBMC chromosomal DNA (10C2, 10C3, 10C5, 10C6, 10C7, 10C8) 를이용하여이들 primers를사용했을때얻어지는 PCR 결과이다. 여기서얻어진 2개의 DNA 단편을절단해 QIAEX II 젤추출 kit (Qiagen) 를사용하여 DNA를정제한후다시같은 primers를사용해 PCR을한결과, Fig. 3B에서보는것처럼 BLV IN 유전자의염기서열을포함하고있는 2가지의뚜렷한 B

5 5' - CATCCAGCAA TCTTTGTTGG TCATGTCCGG AGCCACTCTT CAGCATCCCA CCCTATTGCT TCCCTGAACA A TTATGTAGA TCAACTGCTT CCCTTAGAAA CTCCAGAGCA A TGGCATAAG CTCACCCACT GCAACCCTCG GGCCTTGTCT CGATGGCCGA ACCCACGTAT CTCTGCCTGG GACCCCCGTT CCCCCGCTAC GCTGTGTGAA ACCTGTCAAA AGCTCAATCC AACTGGAGGA GGAAAGATGC GAACTATTCA AAGAGGGTGG GCCCCGAATC ATATTTGGCA GGCCGATATA ACCCATTATA AATACAAACA GTTCACCTAC GCTCTGCATG TGTTTGTAGA TACTTACTCT GGAGCTACTC ATGCCTCGGC GAAGCGTGGG CTCACCACTC AAATGACCAT TGAGGGCCTT CTTGAGGCCA TAGTGCATTT GGGACGTCCA AAAAAGCTAA ACACTGACCA AGGTGCAAAC TACACCTCCA AAACCTTTGT CAGGTTTTGC CAGCAGTTCG GAGTTTCCCT TTCTCATCAT GTTCCCTACC ACCCCACAAG TTCGGGGTTA GTAGAACGGA CAAATGGACT GCTCAAACTT CTTCTATCTA AATATCACCT AGACGAACCC CACCTTCCCA TGACTCAGGC CCTTTCTCGA GCCCTTTGGA CTCACAATCA GATTAACCTC CTACCAAATC TAAAGACCAG ATGGGAGTTA CACCATTCAC CCCCACTTGC TGTCATTTCA GAGGGCGGAG AAACACCCAA GGGCTCTGAT AAACTGTTGT TGTACAAGCT TCCCGGGCAA AACAATCGTC GGTGGCTAGG ACCACTCCCG GCCCTAGTCG AAGCCTCGGG AGGCCCTCTC CTGGCTACTG ACCCCCCCGT GTGGGTTCCC TGGCGTTTGC TGAAGGCCTT CAAGTGCCTA AAAAACGACG GTCCCGAAGA CGCCCCGAAC CGATCATCAG A T G G G T A A -3' Fig. 4. DNA sequences of BLV 10C3 integrase region (3' side of the BLV pol gene). The first codon for BLV integrase should be located in the region of the boxed area. 단일 DNA 밴드를얻을수있었다. 이 DNA 밴드를 BLV IN 유전자의염기서열을결정하는데사용할수있었다. 2. 한국형 BLV integrase 유전자의 DNA 염기서열결정 BLV의 IN은 Gag-Pol polyprotein (pr145) 으로부터 retroviral protease의가수분해작용으로절단되어나오기때문에실제적으로이의 DNA 염기서열은 pol gene의 3' 영역에존재한다 2,6). 따라서우리는 BLV 10C3 pol gene의 3' 영역의염기서열을결정하여 IN 유전자에해당하는부분의염기서열을결정하였다. 즉, primer WBLV 07~08을이용하여 698 bp 크기의 DNA를얻을수있었으며 primer WBLV 09~10을이용하여 529 bp 크기의 DNA를얻을수있었다. 이들 DNA를각 각 sequencing 하였으며 IN 유전자라고추정되는 978 bp의염기서열을결정할수있었다. 이때한국형 BLV 10C3 IN의 C-terminal 부분의염기서열은 TAA (=UAA) 라는 stop codon 을발견함으로써정확히결정할수있었으나, 한국형 BLV IN의 N-terminal의시작부분은정확히결정하기가어려웠다. 왜냐하면 BLV IN의생성은 BLV 복제시 pol 유전자가 polyprotein 형태로번역된후만들어지기때문에, 일반적으로단백질을코딩하는유전자의시작이 ATG (start codon) 로시작되지않기때문이다. 그결과는 Fig. 4에정리되어있는바와같다. 현재까지 BLV IN region이정확히결정되어있지않기 2) 때문에 HIV의 IN이 288 AA (864 bp) 로이루어지고있음을 6)

