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3 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 이종항원발현생균백신 system 을이용한 PRRSV 백신및감별진단법 개발 과제의보고서로제출합니다 년 08 월 11 일 주관연구기관명 : ( 주 ) 바이오리쏘스주관연구책임자 : 정승기세부연구책임자 : 정승기협동연구기관명 : 전남대학교협동연구책임자 : 이재일협동연구기관명 : 전남대학교협동연구책임자 : 김태중 - 1 -

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8 SUMMARY Porcine reproductive and respiratory disease(prrs) is an economicay important disease around the gobe. It is we estabished that PRRS is caused by an enveoped, singe-stranded positive-sense RNA virus known as procine reproductive and respiratory syndrome virus(prrsv). GP5 and GP6 is the major enveope poypeptide of PRRSV, and it is associated with the deveopment of neutraizing antibodies and protection the GP5 and GP6 protein. In this study, a heteroogous PRRS gycoprotein 5(GP5) and used as a ive vaccine vehice. To study the effect of BBS-GP5. we estabished a antigen-specifec antibody(igg & IgA) inductivity induced by BBS-GP5 using mouse and pig. Mice were primed with recombinant GP5(rGP5) foowed by boosting with ive BBS-GP5 via the subcutaneous and intranasa route. Pig experiment is the same that. As a resut, anti-gp5 IgG was significanty induced. our data is beieved to be a good candidate for the deveopment of a ive-attenuated vaccine against PRRSV infections. furthermore antigen-specificity and sensitivity is more usefu than other kit

9 CONTENTS - 7 -

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17 Carbon (%) Nitrogen (%) Commercia sugar Gray Backish White coor coor coor Starch Dextrose Saccharose Lactose Gycero Gaactose Soy 3:10 Z) (68.6) 3:2(75.6) 3:15(70.8) 3:0.5(34.4) 3:10(64.1) 3:10(57.3) 3:3(56.5) 3:10(32.8) 3:1.5(23.2) Soy bean mik 1:10(6.9) 1:2(8.9) 3:10(26.8) 1:0.5(5.4) 3:10(12.4) 1:5(9.2) 2:8(12.7) 1:6(14.5) 1:5(12.9) (NH 4) 2SO 4 1:10(17.9) 1:2(23.2) 1:10(53.3) 3:0.5(8.2) 1:2.5(15.6) 1:2.5(18.4) 1:2.5(21.4) 2:5(12.9) 2:4.5(19.8) (NH 4) 2CO 0.5:1(1.8) 1:2(7.5) 1:3(27.3) 1:0.5(8.4) 1:2(1.6) 0.5:1(7.5) 1.2:2(14.8) 1.6:3(25.2) 1.2:4(11.5) NH 4C 1:5(19.6) 1:2(25.4) 1:5(44.8) 3:0.5(2.4) 1:5(18.4) 1:5(18.6) 1:4.5(19.3) 1:4.2(12.3) 1:4(15.2) Poypeptone 1:10(89.4) 1:2(87.0) 1:10(65.7) 3:0.5(76.2) 1:5(97.0) 1:10(85.9) 1:8(45.2) 1:5(65.3) 1:8(81.6) Peptone 1:3(20.2) 2:5(36.2) 7:5(62.8) 5:1.9(25.6) 7:1.5(70.5) 7:1.5(100) 6:3(96.2) 5:1.5(30.2) 6:5(83.1)

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27 Name Amino acid sequence Encompassing amino acid ocation GP5-VR* #1 CLLDTKGGLYRWRSPV th GP5-VR* #2 CVIIEKRGKVEVEGHLID th GP5-LV** #1 CIVDDRGRVHRWKSPI th GP5-LV** #2 CIVVEKLGKAEVDGNLV th M-VR* CANDNHAFVVRRPGSTT th M-LV** CSGNRAYAVRKPGLTSV th

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29 antigen Reacted antibodies raised against GP5-VR* #1 GP5-VR #1 (3.17±0.17) GP5-VR #2 (0.34±0.20) GP5-LV#1 (0.18±0.02) GP5-LV #2 (0.52±0.31) GP5-VR #2 GP5-VR #2 (3.05±0.50) GP5-VR #1 (0.18±0.11) GP5-LV #1 (0.09±0.07) GP5-LV #2 (0.28±0.17) GP5-LV** #1 GP5-LV #1 (2.28±0.24) GP5-VR #1 (0.64±0.18) GP5-VR #2 (0.27±0.03) GP5-LV #2 (0.16±0.01) GP5-LV #2 GP5-LV #2 (3.01±0.60) GP5-VR #1 (0.50±0.23) GP5-VR #2 (0.25±0.01) GP5-LV #1 (0.14±0.02) M-VR M-VR (3.43±0.36) M-LV (0.24±0.01) M-LV M-LV (3.64±0.61) M-VR (0.20±0.07)

