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상렬 방
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1 대한피부과학회지 2009;47(6): 원저 각질형성세포에서레티노인산 (All-trans Retinoic Acid) 에의한 IL-8 발현의기전 연세대학교의과대학피부과학교실, 피부생물학연구소 정예리ㆍ강태원ㆍ오성민ㆍ정승용ㆍ김수찬 A Mechanism for the Up-regulation of the IL-8 Gene Expression in Keratinocytes by All-trans Retinoic Acid Yae Lee Chung, M.D., Tae-Won Kang, M.D., Sung Min Oh, Seung Yong Chung, Soo-Chan Kim, M.D. Department of Dermatology and Cutaneous Biology Research Institute, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Background: Retinoic acid (RA) has been reported to induce the up-regulation of inflammatory cytokines such as IL-1, TNF-α and IL-8 in dermal fibroblasts and keratinocytes. There is no evidence to support a direct interaction between the RA-mediated transcriptional machinery and IL-8 gene transcription. Objective: The aim of this study is to clarify the mechanism of the up-regulation of IL-8 in keratinocytes by RA. Methods: The IL-1, IL-8, TNF-α and MCP-1 mrna expressions in HaCaT cells stimulated by RA were measured by quantitative RT-PCR. The effects of a NF-κB inhibitor and IL-1 receptor antagonist (ra) on the IL-8 mrna expression were measured by quantitative RT-PCR. Electrophoretic motility shift assay (EMSA) was conducted on the RA-stimulated HaCaT cells that were or were not treated with NF-κB inhibitor to measure the NF-κB binding activity in each group. The phospho-iκb activity in the HaCaT cells after stimulation with RA was also measured by Western blotting. Results: An up-regulation of the IL-8 gene expression by RA was demonstrated in the HaCaT cells. The inhibition assay revealed the involvement of the NF-κB binding site of the IL-8 gene in the RA-enhanced promoter activity. EMSA demonstrated that RA enhanced the formation of the DNA-NF-κB complex. There was no evidence to support IL-1 as an intermediate stimulus between the RA-mediated transcriptional machinery and IL-8 gene transcription. Western blot analysis revealed increased phospho-iκb activity in the HaCaT cells after stimulation with RA. Conclusion: Our result suggested that the IL-8 gene expression of HaCaT cells after RA stimulation is caused by the activation of IKK and the dissociation of IκB from NF-κB and the transcription of NF-κB in the nucleus. (Korean J Dermatol 2009;47(6): ) Key Words: HaCaT cells, IL-8, NF-κB, Retinoic acid 서 레티노이드는합성및자연상태의비타민 A 로서생체 < 접수 : 2009 년 4 월 24 일, 게재허가 : 2009 년 5 월 29 일 > * 이연구는연세학술연구비지원 (2004 년 ) 으로이루어졌음. 교신저자 : 김수찬주소 : 서울시강남구언주로 712 강남세브란스병원피부과전화 : 02) , Fax: 02) kimsc@yuhs.ac 론 내에서레티노인산 (retinoic acid, RA) 으로변형되어기능을한다 1-3. 세포내활성상태인레티노인산은각질형성세포의증식과분화를조절할뿐만아니라피지선을억제하여건선이나여드름치료제로사용되고있다. 그리고진피의콜라겐분해효소를억제하기때문에피부주름의개선제로흔히이용된다 1-3. 그러나레티노인산의국소도포는홍반과인설을동반한자극성피부염을유발하므로그사용에제한이있다 4-6. 이러한자극성피부염의원인으로사이토카인이관여되리라생각되며, 레티노인산을국소도포한마우스피부와레티노인산을투여한배양각질형성세포에서 674