6 점을착안해이크기를완전히 covering할수있는곳까지염기서열을결정하였다. 즉우리는 BLV pol gene의 3' region (IN gene을포함하는 ) 978 bp에해당하는염기서열을확인하 였으며, Fig. 4에제시된 DNA 염기서열의 5' 부분 ( 즉 IN 유전자의 3' end인 TAA에서 864 bp~978 bp 상류인 +1에서 +114 사이, Fig. 4의 box 부분임 ) 에 IN 유전자의시작점이존 Fig

7 Fig. 5. Comparison of BLV integrase DNA sequences between Korean-type BLV (denoted as BLV 10C3) and Australian BLV (denoted as AUS BLV). The first 4 boxes (double lines) is the location of "HHCC" motif in the BLV integrase amino terminus. The next 4 boxes (single lines) is the location of DD35E motif found in the region of carboxyl terminus of BLV integrase. Among them, a thin lined box represents putative D in DD35E motif. The integrase sequences of the Australian BLV was according to Coulston et al. (3) published as an Australian BLV isolate. 존재할수있다고추정하였다. 특히이부위에 retroviral pro-

8 재할수있다고추정하였다. 특히이부위에 retroviral protease의기질절단아미노산 2) 인소수성아미노산 (Phe, Tyr, Trp) 과글루타민 (Gln) 혹은염기성아미노산 (His, Lys, Arg) 들이많이분포해있는점을착안해본다면 +1 bp에서 +114 bp 사이에서 IN 유전자의염기서열이시작될것이라고사료되었다. 3. 한국형 BLV integrase 유전자염기서열과호주형 BLV integrase 유전자염기서열의비교한국형 BLV IN 유전자의염기서열특성과이의아미노산서열을알아보기위하여결정된염기서열수 (978 bp) 에해당되는 DNA 염기서열및이의아미노산서열을호주형 BLV pol gene (Coulston et al., 1990) 과비교하였다 (Fig. 5). 그결과한국형 BLV IN 유전자에서는점돌연변이를포함한총 36개의염기가치환되어, = 3.7% 돌연변이율을보여주었다. 즉, 한국형 BLV 10C3의 IN 유전자와호주형 BLV IN 유전자의염기서열은 96.3% 의높은상동성을보여주었다. 이러한수치는박등 12) 에의해보고된여러종의한국형 BLV의 pol gene 돌연변이율인 2.01%~4.02% ( 평균 2.9%) 와매우근접함을보여주었다. 또한몇개의점돌연변이는결과적으로 6개의아미노산을치환시켰기때문에한국형 BLV 10C3의 IN은호주형 BLV IN과비교해볼때총 6개의아미노산서열이달라져있었다. 즉, 호주형 BLV IN에서발견되는 Arg (AGG) Lys (AAG), Thr (ACG) Met (ATG), Ile (ATT) Val (GTT), Asn (ACC) His (CAC), Phe (TTT) Leu (TTG) 및 Asn (ACC) Asp (GAC) 로한국형 BLV IN 유전자에서는바뀌어있었음을확인할수있었다. 이들의변화를좀더조사해보면 Arg Lys는염기성 AA가염기성 AA로그리고 Ile Val로의변화는같은비극성지방족 AA로의변화이기때문에폴리펩티드자체에큰변화를주지는않았다. 하지만 Thr Met는극성 AA가비극성지방족 AA로의변화이며, Asn His는극성 AA가염기성 AA로, Asn Asp은극성 AA가산성 AA로변화되었으며 Phe Leu의경우방향족 AA가비극성지방족 AA 로바뀌게된것이다. 