30 항원명 양성대조군 음성대조군 시료 양성개체수 (%) GP5-VR* # ± ± ± (10) GP5-VR # ± ± ± (12.3) GP5-LV** # ± ± ± GP5-LV # ± ± ± M-VR 0.372± ± ± (8.8) M-LV 0.466± ± ±

31 - 29 -

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33 - 31 -

34 μ

35 - 33 -

36 - 34 -

37 - 35 -

38 - 36 -

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40 - 38 -

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44 성분명 함량 (g/l) Caf brain Infusion from 200g 7.7 Beef heart Infusion from 250g/L 9.8 Proteose peptone 10 Dextrose 2 Sodium choride 5 Disodium phosphate 2.5 ph 7.4± 0.2 성분 대두박 (%) African ocuse beans(%) 단백질 수분 지방

45 - 43 -

46 Beef extract(g/l) 미네랄혼합물 (g/l) 비타민혼합물 (g/l) O.D 600nm

47 대두에서조제한펩톤 (g/l) African ocust bean 에서조제한 펩톤 (g/l) PRRSV GP5 2.3* * * * * *10 10 Wid type 3.7* * * * * *

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51 일시 Group 1 Group 2 Group 3 rgp5 200ug in PBS + rgp5 200ug in PBS + rgp5 200ug in PBS + Day 0 Freund's compete Freund's compete Freund's compete adjuvant, SC* adjuvant, SC adjuvant, SC Day 14 rgp5 200ug in PBS + Freund's incompete adjuvant, SC BBS-PRRSV GP5**/kg, nasa BBS-aroA*** /kg, nasa Day 21 모든자돈에서채혈및항체가측정 Day 28 rgp5 200ug in PBS + Freund's incompete adjuvant, SC BBS-PRRSV GP5/kg, nasa BBS-aroA/kg, nasa Day 35 모든자돈에서채혈및항체가측정 Day 42 PRRSV chaenge Day 47 채혈및부검실시

52 Group 평균 OD 값 (±SD) 통계적의의 (0.08) 없음 (0.07) 없음 (0.09) 없음 Group 평균 OD 값 (±SD) 통계적의의 (0.30) 있음 (1-2: P<0.05, 1-3; P<0.01) (0.37) 있음 (2-3: P<0.1) (0.13) 없음

53 - 51 -

54 A: supeficia LN B: submandibuar LN C: mediastina LN D: media iiac LN

55 Group 1 Group 2 Group 3 비고 Superficia LN (1.83) (1.69) (3.26) P<0.01 Submandibuar LN 22.01(2.45) (2.49) (1.45) Mediastina LN (1.23) (2.78) (3.29) Media iiac LN (1.20) (2.33) (3.90)

56 - 54 -

57 Antigens N* VR #1** VR #2** VR #1+2 rgp5 Positive Negative True positive Fase positive Fase negative True negative Sensitivity Specificity

58 Antigens N* LV #1** LV #2** Positive Negative True positive 0 0 Fase positive 2 4 Fase negative True negative

59 - 57 -

60 Group 항원 formuae boosting 마리수 1 PBS PBS PBS 3 2 rgp5 50ug PBS rgp5+pbs 3 3 rgp5 50ug 4 rgp5 50ug 5 rgp5 50ug 6 rgp5 50ug 7 rgp5 50ug 8 rgp5 50ug Freund's compete 0.25% chitosan so. 0.25% chitosan 과립 0.5% chitosan 과립 1% chitosan 과립 2% chitosan 과립 rgp5+freund's incompete rgp5+0.25% chitosan so. rgp5+0.25% chitosan 과립 rgp5+0.5% chitosan 과립 rgp5+1% chitosan 과립 rgp5+2% chitosan 과립

61 Group 항원항체가 (SD) 통계적의의 (P) 1 PBS 0.29 (0.21) 의의없음 2 rgp5 50ug 0.32 (0.16) 의의없음 3 rgp5 50ug 1.83 (0.65) 의의없음 4 rgp5 50ug 0.05 (0.00) 의의없음 5 rgp5 50ug 0.04 (0.00) 의의없음 6 rgp5 50ug 0.72 (0.45) 의의없음 7 rgp5 50ug 1.08 (0.61) 의의있음 8 rgp5 50ug 1.16 (0.39) 의의있음

62 Antigens OD 값 (SD) 음성값 (SD) 음성대비 P 값 rgp (0.04) 0.6 (0.01) P < 0.01 rgp (0.01) 0.6 (0.06) P < 0.01 Antigens OD값 (SD) 음성값 (SD) 음성대비 P값 rgp5 1.6 (0.3) P < (0.1) rgp6 1.2 (0.2) P <

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64 - 62 -

65 λ

66 - 64 -

67 - 65 -

68 - 66 -

69 Group Experimenta condition Tota Pigs 백신접종 group BBS PRRS GP5 비강분무 10 백신비접종 group PBS 비강분무

70 - 68 -

71 - 69 -

72 10 9 Cinica scores for experimenta pigs treated nontreated 8 7 Cumuative cinica score Days post chaenge 15 Cinica score for experimenta pigs treated nontreated Cumuative cinica score Days post chaenge

73 - 71 -

74 - 72 -

75 일시 Group 1 Group 2 Group 3 Day 0 rgp5 200ug in PBS + Quiaza saponin, SC* rgp5 200ug in PBS + Quiaza saponin, SC rgp5 200ug in PBS + Quiaza saponin, SC Day 14 rgp5 200ug in PBS + Quiaza saponin, SC BBS-PRRSV GP5**/kg, Quiaza saponin, nasa BBS-aroA*** /kg,quiaza saponin, nasa Day 21 모든자돈에서채혈및항체가측정 Day 28 rgp5 200ug in PBS + Quiaza saponin, SC BBS-PRRSV GP5/kg, Quiaza saponin, nasa BBS-aroA/kg, Quiaza saponin, nasa Day 35 Day 42 Day 47 모든자돈에서채혈및항체가측정 PRRSV chaenge 채혈및부검실시

76 Group 평균 OD 값 (±SD) 통계적의의 (0.07) 없음 (0.12) 없음 (0.53) 없음 Group 평균 OD 값 (±SD) 통계적의의 (0.62) 없음 (0.37) 없음 (0.13) 없음

77 Test group 1(n=12) 2(n=10) 3(n=9) Days post-inocuation Test item 발병 병원체분리 폐사 발병 병원체분리 폐사 발병 병원체분리 폐사

78 - 76 -

79 rgp5 Ag coating ysate Ag coating (-)* (-) (-) (-) (-) (-) (-) (+)** (+) (+) (+) (+) (+) (+) 시료 시료 시료 mean SD (-) (+)

80 - 78 -

81 pate 1 차 2 차 3 차 4 차 5 차 6 차 평균 stock CFU/m

82 pate 1 차 2 차 3 차 4 차 5 차 6 차 평균 stock CFU/m

83 pate 1 차 (10/21) 2 차 (12/21) 3 차 (2/21) 4 차 (4/21) 평균 stock CFU/m pate 1 차 (10/21) 2 차 (12/21) 3 차 (2/21) 4 차 (4/21) 평균 stock CFU/m

84 name sequence(5' 3') size T7po-F T7pro-po-R T7po-pro-F GP5-T7pro-R T7pro-GP5-F GP5-BamH-R AATTGGTACCATGAACACGATTAACATCGC TAGTGAGTCGTATTAATTTTACGCGAACGCGAAGT GCGTTCGCGTAAAATTAATACGACTCACTATAGGG GCTGCTGTCGTTGCTCATATCCTTATCGTCATCGTCGT GATGACGATAAGGATATGAGCAACGACAGCAGCTCCCA AATTGGATCCCTAAGGACGACCCCATTGTT 2.6kb 180bp 0.5kb

85 name sequence(5' 3') size kan-kpn-6his-r ATAGGTACCATGATGATGATGATGATGGAAGAACTCGTC AAG 0.8kb

86 name T7po-kpnI-R Kan-KpnI-F Kan-BamHI-R T7po-6h-Bg-F sequence(5' 3') AATGGTACCCGCGAACGCGAAGTCCGACT CTGGGTACCATGATTGAACAAGATGGATT TCGGGATCCTTAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC TCGAGATCTCATCATCATCATCATCATATGAACACGATTAACATCGC

87 λ

88 - 86 -

89 - 87 -

90 - 88 -

91 - 89 -

92 출원연도 특허명 출원인 출원국 출원번호 2008 바이오리쏘스, 약독화 Bordetea bronchiseptica에서발현된이종항원을전남대학교이용한 PRRSV 백신산학협력단 한국 바이오리쏘스, 2008 펩타이드항원을이용한 PRRSV wses법 전남대학교산학협력단 한국

93 - 91 -

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96 - 94 -

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.... 발간등록번호 11-1250054-000004-10 발간등록번호 11-1250054-000004-10 007 011 016 025 025 029 030 033 035 041 046 046 047 050 057 059 059 061 063 063 071 076 080 084 087 095 095 096 099 099 101 105 108 108 110 114

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<5B D31322D31325DB0EDBAB4BFF8BCBA B9D9C0CCB7AFBDBA D BFA120B4EBC7D120C0CFB9DDBBE7C7D720C1B6BBE72E687770> 고병원성 PRRS 바이러스 (HP-PRRSV) 에대한일반사항 손진희수의사중앙백신연구소 지난 2006년중국에서발생하여양돈산업에심각한타격을입혔던고병원성 PRRS의발병사례를조사하여그심각성을이해하고해당바이러스의특성을파악하기위해자료조사를실시하였다. 또한본조사에이어 HP-PRRS의병원성에기여하는것으로알려진 nsp2 gene에대한추가조사및진단방법의수립등에대하여추가적인자료를통해논하고향후국내상황에대비할필요성여부를파악하고자한다.

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