2 정예리외 : 각질형성세포에서레티노인산 (All-trans Retinoic Acid) 에의한 IL-8 발현의기전 675 IL-1 과 IL-8 유전자발현이증가됨이보고된바있다 7,8. 레티노인산은핵내에서레티노인산수용체 (retinoic acid receptor, RAR) 와결합하여 레티노인산과레티노인산수용체의복합체 를형성한다. 이복합체가전사인자로작용하여표적유전자의전사개시를위한표적유전자프로모터 (target gene promoter) 의레티노인산반응영역 (retinoic acid response elements, RARE) 에결합하여표적유전자의발현을유도하여여러가지기능을나타낸다 그러나각질형성세포에서레티노인산에의한사이토카인발현이어떤기전에의한것인지아직밝혀져있지않다 13,14. IL-8 은호중구나 T 세포의화학주성에관계하거나세포사이의결합이나호중구의활성화또는 histamine 의분비를조절하는등의역할을하는사이토카인으로서여러세포에서자극특이적인방법으로분비된다. 인간의 IL-8 프로모터의 5 flanking region 에는 AP-1, AP-2, AP-3, glucocorticoid receptor, NF-κB, NF-IL-6 등의전사인자가결합할수있는반응영역 (response element) 이있어 IL-8 의분비를조절한다. 이중에서 NF-κB 는 IL-8 유전자발현에핵심적인역할을한다 15. 하지만 IL-8 프로모터에는레티노이드가결합하는반응영역이없으므로레티노이드에의한 IL-8 유전자발현의기전을밝히는연구가필요하다. NF-κB 는사이토카인의발현을통해면역반응과염증반응을매개하는중요한전사인자이다. 다양한신호에의해자극되면 NF-κB 에붙어있는 IκB 는 IκB kinase (IKK) 에의해인산화되면서분리되어분해 (degradation) 되고, NFκB 는세포질에서핵으로이동하여여러가지유전자들의발현을활성화시키게된다. 그중에서도 IL-1 및 IL-8, TNF-α 는 NF-κB 에의해서활성화되며, 이들은다시 NFκB 를직접적으로자극하여자가조절성고리를형성하여다른사이토카인을생산하게함으로써염증반응을증폭시킨다 16. NF-κB 는사이토카인생성외에도부착분자와 nitric oxide (NO) 및 cyclooxygenase (COX-2) 와같은효소의생산도유발하여염증반응을일으키며세포고사를억제하여세포를보호하는역할도함께하고있다 17,18. 이번연구에서는각질형성세포에레티노인산을투여한후 IL-1, TNF-α, IL-8, MCP-1 의 mrna 유전자발현을실시간정량 PCR 로측정하였다. 그리고사이토카인발현에주로관여하는전사인자인 NF-κB 의작동여부를 electrophoretic motility shift assay (EMSA) 로확인하고, NF-κB 억제제를이용하여 NF-κB 가작동하지않을때 IL-8 의발현여부를확인하였다. 그리고레티노인산이 IκB 의인산화를증가시켜 NF-κB 의활성화를유도하는지알아보았다. 또한레티노인산이 NF-κB 를통해 IL-8 유전자발현에영향을줄때직접적인자극보다는간접적인경로가있을가능성을생각하였다. 따라서중간자극제로서가능성이있는 IL-1 의영향으로 NF-κB 가활성화되어 IL-8 유전자가발현되는지를알아보기위해 IL-1 receptor antagonist (ra) 를이용하여 IL-1 의영향을배제한후레티노인산에의한 IL-8 유전자발현을확인하였다. 1. 실험재료 재료및방법 본실험에사용된 HaCaT 세포는형질전환된각질형성세포로정상각질형성세포와형태및반응양식이동일하면서지속적인계대배양이가능한장점이있다. 2. 실험방법 1) HaCaT 세포배양 HaCaT 세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) 과 1% antibiotic/antimycotic (Gibco BRL) 을첨가한 RPMI-1640 (Gibco BRL) 을세포배양액으로이용하였다. 37, 5% CO2 조건의배양기에서배양하면서실험에사용하였다. 2) 레티노인산의처리 10% FBS 가포함된배양액으로배양된 HaCaT 세포가 culture flask 면적의 80% 정도를차지하면, 각 culture flask 에 0.1% ethanol, 10 6 M, 10 7 M 및 10 8 M 의레티노인산 (all-trans-retinoic acid, ATRA) (Sigma, St, Louis, MO, USA) 을 2% FBS 가포함된배양액에각각첨가하여 1 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간동안배양하였다. 3) 실시간정량 PCR 를이용한사이토카인 mrna 의정량 (1) RNA 분리및정량 : 배양한 HaCaT 세포로부터 RNA 를분리하기위하여 TRIzol reagent (Gibco BRL) 을사용하여제작사의설명서에따라분리하였다. 각대조군과실험군으로부터분리한 RNA 를 60 o C water bath 에서 10 분간가열시켜 single strand 로분리한후 spectrophotometer (Biophotometer, Eppendorf, Hamburg, Germany) 를이용하여 RNA 농도및순수도를측정하였다. (2) 역전사반응 (Reverse transcription): 각각의대조군과실험군으로부터분리하여정량, 보정한 RNA 1μg 에 RNA PCR Kit Ver2.1 (TaKaRa, Shiga, Japan) 를이용하여제작사의설명서에따라역전사반응을실행하였다. (3) 실시간정량 PCR (Real time quantitative polymerase chain reaction): cdna 와표적사이토카인유전자의 primers 로디자인한 Light Cycler probes 그리고 Light Cycler reaction protocol 에따라만든 mixture 를섞어만든각각의반응혼합액을 capillary 에, 한실험개체당 20 μl 씩채운다음, 95 o C 1 분 (1 회 ), 95 o C 10 초 (1 회 ), [60 o C 15 초, 72 o C 8 초 ](40 회 ) 의 thermal cycling condition 에서 Light Cycler (Roche, Mannheim, Germany) 를이용하여실시간정량 PCR 을진행시켰다. 실시간정량 PCR 에사용된각사이토카인의 primers 및 Light Cycler probes 는 Table 1 과같다. 인체 glucose-6-phosphate dehydrogenase (h-g6pdh) 유전자를기준표지자로이용하였다. 최종 PCR 증폭산물의양은 h-g6pdh 기준유전자를 에서 까지 10 배단위로단계적으로희석하여각각의 cycle 에해당하는

3 676 대한피부과학회지 : 제 47 권제 6 호 2009 년 Table 1. Cytokine primers and hybridization probe for quantitative RT-PCR IL-1 Primers Forward 5'-GTATGTGACTGCCCAAGA-3' Reverse 5'-CAAGCACACCCAGTAGTCT-3' Amplicon size 190 bp Hybridization probe 5'-AGTGCCGTGAGTTTCCCAGAAGAAGA-3' 3' Label: Fluorescein 5'-GAGGTTGGTCTCACTACCTGTGATGGTT-3' 5' Label: LCRed640 3' Label: Phosphorylated GenBank access number NM_ TNF-α Primers Forward 5'-CAGCCTGTAGCCCATGTT-3' Reverse 5'-ATGGCAGAGAGGAGGTTGAC-3' Amplicon size 261 bp Hybridization probe 5'-GAGGGCCTGTACCTCTATCTACTCCCA-3' 3' Label: Fluorescein 5'-GTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTG-3' 5' Label: LCRed640 3' Label: Phosphorylated GenBank access number NM_ IL-8 Primers Forward 5'-TGCCAAGGAGTGCTAAAG-3' Reverse 5'-CTTCTCCACAACCCTCTG-3' Amplicon size 200 bp Hybridization probe 5'-GTCCACTCTCAATTCACTCTCAGTTCTTTGATA-3' 3' Label: Fluorescein 5'-ATTTGGGGTGGAAAGGTTTGGAGTATG-3' 5' Label: LCRed640 3' Label: Phosphorylated GenBank access number BC MCP-1 Primers Forward 5'-CGCTAGCCAGATGCAAT-3' Reverse 5'-TTGGGTTGTGGAGTGGGT-3' Amplicon size 255 bp Hybridization probe 5'-CGAGCCTCTGCACTGAGATCTTCCTA-3' 3' Label: Fluorescein 5'-TGGTGAAGTTATAGCAGCAGGTGACTGGG-3' 5' Label: LCRed640 3' Label: Phosphorylated GenBank access number M28226 실험군의양으로나누어비교정량하였다. 4) EMSA 를이용한 NF-κB 활성도측정 (1) HaCaT 세포로부터 nuclear extract 제작 : T75 플라스크에키운 HaCaT 세포를 PBS 로 2 회세척하고 PBS 1 ml 를넣은후 scraper 로세포를긁어 1.5 ml eppendorf tube 에옮겼다. 1,200 rpm 으로 5 분간원심분리한후상층액을제거하고 ph 7.9 의 10 mm HEPES, 1.5 mm MgCl 2 와 10 mm KCl, 0.5 mm DTT, 0.2 mm PMSF 로구성된 buffer 액 400μl 를넣고다시녹인후얼음위에 10 분간두었다. 그후 4 o C 에서 3 분간 12,000 rpm 으로원심분리한후다시상층액을제거하였다. ph7.9 의 20 mm HEPES, 20% (V/V) glycerol, 420 mm NaCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.2 mm EDTA, 0.5 mm DTT 와 0.2 mm phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) 로구성된 buffer 액 100μl 를넣고 vortex 한후 20 분간얼음위에두었다. 4 o C 에서 3 분간 12,000 rpm 으로원심분리한후상층액 (nuclear extract) 을단백농도 2μg/μl 로맞춘후 70 o C 에보관하였다. (2) Gel-shift assay: Nuclear extract 10μg 과 5 X incubation buffer 5μl, 증류수 25μl 을섞은후 4 o C 에서 15 분간방치하고 P 32 로표지된 NF-κB oligonucleotide (Promega, Madison, WI, USA) probe 2μl 를넣고실온에서 20 분간방치하였다. NF-κB 의 probe 은 NF-kB oligo (1.75 pmol/ul) 2μl 와 T4 polynucleotide kinase 10 buffer 1μl, r32p-atp 1μl, dh2o 5μl 와 T4 polynucleotide kinase 1μl 를섞어총

4 정예리외 : 각질형성세포에서레티노인산 (All-trans Retinoic Acid) 에의한 IL-8 발현의기전 677 용량 10μl 을 37 o C 에서 10 분간둔후에 0.5 M EDTA 1μl 으로반응을정지시켰다. 89μl 의 TE buffer 를첨가한후 unincorporated nucleotide 를제거하기위하여 G-25 spin column 통과시켜 1,300 rpm 으로 5 분간원심분리후하층액만취하여만들었다. NF-κB 의염기서열은다음과같다. NF-κB: 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3', 3'-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5'. Probe 를첨가후상온에서 20 분간보관한후 0.1% bromphenol blue (BPB) dye 를각샘플마다 2μl 씩넣고 6% non denaturing polyacrylamide gel 에 150 V, 10 ma 에서 2 시간전기영동시켰다. 전기영동이끝나면 vacuum gel dryer (Bio-Rad) 에서건조시킨후 X-ray film 에노출하여감광시켰다. 5) NF-κB 억제제처리후 IL-8 mrna 의발현 NF-κB 의억제제로는 Bay (Biomol, Plymouth, PA, USA) 을사용하였다. 10μM 의 Bay 를레티노인산투여 1 시간전에 HaCaT 세포에주고실시간정량 PCR 을시행하여 IL-8 mrna 의발현여부를확인하였다. 6) IL-1ra 처리후 IL-8 mrna 발현 IL-1 수용체를억제하기위해 IL-1ra (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) 50 ng/ml 을레티노인산처리 24 시간전에배양한 HaCaT 세포에미리투여하였다. IL-1ra 처리 24 시간후에레티노인산 10 6 M 및 10 7 M 을투여한후앞에서설명한방법대로 IL-8 mrna 발현을실시간정량 PCR 을시행해정량하였다. 7) Phospho-IκB-α 항체를이용한 Western blot 레티노인산을처리하여 12 시간, 24 시간배양한 HaCaT 세포를 100μl 의 SDS sample buffer 를이용하여세포를해리시킨후즉시 scraper 를이용하여세포를바닥에서떼어낸 후 micro tube 로옮겨서 초간초음파로분해한후 o C 정도로 5 분간가열해얼음에보관하였다. 이후 5 분간원심분리하고 SDS-PAGE gel 에세포추출액을 20μl 씩넣어 nitrocellulose membrane 에전이하였다. SDS sample buffer 의조성은 62.5 mm Tris-HCl, 2% w/v SDS, 10% glycerol, 50 mm DTT, 0.1% w/v bromophnel blue 이다. 전이후에 nitrocellulose membrane 을 25 ml TBS 로 5 분간상온에서보관후 25 ml 의 blocking buffer 를이용하여상온에서 3 시간둔후 Phospho-IκB-α 항체 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) 와 10 ml primary antibody dilution buffer 를첨가한후 4 o C 에서약간씩흔들어주며하룻밤두었다. 다음에 TBS-Tween 을이용하여 5 분간 3 차례세척한후 HRP-conjugated secondary antibody (1:2,000) 와 HRP-conjugated anti-biotin antibody (1:1,000) 와 blocking buffer 를이용하여 1 시간상온에서진동을주며보관후 TBS-Tween 을이용하여 3 차례세척하였다. Blocking buffer 의조성은 1 TBS, 0.1% Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk 를 150 ml 되게만든다음, 15 ml 10 TBS 와 135 ml water 를넣어섞는다. 그후 7.5 g 의 nonfat dry milk 를더넣고잘섞은다음 0.15 ml Tween-20 (100%) 을섞었다. Primary antibody dilution buffer 의조성은 1 TBS, 0.1% Tween-20 with 5% BSA 를 20 ml 되게만든다음 2 ml 10 TBS 와 18 ml water 를섞은후 1.0 g 의 BSA 를넣고섞을때 20μl Tween-20 (100%) 을넣었다. 세척한 membrane 을 10 ml LumiGLO (0.5 ml 20 LumiGLO, 0.5 ml 20 Peroxide and 9.0 ml Milli-Q water) 을첨가후 1 분간상온에서약간흔들어주면서관찰후 membrane 이마르지않는한도내에서과도한용액은제거후비닐랩 (saran wrap) 으로싼후 10 초간 X-ray film 에현상하였다. Fig. 1. Expression level of IL-8 and IL-1 mrna in HaCaT cells stimulated by 10 6, 10 7, and 10 8 M retinoic acid for 24 hours. (A) Expression of IL-8 mrna were increased for 1 24 hours after 10 6, 10 7, 10 8 M retinoic acid stimulation, (B) Expression of IL-1 mrna were increased for 1 6 hours after 10 6, 10 7, 10 8 M retinoic acid stimulation.

IL-1 mrna 의발현은 1, 6 시간에증가하였다가다시감소하였으며 (Fig. 1B), TNF-α 및 MCP-1 mrna 는발현이증가되지않았다. 2.

NF-κB 억제제투여전후의레티노인산처리후 HaCaT 세포에서의 NF-κB 결합활성도측정을위한 EMSA Fig. 2. Down regulation of the IL-8 mrna expression in HaCaT cells pretreated with NF-κB inhibitors. *p<0.

3. NF-κB binding activity in HaCaT cells by EMSA after treated with all-trans retinoic acid for 12 hours.

5 678 대한피부과학회지 : 제 47 권제 6 호 2009 년 결 1. 레티노인산투여후 HaCaT 세포에서의사이토카인발현량측정을위한실시간정량 PCR 실험 10 6, 10 7 및 10 8 M 레티노인산투여 1, 6, 12, 24 시간 과 후 HaCaT 세포에서발현된사이토카인 mrna 측정결과, 10 6, 10 7, 10 8 M 농도에서 IL-8 mrna 는 1, 6, 12, 24 시간에증가되었다 (Fig. 1A). IL-1 mrna 의발현은 1, 6 시간에증가하였다가다시감소하였으며 (Fig. 1B), TNF-α 및 MCP-1 mrna 는발현이증가되지않았다. 2. NF-κB 억제제를투여한후 IL-8 mrna 실시간정량 PCR 의결과 NF-κB 억제제 (Bay ) 투여후 10 6 및 10 7 M 레티노인산투여 12 시간후 HaCaT 세포에서발현된 IL-8 mrna 측정결과, 10 6, 10 7 M 두농도에서 IL-8 mrna 발현이유의하게저하되었다 (Fig. 2). 3. NF-κB 억제제투여전후의레티노인산처리후 HaCaT 세포에서의 NF-κB 결합활성도측정을위한 EMSA Fig. 2. Down regulation of the IL-8 mrna expression in HaCaT cells pretreated with NF-κB inhibitors. *p<0.01 1) NF-κB 에대한억제제 (Bay ) 투여전과후에 10 6 및 10 7 M 레티노인산처리 12 시간후 HaCaT 세포에서발현된 NF-κB 결합활성도 10 6 및 10 7 M 레티노인산투여 12 시간후 HaCaT 세포에서 NF-κB 결합활성도측정결과, 10 6, 10 7 M 두농도에서농도에비례하여 NF-κB 결합활성도가증가되었다 Fig. 3. NF-κB binding activity in HaCaT cells by EMSA after treated with all-trans retinoic acid for 12 hours. (A) Without NF-κB inhibitor, NF-κB binding activity was increased after 12 hours in HaCaT cells in 10 6, 10 7 M retinoic acid treated group, (B) After addition of NF-κB inhibitor, NF-κB binding activity was not increased after 12 hours in 10 6, 10 7 M retinoic acid treated group (P: probe only, N: normal, EtOH: ethanol, RA: retinoic acid, C: competitor). Fig. 4. NF-κB binding activity in HaCaT cells by EMSA after treated with all-trans retinoic acid for 24 hours. (A) Without NF-κB inhibitor, NF-κB binding activity was increased after 24 hours in HaCaT cells in 10 6, 10 7 M retinoic acid treated group, (B) After addition of NF-κB inhibitor, NF-κB binding activity was not increased after 24 hours in 10 6, 10 7 M retinoic acid treated group (P: probe only, N: normal, EtOH: ethanol, RA: retinoic acid, C: competitor).

6 정예리외 : 각질형성세포에서레티노인산 (All-trans Retinoic Acid) 에의한 IL-8 발현의기전 679 Fig. 6. Western blot analysis revealed increased phospho-iκb activity in the cytoplasm of HaCaT cells at 12, 24 hours after stimulation with 10 6 M retinoic acid (C: control, EtOH: ethanol, RA: retinoic acid). Fig. 5. Effect of IL-1 receptor antagonist (ra) on the IL-8 mrna expression in HaCaT cells stimulated by retinoic acid (Fig. 3A). 반면에 NF-κB 에대한억제제를투여했을경우에는 NF-κB 결합활성도에는큰변화가없었다 (Fig. 3B). 2) NF-κB 억제제투여전후의 10 6 및 10 7 M 레티노인산처리 24 시간후 HaCaT 세포에서발현된 NF-κB 결합활성도 10 6 및 10 7 M 레티노인산투여 24 시간후 HaCaT 세포에서 NF-κB 결합활성도측정결과, 10 6, 10 7 M 두농도에서 NF-κB 결합활성도가증가되었다 (Fig. 4A). 반면에 NF-κB 에대한억제제를투여했을경우에는 NF-κB 결합활성도에는큰변화가없었다 (Fig. 4B). 4. IL-1ra 가레티노인산에의한 IL-8 mrna 발현에미치는영향 IL-1ra처리전후에레티노인산을 10 6, 10 7 M 투여하여 IL-8 mrna의발현을비교하였을때 IL-1ra 를처리하지않은좌측의그래프와 IL-1ra 처리후의우측의그래프에서 IL-8 mrna발현에큰차이가없는것으로관찰되었다 (Fig. 5). 5. Phospho-IκB-α 항체를이용한 Western blot 10 6 M 레티노인산투여 12 시간과 24 시간모두에서세포질내의인산화된 IκB 의농도가증가되는것을확인하였다 (Fig. 6). 고 각질형성세포는표피를구성하는세포로단순한물리적장벽의기능뿐만아니라많은종류의사이토카인을분비하여면역기능과염증반응에관여한다 20. 외부자극을받으면각질형성세포는 IL-1, TNF-α 와같은일차사이토카인을분비하여 IL-8 이나 MCP-1, IP-10 과같은케모카인의생성을유도함으로써활성화된염증세포들이자극부위로모이게하여염증반응을일으킨다 레티노인산의국소도포로유발될수있는자극성피부 찰 염은다른화학물질에의한전형적인자극성피부염에비하여다소지연되어나타나며레티노인산으로인한염증유발기전에 IL-1, TNF-a, IL-8, IL-10 등의사이토카인이관여한다고알려졌으나이들염증성사이토카인이발현되는기전에대해서는아직정확히밝혀져있지않다 본연구에서도레티노인산투여후 IL-1, IL-8 같은사이토카인의증가를확인하였는데, IL-1 은자극초기에만증가하나 IL-8 은레티노인산투여 24 시간후에도증가하는모습을보였다. 레티노인산이유전자발현을조절하는방법으로는몇가지가알려져있다. 첫째로레티노인산은핵수용체인레티노인산수용체 (RARα, β, γ) 와레티노이드 X 수용체 (retinoid X receptor, RXRα, β, γ) 에결합하고이들수용체에특이한 DNA 염기서열에결합하여리간드에의한전사조절에관여하게된다 10,27. 즉, RAR 은대개 RXR 과서로합하여이형이랑체 (heterodimer) 를형성하는데, 이이형이랑체는특정유전자위쪽프로모터에존재하는특이한호르몬반응단위에결합함으로써특정유전자의발현을전사적으로활성화시킨다 10. 레티노인산수용체에의한유전자발현조절의두번째방법으로는서로연관되지않는전사인자와의단백 - 단백직접결합에의한반응을들수있다. 즉, 레티노인산은 AP-1 에반응하는유전자에대해서억제하는역할을하는데, 이는 RAR 이 AP-1 전사인자복합체중하나인 c-jun 과결합하여 AP-1 이반응영역 (response element) 에결합하는것을방지하며대표적인예가 collagenase promoter 이다 28,29. 마지막으로 RAR 과연관이전혀없는여러유전자들도레티노인산이다른전사인자를활성화시키거나억제시킴으로써유전자발현을조절하게된다 31. NF-κB 는사이토카인과스트레스또는생물리학적인자극에의해활성화되어여러유전자의발현에영향을미침으로써염증반응과면역반응에핵심적인역할을하는전사인자이다. 불활성화상태의 NF-κB 는 IκB 라는 NF-κB 의억제제에의해세포질내에머물러있다가활성화되면 IκB 는 IκB kinases (IKK) 에의해인산화되면서분해되고 NF-κB 는핵안으로들어가유전자와결합한다 16. 이러한 NF-κB 경로는여러다양한자극에의해세포마다특이하

7 680 대한피부과학회지 : 제 47 권제 6 호 2009 년 게활성화되어유전자발현에서로다른효과를나타낸다 31. IL-8 은 C-X-C 케모카인에속하는 8.4 kda 의케모카인으로단핵구 / 대식세포, 섬유모세포, 혈관내피세포, 활막세포, 각질형성세포, 상피세포등다양한세포와위암세포나뇌신경종양등의종양세포에서도생산된다 32. IL-8 의전형적인유도인자는염증반응의자극으로 IL-1, TNF, bacterial lipopolysaccharides, 바이러스, 12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate, double-strand RNA 등이있다. IL-8 유전자의 3' flanking region 에는 ATTTA 모티브가존재하여여러가지사이토카인을불안정화시키는역할을하고, IL-8 의프로모터인 5 flanking region 에는여러가지전사인자, 즉 AP- 1, AP-2, AP-3, HSE, HNF-a, IRF-1, glucocorticoid 수용체, NF-κB, NF-IL-6 와 octamer factor 가결합할수있는유전자를포함한다 33,34. 그러므로 NF-κB 가 IL-8 유전자의전사에핵심적인역할을한다고추정할수있다. 본연구에서는레티노인산을 HaCaT 세포에투여하였을때시간에따른차이는있었지만 IL-1 과 IL-8 의증가를확인할수있었다. 또한레티노인산에의해 IL-8 이증가되는기전이 NF-κB 의경로에의할것이라는가설하에 EMSA 로레티노인산투여후농도와시간에따라 NF-κB 발현이증가됨을확인하였으며, NF-κB 에대한억제제를투여한후레티노인산을처리하면 IL-8 의발현이의미있게감소되는것을알수있었다. 또한레티노인산처리후세포질내에인산화된 IκB 의양이증가되는것을확인하였다. 하지만레티노인산에의해서 IL-8 이증가하는것은증명되어있으나 IL-8 유전자의조절부위에전형적인레티노인산의반응단위가존재하지않으므로레티노인산이어떻게 IL-8 의발현을증가시키는지에대해서는밝혀져있지않으 며다만 NF-κB 와연관된다고추정되어왔다 13,33. 저자들은이에레티노인산투여후초기에만증가하는 IL-1 같은일차사이토카인이중간자극제역할을하여 IL-1 이 IL-1 수용체에결합후 IKK 를활성화시켜 NF-κB 가핵내로진입하여 IL-8 의프로모터에결합함으로써 IL-8 유전자발현을조절할수있다는가설을세우고 IL-1 수용체에대한길항제를투여하여 IL-1 에의한 NF-κB 의활성화를억제했을때 IL-8 의발현이증가되는지를확인하였다. 결과에서보듯이 IL-1ra 처리후에레티노인산을투여하였을때발현되는 IL-8 mrna 의양은큰차이가없어 IL-1 이 IL-8 유전자발현에영향을미쳤다고볼수는없었다. 결론적으로레티노인산을각질형성세포에처리후 NF-κB 작동에의해 IL-8 유전자발현이증가된것은레티노인산이 IKK 에의한 IκB 의해리를증가시켜 NF-κB 의핵내진입을용이하게함으로써 IL-8 유전자발현에영향을미쳤을것이라고생각된다 (Fig. 7). 하지만레티노인산이어떤경로를통해 IKK 를활성화시키는지에대해서는계속적인연구가진행되어야할것이다. 결 레티노인산을각질형성세포에투여하였을때증가하는대표적사이토카인인 IL-8 의유전자발현에레티노인산이어떤경로로작용하는지를알아보고자본연구를시행하였으며, 다음과같은결론을얻었다. 첫째, 레티노인산을각질형성세포에투여하였을때 IL-1 과 IL-8 mrna 의발현이증가하였다. 둘째, 레티노인산을각질형성세포에투여하면각질형성세포내의 IκB 의인산화가증대되었고 NF- 론 Fig. 7. A proposed mechanism of retinoic acid induced IL-8 gene expression in keratinocytes via IκB degradation.

8 정예리외 : 각질형성세포에서레티노인산 (All-trans Retinoic Acid) 에의한 IL-8 발현의기전 681 κb 가활성화되었다. 셋째, 레티노인산에의한 IL-8 유전자의발현에 IL-1 은중간자극제로서관여하지않았다. 결론적으로레티노인산에의한각질형성세포의 IL-8 유전자발현의증가는 NF-κB 를통해서이루어짐을알수있었다. 그리고 NF-κB 의활성은 IL-1 에의한영향과는관련이없음을확인하였으며레티노인산에의해 IKK 가활성화되면이로인해 IκB 의인산화와해리가촉진되어 NF-κB 활성이증가되었을것으로추정하였다. 참고문헌 1. Erickson JM, Mawson AR. Possible role of endogenous retinoid (Vitamine A) toxicity in the pathophysiology of primary biliary cirrhosis. J Theor Biol 2000;206: Racke AE, Racke MK. Retinoic acid promotes the development of Th2 like human myelin basic protein-reactive T cells. Cell Immunol 2002;215: Ballow M, Wang W, Xiang S. Modulation of B cell immunoglobuliln synthesis by retinoic acid. Clin Immunol Immunopathol 1996;(Suppl. 80): Yun JI. Retinoid. Clin Dermatol (Seoul) 1996;2: Kang SW. Metabolism and molecular action of retinoids in human skin. Clin Dermatology (Seoul) 1997;3: MacGregor JL, Maibach H. The specificity of retinoidnduced irritation and its role in clinical efficacy. Exog Dermatol 2002;1: Petkovich PM. Retinoid and metabolism. J Am Acad Dermatol 2001;(Suppl. 45): Harant H, Lindley I, Uthman A, Ballaun C, Krupitza G, Grunt T, et al. Regulation of interleukin-8 gene expression by all-trans retinoic acid. Biochem Biophy Res Com 1995; 10: Harant H, de Martin R, Andrew PJ, Foglar E, Dittrich C, Lindley I. Synergistic action of interleukin-8 gene transcription by all-trans-retinoic acid and tumor necrosis factorα involves the transcriptional factor NF-κB. J Bio Chem 1996;271: Chang MM, Harper R, Hyde DM, Wu R. A novel mechanism of retinoic acid-enhanced interleukin-8 gene expression in airway epithelium. Am J Resp cell Mol Bio 2000; 22: Fisher GJ, Voorhees JJ. Molecular mechanism of retinoid actions in skin. FASEB J 1996;10: Awad S, Yokozeki H, Miyazaki Y, Igawa K, Minatohara K, Satoh T, et al. Glucocorticoid induced the production and gene expression of IL-1αthrough AP-1 and partially NFκB activation in murine epidermal cells. J Med Den Sci 2002;49: Na SY, Kang BY, Chung SW, Han SJ, Ma X, Trinchieri G, et al. Retinoid inhibit interleukin-12 production in macrophages through physical association of retinoid X receptor and NF-κB. J Bio Chem 1999;274: Bernard FX, Pedretti N, Rosoy M, Deguercy A. Comparison of gene expression profiles in human keratinocyte mono-layer cultures, reconstituted epidermis and normal human skin; transcriptional effects of retinoid treatments in reconstituted human epidermis. Exp Dermatol 2002;11: Roebuck KA. Regulation of Interleukin-8 gene expression. J Interferon Cytokine Res 1999;19: Yamamoto Y, Gaynor RB. Therapeutic potential of inhibition of the NF-κB pathway in the treatments of inflammation and cancer. J Clin Invest 2001;107: Pahl HL. Activators and targets genes of Rel/NF-κB transcription factors. Oncogenes 1999;18: Gerondakis S, Grumont R, Rourke I, Grossman M. The regulation an roles of Rel/NF-κB transcriptional factors during lymphocytes activation. Curr Opin Immunol 1998; 10: Brockman JA, Scherer DC, McKinsey TA, Hall SM, Qi X, Lee WY, et al. Coupling of a signal response domain in Iκ Bα to multiple pathways for NF-κB activation. Mol Cell Biol 1997;15: Shimada S, Katz SI. The skin as an immunologic organ. Arch Pathol Lab Med 1998;112: Ansel J, Perry P, Brown J, Damm D, Phan T, Hart C, et al. Cytokine modulation of keratinocyte cytokines. J Invest Dermatol 1990;(Suppl. 94): Grone A. Keratinocytes and cytokines. Vet Immunolo Immunopathol 2002;88: Sauder DN. The role of epidermal cytokines in inflammatory skin disease. J Invest Dermatol 1990;(Suppl. 95): Jessens S, Bols L, Vandermeeren M. Retinoic acid potentiates TNF-α-induced ICAM-1 expression in normal human epidermal keratinocytes. Biochem Biophys Res Commun 1999;255: Green GS. Retinoic acid effects on endothelial cell function: interaction with IL-1. Clin Immunol Immunopathol 1994;72: Gidlöf AC, Romert A, Olsson A, Törmă H, Eriksson U, Sirsjö A. Increased retinoid signaling in vascular smooth muscle cells by proinflammatory cytokines. Biochem Biophys Res Commun 2001;286: Yu VC, Delsert L, Anderson B, Holloway JM, Devary OV, Năăr AM, et al. RXR beta: a coregulator that enhances binding of retinoic acid, thyroid hormone, and vitamin D receptors to their cognate response element. Cell 1991;67: Shüle R, Rangarajan P, Yang N, Kliewer S, Ransone LJ,

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hwp 레티노인산에의한각질형성세포에서의 IL-8 발현의기전 연세대학교대학원 의학과 정예리 레티노인산에의한 각질형성세포에서의 IL-8 발현의기전 지도김수찬교수 이논문을박사학위논문으로제출함 2003 년 12 월일 연세대학교대학원 의학과 정예리 정예리의박사학위논문을인준함 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 연세대학교대학원 2003 년 12 월일