즉이러한결과는한국형 BLV가호주형 BLV와같은 BLV이지만돌연변이결과로우리나라의고유의 BLV로정착된것으로사료되었다. 4. 한국형 BLV integrase 의 HHCC motif 와 DD35E 의결정결정된염기서열을아미노산서열로변환시켜보았을때, 한국형 BLV IN에서도모든 retroviral IN에서보존되어있는불변부아미노산들인아미노말단부위의 zinc-finger-like "HHCC" motif가발견되었다 (Fig. 5, 이중 box). 이는모든 retroviruses와 transposon 및원핵세포 transposable elements에 강하게보존되어있는 motif로 IN의활성에필수적인요소이다 6,7). 만일이 motif에돌연변이가일어나면통합기전이불가능하여바이러스의 in vivo 복제가일어나지않는다 13). 이번에조사된한국형 BLV IN의 HHCC motif에서는히스티딘과히스티딘의사이에 3개의아미노산이존재하며시스테인과시스테인인사이에는 2개의아미노산이존재하고있었다. 그리고히스티딘과시스테인의거리는 25개의아미노산으로떨어져있었다. 이것은호주형 BLV의 IN에서도마찬가지였는데, 이로서우리는 BLV IN의 HHCC motif가 H-X 3 - H-X 25 -C-X 2 -C임을확인할수있었다. 일반적으로히스티틴과시스테인의거리는 23~32 AA인것으로 2,5) 알려져있는데한국형 BLV 및호주형 BLV에서는 25 AA임을알수있었다. 또한 IN과 transposases의보편적 motif인 "DD35E" 가발견되었다 (Fig. 5에표시된 solid box들 ). IN 촉매활성부위 8) 의핵심적인아미노산 (DDE) 들은인산전이반응을촉매하는것으로알려져있는데 4), 한국형 BLV의 IN에서의 DD35E domain은 D-X 56 -D-X 35 -E로나타났다. 하지만 BLV 경우 Asp 가 D2의상류부 39번째 AA 위치에또존재하기때문에 BLV integrase의 DD35E domain은 D-X 38 -D-X 35 -E일수도있다고사료되었다. 하지만일반적인 IN의 DD35E domain의구성은 D-X( 39~58 )-D-X 35 -E이기 4,14) 때문에이에대한조사는추후계속되어져야할것이다. 이상을종합해보면이번에조사된한국형 BLV IN의염기서열은호주형 BLV IN 염기서열과 96.3% 의 homology를보이면서어느정도의차이를나타내고있었으나 IN의효소활성에절대적인필수요소들 (HHCC motif 및 DD35E) 은두가지의 BLV ( 한국형및호주형 ) 모두에서잘보존되어있음을알수있었다. 감사의글본연구는 2000년도계명대학교비사연구기금으로이루어졌음. 참고문헌 1) Burny A, Cleuter Y, Kettmann R, Mammerickx M, Marbaix G, Portetelle D, Van Den Broeke A, Willems L and Thomas R (1988): Bovine leukemia: Facts and hypotheses derived from the study of an infectious cancer. Adv Vet Sci Comp Med, 32(1): ) Coffin JM, Hughes SH and Varmus HE (1997): Retroviruses, pp Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. 3) Coulston JC, Naif H, Brandon R, Kumar S, Khan S, Daniel RCW and Lavin MF (1990): Molecular cloning and sequencing of an Australian isolate of proviral bovine leukemia

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence